KR20110097043A

KR20110097043A - 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR20110097043A
Application number: KR1020100016661A
Authority: KR
Inventors: 공광훈
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2011-08-31

Abstract

본 발명은 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유당 발효 효모인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 브라제인의 발현 시스템을 구축하였고, 특히 최적의 조건을 확립한 것으로, 기존 대장균 및 효모균의 발현 시스템 보다 월등히 우수한 발현량을 보여 대량 생산이 가능하다.

Description

브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법{Recombinant expression vector for expression of brazzein and mass production method of brazzein using the same}

본 발명은 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법에 관한 것이다.

백색 설탕(정백당)은 당류의 하나로, 더욱 정확히 말하면 수크로오스(sucrose, 설탕)라는 간단한 탄수화물의 하나로 사카로오스(saccharose, 설탕의 화학적 용어)라고도 하는 이당류이다. 오랜 기간 동안 설탕은 감미료로서 흔하게 사용되어 왔다. 하지만 설탕의 유해성 문제로 최근 세계보건기구(WHO)에서는 설탕 사용을 현재의 10%로 제한하자는 권고안을 제시하였으며, 미국의 주 정부(뉴욕시 2003.7월, 뉴저지주 2004.9월, 일리노이주 2006.3월, 코네티컷주 2006.4월)에서는 설탕 주성분 식품 및 고 함유 음료 판매를 전면 금지시켰다. 또한, 한국의 경우, 국가비만대책위원회를 구성하여 설탕 위험 경고문구 표기 방침 발표하였으며, 2010년 이후부터 설탕 기준치 이상 식품 광고 규제를 실시할 예정이다. 따라서, 설탕을 대체할 수 있는 새로운 감미료의 등장이 요구되고 있다. 1879년 미국의 아이라 렘슨과 독일의 콘스탄틴 팔베르크는 설탕 보다 5백배 단맛을 내는 사카린(saccharin)을 발견하였다. 사카린은 체내에서 분해되지 않고 배설되는 장점을 가졌으나 발암성 물질이라는 논란을 불러일으켰다. 결국 인체에 무해하다고 결론이 났지만, 뒷맛이 쓰다는 단점 때문에 최근에는 많이 사용되지 않는다. 1937년 미국 일리노이대에서 사이클로헥실설파민산 나트륨이 단맛을 내는 것을 발견하였다. 상품명으로 사이클라메이트(cyclamate)로 불리면서 1950년 초부터 사용이 시작돼, 1960년대 세계 감미료 시장을 석권했다. 그러나, 발암성 물질로 판명되면서 우리나라에서는 1970년대부터 사용이 전면 금지되었다. 최근에 가장 널리 사용되는 인공감미료는 1965년 제임스 쉬레터에 의해 발견된 아스파탐(aspartame)이다. 아스파탐은 설탕 보다 약 180 ~ 200배 정도 높은 당도를 가지고 있다. 현재 시판되는 대다수의 다이어트 음료에는 아스파탐이 포함되어 있는데, 체내에 들어가면 대사과정 중 페닐알라닌을 생성한다. 따라서, 페닐알라닌을 분해하는 특정 효소 (phenylalanine hydroxylase)가 선천적으로 결핍된 페닐케톤뇨증 환자들은 이용할 수 없다는 단점을 지닌다.

이 같은 인공 감미료뿐만 아니라 천연 감미료를 개발하기 위한 연구도 계속되어 왔으며, 그 결과로서, 허브로 분류되고 있는 국화과의 다년생 식물(Stevia rabaudiana)의 잎에는 스테비오사이드(stevioside)라는 물질이 존재한다. 파라과이와 브라질의 국경 지대 원주민들은 이 물질을 4백년 이상 감미료로 사용했다. 우리나라의 소주에 첨가되기도 하는데, 설탕 보다 200배 단맛을 갖고 있다.

한편, 최근에는 열대 과일에서 추출한 감미 단백질에 대한 관심이 증대하고 있는데, 타우마틴(Thaumatin)은 서아프리카에서 기적의 과일이라고 불리는 다년생 식물(Thaumatococcus daniellii)의 과실 중에 포함되어 있는 단백질로서, 설탕 보다 2,000 ~ 3,000배나 단맛을 나타낸다. 모넬린(Monellin)은 아프리카의 다우림 지대에 생육하는 세렌디퍼티 베리(Serendipiti berry)라고 하는 넝쿨상 식물의 열매로부터 얻어지는 단백질로 설탕 보다 무려 3,000배가 달다. 그러나, 재배가 쉽지 않으며 열매로부터의 추출도 어렵다. 더욱이 열 안정성이 낮아서 식품가공과정에서 열 처리를 하면 삼차원적인 단백질 구조를 잃어버려 단맛을 내지 못하는 단점을 갖고 있다. 현재에는 이런 단점을 극복하기 위해서 단백질 공학 기술을 이용하여 열 안정성을 증진시키는 연구가 진행되고 있다.

한편, 브라제인(brazzein)은 서아프리카의 펜타디플란드라 브라제나 바이론(Pentadipladra brazzeana Baillon)의 열매에서 처음 추출된 감미 단백질이다[Ming et al., FEBS Letters, 355: 106-108, 1994]. 브라제인은 수크로오스(sucrose)와 비교했을 때 약 500배 내지 2,000배 이상의 단맛을 나타내며[Jin et al., Chem. Senses. 28: 491-498, 2003], 주(major) 타입과 부(minor) 타입의 2가지 형태가 있다. 식물에서 추출한 브라제인의 대부분인 주(major) 타입은 아미노 말단 부위에 피로글루탐산(pyroglutamic acid) 잔기를 포함하여 54개의 아미노산을 가진다. 반면, 부(minor) 타입의 브라제인은 아미노 말단 부위의 피로글루탐산 잔기 없이 53개의 아미노산 잔기만을 가지며 주(major) 타입의 브라제인에 비해 약 2배 정도 강한 단맛을 보인다[Assadi-Porter et al., Arch.. Biochem. Biophys. 376: 259-265, 2000]. 브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기로 약 6.5 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 1개의 서브유닛(subunit)으로 구성된 단량체(monomer)이다. 단일 폴리펩티드(single polypeptide)로 이루어져 있으며 1개의 α-나선(helix)과 2개의 β-병풍구조(sheet)로 구성된다. 브라제인은 8개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가져 분자 내에 4개의 이황화 결합(disulfide bond)를 형성하고 있어 열 안정성이 매우 높다. 또한, 물에 대한 용해도 및 pH 안정성이 매우 높다[Gao et al., Int. J. Biol. macromol. 24: 351-359, 1999].

국제특허(WO 1999/025835)에서는 메틸이용성 효모(methylotrophic yeast)인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 숙주로 하여 상기의 성질을 가지는 브라제인을 유전공학적 방법으로 생산하는 방법을 기술하고 있는데, 효모 알파-메이팅 인자(MF-α) 신호 서열(signal sequence)과 브라제인을 암호화하고 있는 유전자를 연결한 뒤, 이를 AOX1 작동유전자(promoter)를 포함하고 있는 재조합 벡터에 삽입하여, 새로운 형질전환 벡터를 생성한 후, 이를 메틸이용성 효모(methylotrophic yeast)인 피키아 파스토리스에 형질전환하여 최종 재조합 효모 균체 밖 배지로 발현된 브라제인 단백질을 분비, 발현하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 효모 출아형 효모(budding yeast)이며, 제빵 및 양조에 사용되는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 브라제인 생산 방법도 기술하고 있다. 그러나, 피키아 파스토리스의 경우, 200 mg/l 또는 70 mg/l의 높은 수율을 가짐에도 불구하고 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주가 아니며, 탄소원이나 전사유도제로 사용되는 메탄올이 폭발의 위험성이 있으며, 특히 목적 단백질이 식품과 관련이 있는 경우는 메탄올 이용의 제한이 따르는 단점을 가지고 있어 감미 단백질(브라제인)의 발현에는 부적합하다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애의 경우는 그 생산량이 5 mg/L으로 한계가 있어, 대량 생산에 의한 상업화가 곤란하다는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 기존 연구의 단점을 해결하고자 미국 식품의약국(FDA)에 의해 GRAS로 인증된 비병원성 미생물이며, 유당(lactose) 발효 효모인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 발현을 위한 숙주로 이용하였으며, 최적의 발현 및 균체 밖 분비를 위한 재조합 벡터를 제조하여, 야생형 브라제인 및 당 연구실에서 출원한 특허(한국 특허 출원 제2007-0117013호, 제2008-0019008호)에서의 브라제인의 우수한 물리적 특성을 유지하며 높은 단맛을 나타내는 브라제인 변이체와 동일한 아미노산 서열을 가지며 클루이베로마이세스 락티스에 높은 빈도로 존재하는 코돈(codon)으로 구성된 폴리뉴클레오티드를 합성하여 상기의 재조합 벡터에 삽입 후 균체 밖 분비 발현을 유도하였으며, 양이온 교환 크로마토크래피 및 탈염 과정을 통하여 높은 정제도 및 수율을 가지는 브라제인을 제조하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 브라제인의 발현을 위하여 GRAS로 인증된 비병원생 미생물인 효모 클루이베로마이세스 락티스를 발현을 위한 숙주로 하고, 균체 밖으로의 최적 분비 발현을 위한 브라제인의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 제작된 재조합 발현벡터를 제공하는데 있고, 또한 상기 벡터를 이용한 높은 순도 및 수율을 가지는 브라제인을 대량 생산하는 방법을 제공하는데 있다

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모 및 상기 효모를 이용한 브라제인의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명에서는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 균주가 가지고 있는 천연 효모 세포의 세포 밖 분비서열을 이용하여 세포 외부로 브라제인을 배출함으로써 브라제인 정제의 간편성도 증대할 수 있었다. 또한, 이를 통한 브라제인은 L당 약 30 ~ 55 ㎎/L의 생산량을 나타내었다. 또한, 효모 발현계를 통해 발현된 브라제인은 천연에서 유래한 브라제인과 동일한 특성을 지니고 있다.

본 발명에서 효모 발현계를 이용하여 개발한 고효율의 감미도를 가진 재조합 브라제인을 식품감미료로 이용한다면 당뇨병, 비만 등의 질환들로 맛을 즐길 수 없는 환자들에게도 감미 단백질을 섭취함으로써 칼로리 혹은 당 수치에 상관없이 단맛을 느낄 수 있게 하는 대체 감미료로 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 발현벡터 pKLAC2 를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 발현벡터 pKLAC2-브라제인을 디자인하기 위한 pKLAC2 다중 클로닝 부위와 선택된 제한 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 발현벡터 pKLAC2-브라제인의 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 선형화된 발현 카세트의 게놈 인테그레이션(integration)을 나타낸 것이다.
도 5는 발현 카세트의 인테그레이션(integration)을 나타낸 것이다[(A) 단일 삽입 인테그레이션, (B) 다중 삽입 인테그레이션].
도 6은 유전자 삽입 여부를 아가로스 전기영동 분석으로 나타낸 것이다[(A) 단일 삽입 인테그레이션, (B) 다중 삽입 인테그레이션, M: 분자량 마커(λ-HindⅢ DNA marker), NC: 음성 대조군, PC: 양성 대조군, 1: pKLAC2-브라제인(WT-minor type), 2: pKLAC2-브라제인(H30R), 3: pKLAC2-브라제인(E35D), 4: pKLAC2-브라제인(E40A), 5: pKLAC2-브라제인(H30R_E35D), 6: pKLAC2-브라제인(H30R_E40A), 7: pKLAC2-브라제인(E35D_E40A), 8: pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A), 9: pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K)].
도 7은 YPGal 배지에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 8은 YPLac 배지에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 9는 pH 4.5에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 10은 pH 5.0에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 11은 pH 5.5에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 12는 pH 6.0에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~17: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 13은 pH 6.5에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 14는 25 ℃에서 pKLAC2-브라제인으로부터 발현된 브라제인을 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~18: CM 컬럼으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 15는 전배양액의 농도를 1%, 2%, 3%, 4% 및 5% 로 접종한 브라제인 발현 변화를 SDS-PAGE 분석으로 나타낸 것이다[(A) 24시간 배양, (B) 48시간 배양, (C) 72시간 배양, (D) 96시간 배양. M: 분자량 마커; 1: 전배양액 농도 1%; 2: 전배양액 농도 2%; 3: 전배양액 농도 3%; 4: 전배양액 농도 4%; 5: 전배양액 농도 5%].
도 16은 겔 여과법에 의해 탈염 과정을 거친 브라제인의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1~9: 겔 여과법으로 얻어진 브라제인 용출 분획들].
도 17은 분리형 필터에 의한 탈염 과정으로 정제된 재조합 브라제인의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) M: 분자량 마커; 1: 분리형 필터에 의한 탈염과 농축 과정 전의 브라제인; 2: 분리형 필터에 의한 탈염과 1/5로 농축 후의 브라제인; 3: 분리형 필터를 통한 액체 여과, (B) M: 분자량 마커; 1: 2회 분리형 필터에 의한 탈염과 농축 후의 브라제인].
도 18은 CM 셀룰로오스 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피와 분리형 필터에 의한 탈염 과정으로 정제된 재조합 브라제인의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) 정제된 브라제인; (B) 버퍼만].
도 19는 클루이베로마이세스 락티스 내 발현된 브라제인 변이체의 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 20은 브라제인과 브라제인 변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다[M: 분자량 마커; 1: 야생형 브라제인(minor type); 2: H30R 브라제인 변이체; 3: E35D 브라제인 변이체; 4: E40A 브라제인 변이체; 5: H30R_E35D 브라제인 변이체; 6: H30R_E40A 브라제인 변이체; 7: E35D_E40A 브라제인 변이체; 8: H30R_E35D_E40A 브라제인 변이체; 9: H30R_E35D_E40A_E52K 브라제인 변이체].
도 21은 브라제인과 브라제인 변이체의 상대적인 활성을 나타낸 것이다[야생형 브라제인 활성 100% 기준].

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 브라제인의 발현을 위하여 GRAS로 인증된 비병원생 미생물인 효모 클루이베로마이세스 락티스를 발현을 위한 숙주로 하여, 균체 밖으로의 최적 분비 발현을 위한 브라제인의 뉴클레오티드 서열을 이용한 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 높은 순도 및 수율을 가지는 브라제인을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

효모의 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 신호서열의 일종으로[Dominic Esposito et al., Protein Expression and Purification, 40(2): 424-428, 2005, J.J. Clare et al., Gene. 105: 205-212, 1991], 단백질이 효모 내에서 합성되면 소포체로 이동하여 정확한 이황화 결합을 유도하고, 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며 올바른 접힘을 유도한다. 이때, 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 신호서열 일부가 잘려나가게 되며, 이후 골지체로 이동하여 Kex 펩티다제(Kex protease)에 의해 나머지 신호 서열이 모두 제거되고, 천연의 단백질 형태로 배지로 방출되게 된다. 상기 신호서열의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 알파-메이팅 신호서열, 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열, KT 신호서열[Tokunaga et al., Yeast, 13: 699--706, 1997), Saccharomyces cerevisiae pre-SUC2 신호서열(Bergkamp et al., Curr Genet, 21:365-370] 등이 알려져 있다.

그러나, 문헌 자료에 따르면[Anothony J. Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 81: 4642-4646, 1982] 사카로마이세스 세레비지애 유래의 알파-메이팅 신호서열 사용시 분비된 단백질의 N-말단 서열이 100% 야생형이 아닐 수 있음이 밝혀졌다. 이 신호서열을 사용할 경우 분비된 단백질의 N-말단 서열 분석 시 야생형의 단백질 서열 앞에 약 6개의 아미노산(Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala) 서열이 더 추가되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 세포막에 존재하는 시그널 펩티다제의 부족으로 인해 분비된 단백질의 100%를 수용하지 못하고, 일부는 신호서열이 완전히 잘리지 않은 채 배지로 방출된 것으로 추측하고 있다.

본 발명의 브라제인은 N-말단에 추가 아미노산 서열이 존재할 경우, 그 단맛이 현저하게 감소한다. 따라서, 효모 알파-메이팅 신호서열의 완벽한 절단 여부가 그 단맛을 결정하는데 매우 중요한 역할을 한다. 만일 사카로마이세스 세레비지애 유래의 알파-메이팅 신호서열을 사용하여 브라제인을 생산하게 되면, 브라제인이 야생형으로 존재하지 못하고, N-말단에 추가 아미노산 서열을 갖게 되어 브라제인의 단맛 증대에 악영향을 미칠 수 있다.

이에, 본 발명자들은 효모 알파-메이팅 신호서열로서 적합한 신호서열을 조사한 결과, 본 발명에서 숙주로 사용하고 있는 GRAS 유래 비병원성 균주인 클루이베로마이세스 락티스 유래의 신호서열을 사용하게 되면 본 발명에서 최종 분비 배출된 단백질의 N-말단 서열에서 신호서열이 모두 잘려나가 100% 모두 야생형 브라제인 부타입 아미노산 서열로만 존재함을 확인하였다.

본 발명의 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 알파-메이팅 서열은 본 발명의 브라제인 뉴클레오티드 서열의 5' 상단에 단백질로의 번역시 동일한 프레임을 가지도록 연결된다.

상기 신호서열에 연결된 브라제인 유전자는 야생형 브라제인 유전자 또는 브라제인 변이체 유전자일 수 있다. 본 발명에 있어서, 브라제인 유전자는 브라제인 주타입, 부타입, 변이체 모두의 유전자를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 야생형 브라제인 부타입일 수 있으며, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10의 염기서열을 갖는 브라제인 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명의 브라제인 발현용 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열과 서열번호 2 내지 10으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 브라제인 유전자가 각각 연결된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기와 같이 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열과 브라제인 유전자를 통합해서 "브라제인 조합체(combination)"로 명명하였다.

한편, 본 발명은 상기 브라제인 조합체(combination)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 20의 아미노산에 대해서는 서열번호 11의 염기서열, 서열번호 21의 아미노산에 대해서는 서열번호 12의 염기서열, 서열번호 22의 아미노산에 대해서는 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 23의 아미노산에 대해서는 서열번호 14의 염기서열, 서열번호 24의 아미노산에 대해서는 서열번호 15의 염기서열, 서열번호 25의 아미노산에 대해서는 서열번호 16의 염기서열, 서열번호 26의 아미노산에 대해서는 서열번호 17의 염기서열, 서열번호 27의 아미노산에 대해서는 서열번호 18의 염기서열, 서열번호 28의 아미노산에 대해서는 서열번호 19의 염기서열을 가질 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 브라제인 조합체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드 외에 작동 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

상기 '작동 유전자'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 작동 유전자로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 효모 LAC 프로모터, GAL 프로모터(Rosaura Rodicio et al., Microbiology 152 (2006), 2635-2649), KlADH4 프로모터(Michele Saliola et al., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65(1): 53-60), 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터(미국 특허 제6,596,513호), PGK1 프로모터(V. Melvydas et al., BIOLOGIJA, 4:1-4, 2006) 등이 있다. 이외에도 미국 특허 제227,326호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 프로모터는 LAC4 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 브라제인 발현을 위한 재조합 발현벡터로 pKLAC2-브라제인일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pKLAC2-브라제인(WT-minor type), pKLAC2-브라제인(H30R), pKLAC2-브라제인(E35D), pKLAC2-브라제인(E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D), pKLAC2-브라제인(H30R_E40A), pKLAC2-브라제인(E35D_E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A), pKLAC2-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K)일 수 있다.

상기 벡터에서 발현된 브라제인 및 브라제인 변이체는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 29의 아미노산에 대해서는 서열번호 2의 염기서열, 서열번호 30의 아미노산에 대해서는 서열번호 3의 염기서열, 서열번호 31의 아미노산에 대해서는 서열번호 4의 염기서열, 서열번호 32의 아미노산에 대해서는 서열번호 5의 염기서열, 서열번호 33의 아미노산에 대해서는 서열번호 6의 염기서열, 서열번호 34의 아미노산에 대해서는 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 35의 아미노산에 대해서는 서열번호 8의 염기서열, 서열번호 36의 아미노산에 대해서는 서열번호 9의 염기서열, 서열번호 37의 아미노산에 대해서는 서열번호 10의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 제공한다. 상기 효모는 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 이때 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 초산화 리튬(LiCH₃COO)법, 염화 리튬(LiCl)법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 운반 DNA 융합법(Carrier-DNA mediated fusion) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

한편, 본 발명은 상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 배양하는 단계; 상기 배양액에서 균체를 제거하여 정제하는 단계; 및 탈염과정을 수행하는 단계를 포함하는 브라제인의 생산방법을 포함한다.

본 발명은 상기 형질전환된 효모를 배양하고, 브라제인을 최적의 효율로 발현시키는 배양 배지 조성을 제공한다. 상기 형질전환된 효모가 배양되는 동안, 발현벡터 내의 발현 조절 서열에 의해 알파-메이팅 신호서열을 포함하는 브라제인이 발현되고, 이러한 본원발명에서의 브라제인의 발현은 젖당(lactose), 갈락토오스(galactose), 글로코오스(glucose), 녹말(starch)과 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물에 의해 이루어진다. 발현된 α-Mating 신호서열을 포함하는 브라제인은 신호서열에 의해 효모의 소포체로 이동하게 되고, 효모의 시그널 펩티다제(signal peptidase)와 Kex 펩티다제(Kex peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 브라제인이 합성되게 된다. 따라서, 본 발명의 브라제인 발현 재조합 발현벡터를 포함하도록 형질전환된 효모는 브라제인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이는 질소 공급원으로 효모 추출물을 0.5 내지 5%, 펩톤을 0.5 내지 5%로 단독 또는 혼합하여 사용하고, 탄소 공급원 및 발현 유도제로 갈락토오스 1 내지 4%, 글루코오스 1 내지 4%, 젖당 1 내지 4% 및 전분 1 내지 4%로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 특히, 효모 추출물 0.5 내지 5%, 펩톤 0.5 내지 5% 및 갈락토오스 1 내지 4%를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

형질전환된 효모에서 외래 단백질을 배지로 분비시키는 경우 분비 효율이 낮고 분비된 재조합 단백질이 배지 내에서 다량체로 형성되는데 이를 개선하기 위하여, 본 발명은 배지의 pH를 조절한다.

구체적으로, 리보좀에서 번역된 재조합 단백질은 소포체와 골지체를 거쳐 최종적으로 배지로 분비되는데 배양액의 pH가 너무 낮을 경우 산화환원력(redox potential)이 증가하게 되어 전체 배양액의 조건이 산화성으로 전이되므로 이황화 결합에 의한 다량체 형성이 발생할 수 있다. 이를 개선하기 위하여 본 발명에서는 배지의 pH를 4.5 내지 6.0으로 조절할 수 있다. 바람직하게는 배양액의 pH를 5.0 내지 5.5로 조절할 수 있다. 또한, 상기 배양은 25 내지 35 ℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명은 배양된 배지에서 단백질을 분리하고, 브라제인을 정제하기 위한 크로마토그래피 과정을 포함하는 브라제인의 대량 생산방법을 제공한다. 효모 배양액의 배지에 존재하는 단백질에서 본 발명의 브라제인을 분리하는 방법은 당업계에서 사용되는 다양한 분리 및 정제방법을 통해 분리 가능하며, 예를 들어 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 브라제인을 분리할 수 있으나, 본 발명에서는 바람직하기로 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 브라제인을 분리한다. 특히, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 실시 후 탈염 과정을 거치면 높은 순수도와 수율을 가진 브라제인을 생산할 수 있다. 특히 상기 탈염 과정은 단백질 크기 분리형 필터를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서 발현된 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37로 이루어진 아미노산을 가지는 브라제인 및 브라제인 변이체의 효소학적 특성을 정리하면 하기와 같다.

1) 분자량: 6.5 kDa

2) 높은 열 안정성 및 내산성

3) 높은 수용성

4) 1g/100ml의 수크로오스 대비 브라제인 단맛 비율: 약 500 ~약 100,000배 이상

이와 같이, 본 발명에 따른 브라제인은 본 발명자의 특허출원(한국 특허 출원 제2006-97619호)에서 발현, 정제된 브라제인의 부타입의 단백질, 즉 야생형의 브라제인의 부타입의 단백질과 본 발명자의 특허출원(한국 특허 출원 제2007-0117013호, 제2008-0019008호)에서 발현, 정제된 브라제인 변이체 단백질과 비교하였을 때 더 간편한 정제방법을 이용하여 더 높은 생산량을 보이며, 더 높은 정제도를 가지는 것을 그 특징으로 한다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)].

본 발명의 일 실시예에서는 효모 밖 분비 배출 브라제인 및 브라제인 변이체 생산을 암호화하는 재조합 벡터를 제조하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 제조한 재조합 벡터를 이용하여 브라제인을 발현하고 이를 정제하였고, 그 결과 순도 높은 브라제인 변이체를 얻을 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

참조예

1. 기기

폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 기기는 Thermo(Waltham, USA)사의 PCR Sprint를 이용하였고, DNA용 전기영동 (electrophoresis) 장치는 Cosmo Bio co., Ltd.(Tokyo, Japan)의 Mupid-21을 사용하였다. 균을 다루기 위한 무균 작업대는 비전 Bio tech.(Incheon, Korea)사의 Clean bench를 이용하였다. 균을 배양하기 위해 Vision Scientific(Gyeonggi, Korea)사의 Shaking incubator를 이용하였고, 균체 집균을 위한 원심분리기는 한일사(Seoul, Korea)의 HMVC-250Ⅳ와 Micro-17R을 이용하였다. 균체를 분쇄하기 위한 초음파 파쇄기(sonicator)는 Sonics & Materials사(Danbury, USA)의 VCX 400를 사용하였고, Vortex Mixer는 Thermolyne(USA)사의 Type 37600 Mixer를 이용하였다. pH 미터기는 EcoMet사(USA)의 pH/mv/TEMP Meter P25를 사용하였고, 단백질 정량을 위해서 Hitachi사(Tokyo, Japan)의 U-2000 UV/VIS 분광광도계를 이용하였고, 단백질 확인을 위한 HPLC로는 Gilson(France)사의 305 시스템을 이용하였다. DNA 합성은 (주)GenoTech(Seoul, Korea)과 (주)Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, 염기서열 분석은 (주)Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에 의뢰하였다.

2. 시약

PCR 작업을 위한 Ex taq 폴리머라제와 DNA 라이게이션 용액(ligation solution) 및 DNA 작업을 위한 T4 DNA 리가아제, 제한효소 Nco I과 Xho I, 10×K 버퍼, 0.1% BSA, DNA 마커는 TaKaRa(Shiga, Japan) 제품을 사용하였다. 균주 배양을 위한 박토 트립톤, 박토 아가는 Difco laboratories(Detroit, USA) 제품을 사용하였고, 효모 추출액은 Becton Dickinson(Cockeysville, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 아가로오스, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside), TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine), SDS(Sodium lauryl sulfate), trizma^®Base, 글리세롤, 카나마이신 모노설페이트는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, USA) 제품을, 30% 아크릴 아마이드 용액, 브래포드 프로테인 어세이 시약 및 폴리펩타이드 프로테인 마커는 Bio-Rad사(Hercules, USA)의 제품을, DNA 정제를 위한 Wizard^® Plus SV Minipreps DNA purification kit는 Promega(Madison, USA) 제품을 사용하였다. 포타슘 포스페이트(monobasic), 포타슘 포스페이트 (dibasic)은 Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan) 제품을; 히스티딘 바인드 레진은 Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden) 제품을; 부탄올, 소디움 클로라이드, 아세트산은 Duksan Pure Chemical Co.(Kyonggi, Korea) 제품을; 포타슘 클로라이드, 글리신은 Daejung(Incheon, Korea) 제품을 사용하였다. QIAquick^TM gel extraction kit(50)은 Qiagen(Hombrechtikon, Switzerland) 제품을 사용하였다. 그 외 완충용액(buffer)을 만들기 위한 시약과 사용한 모든 시약은 일급 및 특급 시약을 정제하여 사용하였다.

3. 박테리아 균주와 발현벡터

합성한 브라제인을 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 강력한 T7 프로모터(promoter)와 전사종결구(terminator)를 포함하고 있는 발현벡터 pET-26b(+)는 Novagen(Darmstadt, Gemany)으로부터 구입하여 사용하였다. 형질전환을 위해 발현용 숙주인 대장균 DH5α, BL21star(DE3)와 XL1-블루는 Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)와 Promega Coporation(Madison, WI, USA)으로부터 구입하였다.

4. 효모 균주와 발현벡터

야생형 브라제인과 브라제인 변이체 유전자 서열은 클루이베로마이세스 락티스 의 세포 밖으로 단백질을 배출하는 α-메이팅 서열과 Kex 절단 부위를 포함하고 있는 발현벡터 pKLAC2는 New England Biolab(England)으로부터 구입하여 사용하였다. 클루이베로마이세스 락티스에서 브라제인 유전자를 GG799 세포의 게놈 DNA에 삽입시키기 위하여 사용된 발현용 숙주인 GG799 또한 New England Biolab(England)로부터 구입하였다.

5. 단백질 전기영동(SDS-PAGE)

트리스-트리신 겔은 Schagger(1987) 방법에 따라 16.5%의 겔을 만들어 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 쿠마시 블루 R-250을 사용하여 염색하였고, 충분한 탈색을 통해 단백질의 순수도를 확인하였다. 이때, 사용한 분자량 표준 단백질은 트리오세포스페이트 이소머라제(26.6 kDa), 미오글로빈(17 kDa), α-락트알부민(14.4 kDa), 아프로티닌(6.5 kDa)을 포함하고 있는 Bio- rad 사의 Polypeptide SDS-PAGE Melocular Weight Standards를 사용하였다.

6. 단백질의 정량

단백질 정량은 BCA 분석법(Pierce Chemical Co, Rockford IL, USA) 방법에 따라 측정하였으며, 562 nm에서 소태아 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하여 표준 곡선을 작성한 뒤, 단백질 농도를 측정하는데 이용하였다. Bio-Rad사의 단백질 정량 시약과 정제된 브라제인을 상온에서 10분간 반응시킨 후, 210 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하였다.

실시예 1 : 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 제작 및 형질전환

1.야생형 브라제인 및 브라제인 변이체의 효모로의 도입

인체에 보다 무해한 발현계에서 브라제인의 생산을 구축하기 위하여 야생형 브라제인과 브라제인 변이체의 발현을 위해 산업적으로 많이 이용되고 있는 효모 균주인 GRAS(Generally recognized as safe)로 규정된 사카로마이세스 종의 다른 계통 분류인 클루이베로마이세스 락티스를 브라제인을 생산하는 균주로 사용하였다.

효모 발현계로 도입하는 야생형 브라제인 및 브라제인 변이체는 앞선 실험인 대장균 발현계에서 발현 및 정제 과정을 통해 활성도를 비교한 야생형 브라제인 및 브라제인 변이체 중 활성도가 높은 변이체를 선정하였다. 선정된 변이체는 다음의 9종이다. 야생형(minor type), H30R, E35D, E40A, H30R_E35D, H30R_E40A, E35D_E40A, H30R_E35D_E40A, H30R_E35D_E40A_E52K.

효모 발현계로 도입하는 식물로부터 추출한 브라제인의 유전자 서열을 기본으로 하여 아미노산 서열에는 변화를 주지 않는 범위 내에서 DNA 염기서열로 변화를 주어 디자인하였다. 염기서열에 변화를 줄 때에는 클루이베로마이세스 락티스에서의 고발현을 유도할 수 있는 서열을 바탕으로 디자인하였다. 또한, 변이체 작성시 DNA의 삽입 및 결손에 용이하도록 하기 위해 가능한 한 많은 제한효소 자리를 포함하도록 디자인하였다.

2. 발현을 위한 재조합 발현 벡터의 제작 및 효모 게놈 DNA로의 브라제인 유전자 삽입

클루이베로마이세스 락티스의 GG799 세포 바깥으로 목적 단백질인 브라제인이 배출되는 배출 시스템을 이용하기 위하여 클루이베로마이세스 락티스에 사용하는 pKLAC2 벡터[New England Biolab(England)](도 1)의 서열 중 세포 밖으로 단백질을 내보내는 신호서열과 신호서열을 절단하는 Kex 절단 부위(Kex cleavage site)에 해당하는 유전자 서열 다음에 브라제인의 유전자 서열을 삽입하여 브라제인이 세포 밖으로 배출될 수 있도록 설계하였다(도 2). 클로닝한 pUC57-브라제인 유전자를 제한효소 Xho I과 Stu I (10×M 버퍼 사용)을 사용해 37 ℃에서 3시간 절단(digestion)하였다. 발현벡터 pKLAC2 유전자도 브라제인 유전자와 같은 조건으로 절단하였다. 각각의 절단된 유전자를 아가로즈 겔을 사용하여 유전자를 분리한 후, 정제 키트로 유전자를 정제하였다. 정제된 브라제인과 pKLAC2 유전자는 T4 DNA 리가아제(Shiga, Takara) 사용하여 16 ℃에서 2시간 반응하였다. 연결(Ligation) 결과, 생성된 pKLAC2-브라제인의 DNA양을 증가시키기 위해 50 mM CaCl₂에 의해 콤피턴트(competent)화된 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환은 다음과 같이 실시하였다. 라이게이션 샘플 10 ㎕를 DH5α 콤피턴트 셀에 혼합한 후, 42 ℃에서 2 분간 열 충격(heat shock)을 가해 세포막(cell membrane)에 분포하여 있던 pKLAC2-브라제인 유전자가 DH5α 세포 내로 들어가게 하였다(transformation). 이렇게 형질전환시킨 샘플을 항생제 선택법(antibiotic selection)에 의해 pKLAC2-브라제인/DH5α만 분리해 내기 위해서 30 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB-아가 플레이트에서 12시간 배양하였다. 이때, 자란 콜로니(colony)를 액체 LB 배지에 배양하고, Promega의 Wizard^® Plus SV Minipreps DNA purification kit을 이용해 재조합 발현벡터인 pKLAC2-브라제인을 분리하였다(도 3).

상기 pKLAC2-브라제인 유전자를 Stu I과 Xho I으로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동으로 브라제인 유전자를 확인하였다. 아가로오스 겔 전기영동 결과, 발현벡터 pKLAC2는 약 9000 bp에서 브라제인은 약 182 bp에서 각각 그 크기를 나타내었다. 확인된 유전자를 효모 세포로 브라제인을 형질전환하기 위해서 효모 세포의 염색체 내에 브라제인 유전자를 삽입시키는 방법을 택하였다. pKLAC2-브라제인 재조합 유전자를 Sac Ⅱ로 절단하여 선형화하여 고효율 형질전환법을 사용하여 클루이베로마이세스 락티스의 GG799 세포의 gDNA에 삽입하였다(도 4). 형질전환은 다음과 같은 방법을 사용하였다. 50 mL의 YPD 배지를 예열해 놓은 배양 플라스크에 넣고 미리 배양해 놓은 2.5×10⁸개의 GG799 세포를 접종하고 4시간 정도 배양하여 세포의 적정량이 최소 2×10⁷개 이상이 되도록 하였다. 배양이 끝나면 배양액을 3000×g로 5분 동안 원심분리하여 GG799 세포를 집균하였다. 그런 다음, 상층액을 버리고 1 mL의 증류수로 균질화시키고, 이것을 마이크로 튜브에 옮기고 30초 동안 최대 속력으로 원심분리한 뒤, 상층액은 버리고 다시 최종 부피가 1 mL가 되도록 증류수를 넣고 혼합하여 다시 균질화시켰다. 이 균일화된 액체를 100 ㎕씩 마이크로 튜브에 분취한 후 30초 동안 최고 속도로 원심분리하여 상층액을 버렸다. 각각의 형질전환 튜브에 형질전환용 혼합액을 360 ㎕씩 넣고 혼합하여 세포를 다시 균질화시켰다. 그런 다음, 42 ℃의 온욕조에서 40분 동안 방치하고나서 이 튜브를 최고 속도로 30초 동안 원심분리하여 형질전환용 혼합액을 제거하고 1 mL의 증류수를 넣고 집균체를 균질화한 다음, 5 mM의 아세트아미드를 함유하고 있는 고체 YCB 배지 위에 도포하였다. 96시간 가량 지나면 pKLAC2-브라제인 유전자가 성공적으로 삽입되어 아세트아미다아제 부분을 가지고 있는 콜로니가 자라났다. 이 콜로니만을 브라제인의 발현에 이용하였다. 모든 실험 과정은 불 주위가 무균 상태라는 가정 아래 Clean bench에서 진행하였다.

3. 삽입식 형질전환 여부의 판단

1) 단일 삽입 형질전환의 확인

5 mM의 아세트아미드를 포함하고 있는 YCB평판 배지에서 자라난 콜로니 각각을 피펫으로 취하여 2 mg/ml 라이티카아제(Lyticase)를 포함하고 있는 1 M의 소르비톨 25 ㎕로 볼텍스를 이용하여 가용화시킨 후, 30 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 라이티카아제 처리를 한 세포를 용해하기 위하여 98 ℃에서 10분 동안 열을 가하였다. 여기에 10 ㎕의 10×인테그레이션 프라이머(Integration primer) #1, #2[New England Biolab(England)]와 10 ㎕의 2 mM dNTPs, 10 ㎕의 10×ThermoPol 버퍼, 그리고 1 ㎕의 Taq DNA 폴리머라제, 34 ㎕의 증류수를 마이크로튜브에 혼합하여 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 94 ℃ 30초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ 2분으로 구성된 것을 1 주기로 하여 30 주기로 PCR을 하였다. 그 이후에 72 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하는 것으로 PCR을 종료하였다. 반응이 완료되면 반응액 중 10 ㎕를 취하여 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 통해 유전자 삽입(integration) 여부를 확인하였다. 유전자 삽입의 여부는 클루이베로마이세스 락티스 게놈의 LAC4 위치인 2.4 kb에서의 DNA단편으로 확인할 수 있었다(도 5의 A 및 도 6의 A).

2) 다중 삽입 형질전환의 확인

효모 세포로 원하는 유전자를 형질전환 시에는 세포의 게놈(genome)으로 나란히 10개까지도 삽입될 수 있다(도 5). 다중 삽입된 균주의 경우 더 많은 단백질을 배출할 수 있다. YCB 평판 배지에서 자라난, 클루이베로마이세스 락티스의 형질전환체들은 다중 삽입된 콜로니들이 많다. 이것을 확인하기 위해서는 단일 유전자 삽입을 확인할 때와 같이 5 mM의 아세트아미드를 포함하고 있는 YCB 평판 배지에서 자라난 콜로니 각각을 피펫으로 취하여 2 mg/ml 라이티카아제(Lyticase)를 포함하고 있는 1 M의 소르비톨 25 ㎕로 볼텍스를 이용하여 가용화시킨 다음, 30 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그리고 나서 라이티카아제 처리를 한 세포를 용해하기 위하여 98 ℃에서 10분 동안 열을 가하였다. 여기에 10 ㎕의 10×인테그레이션 프라이머 #2, #3[New England Biolab(England)]와, 10 ㎕의 2 mM dNTPs, 10 ㎕의 10×ThermoPol 버퍼, 그리고 1 ㎕의 Taq DNA 폴리머라제, 34 ㎕의 증류수를 마이크로튜브에 혼합하여 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 94 ℃ 30초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ 2분으로 구성된 것을 1 주기로 하여 30 주기로 PCR을 하였다. 그 이후에 72 ℃에서 10분 동안 방치하는 것으로 PCR을 종료하였다. 반응이 완료되면 반응액 중 10 ㎕를 취하여 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 통해 유전자 삽입 여부를 확인하였다. 유전자 삽입의 여부는 클루이베로마이세스 락티스의 게놈의 LAC4 위치인 2.3 kb에서의 DNA단편으로 확인할 수 있었다(도 5의 B 및 도 6의 B).

실시예 2: 브라제인의 발현

상기 브라제인/GG799 세포는 장기 보관을 위해 액체 배양한 시료를 20% 글리세롤 스톡(stock) 상태로 만들어 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

효모 발현계에서 브라제인의 최적 발현 조건을 찾기 위하여, 발현 배지의 종류, 전배양액의 접종 농도, 발현 배지의 pH, 배양온도, 배양 시간의 변화를 주어 실험을 하였다.

발현 배지는 클루이베로마이세스 락티스가 가지고 있는 LAC4 프로모터에 근거하여 갈락토오스를 영양분으로 지니고 있는 YPGal 배지와 락토오스를 영양분으로 지니고 있는 YPLac 배지를 이용하여 배양하여 발현량을 비교하였다.

전 배양액의 접종 농도는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%로 변화시켰으며, 배양 온도는 대장균 발현계에서 최적으로 발현된 30 ℃와 이보다 낮은 25 ℃에서 브라제인을 배양하여 발현량을 비교하였다.

발현 배지의 pH는 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 그리고 배양시간은 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간으로 변화시켜 브라제인을 배양하였고 이에 따른 발현량을 비교하였다.

1. 발현 배지의 변화

YPGal 배지는 효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 갈락토오스 2%, YPLac 배지는 효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 락토오스 2%로 조성되었다. 트리스-트리신 겔 상에서의 발현 상태와 BCA 분석법으로 측정한 발현량을 비교한 결과, YPGal 배지에서의 발현량이 57.2 ㎎/L 이고(도 7), YPLac 배지에서의 발현량이 34.8 ㎎/L으로 나타났다(도 8). YPGal 배지에서의 발현량이 YPLac배지에서의 발현량 보다 약 1.6배 가량 많이 발현되었으므로 조성이 효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 갈락토오스 2% 인 YPGal 배지에서 브라제인을 배양하는 것으로 선택하였다.

2. 발현 배지의 pH 변화

발현 배지의 pH를 아세트산을 이용하여 조절하여 발현 양상을 비교하여 가장 적합한 발현 배지의 pH를 모색하였다.

조성이 효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 갈락토오스 2% 인 YPGal 배지 1L의 pH를 각각 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5로 변화하였다.

트리스-트리신 겔 상에서의 발현 상태와 BCA 분석법으로 측정한 발현량을 비교한 결과, pH 4.5에서의 발현량은 32.8 ㎎/L(도 9), pH 5.0에서의 발현량은 49.5 ㎎/L(도 10), pH 5.5에서의 발현량은 50.51 ㎎/L(도 11), pH 6.0에서의 발현량은 19.55 ㎎/L으로 나타났다(도 12). pH 4.5에서 pH 5.5 범위까지의 발현량은 변화가 크지 않았지만 pH 6.0에서 발현 시에는 발현량이 급격히 감소함을 알 수 있었다. 또한, pH 6.5에서 발현 시 트리스-트리신 겔 상에 나타나는 발현 양상을 보았을 때 브라제인의 이합체 분자량인 13 kDa 부근에서 밴드가 나타나는 것으로 보아 pH가 6.0 이상으로 높아지면 정상적인 브라제인의 발현이 되지 않았다(도 13). 그러므로 브라제인 배양 시 발현 배지의 최적 pH는 pH 5.0 ~ 5.5 범위로 설정하였다.

3. 배양 온도의 변화

대장균 발현계에서 브라제인을 배양할 때의 최적 온도는 30 ℃이므로 효모 발현계에서의 최적 배양온도를 찾기 위해 30 ℃와 이보다 낮은 25 ℃에서 배양하여 낮은 온도 범위에서의 브라제인의 발현 양상을 비교하였다. 트리스-트리신 겔 상에서의 발현 상태와 BCA 분석법으로 측정한 발현량을 비교한 결과, 25 ℃에서의 발현량은 9.44 ㎎/L[도 13], 30 ℃에서는 30.44 ㎎/L로 30 ℃에서 배양하는 것이 약 2.5배 가량 더 효율적인 것으로 나타났다[도 10 및 도 11].

4. 전 배양액의 농도 및 배양 시간의 변화

효모 발현계에서 브라제인을 대량 발현하기 위해서는 평판 배지에서 자라난 콜로니를 채취하여 액체 배지에 접종하여 12시간 동안 전배양을 한 후 전배양액을 미리 만들어 놓은 대량 발현용 배지에 접종하여 배양하였다. 이때, 접종하는 전배양액의 농도를 1%, 2%, 3%, 4%, 5%로 조절하였고, 배양시간 또한 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 동안 배양하여 트리스-트리신 겔 상에서 발현 양상을 비교하였다(도 15). 그 결과, 전배양액의 접종 농도에 따른 변화는 급격하지 않았으며 트리스-트리신 겔 상에서의 발현양상으로 보아 2% 접종, 96시간 동안 배양했을 때 다른 종류의 잡다한 단백질의 발현량이 거의 없고 브라제인의 발현이 뚜렷하게 나타났으므로 이것을 브라제인 배양의 조건으로 정하였다.

실시예 3: 브라제인의 정제

1. CM 셀룰로오스 양이온 교환수지 컬럼을 이용한 브라제인의 정제

대량 발현된 브라제인/GG799 균체를 7,000 g, 4 ℃, 15분간 원심분리하여 균체와 배지를 분리하였다. GG799 균체는 목적 단백질인 브라제인을 세포 밖으로 내보내는 배출 경로를 따르므로 모아진 균체는 버리고 배지를 취하였다. 모아진 배지는 아세트산을 이용하여 pH 5.0으로 pH 값을 조절한 뒤 CM 셀룰로오스 양이온 교환수지 컬(CM 컬럼)을 통해 정제하였다. 100 ㎖ 용량의 CM 컬럼은 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH 4.0) 150 ㎖로 균일화시켰다. pH 값을 미리 조절을 해 둔 배지를 1 ㎖/min의 속도로 CM 컬럼에 단백질을 흡착시켰다. 배양액 1 L를 모두 로딩하고 난 후에 불필요한 단백질을 제거하기 위하여 0.1 M의 NaCl을 포함하고 있는 50 mM 소디움 아세테이트를 500 ㎖ 정도를 흘려주고 그 용액의 OD₂₈₀ 값을 측정하여 0에 최대한 근접한 값이 나오는 것을 확인하였다. 그런 다음, 목적 단백질인 브라제인을 용출하기 위하여 0.4 M의 NaCl을 포함하고 있는 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액을 1 ㎖/min의 속도로 용출시켜 각각 5 mL의 18개 분획을 얻었다.

2. 겔 여과법을 이용한 탈염

CM 셀룰로오스 양이온 교환수지 컬럼 정제로부터 얻은 분획들은 동결건조 후 2 ㎖의 증류수에 녹여 총 5개의 분획으로 농축하였으며, 이때 포화되어 녹지 않는 NaCl 외 상층액만을 취하였다. 농축된 분획은 20 mL의 세파덱스 G-25를 이용하여 탈염과정을 거쳤다. 1 ㎖의 분획을 컬럼에 통과시키고 뒤이어 증류수 10 ㎖를 통과시켜 분획을 받아내었다. 이때, 크기가 큰 단백질은 앞쪽의 분획들에 존재하고 상대적으로 크기가 작은 NaCl을 비롯한 불순물들은 뒤쪽의 분획들에 분포하므로 OD₂₈₀ 값을 측정하여 단백질이 존재하는 구간에 존재하는 분획을 얻었다. 이 과정이 끝난 분획들은 BCA 분석법을 통해 정량하였고, 동결건조하였다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 16).

3. 단백질 크기 분리형 필터(cut-off filter)를 이용한 탈염

CM 셀룰로오스 양이온 교환수지 컬럼 정제를 통해 얻은 분획을 3,000 분리형 필터를 이용하여 5,000 g, 20 ℃, 1시간의 조건으로 원심분리하여 1/5로 농축하였다(도 17). 그리고 부피의 10배에 해당하는 양의 증류수를 첨가한 뒤 위와 같은 과정을 2번 반복하여 거치며 농축과 탈염을 거쳤다. 그리고 나서 이 과정이 끝난 분획들은 BCA 분석법을 통해 정량하였다. 순수도를 측정하기 위해 트리스-트리신 겔 전기영동(도 17)과 HPLC 분석을 실시하였다(도 18). HPLC 분석을 위한 컬럼은 C18 5micron 150×4.6 컬럼을 사용하였고, 검출파장은 210 nm, 컬럼 온도는 상온, 분당유속은 0.5 ml, 이동상 용매로는 A 용매로 0.05% TFA - 증류수, B 용매로 0.05% TFA-아세토니트릴을 사용하여 농도구배 조건으로 분석하였다. 정제된 브라제인은 약 21분에 하나의 피크로 용출되었다(도 18의 A). 참고로 완충용액은 같은 조건에서 약 5분에 용출되었다(도 18의 B).

4. 브라제인 변이체의 정제

브라제인 야생형으로 결정된 배양 및 정제 조건을 이용하여 브라제인 변이체들도 정제하였다.

전체적인 배양 및 정제조건들은 도 19에 나타냈다. 정제된 브라제인 단백질의 순수도는 트리스-트리신 겔을 통해 확인하였다(도 20).

실시예 4: 브라제인 활성 측정

브라제인은 당이 아닌 단백질이므로 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없다. 따라서, 브라제인은 직접 맛을 봄으로써 그 활성을 측정할 수 있다. 사람마다 단맛을 처음 느끼게 되는 역치의 값은 다르기 때문에 설탕 용액과 브라제인 용액의 단맛을 처음 느끼는 농도를 비교하여 활성을 측정하였다. 피실험자는 사전에 훈련된 남성 10명, 여성 10명으로 구성하였다. 먼저, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50 M 농도로 녹인 표준 설탕 용액을 차례로 맛을 보고, 처음으로 단맛을 느끼는 농도를 체크한 후, 마찬가지로 브라제인 야생형 및 브라제인 변이체를 단계별 농도로 녹인 다음 용액의 단맛을 보고 역치 값으로 느끼는 단계의 농도를 체크하여 설탕과 브라제인 야생형 및 브라제인 변이체와의 단맛의 상대 활성을 측정하였다.

수크로오스에 비해 야생형 브라제인은 대장균 발현계와 마찬가지로 약 800배 더 단맛을 내는 것으로 나타내었다(도 21). 또한, 3차 브라제인 변이체와 4차 브라제인 변이체는 수크로오스에 비해 각각 약 10,000배, 100,000배의 단맛을 나타내는 것으로 나타났다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Recombinant expression vector for expression of brazzein and mass production method of brazzein using the same <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-Mating signal sequence <400> 1 atgaaattct ctactatatt agccgcatct actgctttaa tttccgttgt tatggctgct 60 ccagtttcta ccgaaactga catcgacgat cttccaatat cggttccaga agaagccttg 120 attggattca ttgacttaac cggggatgaa gtttccttgt tgcctgttaa taacggaacc 180 cacactggta ttctattctt aaacaccacc atcgctgaag ctgctttcgc tgacaaggat 240 gatctcgaga aaagagaggc tgaagctaga agagctagat ctcctagggg taccgtcgac 300 ggcgcgcctg cggccgctta a 321 <210> 2 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type brazzein gene <400> 2 gacaaatgca aaaaagttta cgaaaattac ccagtttcta agtgccaact ggccaatcaa 60 tgcaattacg attgcaagct tgataagcat gctcgatctg gagaatgctt ttacgatgaa 120 aagagaaatc ttcaatgcat ttgcgattac tgcgaatact agtaa 165 <210> 3 <211> 165 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Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg Ser Gly Glu Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 21 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 21 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg Ser Gly Glu Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 22 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 22 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg Ser Gly Asp Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 23 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 23 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg Ser Gly Glu Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 24 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 24 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg Ser Gly Asp Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 25 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 25 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg Ser Gly Glu Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 26 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 26 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg Ser Gly Asp Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 27 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 27 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg Ser Gly Asp Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr 145 150 155 <210> 28 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein combination <400> 28 Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ile Ser Val 1 5 10 15 Val Met Ala Ala Pro Val Ser Thr Glu Thr Asp Ile Asp Asp Leu Pro 20 25 30 Ile Ser Val Pro Glu Glu Ala Leu Ile Gly Phe Ile Asp Leu Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Val Ser Leu Leu Pro Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Ile 50 55 60 Leu Phe Leu Asn Thr Thr Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ala Asp Lys Asp 65 70 75 80 Asp Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Ala Arg Ser Pro Arg 85 90 95 Gly Thr Val Asp Gly Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Cys Lys Lys Val 100 105 110 Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn 115 120 125 Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg Ser Gly Asp Cys Phe Tyr 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys Asp Tyr Cys Lys Tyr 145 150 155 <210> 29 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type brazzein <400> 29 Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Asn Gln Cys Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg 20 25 30 Ser Gly Glu Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys 35 40 45 Asp Tyr Cys Glu Tyr 50 <210> 30 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein(H30R) <400> 30 Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Asn Gln Cys Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys Arg Ala Arg 20 25 30 Ser Gly Glu Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys 35 40 45 Asp Tyr Cys Glu Tyr 50 <210> 31 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein(E35D) <400> 31 Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Asn Gln Cys Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg 20 25 30 Ser Gly Asp Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys 35 40 45 Asp Tyr Cys Glu Tyr 50 <210> 32 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein(E40A) <400> 32 Asp Lys Cys Lys Lys Val 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Claims

클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 브라제인 발현용 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 브라제인 유전자는 야생형 브라제인 유전자 또는 브라제인 변이체 유전자인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열번호 11 내지 서열번호 19로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브라제인 발현용 재조합 발현벡터.
제4항에 있어서, LAC4 작동 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제4항에 있어서, pKLAC2-브라제인인 재조합 발현벡터.
제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis).
제7항의 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 배양하는 단계;
상기 배양액에서 균체를 제거하여 정제하는 단계; 및
탈염과정을 수행하는 단계
를 포함하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 배양은 질소 공급원으로 효모 추출물 0.5 내지 5% 및 펩톤 0.5 내지 5%로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하고, 탄소 공급원으로는 갈락토오스 1 내지 4%, 글루코오스 1 내지 4%, 젖당 1 내지 4% 및 전분 1 내지 4%로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 배지에서 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 배양은 효모 추출물 0.5 내지 5%, 펩톤 0.5 내지 5% 및 갈락토오스 1 내지 4%를 포함하는 배지에서 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 배양은 pH 4.5 내지 6.0에서 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 배양은 pH 5.0 내지 5.5에서 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 배양은 25 내지 35 ℃에서 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 정제는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 실시하는 브라제인의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 탈염은 분리형 필터(cut-off filter)를 이용하여 실시하는 브라제인의 생산방법.