KR102315036B1

KR102315036B1 - 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 생산 방법

Info

Publication number: KR102315036B1
Application number: KR1020200092359A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 박세웅; 장시욱
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2021-10-21

Abstract

본 발명은 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 생산 방법 등에 관한 것으로, 본 발명자들은 본 발명의 짠맛 펩타이드 유전자를 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로 인증된 효모 Kluyveromyces lactis 균주에 도입하여 발현을 유도하였으며, 염미성 펩타이드의 최적화된 생산 방법을 도출하였다. 본 발명에서 효모 발현계를 이용하여 개발한 고효율의 염미도를 가진 염미성 펩타이드를 식염대체물질로 이용한다면 고혈압 등의 심장병이나 혈관계 질환들로 맛을 즐길 수 없는 환자들에게도 염미성 펩타이드를 섭취함으로써 칼로리 혹은 염 수치에 상관없이 짠맛을 느낄 수 있게 하는 대체 염미료로 사용할 수 있을 것이다.

Description

염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 생산 방법{Recombinant expression vector for expression of Salty peptides and production method using the same}

본 발명은 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 염미성 펩타이드의 생산 방법 등에 관한 것이다.

염(염화나트륨)은 음식물의 조미 및 가공에 있어서, 음식물에의 맛 부여, 음식물의 보존성 향상, 음식물의 물성 개선 등의 중요한 역할을 하고 있다. 식염은 특히 맛있다고 느끼게 하는 맛(식염미)을 음식물에 부여하며, 그 구성성분인 나트륨과 염소는 인체의 필수영양소이다.

그러나, 식염의 구성성분인 나트륨의 과잉섭취는 많은 건강문제, 예로서 고혈압 등의 심장병이나 혈관계 질환의 위험인자가 되는 것으로 여겨지고 있다. 일본은 물론 여러 선진국에서는 이들 질환에 걸리기 쉬운 고령자층의 증가에 따라 식염, 특히 나트륨의 섭취량의 감소가 강하게 요구되고 있다.

식염섭취량의 감소를 위해서는 음식물의 조미 및 가공에 있어서 식염의 사용량을 감소시키는 것이 가장 단순한 방법이다. 그러나, 가정 조리식품이든 가공음식물이든 음식물에 함유되는 식염량을 10% 이상 감소시키면 그 음식물의 미감은 일반적으로 손상받게 된다.

식염미를 손상시키지 않고 식염, 특히 나트륨의 섭취량을 감소시키는 방법, 즉 일반적으로 감염(減鹽) 방법이라고 하는 것으로는, 그 자신이 식염미를 띠는 물질(이하, 식염대체물질이라고 함)을 사용하는 방법과, 그 자신이 식염미를 띠지는 않지만 식염과 공존시 그 식염미를 증강하는 물질(이하, 식염미 증강물질이라고 함)을 사용하는 방법 등이 알려져 있다.

식염대체물질로는 예로서 칼륨염, 암모늄염, 염기성 아미노산, 염기성 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 및 글루콘산의 알칼리금속염 등이 알려져 있다. 식염미 증강물질은 식염을 대체할 수는 없으나 식염의 식염미를 증강시킴으로써 식염의 사용량을 감소시켜, 감염을 가능하게 하는 물질이다.

식염미 증강물질로는 예로서 분자량이 50,000달톤(Da) 이하의 콜라겐을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드(특허문헌 1), 시트르산 생산능을 갖는 흑국균(Aspergillus niger)으로 제국된 흑국, 및 황국균(Aspergillus oryzae)으로 제국된 황국의 혼합물을 소화시켜 수득한 분해 용액 등이 알려져 있다.

또한, 국내에서는 재래 간장으로부터 짠맛 단백질을 발견한 바 있으나, 이 짠맛 단백질은 분자량이 500Da에서 10,000Da에 이르며, 만노스(mannose)와 N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamin)의 당이 수식된 고분자로서, 구체적인 서열이 밝혀지지 않았으며 숙성과정을 거친 후에 추출해야 얻을 수 있어 제조과정이 번거롭다고 알려져 있다[특허문헌 2].

한편, 메틸이용성 효모(methylotrophic yeast)인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 숙주로 하여 식품 관련 감미성 단백질인 브라제인을 유전공학적 방법으로 생산하는 방법이 알려져 있다[특허문헌 3]. 효모 알파-메이팅인자(MF-α) 신호 서열(signal sequence)과 브라제인을 암호화하고 있는 유전자를 연결한 뒤, 이를 AOX1 작동유전자(promoter)를 포함하고 있는 재조합 벡터에 삽입하여, 새로운 형질전환 벡터를 생성한 후, 이를 메틸이용성 효모(methylotrophic yeast)인 피키아 파스토리스에 형질전환하여 최종 재조합 효모 균체 밖 배지로 발현된 브라제인 단백질을 분비, 발현하는 방법이다. 또한, 효모 출아형 효모(budding yeast)이며, 제빵 및 양조에 사용되는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 브라제인 생산 방법도 알려져 있다. 그러나, 피키아 파스토리스의 경우, 200mg/L 또는 70mg/L의 높은 수율을 가짐에도 불구하고 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주가 아니며, 탄소원이나 전사유도제로 사용되는 메탄올이 폭발의 위험성이 있으며, 특히 목적 단백질이 식품과 관련이 있는 경우는 메탄올 이용의 제한이 따르는 단점을 가지고 있어 염미성 펩타이드의 발현에는 부적합하다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애의 경우는 그 생산량이 5mg/L으로 한계가 있어, 대량 생산에 의한 상업화가 곤란하다는 단점이 있었다.

일본 공개특허공보 소63-3766 호 국내 특허 등록 제1126163호 국제특허 WO 1999/025835호

본 발명자들은 본 발명의 짠맛 펩타이드 유전자를 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로 인증된 효모 Kluyveromyces lactis 균주에 도입하여 발현을 유도하였으며, 짠맛 펩타이드의 최적화된 생산에 관한 연구를 진행하였으며, 발현하고자 하는 펩타이드를 40개 반복되는 긴 사슬 형태로 발현한 뒤 절단효소로 처리하여 생산하는 방법과 단일 펩타이드로 분비 발현하는 두 가지의 상이한 발현 벡터를 구축하였다. 또한 펩타이드에 의해 유도된 짠 맛의 메커니즘을 이해하기 위하여, 컴퓨터 모델링을 통하여 짠맛 수용체의 후보인 TRPV1과 짠맛 펩타이드 사이의 상호작용에 대한 주요 결합 부위를 예측한 결과를 기반으로, TRPV1과 더 강한 상호작용이 가능할 것으로 예측되는 4개의 새로운 짠맛 펩타이드를 설계하였다.

이에, 본 발명의 목적은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열; 및 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 효모를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 효모 또는 이의 배양액으로부터 염미성 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 염미성 펩타이드의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 염미성 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 염미성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식염 대체재를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열; 및

서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 서열번호 13으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 발현벡터는 LAC4 작동 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 발현벡터는 pKLAC2 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 1 내지 100회 반복되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1에 개시된 pKLAC2-DKHAR의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 발현벡터는 도 2에 개시된 pKLAC2-KKRAR의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 15 또는 서열번호 16으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 효모는 클루이베로마이세스 락티스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 효모를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 효모 또는 이의 배양액으로부터 염미성 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 염미성 펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 (b)는 제1항의 재조합 발현벡터의 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 2회 이상 반복되어 있는 경우, 분리 및 정제하는 단계에 엔도펩티다아제를 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 염미성 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 염미성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식염 대체재를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 염미성 펩타이드의 식염 대체재 용도를 제공한다.

본 발명자들은 본 발명의 짠맛 펩타이드 유전자를 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로 인증된 효모 Kluyveromyces lactis 균주에 도입하여 발현을 유도하였으며, 짠맛 펩타이드의 최적화된 생산 방법을 도출하였다. 본 발명에서 효모 발현계를 이용하여 개발한 고효율의 염미도를 가진 염미성 펩타이드를 식염대체물질로 이용한다면 고혈압 등의 심장병이나 혈관계 질환들로 맛을 즐길 수 없는 환자들에게도 염미성 펩타이드를 섭취함으로써 칼로리 혹은 염 수치에 상관없이 짠맛을 느낄 수 있게 하는 대체 염미료로 사용할 수 있을 것이다.

또한, TRPV1과 더 강한 상호작용이 가능할 것으로 예측되는 4개의 새로운 짠맛 펩타이드가 설계되었는 바, 본 발명의 짠맛 펩타이드를 응용하여 소금을 대체할 수 있는 새로운 식염대체제로 개발 가능하므로 현대 질병에서 가장 큰 문제가 되는 성인병을 예방할 수 있는 우수한 대체제로 사용되리라 기대된다.

도 1은 pKLAC2-DKHAR 발현 플라스미드 작제물을 도시한 것이다.
도 2는 pKLAC2-KKRAR 발현 플라스미드 작제물을 도시한 것이다.
도 3은 분자 모델링에 의한 TRPV1의 예측 구조를 도시한 것이다.
도 4는 염미성 펩타이드와 TRPV1의 도킹 모델을 도시한 것이다(파랑:DKHAR, 초록:DEKR, 핑크:KKRAR)
도 5는 염미성 펩타이드 DKHAR의 발현 및 정제 결과를 나타낸 것이다. 레인 M은 SDS-PAGE 분자량 표준을 나타내며, 레인 1은 배양 상층액, 레인 2는 배양 상층액으로부터 정제된 염미성 펩타이드 'DKHAR’을 나타낸다.
도 6은 세포 용해물에서 염미성 펩타이드 DKHAR의 발현 및 정제 결과를 나타낸 것이다. 레인 M은 SDS-PAGE 분자량 표준을 나타내며, 레인 1은 세포 용해물, 레인 2는 세포 용해물로부터 정제된 염미성 펩타이드 ‘DKHAR’을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용된 용어, “형질전환”은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에게 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.

본 발명에서 사용된 용어, “재조합”은 본 발명의 효모가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩타이드, 이종의 펩타이드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 효모를 지칭하는 것이다. 재조합 효모는 상기 효모의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 효모는 천연 상태의 효모에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 효모 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “재조합 벡터”는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주에서 발현 가능할 수 있다. 숙주의 종류에 따라 프로모터(promotor), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고, 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현”은 폴리펩타이드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭하며, 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 “고발현”은 정상 상태의 카피수보다 많은 전사체가 생산된 상태를 의미한다.

먼저, 본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열; 및

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

본 발명에서 사용되는 “작동 가능하게 연결된”이라는 용어는 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.

상기 '작동 유전자'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 작동 유전자로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 효모 LAC 프로모터, GAL 프로모터(Rosaura Rodicio et al.,Microbiology 152(2006), 2635-2649), KlADH4 프로모터(Michele Saliola et al., Appl Environ Microbiol. 1999 January; 65(1): 53-60), 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터(미국 특허 제6,596,513호), PGK1 프로모터(V. Melvydas et al., BIOLOGIJA, 4:1-4, 2006) 등이 있다. 이외에도 미국 특허 제227,326호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터는 LAC4 작동 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

효모의 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 신호서열의 일종으로, 단백질이 효모 내에서 합성되면 소포체로 이동하여 정확한 이황화 결합을 유도하고, 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며 올바른 접힘을 유도한다. 이때, 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 신호서열 일부가 잘려나가게 되며, 이후 골지체로 이동하여 Kex 펩티다제(Kex protease)에 의해 나머지 신호 서열이 모두 제거되고, 천연의 단백질 형태로 배지로 방출되게 된다. 상기 신호서열의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 알파-메이팅 신호서열, 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열, KT 신호서열, 사카로마이세스 세레비지애 pre-SUC2 신호서열 등이 알려져 있다.

그러나, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 알파-메이팅 신호서열 사용시 분비된 단백질의 N-말단 서열이 100% 야생형이 아닐 수 있음이 밝혀졌다. 이 신호서열을 사용할 경우 분비된 단백질의 N-말단 서열 분석 시 야생형의 단백질 서열 앞에 약 6개의 아미노산(Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala) 서열이 더 추가되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 세포막에 존재하는 시그널 펩티다제의 부족으로 인해 분비된 단백질의 100%를 수용하지 못하고, 일부는 신호서열이 완전히 잘리지 않은 채 배지로 방출된 것으로 추측하고 있다.

이에, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 서열번호 13으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열과 염미성 펩타이드를 암호화하는 서열번호 7 내지 12으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 각각 연결된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기와 같이 클루이베로마이세스 락티스 알파-메이팅 신호서열과 염미성 펩타이드를 암화하는 폴리뉴클레오티드를 통합해서 "염미성 펩타이드 조합체(combination)"로 명명하였다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 pKLAC2 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 1 내지 100회, 1 내지 90회, 1 내지 80회, 1 내지 70회, 1 내지 60회, 1 내지 50회, 10 내지 50회, 20 내지 50회, 20 내지 45회, 30 내지 45회, 35 내지 45회, 37 내지 42회 또는 약 40회 반복되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는, 염미성 펩타이드의 정제를 편리하게 하기 위하여 1 내지 10개의 히스티딘(His)으로 포함된 아미노산을 염미성 펩타이드에 연결할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 염미성 펩타이드의 C 말단에 8개의 히스티딘 서열을 첨가하였다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 Kex cleavage site(KR), 목적단백질 반복서열(DKHARx40), 8xHis tag, Asp-N 엔도펩티다아제를 통해 제거를 위한 Asp(D) 잔기(DHHHHHHHH) 및 종결코돈을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 알파메이팅 펙터 서열, Kex cleavage site(KR), 목적단백질, 종결코돈 및 DNA 삽입을 위한 절단부위(RP, 염기서열 AGGCCT)를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 도 1에 개시된 pKLAC2-DKHAR의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 도 2에 개시된 pKLAC2-KKRAR의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 효모는 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환 방법에 따라 형질전환되고, 이때 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 초산화 리튬(LiCH₃COO)법, 염화 리튬(LiCl)법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 운반 DNA 융합법(Carrier-DNA mediated fusion) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 효모를 배양하는 단계; 및

상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 2회 이상 반복되어 있는 경우, 분리 및 정제하는 단계에 엔도펩티다아제를 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 염미성 펩타이드가 40개의 반복된 긴 사슬의 형태로 발현된 것에 Asp-N 엔도펩티다아제를 처리함으로써 단일 펩타이드를 수득하였다.

본 발명은 상기 형질전환된 효모를 배양하고, 염미성 펩타이드를 최적의 효율로 발현시키는 배양 배지 조성을 제공한다. 상기 형질전환된 효모가 배양되는 동안, 발현벡터 내의 발현 조절 서열에 의해 알파-메이팅 신호서열을 포함하는 염미성 펩타이드가 발현되고, 이러한 본원발명에서의 염미성 펩타이드의 발현은 젖당(lactose), 갈락토오스(galactose), 글로코오스(glucose), 녹말(starch), 펩톤(peptone)과 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물에 의해 이루어진다. 발현된 α-Mating 신호서열을 포함하는 염미성 펩타이드는 신호서열에 의해 효모의 소포체로 이동하게 되고, 효모의 시그널 펩티다제(signal peptidase)와 Kex 펩티다제(Kex peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 염미성 펩타이드가 합성되게 된다. 따라서, 본 발명의 염미성 펩타이드 발현 재조합 발현벡터를 포함하도록 형질전환된 효모는 염미성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있다.

상기 배지는 질소 공급원으로 효모 추출물 또는 펩톤을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 탄소 공급원 및 발현 유도제로 갈락토오스, 글루코오스, 락토오스 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 효모 추출물을 5 내지 20g/L 또는 5 내지 15g/L 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 펩톤을 10 내지 30g/L 또는 15 내지 25g/L 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 글루코오스를 5 내지 20g/L 또는 5 내지 15g/L 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 갈락토오스를 5 내지 20g/L 또는 5 내지 15g/L 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 배양은 5 내지 50℃, 10 내지 45℃, 10 내지 40℃, 15 내지 40℃, 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 또는 28 내지 32℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 배양된 배지에서 염미성 펩타이드를 분리하고, 염미성 펩타이드를 정제하기 위한 크로마토그래피 과정을 포함하는 염미성 펩타이드의 대량 생산방법을 제공한다. 효모 배양액의 배지에 존재하는 단백질에서 본 발명의 염미성 펩타이드를 분리하는 방법은 당업계에서 사용되는 다양한 분리 및 정제방법을 통해 분리 가능하며, 예를 들어 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 염미성 펩타이드를 분리할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하기로 양이온 교환 크로마토그래피 또는 His 태그 친화성 크로마토그래피를 사용하여 염미성 펩타이드를 분리할 수 있다. 특히, 상기 크로마토그래피 실시 후 탈염 및/또는 세척 과정을 거치면 높은 순수도와 수율을 가진 염미성 펩타이드를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 단백질 발현량을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 웨스턴 블롯팅, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다[Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)].

본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 제조한 재조합 벡터를 이용하여 염미성 펩타이드를 발현하고 이를 정제하였고, 그 결과 순도 높은 염미성 펩타이드를 얻을 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 염미성 펩타이드를 포함하는 식염 대체재를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 염미성 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 기존의 당이 수식된 고분자 펩타이드(분자량이 500~10000Da)와는 달리 4~5개의 아미노산으로 이루어진 짧은 펩타이드로, 제조가 용이할 뿐만 아니라 염을 직접 섭취하지 않기 때문에 나트륨의 섭취를 줄일 수 있고, 칼로리가 거의 없기 때문에 저칼로리 음식으로 응용할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명의 식염미 대체재 또는 식품 첨가제의 대상이 되는 식품으로는 식염을 함유하지 않는 음식물이든 식염을 함유하는 음식물이든, 먹을 때 식염이 함유되는 식품이라면 특별한 제한은 없다. 식품으로 예를 들면, 국, 찌개, 탕 등의 국물, 고추장, 청국장, 된장, 간장, 소스, 드레싱, 마요네즈, 토마토 케찹 등의 조미료, 일본식 맑은 국과 같은 맑은 국, 콘소메 스프, 계란 스프, 미역 스프, 상어 지느러미 스프, 포타쥬(potage), 된장국 등의 스프류, 면류(메밀 국수, 우동, 라면, 파스타 등)용 국물 및 소스류, 죽, 야채 및 쌀의 포리지(porridge), 및 찻물에 말은 밥 등의 쌀 조리 식품, 햄, 소시지, 치즈 등의 축산 가공품, 어묵, 건어물, 젓갈, 진미(chinmi) 등의 수산 가공품, 피클 등의 야채 가공품, 포테이토 칩, 전병, 쿠키 등의 스낵류, 가열 식품, 튀긴 식품, 구운 식품, 카레 등의 조리된 식품 등을 들 수 있다.

상기 식염미 대체재, 식염미 증강제 및/또는 식품 첨가제는 염기성 물질 및/또는 숙신산을 함유하고, 더 필요하다면 무기염, 산, 아미노산류, 핵산, 당류, 부형제 등의 음식물에 사용할 수 있는 각종 첨가물을 함유할 수 있다.

상기 무기염으로는 식염, 염화칼륨, 염화암모늄 등을 들 수 있다. 상기 산으로는 아스코르브산, 푸마르산, 말산, 주석산, 시트르산, 지방산 등과 같은 카르복실산 및 이들의 염 등을 들 수 있다. 상기 염으로는 나트륨 및 칼륨염을 들 수 있다. 상기 아미노산으로는 글루타민산 나트륨, 글리신 등을 들 수 있다. 상기 핵산으로는 이노신산 나트륨, 구아닐산 나트륨 등을 들 수 있다. 상기 당류로는 자당, 포도당, 유당 등을 들 수 있다. 상기 부형제로는 전분 가수분해물인 덱스트린, 각종 전분 등을 들 수 있다. 이들의 사용량은 사용목적에 따라 적절히 설정할 수 있는데, 예로서 펩타이드 100 중량부 당 0.1 내지 500 중량부를 사용할 수 있다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 방법

1.1 염미성 펩타이드의 발현

효모 K. 락티스(Kluyveromyces lactis) GG799를 염미성 펩타이드의 합성 유전자로 형질 전환시켰다.

도 1에 나타난 바와 같이, 염미성 펩타이드 'DKHAR(서열번호 1)'의 발현을 위해, 상기 펩타이드의 40회 반복 형태를 하나의 긴 폴리펩타이드 사슬로 발현시키고, His- 태그 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제를 용이하게 하기 위해 C-말단에 8개의 히스티딘 서열을 첨가하였다.

한편, 도 2에 나타난 바와 같이, 염미성 펩타이드 ‘KKRAR(서열번호 2)’은 단일 펩타이드로 발현되었다.

염미성 펩타이드를 발현시키기 위해, YPDG 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤, 10g/L 글루코오스 및 10g/L 갈락토오스)를 사용하였다. 배양은 2L 삼각 플라스크를 사용하였으며, 500mL의 발현 배지에서 30℃에서 72 시간 동안 200rpm의 진탕 배양기에서 수행되었다. 지연 단계(lag phase) 동안 유도제를 첨가하였다. 배양 후, 상청액을 8,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 수득하였다. 접종원(inoculum)의 경우, 세포를 YPD 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤 및 20g/L 글루코오스)에서 200rpm으로 18시간 30℃로 배양하였다. 세포 배양 배지의 2%를 발현 배지에 접종하였다.

	GENE	SEQUENCE
서열번호 13	α-mating factor	ATGAAATTCTCTACTATATTAGCCGCATCTACTGCTTTAATTTCCGTTGTTATGGCTGCTCCAGTTTCTACCGAAACTGACATCGACGATCTTCCAATATCGGTTCCAGAAGAAGCCTTGATTGGATTCATTGACTTAACCGGGGATGAAGTTTCCTTGTTGCCTGTTAATAACGGAACCCACACTGGTATTCTATTCTTAAACACCACCATCGCTGAAGCTGCTTTCGCTGACAAGGATGATCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGAAGAGCTAGATCTCCTAGGGGTACCGTCGACGGCGCGCCTGCGGCCGCTTAA
서열번호 14	LAC4	GGGGATCGACTCATAAAATAGTAACCTTCTAATGCGTATCTATTGACTACCAACCATTAGTGTGGTTGCAGAAGGCGGAATTTTCCCTTCTTCGAATTTAGCTTGCTTTTTCATTTTTTATTTTCCATTTTTCAGTTTTTGTTTGTGTCGAATTTAGCCAGTTGCTTCTCCAAGATGAAAAAAACCCCTGCGCAGTTTCTGTGCTGCAAGATCCTAATCGACTTTTCCACCCCCCACAAAAGTAAATGTTCTTTTGTTACATTCGCGTGGGTAGCTAGCTCCCCGAATCTTCAAAGGACTTAGGGACTGCACTACATCAGAGTGTGTTCACCTGGTTTGCTGCCTGGTTTGAAAGAAAAGAGCAGGGAACTCGCGGGTTCCCGGCGAATAATCATGCGATAGTCCTTTGGCCTTCCAAGTCGCATGTAGAGTAGACAACAGACAGGGAGGGCAGGAAGGATCTTTCACTGAGATCCTGTATCTTGTTGGGTAAGTCGGATGAAAGGGGAATCGTATGAGATTGGAGAGGATGCGGAAGAGGTAACGCCTTTTGTTAACTTGTTTAATTATTATGGGGCAGGCGAGAGGGGGAGGAATGTATGTGTGTGAGGCGGGCGAGACGGAGCCATCCAGGCCAGGTAGAAATAGAGAAAGCCGAATGTTAGACAATATGGCAGCGTAGTAGAGTAGGTAGGTAGGCAAGTACTGCTAGCAAAGAGGAGAAGGGTAAGCTCACTCTTCGCATTCCACACCGTTAGTGTGTCAGTTTGAACAAAAAAACAATCATCATACCAATTGATGGACTGTGGACTGGCTTTTGGAACGGCTTTTCGGACTGCGATTATTCGTGAGGAATCAAGGTAGGAATTTGGTCATATTTACGGACAACAGTGGGTGATTCCCATATCGAGTAGGAAAACGAGATCATGGTATCCTCAGATATGTTGCGGAAATCTGTTCACCGCAAAGTTCAGGGTGCTCTGGTGGGTTTCGGTTGGTCTTTGCTTTGCTTCTCCCTTGTCTTGCATGTTAATAATAGCCTAGCCTGTGAGCCGAAACTTAGGGTAGGCTTAGTGTTGGAACGTACATATCTATCACGTTGACTTGGTTTAACCAGGCGACCTGGTAGCCAGCCATACCCACACACGTTTTTTGTATCTTCAGTATAGTTGTGAAAAGTGTAGCGGAAATTTGTGGTCCGAGCAACAGCGTCTTTTTCTAGTAGTGCGGTCGGTTACTTGGTTGACATTGGTATTTGGACTTTGTTGCTACACCATTCACTACTTGAAGTCGAGTGTGAAGGGTATGATTTCTAGTGGTGAACACCTTTAGTTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTACTTGAGATTTCGATTGAGAAAAAGGTATTTAATAGCTCGAATCAATGTGAGAACAGAGAGAAGATGTTCTTCCCTAACTCGAAAGGTATATGAGGCTTGTGTTTCTTAGGAGAATTATTATTCTTTTGTTATGTTGCGCTTGTAGTTGGAAAAGGTGAAGAGACAAAAGCTGGAATTGTGAGCGGATAACAAGCTCAACACTTGAAATTTAGGAA
서열번호 15	pKLAC2-DKHAR 삽입 유전자의 염기 서열	AAAAGAGACAAACACGCCAGGGATAAGCACGCTAGAGACAAACATGCAAGAGATAAGCATGCCAGGGACAAACATGCTAGGGATAAACACGCTCGTGATAAGCACGCCAGAGATAAGCACGCAAGAGACAAACACGCAAGAGACAAACATGCTAGGGACAAACATGCCCGTGATAAGCACGCACGTGACAAACATGCAAGAGACAAGCACGCTCGTGACAAGCACGCCCGTGATAAACACGCCCGTGATAAACATGCACGTGATAAGCACGCTCGTGATAAACATGCAAGGGATAAGCATGCAAGGGATAAGCATGCTAGAGATAAACATGCTAGAGACAAGCACGCCCGTGACAAGCACGCACGTGACAAGCATGCACGTGACAAGCATGCAAGGGACAAACATGCAAGGGATAAGCATGCACGTGACAAGCACGCCAGAGATAAACATGCCCGTGATAAGCATGCAAGGGATAAACACGCTAGGGACAAACACGCCCGTGACAAGCATGCTAGGGACAAGCATGCCCGTGATAAACACGCTCGTGATAAACATGCCCGTGACAAACACGCCAGAGATAAACACGCTAGAGACAAGCACGCTAGAGACCACCATCATCATCACCACCATCACTAATGA
서열번호 16	pKLAC2-KKRAR 삽입 유전자의 염기 서열	ATGAAATTCTCTACTATATTAGCCGCATCTACTGCTTTAATTTCCGTTGTTATGGCTGCTCCAGTTTCTACCGAAACTGACATCGACGATCTTCCAATATCGGTTCCAGAAGAAGCCTTGATTGGATTCATTGACTTAACCGGGGATGAAGTTTCCTTGTTGCCTGTTAATAACGGAACCCACACTGGTATTCTATTCTTAAACACCACCATCGCTGAAGCTGCTTTCGCTGACAAGGATGATCTCGAGAAACGTAAAAAACGTGCCAGGTGATAAAGGCCT
서열번호 17	pKLAC2-DKHAR 삽입 유전자의 아미노산 서열	KRDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDKHARDHHHHHHHH
서열번호 18	pKLAC2-KKRAR 삽입 유전자의 아미노산 서열	MKFSTILAASTALISVVMAAPVSTETDIDDLPISVPEEALIGFIDLTGDEVSLLPVNNGTHTGILFLNTTIAEAAFADKDDLEKRKKRAR

배양 후, 배양 배지를 7,000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 4℃에서 세포 및 상청액을 분리하였다. 이어서 세포를 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 재현탁시켰다. 프렌치 압력 셀 프레스(American Instrument Exchange, Haverhill, USA)로 세포를 파괴하고, 15,000rpm로 4℃에서 60분간 원심분리하였다. 배양 배지 중의 추출물 및 세포 용해 후 세포에서의 추출물을 His-태그 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 컬럼은 5mL의 Ni-NTA 아가로오스 수지로 패킹한 후, 컬럼을 결합 완충액(20mM Tris-HCl, 10mM 이미다졸, pH 7.4)으로 평형화시켰다. 추출물은 Ni-NTA 컬럼에 충전한 후, 용리의 Abs₂₀₅(205nm에서의 흡광도)가 세척 완충액과 동일해질 때까지 0.5ml/min의 속도로 20베드 부피 이상의 세척 완충제(20mM Tris-HCl, 10mM 이미다졸, pH 7.4)로 완전히 세척하였다. 그 후, 용리 완충액(20mM Tris-HCl, 500mM 이미다졸, pH 7.4)을 사용하여 염미성 펩타이드 'DKHAR'을 0.5ml/min의 속도로 용출시켰다. 각 분획을 1mL의 부피로 수집하고, Abs₂₀₅를 측정 하였다. 대부분의 단백질은 1mg/mL 용액 기준으로 205nm에서 고유의 흡광 계수를 가지고 있으며, 이 흡광 계수는 단백질 측정을 위한 최적의 파장이 205nm가 되도록 한다. 40회 반복된 염미성 펩타이드를 함유하는 하나의 긴 폴리펩타이드를 Asp-N 엔도펩티다아제 효소로 분해한 후, 단일 펩타이드를 HPLC로 수득하였다.

1.3 염미성 펩타이드 'KKRAR’의 정제

배양 후, 배양 배지를 7,000rpm로 4℃에서 30분 동안 원심 분리하여 세포 및 상청액(배양 배지)을 분리하였다. 염미성 펩타이드 'KKRAR'을 카르복시 메틸(CM) 셀룰로오스 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 상청액으로부터 정제하였다(

zcengiz et al., 2004). 컬럼을 10 mL의 CM 셀룰로스 수지로 패킹한 후, 컬럼을 결합 완충액(20mM Tris-HCl, 10mM 이미다졸, pH 7.4)으로 평형화시켰다. 추출물을 CM 셀룰로스 칼럼에 충전한 후, 용출액의 Abs₂₀₅가 일정해질 때까지 10 베드 부피 이상의 세척 완충제(20mM Tris-HCl, 10mM 이미다졸, pH 7.4)를 이용하여 1 ml/min의 속도로 완전히 세척하였다. 그 후, 용리 완충액(20mM Tris-HCl, 500mM 이미다졸, pH 7.4)을 사용하여 염미성 펩타이드 'KKRAR'을 1ml/min의 속도로 용출시켰다. 각 분획을 1mL의 부피로 수집하고, Abs₂₀₅를 측정하였다. 정제된 염미성 펩타이드를 HPLC로 수득하였다.

실시예 2. TRPV1과 상호 작용에 대한 in silico 연구 및 신규한 염미성 펩타이드 설계

도 3에 나타난 바와 같이, TRPV1의 3차 구조 및 아미노산 서열은 RCSB 단백질 데이터 뱅크(https://www.rcsb.org/)로부터 획득되었다.

모델의 수소 및 가스 테이거 전하는 ‘Autodock Tools’ 소프트웨어(Trott et al., 2010)로 조정되었다. 단백질-단백질 상호 작용을 예측하기 위해, TRPV1과 염미성 펩타이드의 컴퓨터 모델링 구조를 'GRAMM-X' 도킹 시뮬레이션 소프트웨어에 넣었다.

도 4에 나타난 바와 같이, GRAMM-X로 도킹된 파일은 하나의 파일에 있는 모든 숫자의 조합 형태로 제공되므로 'UCSF CHIMERA' 프로그램을 통해 각 조합을 분리하고 분류해야한다. UCSF CHIMERA를 사용하여 분류된 모델은 'LIGPLOT' 프로그램을 사용하여 결합 강도, 친수성 및 소수성 활성과 같은 단백질 간의 상호 작용을 분석하였다.

표 2 내지 4에 나타난 바와 같이, LIGPLOT으로 염미성 펩타이드와 TRPV1의 상호 작용을 분석할 때, 수소 결합, 소수성 상호 작용 및 정전기적 상호 작용의 형성을 고려하여 중요한 잔기가 선택되었다.

이에 기초하여, TRPV1과 염미성 펩타이드 간의 상호 작용을 향상시키기 위한 신규한 염미성 펩타이드 4가지를 설계하였다(표 5 참조).

TRPV1-DKHAR 상호작용
펩타이드 잔기	TRPV1 잔기	Repeated times	TRPV1 위치
Asp1	Glu 570	4	S4-S5 linker
Asp1	Lys 571	4	S4-S5 linker
Lys2	Lys 464	1	S1-S2 linker
His3	No interaction
Ala4	No interaction
Arg5	Ser 632	1	S5-S6 linker

TRPV1-DEKR 상호작용
펩타이드 잔기	TRPV1 잔기	Repeated times	TRPV1 위치
Asp1	Ile 447	3	S1-S2 Linker
Asp1	Leu 585	1	S5
Glu2	Tyr 463	1	S1-S2 Linker
Glu2	Leu 465	1	S1-S2 Linker
Lys3	Arg 455	3	S1-S2 Linker
Lys3	Cys 634	1	S5-S6 linker
Arg4	No interaction

TRPV1-KKRAR상호작용
펩타이드 잔기	TRPV1 잔기	Repeated times	TRPV1 위치
Lys1	Tyr 537	4	S4
Lys1	Ile 661	1	S6
Lys2	Phe 534	2	S3-S4 Linker
Lys2	Leu 577	2	S5
Arg3	Tyr 463	5	S1-S2 Linker
	Ile 573	2	S5
	Leu 574	1	S5
Ala4	Asn 551	2	S4
Ala4	Leu 574	1	S5
Arg5	Lys 464	1	S1-S2 Linker
	Arg 455	1	S1-S2 Linker
	Lys 464	2	S1-S2 Linker
	Lys 535	1	S3-S4 Linker
	Thr 550	1	S4
	Leu 574	1	S5
	Leu 588	2	S5
	Tyr 631	2	S5-S6 linker
	Cys634	1	S5-S6 linker

설계된 염미성 펩타이드
원래 펩타이드	변이
DEKR	DEAKR	서열번호 3
DEKR	DEDAE	서열번호 4
TRPV1에서 상호작용 위치 예측	변이
YRPVD	YEAWR	서열번호 5
KMEKT	EAKEY	서열번호 6

실시예 3. 염미성 펩타이드의 발현 및 정제

도 5에 나타난 바와 같이, Ni-NTA 컬럼을 통한 긴 반복 사슬로부터 DKHAR이 정제됨을 확인하였다

이에 더하여, 도 6에 나타난 바와 같이, 분비되었거나 분비되지 않은 전체 발현된 염미성 펩타이드를 평가하기 위해 세포 용해물을 사용하여 추가 분석을 수행한 결과, 마찬가지로 DKHAR이 잘 발현 및 정제됨을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Recombinant expression vector for expression of Salty peptides and production method using the same <130> MP20-097 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DKHAR <400> 1 Asp Lys His Ala Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKRAR <400> 2 Lys Lys Arg Ala Arg 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEAKR <400> 3 Asp Glu Ala Lys Arg 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEDAE <400> 4 Asp Glu Asp Ala Glu 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YEAWR <400> 5 Tyr Glu Ala Trp Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EAKEY <400> 6 Glu Ala Lys Glu Tyr 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKHAR <400> 7 gacaaacacg ccagg 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KKRAR <400> 8 aaaaaacgtg ccagg 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEAKR <400> 9 gatgaagcga aacgc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEDAE <400> 10 gatgaagatg cggaa 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YEAWR <400> 11 tatgaagcgt ggcgc 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAKEY <400> 12 gaagcgaaag aatat 15 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-mating factor <400> 13 atgaaattct ctactatatt agccgcatct actgctttaa tttccgttgt tatggctgct 60 ccagtttcta ccgaaactga catcgacgat cttccaatat cggttccaga agaagccttg 120 attggattca ttgacttaac cggggatgaa gtttccttgt tgcctgttaa taacggaacc 180 cacactggta ttctattctt aaacaccacc atcgctgaag ctgctttcgc tgacaaggat 240 gatctcgaga aaagagaggc tgaagctaga agagctagat ctcctagggg taccgtcgac 300 ggcgcgcctg cggccgctta a 321 <210> 14 <211> 1574 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAC4 <400> 14 ggggatcgac tcataaaata gtaaccttct aatgcgtatc tattgactac caaccattag 60 tgtggttgca gaaggcggaa ttttcccttc ttcgaattta gcttgctttt tcatttttta 120 ttttccattt ttcagttttt gtttgtgtcg aatttagcca gttgcttctc caagatgaaa 180 aaaacccctg cgcagtttct gtgctgcaag atcctaatcg acttttccac cccccacaaa 240 agtaaatgtt cttttgttac attcgcgtgg gtagctagct ccccgaatct tcaaaggact 300 tagggactgc actacatcag agtgtgttca cctggtttgc tgcctggttt gaaagaaaag 360 agcagggaac tcgcgggttc ccggcgaata atcatgcgat agtcctttgg ccttccaagt 420 cgcatgtaga gtagacaaca gacagggagg gcaggaagga tctttcactg agatcctgta 480 tcttgttggg taagtcggat gaaaggggaa tcgtatgaga ttggagagga tgcggaagag 540 gtaacgcctt ttgttaactt gtttaattat tatggggcag gcgagagggg gaggaatgta 600 tgtgtgtgag gcgggcgaga cggagccatc caggccaggt agaaatagag aaagccgaat 660 gttagacaat atggcagcgt agtagagtag gtaggtaggc aagtactgct agcaaagagg 720 agaagggtaa gctcactctt cgcattccac accgttagtg tgtcagtttg aacaaaaaaa 780 caatcatcat accaattgat ggactgtgga ctggcttttg gaacggcttt tcggactgcg 840 attattcgtg aggaatcaag gtaggaattt ggtcatattt acggacaaca gtgggtgatt 900 cccatatcga gtaggaaaac gagatcatgg tatcctcaga tatgttgcgg aaatctgttc 960 accgcaaagt tcagggtgct ctggtgggtt tcggttggtc tttgctttgc ttctcccttg 1020 tcttgcatgt taataatagc ctagcctgtg agccgaaact tagggtaggc ttagtgttgg 1080 aacgtacata tctatcacgt tgacttggtt taaccaggcg acctggtagc cagccatacc 1140 cacacacgtt ttttgtatct tcagtatagt tgtgaaaagt gtagcggaaa tttgtggtcc 1200 gagcaacagc gtctttttct agtagtgcgg tcggttactt ggttgacatt ggtatttgga 1260 ctttgttgct acaccattca ctacttgaag tcgagtgtga agggtatgat ttctagtggt 1320 gaacaccttt agttacgtaa tgttttcatt gctgttttac ttgagatttc gattgagaaa 1380 aaggtattta atagctcgaa tcaatgtgag aacagagaga agatgttctt ccctaactcg 1440 aaaggtatat gaggcttgtg tttcttagga gaattattat tcttttgtta tgttgcgctt 1500 gtagttggaa aaggtgaaga gacaaaagct ggaattgtga gcggataaca agctcaacac 1560 ttgaaattta ggaa 1574 <210> 15 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKLAC2-DKHAR insert <400> 15 aaaagagaca aacacgccag ggataagcac gctagagaca aacatgcaag agataagcat 60 gccagggaca aacatgctag ggataaacac gctcgtgata agcacgccag agataagcac 120 gcaagagaca aacacgcaag agacaaacat gctagggaca aacatgcccg tgataagcac 180 gcacgtgaca aacatgcaag agacaagcac gctcgtgaca agcacgcccg tgataaacac 240 gcccgtgata aacatgcacg tgataagcac gctcgtgata aacatgcaag ggataagcat 300 gcaagggata agcatgctag agataaacat gctagagaca agcacgcccg tgacaagcac 360 gcacgtgaca agcatgcacg tgacaagcat gcaagggaca aacatgcaag ggataagcat 420 gcacgtgaca agcacgccag agataaacat gcccgtgata agcatgcaag ggataaacac 480 gctagggaca aacacgcccg tgacaagcat gctagggaca agcatgcccg tgataaacac 540 gctcgtgata aacatgcccg tgacaaacac gccagagata aacacgctag agacaagcac 600 gctagagacc accatcatca tcaccaccat cactaatga 639 <210> 16 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKLAC2-KKRAR insert <400> 16 atgaaattct ctactatatt agccgcatct actgctttaa tttccgttgt tatggctgct 60 ccagtttcta ccgaaactga catcgacgat cttccaatat cggttccaga agaagccttg 120 attggattca ttgacttaac cggggatgaa gtttccttgt tgcctgttaa taacggaacc 180 cacactggta ttctattctt aaacaccacc atcgctgaag ctgctttcgc tgacaaggat 240 gatctcgaga aacgtaaaaa acgtgccagg tgataaaggc ct 282 <210> 17 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pKLAC2-DKHAR insert <400> 17 Lys Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala 1 5 10 15 Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg 20 25 30 Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp 35 40 45 Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys 50 55 60 His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His 65 70 75 80 Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala 85 90 95 Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg 100 105 110 Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp 115 120 125 Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys 130 135 140 His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His 145 150 155 160 Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala 165 170 175 Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg 180 185 190 Asp Lys His Ala Arg Asp Lys His Ala Arg Asp His His His His His 195 200 205 His His His 210 <210> 18 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pKLAC2-KKRAR insert <400> 18 Met Lys Ser Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ser Val Val Met Ala Ala Val 1 5 10 15 Ser Thr Thr Asp Asp Asp Ser Val Ala Gly Asp Thr Gly Asp Val Ser 20 25 30 Val Asn Asn Gly Thr His Thr Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ala Ala Asp 35 40 45 Lys Asp Asp Lys Arg Lys Lys Arg Ala Arg 50 55

Claims

클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열; 및
서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 염미성 펩타이드 발현용 재조합 발현벡터로서,
상기 재조합 발현벡터는 효모의 형질전환을 위한 것이며,
상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 10 내지 100회 반복되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅(α-mating) 신호서열은 서열번호 13으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 염미성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 LAC4 작동 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 pKLAC2 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
삭제
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 도 1에 개시된 pKLAC2-DKHAR의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현벡터.
삭제
제1항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모.
제9항에 있어서, 상기 효모는 클루이베로마이세스 락티스인 것을 특징으로 하는, 효모.
(a) 제9항의 효모를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 효모 또는 이의 배양액으로부터 염미성 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 염미성 펩타이드의 생산 방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (b)는 엔도펩티다아제를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 염미성 펩타이드.
제13항의 염미성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식염 대체재.