JP2666069B2 - 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物 - Google Patents
組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、鳥類プロラクチンに関するものであり、特
に、組換え型ニワトリプロラクチン、組換え型ニワトリ
プロラクチン構造遺伝子、組換え型ニワトリプレプロラ
クチン、組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝
子、組換えプラスミド、組換え型ニワトリプロラクチン
及び組換え型ニワトリプレプロラクチンの製造法に関す
るものである。
に、組換え型ニワトリプロラクチン、組換え型ニワトリ
プロラクチン構造遺伝子、組換え型ニワトリプレプロラ
クチン、組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝
子、組換えプラスミド、組換え型ニワトリプロラクチン
及び組換え型ニワトリプレプロラクチンの製造法に関す
るものである。
［従来の技術］ プロラクチンは、下垂体好酸性細胞で産生されるホル
モンであり、成長ホルモンと胎盤性ラクトゲンの近縁の
ペプチドで、共通の先祖ペプチドより派生したと考えら
れている。
モンであり、成長ホルモンと胎盤性ラクトゲンの近縁の
ペプチドで、共通の先祖ペプチドより派生したと考えら
れている。
ホ乳類のプロラクチンは脳下垂体前葉において生産さ
れるが、それらの活性ならびに構造は既に知られてい
る。例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ等は既に報告さ
れており、最近では魚類であるサケプロラクチンの単離
及び構造がカワウチ（H.Kawauchi）らによってジェネラ
ル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジィ（Ge
n.Comp.Endcrinol,49,446−458,1983）やアーク・バイ
オケミストリー・アンド・パイオフィジックス（Arch.B
iochem.Biophysic,244（２）,528−541,1986）に報告さ
れており、同じくカワウチ（H.Kawauchi）らによって、
コイプロラクチンの構造（Gen.Comp.Endocrinol.,66,28
0−290,1987）が報告されている。
れるが、それらの活性ならびに構造は既に知られてい
る。例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ等は既に報告さ
れており、最近では魚類であるサケプロラクチンの単離
及び構造がカワウチ（H.Kawauchi）らによってジェネラ
ル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジィ（Ge
n.Comp.Endcrinol,49,446−458,1983）やアーク・バイ
オケミストリー・アンド・パイオフィジックス（Arch.B
iochem.Biophysic,244（２）,528−541,1986）に報告さ
れており、同じくカワウチ（H.Kawauchi）らによって、
コイプロラクチンの構造（Gen.Comp.Endocrinol.,66,28
0−290,1987）が報告されている。
また、鳥類におけるプロラクチンの作用は多様である
ことが知られている。クロップ・ミルクの形成、巣作
り、抱卵等のいわゆる母性行動の維持、あるいは渡り鳥
では、夜の浮動、いらだち、皮下脂肪の増加（渡りの準
備）等への作用、すなわち生殖あるいはそれに関する行
動に及ぶ広い生理作用が知られている。
ことが知られている。クロップ・ミルクの形成、巣作
り、抱卵等のいわゆる母性行動の維持、あるいは渡り鳥
では、夜の浮動、いらだち、皮下脂肪の増加（渡りの準
備）等への作用、すなわち生殖あるいはそれに関する行
動に及ぶ広い生理作用が知られている。
現在、鳥類のプロラクチンは鳥類における母性行動の
誘起等の作用が考えられるので、特にニワトリプロラク
チンでは、養鶏分野での応用が期待されている。
誘起等の作用が考えられるので、特にニワトリプロラク
チンでは、養鶏分野での応用が期待されている。
［発明が解決しようとする課題］ しかし、鳥類プロラクチンについては、ホルモンタン
パク質が単離されたという報告はあるものの（Scans.C.
G.らGen.Comp.Endocrinol.,27,371−379,1975）その後
の報告はなく、ホルモンタンパク質及び遺伝子の構造は
解析されていない現状であった。
パク質が単離されたという報告はあるものの（Scans.C.
G.らGen.Comp.Endocrinol.,27,371−379,1975）その後
の報告はなく、ホルモンタンパク質及び遺伝子の構造は
解析されていない現状であった。
さらに、天然のニワトリプロラクチンはニワトリ脳下
垂体に極微量に含まれているに過ぎず、その構造解析も
されいないのが現状である。それ故、その供給は大量の
脳下垂体が必要となり限界がある。
垂体に極微量に含まれているに過ぎず、その構造解析も
されいないのが現状である。それ故、その供給は大量の
脳下垂体が必要となり限界がある。
そこで上記の諸問題を鑑み、本発明者らは、遺伝子組
換え技術を利用したニワトリプロラクチンの構造解析
し、将来の大量供給を目的として本発明に至った。
換え技術を利用したニワトリプロラクチンの構造解析
し、将来の大量供給を目的として本発明に至った。
さらに付言すると、本発明によって、ニワトリプロラ
クチン構造遺伝子をクローニングして、塩基配列を決定
するだけでなく、ニワトリプロラクチンのアミノ酸配列
が解明され、ニワトリプロラクチンを大腸菌等の微生物
によって生産し、単離可能になり、多様な生理作用を持
つニワトリプロラクチンのさらに詳しい生理作用の研究
に役立つとともに、その応用範囲の広がることも予想さ
れる。
クチン構造遺伝子をクローニングして、塩基配列を決定
するだけでなく、ニワトリプロラクチンのアミノ酸配列
が解明され、ニワトリプロラクチンを大腸菌等の微生物
によって生産し、単離可能になり、多様な生理作用を持
つニワトリプロラクチンのさらに詳しい生理作用の研究
に役立つとともに、その応用範囲の広がることも予想さ
れる。
即ち、鳥類プロラクチン遺伝子に関して、本発明者ら
がニワトリプレプロラクチン遺伝子を単離し構造を決定
し、ニワトリプロラクチンの構造についてもこれを解明
したものである。
がニワトリプレプロラクチン遺伝子を単離し構造を決定
し、ニワトリプロラクチンの構造についてもこれを解明
したものである。
［課題を解決するための手段］ 本発明の第１発明に係る組換え型鳥類プロラクチン又
は組換え型鳥類プレプロラクチンは、下記のアミノ酸配
列で示されるポリペプチドを含む鳥類下垂体より分泌さ
れるmRNA由来のものである。
は組換え型鳥類プレプロラクチンは、下記のアミノ酸配
列で示されるポリペプチドを含む鳥類下垂体より分泌さ
れるmRNA由来のものである。
第２発明に係る組換え型ニワトリプロラクチンは下記
のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
第３の発明に係る組換え型ニワトリプロラクチン構造
遺伝子は、第２発明のアミノ酸配列をコードするもので
ある。
遺伝子は、第２発明のアミノ酸配列をコードするもので
ある。
第４の発明に係る組換え型ニワトリプロラクチンは、
下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
第５の発明に係る組換え型ニワトリプレプロラクチン
構造遺伝子は、第４の発明のアミノ酸配列をコードする
ものである。
構造遺伝子は、第４の発明のアミノ酸配列をコードする
ものである。
第６の発明に係る組換えプラスミドは、第２の発明の
アミド酸配列をコードする組換え型ニワトリプロラクチ
ン構造遺伝子を含有するものである。
アミド酸配列をコードする組換え型ニワトリプロラクチ
ン構造遺伝子を含有するものである。
第７の発明に係る組換えプラスミドは、第４の発明の
アミノ酸配列をコードする組換え型ニワトリプレプロラ
クチン構造遺伝子を含有するものである。
アミノ酸配列をコードする組換え型ニワトリプレプロラ
クチン構造遺伝子を含有するものである。
第８の発明に係る微生物は第６又は第７の発明に記載
の組換えプラスミドを含むものである。
の組換えプラスミドを含むものである。
本発明をさらに詳しく説明すると、ニワトリから摘出
した脳下垂体組織をグアニジウムチオシアネート溶液中
で粉砕し、遠心分離によりRNA分画を集め、得られたRNA
分画をオリゴｄ（Ｔ）カラムに通してポリ（Ａ）未端を
有するポリ（Ａ）+RNA（メッセンジャーRNA）を濃縮し
た。
した脳下垂体組織をグアニジウムチオシアネート溶液中
で粉砕し、遠心分離によりRNA分画を集め、得られたRNA
分画をオリゴｄ（Ｔ）カラムに通してポリ（Ａ）未端を
有するポリ（Ａ）+RNA（メッセンジャーRNA）を濃縮し
た。
濃縮したポリ（Ａ）+RNAをプラスミドpSI4001のアン
ピシリン耐性遺伝子と77個のｄ（Ｔ）連鎖を持つ全長25
00塩基対のクローニング用プライマーと連結させ、逆転
写酵素でポリ（Ａ）+RNAの相補鎖DNAを合成してその
３′未端にデオキシヌクレオチド未端転送酵素によって
22個のｄ（Ｃ）連鎖をつけた。
ピシリン耐性遺伝子と77個のｄ（Ｔ）連鎖を持つ全長25
00塩基対のクローニング用プライマーと連結させ、逆転
写酵素でポリ（Ａ）+RNAの相補鎖DNAを合成してその
３′未端にデオキシヌクレオチド未端転送酵素によって
22個のｄ（Ｃ）連鎖をつけた。
相補鎖DNAを含まないクローニングベクター側の未端
を制限酵素Hind IIIの処理によって除き、一方で用意し
た両端にHind III H接着未端と22個のｄ（Ｇ）連鎖を持
ち内部にlacプロモーター１個とSD（シャイン・ダルガ
ルノ）配列と翻訳開始コドンATGのセットを３フレーム
分持つ全長390塩基対のpSI4001由来のリンカーDNAをこ
のHind III断片に結合させた。それと同時に両端に位置
した22個づつのｄ（Ｃ）連鎖とｄ（Ｇ）連鎖によってこ
のポリ（Ａ）+RNAを含むベクタープライマーとリンカー
からなるDNA鎖を環状化させ、つづいてRNaseHとDNAポリ
ミラーゼ処理によってリン酸ジエステル結合を形成させ
てここにニワトリプロラクチン構造遺伝子（相補鎖DN
A）を含むDNA鎖を完全な環状DNA構造のプラスミドとし
て完成した。
を制限酵素Hind IIIの処理によって除き、一方で用意し
た両端にHind III H接着未端と22個のｄ（Ｇ）連鎖を持
ち内部にlacプロモーター１個とSD（シャイン・ダルガ
ルノ）配列と翻訳開始コドンATGのセットを３フレーム
分持つ全長390塩基対のpSI4001由来のリンカーDNAをこ
のHind III断片に結合させた。それと同時に両端に位置
した22個づつのｄ（Ｃ）連鎖とｄ（Ｇ）連鎖によってこ
のポリ（Ａ）+RNAを含むベクタープライマーとリンカー
からなるDNA鎖を環状化させ、つづいてRNaseHとDNAポリ
ミラーゼ処理によってリン酸ジエステル結合を形成させ
てここにニワトリプロラクチン構造遺伝子（相補鎖DN
A）を含むDNA鎖を完全な環状DNA構造のプラスミドとし
て完成した。
本発明者らは、得られたプラスミドを大腸菌DH1株に
導入して、37℃で培養し、アンピシリンを含む寒天倍地
上に育成したコロニーに対して、ブタプロラクチンのcD
NAの制限酵素Sty I及びNsi I処理によって得られる250
及び530塩基対のDNA断片をプローブとしてコロニーハイ
ブリダイゼイションを行うことにより複数個の陽性コロ
ニーを得た。
導入して、37℃で培養し、アンピシリンを含む寒天倍地
上に育成したコロニーに対して、ブタプロラクチンのcD
NAの制限酵素Sty I及びNsi I処理によって得られる250
及び530塩基対のDNA断片をプローブとしてコロニーハイ
ブリダイゼイションを行うことにより複数個の陽性コロ
ニーを得た。
第１図に示されているのは本発明によって初めて明ら
かにされたニワトリプロラクチン構造遺伝子の全塩基配
列であり、請求項４で示したアミノ酸配列をコードする
領域を含んでいる。その構造から、Ｎ未端側にシグナル
ペプチド部分と思われるアミノ酸30残基が存在し、本発
明において初めて鳥類のプロラクチンの構造が解明され
た。
かにされたニワトリプロラクチン構造遺伝子の全塩基配
列であり、請求項４で示したアミノ酸配列をコードする
領域を含んでいる。その構造から、Ｎ未端側にシグナル
ペプチド部分と思われるアミノ酸30残基が存在し、本発
明において初めて鳥類のプロラクチンの構造が解明され
た。
なお、形質転換体として本プラスミドpcPRL1を導入し
た大腸菌（DH1株）は寄託番号 微工研菌寄第10163号と
して、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済みであ
る。
た大腸菌（DH1株）は寄託番号 微工研菌寄第10163号と
して、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済みであ
る。
さらに付言すると、本発明のニワトリプロラクチン構
造遺伝子及びニワトリプレプロラクチン構造遺伝子は、
これを利用することにより、適当な宿主（例えば大腸
菌、枯草菌、酵母等）において、ニワトリプロラクチン
あるいはニワトリプロラクチン様ポリペプチドが生産可
能であることを意味するものである。すなわち、本発明
で得られた遺伝子を適当な宿主内で調節可能な遺伝子配
列（例えばtac,trp,λPLと呼ばれるプロモーター）を含
んだ組換えプラスミドを導入し形質転換すれば、そのポ
リペプチドの生産はプロモーターの支配下におかれ、人
為的にその生産を調節することが可能となるということ
である。
造遺伝子及びニワトリプレプロラクチン構造遺伝子は、
これを利用することにより、適当な宿主（例えば大腸
菌、枯草菌、酵母等）において、ニワトリプロラクチン
あるいはニワトリプロラクチン様ポリペプチドが生産可
能であることを意味するものである。すなわち、本発明
で得られた遺伝子を適当な宿主内で調節可能な遺伝子配
列（例えばtac,trp,λPLと呼ばれるプロモーター）を含
んだ組換えプラスミドを導入し形質転換すれば、そのポ
リペプチドの生産はプロモーターの支配下におかれ、人
為的にその生産を調節することが可能となるということ
である。
［作用］ 本発明におけるプロラクチンポリペプチド及びその誘
導体は、鳥類における母性行動の誘起等の作用により、
鳥類の育種、増殖等の分野で広い用途が期待される。鳥
類における母性行動の誘起等の作用が考えられるので、
特にニワトリプロラクチンでは、養鶏分野での応用が期
待されている。
導体は、鳥類における母性行動の誘起等の作用により、
鳥類の育種、増殖等の分野で広い用途が期待される。鳥
類における母性行動の誘起等の作用が考えられるので、
特にニワトリプロラクチンでは、養鶏分野での応用が期
待されている。
［実施例］ 以下に本発明の具体的な実施例を示す。
実施例1.鶏脳下垂体からの全ポリ（Ａ）+RNAの単離： ニワトリ脳下垂体からポリ（Ａ）+RNAの単離は、グア
ニジウムチオシアネート法（重定勝哉、細胞工学、2,61
6（1983））に従い下記のごとく調整した。
ニジウムチオシアネート法（重定勝哉、細胞工学、2,61
6（1983））に従い下記のごとく調整した。
ニワトリの連結脳下垂体640mg（約10個体分）を6Mグ
アニジウムチオシアネート（和光純薬工業社製（以下
「和光」と略記））、5mMクエン酸ナトリウム、0.55ザ
ルコシルナトリウム及び0.1M β−メルカプトエタノー
ル溶液5ml中で、ポリトロンホモゲナイザーにて破砕、
可溶化した。このホモゲネート18G注射針で数回通し、
染色体由来のDNAを分断した。このものを5.7Mセシウム
クロライド（和光）、0.1MEDTA（pH8.0）の溶液上にこ
の溶液の約２倍量となるように静かに重層し、ベックマ
ン社製SW40Tiローターで２万９千回転で19時間遠心する
ことによりRNAの沈殿を得た。このRNAを注意深く洗浄
し、10mM Tris−HC1,1mM EDTAに懸濁し、エタノール沈
殿を３回行った。得られた沈殿を10mM Tris−HC1（pH8.
0）,1mM EDTA,0.1％SDS溶液に懸濁し、最終濃度0.5Mに
なるようにLiClを加え、90℃、２分間インキュベート
し、オリゴ（dT）セルロース（コラボレーティブ・リサ
ーチ社製）カラム・クロマトグラフィをかけた。
アニジウムチオシアネート（和光純薬工業社製（以下
「和光」と略記））、5mMクエン酸ナトリウム、0.55ザ
ルコシルナトリウム及び0.1M β−メルカプトエタノー
ル溶液5ml中で、ポリトロンホモゲナイザーにて破砕、
可溶化した。このホモゲネート18G注射針で数回通し、
染色体由来のDNAを分断した。このものを5.7Mセシウム
クロライド（和光）、0.1MEDTA（pH8.0）の溶液上にこ
の溶液の約２倍量となるように静かに重層し、ベックマ
ン社製SW40Tiローターで２万９千回転で19時間遠心する
ことによりRNAの沈殿を得た。このRNAを注意深く洗浄
し、10mM Tris−HC1,1mM EDTAに懸濁し、エタノール沈
殿を３回行った。得られた沈殿を10mM Tris−HC1（pH8.
0）,1mM EDTA,0.1％SDS溶液に懸濁し、最終濃度0.5Mに
なるようにLiClを加え、90℃、２分間インキュベート
し、オリゴ（dT）セルロース（コラボレーティブ・リサ
ーチ社製）カラム・クロマトグラフィをかけた。
吸着したポリ（Ａ）+RNAを10mM Tris−HC1（pH7.5）,
2mM EDTA及び0.1％SDS溶液で溶出した。紫外線（260n
m）の吸収が認められる画分を回収し、ポリ（Ａ）+RNA6
9μｇを得た。
2mM EDTA及び0.1％SDS溶液で溶出した。紫外線（260n
m）の吸収が認められる画分を回収し、ポリ（Ａ）+RNA6
9μｇを得た。
実施例2.cDNA合成とベクタープラスミドへの組み込み： cDNAの合成とベクターへの組み込みは、オカヤマバー
グ法（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ
（Mol.Cell.Biol.）,2.161（1982）；重定勝哉．細胞工
学,2,616（1983））に従い下記のごとく行った。
グ法（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ
（Mol.Cell.Biol.）,2.161（1982）；重定勝哉．細胞工
学,2,616（1983））に従い下記のごとく行った。
プラスミドpSI4001（K.Isuiら、ヌクレイック・アシ
ド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）.14,1615（198
6））400μｇを制限酵素Kpn I（ニッポンジーン社製、
以下制限酵素は全てニッポンジーン社製のものを使用し
た。）で、37℃で５時間反応させ、完全に消化した。フ
ェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿を行いDN
Aを回収した。Kpn Iで消化したこのDNAを次にターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT,フ
ァルマシア社製）の反応を利用して、Kpn I切断部分の
３′未端にポリｄ（Ｔ）鎖を約60個付加した。フェノー
ルクロロホルム処理、エタノール沈殿後DNAを回収し、
次に制限酵素BamH Iで消化を行い得られた2.8KbpのDNA
断片を低融点アガロースゲルで分離後回収した。
ド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）.14,1615（198
6））400μｇを制限酵素Kpn I（ニッポンジーン社製、
以下制限酵素は全てニッポンジーン社製のものを使用し
た。）で、37℃で５時間反応させ、完全に消化した。フ
ェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿を行いDN
Aを回収した。Kpn Iで消化したこのDNAを次にターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT,フ
ァルマシア社製）の反応を利用して、Kpn I切断部分の
３′未端にポリｄ（Ｔ）鎖を約60個付加した。フェノー
ルクロロホルム処理、エタノール沈殿後DNAを回収し、
次に制限酵素BamH Iで消化を行い得られた2.8KbpのDNA
断片を低融点アガロースゲルで分離後回収した。
回収したDNAは、次にオリゴ（Ａ）セルロースカラム
クロマトグラフィ（コラボレーティブ・リサーチ社製）
を行い、ポリｄ（Ｔ）鎖が充分付加されたDNA断片（以
下ベクタープライマーと呼ぶ）を得た。
クロマトグラフィ（コラボレーティブ・リサーチ社製）
を行い、ポリｄ（Ｔ）鎖が充分付加されたDNA断片（以
下ベクタープライマーと呼ぶ）を得た。
リンカーDNAの調整は以下のごとく行った。pS I 400
1、100μｇを制限酵素Pst Iで完全に消化し、ゲノール
クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、該DNAのPst
I切断部位の３′未端にポリｄ（Ｇ）をTdTを用いて約1
5個付加した。フェノールクロロホルム処理、エタノー
ル沈殿を行い、回収したDNAを制限酵素Hind IIIで完全
に消化し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い
280塩基のポリｄ（Ｇ）付DNA断片を分離、回収した。以
下このDNA断片はリンカーDNAと呼ぶ。
1、100μｇを制限酵素Pst Iで完全に消化し、ゲノール
クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、該DNAのPst
I切断部位の３′未端にポリｄ（Ｇ）をTdTを用いて約1
5個付加した。フェノールクロロホルム処理、エタノー
ル沈殿を行い、回収したDNAを制限酵素Hind IIIで完全
に消化し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い
280塩基のポリｄ（Ｇ）付DNA断片を分離、回収した。以
下このDNA断片はリンカーDNAと呼ぶ。
実施例１で調整したポリ（Ａ）+RNA約５μｇとベクタ
ープライマー1.5μｇとを混合し、10単位の逆転写酵素
（和光）を加えて、37℃、40分反応させた。反応物をフ
ェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿操作を２回
繰返した後、TdTを37℃、20分反応させて、ｄ（Ｃ）鎖
を約15個付加した。該反応物を再びフェノール処理、エ
タノール沈殿を行いDNAを回収して、制限酵素Hind III
で完全消化を行い、再びフェノール処理、エタノール沈
殿を行い、DNAを回収した。該DNAの10分の１量を取り、
上記のごとく調整したリンカーDNA12ngを加えて１晩大
腸菌由来のDNAリガーゼ（ファルマシア社製）を加えて
環状化した。該反応物に大腸菌DNAリガーゼを追加し、
さらにリボヌクレアーゼＨ（ファルマシア社製）、DNA
ポリメラーゼＩ（ニッポンジーン社製）を加えて、12
℃、25℃で各々１時間インキュベートし、ここに二重鎖
DNAの完全な組合せプラシミドを作成した。
ープライマー1.5μｇとを混合し、10単位の逆転写酵素
（和光）を加えて、37℃、40分反応させた。反応物をフ
ェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿操作を２回
繰返した後、TdTを37℃、20分反応させて、ｄ（Ｃ）鎖
を約15個付加した。該反応物を再びフェノール処理、エ
タノール沈殿を行いDNAを回収して、制限酵素Hind III
で完全消化を行い、再びフェノール処理、エタノール沈
殿を行い、DNAを回収した。該DNAの10分の１量を取り、
上記のごとく調整したリンカーDNA12ngを加えて１晩大
腸菌由来のDNAリガーゼ（ファルマシア社製）を加えて
環状化した。該反応物に大腸菌DNAリガーゼを追加し、
さらにリボヌクレアーゼＨ（ファルマシア社製）、DNA
ポリメラーゼＩ（ニッポンジーン社製）を加えて、12
℃、25℃で各々１時間インキュベートし、ここに二重鎖
DNAの完全な組合せプラシミドを作成した。
実施例3.ニワトリプロラクチンcDNA組換えプラスミドの
選択とcDNA部分の塩基配列 上記のごとく得られた組換えプラスミドを大腸菌DE1
株に、ハナハン（Hanahan）の方法（DNA cloning,vol.
1,p109,IPL PRESS,1985）に従い形質転換し、アンピシ
リン耐性を示す約１万個のコロニーをワットマン541ペ
ーパー（ワットマン社製）に固定した。そして、ブタプ
ロラクチンcDNAを制限酵素Sty I及びNsi I処理によって
得られる250及び530塩基よりなるDNA断片をニック・ト
ランスレーションによって32pで標識し、これをプロー
ブとして、50％ホルムアミド、42℃の条件でコロニーハ
イブリダイゼイションを行った所、８個の陽性コロニー
が得られた。
選択とcDNA部分の塩基配列 上記のごとく得られた組換えプラスミドを大腸菌DE1
株に、ハナハン（Hanahan）の方法（DNA cloning,vol.
1,p109,IPL PRESS,1985）に従い形質転換し、アンピシ
リン耐性を示す約１万個のコロニーをワットマン541ペ
ーパー（ワットマン社製）に固定した。そして、ブタプ
ロラクチンcDNAを制限酵素Sty I及びNsi I処理によって
得られる250及び530塩基よりなるDNA断片をニック・ト
ランスレーションによって32pで標識し、これをプロー
ブとして、50％ホルムアミド、42℃の条件でコロニーハ
イブリダイゼイションを行った所、８個の陽性コロニー
が得られた。
これらのコロニーより組換えプラスミドを抽出し制限
酵素により分析を行った所、その全てに付いて、同じよ
うな結果が得られた。その結果を第２図に示す。そして
ほぼ完全長のcDNA部分の長さと推定されたクローンであ
ったpcPRL1につきジオキシ法（Sangerら、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
ス（Proc・Natl・Acad.Sci.）USA,74,5463（1977））に
従いニワトリプロラクチンの塩基配列の決定を行った。
第１図にcDNA部分の塩基配列とアミノ酸配列を示す。ま
た、表1A〜Ｇには組換えプラスミドpcPRL1の全塩基配列
を示す。尚、表中の塩基番号390から1355が第１図で示
した部分である。
酵素により分析を行った所、その全てに付いて、同じよ
うな結果が得られた。その結果を第２図に示す。そして
ほぼ完全長のcDNA部分の長さと推定されたクローンであ
ったpcPRL1につきジオキシ法（Sangerら、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
ス（Proc・Natl・Acad.Sci.）USA,74,5463（1977））に
従いニワトリプロラクチンの塩基配列の決定を行った。
第１図にcDNA部分の塩基配列とアミノ酸配列を示す。ま
た、表1A〜Ｇには組換えプラスミドpcPRL1の全塩基配列
を示す。尚、表中の塩基番号390から1355が第１図で示
した部分である。
［発明の効果］ 本発明は以上説明したとおり、本発明によって初めて
解明されたニワトリプロラクチンのアミノ酸配列をもと
にして、その全部または一部のアミノ酸配列をコードす
るデオキシリボヌクレオチド連鎖を含む種々の発現ベク
ターを構築し、それぞれを適切な形質転換体として大腸
菌、枯草菌、光合成細菌、酵母または動物細胞等に導入
してのち培養することにより各種の形質転換体より組換
え型ニワトリプロラクチンを容易にしかも大量に得るこ
とが出来るという効果がある。
解明されたニワトリプロラクチンのアミノ酸配列をもと
にして、その全部または一部のアミノ酸配列をコードす
るデオキシリボヌクレオチド連鎖を含む種々の発現ベク
ターを構築し、それぞれを適切な形質転換体として大腸
菌、枯草菌、光合成細菌、酵母または動物細胞等に導入
してのち培養することにより各種の形質転換体より組換
え型ニワトリプロラクチンを容易にしかも大量に得るこ
とが出来るという効果がある。
第１図はニワトリプロラクチンを含む相補鎖DNA部分の
全塩基配列とその配列から明らかとなったアミノ酸配列
図、第２図はニワトリプロラクチン相補鎖DNAを含む部
分の制限酵素切断地図である。
全塩基配列とその配列から明らかとなったアミノ酸配列
図、第２図はニワトリプロラクチン相補鎖DNAを含む部
分の制限酵素切断地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (54)【発明の名称】 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチ ン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型 ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物
Claims (9)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で示されるポリペプチ
ドを含む鳥類下垂体より分泌されるmRNA由来の組換え型
鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン。 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
である組換え型ニワトリプロラクチン。 - 【請求項３】請求項２のアミノ酸配列をコードする組換
え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子。 - 【請求項４】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
である組換え型ニワトリプレプロラクチン。 - 【請求項５】請求項４のアミノ酸配列をコードする組換
え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子。 - 【請求項６】請求項２のアミノ酸配列をコードする組換
え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子を含有する組換え
プラスミド。 - 【請求項７】請求項４のアミノ酸配列をコードする組換
え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子を含有する組
換えプラスミド。 - 【請求項８】請求項６又は７に記載の組換えプラスミド
を含む微生物。 - 【請求項９】前記微生物が大腸菌（Escherichia coli）
に属することを特徴とする請求項８に記載の組換えプラ
スミドを含む微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63203913A JP2666069B2 (ja) | 1988-08-18 | 1988-08-18 | 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63203913A JP2666069B2 (ja) | 1988-08-18 | 1988-08-18 | 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0253495A JPH0253495A (ja) | 1990-02-22 |
| JP2666069B2 true JP2666069B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=16481768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63203913A Expired - Fee Related JP2666069B2 (ja) | 1988-08-18 | 1988-08-18 | 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2666069B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04123249U (ja) * | 1991-04-25 | 1992-11-06 | 日本碍子株式会社 | 金属溶湯槽のコーナー部構造 |
-
1988
- 1988-08-18 JP JP63203913A patent/JP2666069B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２５，Ｐ．４４２−４４８（１９８５） |
| Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．２，Ｐ．４２９−４３７（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0253495A (ja) | 1990-02-22 |
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|---|---|---|---|
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