JP2013208114A - 植物においてペプチド／タンパク質を産生する方法およびそれにより産生されたペプチド／タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】グリコシル化部位成分およびコアタンパク質成分を含む、植物における新規な糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【解決手段】植物において少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質を発現する核酸構築物であって、以下：ａ）グリコシル化部位をコードする少なくとも１つの核酸配列およびｂ）生物学的に活性なタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、前記核酸構築物。前記核酸構築物によって、コードされる哺乳動物融合タンパク質。前記核酸構築物を使用して、植物において組換えタンパク質の発現収率を増加させる方法。
【選択図】なし

Description

本発明に至った研究は、少なくとも部分的にＮＳＦ助成金番号ＭＣＢ９８７４７４４およびＵＳＤＡプロジェクト番号ＯＨＯＷ２００２０６２０１に支援された。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。

（発明の説明）
本出願は、２００４年１月１４日に出願した米国仮出願番号第６０／５３６，４８６号および２００４年６月２２日に出願した同第６０／５８２，０２７号および２００４年８月１８日に出願した同第６０／６０２，５６２号に対する優先権を主張する。各々の全体的な開示は本明細書に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、植物において融合ペプチド、融合ポリペプチドおよび融合タンパク質を産生する新規な方法、これらの方法において使用される核酸構築物ならびにこれらの方法に従って産生された生成物に関する。本方法は、全般的に融合タンパク質として上記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する工程を包含し、その融合タンパク質は植物によってグリコシル化される。いくつかの実施形態において、植物ベースのシグナルペプチドが融合タンパク質の部分として発現される。本発明に従って新規な糖タンパク質が提供される。

（発明の背景）
若い生長中の植物組織の支持体は、３つの貫通ネットワーク、すなわちセルロース性キシログルカン、ペクチンおよびヒドロキシプロリンリッチの糖タンパク質（ＨＲＧＰ）からなる弾性的細胞壁により抑制される細胞の膨らみに大きく依存する。これらのネットワークが緩んだ場合、膨圧は細胞伸長を引き起こす。意義深いことには、ＨＲＧＰは動物相同体を有さず、従って植物特異的機能を強調する。

定量的には、細胞表面ＨＲＧＰ（エクステンシン）の殆どは、共有結合的に架橋した細胞壁ネットワークを形成する。エクステンシンとは異なり、別組のＨＲＰＧ、アラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）がアラビノガラクタン多糖により過剰にグリコシル化されたモノマーとして存在する。ＡＧＰは、最初、原形質膜に脂質アンカーにより連結されて、その切断によりペリプラズムから細胞壁を経由する外部への移動を生じる。植物生長および発達の多様な局面に拘わっているが、ＡＧＰの正確な機能は不明のままである。

（発明の要旨）
本発明は、植物における糖タンパク質を産生する新規な方法を提供する。上記糖タンパク質はグリコシル化部位成分およびコアタンパク質成分を含む。いくつかの実施形態において、上記コアタンパク質成分は、哺乳動物（ヒトを含む）起源であり得、そしていくつかの実施形態において、上記コアタンパク質成分は、生物学的に活性なタンパク質であり得る。いくつかの場合、上記タンパク質は、治療的に使用される、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のようなＦＤＡ認可組換えタンパク質であり得る。上記グリコシル化部位は、上記植物によるグリコシル化の標的として作用するアミノ酸配列である。

本方法のひとつの特徴は、タンパク質産生における収率の増加である。発現されたタンパク質においてグリコシル化部位およびシグナルペプチド配列を含むことにより、組換えタンパク質収率は、グリコシル化部位およびシグナルペプチド配列の無い植物における同じタンパク質の発現と比較して著しく増加する。

本方法により産生された糖タンパク質は、野生型対応物より溶解度の増加、タンパク分解酵素に対する抵抗性の増加および安定性の増加を含む、さらなる優れた利点を示す。別の重要な特徴は、野生型タンパク質と比較して生物学的半減期の増加を含む。

本発明のさらなる特徴および利点は、以下の記載に部分的に示され、そして部分的にその記載から明らかであるか、または本発明の実施により習得され得る。本発明の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素および組み合わせにより認識され、そして達成される。

本発明は、植物において少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質の発現のための核酸構築物を提供し、その構築物は：ａ）植物において使用されるグリコシル化部位をコードする少なくとも１つの核酸配列、およびｂ）生物学的に活性なタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。

本発明はまた、植物由来の生物学的に活性な融合タンパク質を提供し、上記タンパク質は：ａ）少なくとも１つの糖構成単位およびｂ）生物学的に活性なタンパク質を含み、このａ）少なくとも１つの糖構成単位は、ｂ）生物学的に活性なタンパク質と共有結合する。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つの糖構成単位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１０００であり、ｉｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１０００であり、そしてｉｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは、１〜約１０００；ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＶａｌから選択され、しかしより好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＡｌａから選択される、から選択されるグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態において少なくとも１つの糖構成単位は、上記タンパク質のＮ−末端および／またはＣ−末端から選択される位置において共有結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの糖構成単位が、生物学的に活性な哺乳動物タンパク質の内部内にある。Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａは、特にＸに対応するように上で同定されるが、任意のアミノ酸がその目的に役立ち得、そのモチーフが植物においてグリコシル化されると考えられている。

生物学的に活性な哺乳動物タンパク質は、成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニスト、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、グレリン、レプチン、プロラクチン、単球誘引活性タンパク質−１、インターロイキン１０、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターフェロンω、インターフェロンα２ａおよびインターフェロンα２ｂ、インターフェロンγ、インターロイキン−１、線維芽細胞成長因子６、ＩＧＦ−１、インスリン様成長因子１、インスリン、エリスロポイエチン、ＧＭＣＳＦおよび任意のヒト化モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体から選択され、ここで、上記糖構成単位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎが２〜約１０００であり；ｉｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎが２〜約１０００でありおよびｉｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは１〜約１０００である、群から選択されるグリコシル化部位を含み；ここで、Ｘは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択され、より好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌである。いくつかの実施形態において、上記糖構成単位は、（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎを含み、Ｘは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択され、より好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択され、そしてｎ＝１〜１０００である。いくつかの実施形態において、上記タンパク質はヒト成長ホルモンであり、上記糖構成単位は（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０を含む。Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａは、特にＸに対応するように上で同定されるが、任意のアミノ酸がその目的に役立ち得、そのモチーフが植物においてグリコシル化されると考えられている。

いくつかの実施形態において、本発明の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合糖タンパク質は、少なくとも１つの炭水化物分子と共有結合する。いくつかの実施形態において、炭水化物は、アラビノガラクタン部分であり、いくつかにおいてアラビノシル部分である。

本発明はまた、タンパク質分子の水溶解度を増加させる方法を提供し、ここで：ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位およびｂ）少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードし、上記核酸構築物を糖タンパク質として発現し、ここで上記糖タンパク質の炭水化物成分は上記糖タンパク質の分子量の約１０％以上を占める、核酸構築物を調製する。上記糖タンパク質の炭水化物成分は、上記糖タンパク質の分子量の約５０％以上、約７５％以上または約９０％以上を占め得る。

本発明はまた、生物学的に活性な融合糖タンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、植物において少なくとも１つの核酸構築物を発現する工程を包含し、この構築物は、糖タンパク質としてａ）グリコシル化部位をコードする少なくとも１つの核酸配列およびｂ）生物学的に活性なタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み；ここで上記糖タンパク質の分子量が１０ｋＤ以上であり、そして上記糖タンパク質の炭水化物成分が上記糖タンパク質分子量の約１０％以上を占める。いくつかの実施形態において、上記糖タンパク質の分子量は、約３５ｋＤ、約４０ｋＤ、約４５ｋＤ、約５０ｋＤまたは約５５ｋＤ以上である。いくつかの実施形態において、糖タンパク質の薬物速度論的半減期が、対応する野生型のタンパク質の薬物速度論的半減期より長い。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのグリコシル化部位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ_ｎ、ここでｎは２〜約１０００であり、ｉｉ）（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎ、ここでｎは２〜約１０００である、から選択され；ここでＸは、任意のアミノ酸であるか、またはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。もちろん、ｎは、４〜２００または６〜１００または８〜５０または１０〜２５あるいはその間の任意の数またはそれらの組み合わせの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、上記生物学的に活性なタンパク質はヒト成長ホルモンであり、そして上記糖タンパク質は（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０を含み、そしていくつかの実施形態において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０は、上記ヒト成長ホルモンタンパク質のＣ−末端に共有結合する。

本発明はまた、グリコシル化ヒト成長ホルモンを含み、タンパク質を溶媒和させるか、またはタンパク質の溶解度を増加させるのに通常必要な付加的な賦形剤をのぞく、注入可能な薬学的処方物を提供する。いくつかの実施形態において、上記処方物は、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、グリシン、ロイシン、トリロイシン、ヒスチジンおよびリン脂質から選択される少なくとも１つの賦形剤を除く。いくつかの実施形態において、上記グリコシル化成長ホルモンは、糖構成単位を含み、その糖構成単位はｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、そしてここでＸは、任意のアミノ酸であるか、またはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択され、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択され、ｉｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、そしてここでＸは、任意のアミノ酸であるか、またはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択され、ならびにｉｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは１〜約１００であり、そしてここでＸは、任意のアミノ酸であるか、またはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。グリコシル化成長ホルモンは、Ｘ−Ｈｙｐ_ｎを含み得、ここでｎは、２〜約２０であり；ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。

本発明はまた、約１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を示すグリコシル化ヒト成長ホルモンの凍結乾燥粉末処方物を提供し、ここで上記処方物は、ペプチド溶解度に必要な付加的な賦形剤を除く。いくつかの実施形態において、上記賦形剤は、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、グリシン、ロイシン、トリロイシン、ヒスチジンおよびリン脂質から選択される。

本発明は、さらにタンパク質の植物産生において収率を増加させる方法を提供し、その方法は、核酸構築物を調製する工程、その構築物は、ａ）分泌性シグナルペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、ｂ）グリコシル化部位をコードする少なくとも１つの核酸配列、およびｃ）タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、ならびに植物においてまたは植物細胞培養物において糖タンパク質として核酸構築物を発現する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのＨＲＧＰグリコシル化部位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ_ｎ、ここでｎは２〜約１０００であり、およびｉｉ）（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎ、ここでｎは１〜約１０００である、から選択され；ここでＸは、任意のアミノ酸であるか、またはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択され、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。上記核酸構築物はまた、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸を含み得、または除外し得る。本発明はまたこれらの方法により産生されたタンパク質を提供する。

本発明はまた、糖構成単位を含むアミノ酸配列に共有結合した成長ホルモン分子を提供し、ここで上記糖構成単位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、ｉｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、およびｉｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは１〜約１００である、から選択され、ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。

本発明はまた、糖構成単位を含むアミノ酸配列に共有結合した成長ホルモンアンタゴニスト分子を提供し、ここで上記構成単位は、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、ｉｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１００であり、およびｉｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは１〜約１００である、から選択され、そしてここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択され、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される。

成長ホルモン欠乏症または成長ホルモン不全症を患う患者を処置する方法もまた提供され、その処置は治療有効量のグリコシル化ヒト成長ホルモンを投与する工程を包含する。

成長ホルモン過剰症または成長ホルモン活性過剰症を患う患者を処置する方法もまた提供され、その処置は治療有効量のグリコシル化ヒト成長ホルモンアンタゴニストを投与する工程を包含する。

前の全般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示的でかつ説明的のみで、請求されるように本発明の限定ではないことが理解される。

添付の図面は、本明細書に援用され、そして明細書の一部を構成するが、本発明の実施の形態を図示し得、説明と一緒に本発明の原理を説明するのに役立ち得る。

図１は、相互のプライミングおよび伸長による（ａ）［Ｇｕｍ］_ｎ（ｎ＝８、２０）_ｍおよび（ｂ）［ＨＰ］_ｍ（ｍ＝２、４、８）合成遺伝子を構築するのに使用される２組のオリゴヌクレオチドのセットを示す。重複部分の下に線を引く。制限部位は、太字イタリックになっている。 図２は、ｐＵＣ１８プラスミドにおけるシグナル配列（下線部分）とＧＦＰ遺伝子との間で構築された（ａ）［Ｇｕｍ］_３、（ｂ）［Ｇｕｍ］_８および［Ｇｕｍ］_２０合成遺伝子のＤＮＡ配列を示す。 図３は、ｐＵＣ１８プラスミドにおけるシグナル配列（下線部分）およびＧＦＰ遺伝子の間で構築された［ＨＰ］_４および［ＨＰ］_８合成遺伝子のＤＮＡ配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図４は、ｐＵＣ１８プラスミドにおけるシグナル配列（下線部分）およびＧＦＰ遺伝子の間で構築された［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_２および［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_４合成遺伝子のＤＮＡ配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図５は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０−ＥＧＦＰ遺伝子カセットの構築に関する概略図を示す。 図６は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０遺伝子カセットの構築に関する概略図を示す。 図７は、ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０遺伝子カセットの構築に関する概略図を示す。 図８は、ＨＳＡ−（ＳＰ）_１０遺伝子カセットの構築に関する概略図を示す。 図９は、ドメインＩ−（ＳＰ）_１０遺伝子カセットの構築に関する概略図を示す 図１０Ａは、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフを結合したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現のための遺伝子構築物を示す。 図１０Ｂは、上記（ＳＰ）_１０遺伝子がプライマー伸長によりいかに構築されたかを示す。 図１１は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフでその２つを結合した緑色蛍光タンパク質と結合したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現のための遺伝子構築物を示す。 図１２（ＡおよびＢ）は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフを結合したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現のための遺伝子構築物を示す。 図１２（ＡおよびＢ）は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフを結合したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現のための遺伝子構築物を示す。 図１３は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフを結合したヒト血清アルブミンドメインＩの発現のための遺伝子構築物を示す。 図１４は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフを結合したインターフェロンα２ａ（ＩＮＦ２ａ）の発現のための遺伝子構築物を示す。 図１５は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０およびｈＧＨのいずれかで形質転換された１０株のタバコ細胞の培地に分泌されたｈＧＨ等価物の検出を示す。 図１６は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０で形質転換されたタバコ細胞の培養培地における細胞増殖およびｈＧＨ等価物の産生の経時変化を示す。 図１７は、培養培地におけるｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（左パネル）およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰのウェスタンブロット検出を示す。 図１８は、逆相ＨＰＬＣによるｈＧＨ−（ＳＯ）_１０およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰの単離に関するクロマトグラフィプロフィールを示す。 図１９は、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２０は、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_２構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２１は、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_５構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２２は、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_２０構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２３は、ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２４は、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨＡ−（ＳＰ）_１０構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２５は、ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２６は、ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２７は、ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５−ＩＮＦ構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２８は、ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_２０構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図２９は、ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０構築物の遺伝子配列を示す。制限部位は太字イタリックになっている。 図３０は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０−ＥＧＦＰに関する結合曲線を示す。 図３１は、市販のｈＧＨに関する結合曲線を示す。 図３２は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０に関する結合曲線を示す。 図３３は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の各々のマウスへの単回投与した後の血清濃度を示す。 図３４は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をマウスへ単回投与した後の血清ＩＧＦ−１濃度を示す。 図３５は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をマウスへ単回投与後の血液ｈＧＨ等価物濃度を示す。 図３６は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０（およびＰＢＳコントロール）をマウスへ１日２回、５日間投与した後のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の血清濃度を示す。 図３７は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０（およびＰＢＳコントロール）をマウスへ１日２回、５日間投与した後の血清ＩＧＦ−１濃度を示す。 図３８は、低濃度（１μｇ／ｇｍ）の市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０（およびＰＢＳコントロール）をマウスへ１日１回、５日間投与した後の成長ホルモンのレベルを示す。 図３９は、低濃度（１μｇ／ｇｍ）の市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０（およびＰＢＳコントロール）をマウスへ１日１回、５日間投与した後の血清ＩＧＦ−１濃度を示す。 図４０は、市販のｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０で２週間にわたる処置の間の体重の増加を示す。

（実施形態の説明）
構造と機能の関連は、生物学における深遠な教えの１つである。ヒドロキシプロリンリッチな糖タンパク質（ＨＲＧＰ）構造生物学の少なくとも２つの局面は、機能的な意義を有するように見える：グリコシル化および共有結合的な架橋。ＨＲＧＰは、繰返し構成単位の糖タンパク質が伸長する傾向にあるので、この点に関する研究は、ＨＲＧＰ機能的性質を構成単位ごとに切断することに焦点がおかれている。合成遺伝子は、各推定上の構成単位のアナログとして設計された。このアプローチは、多くの以下の発見を可能にした：グリコシル化コードの解明、糖置換基の構造的解明、架橋モチーフの同定および改良された生物医学的産生物を含む新規な糖タンパク質の設計。

本研究は、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉらにより最初に提唱された連続性Ｈｙｐ−理論を拡大し、そして発展させた。このＯ−Ｈｙｐグリコシル化コードは、ＨＲＧＰのグリコシル化部位および置換基を予測することが見出された。本開示は、多くの方法においてこの発見を適用する。

いくつかの実施形態は、植物におけるタンパク質産生の収率を改善する方法に関する。いくつかの実施形態は、本開示に従って産生された改変タンパク質を含み、延長された生物学的半減期および改善されたバイオアベイラビリティを含む全体として改善された性質を示す。

本発明は、場合によっては添付の図面を参照しながら、より詳細な実施形態に関して記載される。本発明は、しかしながら、異なる形態で実施され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が周到かつ完全であり、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるように提供される。

他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解される場合と同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明に使用される用語は、特定の実施形態を単に記載するためだけであって本発明を限定するよう意図されていない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形態の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その」は、文脈から明らかに他に示されない限り、複数を含むと意図される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、明白に全体を参考として援用される。

他で示されない限り、本明細書および特許請求の範囲の中で使用される成分、反応条件などの量を表現する全ての数は、用語「約」により全ての例において改変されるように理解されるべきである。従って、反対に示されない限り、以下の明細書および特許請求の範囲に示される数値的なパラメータは、本発明により得られるように求められる所望の性質に依存して変化し得る近似値である。せめておよび特許請求の範囲に対する等価物の教義の適用を限定する企図としてではなく、各数値パラメータは、有意の数字の数および普通の丸め方に照らして解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を示す数値範囲および数値パラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例で示される数値は可能な限り正確に報告される。任意の数値は、しかしながら、それぞれの試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。本明細書の全体にわたって示される各数値範囲は、あたかもそのような狭い数値範囲が本明細書に全て明らかに書かれているように、そのようなより広い数値範囲内に入る各々のより狭い数値範囲を含む。

本開示の全体にわたって、本発明の化合物が言及される。本明細書および特許請求の範囲におけるそのような化合物に対する言及は、そのような化合物のエステルおよび塩も含む。従って、明らかに列挙されない場合でさえ、そのようなエステルおよび塩が企図され化合物自身を参考として含まれる。

さらに、本明細書で使用される場合、「ペプチド」「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用される。「ペプチド／ポリペプチド／タンパク質」は、場合によっては、これらの３つのいずれか１つを言及するのに使用されるが、これら３つのいずれか１つの説明は他の２つを企図する。すなわち、アミノ酸ポリマー（ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）の大きさに関する意図された限定はなく、本発明を使用して発現され得る。さらに、「タンパク質」の説明は、酵素、ホルモン、レセプター、チャネル、細胞内シグナル伝達分子および他の機能を有するタンパク質を含むよう意図される。多重結合タンパク質はまた、本発明に従って作製され得る。

本開示の全体にわたって天然に存在するアミノ酸が議論される場合、天然に存在しないアミノ酸または改変アミノ酸もまた企図され、そして本発明の範囲内である。事実、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、全てそれらのＤ立体異性体およびＬ立体異性体の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸アナログをいう。天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、ヒドロキシプロリン（Ｏおよび／またはＨｙｐ）、イソジチロシン（ＩＤＴ）およびジイソジチロシン（ｄｉ−ＩＤＴ）が挙げられる。ヒドロキシプロリン、イソジチロシンおよびジイソジチロシンは、翻訳後に形成される。天然に存在するアミノ酸、特に２０の遺伝学的にコードされたアミノ酸の使用が好ましい。

天然に存在しないアミノ酸としては、限定されないが、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、トリロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンおよびピペコリン酸が挙げられる。

さらに、別々のペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質が特定して言及される場合、それらのペプチドまたはタンパク質の変異体（ｍｕｔａｎｔ）または改変体（ｖａｒｉａｎｔ）もまた特に企図される。本明細書で使用される場合、「改変体」はそのアミノ酸配列が参照ペプチド／ポリペプチド／タンパク質に類似するが、それぞれのペプチド／ポリペプチド／タンパク質配列に対して１００％の同一性を有しないタンパク質（またはペプチドまたはポリペプチド）をいう。改変体ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、上記参照配列の１以上のアミノ酸が欠失または置換されるか、あるいは上記参照配列に１以上のアミノ酸が挿入される変化した配列を有する。改変体は、欠失、置換または挿入の任意の組合せを有し得る。変化の結果として、改変体ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、参照配列に対して、少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３，６４，６５，６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い％、同一のアミノ酸配列を有し得る。より低い同一性％もまた許容され得、そして２０％までの低い範囲であり得る。

変異体ポリペプチドが任意の脊椎動物のポリペプチドと実質的に同一かどうかを決定するために、上記変異体ポリペプチド配列は、第１参照脊椎動物ポリペプチドの配列と一緒にアライメントされ得る。アライメントの１方法は、スコアリングマトリックスおよびギャップペナルティのデフォルト設定を使用するＢｌａｓｔＰによる。１つの実施形態において、第１参照脊椎動物ポリペプチドは、そのようなアライメントが最低のＥ値、すなわち良好またはより良好なアライメントスコアを有するアライメントが、偶然発生する確率が最低という結果になるポリペプチドである。あるいは、そのようなアライメントが最高の同一性％という結果になるポリペプチドである。

置換は、保存的および／または非保存的であり得る。保存的アミノ酸置換において、置換されたアミノ酸は、上記参照配列において対応するアミノ酸と類似する構造的性質および／または化学的性質を有する。例として、保存的置換（代替）は、以下に示される群の中での交換として定義される：
Ｉ 小さい脂肪族、非極性または僅かに極性残基−−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
ＩＩ 負に荷電した残基およびそれらのアミド Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＩＩ 正に荷電した残基−−Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＶ 大きい脂肪族の非極性残基−−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
Ｖ 大きい芳香族残基−−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
３つの残基がタンパク質構造におけるそれらの特別の役割故に括弧に入れてある。Ｇｌｙは、側鎖のない唯一の残基であり、従って鎖に可撓性を付与する。Ｐｒｏは、鎖をしっかりと束縛する異常な構造を有する。Ｃｙｓは、ジスルフィド結合に関与し得、タンパク質を特定のフォールディングに維持し得る；ｂＧＨの４つのシステインは高度に保存される。保存的置換で、低レベルの同一性を有する改変体でさえも、非改変ペプチド／ポリペプチド／タンパク質に対して非常に類似する活性を示し得る。

本発明による「改変体」は、野生型版のアミノ酸の数より多くのまたはより少ないアミノ酸の数を有するペプチド／ポリペプチド／タンパク質を含むことを注記されるべきである。成長ホルモンに関して、例えば、野生型は、約２２ｋＤａの分子量を有するが、２０ｋＤａおよび１７ｋＤａの改変体もまた存在する。これらの種類の改変体は、天然であり得、または天然に存在しないであり得、明らかに企図される。成長ホルモンアンタゴニストは、約２２ｋＤａの分子量を有するが、また２０ｋＤａ形態および１７ｋＤａ形態でも存在し得、成長ホルモンアンタゴニストのこれらの形態もまた明らかに企図される。

「生物学的に活性な」物質とは、例えば、細胞により取り込まれるときに細胞の構造、機能または組成に観察し得る変化を生じさせる任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をいう。いくつかの実施形態において、上記物質は、動物タンパク質であり、いくつかの実施形態において哺乳動物タンパク質であり、いくつかの実施形態においてヒトタンパク質である。観察し得る変化としては、限定されないが、１以上のｍＲＮＡの発現の増加または減少、１以上のタンパク質の発現の増加または減少、タンパク質もしくは他の細胞成分のリン酸化または脱リン酸化、酵素の阻害または活性化、結合対のメンバー間の結合の阻害または活性化、代謝物の合成速度の増加または減少、細胞増殖の増加または減少、生物の表面的表現型に対する効果の増加または減少などが挙げられる。例えば、ＧＨ欠乏小児に対するｈＧＨの投与は、最終的には成長を促進する。または、先端巨大症の個体へのヒトＧＨアンタゴニストの投与は、低レベルのＩＧＦ−１という結果になり、上記疾患を臨床的に治癒する。生物学的に活性なタンパク質の断片は、ここでその断片は生物学的活性を維持し、明らかに企図される。

本方法は、植物において融合タンパク質を産生するのに使用される得ることもまた、注記されるべきである。融合タンパク質において改変された塩基性のタンパク質は、任意の起源、植物または動物であり得る。もちろん、動物起源たんぱく質は、ヒトタンパク質を含む。この書類のいたるところで、しばしばタンパク質のヒト形態について言及される。ヒトタンパク質に言及される場合、同じタンパク質が、多くの場合、他の非ヒト哺乳動物において見出される。これらの他の非ヒト哺乳動物タンパク質は、明らかに企図される。

（グリコシル化）
本発明は、全般に新規なアプローチを使用して植物における糖タンパク質を発現することを包含する。このアプローチは全般的に非ＨＲＧＰタンパク質／ペプチド／ポリペプチドについてグリコシル化部位をコードする核酸配列を遺伝子に、植物における翻訳後改変を引き起こすコードを使用して遺伝子操作する工程を包含する。グリコシル化の上記配列は、融合タンパク質を形成するのに上記遺伝子の一端または他端に結合する別々の単位として構築され得る。これらの遺伝子はまた、遺伝子産物を分泌するよう標的化する植物シグナルペプチド配列をコードするよう操作され得る。

グリコシル化の型としては、限定されないが、アラビノシル化およびアラビノガラクタン−多糖付加が挙げられる。アラビノシル化は、一般的に短鎖（例えば、一般的に約１〜５）アラビノオリゴ糖（一般的には、Ｌ−アラビノフラノシル残基）の付加が挙げられる。一方、アラビノガラクタン−多糖は、より大きく、そして一般的にＤ−ガラクトースおよびＬ−アラビノースの小さい側鎖の１，６−付加により、そして場合によってはＬ−ラムノースのような他の糖ならびにＤ−グルクロン酸およびその４−ｏ−メチル誘導体のような糖酸により１，６−付加で周期的に修飾されるコアβ−１，３−Ｄ−ガラクタン骨格から形成される。アラビノガラクタン−多糖はまた、アラビノフラノシルの小さい側鎖の１，６−付加により周期的に修飾されるコアβ−１，６−Ｄ−ガラクタン骨格の形態をとり得る。これらの付加化合物は、植物天然酵素系によりグリコシル化標的部位、すなわちグリコシル化部位を含むペプチド／ポリペプチド／タンパク質に付加されることは注記されるべきである。起こるグリコシル化の実際の分子構造においてバリエーションがあり得る。基本的に、植物細胞に付加され得る任意の糖は、限定されずに挙げられる。上記オリゴ糖鎖は、宿主細胞により提供され、そしてオリゴ糖鎖を構成し得る任意の糖が挙げられ得、限定されないが、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃが挙げられる。グリコシル化は、インビトロで達成し得ることは注記されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「糖構成単位」は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される少なくとも１つのプロリン残基を含むアミノ酸配列をいうよう意味される。本明細書で使用される場合、用語「グリコシル化部位」とは、ヒドロキシル化および引き続くグリコシル化の標的部位として作用する少なくとも１つのプロリン残基を含むアミノ酸配列をいうよう意味される。グリコシル化は、一般的に上記部位の１以上のプロリン残基のヒドロキシル化に続いて起きる。従って、グリコシル化部位内で、プロリン残基がヒドロキシル化されて、ヒドロキシプロリンを形成し得る。

グリコシル化の２つの主な型は、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質への１以上のグリコシル化部位の導入により本発明に従って達成される。グリコシル化は、一般的に２つの型である：１）アラビノガラクタン糖構成単位は、Ｈｙｐ残基がアラビノガラクタン付加生成物（その構造は上に記載される）でＯ−グリコシル化されるクラスター状の非連続性ヒドロキシプロリンを含み；そして２）アラビノシル化糖構成単位は、Ｈｙｐ残基のいくつかまたは全てが約１〜５の残基長のアラビノース鎖でアラビノシル化（Ｏ−グリコシル化）される連続性Ｈｙｐ残基を含む。グリコシル化の標的部位および連続性Ｈｙｐ理論に関するより詳細な議論について以下の米国特許および公開出願を参照のこと：米国特許番号第６，５４８，６４２号、同第６，５７０，０６２号、同第６，６３９，０５０号および出願番号２００４／０００９５５５号および同２００４／０００９５５７号。これらの特許および特許出願の各々の全体的な開示は、本明細書に参考として援用される。

特に、グリコシル化部位は以下のように導入され得る。アラビノガラクタン糖構成単位（ここで、上記グリコシル化部位はクラスター状の非連続性Ｈｙｐ残基である）に関して、遺伝子は、（Ｐｒｏ−Ｘ）_ｎおよび（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎ、ここでｎ＝１〜１０００であり、ならびに（Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ_１〜９）、ここでＸはＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、もしくはＶａｌであるか、またはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、もしくはＶａｌである、のバリエーションをコードする。他の実施形態において、ｎは、２、３、５、５、６、７、８、９、１０、５０、１００もしくは５００より大きいか、または９９９、９９８、９９７、９９６、９９５、９９４、９９３、９９２、９９１、９９０、９００、８００、７００、６００、もしくは５００より小さい；ｎは、１〜１０００の間の任意の数から任意の数の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ｎは、１〜１００もしくは１〜７５、もしくは１〜５０、もしくは２〜２５、もしくは２〜１０または２〜６の範囲である。これらの配列のプロリン残基の多くは、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）にヒドロキシル化され、そして引き続きアラビノガラクタンオリゴ糖またはアラビノガラクタン多糖でＯ−グリコシル化される。（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎ繰返しまたは（Ｐｒｏ−Ｘ）_ｎ繰返しは、互いに他のアミノ酸が点在し得、そしてこのような点在した繰返し基が明らかに企図されることは注記されるべきである。Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａがＸに対応するように特に同定される一方、任意のアミノ酸がその目的に役立ち、そしてそのモチーフが植物においてグリコシル化されると考えられる。注記されるように、Ｘは、より好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＶａｌから選択される。

アラビノシル化糖構成単位（ここで、グリコシル化部位は連続性Ｈｙｐ残基である）に関して、発現のために設計された遺伝子は、連続性Ｐｒｏ（Ｐｒｏ）_ｎをコードし、ここでｎは２〜１０００である。他の実施形態において、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、もしくは５００より大きいか、または９９９、９９８、９９７、９９６、９９５、９９４、９９３、９９２、９９１、９９０、９００、８００、７００、６００もしくは５００より小さく；ｎは２〜１０００の間の任意の数から任意の数までの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ｎは、１〜１００もしくは１〜７５、もしくは１〜５０、もしくは２〜２５、もしくは２〜１０または２〜６の範囲である。これらの配列のプロリン残基のほとんどは、ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化され、そして引き続き１〜５個のアラビノース残基の大きさの範囲のアラビノシドでＯ−グリコシル化される。（Ｐｒｏ）_ｎ繰返しは、他のアミノ酸が点在し得、そしてこのような点在した繰返し基が明らかに企図されることは注記されるべきである。

混乱を避けるために、核酸構築物および遺伝子に言及する場合、ヌクレオチドは、プロリンをコードし、ヒドロキシプロリンはコードしない事実を反映することを注記されるべきである。従って、核酸構築物、遺伝子などはＰｒｏまたはＰ（一文字表記）をいう。繰返し単位をコードする遺伝子を言及する場合、以下のようであり得る：（ＳＰ）_１０は、Ｓｅｒ−Ｐｒｏの１０の繰返し単位をコードする核酸構築物をいう。植物において産生されるペプチド／ポリペプチド／タンパク質を区別するために、ヒドロキシプロリン、もしくはｈｙｐまたはＯ（１文字表記）と言及される。従って、一度上記（ＳＰ）_１０が植物において発現されると、それは（ＳＯ）_１０として言及され得る。

単一の糖タンパク質内の糖構成単位の任意の組み合わせもまた、なされ得る。すなわち、糖タンパク質は、アラビノシル化糖構成単位およびアラビノガラクタン糖構成単位を含む。従って、単一の遺伝子構築物は、１以上のアラビノシル化部位および／または１以上のアラビノガラクタン多糖部位をコードする核酸配列を含み得、植物宿主において発現されるときにヒドロキシル化され、そしてグリコシル化される。

グリコシル化のための上記部位は、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質のいずれかまたは両方の末端に配置され得、そして／あるいは所望の場合、分子の内部に配置され得る。例えば、より小さい分子においては、Ｎ−末端またはＣ−末端はグリコシル化部位の付加により改変され得；より大きな分子においては内部置換がより望ましくあり得る。もちろん、より小さな分子は、内部で改変され得、そしてより大きな分子はいずれかの末端もしくは両方の末端において改変され得る−選択は実施者に委ねられる。

膜貫通酵素または膜固定化酵素の場合、膜貫通ドメインまたは膜固定化ドメイン（例えば、ＥＲ膜／ゴルジ膜と関連するグリコシルトランスフェラーゼの本質的な傾向を避けて）をＮ−末端分泌シグナル配列で置換し、続いて例えば、短い（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎ繰返しまたは（Ａｌａ−Ｈｙｐ）_ｎ繰返しのようなグリコシル化配列で置換してＮ−末端を改変する、構築物が調製され得る。（例えば、いくつかの酵素（例えば、グリコシル化トランスフェラーゼ）は、多くの場合、上記酵素を膜に固定するＮ−末端膜貫通配列をシグナル配列および糖構成単位で置換し、グリコシル化トランスフェラーゼがグリコシル化されＥＲ膜またはゴルジ膜に留まらずに分泌されることを可能にすることにより、改変され得る。）上記導入遺伝子は、内膜系を通って分泌するためのシグナル配列をコードするよう設計される。全体の分子を分泌するよう標的化する分泌シグナル配列を使用する戦略は、いずれの構築物においても使用され得、通常の膜に連結したタンパク質、膜貫通タンパク質または膜固定化タンパク質に限定されない。

グリコシル化部位の付加およびそれに続くグリコシル化は、それがアラビノシル化および／またはアラビノガラクタン多糖付加であろうと、多くの異なる効果を有し得る。いくつかの例において、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質のグリコシル化は、他は同一であるが非グリコシル化生成物と比較すると、発現された生成物の収率および分泌が増加する。すなわち、アラビノシル化またはアラビノラクタン多糖付加の少なくとも１部位を付加することは、付加なしで発現された生成物と比較して分泌生成物の収率が増加する結果になる。収率は、約１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくは１０００％またはそれより多く増加する。

グリコシル化は、目的のペプチド／ポリペプチド／タンパク質の単離に関してさらなる手段を提供する。例えば、タンパク質遺伝子にグリコシル化部位を導入し、引き続き植物において上記遺伝子を発現させることにより、生成物はアフィニティクロマトグラフィにより、またはレクチンベースのクロマトグラフィーの使用により、単離および／または分離され得る。

アラビノオリゴ糖またはアラビノガラクタン多糖の付加は、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の物理化学的活性に対する効果を有し得る。上記付加は、分子量を増加し、等電点を変化させ、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の他の媒体についての効果を改変する能力を変化させ得る。例えば、グリコシル化は、タンパク質の乳化剤として作用する能力を増加する効果を有し得る。従って、本発明により作製された糖タンパク質は、乳化剤として使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の糖タンパク質は、乳化剤として作用し、糖タンパク質の投与を改善しまたは別の生物学的に活性な物質の投与を改善するために、薬学的組成物中で乳化剤と組み合わせられる。

グリコシル化は上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の分子量を増加し得る。上記グリコシル化は、上記糖タンパク質の１％、２％、３％、４％、５％、８％、１２％、１６％、２４％、３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらにより高い％を占め得る。グリコシル化は、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質に対して０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｋＤａまたはより多くを付加し得る。一般的にグリコシル化は、任意の％の増加により分子量を増加し得る。

本発明によるタンパク質のグリコシル化は、不溶性タンパク質を可溶化し得、既に可溶性のタンパク質の溶解度を増加し得る。従って、いくつかの実施形態において、これらの方法により改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、野生型タンパク質では干渉溶液を必要とする水中で単離され得、または溶解され得る。本発明のいくつかの実施形態において、上記糖タンパク質は野生型タンパク質（適切に取り扱われないと凝集しそして多重結合体を形成する）と比較するとより安定である。

特に、成長ホルモンおよび成長ホルモンアンタゴニストの溶解度に関して、溶解度は、非グリコシル化型の溶解度より増加する。非グリコシル化形態においては溶解に必要とされる他の要素の非存在下において、溶解度の増加が観察される。溶解度は、約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍｇ／ｍｌ以上またはより大きい値であり得る。

本発明によるペプチド／ポリペプチド／タンパク質のグリコシル化は、酵素分解に対する抵抗性を増加する所望の効果を有し得る。何故このようになるかは完全には明らかではないが、本発明により付加された大きな炭水化物置換基が、酵素分解部位への接近を遮断もしくは抑制するように考えられる、従って、ペプチダーゼは、特定の端末または特定のアミノ酸配列に特異性を有し得、グリコシル化は、これらの部位へのペプチダーゼの接近を遮断、遅延または妨害する。これらの保護的効果は、有効保存期間の増加、微生物による分解の減少、胃腸管透過の可能性の増加および従っていくつかの場合には、経口投与を可能にすることを含む、多くの現実の実用性を有する。

いくつかの実施形態において、凍結乾燥された本発明の改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、容易に溶解し得るが、野生型ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、より溶解し難い。本発明のこの局面は、例えば、凍結乾燥された本発明の改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質を注射（例えば、筋肉内注射（ＩＭ）、皮下注射（ＳＣ）、静脈内注射（ＩＶ）または腹腔内注射（ＩＰ）であり得る）の前に再構成することにおいて重要であり、このことにおける有用性をもたらす。野生型ペプチド／ポリペプチド／タンパク質が、溶解し難いものであり得、緩衝液、塩または他の溶解成分を必要とし、これによって、注入時に火傷または刺激を引き起こし得る場合、本発明のいくらかの改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、これらの望ましくない添加剤を避け得る。従って、１つの実施形態において、例えば、改変されたヒト成長ホルモンは、本発明に従ってマンニトール非存在下で作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、マンニトールを除く。１つの実施形態において、改変されたヒト成長ホルモンは、添加グリシンの非存在下で、本発明に従って作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、添加グリシンを除く。１つの実施形態において、改変されたヒト成長ホルモンは、添加ロイシンの非存在下で、本発明に従って作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、添加ロイシンを除く。１つの実施形態において、改変されたヒト成長ホルモンは、添加リン脂質の非存在下で、本発明に従って作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、添加リン脂質を除く。１つの実施形態において、改変されたヒト成長ホルモンは、添加トレハロースの非存在下で、本発明に従って作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、添加トレハロースを除く。１つの実施形態において、改変されたヒト成長ホルモンは、添加ヒスチジンの非存在下で、本発明に従って作製され、調製されそして包装される；注射用の凍結乾燥散剤または溶液は、添加ヒスチジンを除く。実際に、本発明の改変されたヒト成長ホルモンは、例えば、他の成長ホルモン処方物に通常必要とされる任意の賦形剤を除き得る。

物理化学的な性質に対するこれらの効果は、生物学的活性に影響を及ぼさずに達成され得る。しかし、いくつかの場合、グリコシル化は、付加的な利点を与える。

溶解度の増加および溶解し易さが原因で、本発明のいくつかの改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、薬学的効果のために肺への吸入により送達され得る。例えば、野生型タンパク質は、添加剤なしで溶解は難しいものであり得る。凍結乾燥された散剤形態における上記野生型タンパク質の吸入時に、肺の膜における溶解は、非常に遅い。このことは、ａ）取り込み速度を遅延し、ｂ）微粒子物質の貪食作用を可能にし、そしてｃ）線毛が微粒子物質を肺の上部および外側に運ぶのを可能にする。しかし、本発明の改変されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、はるかに早く溶解し得、それにより取り込み速度を増加し、貪食作用の機会を減少し、そして線毛作用を通じての排出を抑制する。正味の効果は、吸入により送達され得る薬物の作製であり、そのような送達は、野生型薬物については実現可能ではない。

生物学的活性を有するペプチド／ポリペプチド／タンパク質のいくつかの実施形態において、アラビノシル化および／またはアラビノガラクタン多糖付加は、その生物学的活性を変化し得る。生物学的活性の変化は、例えば、薬力学的であり得、すなわち、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質のアゴニスト活性および／またはアンタゴニスト活性を改変し得る。例えば、改変されたアゴニストは、アンタゴニスト活性を示し得る；従って、アンタゴニストは、アゴニストから作製され得る。他の例において、改変は、レセプター親和性の増加または減少を引き起こす。

生物学的活性の変化は、例えば、薬力学的であり得、すなわち、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の吸収、分布、組織における局在化、生体内変化および／または排泄を改変し得る。例えば、グリコシル化ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、非グリコシル化ペプチド／ポリペプチド／タンパク質と比較して、バイオアベイラビリティまたは半減期の増加を示し得る。バイオアベイラビリティまたは半減期は、約１０％、約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、もしくは約１０００％またはそれ以上増加し得る。

バイオアベイラビリティは、一般的に、曲線下面積（ＡＵＣ）により測定され得る。上記曲線下面積は、薬物投与後の時間に対する薬物の血漿濃度（その濃度の対数ではない）のプロットである。上記面積は、一般的に、台形規則により決定され得、ここでそのデータポイントは、直線区分で連結され、垂線が、横座標から各データポイントへ直立し、そのように構築された三角形の面積および台形の面積の総和が計算される。曲線下面積は、この値を計算するための当該分野において公知の任意の手段により計算され得る。本発明に従って、ＡＵＣは、約１０％、約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、もしくは約１０００％またはそれ以上増加し得る。

バイオアベイラビリティの増加はまた、ピーク血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）の増加において反映され得る。本発明に従って、ピーク血漿濃度は、約１０％、約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、もしくは約１０００％またはそれ以上増加し得る。

従って、本発明に従って産生される生物学的に活性なタンパク質は、半減期の延長および／またはバイオアベイラビリティの増加を示す利点を有し得る。これがどのようにして生じるかも、何故起こるかということも、完全には明らかではないが、これは、本発明の炭水化物モチーフにより上記生物学的分子に付与される電荷およびサイズの増加と関連し得る。

本発明に従うグリコシル化の別の効果は、免疫原性の変化も抗原性の変化も無いことである。従って、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の免疫原性または抗原性は、本発明による糖タンパク質としてそれを産生することによって不変であり得る。いくつかの実施形態において、その免疫原性または抗原性は、実際には減少する。変化なしまたは減少なしのいずれかの場合、これは、望ましい生物学的効果を示すがその免疫原性／抗原性により抑制される、ワクチンまたは他の非経口的に導入される分子に関して重要である。具体的例としては、限定されないが、β−アミロイドペプチドが挙げられる。

基礎のタンパク質と比較して低減した免疫原性（またはアレルゲン性）は、抗体が上記コアタンパク質を認識する能力（認識できない能力）から生じ得る。しかし、上記炭水化物部分はまた、抗体のエピトープであり得、従って、免疫原またはアレルゲンとして機能し得ることもまた、留意されるべきである。抗体にこれらの炭水化物部分を非自己として認識させるのに何が必要かは、明らかではないが、本発明に従って製造される糖タンパク質は、アレルギー免疫治療のための感作剤として役立ち得ると考えられる。すなわち、本発明に従って作製される糖タンパク質は、アレルギー応答を低減するという望ましい長期間の効果を備えて、反復注入のために使用され得る。特に、アラビノシル化糖タンパク質（糖ペプチドまたはグリコシル化アミノ酸（例えば、少なくとも１つのアラビノースが結合している単一のヒドロキシプロリン）でさえも含む）は、糖構成単位Ｘ−Ｈｙｐ_ｎを含み、アレルギー免疫治療に有用であると考えられる。

（ペプチド／ポリペプチド／タンパク質）
本発明により改変され得るペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、限定されないが、ヒトおよび他の哺乳動物および／または脊椎動物、非脊椎動物、植物、海綿動物、細菌、真菌、藻類、古細菌などを含む、種々の生物由来であり得る。さらに、合成タンパク質および合成ペプチドが、明示的に企図され、任意のタンパク質の誘導体およびアナログ（例えば、アンタゴニスト、ペプチドアゴニストもしくはペプチドアンタゴニスト）または抗体もまた同様に企図される。

上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、大きくても小さくてもよく、モノマーであっても多量体であってもよく、そして任意の型の有用性を有する。いくつかの実施形態において、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、小さい（例えば、約２５ｋＤａより小さい）。本発明によるグリコシル化により、それらの分子量は、４０ｋＤａ以上へと増加し得る。

いくつかの実施形態において、上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、ジスルフィド結合形成またはＮ結合型グリコシル化を除いて、翻訳後に修飾されない。いくつかの実施形態において、多くのプロリン残基を有するペプチド（これは、ヒドロキシル化および引き続くＨｙｐ−グリコシル化の標的となり得る）は、避けられる。

本発明を使用して発現され得るペプチド／ポリペプチド／タンパク質としては、限定されないが、成長ホルモンスーパーファミリーの分子（限定されないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲンおよび他のインターロイキンが挙げられる）が挙げられる。他の具体的な例としては、限定されないが、単球化学誘導タンパク質１、インターロイキン１０、プレイオトロピン、インターロイキン７、インターロイキン８、インターフェロンω、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンγ、インターロイキン１、線維芽細胞増殖因子６、ＩＧＦ−１、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、副腎皮質刺激ホルモン、β−アミロイド、アミリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（例えば、α）、ボンベシン、ブラジキニン、脳ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ダイノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン（例えば、エンドセリン１、エンドセリン２、およびエンドセリン３）、エンケファリン、上皮増殖因子、胃抑制性ペプチド、ガストリン、ガストリン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、カタカルシン、黄体化ホルモン放出ホルモン、ニューロキニン（例えば、ニューロキニンＡおよびニューロキニンＢ）、ニューロメジン（例えば、ニューロメジンＢおよびニューロメジンＣ）、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オキシトシン、膵ポリペプチド、パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｓｔｉｎ）、パンクレアスタチン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、トランスフォーミング増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子α）、血管作用性腸ペプチド、バソプレシン、バソトシン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ＰＯＲＦ−１およびＰＯＲＦ−２（視索前調節因子）、およびＰＹＹ３−３６が挙げられる。また、任意のタンパク質増殖因子、ホルモン、抗体、サイトカイン、癌タンパク質（癌の原因になるタンパク質）、リンホカインまたはそれらの誘導体も、含まれる。また、代謝プロセスに関連するタンパク質も含まれ、限定されないが、インスリン、グレリン、レプチン、アジポネクチン、レジスチンなどが挙げられる。

例えば、本発明は、改変された成長ホルモンを発現するのに使用され得る。成長ホルモン（ＧＨ）は、下垂体により分泌される。それは、種々の生物学的活性を示す約２２ｋＤａのタンパク質である。成長ホルモン分泌過多は、巨人症および／または先端巨大症を生じるが、成長ホルモン分泌不全は、小人症を生じる。ｈＧＨをコードする核酸、植物シグナル配列をコードする核酸と一緒にヒドロキシプロリングリコシル化部位をコードする核酸を含む組換えＤＮＡ構築物が、調製され得る。ヒドロキシルプロリングリコシル化部位をコードする上記核酸は、Ｘ−Ｐｒｏ_ｎ（またはＰｒｏ_ｎ−Ｘ）をコードし得、ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌまたは任意のアミノ酸であり、あるいはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、ｎは２〜１０００であるか；あるいは上記核酸は、Ｘ−Ｐｒｏ_ｎ（またはＰｒｏ_ｎ−Ｘ）コードし得、ここでＸは、任意のアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＶａｌ、あるいはより好ましくはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＶａｌ）であり、ｎは１〜１０００である。嵩高いアミノ酸に関しては、ＸＰＰＰＰＰシリーズの最初のＰｒｏは、ヒドロキシル化されないかもしれないが、他はヒドロキシル化される。１つの実施形態において、例えば、上記核酸は（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）_１０をコードする。１つの実施形態において、ｈＧＨは、ＧＨ−（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）_１０（Ｎ末端またはＣ末端で改変される）として発現される；上記Ｐｒｏは、植物によりヒドロキシル化され、その後、アラビノガラクタン鎖でグリコシル化される。上記生成物は、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０を含むｈＧＨ糖タンパク質である。上記糖タンパク質は、野生型ｈＧＨと同じ活性を示すが、顕著に増加した薬物速度論的半減期を示す。（本実施形態の産生および試験が、本明細書下記の実施例６において、より詳細に記載される。）
本発明に従って改変されたＨＧＨは、単回皮下（ＳＣ）注射の後、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、もしくは約２４時間またはそれより長い時間、ピーク血漿濃度を生じ得る。これは、野生型成長ホルモンの半減期（約２０分間〜約３０分間の半減期を示す）に対して実質的に増加する。

１つの実施形態において、ｈＧＨをコードする核酸は、ｈＧＨアンタゴニストを作製するよう操作され、上記グリコシル化部位が、Ｃ末端に付加される。例えば、１１９位のＧｌｙ（種々の野生型動物の成長ホルモンにおいて見出される）または（ｈＧＨの）Ｇｌｙ１２０は、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換されてアンタゴニストを生じ得る。１つの実施形態において、ｈＧＨのＧｌｙ１２０は、Ｌｙｓで置換され、ヒト成長ホルモンアンタゴニストを生成する。また、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフが、Ｃ末端に結合される。その結果は、ｈＧＨ活性を示し、かつ２０分間〜３０分間である非グリコシル化ｈＧＨアンタゴニストの半減期と比較して増加した半減期を示す、糖タンパク質である。

もちろん、同様の構築物が、成長ホルモンの２０ｋＤの改変体で作製され得、同様の結果を伴う。例えば、１０４位のＧｌｙ（種々の野生型動物の２０ｋＤａ成長ホルモンにおいて見出される）または（その２０ｋＤａヒト成長ホルモンの）Ｇｌｙ１０５は、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換されてアンタゴニストを生じ得る。１つの実施形態において、ｈＧＨ（２０ｋＤａ形態）のＧｌｙ１０５は、Ｌｙｓで置換されてｈＧＨアンタゴニストを生じる。また、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０モチーフが、Ｃ末端で結合される。

１つの実施形態において、ｈＧＨをコードする上部核酸は、上記タンパク質の内側部分にヒドロキシプロリングリシル化部位を挿入するよう操作される。２２ｋＤａのＧＨの場合、例えば、通常１１９位または１２０位にあるＧｌｙが、欠失され、その場所に、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが挿入される。この構築物で、上記プロリンは、ヒドロキシル化され、その後アラビノシル化される。その結果は、半減期の増加したアンタゴニストである。

以下のより全般的な説明は、本発明に従って作製され得る成長ホルモンスーパーファミリーの融合ペプチド／融合タンパク質について情報を与える。本発明の１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ａ）少なくとも１つの糖構成単位、およびｂ）下記に定義されるような、ＧＨ−ＰＲＬ−ＰＬスーパーファミリーに属する天然の脊椎動物ホルモンを含む。脊椎動物成長ホルモン、プロラクチンまた胎盤ラクトゲンが、特に興味深い。

本発明の別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ａ）少なくとも１つの糖構成単位と、ｂ）天然の脊椎動物成長ホルモン、プロラクチンまたは胎盤ラクトゲンと実質的に同一であるが完全には同一ではない生物学的に活性な変異体ペプチドとを、含む。

用語「天然（に存在する）」とは、ヒトの介入が存在しないことを前提とする。すなわち、トランスジェニックマウスが外来タンパク質を産生するよう遺伝子的に操作されているという事実は、対象外来タンパク質がマウスにおいて天然に生じることを意味するものではない。

この変異体は、アゴニストであり得る。すなわち、それは、脊椎動物成長ホルモン、プロラクチンまたは胎盤ラクトゲンの少なくとも１つの生物学的活性を有する。成長ホルモンがよりよいプロラクチンアゴニストまたは胎盤ラクトゲンアゴニストになるように改変され得ること、およびその逆が、留意されるべきである。上記変異体は、ＢｌａｓｔＰによるアライメント後に、それが何らかの公知の脊椎動物プロラクチンまたは胎盤ラクトゲンと同一性を有するよりも高い同一性を脊椎動物成長ホルモンと有する場合に、成長ホルモン変異体として特徴付けられ得る。プロラクチン変異体および胎盤ラクトゲン変異体が、同様に定義される。

あるいは、上記変異体は、脊椎動物成長ホルモンのアンタゴニスト、プロラクチンのアンタゴニストまたは胎盤ラクトゲンのアンタゴニストであり得る。一般的に、企図されるアンタゴニストは、レセプターアンタゴニストであり、すなわち上記レセプターに結合するがそのレセプターを実質的には活性化せず、それにより競合阻害機構を介してレセプター活性と拮抗する分子である。生物学的に活性なＧＨレセプターアンタゴニストをコードするＧＨ変異体の最初の同定は、Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、米国特許第５，３５０，８３６号、同第５，６８１，８０９号、同第５，９５８，８７９号、同第６，５８３，１１５号および同第６，７８７，３３６号ならびにＣｈｅｎら、１９９１、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｏｕｓｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）ａｎｄ ａ ＧＨ ａｎａｌｏｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｗａｒｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：１４０２〜１４０８、Ｃｈｅｎら、１９９１、「Ｇｌｙｃｉｎｅ １１９ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５：１８４５〜１８５２、ならびにＣｈｅｎら、１９９１、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ．ａｌｐｈａ．−ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｉｔｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２５２〜２２５８においてであった。これらの参考文献の全て（これ以降「Ｋｏｐｃｈｉｃｋら（上述）」）は、全体として本明細書中で参考として援用される。

上記変異体ポリペプチドがＧＨ−ＰＲＬ＿ＰＬスーパーファミリーの何らかの脊椎動物ホルモンと実質的に同一か否かを決定するために、上記変異体ポリペプチド配列は、そのスーパーファミリーの第１参照脊椎動物ホルモンの配列と整列され得る。アライメントの１つの方法は、スコアリングマトリックスおよびギャップペナルティのデフォルト設定を使用する、ＢｌａｓｔＰによる。１つの実施形態において、その第１参照脊椎動物ホルモンは、そのようなアライメントが最低のＥ値（すなわち、良好またはより良好なアライメントスコアを有するアライメントが偶然に発生する確率が、最低である）を生じるホルモンである。あるいは、その第１参照脊椎動物ホルモンは、そのようなアライメントが最高の同一性％を生じるものである。

一般的に、上記変異体ポリペプドアゴニストは、その差異全てが、（１）同類のタンパク質のファミリーにおいて優先的に交換されることが公知であるアミノ酸の保存的置換、（２）関連する生物学的活性の喪失をもたらす可能性がないことが公知であるかまたは（例えば、アラニンスキャニング変異誘発により）決定可能であるアミノ酸位置の非保存的置換、あるいは（３）ＧＨ−ＰＲＬ−ＰＬスーパーファミリー内（またはより具体的には、関連ファミリー内）で観察される変化（置換、挿入、欠失）であることが確認され得る場合には、上記参照脊椎動物ホルモンと実質的に同一であると考えられる。上記変異体ポリペプチドアンタゴニストは、さらに、１以上のレセプター拮抗変異により上記参照脊椎ホルモンとは異なる。

上記ポイント（３）を挿入および欠失に適用することに関して、上記変異体ポリペプチドを、少なくとも２つの異なる参照ホルモンと整列することが必要である。これは、各参照ホルモンと上記変異体ポリペプチドとの対合アライメントによりなされる。

２つの配列を互いに対して整列する場合、上記アライメントアルゴリズムは、一方または両方の配列中にギャップを導入し得る。配列ＢにおけるＸ位に対応する１ギャップ長が配列Ａにおいて存在する場合、（１）配列Ａは、配列ＢのＸ位のアミノ酸の欠失により配列Ｂと異なる、または（２）配列Ｂは、配列Ｂの（Ｘ−１）位および（Ｘ＋１）位と整列された配列Ａのアミノ酸の間における配列ＢのＸ位のアミノ酸の挿入により、配列Ａと異なると、同等に言い得る。

第１参照ホルモンに対する変異体配列のアライメントが上記変異体配列においてギャップを作製する場合、上記変異体配列は、第１参照ホルモンのその位置におけるアミノ酸の欠失により、第１参照ホルモンと異なると特徴付けられ得、そのような欠失は、別の参照ホルモンが同様に第１参照ホルモンと異なる場合、条項（３）を受けて容認される。

同様に、第１参照ホルモンに対する変異体配列のアライメントが上記参照配列にギャップを作製する場合、上記変異体配列は、第１参照ホルモンのそのギャップで整列されたアミノ酸の挿入により、第１参照ホルモンと異なると特徴付けられ得、そのような挿入は、別の参照ホルモンが同様に第１参照ホルモンと異なる場合という条項（３）の下で、見出される。

本発明の上記の好ましい脊椎動物ＧＨ由来ＧＨレセプターアゴニストは、ポリペプチド配列Ｐを含む融合タンパク質であり、そのポリペプチド配列Ｐについて、もしあれば、上記アミノ酸配列と第１参照脊椎動物成長ホルモンのアミノ酸配列との差異が、以下：
（ａ）対応する第１参照脊椎動物成長ホルモン残基についての保存的置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）；
（ｂ）対応する第１参照脊椎動物成長ホルモン残基についての非保存的置換の置換であって、ここで；
（ｉ）対応するアミノ酸が、対応する第１参照脊椎動物成長ホルモンの非保存的置換である、別の参照脊椎動物成長ホルモンが存在し、そして／または
（ｉｉ）第１参照脊椎動物成長ホルモンの単一置換変異体（上記対応する残基（アラニンでない）が、アラニンにより置換されている）の結合親和性が、第１脊椎動物成長ホルモンが天然で結合する脊椎動物成長ホルモンレセプターの結合親和性の少なくとも１０％である；
（ｃ）上記第１参照脊椎動物成長ホルモンには見出されるが、別の参照脊椎動物成長ホルモンにおいては欠失している１以上の残基の、欠失；
（ｄ）上記第１参照脊椎動物成長ホルモンの隣接アミノ酸位置の間における、その第１参照脊椎動物成長ホルモン中への１以上の残基の挿入（ここで、別の参照脊椎動物成長ホルモンが、上記第１参照脊椎動物成長ホルモンの同じ位置への挿入により上記第１参照成長ホルモンと異なる）；ならびに
（ｅ）上記第１参照脊椎動物成長ホルモンにおいて見出される最初の１残基〜８残基、１残基〜６残基、１残基〜４残基もしくは１残基〜３残基、および／または最後の１残基〜８残基、１残基〜６残基、１残基〜４残基もしくは１残基〜３残基の短縮化（「短縮化」とは、そのペプチドのＮ末端またはＣ末端における残基の欠失をいうことが意図される）；
からなる群より独立して選択され、
ここで上記ポリペプチド配列は、脊椎動物成長ホルモンレセプター（好ましくは上記第１脊椎動物成長ホルモンが天然に結合するもの）に対する上記第１脊椎動物成長ホルモンの結合親和性のうちの少なくとも１０％を有し、そして
上記融合タンパク質が、脊椎動物成長ホルモンレセプターに結合し、そしてそれによりその脊椎動物成長ホルモンレセプターを活性化する。
本発明者らは、上記融合タンパク質を「ＧＨ由来」として特徴付ける。なぜなら、上記ポリペプチド配列Ｐは、上記で定義されるような、脊椎動物ＧＨまたは脊椎動物ＧＨ変異体としてみなされるからである。

成長ホルモンは、同じ種で見出される成長ホルモンレセプターに天然で結合する。すなわち、ヒト成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンレセプター、ウシ成長ホルモンレセプター、ウシＧＨレセプターなどと結合する。

異なる生物の相同性タンパク質の間のアミノ酸変化の頻度分析（例えば、ＳｃｈｕｌｚおよびＳｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅの表１〜２ならびにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ, Ｐｒｏｔｅｉｎｓの図３〜９に提示されるアミノ酸変化）に基づいて、本発明者らは、下に示される群：
Ｉ． 小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性残基−−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
ＩＩ． 負に荷電した残基およびそれらのアミド−−Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＩＩ． 正に荷電した残基−−Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＶ． 大きい脂肪族の非極性残基−−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
Ｖ． 大きい芳香族残基−−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
の中での交換として、保存的置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を定義する。
３つの残基が、タンパク質構造におけるそれらの特別の役割故に括弧に入れてある。Ｇｌｙは、側鎖のない唯一の残基であり、従って、その鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは、鎖その鎖をしっかりと束縛する独特な構造を有する。Ｃｙｓは、ジスルフィド結合に関与し得、そのジスルフィド結合は、タンパク質を特定のフォールディング状態へと保持する；ｂＧＨの４つのシステインは、高度に保存される。

Ｉ／ＩＩを交換する変異、またはＩＩＩ／ＩＶ／Ｖを交換する変異は、半保存的と考えられ得、これは、非保存的変異の部分集合である。非保存的変異（これは、半保存的として特徴づけられない）は、「強く非保存的」であると特徴づけられる。

ヒト成長ホルモンレセプターに対して結合することに関して、結合親和性は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ「Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１０８１（１９８９）に記載される方法により決定され、そしてｈＧＨＲｂｐを標的として使用する。ヒトプロラクチンレセプターに対して結合することに関して、結合は、ＷＯ９２／０３４７８に記載される方法により決定され、従って、ｈＰＲＬｂｐを標的として使用する。非ヒト脊椎動物ホルモンレセプターへの結合に関し、結合親和性は、上記レセプターの細胞外結合ドメイン、上記精製したレセプター全体および未精製のレセプター源（例えば、膜調製物）の使用（優先順）によって、決定される。

上記レセプター結合融合タンパク質は、好ましくは、脊椎動物において成長促進活性を有する。成長促進（または成長阻害）活性は、Ｋｏｐｃｈｉｃｋらに示されるアッセイにより決定され得、それはマウスにおいてＧＨアゴニストまたはＧＨアンタゴニストのトランスジェニック発現に関与する。あるいは、それは、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に対する、ＧＨアゴニストまたはＧＨアンタゴニストの薬学的投与の効果を試験することにより決定され得る。

好ましくは、以下のさらなる条件：
（１）上記ポリペプチド配列Ｐは、上記第１参照脊椎成長ホルモンに対して、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％、同一である；
（２）上記保存的置換アミノ酸が、高度に保存された置換アミノ酸である；
（３）条項（ｃ）に下でのどの欠失も、上記脊椎動物成長ホルモンファミリーの保存された残基の位置に位置せず、より好ましくは哺乳動物成長ホルモンサブファミリーの保存された残基位置ではない；
（４）第１参照脊椎動物成長ホルモンが、哺乳動物成長ホルモンであり、より好ましくはヒト成長ホルモンまたはウシ成長ホルモンである；
（５）条項（ｄ）の下でのどの挿入も、上記第１参照脊椎動物成長ホルモンの同じ位置における等しい長さの挿入により上記第１参照成長ホルモンとは異なる、別の参照脊椎動物成長ホルモンが存在するような長さである；
（６）上記差異が、条項（ａ）および／または条項（ｂ）に従う置換に限定される；
（７）第１参照脊椎動物成長ホルモンが非ヒト成長ホルモンであり、意図される使用が、上記ヒト成長ホルモンレセプターを結合することまたは活性化することにおいてである場合、上記差異は、ヒト成長ホルモンに対する全体的同一性を増加する；
（８）その置換のうちの１つ以上が、下記に記載されるようなｈＧＨ変異体Ｂ２０２４および／またはＢ２０３６を特徴付ける変異のうちの１以上からなる群より選択される；
（９）上記ポリペプチド配列Ｐが、上記第１参照脊椎動物成長ホルモンに対して、少なくとも５０％、より好ましくは５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはアゴニストである場合には、最も好ましくは少なくとも１００％類似する；あるいは
（１０）上記ポリペプチド配列Ｐは、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスおよびギャップペナルティ−１１（ギャップ作製に対して）およびギャップペナルティ−１（ギャップ伸長に対して）を使用するＢｌａｓｔＰにより第１参照脊椎動物成長ホルモンに対して整列された場合、Ｅ値が、ｅ−１０より小さく、より好ましくはｅ−２０、ｅ−３０、ｅ−４０、ｅ−５０、ｅ−６０、ｅ−７０、ｅ−８０、ｅ−９０より小さく、または最も好ましくはｅ−１００より小さい、アライメントを生じる；
のうちの１つ以上が、適用される。

条項（１）の目的のためには、同一性％は、ＢｌａｓｔＰ法により計算され、すなわち、内部ギャップを含む整列された重複領域の％として同定する。条項（２）の目的のためには、高度に保存されたアミノ酸置換は、以下の通りである：Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｌｙｓ、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、およびＰｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ。条項（３）の目的のためには、上記保存された残基位置は、その配列が一般に利用可能な出願時の配列データベースにあるすべての脊椎動物成長ホルモンが、本明細書に教示されるように整列される場合、上で定義されるように、同じ保存的置換交換群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）に属するアミノ酸によってのみ占められる残基位置である。保存されていない残基位置は、異なる交換群に属するアミノ酸によって占められる残基位置、および／または上記脊椎動物成長ホルモンのうちの１つ以上において占められない（すなわち、欠失されている）残基位置である。脊椎動物成長ホルモンファミリーの完全に保存された残基位置は、上記脊椎動物成長ホルモンのすべてにおいて同じアミノ酸によって示される残基位置である。条項（ｃ）は、完全に保存された残基位置の１つに残基の欠失を許容しない。同様に、哺乳動物成長ホルモンファミリーの完全に保存された、保存されたおよび保存されていない残基位置を定義する。

条項（４）の目的のためには、ｈＧＨは、好ましくは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＳＯＭＡ＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ０１２４１、アイソフォーム１（２２ｋＤａ）に示される配列の成熟部分（ＡＡ２７〜２１７）に対応するｈＧＨ形態であり、ウシ成長ホルモンは、好ましくは、Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．Ｌ．、Ｍａｒｔｉａｌ Ｊ．Ａ．、Ｂａｘｔｅｒ Ｊ．Ｄ．；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ ｔｏ
ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｍＲＮＡ」；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：７５２１〜７５２４（１９８０）に従って、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＳＯＭＡ＿ＢＯＶＩＮ、Ｐ０１２４６に示される配列の成熟部分（ＡＡ２８〜２１７）に対応するウシ成長ホルモンの形態である。これらの参考文献は、その全体が参考として援用される。条項（１０）の目的のためには、類似性％は、ＢｌａｓｔＰ法により計算され、すなわち、内部ギャップを含む整列された重複部分の％として陽性（Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスにおいて陽性スコアを有する整列された対）である。

本発明の脊椎動物ＧＨ由来のＧＨレセプターアンタゴニストは、同様に定義されるが、但し、上記ポリペプチド配列は、参照脊椎動物成長ホルモンの配列とは、例えば、ウシ成長ホルモンのＧｌｙ１１９またはヒト成長ホルモンのＧｌｙ１２０に対応する位置で、上記ポリペプチド配列に対して、そしてそれにより融合タンパク質に対して、ＧＨレセプターアンタゴニスト（結合するが活性化しない）活性を付与するような様式で、さらに異ならなければならない。ｂＧＨ Ｇｌｙ１１９／ｈＧＨ Ｇｌｙ１２０は、現在、脊椎動物ＧＨファミリーにおいて完全に保存された残基と考えられることに、留意すべきである。独立した変異Ｒ７７Ｃは、増殖阻害をもたらし得ることが報告された。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ、Ｋａｊｉ Ｈ、Ｏｋｉｍｕｒａ Ｙ、Ｇｏｊｉ Ｋ、Ａｂｅ Ｈ，Ｃｈｉａｒａ
Ｋ．「Ｂｒｉｅｆ ｒｅｐｏｒｔ：ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
ａ ｍｕｔａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９６、Ｆｅｂ １５；３３４（７）４３２〜６。

好ましくは、上記ＧＨレセプターアンタゴニストは、成長阻害活性を有する。上記化合物は、上記化合物で処置される（またはその化合物自体を発現するよう遺伝子操作された）少なくとも１種の脊椎動物種の試験動物の成長が、コントロール動物の成長よりも（０．９５信頼性レベルで）有意に遅くなる場合に、成長阻害的であると考えられる（用語「有意に」とは、統計的な意味において使用される）。いくつかの実施形態において、その化合物は、複数の種において、または少なくともヒトおよび／もしくはウシにおいて、成長阻害的である。

また、上記ＧＨアンタゴニストは、第１参照脊椎動物成長ホルモンの第３の主要なαヘリックスに本質的に対応し、かつそれと少なくとも５０％同一（より好ましくは８０％同一）である、αヘリックスを含み得る。しかし、上記変異は、その第３の主要なαヘリックスに限定される必要はない。

企図される脊椎動物ＧＨアンタゴニストとしては、特に、米国特許番号第５，８４９，５３５号に定義されるようなｈＧＨ変異体Ｂ２０２４およびＢ２０３６に上記ポリペプチドＰが対応する、融合物が挙げられる。Ｂ２０２４およびＢ２０３６は、両方とも、とりわけＧ１０Ｋ置換を含むｈＧＨ変異体であることが、留意される。さらに、本発明者らは、Ｂ２０２４およびＢ２０３６が、上で示される原理を準用してさらに変異されている（すなわち、Ｂ２０２４およびＢ２０３６が、参照脊椎動物ＧＨとして天然のＧＨ（例えば、ＨＧＨ）の代わりに作用する）ＧＨアンタゴニストを企図する。

同様な様式で、脊椎動物プロラクチンアゴニストおよび脊椎動物プロラクチンアンタゴニスト、ならびに脊椎動物胎盤ラクトゲンアゴニストおよび脊椎動物胎盤ラクトゲンアンタゴニストを定義し得、それらは、脊椎動物プロラクチンレセプターに対してアゴニスト作用または拮抗作用を及ぼす。また、脊椎動物成長ホルモンの変異体（それらは、プロラクチンレセプターにアゴニスト作用または拮抗作用を及ぼす（成長ホルモンレセプターに対する活性を保持するか、または保持しない））、または脊椎動物プロラクチンの変異体もしくは脊椎動物胎盤ラクトゲンの変異体（それらは、脊椎動物成長ホルモンレセプターにアゴニスト作用または拮抗作用を及ぼす（プロラクチンレセプターに対する活性を保持するか、または保持しない））もまた、有し得る。同様な様式で、上記脊椎動物成長ホルモン−プロラクチン−胎盤ラクトゲンホルモンスーパーファミリーのうちの２つ以上の参照ホルモンのハイブリッドまたはハイブリッド変異体であり、かつその参照ホルモンの少なくとも１つのレセプター結合活性の少なくとも１０％を保持する、アゴニストおよびアンタゴニストを定義し得る。

これらのハイブリッドが定義され得るいくつかの方法が存在する。１つの実施形態において、本発明者らは、第１参照脊椎動物成長ホルモンおよび別の参照脊椎動物成長ホルモンが、上記スーパーファミリーのメンバーである任意の脊椎動物ホルモンであることを単に許容する。第２の実施形態において、上記変異体は、１ファミリー（例えばＧＨ）に基づいて大部分が定義されるが、限定数（例えば、配列Ｐの１０％未満または５％未満）の位置において、別のファミリーから選択されることが可能である。このカテゴリーにおいて、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍプロラクチンオクト変異体（ｏｃｔｏｍｕｔａｎｔ）（下記）であり、これは、ｈＧＨと結合する。第３の実施形態において、上記ハイブリッドは、例えば、（ａ）脊椎動物成長ホルモンファミリーまたは（ｂ）脊椎動物プロラクチンファミリーのいずれかから始まって二者択一的に誘導されるセグメントからなるものとして可視化される、区分されたハイブリッド（例えば、ジハイブリッド）である。セグメントの数は、奇数であっても、偶数であってもよく、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個であり得る。ＧＨ由来のセグメントにおいて、上記参照ホルモンは、脊椎動物ＧＨであり、プロラクチン由来セグメントにおいて、上記参照ホルモンは、脊椎動物プロラクチンである。好ましくは、各セグメントは、少なくとも１０個連続するアミノ酸長である。上記セグメントは、長さにおいて等しくなくてもよい。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ（下記）は、（ＧＨ由来）−（プロラクチン由来）−（ＧＨ由来）という形式の３つのセグメントを有する、いくつかのＧＨ／プロラクチンハイブリッド（またはそれらの変異体）を記載する。同様な様式で、区分化されたハイブリットは、ＧＨ／ＰＬジハイブリッドまたはＰＬ／ＰＲＬジハイブリッド、あるいはＧＨ／ＰＲＬ／ＰＬトリハイブリッドであり得る（最後の場合は、規則は、隣接セグメントが、ＧＨであろうと、ＰＲＬであろうと、ＰＬであろうと、異なるファミリーに由来することである）。

（成長ホルモン−プロラクチン−胎盤ラクトゲンファミリー）
成長ホルモン、胎盤ラクトゲンおよびプロラクチンは、相同性タンパク質であり、共通の祖先分子から生じたと考えられている。プロラクチンおよび成長ホルモンは、約４００万年前に分岐したと考えられ、従って、魚類において別個のプロラクチンおよび成長ホルモンが存在する。胎盤ラクトゲンは、哺乳動物においてのみ観察され、霊長動物ＰＬは、成長ホルモン系統から進化し、そして非霊長動物ＰＬは、プロラクチン系統から進化したと仮説が立てられている。上記タンパク質ｈＣＳは、ｈＧＨからの遺伝子複製により進化したと考えられている。魚類においてまた、プロラクチンの配列とＧＨの配列との中間の配列を有する、ソマトスタチンが存在する。

成熟成長ホルモン、成熟プロラクチン、および成熟胎盤ラクトゲンは、代表的には、１９０残基〜２００残基から構成され、２２，０００ダルトン〜２３，０００ダルトンの分子量を有する。しかし、これらのサイズは、必要とはされず、例えば、成熟ヒラメＧＨは、１７３未満の残基長である。

これらのタンパク質のアミノ酸配列は、類似しすぎて偶然生じることはない；成熟ｈＧＨをクエリー配列として使用して、デフォルトスコアリングマトリックス（Ｂｌｏｓｕｍ６２）およびギャップペナルティ（１１作製／１伸長）を用い、低複雑度領域フィルターは用いないでＢｌａｓｔＰサーチをすると、Ｅ値１ｅ−１０６が得られ、ヒト胎盤ラクトゲン（ｐｒｆ７３１１４４ａ）とのアライメントに関して９ｅ−９０のＥ値が得られ、ヒトプロラクチン（ｒｅｆＮＰ＿０００９３９．１）とのアライメントに関して６ｅ−１１のＥ値が得られる。

機能的考慮事項もまた、成長ホルモン−胎盤ラクトゲン−プロラクチンスーパーファミリーの定義を正当化する。異なる胎盤ラクトゲンレセプターが存在する場合（Ｆｒｅｅｍａｒｋ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８３：８８３〜９（１９８９）を参照）でさえも、プロラクチンレセプターに対する胎盤ラクトゲンの効果は顕著である。古典的には、上記ＧＨレセプターは、ＧＨに関して特異的なレセプターであり、上記プロラクチン（ラクトゲンとしても公知である）レセプターは、プロラクチンおよび胎盤ラクトゲンに関して特異的なレセプターである。しかし、霊長動物ＧＨは、高い親和性で上記プロラクチンレセプターと結合し得、いくつかの非ヒト哺乳動物胎盤ラクトゲンは、ソマトゲン（ＧＨ）レセプターと結合し得る。上記ＧＨレセプタータンパク質およびプロラクチンレセプタータンパク質の構造的類似性についてもまた、言及がなされ得る。Ｇｏｆｆｉｎら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ、Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｌａｃｔｏｇｅｎ，ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｓ．、１７（４）：３８５〜４１０（１９９６）；Ｎｉｃｏｌｌら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｌａｃｔｉｎｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｔｈａｔ Ｃａｎ ｂｅ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｅｎｄｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｓ．、７（２）：１６９〜２０３（１９８６）を参照のこと。

本出願の目的のために、上記ＧＨ−ＰＲＬ−ＰＬスーパーファミリーは、上で示されるようにＢｌａｓｔＰによりｈＧＨ（ｒｅｆＮＰ＿０００５０６．２の成熟部分）に対して整列した場合、Ｅ値がｅ−０６未満（すなわち、これよりも良い）アライメントを生じるすべてのタンパク質から構成される。

上記成長ホルモン（ＧＨ）は、約１９１アミノ酸残基を有する脊椎動物タンパク質のファミリーであり、残基数は、種により変化する。４つのシステイン残基および２つのスルフィド結合が存在する。一般的には、Ｈａｒｖｅｙら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：１９５５）を参照のこと。種々の脊椎動物から単離された成長ホルモンのアミノ酸配列は、高度に保存される。前述のＢｌａｓｔＰサーチにおいて、多くの他のデータベースのＧＨのうちの少数との成熟ｈＧＨのアライメントに関するＥ値は、以下の通りであった（引用された各種についての最良のアライメント）：１ｅ−１０６（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、３ｅ−９７（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ、コモンマーモセット）、３ｅ−６８（Ｂａｌａｅｎｏｐｔｅｒａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ナガスクジラ；Ｄｅｌｐｈｉｎｕｓ ｄｅｌｐｈｉｓ、マイルカ；Ｈｉｐｐｏｐｏｔａｍｕｓ ａｍｐｈｉｂｉｕｓ）、４ｅ−６８（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、イヌ；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、ブタ）、２ｅ−６７（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、１ｅ−６６（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ドブネズミ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ、イエウサギ；Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、モルモット）、２ｅ−６５（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ、ヤギ；Ｇｉｒａｆｆａ ｃａｍｅｌｏｐａｒｄａｌｉｓ、キリン；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、ウシ）；３ｅ−６５（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ、飼養ヒツジ；４ｅ−５９（Ｃｒｏｃｏｄｕｌｕｓ ｎｏｖａｅｇｕｉｎｅａｅ）、４ｅ−５８（Ｃｈｅｌｏｎｉａ ｍｙｄａｓ）、５ｅ−５８（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、ニワトリ）；２ｅ−５５（Ｔａｒｓｉｕｓ ｓｙｒｉｃｈｔａ、フィリピンメガネザル）（哺乳動物については相対的に高いＥ値）；１ｅ−５３（Ｌｅｐｉｓｏｓｔｅｕｓ ｏｓｓｅｕｓ、硬骨魚）；８ｅ−０８（Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、ゴマフシビレエイ）。最良のスコアのソマトラクチンは、ｓｐ Ｐ２０３６２、Ｅ値が２ｅ−１８である。最良（最低）のＥ値は、クエリー配列とデータベース配列とが同一である場合に得られるＥ値である；クエリー配列が成熟ＨＧＨである最近のサーチにおいて、最良のＥ値は、成熟ＨＧＨとデータベースＨＧＨ前駆体（ｒｅｆＮＰ＿０００５０６．２）とのアライメントについてのＥ値であった（１ｅ−１０６）。

アライメントについてのＥ値が低い場合、アライメントスコアは、偶然生じるスコアと比較して高いはずである。各アライメントについてのアライメントスコアは、スコアリングマトリックスにより決定される個別のアミノ酸対スコアを合計すること、そしてあらゆるギャップに関する適切なギャップペナルティを差し引くことによって、計算される。上記アライメントアルゴリズムは、ギャップが全体的アライメントスコアにおける正味の改善をもたらす場合にのみ、ギャップを導入する。スコアリングマトリックスにおいて、同一性は、より高い値を有する傾向にあり、従って、高いアライメントスコアを有するアライメントもまた、高い同一性％を有するように特徴付けられる傾向にある。しかし、アライメントスコアにより格付けされたアライメントは、それらの同じアライメントが同一性％により格付けされたのと同じ順位を有するとは必ずしも限らない。

ＢｌａｓｔＰにおいて、上記同一性％は、整列された領域における「重複」の長さの％として表現される同一性の数であるとして、計算される。この領域は、整列されたアミノ酸対（必ずしも同一ではない）で始まりそして終わり、一方の配列または両方の配列において１以上のギャップを含み得る。ギャップは、一配列の内側の１以上の連続アミノ酸が、もう一方の配列中のアミノ酸と対にならないままで残る場合に、生じる（これは、そのもう一方の配列において、例えばハイフンのような意味の無い符合とそれらの各々とを整列することによって、符号化され得る）。その重複領域の計算された長さは、整列された対の数とギャップの長さとの合計である。１つの配列が別の配列の上に突出する場合、その突出は、その重複領域の外側にある末端ギャップであり、同一性％を計算することにおいて計数しない。

以下は、ヒトＧＨ（ｒｅｆＮＰ＿０００５０６．２）と、ＧＨ−ＰＲＬ−ＰＬスーパーファミリーの他のメンバーとのＢｌａｓｔＰ同一性％の例である：ヒト胎盤ラクトゲン（８５％、１６１／１８９）、クジラ、イルカおよびカバのＧＨ（６７％、ギャップにおいて１３０／１９２、３／１９２）、ブタＧＨ（６７％、ギャップにおいて１３０／１９３、３／１９２）、マウスＧＨ（６５％、ギャップにおいて１２６／１９２、３／１９２）、ウシＧＨ（６６％、ギャップにおいて１２７／１９２、３／１９２）、ワニＧＨ（５９％、ギャップにおいて１１３／１９０、３／１９０）、ニワトリＧＨ（５７％、ギャップにおいて１１０／１９０、３／１９０）、ゴールデンハムスターＧＨ（６２％、ギャップにおいて１０８／１７２、２／１７２）、Ｌｅｐｉｓｏｓｔｅｕｓ ｏｓｓｅｕｓ ＧＨ（５４％、ギャップにおいて１０２／１８６、３／１８６）、ヒラメ（２７％、ギャップにおいて５３／１９０、８／１９０）、ヒトプロラクチン（２３％、ギャップにおいて４５／１９１、１２／１９１）。

ウシ成長ホルモンと他の非霊長類哺乳動物成長ホルモンとの全体的同一性％は、非常に高い：ブタ（９２％）、ヒツジ（９９％）、およびラット（８７％）。Ｗａｔａｈｉｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：３１２（１９８９）は、ヒラメ成長ホルモン、ブリ成長ホルモン、マグロ成長ホルモン、サケ成長ホルモン、ニワトリ成長ホルモン、ラット成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒツジ成長ホルモン、ウシ成長ホルモンおよびヒト成長ホルモンの配列を比較した。Ｗａｔａｈｉｋｉの図３は、上記ＧＨの間で保存された残基、および成長促進活性の解明に重要であると予測される残基を同定する。彼は、彼がＧＤ１〜ＧＤ５と名づけた、保存された５つのドメインを同定した。これらの保存されたドメインにおける変異は、活性に影響を与える可能性が高い。

２つのＧＨの３次元構造が公知であり、それらは非常に類似している。ブタＧＨは、４つのヘリックス束が、逆平行（上向き−上向き−下向き−下向き）関係で存在するヘリックスとして配列された、単一ドメインタンパク質である。その４つのヘリックスは、残基７〜３４、７５〜８７、１０６〜１２７および１５２〜１８３から構成されている。Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄら、Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４３４（１９８７）を参照のこと。ヒト成長ホルモンは、４つの主要なヘリックス（９〜３４、７２〜９２、１０６〜１２８および１５５〜１８４）からなる束を特徴とし、これらは、ループ（３５〜７１、９３〜１０５、および１２９〜１５４）により連結される。ループ１（ヘリックス１とヘリックス２との間）は、３８〜４７および６４〜７０においてミニヘリックスを含み、ループ２（ヘリックス２とヘリックス３との間）は、９４〜１００において１つのミニヘリックスを含む。ｈＧＨのヘリックス１〜４に対する言及は、上記の主要なヘリックスに対する言及であり、ミニヘリックスに対する言及ではない。ヘリックス２は、Ｐｒｏ−８９においてよじれている。Ｄｅｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：３０６〜３１２（１９９２）を参照のこと。

他のＧＨもまた、ｐＧＨおよび／またはｈＧＨの２次構造予測法、配列アライメント、および３Ｄ構造を基礎にして、４ヘリックスタンパク質であると考えられる。例えば、ウシ成長ホルモンは、ブタ成長ホルモンとアミノ酸配列レベルで９２％相同性であり、そしてｂＧＨの構造は、その２つの配列に関する研究およびブタ成長ホルモンの構造の研究により、推論されている。その４つのαヘリックスは、アミノ酸４〜３３、６６〜８０、１０８〜１２７および１５０〜１７９により呈されると報告されている。ｂＧＨの３番目のαヘリックスは、アミノ酸１０６〜１２９として定義されている。しかし、このヘリックスの末端は、中心領域（１０９〜１２６）よりも明確でないαヘリックス２次構造を有することが、留意される。第３のαヘリックスの正確な境界は、「末端」アミノ酸のαヘリックス傾向に依存して、他のＧＨとは異なり得る。上記立体配座は、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２（１９７４）（ＡＡ１０〜３４、６６〜８７、１１１〜１２７、１８６〜１９１）の方法を使用するＣｈｅｎおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６：２１１０（１９７７）により作製された予測と適度に一致する。ｂＧＨの３−Ｄ構造を決定する予備的研究について、Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：８５２０〜２５（１９８５）を参照のこと。

成長ホルモンは、顕著な種間交叉反応性を有し得る。一般的に、その傾向は、「より上位の」成長ホルモンは、「より下位の」ＧＨレセプターを活性化するが、逆の場合はそうではない。ヒトＧＨは、非ヒト哺乳動物において活性であるが、非ヒト非霊長動物ＧＨは、ヒトにおいて一般的に不活性である。ウシＧＨは、ウマにおいて活性である（ＤｅＫｏｃｋら、Ｊ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ．１７１（１）：１６３〜１７１（２００１）を参照のこと）。哺乳動物ＧＨおよびトリＧＨは、魚類において活性であり、Ｇｉｌｌら、Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：６４３（１９８５）は、組換えニワトリ成長ホルモンおよび組換えウシ成長ホルモンが、幼形の太平洋サケにおいて成長を促進することを報告している。ヒトＧＨに対する類似性を増加させる非ヒトＧＨの変異によって、その非ヒトＧＨは、ヒトＧＨレセプターに対してより活性であるようになる。ＧＨまたはそのレセプターにおける種特異性の構造起源の研究に関して、Ｌｉｕら、「Ｅｐｉｓｏｄｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、１７：９４５〜５３（２００１）；Ａｌｌａｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｏｖｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６１（２）：５５５〜６２（１９９９）を参照のこと。

ヒト胎盤ラクトゲンは、ｈＧＨと８５％の全体的な配列同一性を有するが、ｈＧＨｂｐへの結合は約２０００分の１の弱さである。ＷＯ９７／１１１７８の１００頁。胎盤ラクトゲンの比較に関しては、Ｆｏｒｓｙｔｈ、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１０２（３）：２４４〜５１（１９９４）を参照のこと。

ヒトプロラクチンは、１９９残基（２３ｋＤａタンパク質）であって、ヒトＧと２３％（ＢｌａｓｔＰ）の同一性を有する。ヒトプロラクチン３Ｄ構造は、決定されている；予測される通り、ちょうどヒト成長ホルモンのように４つの主要なヘリックスを有し、上向き−上向き−下向き−下向きのトポロジーを有する。興味深い差異もまた存在する。ｈＰＲＬの第１の伸長したループは、ｈＧＨの匹敵するループで見出される２つのミニヘリックスの第１を欠いており、そして第２のミニヘリックスは、ｈＧＨの対応ミニヘリックスとは角度が異なる。ｈＰＲＬおよびｈＧＨは、主要ヘリックス２および主要ヘリックス３を結合する短いループを有するが、そのループは、ｈＰＲＬにおける方が短く、成分ミニヘリックスが存在しない。最後に、ｈＰＲＬのＮ末端は、ｈＧＨのＮ末端よりも長く、そしてこれは、短いジスルフィド結合ループを含む。Ｋｅｅｌｅｒら、「Ｔｈｅ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ」、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、３２８：１１０５〜２２１（２００３）を参照のこと。Ｋｅｅｌｅｒの図１において、ＨＧＨ Ｇｌｙ−１２０が、ｈＰＲＬ Ｇｌｙ−１２９と整列されている。ｈＰＲＬのＧ１２９Ｘ変異体は、プロラクチンレセプターアンタゴニスト活性を示すことが公知である。以下を参照のこと。

（成長ホルモン（ソマトトロピン）レセプター）
ｈＧＨレセプターは、造血系起源のレセプターの大きなファミリーに属し、このファミリーは、インターロイキン−３レセプターおよび顆粒球コロニー刺激因子レセプターを含む。ヒト成長ホルモンレセプターの精製および特性測定は、Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５３７〜４３（１９８７）を参照のこと。

ｈＧＨレセプターの細胞外ドメインは、ｈＧＨｂｐと呼ばれる。ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの親和性（Ｋｄ）は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）により０．３４ｎＭであると報告された。ＷＯ９２／０３４７８は、ＥＤＴＡ存在下でのｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの親和性がＫｄ＝０．４２ｎＭであることを報告するが、ＺｎＣｌ_２の存在下では親和性は減少する（ＫＤ＝１．６ｎＭ）。このＷＯ９２／０３４７８はまた、ｈＧＨｂｐに対するｈＰＲＬの親和性は、極度に低い（ＥＤＴＡまたはＺｎＣｌ_２の存在下で、Ｋｄ＞１００，０００ｎＭ、表１を参照のこと）。ｈＧＨｂｐに対するｈＰＬの親和性は、非常に低い（９４９．２ｎＭ、表１３）が、ｈＰＲＬの親和性ほど低くはない。

（ＧＨの３Ｄ構造：ＧＨレセプター複合体）
ｈＧＨ：ｈＧＨｂｐ複合体の３Ｄ構造もまた、公知である（ＷｅｌｌｓおよびＤｅＶｏｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、２２：３２９〜５１（１９９３）ならびにＤｅＶｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：３０６（１９９２）を参照のこと）。これらの研究者らは、ｈＧＨとそのレセプター（ｈＧＨＲ）の細胞外ドメインとの複合体を、Ｘ線回折により試験した。上記複合体は、形態ｈＧＨ（ｈＧＨＲ）_２を有する；すなわち、上記レセプターは、ｈＧＨと相互作用するように二量体化する。

ｈＧＨの第１レセプター結合領域（「部位１」）は、凹面状であり、主にヘリックス４の露出面の残基により形成されるが、ヘリックス１の露出した残基ならびにヘリックス１とヘリックス２とを接続する領域の残基によってもまた形成される。上記第２レセプター結合領域（「部位２」）は、ヘリックス１およびヘリックス３の露出された側を含み、比較的平面状である。上記ヘリックス３の役割は、ＤｅＶｏｓの図５において最もよく示されている；複合体形成時に、ｈＧＨ Ｅ１１９の周辺への溶媒の接近し易さが顕著に減少する。ｂＧＨ１１９Ｘ（またはｈＧＨ１２０Ｘ）に対応する変異を有するＧＨ変異体であるＧＨアンタゴニストは、レセプターの二量体化を妨害するようである。

ｈＧＨの部位１の残基は、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｑ２２、Ｆ２５、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ４５、Ｑ４６、Ｐ６１、Ｓ６２、Ｎ６３、Ｅ６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｉ１７５、Ｒ１７８、Ｃ１８２、およびＣ１８９である。部位２の残基は、Ｔ３、Ｉ４、Ｌ６、Ｌ９、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｑ２２、Ｙ１０３、Ｎ１０９、Ｄ１１６、Ｄ１１９、Ｇ１２０およびＴ１２３である。これらの残基とｈＧＨＢＰとの間の相互作用の性質に関する詳細については、米国特許番号第５，５０６，１０７号の表４および表５を参照のこと。

ｈｇｈ（ｈＧＨｂｐ）２複合体のＸ線構造によると、上記２つのＨＧＨｂｐは、Ｓｅｒ２０１において相互に接触する。結果として、ｈＧＨｂｐ（Ｓ２０１Ｃ）マトリックスは、部位１単独に結合するｈＧＨの改変体を試験するのに使用され得る。ＷＯ９７／１１１７８を参照のこと。

（プロラクチンレセプター）
プロラクチンレセプターの細胞外結合ドメインは、ｈＰＲＬｂｐと呼ばれる。それは、ｈＧＨｂｐと約３２％同一である。ＷＯ９０／０４７８８のｐ８９を参照のこと。ＷＯ９２／０３４７８は、最初に、ＥＤＴＡ存在下におけるｈＰＲＬｂｐに対するｈＰＲＬの親和性がＫｄ-＝２．１ｎＭであるが、ＺｎＣｌ_２存在下では、親和性が減少する（ＫＤ＝２．６ｎＭ）ことを報告する（表１）。しかし、表１１には、ｈＰＲＬｂｐに対するｈＰＲＬの親和性は、亜鉛非存在下で２．８ｎＭと言っている。

ヒトＧＨはまた、ヒトプロラクチンレセプターと結合する。（Ｂｏｕｔｉｎら、Ｃｅｌｌ、５３：６９（１９８８）を参照のこと）。ＷＯ９２／０３４７８は、ＥＤＴＡ存在下におけるｈＰＲＬｂｐに対するｈＧＨの親和性はＫｄ＝２７０ｎＭであるが、ＺｎＣｌ_２存在下では実質的に増加する（ＫＤ＝０．０３３ｎＭ、すなわち３３ｐＭ）ことを報告する。増加した親和性はまた、単一のＡｌａ置換ｈＧＨ変異体Ｈ１８Ａ（３７０ｎＭから４．５ｎＭへ）、Ｈ２１Ａ（２００ｎＭから３ｎＭへ）、Ｅ１７４Ａ（３６０ｎＭから１２ｎＭへ）およびＤ１７１Ａ（ＮＤから０．０３７ｎＭへ）についても観察される。

プロラクチンレセプターに対するｈＧＨ結合エピトープは、ヘリックス１の中央にある決定基（残基Ｆ２５およびＤ２６を含む）、ループ領域にある決定基（Ｉ５８およびＲ６４を含む）ならびにヘリックス４の中心部分にある決定基（Ｋ１６８ｍ Ｋ１７２、Ｅ１７４およびＦ１７６を含む）から構成される。ＷＯ９０／０４７８８のｐ５６を参照のこと。このパッチは、ｈＧＨレセプターに対するｈＧＨエピトープと重複はするが同一ではない。ＺｎＣｌ_２存在下でのｈＰＲＬｂｐに対する種々のｈＧＨ変異体の結合親和性が、表７〜９に示される。ＷＯ９２／０３４７８、ｐ．１３は、ｈＧＨ：ｈＰＲＬｂｐ複合体に対する亜鉛の結合が、ｈＧＨ残基Ｈ１８、Ｈ２１およびＥ１７４により媒介されることを示唆する。

ＺｎＣｌ_２存在下におけるｈＰＲＬｂｐに対するｈＰＬの親和性は、５０ｐＭである。亜鉛の非存在下では、ｈＰＬは沈殿した。ｈＰＬ変異体Ｄ５６Ｅ、Ｍ６４Ｒ、Ｅ１７４Ａ、Ｍ１７９Ｉ、Ｄ５６Ｅ／Ｍ６４Ｒ／Ｍ１７９ＩおよびＶ４Ｉ／Ｄ５６Ｅ／Ｍ６４Ｒ／Ｍ１７９ＩのｈＰＲＬｂｐ親和性は、ＷＯ９２／０３４７８の表１２に示される。

（ハイブリッドタンパク質およびホモログスキャニング変異）
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０〜１３３６（１９８９）は、ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合に関与する残基を同定するために、ホモログスキャニング変異誘発と呼ばれる技術を使用した。本質的には、ｈＧＨポリペプチドの選択された断片が、相同性ホルモン（ｐＧＨ、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ）の対応する断片で（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍの配列アライメントに従って）置換された。これは、事実上、ｈＧＨと相同性ホルモンとのハイブリッドを作製した。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍは、常に上記標的断片の全ての残基を置換したわけではなかったことが、留意されるべきである。

クローン化された肝ｈＧＨに対するこれらの変異体ＧＨおよび野生型ｈＧＨの結合親和性の比較は、ｈＧＨにおいて、レセプター結合と関与する３つの非連続的なポリペプチド決定基が存在するという結論を導いた。それらは、ＮＨ_２末端、ＣＯＯＨ末端、およびアミノ酸残基５４とアミノ酸残基７４との間のループ内に位置した。これらの推定結合ドメインがさらに、アラニン残基がそれらの領域の全体に渡って系統的に置換されるアラニンスキャニング変異誘発技術により分析された（下記を参照のこと）。

ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍによりｈＧＨに導入された変異は、下に示される。

最初の４列は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）に基づき、最後の列は、ＷＯ９０／０４７８８の表ＸＶＩＩＩに基づく。ｗ＋ｈＰＲＬに関するｈＧＨｂｐデータもまた、ＷＯ９０／０４７８８からである。ｗ＋ｈＧＨ結合ｈＧＨｂｐに関するデータは、ＷＯ９４／０４７８８の表ＩＩＩからである。

（最初のＡｌａスキャニング変異誘発研究）
アラニンスキャニング変異誘発は、最初、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（「Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１０８１（１９８９）により記載された。ホモログスキャニング変異誘発の結果を考慮して、彼等の研究は、残基２〜１９、５４〜７５、および１６７〜１９１に向けられた。ｈＧＨの位置１０、５８、６４、６８、１７２、１７４、１７５および１７６におけるアミン酸残基は、ＧＨレセプター結合のために重要であることが示された。しかし、試験された単一Ａｌａ置換変異体ＧＨのいずれもが、成長を阻害しなかったと報告された。

アラニンスキャニング変異誘発に基づいて、ｈＧＨ残基Ｆ１０、Ｆ５４、Ｅ５６、Ｉ５８、Ｒ６４、Ｑ６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｃ１８２、およびＶ１８５についての好ましいアミノ酸置換は、ＷＯ９０／０４７８８のｐ５２、表ＩＶに列挙される。これらの残基は、アラニン置換がＫｄに対して４倍を超える効果を生じた残基である。同じ参考文献の表Ｖは、アラニン置換が２倍未満の効果を生じた残基を列挙し、表ＶＩは、それが良好な効果を有した残基を列挙した。表Ｘは、ｈＧＨ残基Ｓ４３、Ｆ４４、Ｈ１８、Ｅ６５、Ｌ７３、Ｅ１８６、Ｓ１８６、Ｓ１８８、Ｆ１９１、Ｆ９７、Ａ９８、Ｎ９９、Ｓ１００、Ｌ１０１、Ｖ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｒ１９、Ｑ２２、Ｄ２６、Ｑ２９、Ｅ３０、およびＥ３３に関する示唆されるＡＡ置換を示す。

（ｈＧＨ１７４研究）
変異体Ｅ１７４は、ｈＧＨ：ｈＧＨｂｐ親和性の実質的な増加を生じ、この部位における１２種の択一的置換が活性について試験された。側鎖サイズは、親和性を決定する主要な要因であるようであった。最適ＡＡは、Ａｌａ（０．０７５）のままであり、これに、Ｓｅｒ（０．１１）、Ｇｌｙ（０．１５）、Ｇｌｎ（０．２１）、Ａｓｎ（０．２６）、Ｇｌｕ（野生型、０．３７）、Ｈｉｓ（０．４３）、Ｌｙｓ（１．１４）、Ｌｅｕ（２．３６）およびＴｙｒ（２．９）が続いた。Ｅ１７４ＤまたはＥ１７４Ｒは、発現しなかった。ＷＯ９２／０３４７８の表６を参照のこと。

（第２回のアラニンスキャニング変異誘発研究）
残基Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ４５、およびＱ４６は、第１ミニヘリックスに属す。これらは、最初の研究では評価されず、従って、引き続いて研究された。Ｋｄ値は、米国特許番号第５，５３４，６１７号の表３に示される。ＷＯ９７／１１１７８は、１０６頁で「親和性の効率的最適化に関する出発点は、関連する境界面の完全なアラニンスキャンである」とコメントしている。

（二重変異体）
いくつかの二重変異体が、ｈＧＨ／ｈＰＲＬｒレセプター選択性を変える目的で調製された。ｗｔｈＧＨに関して、結合性は、ｈＰＲＬに対して２．３ｎＭであり、ｈＧＨｒに対して０．３４ｎＭである。Ｋ１６８Ａ／Ｅ１７４Ａに関しては、上記値は、１９５０および０．０９であり、Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａに関しては、それらは、約４０，０００および１９０である。これらの二重変異体は、従ってｈＰＲＬｒに対するよりも増加したｈＧＨｒの選択性を明示する。ＷＯ９０／０４７８８を参照のこと。

（単一置換効果の相加性）
ＷＯ９０／０４７８８の表ＸＸＩは、ｈＧＨレセプターまたはｈＰＲＬレセプターへの結合に対する種々の単一置換の効果の相加性を分析する。これらの効果は、「著しく相加的」であると特徴づけられる。

（ヘリックス−４ａライブラリー）
野生型ｈＧＨが残基Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｆ１７６およびＲ１７８で無作為化された、変異体のコンビナトリアルライブラリーが、調製された。これらの残基は、ランダム変異誘発のために標的化された。なぜなら、それらは、全てｈＧＨの表面上または表面近くにあり、Ａｌａスキャニング変異誘発により示されるレセプター結合に著しく貢献し、ヘリックス４の同じ側にある２つのターンを占める充分に特定された構造内に存在し、ｈＧＨの公知の進化改変体の間で、少なくとも１つのアミノ酸により各々置換されるからである。ＷＯ９２／０９６９０のｐ３２を参照のこと。ｈＧＨｂｐに対する競合結合により選択された変異体は、ＫＳＹＲ（０．０６ｎＭ）、ＲＳＦＲ（０．１０）、ＲＡＹＲ（０．１３）、ＫＴＹＫ（０．１６）、ＲＳＹＲ（０．２０）、ＫＡＹＲ（０．２２）、ＲＦＦＲ（０．２６）、ＫＱＹＲ（０．３３）、ＫＥＦＲ（野生型、０．３４）、ＲＴＹＨ（０．６８）、ＱＲＹＲ（０．８３）、ＫＫＹＫ（１．１）、ＲＥＦＳ（１．１）およびＫＳＮＲ（３．１）であった。例えば、「ＫＳＹＲ」は、Ｋ１７２、Ｓ１７４、Ｙ１７６およびＲ１７８を意味する。最も強固に結合する変異体（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）は、野生型ｈＧＨより約６倍高い親和性を有する。ＷＯ９２／０９６９０の表ＶＩＩを参照のこと。

いくつかの選択されなかった変異体（それにより、そのライブラリーの多様性を示す）の配列に関して、米国特許番号第５，７８０，２７９号の表ＶＩを参照のこと。これらの変異体は、選択された変異体よりも低いｈＧＨｂｐ親和性を有するはずであるが、必ずしも完全に非結合性というわけではない。

（ヘリックス−４ｂライブラリー）
変異体ｈＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）が無作為にＲ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ１７９において変異された変異体コンビナトリアルライブラリーが、調製された。ＷＯ９２／０９６９０の表ＸＩは、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、ＥおよびＡが、１６７（ｗｔ＝Ｒ）で全て受け入れられ；Ｓ、ＮおよびＤが、１７１（ｗｔ＝Ｄ）で受け入れられ；Ｔ、Ａ、およびＳが、１７５（ｗｔ＝Ｔ）で受け入れられ；ならびに、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＩおよびＬが、１７９（ｗｔ＝Ｉ）で受け入れられたことを示す。

いくつかの変異は、それらをコードするために使用されるコドン（ＮＮＳ）を基礎にして上記ライブラリーにおけるそれらの変異の予想頻度と比較して、選択されたクローンの間で過剰表現された。この過剰表現は、標準偏差単位で、（観察された頻度−予想頻度）／標準偏差により表され得る。配列決定された５６個のクローンにおいて、過剰表現された変異（少なくとも２．０の標準偏差単位のスコアを有する）は、Ｒ１６７Ｎ（２５．６標準偏差）、Ｒ１６７Ｋ（４．１標準偏差）、Ｄ１７１Ｓ（１４．１標準偏差）、Ｄ１７１（４．８標準偏差）、Ｄ１７１Ｎ（４．１標準偏差）、Ｔ１７５（２９．１標準偏差）、Ｉ１７９Ｔ（１８．６標準偏差）、Ｉ１７９Ｎ（４．１標準偏差）であった。米国特許番号第５，５３４，６１７号の表４を参照のこと。最良のライブラリーメンバーは、ペンタ変異体（Ｒ１６７Ｄ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１９７Ｔ）であった。これは、２つの変異バックグランドと比較して３つの新しい変異を有し、これは、野生型ｈＧＨより約８倍良好にｈＧＨレセプターに結合した。

（ヘリックス−１ライブラリー）
野生型ｈＧＨが無作為にＦ１０、Ｍ１４、Ｈ１８およびＨ２１で変異された変異体コンビナトリアルライブラリーが、調製された。４回の選択後、野生型ｈＧＨより約３倍良好に（Ｋｄ＝０．１０ｎＭ）レセプターに結合するテトラ変異体（Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ）が、単離された。配列決定された６８個のクローンにおいて、以下のアミノ酸は、少なくとも２．０標準偏差単位のスコアで、変異位置において過剰表現された：Ｆ１０Ａ（１２．０標準偏差）、Ｆ１０（１０．４標準偏差）、Ｆ１０Ｈ（６．２標準偏差）、Ｍ１４Ｗ（１１．１標準偏差）、Ｍ１４Ｓ（４．８標準偏差）、Ｍ１４Ｙ（２．７標準偏差）、Ｍ１４Ｎ（２．７標準偏差）、Ｍ１４Ｈ（２．０）、Ｈ１８Ｄ（１８．８）、Ｈ１８Ｆ（４．１）、Ｈ１８Ｎ（３．４）、Ｈ２１Ｎ（２０．２）、およびＨ２１（４．８）。米国特許番号第５，５３４，６１７号の表４を参照のこと。より一般的には、ＷＯ９２／０９６９０の表ＶＩＩＩは、Ｈ、Ａ、Ｙ、Ｌ、ＩおよびＦが、位置１０で全て受け入れられ、位置１４でＧ、Ｗ、Ｔ、ＮおよびＳが受け入れられ、位置１８でＮ，Ｄ，Ｖ，Ｉ，ＳおよびＦで受け入れられ、ならびに位置２１でＮ，Ｈ、ＧおよびＬで受け入れられたことを示す。

（ミニヘリックス−１ライブラリー）
野生型ｈＧＨがミニヘリックス１の位置Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ４５およびＱ４６で変異された変異体コンビナトリアルライブラリーが、調製された。結果は、米国特許番号第５，５３４，６１７号の表４に示される。１７個のクローンが配列決定された。標準偏差的基準により、Ｋ４１Ｒに関して中程度の選択性（３．７標準偏差単位）、Ｙ４２Ｒ（２．０標準偏差単位）またはＹ４２Ｑ（２．０標準偏差単位）に関してわずかな選択性、Ｌ４５Ｗ（４．８標準偏差単位）または野生型Ｌ４５（４．５標準偏差単位）に関して強い選択性、Ｑ４６Ｗ（７．６標準偏差単位）に関して、より強い選択性が存在した。Ｋ４１Ｆ（２．０標準偏差単位）、Ｑ４６Ｆ（２．０標準偏差単位）およびＱ４６Ｙ（２．０標準偏差単位）もまた観察された。ライブラリーメンバーで最良のものは、クローン８３５．Ａ６（４１Ｉ、４２Ｈ、４５Ｗ、４６Ｗ）であり、野生型ｈＧＨに対して４．５倍の改善された親和性を有した。米国特許番号第５，５３４，６１７号の表５を参照のこと。

（ループ−Ａライブラリー）
野生型ｈＧＨがループＡの位置Ｆ５４、Ｅ５６、Ｉ５８およびＲ４で無作為に変異された変異体コンビナトリアルライブラリーが、調製された。配列決定された２６個のクローンにおいて、過剰表現された変異（少なくとも２標準偏差）は、Ｆ５４Ｐ（１４．１標準偏差）、Ｅ５６Ｄ（４．７標準偏差）、Ｅ５６Ｗ（４．７標準偏差）、Ｅ５６Ｙ（２．５標準偏差）、Ｉ５８（８．１標準偏差）、Ｉ５８Ｖ（３．５標準偏差）ならびにＲ６４Ｋ（２２．８標準偏差）であった。上記Ｒ６４Ｋ変異体は、上記クローンの８１％で見出され、単独で３倍の親和性改善を引き起こすことが以前に知られていた。試験されたライブラリーメンバーの内の最良のものは、テトラマー変異体（Ｆ５４Ｐ、Ｅ５６Ｄ、Ｉ５８Ｔ、Ｒ６４Ｋ）であり、それらは、野生型ｈＧＨより５．６倍大きい親和性を有した。

（コンビナトリアルライブラリーの使用（一般的））
ＷＯ９７／１１１７８（１０７頁）は、同じ変異誘発工程において相互に接触する残基を、それらが共に変化することができるように理想的には無作為化すべきであるとコメントしている。そのような共同変化は、非相加的な複数置換効果の検出を可能にするが、ほとんどの改善は、単純な相加的効果であった。ＷＯ９７／１１１７８の１０８頁を参照のこと。

（非コンビナトリアル複数置換変異体）
以下の複数変異の部分組み合わせの種々の組み合わせが、米国特許番号第５，５３４，６１７号の表６に示されるように合成され、そして試験された。

Ａ＝Ｆ１０Ｈ、Ｍ１４Ｇ、Ｈ１８Ｎ、Ｈ２１Ｎ
Ｂ＝Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ（０．１０）
Ｃ＝Ｍ１４Ｓ、Ｈ１８Ｆ、Ｈ２１Ｌ（０．６８）
Ｄ＝Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ（０．０４）
Ｅ＝Ｒ１６７Ｅ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、（０．０４）
Ｆ＝Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｎ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ（０．０６）
８５２ｂ＝Ｋ４１Ｉ、Ｙ４２Ｈ、Ｌ４５Ｗ、Ｑ４６Ｗ、Ｆ５４Ｐ、Ｒ６４Ｋ（０．００７９）。

ヘリックス−１改変体Ａ、ヘリックス−１改変体Ｂまたはヘリックス−１改変体Ｃとヘリックス−４ｂ改変体Ｄ、ヘリックス−４ｂ改変体Ｅまたはヘリックス−４ｂ改変体Ｆとの組み合わせが、調製された。上記改変体Ａ、ならびに組合せＡＤ、ＡＥおよびＡＦは、ジスルフィド二量体を形成し、従ってさらに続行されなかった。改変体Ｃもまた、ジスルフィド二量体を形成したが、ＣＤ、ＣＥおよびＣＦは形成しなかった。ＢＥが調製されたか否かは不明である；それについて言及されていない。

試験された組合せおよびそれらのＫｄ値（ｎＭ）は、ＢＤ（０．０１）、ＣＤ（０．０１１）、ＣＥ（０．０１４）、ＢＦ（０．１６）、ＣＦ（０．０２１）および８５２ｄ（ＢＤ＋８５２ｂ）（０．０００９）であった。８５２ｄは、野生型ｈＧＨとは１５個の置換により異なることに、留意されたい。

（共同選択コンビナトリアルライブラリー）
ヘリックス−１およびヘリックス−４の同時変異をコンビナトリアルな方法で探査する試みがなされた。ヘリックス−１の４残基およびへリックス−４の４残基をこれらの８つの各位置で、２０種の可能なＡＡ全てを系統的に探査するように変異することは、ＮＮＳ縮重により２．６ｅ１０個の異なるポリペプチドをコードする１．１ｅ１２個のＤＮＡ配列のプールを調製することを意味する。全ての改変体の表現を確実にするのに十分大きな（おそらくｅ１３個の形質変換体）ランダムファージミドライブラリーを得ることは、１９９１年には可能ではなかった。

結果として、ライブラリーは、ヘリックス−１のライブラリースクリ−ンおよびヘリックス−４のライブラリースクリーンから選択されたＤＮＡプールをランダムに連結することにより構築され、コード配列を完結させるためにＤＮＡが縮重され、そしてあわせたプールを作製する。ドナープールの夫々にある量の多様性が存在する。結果はＷＯ９２／０９６９０の表ＸＩＩＩ−Ａに示される。また、ＷＯ９７／１１１７８の表７を参照のこと。

（ＧＨアンタゴニストとして機能する成長ホルモンの第３αヘリックス変異体）
ＧＨアンタゴニストとして機能するｈＧＨ変異体およびｂＧＨ変異体は、最初にＫｏｐｃｈｉｃｋらにおいて同定された。ＫｏｐｃｈｉｃｋらはｂＧＨにおけるＧｌｙ１１９のＡｒｇへの変異（「Ｇ１１９Ｒ」）、Ｐｒｏへの変異（「Ｇ１１９Ｐ」）、Ｌｙｓへの変異（「Ｇ１１９Ｋ」）、Ｔｒｐへの変異（「Ｇ１１９Ｗ」）またはＬｅｕへの変異（「Ｇ１１９Ｌ」）、あるいはｈＧＨにおける相同なＧｌｙ１２０のＡｒｇまたはＴｒｐへの変異が、脊椎動物、特に哺乳動物において成長阻害活性を有するミューテイン（変異タンパク質またはそれのペプチド断片）を生じるということを発見した。

ＫｏｐｃｈｉｃｋらはｂＧＨ変異体がトランスジェニックマウスにおいて発現される場合、マウスにおいて０．５７と１．０との間の成長比率を生じることを発見した。マウスの成長比率はｂＧＨアナログの血清レベルと負の相関をした。すなわちｂＧＨアナログの血清レベルが増加するにつれて、動物の成長比率が減少した。また、これらのアナログは、ＮＩＨ−３Ｔ３−前脂肪細胞に発現させる場合、前脂肪細胞の分化を促進する結果にはならなかったが、一方、天然のＧＨは分化を促進する。事実、これらのアナログは、野生型ＧＨが前脂肪細胞の分化を促進する能力に拮抗する。Ｋｏｐｃｈｉｃｋらは、これらのアナログを「機能的アンタゴニスト」といった。

Ｋｏｐｃｈｉｃｋらはまた、野生型ｈＧＨ、ｈＧＨ Ｇ１２０Ａ、ｈＧＨ Ｇ１２０ＲおよびｈＧＨ Ｇ１２０Ｗのいずれかを発現するトランスジェニックマウスを調製した。ｈＧＨ Ｇ１２０Ａを発現するマウスは、野生型ｈＧＨを発現するマウスに類似する、成長亢進した表現型を示す。反対にｈＧＨの１２０位のＧにおけるＲまたはＷの置換、および引き続くトランスジェニックマウスにおける発現は、０．７３と０．９６との間の成長比率を有する動物を生じ、その血清ｈＧＨのレベルは、成長表現型と負の相関をする；すなわちこれらのｈＧＨ１２０アナログの血清レベルは増加するにつれて、成長比率は減少する。

ｈＧＨのＧ１２０Ｒ変異体が、ｈＧＨｂｐに結合し、そしてｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ）に対するその親和性は、Ｋｄ＝１．６ｎＭであり、ｈＧＨｂｐ（Ｓ２０１Ｃ）に対する親和性はＫｄ＝２．７ｎＭであることが、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの研究者により以前に示された。同じ実験において、野生型ｈＧＨのｈＧＨｂｐ（Ｓ２０１Ｃ）への結合に関するＫＤは、０．９ｎＭであった。ｈＧＨおよびｂＧＨが、配列アライメントの通常受け入れられている原理に従ってアライメントされる場合、１１９位でのｂＧＨのグリシン残基が１２０位のｈＧＨのグリシン残基とアライメントされる（すなわち対応する）ことに注意することは重要なことである。それらは、両方共に第３αヘリックスの中心部分に位置する。

上記好ましい成長阻害変異体は、第３αヘリックスの表面形状（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）の改変により特徴付けられる。「野生型」ウシ成長ホルモンの第３αヘリックスにおいて、アスパラギン酸−１１５で開始し、グリシン−１１９で深くなり、そしてアラニン−１２２で終結する、表面の裂け目または窪みが存在する。この節で引用された参考文献において議論される変異体の全ての、野生型成長促進活性を保持するものとそうでないものの両方は、成長促進活性がこの裂け目または窪みの存在が必要であり、そしてもしこの裂け目の中心がより嵩高い側鎖を有するアミノ酸の置換により「満たされている」場合、ミューテインは対象物の成長を阻害するという理論と一致する。

アミノ酸１１９に関して、グリシンは、最も小さくかつαヘリックス形成に最も不都合なアミノ酸残基である。従って、任意の他のアミノ酸は、上記のαヘリックスを不安定化させずにそれを置換し得、一方同時に上述の裂け目に充填すると考えられる。試験されたＧ１１９のｂＧＨ置換体の全ては、「小動物」表現型という結果になった。これらの置換体は、アルギニン（大きく、正に荷電したＡＡ）、プロリン（環状脂肪族ＡＡ）、リジン（大きく、正に荷電したＡＡ）、トリプトファン（大きな芳香族ＡＡ）およびロイシン（大きく、極性の脂肪族ＡＡ）であった。

ｈＧＨにおいて、相同のグリシンは１２０位である。アルギニンまたはトリプトファンの置換は、アンタゴニストを生じたが、しかしながらｈＧＨ Ｇ１２０Ａは、成長促進活性を保持した。結果として、アンタゴニスト活性が所望の場合、このグリシンは、全ての脊椎動物ＧＨにおいて保存されているが、アラニン（２番目に小さいアミノ酸）以外の任意のアミノ酸、より好ましくは、少なくともプロリン（「小さい」動物表現型を生じることが公知の最小の置換アミノ酸）と同じ大きさの任意のアミノ酸により置換され得る。

１１５位の改変はＫｏｐｃｈｉｃｋらの「裂け目」理論により示唆される。１１５位のアスパラギン酸は、より嵩高いアミノ酸により置換され得、それは上記αヘリックスを破壊しない。好ましくは、置換アミノ酸は、アスパラギン酸のサイズより大きなサイズを有する。アミノ酸のヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは実質的にアスパラギン酸より大きい。これらの中で、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＬｅｕおよびＴｒｐがより好ましい。なぜなら、有する嵩高さの利点と合理的に強いヘリックス傾向とを結び付けるからである。しかしながらＧｌｕはアミノ酸すべての中で最強のαヘリックス形成体であることは注意すべきである。ｂＧＨのＤ１１５Ａ変異体は、ＧＨアンタゴニストではないが、アラニンはアスパラギン酸より小さく、それ故、Ａｓｐ１１５をより嵩高いアミノ酸で置換しようと試みる価値はない。

ｂＧＨ１１９のみに対応する位置、またはｂＧＨ１１５および／もしくはｂＧＨ１１９にも対応する位置で、全ての可能なアミノ酸置換の効果を系統的にスクリーニングすることは可能である。Ｇ１１９Ａは、もし他の変異（例えば、１１５位および１２２位で）と結合される場合、「小さい」表現型に導く可能性がある。従って、全てのライブラリーメンバーが変異Ｇ１１９Ａを含み、そして１１５位および１２２位がそれぞれ２０の可能なアミノ酸全体にわたって変化される、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし得る。

このアプローチは、所望の場合、第３αヘリックスの他のアミノ酸位置まで拡張し得る。スクリーニングに特に好ましいアミノ酸は、ｂＧＨのグリシン１１９に空間的に最も近い６つのアミノ酸、すなわちＡｌａ１２２、Ｌｅｕ１２３、Ｉｌｅ１２０、Ｌｅｕ１１６、Ａｓｐ１１５およびＧｌｕ１１８である。１１９位の全ての可能な変異の効果についてのスクリーニングおよびこれら６つの近接する位置は、２０^７メンバーのライブラリーを必要とする。そのようなライブラリーが調製され得ない場合、１９の別のライブラリーを調製し得、各々は、特定のｂＧＨ Ｇ１１９Ｘバックグランド変異、および６つの近接する位置のランダマイゼーション（１ライブラリー当たり２０^６の異なるライブラリーメンバー）により特徴づけられる。

ｂＧＨ１１９に対応する位置における変異（所望の成長阻害活性を付与するために必要と考えられる）に加えて、成長阻害活性または他のアンタゴニスト活性を完全に残す、さらなる変異が可能である。これらの変異は、上記ポリペプチドの非本質領域における単一または複数の置換、欠失もしくは挿入の形態をとり得る。例えば、αヘリックスにおいて、置換がそのαヘリックスを破壊しないのであれば、別のアミノ酸を変えることが可能である。好ましくは、そのような変化は、アミノ酸を同様なサイズおよび極性を有するアミノ酸に置換する。上記配列のαヘリックス傾向を増加させるために主要な変異部位１１９に隣接するアミノ酸を、特に１１９での変異が上記ヘリックスを不安定化することが予想される変異である場合、改変することは有利であり得る。

上記ＧＨアンタゴニスト活性が、これらの単一置換変異のみならず、複数置換変異においても明白になった。Ｋｏｐｃｈｉｃｋらにより研究された第１のものは、ｂＧＨ変異体Ｅ１１７Ｌ／Ｇ１１９Ｒ／Ａ１２２Ｄであって、トランスジェニックマウスにおいて成長を阻害した。変異体タンパク質のマウスＬ細胞分泌が、ｂＧＨ変異体Ｅ１１７／Ｇ１１９Ｒ、Ｅ１１１Ｌ／Ｇ１１９Ｗ、Ｅ１１１Ｌ／Ｇ１１９Ｗ／Ｌ１２１Ｒ／Ｍ１２４Ｋ、Ｅ１１１Ｌ／Ｇ１１９Ｗ／Ｒ１２５Ｌ、およびＥ１１１Ｌ／Ｇ１１９Ｗ／Ｌ１２１Ｒ／Ｍ１２４Ｋの場合に観察された。

（Ｂ２０２４ ＧＨＡ変異体およびＢ２０３６ ＧＨＡ変異体）
前述の変異体分析を考慮して、ｈＧＨの２つの変異体が特に注目されるよう選択された。Ｂ２０２４変異体は、変異体Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｇ１２０Ｋ、Ｋ１６８Ａ、およびＥ１７４Ａにより特徴づけられる。上記ｂ２０３６変異体が変異体Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、およびＩ１７９Ｔにより特徴づけられる。両方の場合、太字の変異はアンタゴニスト活性を付与し、そして他の変異は、ｈＧＨレセプターへの「部位１」結合を改善する。ＷＯ９７／１１１７８を参照のこと。

Ｂ０３６変異体は、以前に記載された８５２ｄ ＧＨアンタゴニスト変異体と比較され得る。８５２ｄのＲ６４Ｋ変異は、ＰＥＧ化から部位１結合残基を保護するために省略された。同様に、変異Ｋ１６８ＡおよびＫ１７２Ｒは、部位１ＰＥＧ化部位の数を減少させるためにＢ２０３６に付け加えられた。８５２ｄのいくつかの変異は、Ｂ２０３６から省略された、というのは、それらは適度に親和性を亢進するのみで、それらの省略はヒトにおいて抗原性を減少させる可能性があると考えられた。上記Ｂ２０２４変異体はこれらの課題をさらに保有し、さらなる変異を省略する。Ｂ２０３６およびＢ２０２４の両方は、Ｇ１２０変異を逆転することによりアゴニストに変換され得る。

アンタゴニスト活性の細胞ベースのアッセイにおいて、非ＰＥＧ化Ｂ２０３６は、０．１９μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し、一方Ｂ２０３６のＰＥＧ化形態（ＰＥＧ−４／５−Ｂ２０３６）に関するＩＣ５０は、１３．１μｇ／ｍｌであった。その後、別のＰＥＧ化形態ＰＥＧ（２０，０００）−Ｂ２０３６は、０．２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有したことを示した。ＷＯ９７／１１１７８、１３５頁を参照のこと。Ｂ２０３６のＰＥＧ化形態および非ＰＥＧ化形態の両方は、アカゲザルにおいてＩＧＦ−１のレベルを減少させることが示された。ＷＯ９７／１１１７８、１３６頁を参照のこと。（一般的には、ＰＥＧ化成長ホルモンおよびそれらの結合についての考察に関しては、Ｒｏｓｓら、ＪＣＥ、２００１、８６巻、１７１６〜１７２３頁を参照のこと）。

（化学的に改変された（ＰＥＧ化を含む）ＧＨアゴニストおよびＧＨアンタゴニスト）
免疫原性を減少させおよび／または半減期を増加させるために、ポリオールが１以上のアミノ酸残基（例えば、リジン）においてＧＨアゴニストまたはＧＨアンタゴニストと結合体化され得る。ＷＯ９３／００１０９を参照のこと。適切なポリオールとしては、限定されないが、１以上のヒドロキシル位を、例えば、１〜４つの炭素原子を有するアルキル基のような化学基で置換されるポリオールが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には上記ポリオールは、例えば、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）のようなポリ（アルキレン）グリコールである。ＰＥＧとｈＧＨ（またはｈＧＨ変異体）とを結合体化するプロセスは、ＰＥＧ化と呼ばれるが、上記プロセスはまた、他のポリオールの結合体化にも適用可能である。好ましくは、ＰＥＧは、５００〜３０，０００ダルトンの分子量を有し、５，０００ダルトンの平均分子量が特に好ましい。

好ましくは、上記プロセスは、２〜７つの、より好ましくは４〜６つのＰＥＧ分子がｈＧＨ（または変異体）の各分子に結合体化されるようなプロセスである。最終的組成物は、均一であり得、すなわち全ての分子が、同じＰＥＧ化部位に同じＰＥＧの数を有するか、または不均一であり得、すなわち、ＰＥＧの数またはＰＥＧの結合部位は、結合体ごとに変動する。

好ましくは、上記反応条件は、その結合体が部位１結合活性を破壊しないようなものである。また、上記結合体がＧＨアゴニストとして使用される場合、上記結合体は、部位２結合活性を破壊してはならない。一般的にＷＯ９７／１１１７８を参照のこと。上記で企図されるＧ１２０Ｋ変異は、さらなるＰＥＧ化部位を提供する。

（プロラクチン変異体）
上で示されるデータに基づき、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６１（１９９０年３月１１日）は、ヒトプロラクチンオクタ変異体（ｏｃｔａｍｕｔａｎｔ）を設計し、これはｈＧＨｂｐを野生型ヒトプロラクチンが結合するよりも１０，０００倍超の強さであり（２．１ｎＭのＫｄ）結合した（Ｋｄ＞４０，０００）。このｈＰＲＬオクタ変異体は、野生型ｈＧＨの約６分の１の強さでｈＧＨｂｐと結合した（０．３４ｎＭのＫｄ）が、ｈＧＨと全体で２６％のみの配列同一性を有する。上記オクタ変異体は、変異（ｈＧＨ番号付け、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｈＧＨ：ｈＰＲＬアライメント）Ｈ１７１Ｄ、Ｎ１７５Ｔ、Ｙ１７６Ｆ、Ｋ１７８Ｒ、Ｅ１７４Ａ、Ｅ６２Ｓ、Ｄ６３ＮおよびＱ６６Ｅによって特徴付けられる。さらなる変異Ｌ１７９Ｉは、親和性を変化させなかった。ＷＯ９０／０４７８８は、変異Ｖ１４Ｍおよび変異Ｈ１８５Ｖでさらに結合を向上させる可能性を示唆する（１１３頁を参照のこと）。

（ｈＧＨおよびｈＰＬの比較により生じた変異研究）
ｈＧＨのｈＧＨｒ結合エピトープを構成するとするＡｌａスキャニング突然変異誘発により同定された３つの領域（ｈＧＨ残基４〜１４、５４〜７４、１７１〜１８５）内で、ｈＰＬは、ｈＧＨと以下の７つの位置でのみ異なる：Ｐ２Ｑ、Ｉ４Ｖ、Ｎ１２Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｅ５６Ｄ、Ｒ６４ＭおよびＩ１７９Ｍ、ここで例えば、「Ｐ２Ｑ」は、ｈＧＨの２位のプロリンがアライメントされたｈＰＬの対応するＡＡにおいてＱで置換されることを意味する。これらの７つの位置の全ては、ｈＧＨにおいてＡｌａスキャンされ、Ａｌａ置換の４つ（Ｉ４Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｒ６４ＡおよびＩ１７９Ａ）が、結合親和性について２倍以上減少する結果になった。

ｈＧＨ単一置換変異体Ｉ１７９Ｍは、ｈＧＨ親和性を１／１．７だけ低下させた（Ｉ１７９Ａに関する１／２．７と比較して）。上記Ｒ６４Ａ変異およびＲ６４Ｍ変異は両方とも、親和性に関して１／２０の低下を引き起こした。ｈＧＨ２重変異体Ｅ５６Ｄ／Ｒ６４Ｍは、親和性に関して全体で１／３０の低下を明らかにした。

（胎盤ラクトゲン変異体）
野生型ｈＰＬは、ｈＧＨｂｐ（Ｓ２０１Ｃ）と１８００ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合するが、一方野生型ｈＧＨは、同じ標的と１．４ｎＭの親和性で結合する。上記変異体ｈＰＬ（０２７４）は、変異１０Ｙ、１４Ｅ、１８Ｒ、２１Ｇにより特徴づけられ、ｈＧＨｂｐ（Ｓ２０１Ｃ）と１．１ｎＭの親和性で結合する、すなわち野生型ｈＧＨの親和性より優れている。ＷＯ９７／１１１７８、１０１頁の表９を参照のこと。

ＷＯ９０／０４７８８、ｐ１１６は、ｈＰＬにおける二重変異体Ｄ５６Ｅ、Ｍ６４Ｒが実質的にｈＧＨレセプターに関する結合親和性を増強し、またさらなる改変体Ｍ１７９ＩおよびＶ４Ｉを示唆する。ｈＰＬの上記Ｇ１２０Ｒ変種は、ｈＰＲＬレセプターでトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞のｈＧＨ刺激性の成長を阻害する。Ｇ１２０Ｒ−ｈＰＬに対するＩＣ５０は、Ｇ１２０Ｒ−ｈＧＨに対するＩＣ５０より約８倍高い。Ｆｕｈ ＆ Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３１３３（１９９５）を参照のこと。

タンパク質の成長ホルモンスーパーファミリーに加えて、本明細書で言及されるペプチド／ポリペプチド／タンパク質の全ての変種が、特に企図される。従って、如何なる位置の任意のアミノ酸は、欠失／挿入／変異で改変され得る。これらの改変は、グリコシル化モチーフに加えて、またはその一部分として作製され得る。

薬物送達／乳化に関して：小さい疎水性または両親媒性タンパク質が薬物乳化剤を作製するために所望のモチーフでタグ化される。例としては、限定されないが、ヒト血清アルブミンが挙げられ、これは個別のドメインを含む。もちろん、ｈＳＡは、任意の目的および使用のためであって、薬物送達／乳化のみに関するものではなく、本発明に従って糖構成単位で作製され得る。

以下の改変タンパク質は、特に企図される：１）Ｃ−末端またはＮ−末端において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎで改変されたヒト成長ホルモン、ここでｎが約１〜約２０、または約２〜約１８、または約４〜約１６、または約６〜約１４、または約８〜約１２、あるいは約１０：２）Ｃ−末端またはＮ−末端において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎで改変されたヒトプロラクチン、ここでｎは、約１〜約２０、または約２〜約１８、または約４〜約１６、または約６〜約１４、または約８〜約１２、または約１０：３）Ｃ−末端またはＮ−末端において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎで改変されたヒト胎盤ラクトゲン、ここでｎは、約１〜約２０、または約２〜約１８、または約４〜約１６、または約６〜約１４、または約８〜約１２、または約１０：４）Ｃ−末端またはＮ−末端において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎで改変されたインターフェロン−２−α、ここでｎは、約１〜約２０、または約２〜約１８、または約４〜約１６、または約６〜約１４、または約８〜約１２、または約１０：そして、５）Ｃ−末端またはＮ−末端において（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_ｎで改変されたインスリンここでｎは、約１〜約２０、または約２〜約１８、または約４〜約１６、または約６〜約１４、または約８〜約１２、または約１０である。

いくつかの実施形態において、Ｎ−末端「挿入」は、種々のホルモンの成熟形態または循環系の形態のＮ−末端における挿入である。この位置は、血流中に見出されるタンパク質ホルモンにとって望ましくあり得、分泌プロセスの間に切断されるアミノ末端分泌ペプチドにより形成される。

上で示された特定のタンパク質に加えて、抗体（モノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を含む）もまた、本発明に従って発現され得る。例えば、成長ホルモンに対するグリコシル化抗体または成長ホルモンレセプターに対するグリコシル化抗体は、本発明に従って作製され得る。

（植物における発現）
例えば、限定されないが、ＢＹ２タバコ細胞を含む懸濁培養細胞のような植物細胞において、組換え遺伝子は発現される。発現はまた、インタクトな植物宿主の範囲および、限定されないが、脊椎動物、植物、海綿動物、細菌、藻類、古細菌を含む他の生物体において、達成され得る。

いくつかの実施形態において、発現構築物／プラスミド／組換えＤＮＡは、プロモーターを含む。本発明は、特定のプロモーターに限定するよう意図されていない。本発明の核酸の少なくとも一部をコードする作動可能に連結された核酸配列の発現を命令することが可能な如何なるプロモーター配列も本発明の範囲内であることが企図される。プロモーターとしては、限定されないが、細菌、ウイルスおよび植物起源のプロモーター配列が挙げられる。細菌起源のプロモ−ターとしては、限定されないが、オクトピンシンターゼプロモーター、のノパリンシンターゼプロモーターおよび天然のＴｉプラスミド由来の他のプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、ならびにアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡプロモーターが挙げられる。植物プロモーターとしては、限定されないが、リブロース−１，３−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、メイズユビキチンプロモーター、ファセオリンプロモーター、Ｅ８プロモーターおよびＴｏｂ７プロモーターが挙げられる。

本発明は、目的の核酸配列の発現を制御するために使用されるプロモーターの数に限定されない。目的の核酸配列の発現が所望の様式で制御される限り、任意の数のプロモーターが使用され得る。さらに、プロモーターの選択は、発現が植物全体にわたって存在するか、植物の選択された組織（例えば、根、葉、果実など）に局在化されるかは、所望可能に支配され得る。例えば、花において活性なプロモーターは、公知である（Ｂｅｎｆｙら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：８４９〜８５６）。

植物細胞の形質転換は、種々の方法により達成され得、例えば、粒子媒介遺伝子移入（例えば、参考として本明細書により援用される米国特許第５，５８４，８０７号）；ランダム組込みのための外来ＤＮＡを含みアグロバクテリウム種での感染（参考として本明細書により援用される、米国特許第４，９４０，８３８号）または外来ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの標的化組込み（参考として本明細書により援用される、米国特許第５，５０１，９６７号）；電子注入（Ｎａｎら、（１９９５） Ｉｎ「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ」Ｅｄ．Ｙ．Ｐ．Ｓ．Ｂａｊａｊ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｏｌ
３４：１４５〜１５５；Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ（１９９２）Ｈｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：６２０）；リポソーム、リソゾーム、細胞、ミニセル（ｍｉｎｉｃｅｌｌ）または他の融合可能な脂質表面体（Ｆｒａｌｅｙら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１８５９〜１８６３；ポリエチレングリコール（Ｋｒｅｎｓら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２〜７４）；遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学薬品；ウイルスを使用する形質転換など。

用語、細菌による「感染する」および「感染」とは、細菌内に含まれる核酸配列が標的生物学的サンプルの１以上の細胞に導入されるような条件下における、標的生物学的サンプル（例えば、細胞、組織など）と細菌との共インキュベーションをいう。

用語「アグロバクテリウム」とは土壌性の、グラム陰性、桿状植物病原性細菌をいい、それはクラウンゴールを引き起こす。用語「アグロバクテリウム」とは、限定されないが、種Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（代表的には感染植物においてクラウンゴールを引き起こす）およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（感染宿主植物において毛根病を引き起こす）が挙げられる。植物細胞のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染は、一般的には感染細胞によるオパイン（例えば、ノパリン、アグロピン、オクトピンなど）の産生を生じる。従って、ノパリンの産生を引き起こすＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、種ＬＢＡ４３０１、Ｃ５８、Ａ２０８）は、「ノパリン型」アグロバクテリアといい；オクトピンの産生を引き起こすアグロバクテリウム種（例えば、種ＬＢＡ４４０４、Ａｃｈ５、Ｂ６）を「オクトピン型」アグロバクテリアといい；アグロピンの産生を引き起こすアグロバクテリウム種（例えば、種ＥＨＡ１０５、ＥＨＡ１０１、Ａ２８１）を「アグロピン型」アグロバクテリアという。

用語「撃ち込むこと」「撃ち込み」および「微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」は、粒子を標的生物学的サンプル（例えば、細胞、組織など）に向けて加速させて、標的生物学的サンプル中の細胞の細胞膜を損傷させるプロセスおよび／または標的生物学的サンプルにおける粒子の導入をいう。微粒子銃についての方法は、当該分野で公知であり（例えば、米国特許第５，５８４，８０７号。この内容は本明細書に参考として援用される）、市販されている（例えば、ヘリウムガス駆動の微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）加速器（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）（ＢｉｏＲａｄ）。

植物組織に言及される場合、用語「微損傷」は、その組織における微小な損傷の導入をいう。微損傷は、例えば、粒子または微粒子銃を用いる方法により達成され得る。

植物細胞はまた、本発明に従って葉緑体遺伝子操作（当該分野で説明されるプロセス）により形質転換され得る。葉緑体遺伝子操作についての方法は、例えば米国特許第６，６８０，４２６号および公開された米国出願第２００３／０００９７８３号、同第２００３／０２０４８６４号、同第２００３／００４１３５３号、同第２００２／０１７４４５３号、同第２００２／０１６２１３５号に記載のように達成され得、これらは本明細書に参考として各全体が援用される。

種々の宿主細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、本発明に使用されることが企図される。本発明は、本発明の合成遺伝子の発現に使用される宿主により限定されることを意図されない。一般的に、本発明は植物において企図される。本明細書で使用される場合、「植物」とは、光合成独立栄養的である任意の生物体を含み、それは青緑藻類を含む。また特に緑藻類、赤藻類、褐藻類も企図される。

宿主細胞として使用され得る植物は、維管束植物および非維管束植物を含む。非維管束植物としては、限定されないが、苔類が挙げられ、これさらに蘚類（コケ植物亜門）、苔類（苔類亜門）、およびマツモ（ツノゴケ植物亜門）が挙げられるが、これらに限定されない。維管束植物としては、限定されないが、低い（例えば胞子放散性）維管束植物（例えば、ヒカゲノカズラ植物門（ヒカゲノカズラ類）、ヒカゲノカズラ目、イワヒバ目およびミズニラ、トクサ類またはスギナ（有節植物門）、マツバラン（古生マツバラン類）ならびにシダ（シダ類）が挙げられる。

維管束植物は、限定されないがｉ）化石シダ種子類（シダ植物類）、ｉｉ）裸子植物（種が果肉によって保護されていない）、例えばソテツ類、（ソテツ）、針葉樹類（針葉樹、例えばマツ、トウヒ、モミ、ツガ、イチイ）、イチョウ類（イチョウ）、マオウ類（例えば、グネツム、マオウおよびサバクオモト），ｉｉｉ）ならびに被子植物（顕花植物−種は果肉により保護される）、これはさらに被子植物類を含み、さらに双子葉類（双子葉類）および単子葉類（単子葉類）を含む。本発明に従って使用され得る特定の植物宿主細胞としては、限定されないが、マメ科（例えばダイズ）およびナス科植物（例えば、タバコ、トマトなど）が挙げられる。本発明の範囲内であることが企図される他の細胞としては、緑藻型、クラミドモナス、ボルボックスおよびウキクサ（アオウキクサ）である。

本発明は、植物細胞の性質により限定されない。植物組織の全ての供給源が企図される。１つの実施形態において、本発明の配列を発現することができるベクターを用いた形質転換の標的として選択される植物組織は、植物を再生し得る。本明細書で使用される場合、用語「再生」とは、植物細胞、１群の植物細胞、植物部分、または植物片（例えば、種子、プロトプラスト、カルス、プロトコーム類似球体、または組織部分）から植物全体に生長することを意味する。そのような組織としては、種子に限定されない。顕花植物の種子は、胚、種皮および貯蔵された栄養分から構成される。完全に形成された場合、胚は一般的に１つまたは２つの子葉のいずれかを担持する胚軸−根軸、ならびに、茎頂および根端における頂端分裂組織から構成される。殆どの双子葉類の子葉は、多肉質の、種子の貯蔵された栄養分を含む。他の双子葉類および殆どの単子葉類において、栄養分が、胚乳に貯蔵され、そして子葉は、栄養分の消化から生じる単純な化合物を吸収するよう機能する。

以下の植物の属の例からの種は、形質転換されたプロトプラストから再生され得る：オランダイチゴ、ミヤコグサ、ウマゴヤシ、イガマメ、シロツメグサ、トリゴネラ、ササゲ属、レモン、アマ、ゲンノショウコ、キャッサバ、ニンジン、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイコン、カラシ、アトロパ、トウガラシ、ヒヨスキアムス、トマト、タバコ、ナス、ツクバネアサガオ、ジギタリス、マジョラム、キクニガナ（Ｃｉｏｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ、アキノゲン、キツネガヤ、クサスギカズラ、キンギョソウ、ユリ、ネメシア、テンジクアオイ、オオクサキビ、チカラシバ、キンポウゲ、ハンゴンソウ、サルピグロッシス（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、ウリ、ブロワリア（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、ダイズ、ドクムギ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびチョウセンアサガオ。

トランスジェニックプロトプラストからトランスジェニック植物の再生に関して、形質転換されたプロトプラストの懸濁物または形質転換された外植体を含むペトリ皿が、最初に提供される。カルス組織は、形成されそしてシュートはカルスから誘発され得、その後根づき得る。あるいは、体細胞胚形成は、カルス培養で誘発され得る。これらの体細胞胚は、植物を形成する天然胚として発芽する。培養培地は、一般的には種々のアミノ酸および例えば、オーキシンおよびサイトカイニンのような植物ホルモンを含んでいる。グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することもまた、特にコーンおよびアルファルファのような種には好都合である。効率的な再生は、培地、表現型および培養の履歴に依存する。これらの３つの変数は、再現性のある再生になるよう実験的に制御され得る。

植物はまた、培養細胞または培養組織からも再生され得る。トランスジェニック全植物体を得るために形質転換された個別の細胞から再生することができることが示された双子葉植物としては、例えばリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）、クロイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）、クロイチゴ／キイチゴハイブリッド（Ｒｕｂｕｓ）、アカキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、セロリー（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、野生ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、イチゴ（Ｆｒａｇｒａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）およびマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）が挙げられる。トランスジェニック全植物体を得るために形質転換された個別の細胞から再生可能であることを示された単子葉植物としては、例えばコメ（Ｏｒｙｚａ）、ライ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）およびメイズが挙げられる。

さらに細胞から全植物体の再生（必ずしも形質転換されていない）はまた、以下に観察された：アンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、バナナ（ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｓａ）、マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サクラ（ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｕｎｕｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、タマネギ（ｈｙｂｒｉｄ ｌｌｉｕｍ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、パパイア（Ｃａｒｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉａ）、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、洋ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）。

再生された植物は、標準的な土壌条件に移動されて従来の様式で栽培される。発現ベクターが再生されたトランスジェニック植物に安定に取り込まれた後、このベクターは栄養繁殖によるか、または性的勾配により他の植物に移動され得る。例えば、栄養繁殖した穀類において成熟トランスジェニック植物は、挿し木をすることによるか、または組織培養技術により繁殖されて、複数の同一の植物を形成する。種子繁殖穀類において、成熟トランスジェニック植物は自己交配されて、メンデル遺伝によりその子孫に導入遺伝子を伝え得る能力を有するホモ接合近交系植物を産生する。近交系植物は目的の核酸配列を含む種子を産生する。これらの種子は、成長して所望のペプチドを産生する植物を生じ得る。これらの近交系植物をまた、ハイブリッドを産生するためにその近交系植物と別の近交系植物と交配することにより使用して、新しいハイブリッドを開発し得る。

本発明は、特定の型の植物のみに限定されるよう意図されていない。単子葉類および双子葉類の両方が企図される。単子葉類としては、イネ科植物、ユリ、アイリス、ラン、ガマ、ヤシ、トウモロコシ（例えば、コーン）、コメ、オオムギ、コムギおよび全てのイネ科植物が挙げられる。双子葉類としては、よく知られている殆ど全ての樹木および潅木（参照以外のもの）および多くの草本（非樹木性の植物）が挙げられる。

トマト培養物は、反復性ＨＲＧＰ構成単位がヒドロキシル化かつグリコシル化されるレシピアントの一例である。上記培養物は、細胞表面に高収率でＨＲＧＰを産生し、それは容易にインタクトな細胞の細胞表面から溶出され、そして植物に特に必要とされる翻訳後酵素（ＨＲＧＰ プロリルヒドロキシラーゼ、ヒドロキシプロリン Ｏ−グリコシルトランスフェラーゼおよび他の特定の複合体多糖側鎖を構築するグリコシルトランスフェラーゼ）を所有する。本発明の配列に関する他のレシピエントとしては、限定されないが、タバコ培養細胞および植物（例えば、タバコＢＹ２（ｂｒｉｇｈｔ ｙｅｌｌｏｗ２））が挙げられる。

簡単にいえば、本発明の発現ストラテジーは、植物（例えば、インタクトな単子葉類および双子葉類、裸子植物、シダ類、苔類、細胞懸濁培養物および藻類など）において、種々の生物体（例えば、ヒトおよび他の哺乳動物ならびに／または脊椎動物、無脊椎動物、植物、海綿動物、細菌、真菌、藻類、古細菌、可能性としてこの惑星上における可能性ある任意の生物体）からのタンパク質を発現するために使用され得る。

（有用性）
発現される特定のペプチド／ポリペプチド／タンパク質に依存して、生成物の種々の有用性が企図される。発現される生成物が緑色蛍光タンパク質を含んでいる場合、例えば、この生成物またはこの生成物を含む細胞は、蛍光スクリーニングアッセイに使用され得る。上記生成物が生物学的に活性である場合、例えば、発現された生成物は、レセプターのアンタゴニストまたはアゴニストとして使用され得、インビトロおよびインビボで使用され得る。インビトロの有用性は、例えば、スクリーニングアッセイにおける使用を含む。インビトロ有用性としては、限定されないが、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に基づき、ヒトまたは他の動物の処置に関する上記化合物の使用が挙げられる。

疾患に関連して本明細書で使用される場合、用語「処置」とは、広範囲に使用され、疾患の治癒の方法に限定されない。用語「処置」は、疾患の病理学的効果または症状の１以上を軽減させるか、あるいはそのような病理学的効果または症状の１以上の進行速度を軽減させるのに役立つ、如何なる方法をも含む。

本発明に従ってなされ得る上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質の全てについての有用性全ての説明にはスペースが限りあるので、実施例は、特に成長ホルモンに関して記載される。本明細書で記載される成長ホルモンの投与は、以下のために使用され得る：成長ホルモン欠乏症のヒトまたはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマを含む他の動物を処置すること；糖質コルチコイドの異化的副作用を減少させること；骨粗鬆症を処置すること；免疫系を刺激すること；創傷治癒を加速すること；骨折修復を加速すること；成長遅延を処置すること；うっ血性心不全を処置すること；急性腎不全もしくは慢性腎不全または急性腎機能不全もしくは慢性腎機能不全を処置すること；成長ホルモン欠乏小児を含む、生理学的短身を処置すること；慢性疾患と関連する短身を処置すること；肥満を処置すること；プラーダー−ヴィリ症候群およびターナー症候群と関連する短身を処置すること；代謝性症候群（シンドロームＸとしてもまた知られる）を処置すること；熱傷患者または大手術後の回復を加速し、入院を減少させること；子宮内成長遅延、骨格異形成、副腎皮質機能亢進症およびクッシング症候群を処置すること；ストレスのかかった患者において成長ホルモンを元に戻す（ｒｅｐｌａｃｅ）こと；骨軟骨異形成、ヌーナン症候群、睡眠障害、アルツハイマー病、遅延した創傷治癒および心理・社会的欠乏を処置すること；肺機能不全および吸入器依存症を処置すること；大手術の後のタンパク質異化応答を減弱すること；吸収不良症候群を処置すること癌またはＡＩＤＳなどの慢性疾患に起因する悪液質およびタンパク質喪失を減少させること；完全非経口栄養を受ける患者における体重増加およびタンパク質増大を加速すること；膵島細胞症を含む、高インスリン血症を処置すること；排卵誘導のための補助的処置ならびに胃潰瘍および十二指腸潰瘍を予防し、そして処置すること；胸腺発達を促進し、そして胸腺機能の加齢性減退を予防すること；慢性透析患者の補助的治療；免疫抑制患者を処置し、ワクチン接種に続く抗体応答を亢進すること；虚弱な年配者における筋肉強度を改善すること、筋肉量、運動性の増加、皮膚厚さ、代謝性ホメオスタシス、腎性ホメオスタシスの維持；骨芽細胞、骨再構成および軟骨成長を刺激すること；例えば末梢神経障害および薬物誘導神経障害、ギヤン−バレー症候群、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳血管障害および脱髄疾患などの神経性疾患を処置すること；羊において羊毛成長を促進すること。

農場の動物において、成長ホルモンは、以下のことに使用され得る：例えばニワトリ、七面鳥、ヒツジ、ブタおよびウシにおいて食肉産生を増加すること；出生前後の成長を促進し、肉産生のために飼養される動物において食餌効率を亢進し、屠体品質を改善すること（脂肪に対する筋肉の比率を増加すること）；乳牛もしくは他の哺乳動物種において乳産生を増加すること；身体組成を改善すること；例えば、ワクチン接種に続く抗体応答を促進することまたは発達プロセスを改善することなど、他のＧＨ依存性代謝機能および免疫学的機能の改変；ならびに魚において成長を加速し、そしてタンパク質 対 脂質比を改善すること。

ペット動物において、成長ホルモンの使用としては以下が挙げられる：胸腺の発達を促進することと胸腺機能の加齢性減退を予防すること；胸腺機能の加齢性減退を予防すること；認知において加齢性減退を予防すること；創傷治癒を加速すること；骨折修復を加速すること；骨芽細胞、骨再構成および軟骨成長を刺激すること；大きな手術後のタンパク質の異化応答を減弱し、熱傷および例えば消化管手術のような大きな手術からの回復を加速すること；免疫系を刺激しワクチン接種の後の抗体応答を亢進すること；うっ血性心不全を処置すること；急性腎不全もしくは慢性腎不全または急性腎機能不全もしくは慢性腎機能不全を処置すること、肥満を処置すること；成長遅延、骨格異形成および骨軟骨異形成を処置すること；糖質コルチコイドの異化的副作用を予防すること；クッシング症候群を処置すること；吸収不良症候群を処置すること、癌のような、慢性疾患に起因する悪液質およびタンパク損失を減少させること、完全非経口栄養を受ける動物の体重増加およびタンパク質増大を加速すること；排卵誘導の補助的処置を提供すること、そして消化管潰瘍を抑制すること；筋肉の量、強度および運動性を改善すること；皮膚厚さの維持ならびに活力ある器官機能および代謝性ホメオスタシスを改善すること、または小さい動物の大きな動物への成長を促進すること。

本明細書で記載される成長ホルモンアンタゴニストに関して、処置され得る疾患は以下の基準の１つ以上により特徴付けられる；成長ホルモン産生レベルの増加、成長ホルモンレセプター産生レベルの増加および成長ホルモンに対するレセプターの細胞性応答の増加。本明細書で使用される用語「増加」は、正常な個体におけるレベルと比較した、疾患したヒト（もしくは動物）の１組織（もしくは複数の組織）における、成長ホルモン産生、成長ホルモンレセプター産生または成長ホルモン媒介性細胞応答の正常レベルに対して使用される。本発明の方法による成長ホルモンアンタゴニストで処置され得る疾患としては、限定されないが、先端巨大症、巨人症、癌、糖尿病、血管性眼疾患（糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性、鎌状赤血球貧血の網膜症など）ならびに腎症および糸球体硬化症、ならびに病院の集中治療ユニットの重症個体が挙げられる。

本発明により処置され得る癌としては、限定されないが、成長ホルモンレセプターを発現する腫瘍細胞を含む癌が挙げられる。本発明の方法により処置され得る癌としては、限定されないが以下が挙げられる：心臓系：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原生癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺種、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様の過誤腫、中皮種；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド、カポージ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺種、絨毛腺種、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖管：腎（腺癌、ウィルムス腫（腎芽細胞腫）、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎生期癌、奇形症、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原生肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫（ｃｈｏｒｉｄｒｏｍｙｘｏｆｉｂｒｏｍａ）、類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞癌、髄芽細胞腫、神経膠腫、上皮腫、胚細胞腫［松果体腫］、膠芽腫多形、希突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘膜性嚢胞腺癌、類内膜腫瘍、腹部芽細胞腫（ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、明細胞癌、未分類癌］、顆粒層包膜細胞腫瘍、セルトーリ−ライディヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管（癌）；血液系：血液（骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および副腎：神経芽細胞腫。特に、乳癌、結腸癌および前立腺癌ならびに白血病およびリンパ腫における使用が企図される。

成長ホルモンアゴニストまたは成長ホルモンアンタゴニストは、適合性のある、非毒性の薬学的賦形剤と組合せ得、そして投与され得る。非ヒト動物への投与の場合、薬物を動物の食餌中に混和すること、可能であれば農家により即時使用可能な薬物と栄養物質との調製された組合せが好ましくあり得る。成長ホルモンまたは成長ホルモンアンタゴニストは、任意の適切な薬学的投薬形態で経口的に、直腸経由で、経皮的に、肺浸潤で、ガス注入法で、または非経口的（静脈内に、皮下におよび筋肉内を含む）に、ヒトに投与され得る。ポリエチレングリコール部分はまた、成長ホルモンまたは成長ホルモンアンタゴニストに付加され得る。網膜症の処置の場合、従来の眼用の製薬形態によって眼または眼内に直接的に投与され得る。

有効用量および処置プロトコルは、実験動物で低い用量から始めて、その後効果をモニターしながら投薬量を増加させ、そして系統的に投薬レジメンもまた変えていく、従来の方法で決定され得る。一般的に、ＧＨ作用の臨床的な終点は、血清ＩＧＦ−１のレベルを測定することである。ＧＨが上がるにつれてＩＧＦ−１も上がる。ＧＨが下がるにつれてＩＧＦ−１が下がる。そこで、ＧＨ欠乏条件においては、ＧＨおよびＩＧＦ−１の両方が低い。これらの個体に組換えＧＨを与える場合、ＩＧＦ−１レベルは上昇する。臨床医は、年齢で調整した正常範囲にＩＧＦ−１レベルを維持しようと試みる。一方、ＧＨが多すぎると、ＩＧＦ−１レベルは高い。ＧＨアンタゴニストを与える場合、ＩＧＦ−１レベルは低下する。臨床医は、ＩＧＦ−１レベルが年齢で調整した正常レベルに戻るように、患者に投薬を試みる。投与した被験体に最適な投薬量を決定する場合、多くの要因が臨床医に考慮され得る。それらの要因の中で重要なものは、下垂体により通常分泌される成長ホルモンの量であり、それは健常な成人については０．５ｍｇ／日のオーダーである。さらなる要因としては、患者の体格、患者の年齢、患者の一般状態、処置される特定の疾患、疾患の重篤度、患者における他の薬物の存在、アゴニストまたはアンタゴニストのインビボ活性などが挙げられる。試行投薬は、動物研究の結果および成長ホルモンおよび／またはソマトスタチン（成長ホルモン放出インヒビター）の投与に関する臨床的文献を考慮した後、選択される。例えばインビトロ成長ホルモン結合競争アッセイから誘導された結合定数およびＫｉの情報はまた、投薬量を計算するのに使用され得ることは、当業者に理解される。

成長ホルモンアンタゴニストの代表的なヒト用量は、約０．１ｍｇ／日〜約１０ｍｇ/日、または約０．５ｍｇ/日〜約２ｍｇ/日、または約１ｍｇ/日である。成長ホルモンアゴニストの代表的なヒト用量は、約１０ｍｇ／日〜約８０ｍｇ／日、または約２０ｍｇ／日〜約４０ｍｇ／日、または約３０ｍｇ／日である。上で注記されたように、適切な用量は、ＩＧＦ−１レベルをモニタリングすることにより実験的に決定され得る。例えば、十分なＧＨアンタゴニストを投与してＩＧＦ−１レベルを正常に戻す。

本発明によるタンパク質のグリコシル化は、分子量を有意に増加し得ることが注意されるべきである。（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０で改変された成長ホルモン（２２ｋＤａ）は、例えば、４５ｋＤａを超える分子量を示す。そのように上記分子量は２倍を超えるが、それでも活性を同じに維持する。これは、用量および用量等価を決定するにはモル濃度ベースで考慮されなければならないということが、参酌されなければならない。

本発明はまた、疾患を処置する課題の方法に使用する薬学的処方物を提供する。処方物は、例えば成長ホルモンアゴニストまたは成長ホルモンアンタゴニストのような生物学的に活性なタンパク質を少なくとも１つ含み得、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。種々の水溶性キャリア、例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが使用され得る。薬学的処方物はまた、保存剤、タンパク質安定剤などを含む薬学的処方物の有効貯蔵期間を延ばすのに役立つ付加的な成分を含み得る。上記処方物は、好ましくは滅菌されそして粒子状物質（注入可能な形態に関して）がない。これらの組成物は、従来の周知の安定化技術により滅菌され得る。上記組成物は、生理的条件に近似するのに必要とされる、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酪酸ナトリウムなど）のような薬学的に受容可能な補助的物質を含み得る。本発明の処方物は、筋肉内、皮下、静脈内、眼内などを含む、種々の投与の形態に適合され得る。課題の処方物はまた、成長ホルモンアゴニストまたは成長ホルモンアンタゴニストの徐放を提供するように処方され得る。非経口的に投与可能な組成物、および被験体に投与するのに必要な調製物を調整する方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅにさらに詳細に記載され、それは本明細書に参考として援用される。

他の有用性は、本説明を読むことにより当業者には容易に明らかである。

（実施例１：トランスジェニックタバコ細胞を用いるアラビアゴム糖タンパク質アナログの発現）
アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）、アラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）、は、ゴアラビアゴムの乳化特性を説明する表面活性成分である。この機能的ＧＡＧＰは、ガラクトース、アラビノース、ラムノースおよびグルクロン酸を含む４つの主な炭化水素部分、ならびに上記構造の集積された部分としてのＨｙｐに富んだタンパク質（Ｉｓｌａｍ Ａ．Ｍ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｇ．Ｏ．、Ｓｌｊｉｖｏ Ａ．、Ｓｎｏｗｄｅｎ Ｍ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍ Ｐ．Ａ．（１９９７）、Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ １１（４）：４９３〜５０５）の小部分（約１０％、ｗ／ｗ）からなる代表的なＨＲＧＰである。上記ＧＡＧＰは、すでに単離されており、そして十分に特徴付けられている。しかしながら、ＧＡＧＰをコードする遺伝子は、今までにクローン化はされていないし、ＧＡＧＰが乳化能力およびユニークな特性を示す正確なメカニズムも解明されていない。最近、ＧＡＧＰポリペプチド骨格の主なアミノ酸配列が、得られた。それは１９残基のコンセンサスモチーフ、ＳＯＯＯ（Ｏ／Ｔ／Ｓ）ＬＳＯＳＯＴＯＴＯＯ（Ｏ／Ｌ）ＧＰＨ（Ｏ：ヒドロキシプロリン）（Ｇｏｏｄｒｕｍ Ｌ．Ｊ．、Ｐａｔｅｌ Ａ．、Ｌｅｙｋａｍ Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ Ｍ．Ｊ．（２０００）、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ５４（１）：９９〜１０６）。これは、トランスジェニック植物において、合成遺伝子技術を使用してＧＡＧＰアナログを発現する可能性を提供する。７つのＧＡＧＰアナログをコードする遺伝子を設計し、そして構築した。これらは、以下の３つの型を含む：ａ）［Ｇｕｍ］_３，［Ｇｕｍ］_８および［Ｇｕｍ］_２０は、それぞれＧＡＧＰコンセンサスモチーフの３回反復、８回反復、２０回反復をコードする遺伝子であり；ｂ）［ＨＰ］_４および［ＨＰ］_８は、ＧＡＧＰ疎水性ポリペプチド［ＨＰ］の４回反復および８回反復をコードする遺伝子であり、それはまた、ＧＡＧＰ骨格ポリペプチドから由来したものである；ならびにｃ）［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_２および［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_４は、［Ｇｕｍ］_８と、２回反復の［ＨＰ］および４回反復の［ＨＰ］との組合せの型である。これらの合成アナログは、タバコ細胞において、増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との融合タンパク質として発現される。

（材料および方法）
（遺伝子構築）
ＧＡＧＰアナログを発現するように構築された全ての遺伝子カセットは、「ＳＳ^ｔｏｂ−［合成遺伝子］−ＥＧＦＰ」構造を有する。この構造において種々のＧＡＧＰアナログをコードする合成遺伝子を、ＳＳ^ｔｏｂ（これはタバコからのエクステンシンシグナル配列をコードする（Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ、Ｍ．、Ｇｈｅｙｓｅｎ、Ｇ．、Ｔｉｒｅ、Ｃ．、Ｇｉｅｌｅｎ、Ｊ．、Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ、Ｒ．、Ｇｅｎｅｔｅｌｌｏ、Ｃ．、Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ．、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａ．およびＩｎｚｅ、Ｄ．（１９９１）、Ｇｅｎｅ、９９：９５〜１００））とＥＧＦＰの遺伝子との間に挿入した。

（１）［Ｇｕｍ］_３、［Ｇｕｍ］_８および［Ｇｕｍ］_２０遺伝子合成）
ＳＰＳＰＴＰＴＡＰＰＧＰＨＳＰＰＰＴＬの３回繰返しをコードする［Ｇｕｍ］_３を，Ｓｈｐａｋら（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１）により記載されるように５’−リンカー、内部ＧＡＧＰ繰り返し、および３’−リンカーを含む、３つのセットの部分的に重複した、相補的なオリゴヌクレオチド対の頭−尾重合により構築した。

［Ｇｕｍ］_８および［Ｇｕｍ］_２０を、ＧＰＨＳＰＰＰＰＬＳＰＳＰＴＰＳＰＰＬ−ＧＰＨＳＰＰＰＴＬＳＰＳＰＴＰＴＰＰＰ（［Ｇｕｍ］_２と名付けた）の４回繰返しおよび１０回繰返しをコードするように設計した。交互の繰返しに僅かな差異を有し、従って天然のＧＡＧＰとより正確に類似する。上記［Ｇｕｍ］_２遺伝子を、２つの相互にプライミングするオリゴヌクレオチド（図１ａ）のプライマー伸長により合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）。２重鎖をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ１８プラスミドに入れた。上記合成遺伝子の４回繰返しおよび１０回繰返しの構築は、［Ｇｕｍ］_２フラグメントの、適合するが再生不能な制限部位（ＸｍａＩおよびＢｓｒＦＩ）をアニーリングして、２倍の数の繰返しを形成することを要した（Ｌｅｗｉｓ Ｒ．Ｖ．、Ｈｉｎｍａｎ Ｍ．Ｋｏｔｈａｋｏｔａ Ｓ．およびＦｏｕｒｎｉｅｒ Ｍ．（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ ７：４００〜４０６）。繰返しにより、そのような遺伝子フラグメントは、幾何数列的に４回繰返しおよび１０回繰返しの長さに増大され得る。

（２）［ＨＰ］_２、［ＨＰ］_４および［ＨＰ］_８遺伝子合成）
［ＨＰ］_２、［ＨＰ］_４および［ＨＰ］_８遺伝子を、［ＨＰ］_１と名付けられたＴＰＬＰＴＬＴＰＬＰＡＰＴＰＰＬＬＰＨの２回繰返し、４回繰返しおよび８回繰返しをコードするように設計した。［ＨＰ］_１はまた、上述のように２つの相互にプライミングするオリゴヌクレオチド（図１ｂ）のプライマー伸長により合成した。２重鎖をｐＵＣ１８プラスミドにＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして入れた。上記合成遺伝子の２回繰返し［ＨＰ］_２、４回繰返し［ＨＰ］_４および８回繰返し［ＨＰ］_８の構築は、［ＨＰ］_１フラグメントの、適合するが再生不能な制限部位（ＢｓｐＥＩおよびＸｍａＩ）をアニールする工程を要した。

（３）ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_ｎ−ＥＧＦＰ（ｎ＝３，８，１０）プラスミド構築）
上記プラスミドｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_３−ＥＧＦＰを、Ｓｈｐａｋら（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１）に従って構築した（図２ａ）。重合した［Ｇｕｍ］_８および［Ｇｕｍ］_２０遺伝子を、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰに、ＳＳ^ｔｏｂとＥＧＦＰ遺伝子との間のＢｓｐＥＩ／ＡｇｅＩフラグメントとしてサブクローニングして（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１）、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_８−ＥＧＦＰおよびｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_２０−ＥＧＦＰと表されたプラスミド（図２ｂ）を形成した。

（４）ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［ＨＰ］_ｎ−ＥＧＦＰ（ｎ＝４，８，）プラスミド構築）
重合した［ＨＰ］_４および［ＨＰ］_８遺伝子を、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰに、ＳＳ^ｔｏｂとＥＧＦＰ遺伝子との間のＡｇｅＩ／ＮｃｏＩフラグメントとしてサブクローニングして（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１）、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［ＨＰ］_４−ＥＧＦＰおよびｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［ＨＰ］_８−ＥＧＦＰ（図３）と表されたプラスミドを形成する。

（５）ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_ｎ−ＥＧＦＰ（ｎ＝２，４）プラスミド構築）
重合した［ＨＰ］_２および［ＨＰ］_４遺伝子を、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_８−ＥＧＦＰに、［Ｇｕｍ］_８とＥＧＦＰ遺伝子との間のＡｇｅＩ／ＮｃｏＩフラグメントとしてサブクローニングし、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_２−ＥＧＦＰおよびｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−［Ｇｕｍ］_８［ＨＰ］_４−ＥＧＦＰと表されたプラスミド（図４）を形成した。

上で構築された全ての遺伝子のＤＮＡ配列分析は、オハイオ大学環境−植物生物学の学科で行われた。

（植物形質転換ベクターの構築）
全体の「ＳＳ^ｔｏｂ−［合成遺伝子］−ＥＧＦＰ」構築物を、その後植物ベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＣＡ）にＢａｍＨＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてβ−グルクロニダーゼリポーター遺伝子の代わりにサブクロ-ニングし、プラスミドｐＢＩ−ＳＳ^ｔｏｂ−［合成遺伝子］−ＥＧＦＰを形成した。これらの合成遺伝子を、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターの制御下で発現した。

（植物細胞形質転換および選択）
プラスミドｐＢＩ１２１−ＳＳ^ｔｏｂ−［合成遺伝子］−ＥＧＦＰを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に凍結融解法（Ｈｏｌｓｔｅｒら、１９７８）により導入し、その後懸濁培養タバコ細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、ＢＹ２）を以前に記載されるように（Ａｎ，Ｇ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７９：５６８−５７０）アグロバクテリウムで形質転換し、０．４ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２００ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）および４００ｍｇ／Ｌのチメンチン（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、ＰＡ）を含有する固形Ｓｃｈｅｎｋ ＆ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（ＳＨ）培地（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ、１９７２）で選択した。各構築物の少なくとも１０細胞株を選択し、チメチンを除く以外は上と同じ成分からなる液体ＳＨ培地に移した。９０ｒｐｍで回転するＩｎｎｏｖａ回転振盪器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）上で、１０日間室温で培養後、各細胞株の培養培地を、緑色蛍光強度を測定することにより標的タンパク質についてスクリーニングした。各構築物の最高緑色蛍光強度を生成する細胞株を、継代培養のために選択した。

（培地からのＧＡＧＰアナログ−ＥＧＦＰ融合糖タンパク質の単離）
１２〜１４日間培養後に採取した培養培地を３０℃でロータリーエバポレーションにより約１０倍濃縮した。２Ｍ塩化ナトリウムを含む１００〜２００ｍｌの培地アリコートを、２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、１６×７００ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に載せ、２Ｍ、１Ｍから蒸留水へ段階的に塩化ナトリウム勾配をかけて溶出した。蒸留水で溶出した緑色蛍光画分をプールして、凍結乾燥で濃縮し、その後２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム（１６×７００ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分画した。ＧＰＣカラムから収集された蛍光画分を、さらに出発緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）で平衡化したＨａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−１半調製用カラム（１０μｍ、７×３０５ｍｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）に注入することによりＨＰＬＣで精製した。１．０ｍｌ／分の流速で、１００分の内に０〜７０％Ｂの直線勾配をかけて、緩衝液Ｂ（０．１％ トリフルオロ酢酸＋８０％ アセトニトリル、ｖ／ｖ）でタンパク質を溶出した。

（トリプシン消化による融合糖タンパク質からＥＧＦＰの除去）
約１００ｍｇの融合タンパク質を、２分間沸騰水中で熱変性させ、冷却後、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび１００μｇトリプシンを含む、新しく調製した等容量の２％（ｗ／ｖ）重炭酸アンモニウムと合わせた。室温で一晩インキュベーションした後、サンプルをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ ＧＰＣカラムで分画し、上述と同じ方法を使用してＨＰＬＣでさらに精製した。

（乳化特性の特性付け）
ＰｅａｒｃｅおよびＫｉｎｓｅｌｌａの方法（Ｐｅａｒｃｅ Ｋ．Ｎ．およびＫｉｎｓｅｌｌａ Ｊ．Ｅ．（１９７８）Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２６（３）：７１６〜７２３）をいくらか改変して、乳化アッセイを行った。乳化液を、ガラス試験管中で０．４ｍＬのオレンジ油および０．６ｍＬの０．５％（ｗ／ｖ）のタンパク質溶液（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）をＭｉｃｒｏｔｉｐ（登録商標）プロ−ブを装備したＳｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、超音波処理することにより調製した。振幅を４に設定し、そしてオイル／水混合物を６０秒処理し、ずっとその間氷上を保った。このように得られた１００μlアリコートの乳化液を、その後０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液で連続的に希釈し、最終希釈１／１５００を得た。１／１５００希釈の光学密度を５００ｎｍで測定し、それを乳化能力（ＥＡ）として定義した。残っている乳化液を、室温で２時間、ガラス試験管中で垂直に保持して、再び１／１５００希釈の光学密度を測定した。２時間保存後に残っている光学密度の割合を乳化安定性（ＥＳ）と定義する。

（結果）
タバコ細胞により発現されたＧＡＧＰアナログの全てが、天然のＧＡＧＰより低い乳化能力を示した。これらのＧＡＧＰアナログの乳化能力の順は、［ＨＰ］_８＞［ＨＰ］_４＞［ＧＵＭ］_８［ＨＰ］_４＞［ＧＵＭ］_８［ＨＰ］_２＞［ＧＵＭ］_２０＞［ＧＵＭ］_８＞［ＧＵＭ］_３であった。しかしながら、表１に示すように、ＥＧＦＰがこれらの合成ＧＡＧＰアナログに連結される場合、全ての融合タンパク質は天然のＧＡＧＰより、より良好な乳化能力を示した。

（実施例２：グリコシル化により増加した収率）
植物細胞において発現したいくつかのトランスジェニックタンパク質は、一般的に低い収率であり、従って植物系における発現は費用がかかり、効率が悪く、実践的ではない。本発明は、植物細胞において産生されるトランスジェニックタンパク質の収率を、そのトランスジェニックタンパク質を、少なくとも１つのヒドロキシプロリンリッチな糖タンパク質（ＨＲＧＰ）糖構成単位を有する融合タンパク質として産生することにより増加させる新たな方法を包含する。この実施例は、上の実施例１で記載された、糖構成単位を有する新規なタンパク質を創作する技術のいくつかを用いる。これらの糖構成単位を含むことにより、培地中に発現されるタンパク質の収率が増加する。

簡単にいうと、２つの一般的な糖構成単位の型があり：１）ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基がアラビノガラクタン付加化合物Ｏ−グリコシル化された、クラスター状の非連続性Ｈｙｐ残基を含むアラビノガラクタン糖構成単位（例えば、Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ繰返しであって、ここでＸａａは、ＳｅｒまたはＡｌａであるが、ＴｈｒまたはＶａｌ（あるいは、ＬｙｓまたはＧｌｙ）のような他のアミノ酸でもあり得る。例えば、［Ｓｅｒ−Ｈｙｐ］_ｎまたは「Ａｌａ−Ｈｙｐ］_ｎ）；ならびに２）連続性Ｈｙｐ残基を含むアラビノシル化糖構成単位であって、ここでＨｙｐ残基のいくらかまたは全てが約１〜５残基長のアラビノオリゴ糖鎖でアラビノグリコシル化されているもの（例えば、Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ_ｎ構成単位であって、ここでＸａａは、ＳｅｒまたはＡｌａまたは他のアミノ酸（例えば、［Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ］_ｎまたは［Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ］_ｎ）であり得る）。

（発現のための遺伝子の設計）
導入遺伝子は、内膜系を通過して分泌させるためのシグナル配列を含み得る。例えば、タバコエクステンシンシグナル配列：ＭＡＳＬＦＡＴＦＬＶＶＬＳＬＳＬＡＱＴＴＲＳＡ（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１）；トマトＬｅＡＧＰ−１シグナル配列：ＭＤＲＫＦＶＦＬＶＳＩＬＣＩＶＶＡＳＶＴＧ（Ｌｉ ＆
Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ、ＬｉおよびＳｈｏｗａｌｔｅｒ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６）Ｎｏｖ；３２（４）：６４１〜５２；Ｚｈａｏ ＺＤ、Ｔａｎ Ｌ、Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ ＡＭ、Ｌａｍｐｏｒｔ ＤＴ、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、ＭＪ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２００２ Ａｕｇ；３１（４）：４３１〜４４）。

（１）遺伝子構築）
これらの例に関して、上記遺伝子カセットを、以下の構造を有するよう構築した：

図５、６、７、８および９は、それぞれ、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０−ＥＧＦＰ、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０、ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）−（ＳＰ）_１０およびドメインＩ（ＨＳＡのドメインＩ）−（ＳＰ）_１０に関する遺伝子カセットの構築の概要を示す。図１０Ａは、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の発現のための遺伝構築物を示す；図１０Ｂは、その構築物が如何にプライマー伸長により創作されたかを示す。図１１、１２（ＡおよびＢ）、１３および１４は、それぞれｈＧＨ−（ＳＰ）_１０−ＥＧＦＰ、ＨＳＡ−（ＳＰ）_１０、ドメインＩ（ＨＳＡの）−（ＳＰ）_１０およびＩＮＦ２α（インターフェロン２α）−（ＳＰ）_１０を示す。

（結果の要約）
ＥＧＦＰを、ＥＧＦＰが分泌されるようにするＮ末端シグナル配列と一緒に発現した。しかしながら、シグナル配列が連結されてすら、培地中に分泌される平均量は、正確に定量できないほど低かった。

反対に、ＥＧＦＰが種々の型のＨＲＧＰ融合タンパク質として発現される場合、収率は劇的に増加した。下の表２および３は、収率を増加した異なる型の植物、タンパク質および構築物の例を示す。

（結果の詳細な説明）
上に要約された結果は、異なる構築物および発現された異なるタンパク質を用いた多くの異なる研究から確認し、各特定の研究の代表的なものとして選択した。以下の節は、種々の段階で観察される発現のプロセスを、ａ）グリコシル化構成単位を有しないｈＧＨ構築物およびｂ）グリコシル化構成単位を有するｈＧＨ構築物、の発現に焦点をあてて分析する。いくつかの例において、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の発現を、如何に異なるペプチド要素が発現されたかを観察するために、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰと比較した。

図１５は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０およびｈＧＨで形質転換されたタバコ細胞の培地に分泌されたｈＧＨ等価物の検出を示す。フレーム（Ａ）は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（上段）またはｈＧＨ（下段）で形質転換された１０の細胞株から１μＬの培地に生じたｈＧＨ等価物のドットブロットアッセイを示す。フレーム（Ｂ）は、１０の細胞株の同じ２セットからの培地でのｈＧＨ等価物のサンドイッチＥＬＩＳＡ定量を示す。これらの結果は、グリコシル化構成単位の連結が、培地中への発現されたタンパク質の分泌を有意に増加したことを実証する。

図１６は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０で形質転換されたＢＹ−２タバコ細胞における細胞増殖およびｈＧＨ等価物の経時変化を示す。上記タバコ細胞を、１００ｍＬの培地を含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコで増殖した。３つのフラスコを、２日間隔で、培地中の細胞乾燥重量およびｈＧＨ等価物を測定するために取り出した。培養細胞を、焼結漏斗上でろ過により採取し、その濾液（培養培地）を、ｈＧＨアッセイのために収集し；上記細胞を３回蒸留水で洗浄し、その後乾燥重量を測定する前に３日間凍結乾燥した。ｈＧＨ等価物をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定した。

形質転換細胞からの培地を８〜１０日間の培養後に、粗焼結漏斗上での濾過により採取し、塩化ナトリウムを最終濃度２Ｍになるよう補填した。不溶性物質を、２５，０００×Ｇで４℃で２０分間遠心分離によりペレット化した。上清を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ カラム（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、１６×７００ｍｍ、Ａｍｅｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分画した。培地を完全に上記ＨＩＣカラムに載せた後、タンパク質を、最初、トリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８．５）／２Ｍ 塩化ナトリウム、続いてトリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８．５）／０．８Ｍ 塩化ナトリウム、その後トリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８．５）／０．２Ｎ 塩化ナトリウムで段階的に溶出した。流速は１．０ｍｌ／分で、画分はＵＶ検出器で、２２０ｎｍでモニターした。各溶出画分を、ｈＧＨの存在についてドットブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによりアッセイした。ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０融合糖タンパク質の殆どを含むトリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８．５）／０．２Ｎ ＮａＣｌ画分を、４℃で、限外ろ過で濃縮し、ｈＧＨ結合アッセイおよびｈＧＨ活性アッセイ、またはさらに逆相クロマトグラフィーによる精製のいずれかに使用した。

図１８は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（Ａ）およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ（Ｂ）の、緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）で平衡化したＨａｍｉｌｔｏｎ ポリマー性逆相−１（ＰＲＰ−１）カラム上での逆相クロマトグラフィーによる単離を示す。タンパク質を、流速０．５ｍｌ／分で、緩衝液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸、８０％アセトニトリル、ｖ／ｖ）により、１５分間の０〜３０％Ｂ、続いて９０分間の３０％〜７０％Ｂの２段階の直線勾配を使用して溶出した。吸光度を、２２０ｎｍで測定した。融合タンパク質ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰを、ＰＲＰ−１に注入する前に、まず、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。

図１７は、抗ｈＧＨ抗体を使用する、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（左側パネル）およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ（右側パネル）のウェスタンブロット検出を示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して培養培地を分画した後に、ゲルを流した。サンプル（１０μｇタンパク質）を、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、その後ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ膜に移した。ＴＴＢＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で１：５００希釈したウサギポリクローナル抗ｈＧＨ抗体、およびＴＴＢＳ緩衝液中で１：１０００希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを、それぞれ一次抗体および二次抗体として使用した。レーン１：分子量マーカー；レーン２、３、４：ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（Ａ）またはｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ（Ｂ）培養培地；レーン５：ｈＧＨ標準（２μｇ）。

５０−７５ｋＤａ（Ａ）または７５〜１００ｋＤａにおける曖昧なバンドは、アラビノガラクタン−タンパク質に関して代表的なものであり、これはｈＧＨ−（ＳＯ）_１０およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰを含む。十分なＯ−Ｈｙｐアラビノガラクタンを、分子量を約５０ｋＤａにするために付加した。炭水化物は、微小不均一性の部位を作るのみならず、ＳＤＳ結合も妨害し、このことによって、上記ゲルで観察される曖昧さが生じる。（Ａ）における＞１５０ｋＤａのバンドは、夾雑物であり得る。（Ａ）における約２２ｋＤａのバンドは、おそらくｈＧＨが、単離プロセスの間か、またはｐＨ８のローディング緩衝液における熱処理のときのいずれかにおいてｈＧＨ−（ＳＯ）_１０融合タンパク質から放出されたｈＧＨである。本発明者らは、ＳＯＳＯリッチ構築物（Ｏ＝Ｈｙｐ）が、塩基（ｐＨ８）中で加熱される場合、おそらくＮ−＞Ｏアシルシフト（これはＳｅｒ残基の周辺の問題である）により、いくらか不安定であることを観察した。ＳＤＳ ＰＡＧＥの前に構築物を加熱するよりはむしろ、タンパク質をローディング緩衝液（加熱しない）中で、数時間室温でインキュベートしたほうがよく、このことにより、問題が解決されるようである。（Ｂ）中の約２５ｋＤａのバンドは、ＥＧＦＰか、いくつかのＳＯおよびグリカンが連結したｈＧＨか、またはある夾雑物であり得る。

ＥＧＦＰ要素の存在は、上記発現されたタンパク質のグリコシル化プロフィールを有意に変化させなかった。下の表４に示すように、ガラクトースおよびアラビノースは、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０またはｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ中で主要な単糖を構成し、ラムノースおよびウロン酸の量は少ない。糖は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の乾燥重量の５５．５％を占め、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の乾燥重量の４６．５％を占める。

表５は、ＩＮＦ−（ＳＯ）_１０のグリコシル化プルフィールを示し、これは、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０のグリコシル化プルフィールと類似であった。

Ｈｙｐ連続仮説により予測されるように（Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１；Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｂａｒｂａｒ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．＆ Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、１１２７２〜１１２７８（２００１））、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０−ＥＧＦＰ融合糖タンパク質の両方が、Ｈｙｐ−多糖のみを含有した（表６）。同じ効果が、ＩＮＦ−（ＳＯ）_１０においても観察された（表７）。

表８は、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０のグルコシル結合分析を示す。

（一般的なクローニングの説明）
遺伝子カセットを、上記タンパク質のＮ末端か、またはＣ末端のいずれかのグリコシル化部位をコードするよう構築し、そしてｐＵＣ１８−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰ（タバコエクステンシンシグナル配列［ＳＳ^ｔｏｂ］およびＥＧＦＰをコードするｐＵＣ１８ベクター）にサブクローニングした。上記遺伝子を配列分析し、その後ｐＢ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にβ−グルクロニダーゼ遺伝子の代わりにカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの後ろにＢａｍＨＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてサブクローニングした。

（植物形質転換）
上記遺伝子カセットを含むｐＢＩ１２１由来プラスミドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ株ＬＢＡ４４０４に移した。タバコ細胞の形質転換は、以前に記載された方法に従った（Ａｎ，Ｇ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７９：５６８−５７０；Ｓｈｐａｋ、Ｅ．、Ｌｅｙｋａｍ、Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍ．Ｊ．（１９９９）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、９６：１４７３６〜１４７４１；Ｚｈａｏ ＺＤ、Ｔａｎ Ｌ、Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ ＡＭ、Ｌａｍｐｏｒｔ ＤＴ、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、ＭＪ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２００２ Ａｕｇ；３１（４）：４３１〜４４）。上記トマト細胞を、リーフディスク法（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、１９８６、Ｌｅａｆ ｄｉｓｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｔｏｍａｔｏ（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅｍ、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、Ｓ．；Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ、Ｊ．；Ｆｒｙ、Ｊ．；Ｂａｒｎａｓｏｎ、Ａ．；Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ．；Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１〜８４）を使用して形質転換した。シロイヌナズナ細胞を、Ｆｏｒｒｅｉｔｅｒらの方法（Ｆｏｒｒｅｉｔｅｒ Ｃ、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ Ｍ、Ｎｏｖｅｒ Ｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１９９７ Ｄｅｃ；９（１２）：２１７１〜８１）を用いて形質転換した。

（細胞培養）
全ての形質転換細胞を、３４ｇ／Ｌ スクロース、０．４ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）および２００ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９７２）中で培養した。フラスコ（２５０ｍｌまたは１０００ｍｌ）を室温で、９０ｒｐｍで回転する回転振盪器に入れた。培地を、標的タンパク質の単離のために１０〜２０日培養後に収集した。

（糖タンパク質単離）
糖タンパク質を、以前に示されるように（以下の差異に注意すること：２Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を用いて、ＨＩＣカラムを平衡化した；そのカラムをちょうど２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を含む第２の緩衝液の段階的勾配を用いて溶出した。このｈＧＨ誘導体は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．２Ｍでの勾配において溶出した）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および逆相クロマトグラフィーを用いて培地から単離した（Ｓｈｐａｋ，Ｅ．，Ｂａｒｂａｒ，Ｅ．，Ｌｅｙｋａｍ，Ｊ．Ｆ．およびＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｊ． Ｊ．Ｂiｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１１２７２−１１２７８（２００１）；Ｚｈａｏ ＺＤ，Ｔａｎ Ｌ，Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ ＡＭ，Ｌａｍｐｏｒｔ ＤＴ，Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ ＭＪ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２００２ Ａｕｇ；３１（４）：４３１−４４；Ｌｉ ＬＣ，Ｂｅｄｉｎｇｅｒ ＰＡ，Ｖｏｌｋ Ｃ，Ｊｏｎｅｓ ＡＤ，Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ＤＪ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３ Ａｕｇ；１３２（４）：２０７３−８５）。

（実施例３：さらなるヒト成長ホルモン構築物の例）
上記の実施例２に記載のｈＧＨ構築物に加えて、以下の構築物もまた、合成し、タバコ細胞に形質転換した。

（１．ｈＧＨ−（ＳＯ）_１）
ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１遺伝子フラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとしておよび以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した：

次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰにサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１と指定されたプラスミド（図１９）を生成した。

（２．ｈＧＨ−（ＳＯ）_２）
ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_２遺伝子フラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰにサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_２と指定されたプラスミド（図２０）を生成した。

（３．ｈＧＨ−（ＳＯ）_５）
ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_５遺伝子フラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰにサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_５と指定されたプラスミド（図２１）を生成した。

（４．ｈＧＨ−（ＳＯ）_２０）
ＮｃｏＩ制限部位を、まず、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０遺伝子フラグメントのすぐ後ろに、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで導入した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントであるＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０ ^ＮｃｏＩを、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ^ＮｃｏＩ−（ＳＰ）_１０ ^＊にサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ^ＮｃｏＩを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_２０と指定されるプラスミドを生成した（図２２）。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した（＊：ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ^ＮｃｏＩ−（ＳＰ）_１０は、ＮｃｏＩ制限部位を除去するために部位指向性変異に供されない、予備ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０プラスミドである）。

（５．（ＳＯ）_１０−ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０）
（ＳＰ）_１０フラグメントを、まず、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

次いで、得られたフラグメントである^ＸｍａＩ（ＳＰ）_１０ ^ＸｍａＩを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−^ＸｍａＩｈＧＨ−（ＳＰ）_１０ ^＊＊にＸｍａＩ部位でサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂとｈＧＨ−^ＸｍａＩ（ＳＰ）_１０との間に挿入して、ｐＵＣ＿ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０と指定されるプラスミド（図２３）を生成した。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した（^＊＊ ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−^ＸｍａＩｈＧＨ−（ＳＰ）_１０は、ＸｍａＩ制限部位を除去するために部位指向性変異に供されない、予備ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０プラスミドである）。

（６．ｈＧＨＡ−（ＳＯ）_１０（ｈＧＨＡ：ヒト成長ホルモンアンタゴニスト））
ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨＡ−（ＳＰ）_１０（図２４）を、以下のプライマーセットを用いて、プラスミドｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の（Ｇｌｙ^１２０をコードするものからＬｙｓ^１２０をコードするものへの）部位指向性変異誘発によって生成した。

（実施例４：インターフェロン構築物のさらなる例）
上記の実施例２に記載されるインターフェロンα２構築物（ＩＮＦ−（ＳＯ）_１０）に加えて、以下のさらなる構築物を作製した。

（１．ＩＮＦ−（ＳＯ）_５）
ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５遺伝子フラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＢｓｒＧＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰにサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５と指定されたプラスミドを生成した（図２５）。この形質転換を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ細胞において行った。

（２．（ＳＯ）_５−ＩＮＦ−（ＳＯ）_５）
ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５遺伝子フラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５にサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５−ＩＮＦ−（ＳＰ）_５と指定されたプラスミドを生成した（図２６）。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した。この形質転換を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ細胞において行った。

（３．（ＳＯ）_５−ＩＮＦ）
ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５遺伝子フラグメントを、上記のようにＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦにサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_５−ＩＮＦと指定されたプラスミドを生成した（図２７）。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した。この形質転換を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ細胞において行った。

（４．ＩＮＦ−（ＳＯ）_２０）
ＮｃｏＩ制限部位を、ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０遺伝子フラグメントの直ぐ後ろに、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０をテンプレートとして、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで導入した。

次いで、得られたＰＣＲフラグメントであるＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０ ^ＮｃｏＩを、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ^ＮｃｏＩ−（ＳＰ）_１０にサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ^ＮｃｏＩを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_２０と指定されるプラスミドを生成した（図２８）。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した。この形質転換を、タバコ細胞において行った。

（５．（ＳＯ）_１０−ＩＮＦ−（ＳＯ）_１０）
ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０フラグメントを、ｐＵＣ＿ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０ ^ＸｍａＩ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０ ^＊＊＊をＢａｍＨＩ／Ｘｍａｌで消化することによって生成した。次いで、このフラグメントを、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０にサブクローニングし、ＳＳ^ｔｏｂを置換して、ｐＵＣ＿ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ＩＮＦ−（ＳＰ）_１０と指定されるプラスミドを生成した（図２９）。次いで、クローニング目的でこのプラスミドに導入された余分のヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した（^＊＊＊：ｐＵＣ＿ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０ ^ＸｍａＩ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０は、ＸｍａＩ制限部位を除去するために部位指向性変異に供されない、予備ｐＵＣ＿ＳＳ^ｔｏｂ−（ＳＰ）_１０−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０プラスミドである）。この形質転換を、タバコ細胞において行った。

（実施例５：ＥＧＦＰ融合タンパク質の推定実施例）
本発明に従って作製され得る他のＥＧＦＰ融合タンパク質としては、（Ａｌａ−Ｈｙｐ）_１１−ＥＧＦＰ、（Ｔｈｒ−Ｈｙｐ）_１１−ＥＧＦＰ、（Ｔｈｒ−Ｈｙｐ）_１０１−ＥＧＦＰ、および（Ｖａｌ−Ｈｙｐ）_１１−ＥＧＦＰが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、具体的に企図される実施例のうちのごくわずかに過ぎない。本発明は、実際には、これらの実施例に限定されない；本質的に、いかなる組み合わせもＸ−Ｈｙｐ反復数も、なされ得る（ここでＸは、アミノ酸であり、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである）。

（実施例６：グリコシル化によるペプチドの生物学的特徴の改善）
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、下垂体により分泌され、血液によって標的組織（例えば、肝臓、筋肉、骨、および脂肪組織中の脂肪）に輸送されるポリペプチドホルモンである。ヒトＧＨは、その標的組織において代謝変化を誘導し、最終的には、身体の成長を生じるプロセスを刺激する。ｈＧＨの過少分泌は、小人症を生じ、過剰分泌は、巨人症および末端肥大症を生じる。さらに、ｈＧＨは、脂肪細胞および筋細胞の代謝、ならびに加齢のようなプロセスに影響を及ぼす；従って、血中および組織中のｈＧＨレベルを操作することに強い関心がある。

これらの重要な有用性にも拘わらず、ネイティブＧＨおよび組換えＧＨは、一般に、ポリペプチド薬物として不適切である。なぜなら、その大きさが小さいため、迅速な腎クリアランスおよび非常に短い循環半減期（約３０分）しか生じないからである。従って、小人症のための処置を受けている患者は、あまりにも頻繁なｈＧＨの注射が必要である。

このポリペプチドにおいてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をリジン残基に結合させる（ＰＥＧ化とよばれるプロセス）と、ｈＧＨの薬理学的特性が劇的に改善する。ＰＥＧ化により、その分子量が増大し、それにより、腎臓による濾過が妨げられ、身体からのｈＧＨのクリアランスが遅くされることによって、ｈＧＨがより臨床上有効になる；ＰＥＧ化はまた、このポリペプチドをタンパク質分解から保護し、免疫原性を低下させる。

しかし、ＰＥＧ化には、いくつかの欠点がある。リジン残基の比較的非特異的な標的化は、１５００倍程度もレセプター結合親和性を劇的に低下させる。さらに、ＰＥＧ化のプロセスは、誘導体化ポリペプチドの精製（これは、薬物のコストを非常に増大させる）を要するので、時間がかかり、かつ不便である。

この実施例は、本発明者らが、ｈＧＨの有効分子量およびその対応する循環安定性を、植物細胞においてｈＧＨを糖タンパク質として発現することによって増大させた研究を記載する。

（材料および方法）
（植物形質転換プラスミドｐＢＩ ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の構築）
ｐＢＩ１２１は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているプラスミドである。その誘導体を、この研究のために作製した。

ヒト成長ホルモンｃＤＮＡを、ｈＧＨ遺伝子で安定にトランスフェクトしたマウスＬ細胞から抽出した総ＲＮＡから、以下のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにより生成した（Ｃｈｅｎら，１９９４）。

得られたＰＣＲフラグメントは、ｈＧＨのオープンリーディングフレームを含んでいたが、そのシグナルペプチドを欠いていた。このフラグメントを、ＳＳ^ｔｏｂ（これは、タバコ由来のエクステンシンシグナル配列（ＳＳ）をコードする）と、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子との間に、ＸｍａＩ／ＮｃｏＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ＥＧＦＰにクローニングして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−ＥＧＦＰと指定されたプラスミドを生成した。ジペプチドの１０個の反復をコードする合成遺伝子であるＳｅｒ−Ｐｒｏ（ＳＰ）_１０を、２つの相互にプライムするオリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）のプライマー伸長によって構築した（図１０Ｂ）。

この（ＳＰ）_１０遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＢｓｒＧＩフラグメントとして、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−ＥＧＦＰにサブクローニングし、ＥＧＦＰを置換して、ｐＵＣ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０を生成した。次いで、クローニング目的でＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０遺伝子カセットに導入された余分なヌクレオチドを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＣＡ）を用いる部位指向性変異誘発により除去した。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｈｉｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の配列決定を行った。

次いで、ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０構築物全体（図１０Ａ）を、β−グルクロニダーゼレポーター遺伝子に代わりに、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩフラグメントとして、植物形質転換ベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）にクローニングして、プラスミドｐＢＩ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０を得た。ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の発現は、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下にある。

（植物細胞形質転換および選択）
プラスミドｐＢＩ−ＳＳ^ｔｏｂ−ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０を、凍結融解法（Ｈｏｌｓｔｅｒｓら，１９７８）によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に導入し、次いで、懸濁培養したタバコ細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、ＢＹ２）を、以前に記載されたように（Ａｎ，Ｇ．（１９８５） Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７９：５６８−５７０）、そのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換し、０．４ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２００ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および４００ｍｇ／Ｌ ＴＩＭＥＮＴＩＮ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，ＰＡ）を含む、固体Ｓｃｈｅｎｋ ＆ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（ＳＨ）培地（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，（１９７２） Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ａｎｄ ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｃａｎ Ｊ Ｂｏｔ，５０：１９９−２０４）上で選択した。

導入遺伝子生成物を生成するために、細胞を、ＴＩＭＥＮＴＩＮを除いた以外は上記と同じ成分から構成される液体ＳＨ培地中で増殖させた。９０ｒｐｍで回転しているイノーバジャイロ回転振盪機（ｉｎｎｏｖａ ｇｙｒｏｔａｒｙ ｓｈａｋｅｒ）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）上で室温で培養して８〜１０日後に、各細胞株の培養培地を、ｈＧＨ発現について、ドットブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイ（以下を参照のこと）でスクリーニングした。３つの高収量細胞株を、上記の条件下での継代培養のために選択した。

（ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０融合糖タンパク質の単離）
形質転換細胞からの培地を、粗い焼結漏斗での濾過により培養して８〜１０日後に採取し、最終濃度が２Ｍになるように塩化ナトリウムを補充した。不溶性物質を、２５，０００×Ｇで２０分間、４℃で遠心分離することによりペレット状にした。その上清を、２Ｍ
塩化ナトリウムで平衡化したフェニル−セファロース６カラム（フェニル−セファロース６ファーストフロー、１６×７００ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分画した。ＨＩＣカラム上に培地を完全に載せた後、そのタンパク質を、まず、Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ８．５）／２Ｍ 塩化ナトリウム、次に、Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ８．５）／０．８Ｍ 塩化ナトリウム、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ８．５）／０．２Ｎ 塩化ナトリウムで段階的に溶出した。流速は、１．０ｍｌ／分であり、その画分を、ＵＶ検出器を用いて２２０ｎｍでモニターした。各溶出画分を、ドットブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによって、ｈＧＨの存在についてアッセイした。ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０融合糖タンパク質の大部分を含むＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ８．５）／０．２Ｎ ＮａＣｌ画分を、４℃での限外濾過により濃縮し、ｈＧＨ結合アッセイおよび活性アッセイのためか、逆相クロマトグラフィーによるさらなる精製のためかのいずれかに用いた。

各溶出画分を、ドットブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによって、ｈＧＨの存在についてアッセイした。ＨＩＣカラムからの画分（これは、融合糖タンパク質（ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０と名付けた）を含んでいた）を、４℃での限外濾過により濃縮し、ｈＧＨ結合アッセイおよび活性アッセイのためか、ＨＩＣのｈＧＨ−（ＳＯ）_１０リッチ画分の緩衝液Ａ（０．１％ トリフルオロ酢酸）で平衡化したＨａｍｉｌｔｏｎポリマー逆相−１（ＰＲＰ−１）分析カラム（４．１×１５０ｍｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．，Ｒｅｎｏ， ＮＶ）での逆相クロマトグラフィーによるさらなる精製のためかのいずれかに用いた。緩衝液Ｂ（０．１％ トリフルオロ酢酸、８０％ アセトニトリル、ｖ／ｖ）を用いて、流速０．５ｍｌ／分で、１５分間で０〜３０％ Ｂ、続いて９０分間で３０％〜７０％ Ｂの２段階の直線勾配を用いて、タンパク質を溶出した。吸光度を、２２０ｎｍで測定した。

（ウェスタンブロット分析）
ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０のサンプル（１０μｇ）を、等容積の２×還元サンプル緩衝液と混合し、４〜１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ，ＣＡ）上で電気泳動し、次いで、ＢｉｏＲａｄ ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔセルを用いてＮｉｔｒｏＢｉｎｄ膜（ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）に転写した。ＴＴＢＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１：５００希釈したウサギポリクローナル抗ｈＧＨ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）、およびＴＴＢＳ緩衝液で１：１０００希釈したアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ、一次抗体および二次抗体として使用した。

（ＥＬＩＳＡによるｈＧＨの定量）
培地中またはカラム溶出液中のｈＧＨ等価物の濃度を、サンドイッチｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者の説明書に従って決定した。

（グリコシル組成物およびヒドロキシプロリングリコシドプロフィール）
中性糖を、１．２℃／分で１３０℃〜１７７℃にプログラムされた、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ−５カラム（５％ ＰＨ ＭＥ シロキサン架橋、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ）を用いるガスクロマトグラフィーによって酢酸アルジトール誘導体として分析した。データを、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアによって捕獲した。１００μｇのｈＧＨ−（ＳＯ）_１０を、内部標準物質として５０ｎｍｏｌのミオイノシトールを用いる各分析について使用した。標準物質としてＤ−グルクロン酸を用いて、ｍ−ヒドロキシジフェニルとの反応に基づいて、ウロン酸を比色法によりアッセイした。

（アミノ酸配列決定および組成アッセイ）
ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０のＮ末端アミノ酸配列を、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、４７７−Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｇａｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した。ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０アミノ酸組成を、塩酸加水分解および引き続くフェニルイソチオシアネート誘導体化（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｔ、Ｃａｒｌｑｕｉｓｔ，Ｍ、Ｊｏｒｎｖａｌｌ，Ｈ．（１９８６） Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｗｉｔｔｍａｎｎ−ｌｉｅｂｏｌｄ Ｂ編者、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．ｐ４５−５５）の後に、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ）で逆相ＨＰＬＣにより決定した。サンプルのＨｙｐ含有量を、以前に記載されたように（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．およびＬｉｅｓｍａａ，Ｍ．（１９５９） Ａ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ，１１：１２８−１３１）、比色的にアッセイした。

上記の多い方の配列は、インタクトなｈＧＨ−（ＳＰ）_１０のＮ末端であり、少ない方の配列は、ｈＧＨ−ＳＰ_１０のｈＧＨドメイン中の１つの不安定な部位（Ｎ１５０−Ｓ１５１）でのタンパク質分解性切断後に生じる。ＢＹ−２系において目的タンパク質として発現されたｈＧＨの分析により、Ｈｙｐが含まれないことが示された。このことは、本発明者らの融合糖タンパク質におけるｈＧＨが、ＳＯモジュールにおいてのみＨｙｐを含むことを示唆した。このアミノ酸組成は、２１１アミノ酸配列の中に９．５のＨｙｐ残基が存在することを示す。

（ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０のラジオレセプター結合アッセイ）
ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）で単離されたｈＧＨ−（ＳＰ）_１０の結合アッセイを、単層細胞表面結合アッセイを用いて行った。

簡潔には、成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）発現ＮＩＨ ３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１２ウェル細胞培養プレート中でコンフルエントになるまで増殖させた。何も混ぜていないＤＭＥＭを用いて、その細胞に一晩血清を与えなかった。その細胞を、結合アッセイの前に、室温で１ｍｌのＰＢＳ（０．１％ ＢＳＡを含む）で２回すすいだ。細胞を、一定量の［^１２５Ｉ］−ｈＧＨ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、０．１％ ＢＳＡを含む１ｍＬの反応容積中の種々の量のＧＨ調製物とともに、室温で２時間、軌道振盪機上でインキュベートした。１ｍＬの氷冷ＰＢＳ（０．１％ ＢＳＡを含む）で細胞を３回すすぐことによって、結合反応を終了させた。０．１Ｎ ＮａＯＨに細胞を溶解し、０．１Ｎ
ＨＣｌで中和し、細胞表面結合放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。

この結合アッセイを、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０−ＥＧＦＰ構築物を用いて繰り返した。図３０に示される結果は、緑色蛍光タンパク質を結合させても、改変ｈＧＨは、比較的高い親和性（約１０ｎＭのＥＣ_５０）でレセプターに結合することを示す。この結果はまた、そのグリコシル化モチーフが、内部に位置し得；必ずしも、そのグリコシル化モチーフがいずれかの末端に存在する必要はないことを示す。

市販のｈＧＨについての結果、およびｈＧＨ−（ＳＰ）_１０についての結果は、図３１および３２に示す。ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０に対するＥＣ_５０は、１ｎＭであり、そのレセプターの市販のｈＧＨ結合と一致していた（図３１）。

（ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０のインビボ効果）
改変成長ホルモンの薬理学的効果およびクリアランス速度を決定するために、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０と市販のｈＧＨ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ． ３４ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｓｑｕａｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ ０１７４２−３０４９ ＵＳＡ）を、マウスで試験した。

これらの試験のために、５〜６ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＰＢＳ中に調製したＧＨサンプルを腹腔内注射した。血漿を、成長ホルモンおよびインスリン様成長因子Ｉ（「ＩＧＦ−１」；成長ホルモンに応答して、身体が放出する）のレベルについてアッセイした（成長ホルモンＥＬＩＳＡキットおよびＩＧＦ−１キットを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入した）。

試験１：２μｇ ＧＨ／ｇ体重の１回の注射。血漿を、注射して１日後と４日後にサンプリングした。その結果を図３３（成長ホルモン濃度）および図３４（ＩＧＦ−１濃度）に示す。明らかに、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０は、１日目の測定で遙かに高い濃度を示し、半減期が劇的に増大し、曲線下面積が増大した。このＩＧＦ−１レベルは、ＧＨの生物学的レベルが、増強しかつ延びたことを示す。

ｈＧＨ半減期の別の試験において、マウス（２匹）の各群に、３０μｇのｈＧＨ等価物の単一用量を与えた。血清サンプル（３０μｌ）を、４８時間にわたって間隔を空けて採取し、ＥＬＩＳＡによってｈＧＨ濃度について分析した。図３５に示される結果は、グリコシル化による血漿半減期の有意な延長を示す。

試験２：２μｇ ＧＨ／ｇ体重／日。成長ホルモン（改変およびコントロール）を、１２時間間隔を空けて、５日間、１日に２回注射として投与した。血漿を、１回目に注射して１日後、４日後、６日後、８日後、１１日後および１８日後にサンプリングした。その結果を、図３６および図３７に示す。図３６は、成長ホルモンの血清濃度を示し；図３７は、ＩＧＦ−１の血清濃度を示す。

繰り返すと、どの程度でも、ＧＨレベル（図３６）が、市販の成長ホルモン調製物を用いて一日でほんのわずかであるのに対して、グリコシル化形態は、１日目で遙かに高い濃度を有することに注意のこと。市販の成長ホルモンについての生物学的効果（図３７に示される）は、最後に投与してから５日後（５日目）までに本質的に止むのに対して、グリコシル化形態は、最後の投与から２週間後を過ぎても、測定可能なＩＧＦ−１レベルを生成し続けた。これらの結果は、これが、これまで開発した中で最も長時間作用する成長ホルモンであり得ることを示唆する。

試験３：１μｇ ＧＨ／ｇ体重／日。このＧＨを、１日に１回注射して、５日間投与し、血漿を、最初に注射してから１日後、４日後、７日後、９日後、および１１日後にサンプリングした。この結果を、図３８および図３９に示す。この低用量であっても、市販の成長ホルモンと本発明のグリコシル化形態との間には有意差が認められる。

試験４：身体全体の成長に対するｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の効果
７週齢〜８週齢のマウスを、３つの処置群（すなわち、コントロール（ｎ＝３）、ｈＧＨ（ｎ＝３）、およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０（ｎ＝４））に無作為に分けた。２匹または３匹ずつの個体グループにして、マウスをケージに収容した。ｈＧＨ（Ｆｉｔｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｃｏｎｃｏｒｄ ＭＡ）およびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０を、ＰＢＳ中、１００μｇ／ｍＬで調製した。１μｇ／ｇ体重の総容量を、１日２回、６日間、午前９時頃と午後９時頃に、マウスに腹腔内注した。１日中断した後、投与量を、２μｇ／ｇ体重に増やして、さらに７日間投与した。

図４０は、試験中のマウスの体重増加を示す。簡潔には、コントロールマウスは、２週間の期間に平均０．８３ｇ、体重が増加した。ｈＧＨを受容したマウスは、平均２．１３ｇ、体重が増加し、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０を受容したマウスは、２週間の期間に平均２．１５ｇ、体重が増加した。コントロールマウスに対する体重増加は、ｈＧＨおよびｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の両方について有意であり（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）、ｈＧＨ処置とｈＧＨ−（ＳＯ）_１０処置との間に有意差はなかった。

（ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の免疫原性アッセイ）
ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０を、マウスに注射して、野生型成長ホルモンと比較して、その免疫原性を試験した。

（免疫レジメン）
２匹のメスＢａｌｂ／Ｃマウス（約６〜７週齢）から採血し、２週間間隔で４回免疫した。各マウスに、５０μｇのｈＧＨ−（ＳP）_１０を、２箇所の部位に分けて皮下に与えた（右側腹部及び左側腹部。０．０５ｍＬ／部位）。ＥＬＩＳＡで抗体活性をアッセイするまで、血清を−２０℃で凍結した。

（ＥＬＩＳＡプロトコル）
ＥＩＡプレート（ＮＵＮＣポリスチレン）を、炭酸−炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．０）中、４０μｇ／ｍＬ 免疫原（ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０）、５０μＬ／ウェルでコーティングし、一晩静置した。等数のウェルを、緩衝液のみ、（ＳＰ）_１０のみ（２０μｇ／ｍＬ）またはｈＧＨのみ（２０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。免疫原を外に出し、２００μＬのＰＢＳ−５％ ＢＳＡ（＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を１ウェルあたりに、室温で２時間添加して、非特異的結合をブロックした。

ＢＳＡを外に出し、各ウェルに５０μＬ（免疫原コーティングウェルおよび免疫原非コーティングウェルの両方で２連のウェル）のＰＢＳ−１％ ＢＳＡのみまたはＰＢＳ−ＢＳＡ中のマウス血清希釈液を添加した。免疫前血清および直近の血清サンプルを、各プレートで同じマウスで比較する。

室温で４時間または４℃で一晩で、インキュベーションを行う。そのウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。

各ウェルに、ＰＢＳ−ＢＳＡ中の１：５０００希釈のペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇ（全アイソタイプ）を５０μｌ、室温で１時間添加する。ウェルを４回洗浄する。

そのアッセイを、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６）中の５０μＬ／ウェルのＯＰＤ基質を添加することによって、発色させる。その反応を、バックグラウンドとサンプルとの間の良好な対比が見られたときに、５０μｌ／ウェルの１２．５％ 硫酸を添加することによって停止させる。このＥＬＩＳＡを、４９０ｎｍで読み取る。

（解説）
両方のマウスが、ｈＧＨの１回の注射の後に、ｈＧＨに対して強い抗体応答を示した。その抗体レベルは、反復注射によって上昇した。

両方のマウスが、２回目の注射および３回目の注射の後に、精製（ＳＰ）_１０に対してわずかに検出可能な抗体を有した。その低い応答は、ＥＬＩＳＡプレートへの精製（ＳＰ）_１０抗原の結合が低い結果（これは、見られる反応を減少させてしまう）として、検出が不十分であったことに起因し得る（以下を参照のこと）。

両方のマウスが、免疫前ですら、ｈＧＨ−ＳＰ１０結合体抗原に対して予測外に高い抗体レベルを有した。免疫前血清は、精製（ＳＰ）_１０ともｈＧＨ単独とも反応しなかったので、このことは、これらのマウスが、予め形成された抗（ＳＰ）_１０、すなわち、以前に遭遇したいくつかの他の抗原に対する交差反応性抗体を有したことにより説明され得る。ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０結合体は、ＥＬＩＳＡプレートに強く結合して、抗（ＳＰ）_１０のより良好な検出が可能になったので、ｈＧＨに結合体化される場合にのみ検出されることが考えられる。これは推測であるが、植物物質が、免疫なしでバックグラウンド応答を生じた他のマウスでの観察と一致する。

そのＯＤ値は、ｈＧＨ−（ＳＰ）_１０コーティングプレートに対する値よりも、ｈＧＨコーティングプレート対する値の方が高かった。このことは、２つのプレート上の認識される決定基の異なる認識または単に異なるレベルを示し得る。

競合実験もまた、ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０コーティングプレート、抗ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０抗体（１：１０，０００血清希釈液）、および抗体結合の競合インヒビターとしての１００μｇ／ｍｌ （ＳＯ）_１０を用いて行った。その反応の５％ 阻害が観察された。

まとめると、このｈＧＨ融合糖タンパク質（ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０と名付けられる）は、Ｃ末端に、ラムノグルクロノアラビノガラクタン多糖を各Ｈｙｐ残基に付加し、ｈＧＨの分子量を２２ｋＤａから約５０ｋＤａに増大させ、循環半減期を数分から、数時間、さらに数日にまで増大させる、グリコシル化部位Ｓｅｒ−Ｈｙｐ（ＳＯ）の１０個の直列反復を含んでいた。ｈＧＨ−（ＳＯ）_１０ についてのＥＣ_５０は、そのレセプターの野生型ＧＨ結合と一致して、１ｎＭであった；さらにｈＧＨ−（ＳＯ）_１０は、培養細胞においてＪＡＫ ５のリン酸化を刺激し、最終的に、野生型ｈＧＨと同じ生理学的応答を引き起こした。マウスに皮下注射したｈＧＨ−（ＳＯ）_１０の抗原性の予備的な評価により、野生型成長ホルモンより免疫原性が高くないことが示される。

本発明の他の実施形態は、明細書および本明細書に開示される発明の実施を考慮すれば、当業者に明らかである。明細書および実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって示されると解釈される。

Claims (57)

1. 植物において少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質を発現する核酸構築物であって、以下：ａ）グリコシル化部位をコードする少なくとも１つの核酸配列およびｂ）生物学的に活性なタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、核酸構築物。
2. 植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合糖タンパク質であって、以下：ａ）少なくとも１つの糖構成単位およびｂ）生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を含み、該ａ）少なくとも１つの糖構成単位は、該ｂ）生物学的に活性な哺乳動物タンパク質と共有結合する、哺乳動物融合糖タンパク質。
3. 請求項２に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで少なくとも１つの糖構成単位がｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎまたはＸ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは２〜約１０００であり、ｉｉ）Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、２〜約１０００であり、ｉｉｉ）（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、１〜約１０００であり、およびｉｖ）（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、１〜約１０００であるから選択される；
   ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、哺乳動物融合糖タンパク質。
4. 請求項３に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで前記糖構成成分Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎおよび（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎに関するＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
5. 請求項４に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここでＸは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
6. 請求項３に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで少なくとも１つの糖構成単位が該タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端から選択される位置で共有結合する、哺乳動物融合タンパク質。
7. 請求項３に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、少なくとも１つの糖構成単位が生物学的に活性な哺乳動物タンパク質の内部内に存在する、哺乳動物融合タンパク質。
8. 請求項２に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、該生物学的に活性な哺乳動物タンパク質が成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニスト、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、グレリン、レプチン、プロラクチン、誘引活性タンパク質−１、インターロイキン１０、プレイオトロフィン、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターフェロンω、インターフェロンα２、インターフェロンγ、インターロイキン−１、線維芽細胞成長因子６、ＩＦＧ−１、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン、エリスロポイエチン、ＧＭＣＳＦおよび任意のヒト化モノクローナル抗体から選択され、
   ここで、前記糖構成単位は、ｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、またはＨｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎが２〜約１０００であり、および；ｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎまたは（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎが１〜約１０００である、を含み；ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、哺乳動物融合タンパク質。
9. 請求項８に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで前記糖構成成分Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎおよび（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎに関するＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
10. 請求項９に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここでＸは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
11. 請求項８に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、該生物学的に活性な哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質である、哺乳動物融合タンパク質。
12. 請求項８に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで前記糖構成単位が（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎまたは（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎを含み、ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
13. 請求項１２に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここでＸは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される、哺乳動物融合タンパク質。
14. 請求項１３に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで該タンパク質がヒト成長ホルモンであり、そして前記糖構成単位が（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０を含む、哺乳動物融合タンパク質。
15. 請求項２に記載の植物由来の生物学的に活性な哺乳動物融合タンパク質であって、ここで該融合糖タンパク質が少なくとも１個の炭水化物分子と共有結合する、哺乳動物融合タンパク質。
16. タンパク質分子の水溶解度を増加させる方法であって、以下：
    ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位およびｂ）少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列を調製する工程；および
    核酸構築物を融合糖タンパク質として発現する工程を包含し、
    ここで、糖タンパク質の炭水化物成分が該糖タンパク質の分子量の約１０％以上を占める、方法。
17. 請求項１６に記載のタンパク質分子の水溶解度を増加させる方法であって、ここで前記糖タンパク質の炭水化物成分が該糖タンパク質の分子量の約５０％以上を占める、方法。
18. 請求項１７に記載のタンパク質分子の水溶解度を増加させる方法であって、ここで前記糖タンパク質の炭水化物成分が該糖タンパク質の分子量の約７５％以上を占める、方法。
19. 請求項１８に記載のタンパク質分子の水溶解度を増加させる方法であって、ここで前記糖タンパク質の炭水化物成分が該糖タンパク質の分子量の約９０％以上を占める、方法。
20. 生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、以下：
    ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位およびｂ）少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質を、糖タンパク質としてコードする少なくとも１つの核酸配列を植物において発現する工程を包含し、
    ここで該糖タンパク質の分子量が約１０ｋＤ以上であり、そして該糖タンパク質の炭水化物成分が糖タンパク質分子量の約１０％以上を占める、方法。
21. 請求項２０に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質がインスリン、インスリン様成長因子、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、グレリン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、成長ホルモンおよび成長ホルモンアンタゴニストから選択される、方法。
22. 請求項２０に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで前記糖タンパク質の分子量が約３５ｋＤ以上である、方法。
23. 請求項２２に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで前記糖タンパク質の分子量が約４０ｋＤ以上である、方法。
24. 請求項２３に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで前記糖タンパク質の分子量が約４５ｋＤ以上である、方法。
25. 請求項２０に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、該糖タンパク質の薬物速度論的半減期が対応する野生型タンパク質の薬物速度論的半減期より大きい、方法。
26. 請求項２０に記載の生物学的に活性な融合タンパク質分子を産生する方法であって、ここで少なくとも１つのグリコシル化部位がｉ）Ｘ−Ｐｒｏ_ｎまたはＰｒｏ_ｎ−Ｘ、ここでｎは６〜約１００であり、およびｉｉ）（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎまたは（Ｐｒｏ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは６〜約１００である；から選択され；ここでＸは、任意のアミノ酸である、方法。
27. 請求項２６に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、方法。
28. 請求項２７に記載の生物学的に活性な融合タンパク質分子を産生する方法であって、ここでＸは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される、方法。
29. 請求項２０に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、該生物学的に活性なタンパク質が成長ホルモンであり、そして前記糖タンパク質が（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０を含む、方法。
30. 請求項２９に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）_１０が前記成長ホルモンのＣ−末端に共有結合する、方法。
31. 請求項２９または請求項３０のいずれか１項に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここで前記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、方法。
32. グリコシル化ヒト成長ホルモンを含む注入可能な薬学的処方物であって、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、グリシン、ロイシン、トリロイシン、ヒスチジンおよびリン脂質から選択される少なくとも１つの賦形剤を除く、処方物。
33. 請求項３２に記載の注入可能な薬学的処方物であって、ここで前記グリコシル化ヒト成長ホルモンが、ｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、またはＨｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎが６〜約１００であり、および；ｉｉ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎまたは（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎが６〜約１００である、を含み；
    ここで、Ｘは、糖構成単位Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎにおける任意のアミノ酸であり、そして、該糖構成成分Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎおよび（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎに関するＸはＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、処方物。
34. 請求項３３に記載の注入可能な薬学的処方物であって、ここで前記グリコシル化成長ホルモンが（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎまたは（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎを含み、ここでｎが６〜約２０であり；ＸがＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、処方物。
35. 請求項３４に記載の注入可能な薬学的処方物であって、ここでＸは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＶａｌから選択される、処方物。
36. 約１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を示すグリコシル化ヒト成長ホルモンの凍結乾燥粉末処方物であって、ここで該処方物は、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、グリシン、ロイシン、トリロイシン、ヒスチジンおよびリン脂質から選択される少なくとも１つの賦形剤を除く、処方物。
37. 請求項３６に記載の凍結乾粉末処方物であって、ここで該処方物は、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、グリシン、ロイシン、トリロイシンおよびリン脂質を除く、処方物。
38. タンパク質の植物産生において収率を増加させる方法であって、以下：
    ａ）少なくとも１つのシグナルペプチド核酸をコードする配列、ｂ）少なくとも１つのグリコシル化部位核酸をコードする配列、およびｃ）少なくとも１つのタンパク質核酸をコードする配列を含む核酸該構築物を調製する工程；ならびに
    糖タンパク質として核酸構築物を発現する工程を包含する、方法。
39. 請求項３８に記載の方法であって、ここで少なくとも１つのグリコシル化部位がｉ）Ｘ−Ｐｒｏ_ｎまたはＰｒｏ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、２〜約１０００であり、およびｉｉ）（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎまたは（Ｐｒｏ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、１〜約１０００である、から選択され；ここでＸは、任意のアミノ酸である、方法。
40. 請求項３９に記載の方法であって、ＸがＧｌｙ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、およびＶａｌから選択される、方法。
41. 請求項４０に記載の方法であって、ＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＶａｌから選択される、方法。
42. 請求項３８に記載の方法であって、前記核酸構築物が緑色蛍光タンパク質をコードする核酸配列を除く、方法。
43. 請求項４２に記載の方法に従って産生したタンパク質。
44. 少なくとも１つの糖構成単位を含むアミノ酸配列に共有結合したヒト成長ホルモン分子であって、ここで該糖構成単位がｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎまたはＸ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉ）Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉｉ）（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、およびｉｖ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００である、から選択され；ここでＸは、糖構成単位Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎにおいて任意のアミノ酸であり、そしてここで糖構成単位Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、および（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎに関するＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＶａｌから選択される、ヒト成長ホルモン分子。
45. 少なくとも１つの糖構成単位を含むアミノ酸配列に共有結合したヒト成長ホルモンアンタゴニスト分子であって、ここで該糖構成単位がｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎまたはＸ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉ）Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉｉ）（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、およびｉｖ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００である、から選択され；ここでＸは、糖構成単位Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎにおいて任意のアミノ酸であり、そしてここで糖構成単位Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、および（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎに関するＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＶａｌから選択される、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト分子。
46. 成長ホルモン欠乏症または成長ホルモン不全症を患う患者を処置する方法であって、治療有効量のグリコシル化ヒト成長ホルモンを投与する工程を包含する、方法。
47. 請求項４６に記載の患者を処置する方法であって、ここで前記成長ホルモンが請求項４４に記載のものである、方法。
48. ヒト成長ホルモン過剰症または成長ホルモン活性過剰症を患う患者を処置する方法であって、治療有効量のグリコシル化成長ホルモンアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
49. 請求項４８に記載の患者を処置する方法であって、ここで前記成長ホルモンアンタゴニストが請求項４５に記載のものである、方法。
50. Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を患う患者を処置する方法であって、治療有効量のグリコシル化インスリンを投与する工程を包含する、方法。
51. 請求項５０に記載の患者を処置する方法であって、ここで前記グリコシル化インスリンがｉ）Ｘ−Ｈｙｐ_ｎまたはＸ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉ）Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、４〜約１００であり、ｉｉｉ）（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００であり、およびｉｖ）（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎ、ここでｎは、４〜約１００である、から選択される糖構成単位を含み；ここでＸは、糖構成単位Ｘ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎにおいて任意のアミノ酸であり、そしてここで糖構成単位Ｘ−Ｈｙｐ_ｎ、Ｈｙｐ_ｎ−Ｘ、（Ｈｙｐ−Ｘ）_ｎ、および（Ｘ−Ｈｙｐ）_ｎに関するＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＶａｌから選択される、方法。
52. 哺乳動物においてアレルギー性免疫応答を予防する方法であって、植物由来の融合糖タンパク質を動物に少なくとも１回投与する工程を包含し、該糖タンパク質は、ａ）少なくとも１つの糖構成単位およびｂ）生物学的に活性なタンパク質を含み、該ａ）少なくとも１つの糖構成単位は、該ｂ）生物学的に活性なタンパク質に共有結合し、ここで該少なくとも１つの糖構成単位がＸ−Ｈｙｐ_ｎおよびＸ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ_ｎから選択され、ここでｎは２〜約１０００であり、そしてここでＸは任意のアミノ酸である、方法。
53. 請求項５２に記載のアレルギー性免疫応答を予防する方法であって、ここでＸは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、方法。
54. 生物学的に活性な融合タンパク質の半減期を増加させる方法であって、以下：
    ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位およびｂ）少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質を、糖タンパク質としてコードする少なくとも１つの核酸配列を植物において発現させる工程を包含し；
    ここで該糖タンパク質の分子量が約１０ｋＤ以上であり、そして該糖タンパク質の炭水化物成分が該糖タンパク質の分子量の約１０％以上を占める、方法。
55. 請求項５４に記載の生物学的に活性な融合タンパク質分子の半減期を増加させる方法であって、ここで少なくとも１つのグリコシル化部位がｉ）Ｘ−Ｐｒｏ_ｎまたはＰｒｏ_ｎ−Ｘ、ここでｎは、６〜約１００であり、およびｉｉ）（Ｘ−Ｐｒｏ）_ｎまたは（Ｐｒｏ−Ｘ）ｎ、ここで_ｎは、６〜約１００である、から選択され；ここでＸは、任意のアミノ酸である、方法。
56. 請求項５５に記載の生物学的に活性な融合タンパク質分子を産生する方法であって、ここでＸが、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択される、方法。
57. 請求項５６に記載の生物学的に活性な融合タンパク質を産生する方法であって、ここでＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＶａｌから選択される、方法。

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