JP2513909B2 - ネコインタ―フェロンおよびその製造法 - Google Patents
ネコインタ―フェロンおよびその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来で
あるインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィル
スを利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）と
することを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルス
およびそのウィルスを利用して生産したネコイターフェ
ロン（以下、FeIFNと略す）、さらにFeIFNの製造法に関
する。
あるインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィル
スを利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）と
することを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルス
およびそのウィルスを利用して生産したネコイターフェ
ロン（以下、FeIFNと略す）、さらにFeIFNの製造法に関
する。
［従来の技術］ インターフェロンは、抗ウィルス作用を示すところの
蛋白質を主成分とする生理活性物質でIFNと略記され
る。
蛋白質を主成分とする生理活性物質でIFNと略記され
る。
遺伝子操作技術の進歩によりヒトのIFNのみならず、
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のIFNも大量生産が可能と
なり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬として
のIFNの用途開発研究が行なわれているものもある。
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のIFNも大量生産が可能と
なり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬として
のIFNの用途開発研究が行なわれているものもある。
ネコについても、α、β、γ各タイプのIFNが報告さ
れている（文献１）。
れている（文献１）。
［発明が解決しようとする課題］ しかるに、ネコのIFNが遺伝子操作により大量生産が
可能になったという報告は未だない。
可能になったという報告は未だない。
ネコには、ネコエイズ、ネコ白血病、ネコウィルス性
鼻気管炎、ネコカリキウィルス病、ネコ伝染性腹膜炎は
じめ多数のウィルス病が知られている。
鼻気管炎、ネコカリキウィルス病、ネコ伝染性腹膜炎は
じめ多数のウィルス病が知られている。
そこで、ヒトのαIFNやウシのβIFNを経口投与し、ネ
コ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報告さ
れている。経口ではなく、体内注射を行なえば、より頭
著な効果が期待されるものの、異種IFNに対する中和抗
体の生産が起こることが懸念される。同種IFN、つまり
ネコのIFNが容易に入手可能となれば、ネコの抗ウィル
ス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期待される。
コ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報告さ
れている。経口ではなく、体内注射を行なえば、より頭
著な効果が期待されるものの、異種IFNに対する中和抗
体の生産が起こることが懸念される。同種IFN、つまり
ネコのIFNが容易に入手可能となれば、ネコの抗ウィル
ス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期待される。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑みFeIFNの大量生産を
目的とし、創意工夫をなし、市販のベクターを用いてネ
コのcDNAライブラリーを作製し、この中からサルの培養
細胞をトランジェント・エクスプレスをさせ、FeIFNを
生産させるプラスミドを単離することに成功し、さらに
はカイコ核多角体病ウィルスのDNAをFeIFNの蛋白をコー
ドするDNAで組換えた組換え体ウィルスを単離し、この
組換え体ウィルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生
体中で増殖させてFeIFNを生産することに成功し、以っ
て簡単に大量にFeIFNを製造する方法を確立し、かくし
て本発明を完成させるに至った。
目的とし、創意工夫をなし、市販のベクターを用いてネ
コのcDNAライブラリーを作製し、この中からサルの培養
細胞をトランジェント・エクスプレスをさせ、FeIFNを
生産させるプラスミドを単離することに成功し、さらに
はカイコ核多角体病ウィルスのDNAをFeIFNの蛋白をコー
ドするDNAで組換えた組換え体ウィルスを単離し、この
組換え体ウィルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生
体中で増殖させてFeIFNを生産することに成功し、以っ
て簡単に大量にFeIFNを製造する方法を確立し、かくし
て本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、FeIFNの蛋白質をコードするDNAを
外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイコ核多
角体病ウィルス、および該ウィルスをカイコ樹立細胞中
もしくはカイコ生体中で増殖させるFeIFNの生産法、さ
らに得られたFeIFNを提供するものである。
外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイコ核多
角体病ウィルス、および該ウィルスをカイコ樹立細胞中
もしくはカイコ生体中で増殖させるFeIFNの生産法、さ
らに得られたFeIFNを提供するものである。
以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。
cDNAライブラリーは大腸菌を宿主とし、ネコの細胞か
ら抽出したpoly（Ａ）+RNAを基質とし、逆転写酵素を用
いた一般的な方法で作れる。
ら抽出したpoly（Ａ）+RNAを基質とし、逆転写酵素を用
いた一般的な方法で作れる。
poly（Ａ）+RNAの供与体としてのネコの細胞は、例え
ばLSA（文献１）のような株化された培養細胞が使用に
便利ではあるが、これに限らない。培養した細胞からpo
ly（Ａ）+RNAを得るときは、その細胞に適したインター
フェロンインデューサーを検討し、これを用いてpoly
（Ａ）+RNAの増収を図ると便利であり、例えばLSA細胞
では培養時にNDV（New Castle−disease Virus）やTPA
（12−Ｏ−Tetradecanoylphorbol 13−acetate）などを
誘導剤として用いるとpoly（Ａ）+RNAの収量増大が図れ
便利である。プラスミドベクターは動物細胞用発現機構
を備え、かつ大腸菌で複製可能なもの、例えばファルマ
シア社製オカヤマ・バーグ・ベクター類のような市販の
ものを使うと便利である。宿主の細菌は大腸菌（E.coi
l）K12株を用いることができる。
ばLSA（文献１）のような株化された培養細胞が使用に
便利ではあるが、これに限らない。培養した細胞からpo
ly（Ａ）+RNAを得るときは、その細胞に適したインター
フェロンインデューサーを検討し、これを用いてpoly
（Ａ）+RNAの増収を図ると便利であり、例えばLSA細胞
では培養時にNDV（New Castle−disease Virus）やTPA
（12−Ｏ−Tetradecanoylphorbol 13−acetate）などを
誘導剤として用いるとpoly（Ａ）+RNAの収量増大が図れ
便利である。プラスミドベクターは動物細胞用発現機構
を備え、かつ大腸菌で複製可能なもの、例えばファルマ
シア社製オカヤマ・バーグ・ベクター類のような市販の
ものを使うと便利である。宿主の細菌は大腸菌（E.coi
l）K12株を用いることができる。
FeIFNをコードするcDNAを有するプラスミドのクロー
ン化は、サルの株化細胞COS1あるいはCOS7をトランスフ
ェクトし、トランジェント・エクスプレションでCOS1あ
るいはCOS7に抗ウィルス活性生産能を賦与するプラスミ
ドとして、cDNAライブラリーの中からスクリーニングす
ることにより行なうことができる。プラスミドによるFe
IFNトランジェント・エクスプレションは、例えばDEAE
−デキストラン法やリン酸カルシウム法のような一般的
な方法（常法）で行なうことができる。このようにして
選び出した活性を有するプラスミドの１つがpFeIFN1で
あり、これを含有する形質転換体大腸菌がE.coli（pFeI
FN1）（微工研条寄第1633号）である。pFeIFN1は、4.3k
bの大きさで、その制限地図を第１図に示す。
ン化は、サルの株化細胞COS1あるいはCOS7をトランスフ
ェクトし、トランジェント・エクスプレションでCOS1あ
るいはCOS7に抗ウィルス活性生産能を賦与するプラスミ
ドとして、cDNAライブラリーの中からスクリーニングす
ることにより行なうことができる。プラスミドによるFe
IFNトランジェント・エクスプレションは、例えばDEAE
−デキストラン法やリン酸カルシウム法のような一般的
な方法（常法）で行なうことができる。このようにして
選び出した活性を有するプラスミドの１つがpFeIFN1で
あり、これを含有する形質転換体大腸菌がE.coli（pFeI
FN1）（微工研条寄第1633号）である。pFeIFN1は、4.3k
bの大きさで、その制限地図を第１図に示す。
本発明の組換えカイコ核多角体病ウィルスは、例えば
前記のE.coil（pFeIFN1）から抽出したプラスミドからF
eIFNの蛋白質をコードするDNAを切り出して、カイコの
クローニングベクター（文献２）に連結して作製した組
換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスDNAと
を、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクションして作
製することができる。従って、本発明の組換え体ウィル
スは、in vivo的な方法で作製することができる。
前記のE.coil（pFeIFN1）から抽出したプラスミドからF
eIFNの蛋白質をコードするDNAを切り出して、カイコの
クローニングベクター（文献２）に連結して作製した組
換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスDNAと
を、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクションして作
製することができる。従って、本発明の組換え体ウィル
スは、in vivo的な方法で作製することができる。
すなわち、微工研条寄第1633号の大腸菌形質転換体か
ら、例えば文献３のような一般的な方法により抽出した
プラスミドpFeIFN1からFeIFNの蛋白質をコードするDNA
部分を、例えばpBM030（文献２）などのカイコのクロー
ニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという
一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製
することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウィルスDNA（文献２）とを、文献２のような
方法でカイコ樹立細胞、例えばBM−Ｎ株（文献２）にコ
・トランスフェクションした後、培養を続け、培養液中
に出現した非組換え体（野生型）と組換え体のウィルス
の中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的
な方法によって組換え体ウィルスをクローニングするこ
とができる。組換え体ウィルスは多角体の形成能がない
ことから、野生型ウィルスと容易に区別できる。
ら、例えば文献３のような一般的な方法により抽出した
プラスミドpFeIFN1からFeIFNの蛋白質をコードするDNA
部分を、例えばpBM030（文献２）などのカイコのクロー
ニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという
一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製
することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウィルスDNA（文献２）とを、文献２のような
方法でカイコ樹立細胞、例えばBM−Ｎ株（文献２）にコ
・トランスフェクションした後、培養を続け、培養液中
に出現した非組換え体（野生型）と組換え体のウィルス
の中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的
な方法によって組換え体ウィルスをクローニングするこ
とができる。組換え体ウィルスは多角体の形成能がない
ことから、野生型ウィルスと容易に区別できる。
FeIFNの生産は、前記の組換えカイコ核多角体ウィル
スをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させ
ることにより行なう。
スをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させ
ることにより行なう。
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウィル
スを含む培養液により、BM−Ｎ細胞を感染させ、平面培
養または浮遊培養により培養する。BM−Ｎ細胞を培養す
る培地としては、例えば牛血清を添加したTC−10培地
（文献４）を使用することができる。培養温度は25〜28
℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清
からFeIFNを回収する。
スを含む培養液により、BM−Ｎ細胞を感染させ、平面培
養または浮遊培養により培養する。BM−Ｎ細胞を培養す
る培地としては、例えば牛血清を添加したTC−10培地
（文献４）を使用することができる。培養温度は25〜28
℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清
からFeIFNを回収する。
カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え体ウィルス
を含む培養液をカイコ幼虫に注射して、クワの葉または
人工飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその
上清からFeIFNを回収する。
を含む培養液をカイコ幼虫に注射して、クワの葉または
人工飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその
上清からFeIFNを回収する。
体液中に存在する組換えカイコ各多角体病ウィルスは
pH1〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
pH1〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
生産されたFeIFNは、通常のカラムクロマトグラフィ
ーなどで精製することができる。例えばアフィニティー
クロマトグラフィーなどが用いられ、好ましくはブルー
色素を結合させた担体（以下、ブルー担体と略す）、銅
をキレート結合させた担体（以下、銅キレート担体と略
す）などが用いられる。これらの担体は単独で用いても
よいが、精製効果を上げるためには、１種以上の担体を
併用する方法が好ましい。特に、ブルー担体を用いるク
ロマトグラフィーと銅キレート担体を用いるクロマトグ
ラフィーとを連続して行なう方法が好ましい。
ーなどで精製することができる。例えばアフィニティー
クロマトグラフィーなどが用いられ、好ましくはブルー
色素を結合させた担体（以下、ブルー担体と略す）、銅
をキレート結合させた担体（以下、銅キレート担体と略
す）などが用いられる。これらの担体は単独で用いても
よいが、精製効果を上げるためには、１種以上の担体を
併用する方法が好ましい。特に、ブルー担体を用いるク
ロマトグラフィーと銅キレート担体を用いるクロマトグ
ラフィーとを連続して行なう方法が好ましい。
ブルー担体としては、次のものが使用される。
ブルー色素は一般名をCIリアクティブブルー２とい
い、例えばCIBA−GEIGY社から“シバクロンブルーF3GA"
または“シバクロンブルー3GA"という商品名で市販され
ている青色色素などが挙げられる。
い、例えばCIBA−GEIGY社から“シバクロンブルーF3GA"
または“シバクロンブルー3GA"という商品名で市販され
ている青色色素などが挙げられる。
実際のクロマトグラフィーに用いるブルー担体として
は、“ブルー・セファロースCL−6B"（Pharmacia社
製）、“ブルー・セファロース６ファーストフロー”
（Pharmacia社製）、“マトレックスゲル・ブルーA"（A
micon社製）、および“アフィゲル・ブルー”（Biorad
社製）などの商品名で市販されているブルーアガロース
ゲル、または“ブルー・トリスアクリル−M"（LKB社
製）、“ブルーセルロファイン”（チッソ社製）などの
商品名で市販されているブルーセルロースゲルなどが適
当であり、容易に入手することができる。
は、“ブルー・セファロースCL−6B"（Pharmacia社
製）、“ブルー・セファロース６ファーストフロー”
（Pharmacia社製）、“マトレックスゲル・ブルーA"（A
micon社製）、および“アフィゲル・ブルー”（Biorad
社製）などの商品名で市販されているブルーアガロース
ゲル、または“ブルー・トリスアクリル−M"（LKB社
製）、“ブルーセルロファイン”（チッソ社製）などの
商品名で市販されているブルーセルロースゲルなどが適
当であり、容易に入手することができる。
銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、
ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシ
メチルイミノ基〔−Ｎ（CH2COON）２〕などのキレート
能を有する交換基が結合した担体を、硫酸銅などの銅塩
の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは、“キ
レーティングセファロース”（Pharmacia社製）などの
不溶性多糖類系担体に銅をキレートさせた担体が用いら
れる。
ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシ
メチルイミノ基〔−Ｎ（CH2COON）２〕などのキレート
能を有する交換基が結合した担体を、硫酸銅などの銅塩
の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは、“キ
レーティングセファロース”（Pharmacia社製）などの
不溶性多糖類系担体に銅をキレートさせた担体が用いら
れる。
クロマトグラフィーによるFeIFNの精製操作は次のよ
うに行なう。
うに行なう。
すなわち、まずFeIFNを含む溶液を上記担体に接触吸
着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちらでも可能
であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちらでも可能
であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
次に、吸着させたFeIFNを溶出剤で溶離させる。ブル
ー担体からの溶離は、溶出剤のpH値、イオン強度、疎水
度によって決定される。例えば、高イオン強度下ではpH
6〜７でFeIFNは溶出される。このイオン強度は、リン
酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸などの緩衝液の濃度を上げ
たり、塩化ナトリウム、塩化カリウムのような中性塩の
添加（0.2〜1.0M）により増加させることができる。ま
た、溶出剤中にエチレングリコール、プロピレングリコ
ールなどの疎水的相互作用を弱める溶剤を含む場合、pH
5〜７での溶出が可能になる。
ー担体からの溶離は、溶出剤のpH値、イオン強度、疎水
度によって決定される。例えば、高イオン強度下ではpH
6〜７でFeIFNは溶出される。このイオン強度は、リン
酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸などの緩衝液の濃度を上げ
たり、塩化ナトリウム、塩化カリウムのような中性塩の
添加（0.2〜1.0M）により増加させることができる。ま
た、溶出剤中にエチレングリコール、プロピレングリコ
ールなどの疎水的相互作用を弱める溶剤を含む場合、pH
5〜７での溶出が可能になる。
銅キレート担体からの溶離は、通常、リン酸、酢酸、
クエン酸などの酸性緩衝液で行ない、pH5以下が好まし
い。しかし、高イオン強度下では、さらに高いpHの溶離
が可能となる。
クエン酸などの酸性緩衝液で行ない、pH5以下が好まし
い。しかし、高イオン強度下では、さらに高いpHの溶離
が可能となる。
溶出剤の組成や濃度、液量は特に限定されるものでは
なく、それぞれ粗FeIFN中に含まれる夾雑蛋白質を除去
するのに有効で、pHを保持するのに必要な濃度、吸着さ
れたFeIFNを実質的に回収するのに必要な量が用いられ
る。
なく、それぞれ粗FeIFN中に含まれる夾雑蛋白質を除去
するのに有効で、pHを保持するのに必要な濃度、吸着さ
れたFeIFNを実質的に回収するのに必要な量が用いられ
る。
［実 施 例］ 以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ （１） ネコのcDNAライブラリーの作製 poly（Ａ）+RNAの供与体であるネコの細胞LSA−D4−K
17（文献１）を200mlの10％FBSを含むMEM−L15培地〔50
％イーグル（Eagle）MEM−50％レイボヴイッツ（Leibov
itz）培地〕中スピナーカルチャーで増殖させ、細胞濃
度105〜106/mlのところでTPA（12−Ｏ−tetradecanoylp
horbol 13−acetate、シグマ社製）を5ng/mlとなるよう
に培地中に加え、さらに20時間培養を続けた後、遠心分
離で細胞を集めた。この細胞から、グアニジウムチオシ
アネート法の変法によりpoly（Ａ）+RNAを抽出した。
17（文献１）を200mlの10％FBSを含むMEM−L15培地〔50
％イーグル（Eagle）MEM−50％レイボヴイッツ（Leibov
itz）培地〕中スピナーカルチャーで増殖させ、細胞濃
度105〜106/mlのところでTPA（12−Ｏ−tetradecanoylp
horbol 13−acetate、シグマ社製）を5ng/mlとなるよう
に培地中に加え、さらに20時間培養を続けた後、遠心分
離で細胞を集めた。この細胞から、グアニジウムチオシ
アネート法の変法によりpoly（Ａ）+RNAを抽出した。
すなわち、細胞３〜５×108を20mlの5mMクエン酸ナト
リウム−0.5％ザルコシルナトリウム−0.1Mメルカプト
エタノール−6Mグアニジンチオシアネートに懸濁した
後、18Gの注射針を10回通すことでホモジナイズした。
ポリアロア遠心管にホモジネートの1/3容の0.1M EDTA
（pH7.5）−5.7M CsC1を入れた後、この上にホモジネ
ートを重層し、日立RPS40Tローターで35,000rpm、20
℃、20時間遠心した。チューブ底部にパックされたRNA
画分を1mlのTE（10mMトリス・塩酸−1mMEDTA pH7.5）
に溶かし、0.1mlの3M酢酸ナトリウム液と混ぜた後、2.5
容の冷エタノールと混ぜ、−20℃で２時間静置した。遠
心分離により生じた底部のペレットを1mlのTEに溶か
し、65℃、４分間インキュベートした後、氷冷し1mlのT
Eを加えた後、等量の1.0M NaClと混ぜた。この混合物
を0.5M NaCl−TEで平衡化した0.5mlのoligo（dT）セル
ロース（タイプ３）（コラボラティブ・リサーチ社製）
のカラムに通し、poly（Ａ）+RNAを吸着させ、10mlの0.
5M NaCl−TEで洗滌した後、5mlのTEで溶出し、エタノ
ール沈殿法でペレット化したpoly（Ａ）+RNAを30μの
TEに溶かし、−80℃で保存した。７×108個の細胞から3
00μｇのpoly（Ａ）+RNAが得られた。
リウム−0.5％ザルコシルナトリウム−0.1Mメルカプト
エタノール−6Mグアニジンチオシアネートに懸濁した
後、18Gの注射針を10回通すことでホモジナイズした。
ポリアロア遠心管にホモジネートの1/3容の0.1M EDTA
（pH7.5）−5.7M CsC1を入れた後、この上にホモジネ
ートを重層し、日立RPS40Tローターで35,000rpm、20
℃、20時間遠心した。チューブ底部にパックされたRNA
画分を1mlのTE（10mMトリス・塩酸−1mMEDTA pH7.5）
に溶かし、0.1mlの3M酢酸ナトリウム液と混ぜた後、2.5
容の冷エタノールと混ぜ、−20℃で２時間静置した。遠
心分離により生じた底部のペレットを1mlのTEに溶か
し、65℃、４分間インキュベートした後、氷冷し1mlのT
Eを加えた後、等量の1.0M NaClと混ぜた。この混合物
を0.5M NaCl−TEで平衡化した0.5mlのoligo（dT）セル
ロース（タイプ３）（コラボラティブ・リサーチ社製）
のカラムに通し、poly（Ａ）+RNAを吸着させ、10mlの0.
5M NaCl−TEで洗滌した後、5mlのTEで溶出し、エタノ
ール沈殿法でペレット化したpoly（Ａ）+RNAを30μの
TEに溶かし、−80℃で保存した。７×108個の細胞から3
00μｇのpoly（Ａ）+RNAが得られた。
poly（Ａ）+RNAのプラスミドベクターへの連結とcDNA
の合成は、市販のプラスミドプライマーとリンカーとを
用いて行なった。
の合成は、市販のプラスミドプライマーとリンカーとを
用いて行なった。
すなわち、1.5ml容のエツペンドルフチューブに5mg/m
lのpoly（Ａ）+RNAを５μ入れ、これに水を加えて20
μとし、65℃、３分間インキュベートした後、室温に
戻した。これに0.3Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.3）−80m
M MgCl2−0.3M KCl−3mMジチオスレイトールを４μ
加え、これにオリゴ（dT）テイルドpcDV1プラスミドプ
ライマー（ファルマシア社製）を２μｇ（３μ）、そ
してそれぞれ25mM濃度のdATP、dTTP、dGTP、dCTPの混合
液を４μ、そして［α−32P］dCTP 10mCi/mlを２μ
、そして水を３μ加えた後、18単位／μの逆転写
酵素（生化学工業社製）を４μ加え、42℃、１時間イ
ンキュベートして酵素反応を行ない、４μの0.25M E
DTAと２μの10％SDSとを加え反応を停止した後、フェ
ノール・クロロホルム抽出を行ない水層を取り、40μ
の4M酢酸アンモニウム、160μのエタノールを加え、
ドライアイス中15分間冷却した。これを室温に戻してか
らマイクロ遠心機で10分間遠心し、上清を除いた後、ペ
レットを20μの水に溶解し、20μの4M酢酸アンモニ
ウム、80μのエタノールを加え、再度エタノール沈殿
を行なった。ペレットをエタノールで洗滌し乾燥させた
後、10μの水に溶かした。これに、２μの1.4Mカコ
ジル酸ナトリウム−0.3Mトリス・塩酸緩衝液（pH6.8）
−1mMジチオスレイトール、１μの200μg/mlポリアデ
ニル酸（生化学工業社製）、１μの20mM COCl2、1.4
μの1mM dCTP、0.5μの［α−32P］dCTP 400Ci/m
mol（10mCi/ml）を順次加え、さらに水を加えて20μ
とした後、27単位／μのターミナルヌクレオチオジル
トランスフェラーゼを0.8μ加え、37℃、５分間イン
キュベートし、氷中で酵素反応を止めた。末端付加した
dCMP残基数は、平均12と推算された。これからフェノー
ル・クロロフォルム抽出法と２回のエタノール沈殿法に
より核酸を回収した。
lのpoly（Ａ）+RNAを５μ入れ、これに水を加えて20
μとし、65℃、３分間インキュベートした後、室温に
戻した。これに0.3Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.3）−80m
M MgCl2−0.3M KCl−3mMジチオスレイトールを４μ
加え、これにオリゴ（dT）テイルドpcDV1プラスミドプ
ライマー（ファルマシア社製）を２μｇ（３μ）、そ
してそれぞれ25mM濃度のdATP、dTTP、dGTP、dCTPの混合
液を４μ、そして［α−32P］dCTP 10mCi/mlを２μ
、そして水を３μ加えた後、18単位／μの逆転写
酵素（生化学工業社製）を４μ加え、42℃、１時間イ
ンキュベートして酵素反応を行ない、４μの0.25M E
DTAと２μの10％SDSとを加え反応を停止した後、フェ
ノール・クロロホルム抽出を行ない水層を取り、40μ
の4M酢酸アンモニウム、160μのエタノールを加え、
ドライアイス中15分間冷却した。これを室温に戻してか
らマイクロ遠心機で10分間遠心し、上清を除いた後、ペ
レットを20μの水に溶解し、20μの4M酢酸アンモニ
ウム、80μのエタノールを加え、再度エタノール沈殿
を行なった。ペレットをエタノールで洗滌し乾燥させた
後、10μの水に溶かした。これに、２μの1.4Mカコ
ジル酸ナトリウム−0.3Mトリス・塩酸緩衝液（pH6.8）
−1mMジチオスレイトール、１μの200μg/mlポリアデ
ニル酸（生化学工業社製）、１μの20mM COCl2、1.4
μの1mM dCTP、0.5μの［α−32P］dCTP 400Ci/m
mol（10mCi/ml）を順次加え、さらに水を加えて20μ
とした後、27単位／μのターミナルヌクレオチオジル
トランスフェラーゼを0.8μ加え、37℃、５分間イン
キュベートし、氷中で酵素反応を止めた。末端付加した
dCMP残基数は、平均12と推算された。これからフェノー
ル・クロロフォルム抽出法と２回のエタノール沈殿法に
より核酸を回収した。
この核酸を40μの10mMトリス・塩酸（pH8.0）−60m
M NaCl−10mM MgCl2−1mM2−メルカプトエタノール溶
液に溶解し、Hind III制限酵素を10単位加え、37℃、３
時間インキュベートした後、フェノール・クロロホルム
抽出、２回のエタノール沈殿によりDNAを回収し、エタ
ノールで洗滌・乾燥した後、10μのTE緩衝液に溶解し
た。これに５μの2M NaCl、81μのTE緩衝液、４μ
の市販の３′−オリゴ（dG）テイルドpL1リンカー
（ファルマシア社製）を順次加えた後、65℃、５分間、
次に42℃、１時間加温した後、水冷した。これに100μ
の0.2トリス・塩酸緩衝液（pH7.5）−40mM MgCl2−
0.1硫酸アンモニウム−1M KCl、７μの14mM β−NA
D、50μの1mg/mlウシ血清アルブミン溶液、６μの1
mg/ml E.coli DNAリガーゼを順次加え、水を加えて1m
lとし、12℃一晩インキュベートした。
M NaCl−10mM MgCl2−1mM2−メルカプトエタノール溶
液に溶解し、Hind III制限酵素を10単位加え、37℃、３
時間インキュベートした後、フェノール・クロロホルム
抽出、２回のエタノール沈殿によりDNAを回収し、エタ
ノールで洗滌・乾燥した後、10μのTE緩衝液に溶解し
た。これに５μの2M NaCl、81μのTE緩衝液、４μ
の市販の３′−オリゴ（dG）テイルドpL1リンカー
（ファルマシア社製）を順次加えた後、65℃、５分間、
次に42℃、１時間加温した後、水冷した。これに100μ
の0.2トリス・塩酸緩衝液（pH7.5）−40mM MgCl2−
0.1硫酸アンモニウム−1M KCl、７μの14mM β−NA
D、50μの1mg/mlウシ血清アルブミン溶液、６μの1
mg/ml E.coli DNAリガーゼを順次加え、水を加えて1m
lとし、12℃一晩インキュベートした。
この反応液に、それぞれが25mMのdATP、dGTP、dTTP、
dCTP混合液を２μ、14mM β−NADを３μ、35単位
／μのE.coli DNAポリメラーゼＩ（宝酒造（株）
製）を0.7μ、2.5単位／μのE.coil RNaseH（宝酒
造（株）製）を2.4μ、1mg/mlのE.coli DNAリガーゼ
を４μを順次加え、12℃、１時間、次に25℃、１時間
インキュベートした後、−20℃で保存した。これの100
μを文献５の方法でコンピテント化したE.coli MC10
61（文献６）懸濁液に1mlに加えて形質転換反応を行な
った後、100μg/mlのアンピシリンを含んだLB培地250ml
に移し、37℃で一晩培養し、このうちの10mlにDMSOを0.
7ml加え、cDNAライブラリーとし、−80℃で保存した。
dCTP混合液を２μ、14mM β−NADを３μ、35単位
／μのE.coli DNAポリメラーゼＩ（宝酒造（株）
製）を0.7μ、2.5単位／μのE.coil RNaseH（宝酒
造（株）製）を2.4μ、1mg/mlのE.coli DNAリガーゼ
を４μを順次加え、12℃、１時間、次に25℃、１時間
インキュベートした後、−20℃で保存した。これの100
μを文献５の方法でコンピテント化したE.coli MC10
61（文献６）懸濁液に1mlに加えて形質転換反応を行な
った後、100μg/mlのアンピシリンを含んだLB培地250ml
に移し、37℃で一晩培養し、このうちの10mlにDMSOを0.
7ml加え、cDNAライブラリーとし、−80℃で保存した。
（２） クローニング こうして作製したcDNAライブラリーの菌液の１部を、
10個の9cmLBプレートのそれぞれにコロニーが1,000〜2,
000個生じるように撒き、37℃で一晩培養した後、それ
ぞれのシャーレごとに生育したコロニーをかき集め、そ
れぞれ10mlのLB培地に懸濁し、この菌液の3mlを0.21ml
のDMSOと混ぜて凍結保存し、残りの菌液をそれぞれ100
μg/mlのアンピシリンを含んだ100mlのLB培地と混ぜ、3
7℃で一晩培養した。それぞれの培養液から菌体を集
め、文献３の方法でプラスミドを抽出・精製した。これ
らのプラスミドの30μｇずつにつき、DEAEデキストラン
・トランスフェクション法を用いて、9cmシャーレ内で
コンフルエントにまで増殖したCOS1細胞（文献７）にト
ランジェント・エクスプレション（transient expressi
on）を試み、それぞれのプラスミドDNAサンプルのFeIFN
生産能を調べた。
10個の9cmLBプレートのそれぞれにコロニーが1,000〜2,
000個生じるように撒き、37℃で一晩培養した後、それ
ぞれのシャーレごとに生育したコロニーをかき集め、そ
れぞれ10mlのLB培地に懸濁し、この菌液の3mlを0.21ml
のDMSOと混ぜて凍結保存し、残りの菌液をそれぞれ100
μg/mlのアンピシリンを含んだ100mlのLB培地と混ぜ、3
7℃で一晩培養した。それぞれの培養液から菌体を集
め、文献３の方法でプラスミドを抽出・精製した。これ
らのプラスミドの30μｇずつにつき、DEAEデキストラン
・トランスフェクション法を用いて、9cmシャーレ内で
コンフルエントにまで増殖したCOS1細胞（文献７）にト
ランジェント・エクスプレション（transient expressi
on）を試み、それぞれのプラスミドDNAサンプルのFeIFN
生産能を調べた。
すなわち、9cmシャーレ内でCOS1細胞を10％FBSを含む
RPMI1640（GIBCO社製）培地20ml中でコンフルエントに
なるまで増殖させた後、培地を除去して、7.5μg/mlの
プラスミドDNAサンプル、50mMトリス・塩酸緩衝液（pH
7.4）、400μg/mlDEAE−デキストラン（ファルマシア社
製）を含むRPMI1640培地4mlをシャーレ内に入れ、37
℃、４時間、さらに培養を続けた。次に、150μＭクロ
ロキンを含むPRMI1640培地4mlに交換し、37℃、３時間
培養した後、さらに10％FBSを含むRPMI1640培地に交換
し、37℃、３日間培養を続け、培地中の抗ウィルス活性
を調べた。以上のRPMI1640培地には、いずれも100単位/
mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシ
ンを添加して用いた。
RPMI1640（GIBCO社製）培地20ml中でコンフルエントに
なるまで増殖させた後、培地を除去して、7.5μg/mlの
プラスミドDNAサンプル、50mMトリス・塩酸緩衝液（pH
7.4）、400μg/mlDEAE−デキストラン（ファルマシア社
製）を含むRPMI1640培地4mlをシャーレ内に入れ、37
℃、４時間、さらに培養を続けた。次に、150μＭクロ
ロキンを含むPRMI1640培地4mlに交換し、37℃、３時間
培養した後、さらに10％FBSを含むRPMI1640培地に交換
し、37℃、３日間培養を続け、培地中の抗ウィルス活性
を調べた。以上のRPMI1640培地には、いずれも100単位/
mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシ
ンを添加して用いた。
その結果、10種の培養液のうち、20単位/ml以上の抗
ウィルス活性を示すものが３種あったため、該当凍結保
存菌液の中から、抗ウィルス活性生産性をCOS1細胞に賦
与するプラスミドを有する大腸菌を次のようにして探し
出した。
ウィルス活性を示すものが３種あったため、該当凍結保
存菌液の中から、抗ウィルス活性生産性をCOS1細胞に賦
与するプラスミドを有する大腸菌を次のようにして探し
出した。
すなわち、当該活性を生じさせるプラスミドを有する
３種凍結保存菌液の１種を希釈し、プレート当り約600
個のコロニーを生じるよう10枚の100μg/mlアンピシリ
ンを含んだLBプレートに撒き、37℃、一晩培養した後、
保存プレートとしてのレプリカを作った後、各プレート
ごとに菌体をかき取り、5mlのLB培地に懸濁してから100
μg/mlのアンピシリンを含んだ100mlのLB培地と混ぜ、3
7℃で一晩培養し、菌体を集めプラスミドを抽出・精製
した。これら10種のプラスミドをシャーレ当り20μｇず
つ用い、DEAE−デキストラン法でCOS1細胞によるトラン
ジェント・エクスプレションをさせ、FeIFN生産能を調
べた。
３種凍結保存菌液の１種を希釈し、プレート当り約600
個のコロニーを生じるよう10枚の100μg/mlアンピシリ
ンを含んだLBプレートに撒き、37℃、一晩培養した後、
保存プレートとしてのレプリカを作った後、各プレート
ごとに菌体をかき取り、5mlのLB培地に懸濁してから100
μg/mlのアンピシリンを含んだ100mlのLB培地と混ぜ、3
7℃で一晩培養し、菌体を集めプラスミドを抽出・精製
した。これら10種のプラスミドをシャーレ当り20μｇず
つ用い、DEAE−デキストラン法でCOS1細胞によるトラン
ジェント・エクスプレションをさせ、FeIFN生産能を調
べた。
その結果、10種のプラスミドサンプルのうちの１種に
該生産能が認められたため、該当する保存プレートのコ
ロニー593個を別のアンピシリン含有LBプレートに爪楊
枝で約100個ずつ移植し、37℃、一晩培養した後、各プ
レートごとに菌体をかき取り、100mlのアンピシリン含
有LB培地中で一晩培養し、集めた菌体からプラスミドを
抽出・精製し、トランジェント・エクスプレション法に
より各プラスミドの該抗ウィルス活性生産能を調べた。
該生産能が認められたため、該当する保存プレートのコ
ロニー593個を別のアンピシリン含有LBプレートに爪楊
枝で約100個ずつ移植し、37℃、一晩培養した後、各プ
レートごとに菌体をかき取り、100mlのアンピシリン含
有LB培地中で一晩培養し、集めた菌体からプラスミドを
抽出・精製し、トランジェント・エクスプレション法に
より各プラスミドの該抗ウィルス活性生産能を調べた。
その結果、１つのプラスミドサンプルに該生産能が認
められたため、該当する保存プレート中のコロニー100
個を各々2ml LB培地で培養し、プラスミドを抽出し、ト
ランジェント・エクスプレション法で各プラスミドの抗
ウィルス活性生産能を測定した。該生産能の最も高いプ
ラスミドをpFeIFN1、これを含有する大腸菌をE.coli（p
FeIFN1）と名付け、菌は微工研に寄託した（微工研条寄
第1633号）。
められたため、該当する保存プレート中のコロニー100
個を各々2ml LB培地で培養し、プラスミドを抽出し、ト
ランジェント・エクスプレション法で各プラスミドの抗
ウィルス活性生産能を測定した。該生産能の最も高いプ
ラスミドをpFeIFN1、これを含有する大腸菌をE.coli（p
FeIFN1）と名付け、菌は微工研に寄託した（微工研条寄
第1633号）。
（３） 抗ウィルス活性測定法 ウィルスはVesicular Stomatitis Virus、感受性細胞
はネコFC9（文献１）を用い、CPE法に従って抗ウィルス
活性を測定した。スタンダードリフェランスとして、NI
Hのヒトの天然型αIFN換算したHuIFNαを用いた。
はネコFC9（文献１）を用い、CPE法に従って抗ウィルス
活性を測定した。スタンダードリフェランスとして、NI
Hのヒトの天然型αIFN換算したHuIFNαを用いた。
（４） FeIFNをコードするDNAを含む組換えプラスミド
の作製 （Ａ）形質転換大腸菌E.coli（pFeIF1）（微工研条寄第
1633号）から文献３の方法で抽出したプラスミドpFeIFN
1 20μｇを制限酵素SfaN I、Hinc IIで完全分解し、得
られた複数のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
け、約750bpのDNA断片をエレクトロエリューションで取
り出し、約２μｇを回収した。こうして、FeIFNをコー
ドするDNAを含むSfaN I−Hinc II断片を得た。
の作製 （Ａ）形質転換大腸菌E.coli（pFeIF1）（微工研条寄第
1633号）から文献３の方法で抽出したプラスミドpFeIFN
1 20μｇを制限酵素SfaN I、Hinc IIで完全分解し、得
られた複数のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
け、約750bpのDNA断片をエレクトロエリューションで取
り出し、約２μｇを回収した。こうして、FeIFNをコー
ドするDNAを含むSfaN I−Hinc II断片を得た。
クローニングベクターpBM030（文献２）５μｇを制限
酵素Bgl II、Sma Iで完全分解し、上記のSfaN I−Hinc
II断片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反
応液をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造
（株）製）と混合し、形質転換を行なった。100μg/ml
のアンピシリンを含むLBプレート上に生育するコロニー
の中から、アルカリミニスクリーン法で抽出したプラス
ミドのHind IIIでの制限分析により、クローニングベク
ターpBM030に約750bpのDNA断片が組み込まれているプラ
スミドを得た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNA
の開始コドンを含む約100baseのDNAシーケンスを行なっ
て、pBM030にFeIFNをコードするDNAが組込まれているプ
ラスミドを得た。この組換え体プラスミドをpBmFeIFN1
とした。pBmFeIFN1の作製法を第２図に示す。
酵素Bgl II、Sma Iで完全分解し、上記のSfaN I−Hinc
II断片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反
応液をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造
（株）製）と混合し、形質転換を行なった。100μg/ml
のアンピシリンを含むLBプレート上に生育するコロニー
の中から、アルカリミニスクリーン法で抽出したプラス
ミドのHind IIIでの制限分析により、クローニングベク
ターpBM030に約750bpのDNA断片が組み込まれているプラ
スミドを得た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNA
の開始コドンを含む約100baseのDNAシーケンスを行なっ
て、pBM030にFeIFNをコードするDNAが組込まれているプ
ラスミドを得た。この組換え体プラスミドをpBmFeIFN1
とした。pBmFeIFN1の作製法を第２図に示す。
（Ｂ）プラスミドpFeIFN1 100μｇを制限酵素Hinc II
で完全分解後、バクテリアアルカリホスファターゼ（BA
P）処理し、次いで制限酵素Bgl Iで完全分解し、得られ
た複数のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約7
00bpのDNA断片をエレクトロエリューションで取り出
し、約10μｇを回収した。こうしてFeIFNをコードするD
NAを含むBgl I−Hinc II断片を得た。
で完全分解後、バクテリアアルカリホスファターゼ（BA
P）処理し、次いで制限酵素Bgl Iで完全分解し、得られ
た複数のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約7
00bpのDNA断片をエレクトロエリューションで取り出
し、約10μｇを回収した。こうしてFeIFNをコードするD
NAを含むBgl I−Hinc II断片を得た。
次に、開始コドンATGの上流3bpに平滑末端を持ち、下
流側がBgl I部位までになる２本鎖DNAを合成した。すな
わち、34mer（GGGCCACCAAGAAGGAAGAGGGCAGCGCCATATT）
と37mer（AATATGGCGCTGCCCTCTTCCTTCTTGGTGGCCCTGG）の
２種のオリゴマーをApplied Biosystems社製のDNAシン
セサイザーで合成し、34merオリゴマーをT4ポリヌクレ
オチドキナーゼでカイネーシング後、２種のオリゴマー
を90℃で５分間加温し、徐々に冷却してアニーリングし
た。
流側がBgl I部位までになる２本鎖DNAを合成した。すな
わち、34mer（GGGCCACCAAGAAGGAAGAGGGCAGCGCCATATT）
と37mer（AATATGGCGCTGCCCTCTTCCTTCTTGGTGGCCCTGG）の
２種のオリゴマーをApplied Biosystems社製のDNAシン
セサイザーで合成し、34merオリゴマーをT4ポリヌクレ
オチドキナーゼでカイネーシング後、２種のオリゴマー
を90℃で５分間加温し、徐々に冷却してアニーリングし
た。
上記で得たBgl I−Hinc II断片と２本鎖合成DNAオリ
ゴマーをT4DNAリガーゼによってライゲーションし、次
いでアガロースゲル電気泳動を行ない、約740bpの断片
をエレクトロエリューションで分取し、FeIFNをコード
するDNAを含む断片を作製した。
ゴマーをT4DNAリガーゼによってライゲーションし、次
いでアガロースゲル電気泳動を行ない、約740bpの断片
をエレクトロエリューションで分取し、FeIFNをコード
するDNAを含む断片を作製した。
クローニングベクターpBM030を制限酵素Bgl IIで切断
後、ムングビーンヌクレアーゼにより平滑末端とし、次
いでセルフライゲーションを防ぐためにBAP処理した。F
eIFN遺伝子を含む断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼで
カイネーシング後、ベクターDNAとT4DNAリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したE.co
li HB101と混合し、形質転換を行なった。100μg/mlの
アンピリシンを含むLBプレート上に生育するコロニーの
中から、FeIFNをコードするDNAを含む上記Bgl I−Hinc
II断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼ
ーション、次いでアルカリミニスクリーン法で抽出した
プラスミドのBamH I、Bgl IIでの制限分析により、約74
0bpのDNA断片を組込んでいるクローンを得た。文献３の
方法で抽出したプラスミドのFeIFNをコードするDNAの開
始コドンATGを含む約100baseのDNAシーケンスを行なっ
て、目的のプラスミドを得た。これらの組換え体プラス
ミドをpBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２、pBmFeIFN2−３
とした。これら３種の組換え体プラスミドの作製法を第
３図に示す。
後、ムングビーンヌクレアーゼにより平滑末端とし、次
いでセルフライゲーションを防ぐためにBAP処理した。F
eIFN遺伝子を含む断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼで
カイネーシング後、ベクターDNAとT4DNAリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したE.co
li HB101と混合し、形質転換を行なった。100μg/mlの
アンピリシンを含むLBプレート上に生育するコロニーの
中から、FeIFNをコードするDNAを含む上記Bgl I−Hinc
II断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼ
ーション、次いでアルカリミニスクリーン法で抽出した
プラスミドのBamH I、Bgl IIでの制限分析により、約74
0bpのDNA断片を組込んでいるクローンを得た。文献３の
方法で抽出したプラスミドのFeIFNをコードするDNAの開
始コドンATGを含む約100baseのDNAシーケンスを行なっ
て、目的のプラスミドを得た。これらの組換え体プラス
ミドをpBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２、pBmFeIFN2−３
とした。これら３種の組換え体プラスミドの作製法を第
３図に示す。
（Ａ）、（Ｂ）で作製した組換え体プラスミド、pBmF
eIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２およびpBmFeIFN2
−３のFeIFNをコードするDNAの開始コドンATG周辺の塩
基配列を第４図に示す。
eIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２およびpBmFeIFN2
−３のFeIFNをコードするDNAの開始コドンATG周辺の塩
基配列を第４図に示す。
（５） FeIFNをコードするDNAで組換えられた組換えカ
イコ核多角体病ウィルスの作製 文献２の方法で組換え体ウィルスを作製した。すなわ
ち、50mM HEPESバッファーpH7.1、0.28M NaCl、0.7mM
Na2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液に、2.
5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体病ウィ
ルスBmNPV T3株（文献２）のDNA10μｇ、組換え体プラ
スミドpBmFeIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２、pBm
FeIFN2−３のDNAそれぞれ65μｇずつ別々に含む）を滴
下し、生じた懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したT
C−10培地（文献４）中、25cm2のフラスコで平面培養し
た約３×105個のBM−Ｎ細胞（文献２）の培養基に加
え、カイコ細胞にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培
地と交換し、さらに５日間培養後、培養液を回収した。
その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に
培養したBM−Ｎ細胞の培養基に添加して７日間培養後、
顕微鏡観察によりウィルス感染が見られ、かつ多角体が
形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
イコ核多角体病ウィルスの作製 文献２の方法で組換え体ウィルスを作製した。すなわ
ち、50mM HEPESバッファーpH7.1、0.28M NaCl、0.7mM
Na2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液に、2.
5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体病ウィ
ルスBmNPV T3株（文献２）のDNA10μｇ、組換え体プラ
スミドpBmFeIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２、pBm
FeIFN2−３のDNAそれぞれ65μｇずつ別々に含む）を滴
下し、生じた懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したT
C−10培地（文献４）中、25cm2のフラスコで平面培養し
た約３×105個のBM−Ｎ細胞（文献２）の培養基に加
え、カイコ細胞にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培
地と交換し、さらに５日間培養後、培養液を回収した。
その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に
培養したBM−Ｎ細胞の培養基に添加して７日間培養後、
顕微鏡観察によりウィルス感染が見られ、かつ多角体が
形成していない培養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を２回繰り返すことによって組換え体ウィ
ルスをクローニングし、ここで作製したFeIFNをコード
するDNAを含む組換え体ウィルスを、それぞれBmFeIFN
1、BmFeIFN2−１、BmFeIFN2−２、BmFeIFN2−３とし
た。BmFeIFN1は、European Collection of Animal Cell
Cuturesにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ac
cession No.V89062701）。
ルスをクローニングし、ここで作製したFeIFNをコード
するDNAを含む組換え体ウィルスを、それぞれBmFeIFN
1、BmFeIFN2−１、BmFeIFN2−２、BmFeIFN2−３とし
た。BmFeIFN1は、European Collection of Animal Cell
Cuturesにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ac
cession No.V89062701）。
（６） 組換え体ウィルス液の調製 75cm2のフラスコ底面で、15mlの10％FBSを含むTC−10
培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記
（５）でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM−
Ｎ細胞の培養液４種を、それぞれ50μずつ別々のBM−
Ｎ細胞に添加して、27℃で５日間培養後、培養液を3,00
0rpmで５分間遠心分離して遠心上清を組換え体ウィルス
液として得た。それぞれのウィルス液を10-7希釈し、そ
の1mlをBM−Ｎ細胞の培養基に添加して27℃で７日間培
養を続けると、顕微鏡観察によっていずれの培養基のBM
−Ｎ細胞にもウィルス感染が認められた。
培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記
（５）でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM−
Ｎ細胞の培養液４種を、それぞれ50μずつ別々のBM−
Ｎ細胞に添加して、27℃で５日間培養後、培養液を3,00
0rpmで５分間遠心分離して遠心上清を組換え体ウィルス
液として得た。それぞれのウィルス液を10-7希釈し、そ
の1mlをBM−Ｎ細胞の培養基に添加して27℃で７日間培
養を続けると、顕微鏡観察によっていずれの培養基のBM
−Ｎ細胞にもウィルス感染が認められた。
（７） カイコ樹立細胞でのFeIFNの生産 前記（６）項で得た４種の組換え体ウィルス液を、そ
れぞれ別々に0.5mlずつ、25cm2のフラスコで10％のFBS
を含むTC−10培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ
細胞に加えた。30分後、新鮮な5mlの10％のFBSを含むTC
−10培地と交換し、27℃で３日間培養した。培養液の遠
心上清をとり、抗ウィルス活性を調べた。結果を表−１
に示す。
れぞれ別々に0.5mlずつ、25cm2のフラスコで10％のFBS
を含むTC−10培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ
細胞に加えた。30分後、新鮮な5mlの10％のFBSを含むTC
−10培地と交換し、27℃で３日間培養した。培養液の遠
心上清をとり、抗ウィルス活性を調べた。結果を表−１
に示す。
（８） 血清を含まない培地で生育したカイコ樹立細胞
中でのFeIFNの生産 FBSの代わりに4g/酵母エキス、1g/プルロニック
ポリオールＦ−68（BASF社製）、10mg/タラ油、25mg/
ツィーン80、4.5mg/コレステトール、2mg/酢酸ト
コフェロールを添加したTC−10培地で、25cm2フラスコ
で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記（６）
項で調製した組換え体ウィルスBmFeIFN1のウィルス液0.
5mlを添加した。30分後、新鮮な上記の培地と交換し、2
7℃で３日間培養し、培養液を回収し、遠心上清の抗ウ
ィルス活性を調べた。5.8×105単位/ml（培養液）のFeI
FNが生産されていた。
中でのFeIFNの生産 FBSの代わりに4g/酵母エキス、1g/プルロニック
ポリオールＦ−68（BASF社製）、10mg/タラ油、25mg/
ツィーン80、4.5mg/コレステトール、2mg/酢酸ト
コフェロールを添加したTC−10培地で、25cm2フラスコ
で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記（６）
項で調製した組換え体ウィルスBmFeIFN1のウィルス液0.
5mlを添加した。30分後、新鮮な上記の培地と交換し、2
7℃で３日間培養し、培養液を回収し、遠心上清の抗ウ
ィルス活性を調べた。5.8×105単位/ml（培養液）のFeI
FNが生産されていた。
（９） 浮遊培養のカイコ樹立細胞中でのFeIFNの生産 10％のFBSを含むTC−10培地150mlを500ml容量のスピ
ナーフラスコに入れ、80rpmの撹拌速度、27℃でBM−Ｎ
細胞を培養した。細胞密度が5.3×105個/mlのとき、前
記（６）項で得た組換え体ウィルスBmFeIFN1のウィルス
液1mlを添加し、27℃で４日間浮遊培養を続けた後、培
養液を回収し、遠心上清の抗ウィルス活性を調べた。2.
1×105単位/ml（培養液）のFeIFNが生産されていた。
ナーフラスコに入れ、80rpmの撹拌速度、27℃でBM−Ｎ
細胞を培養した。細胞密度が5.3×105個/mlのとき、前
記（６）項で得た組換え体ウィルスBmFeIFN1のウィルス
液1mlを添加し、27℃で４日間浮遊培養を続けた後、培
養液を回収し、遠心上清の抗ウィルス活性を調べた。2.
1×105単位/ml（培養液）のFeIFNが生産されていた。
（10） カイコ生体中でのFeIFNの生産 ５令１日目のカイコ幼虫に、前記（６）項で得た４種
の組換え体ウィルスのウィルス液をそれぞれ50μ／頭
ずつ別々に注射し、25℃で４日間、市販の人工飼料（ビ
タシルク販売（株）製）を与えて飼育後、尾脚を切り、
体液を氷冷したエッペンドルフ・チューブに採取し、遠
心し、上清を得、抗ウィルス活性を調べた。結果を表−
１に示す。
の組換え体ウィルスのウィルス液をそれぞれ50μ／頭
ずつ別々に注射し、25℃で４日間、市販の人工飼料（ビ
タシルク販売（株）製）を与えて飼育後、尾脚を切り、
体液を氷冷したエッペンドルフ・チューブに採取し、遠
心し、上清を得、抗ウィルス活性を調べた。結果を表−
１に示す。
実施例２ （１） FeIFNをコードするDNAを含む組換えプラスミド
の作製 第１図に示したプラスミドpFeIFN1から、第５図に示
す方法でFeIFNをコードするDNAを含む組換えプラスミド
を作製した。
の作製 第１図に示したプラスミドpFeIFN1から、第５図に示
す方法でFeIFNをコードするDNAを含む組換えプラスミド
を作製した。
すなわち、プラスミドpFeIFN1 50μｇを制限酵素Xho
Iで完全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動で分け、約1.2kbのDNA断片をエレクトロエ
リューションで取り出し、約10μｇを回収した。次に、
このDNA断片10μｇを制限酵素SfaN IとHinc IIで完全分
解し、得られたDNA断片のうち約750bpのものを同様にし
て約３μｇ回収した。こうしてFeIFN構造遺伝子を含むS
faN I−Hinc II断片を得た。この断片と制限酵素BamH I
とHinc IIとで切断した市販のpUC18（宝酒造（株）製）
の断片とを、T4DNAリガーゼで連結し、pUCIFN4を作製し
た。pUCIFN4 25μｇを制限酵素BamH I、Hicn IIで完全
分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース電気泳動
で分け、約0.7kbのDNA断片をエレクトロエリューション
で取り出し、約２μｇを回収した。
Iで完全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動で分け、約1.2kbのDNA断片をエレクトロエ
リューションで取り出し、約10μｇを回収した。次に、
このDNA断片10μｇを制限酵素SfaN IとHinc IIで完全分
解し、得られたDNA断片のうち約750bpのものを同様にし
て約３μｇ回収した。こうしてFeIFN構造遺伝子を含むS
faN I−Hinc II断片を得た。この断片と制限酵素BamH I
とHinc IIとで切断した市販のpUC18（宝酒造（株）製）
の断片とを、T4DNAリガーゼで連結し、pUCIFN4を作製し
た。pUCIFN4 25μｇを制限酵素BamH I、Hicn IIで完全
分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース電気泳動
で分け、約0.7kbのDNA断片をエレクトロエリューション
で取り出し、約２μｇを回収した。
次に、市販のM13mp19RFDNA（宝酒造（株）製）５μｇ
を制限酵素Bgl Iで完全分解し、次いでT4DNAポリメラー
ゼで３′末端を平滑末端にした後、T4DNAリガーゼで連
結し、Bgl I切断部位を欠いたM13ベクターを作製した。
このベクターを制限酵素BamH I、Hinc IIで完全分解
後、前述の0.7kbのBamH I−Hinc II断片とT4DNAリガー
ゼで連結した。この組換えDNA10μｇを制限酵素Bgl I、
EcoO109Iで完全分解し、バクテリアアルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造（株）製）で反応後、アガロース電気泳動
で分け、約7.9kbのDNA断片をエレクトロエリューション
で取り出した。
を制限酵素Bgl Iで完全分解し、次いでT4DNAポリメラー
ゼで３′末端を平滑末端にした後、T4DNAリガーゼで連
結し、Bgl I切断部位を欠いたM13ベクターを作製した。
このベクターを制限酵素BamH I、Hinc IIで完全分解
後、前述の0.7kbのBamH I−Hinc II断片とT4DNAリガー
ゼで連結した。この組換えDNA10μｇを制限酵素Bgl I、
EcoO109Iで完全分解し、バクテリアアルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造（株）製）で反応後、アガロース電気泳動
で分け、約7.9kbのDNA断片をエレクトロエリューション
で取り出した。
次に、Bgl I部位からEcoO109I部位までになる２本鎖D
NAを合成した。すなわち、Apllied Biosystems社製のDN
Aシンセサイザーで合成した。
NAを合成した。すなわち、Apllied Biosystems社製のDN
Aシンセサイザーで合成した。
41mer（TGGCGCTGGGCTGCAACTCCGTCTGCGTGCTGGGCTGTGA
C）と32mer（CTGCCTCAGACCCACGGCCTGCTGAACAGGAG）と38
mer（GCCCAGCACGCAGACGGAGTTGCAGCCCAGCGCCACCA）と41m
er（GCCCTCCTGTTCAGCAGGCCGTGGGTCTGAGGCAGGTCACA）の
４種のオリゴマーを混合し、T4ポリヌクレオキドキナー
ゼ（宝酒造（株）製）でカイネーシング後、90℃で２分
間加熱したあと、放冷することによってアニーリングし
た。この２本鎖DNAと上記で得た約7.9kbのBgl I−EcoO1
09I断片とを、T4DNAリガーゼで連結した。20μｇを制限
酵素BamH I、Hinc IIで完全分解し、得られた複数のDNA
断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約750bpのDNA断
片をエレクトロエリューションで取り出し、約２μｇを
回収した。こうしてFeIFNをコードするDNAを含むBamH I
−Hinc II断片を得た。
C）と32mer（CTGCCTCAGACCCACGGCCTGCTGAACAGGAG）と38
mer（GCCCAGCACGCAGACGGAGTTGCAGCCCAGCGCCACCA）と41m
er（GCCCTCCTGTTCAGCAGGCCGTGGGTCTGAGGCAGGTCACA）の
４種のオリゴマーを混合し、T4ポリヌクレオキドキナー
ゼ（宝酒造（株）製）でカイネーシング後、90℃で２分
間加熱したあと、放冷することによってアニーリングし
た。この２本鎖DNAと上記で得た約7.9kbのBgl I−EcoO1
09I断片とを、T4DNAリガーゼで連結した。20μｇを制限
酵素BamH I、Hinc IIで完全分解し、得られた複数のDNA
断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約750bpのDNA断
片をエレクトロエリューションで取り出し、約２μｇを
回収した。こうしてFeIFNをコードするDNAを含むBamH I
−Hinc II断片を得た。
クローニングベクターpBM030（文献２）５μｇを制限
酵素Bgl II、Sma Iで完全分解し、上記のBamH I−Hinc
II断片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反
応液をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造
（株）製）と混合し、形質転換を行なった。100μg/ml
のアンピシリンを含むLBプレート上に生育するコロニー
の中から、アルカリミニスクリーン法で抽出したプラス
ミドのHind IIIでの制限分析により、クローニングベク
ターpBM030に約750bpのDNA断片が組込まれているプラス
ミドを得た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNAの
シーケンスを行なって、pBM030にFeIFNをコードするDNA
が組込まれているプラスミドを得た。この組換え体プラ
スミドをpYU871とした。pYU871のFeIFNをコードするDNA
の塩基配列を第６図に示す。
酵素Bgl II、Sma Iで完全分解し、上記のBamH I−Hinc
II断片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反
応液をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造
（株）製）と混合し、形質転換を行なった。100μg/ml
のアンピシリンを含むLBプレート上に生育するコロニー
の中から、アルカリミニスクリーン法で抽出したプラス
ミドのHind IIIでの制限分析により、クローニングベク
ターpBM030に約750bpのDNA断片が組込まれているプラス
ミドを得た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNAの
シーケンスを行なって、pBM030にFeIFNをコードするDNA
が組込まれているプラスミドを得た。この組換え体プラ
スミドをpYU871とした。pYU871のFeIFNをコードするDNA
の塩基配列を第６図に示す。
（２） FeIFNをコードするDNAで組換えられた組換えカ
イコ核多角体病ウィルスの作製 文献２の方法で組換え体ウィルスを作製した。すなわ
ち、50mM HEPESバッファーpH7.1、0.28M NaCl、0.7mM
Na2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液に、2.
5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体病ウィ
ルスBmNPV T3株（文献２）のDNA10μｇ、組換え体プラ
スミドpYU871のDNA 65μｇを含む）を滴下し、生じた
懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したTC−10培地
（文献４）中、25cm2のフラスコで平面培養した約３×1
05個のBM−Ｎ細胞（文献２）の培養基に加え、カイコ細
胞にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培地と交換し、
さらに５日間培養後、培養液を回収した。その培養液を
遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したBM−
Ｎ細胞の培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察に
よりウィルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
イコ核多角体病ウィルスの作製 文献２の方法で組換え体ウィルスを作製した。すなわ
ち、50mM HEPESバッファーpH7.1、0.28M NaCl、0.7mM
Na2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液に、2.
5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体病ウィ
ルスBmNPV T3株（文献２）のDNA10μｇ、組換え体プラ
スミドpYU871のDNA 65μｇを含む）を滴下し、生じた
懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したTC−10培地
（文献４）中、25cm2のフラスコで平面培養した約３×1
05個のBM−Ｎ細胞（文献２）の培養基に加え、カイコ細
胞にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培地と交換し、
さらに５日間培養後、培養液を回収した。その培養液を
遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したBM−
Ｎ細胞の培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察に
よりウィルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を５回繰り返した後、プラーク法によって
組換え体ウィルスをクローニングした。つまり、60mm径
の培養用プラスチックシャーレに５×106個のBM−Ｎ細
胞を培養し、培養液を取り除いた後にプレート当り0.5m
lのウィルス液を加えて、27℃で１時間保温した後、ウ
ィルス液を除き、0.75％のシー・プラーク・アガロース
（FMC社製）と５％の牛胎児血清を含むTC−10培地を5ml
加え、アガロースを固化させた後、27℃で４〜６日間培
養した。次に上記のアガロースを含む培養液に0.01％の
中性赤を加えたTC−10培地を2.5ml重層し、27℃で１日
保温した。多角体を形成しない透き通ったプラークをパ
スソールピペットとアガロースとで吸いとり、少量の培
養液に浮遊させた後、さらにプラーク純化を２回繰り返
して、組換え体ウィルスをクローニングした。ここで作
製したFeIFNをコードするDNAを含む組換え体ウィルスを
rBNV100とした。
組換え体ウィルスをクローニングした。つまり、60mm径
の培養用プラスチックシャーレに５×106個のBM−Ｎ細
胞を培養し、培養液を取り除いた後にプレート当り0.5m
lのウィルス液を加えて、27℃で１時間保温した後、ウ
ィルス液を除き、0.75％のシー・プラーク・アガロース
（FMC社製）と５％の牛胎児血清を含むTC−10培地を5ml
加え、アガロースを固化させた後、27℃で４〜６日間培
養した。次に上記のアガロースを含む培養液に0.01％の
中性赤を加えたTC−10培地を2.5ml重層し、27℃で１日
保温した。多角体を形成しない透き通ったプラークをパ
スソールピペットとアガロースとで吸いとり、少量の培
養液に浮遊させた後、さらにプラーク純化を２回繰り返
して、組換え体ウィルスをクローニングした。ここで作
製したFeIFNをコードするDNAを含む組換え体ウィルスを
rBNV100とした。
（３） 組換え体ウィルス液の調製 75cm2のフラスコ底面で、15mlの10％FBSを含むTC−10
培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記
（２）項でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM
−Ｎ細胞の培養液50μをBM−Ｎ細胞に添加して、27℃
で５日間培養後、培養液を3,000rpmで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウィルス液として得た。ウィル
ス液を10-7希釈し、その1mlをBM−Ｎ細胞の培養基に添
加して27℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によっ
て培養基のBM−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた。
培地中で平面培養した約３×106のBM−Ｎ細胞に、前記
（２）項でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM
−Ｎ細胞の培養液50μをBM−Ｎ細胞に添加して、27℃
で５日間培養後、培養液を3,000rpmで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウィルス液として得た。ウィル
ス液を10-7希釈し、その1mlをBM−Ｎ細胞の培養基に添
加して27℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によっ
て培養基のBM−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた。
（４） カイコ樹立細胞でのFeIFNの生産 前記（３）項で得た組換え体ウィルス液を0.5ml、25c
m2のフラスコで10％のFBSを含むTC−10培地中で平面培
養した約３×106のBM−Ｎ細胞に加えた。30分後、新鮮
な5mlの10％のFBSを含むTC−10培地と交換し、27℃で３
日間培養した。培養液の遠心上清をとり、抗ウィルス活
性を調べた。結果を表−２に示す。
m2のフラスコで10％のFBSを含むTC−10培地中で平面培
養した約３×106のBM−Ｎ細胞に加えた。30分後、新鮮
な5mlの10％のFBSを含むTC−10培地と交換し、27℃で３
日間培養した。培養液の遠心上清をとり、抗ウィルス活
性を調べた。結果を表−２に示す。
（５） カイコ生体中でのFeIFNの生産 ５令１日目のカイコ幼虫に、前記（３）項で得た組換
え体ウィルスのウィルス液を50μ／頭注射し、25℃で
４日間、市販の人工飼料（ビタシルク販売（株）製）を
与えて飼育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンド
ルフ・チューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィル
ス活性を調べた。結果を表−２に示す。
え体ウィルスのウィルス液を50μ／頭注射し、25℃で
４日間、市販の人工飼料（ビタシルク販売（株）製）を
与えて飼育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンド
ルフ・チューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィル
ス活性を調べた。結果を表−２に示す。
（６） 組換えカイコ核多角体病ウィルスの失活 上記（５）項で得た0.1ml当り４×108TCID50の組換え
カイコ核多角体病ウィルスを含むカイコ体液を、0.1N塩
酸でpH1.5にして４℃で１日保存した。2N NaOH溶液で
中和し、その1mlをBM−Ｎ細胞の培養液に添加したがBM
−Ｎ細胞はウィルス感染しなかった。
カイコ核多角体病ウィルスを含むカイコ体液を、0.1N塩
酸でpH1.5にして４℃で１日保存した。2N NaOH溶液で
中和し、その1mlをBM−Ｎ細胞の培養液に添加したがBM
−Ｎ細胞はウィルス感染しなかった。
塩酸によって組換え体ウィルスを失活させ、NaOH溶液
によって中和したカイコ体液を粗FeIFN溶液とした。
によって中和したカイコ体液を粗FeIFN溶液とした。
（７） ブルー担体を用いたFeIFNの精製 前記（６）項の1.3×106U/mlのFeIFN活性を含み、FeI
FN比活性が4.7×105U/mg蛋白質である粗FeIFN溶液560ml
を、“ブルーセファロース（ファースト・フロータイ
プ）"27mlを含むカラムにかけ、続いてこのカラムを0.5
M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液（pH8）で洗浄
した後、1M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液（pH
8）490mlでFeIFNを溶出した。溶出されたFeIFNは1.4×1
06U/mlのFeIFN活性を含み、比活性3.5×107U/mg蛋白質
であった。このときのFeIFN活性回収率は94％で、比活
性は74倍に上昇した。
FN比活性が4.7×105U/mg蛋白質である粗FeIFN溶液560ml
を、“ブルーセファロース（ファースト・フロータイ
プ）"27mlを含むカラムにかけ、続いてこのカラムを0.5
M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液（pH8）で洗浄
した後、1M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液（pH
8）490mlでFeIFNを溶出した。溶出されたFeIFNは1.4×1
06U/mlのFeIFN活性を含み、比活性3.5×107U/mg蛋白質
であった。このときのFeIFN活性回収率は94％で、比活
性は74倍に上昇した。
（８） 銅キレート担体を用いたFeIFNの精製 前記（７）項のブルー担体からのFeIFN溶出液310ml
を、銅をキレート結合させた“キレーティングセファロ
ーズ"5mlを含むカラムに直接かけ、0.5M塩化ナトリウム
を含む50mM酢酸緩衝液（pH4.2）および0.5M塩化ナトリ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（pH3.9）で洗浄後、0.5M塩
化ナトリウムを含む50mM酢酸緩衝液（pH3.6）33mlでFeI
FNを溶出した。溶出されたFeIFNは1.1×107U/mlのFeIFN
活性を含み、比活性1.2×108U/mg蛋白質であった。この
ときのFeIFN活性回収率は84％で、比活性は3.4倍に上昇
した。
を、銅をキレート結合させた“キレーティングセファロ
ーズ"5mlを含むカラムに直接かけ、0.5M塩化ナトリウム
を含む50mM酢酸緩衝液（pH4.2）および0.5M塩化ナトリ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（pH3.9）で洗浄後、0.5M塩
化ナトリウムを含む50mM酢酸緩衝液（pH3.6）33mlでFeI
FNを溶出した。溶出されたFeIFNは1.1×107U/mlのFeIFN
活性を含み、比活性1.2×108U/mg蛋白質であった。この
ときのFeIFN活性回収率は84％で、比活性は3.4倍に上昇
した。
（９） FeIFNの分子量の決定 前記（８）項で得たFeIFNを用いて、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって、FeIFN分子量を求め
た。
ルアミドゲル電気泳動によって、FeIFN分子量を求め
た。
つまり、４％SDS、10％２−メルカプトエタノールを
含む液中で50分間煮沸したFeIFN １μｇを、アクリル
アミド濃度５％の濃縮ゲルとアクリルアミド濃度15％の
分離ゲルからなるゲルにのせ、BIO−RAD社製のSDS−PAG
E Standards,Low Rangeを分子量マーカーとして、15mA
でATTO社製ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置を用いて
電気泳動した。泳動終了後、ゲルを40％メタノール、10
％酢酸溶液、次いで10％エタノール、５％酢酸溶液中で
それぞれ30分間ずつ振盪した後、0.05％クマシーR250
（バイオラド社製）、25％イソプロピルアルコール、10
％酢酸からなる染色液に浸し、３時間振盪した。10％酢
酸で脱色後、分子量を計算した。FeIFNの分子量は25,00
0であった。
含む液中で50分間煮沸したFeIFN １μｇを、アクリル
アミド濃度５％の濃縮ゲルとアクリルアミド濃度15％の
分離ゲルからなるゲルにのせ、BIO−RAD社製のSDS−PAG
E Standards,Low Rangeを分子量マーカーとして、15mA
でATTO社製ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置を用いて
電気泳動した。泳動終了後、ゲルを40％メタノール、10
％酢酸溶液、次いで10％エタノール、５％酢酸溶液中で
それぞれ30分間ずつ振盪した後、0.05％クマシーR250
（バイオラド社製）、25％イソプロピルアルコール、10
％酢酸からなる染色液に浸し、３時間振盪した。10％酢
酸で脱色後、分子量を計算した。FeIFNの分子量は25,00
0であった。
（10） FeIFNのアミノ酸配列の決定 前記（８）項で得たFeIFN100μｇを用いて、アプライ
ドバイオシステムズ社製アミノ酸シーケンサーによって
Ｎ末端から10個のアミノ酸を決定した。Ｎ末端からの配
列は であった。
ドバイオシステムズ社製アミノ酸シーケンサーによって
Ｎ末端から10個のアミノ酸を決定した。Ｎ末端からの配
列は であった。
次に、前記（８）項で得たFeIFN約1mgをまず逆相HPL
C、つまりThe Sep/a/ra/tions Group社製Vydac C18カラ
ムを用い、30〜50％アセトニトル濃度を20分間の直線的
濃度勾配で高度に精製し、8M尿素存在下でメルカプトエ
タノールでジスルフィド結合を還元し、次いで４−ビニ
ルピリジンでシステインを修飾後、ゲル過によって脱
塩した。2M尿素存在下でリジルエンドペプチターゼで37
℃、１晩消化後、逆相HPLC（Vydac C18カラム、５〜55
％アセトニトル濃度、50分の直線的濃度勾配）で、各ペ
プチドを分取し、さらに最も長いペプチドをトリプシン
で再消化し、逆相HPLCで分取した。各ペプチドを塩酸で
加水分解し、アミノ酸分析計（日立（株）製）によりア
ミノ酸組成分析した。次いでアミノ酸シーケンサーによ
る各ペプチドのアミノ酸配列を分析した。
C、つまりThe Sep/a/ra/tions Group社製Vydac C18カラ
ムを用い、30〜50％アセトニトル濃度を20分間の直線的
濃度勾配で高度に精製し、8M尿素存在下でメルカプトエ
タノールでジスルフィド結合を還元し、次いで４−ビニ
ルピリジンでシステインを修飾後、ゲル過によって脱
塩した。2M尿素存在下でリジルエンドペプチターゼで37
℃、１晩消化後、逆相HPLC（Vydac C18カラム、５〜55
％アセトニトル濃度、50分の直線的濃度勾配）で、各ペ
プチドを分取し、さらに最も長いペプチドをトリプシン
で再消化し、逆相HPLCで分取した。各ペプチドを塩酸で
加水分解し、アミノ酸分析計（日立（株）製）によりア
ミノ酸組成分析した。次いでアミノ酸シーケンサーによ
る各ペプチドのアミノ酸配列を分析した。
アミノ酸組成分析とアミノ酸配列分析の結果から、そ
れぞれのペプチドのアミノ酸配列を決定し、それに上記
のFeIFNのＮ末端から10個のアミノ酸配列およびFeIFNを
コードするDNAの塩基配列と対応させてFeIFNのアミノ酸
配列を決定した。FeIFNのアミノ酸配列を第６図に示
す。
れぞれのペプチドのアミノ酸配列を決定し、それに上記
のFeIFNのＮ末端から10個のアミノ酸配列およびFeIFNを
コードするDNAの塩基配列と対応させてFeIFNのアミノ酸
配列を決定した。FeIFNのアミノ酸配列を第６図に示
す。
（11） FeIFNの等電点の決定 前記（８）項で得たFeIFNを用いて、FeIFNの等電点を
決定した。
決定した。
つまり、ファルマシア製Phastsystemを用い、泳動ゲ
ルIEF3〜９に前記（９）項と同様に４％SDS、10％２−
メルカプトエタノールで煮沸したFeIFN1.6μｇをのせ、
Pharmacia製LKB pH3〜10を等電点マーカーとして泳動
後、銀染色した。等電点は６であった。
ルIEF3〜９に前記（９）項と同様に４％SDS、10％２−
メルカプトエタノールで煮沸したFeIFN1.6μｇをのせ、
Pharmacia製LKB pH3〜10を等電点マーカーとして泳動
後、銀染色した。等電点は６であった。
（12） FeIFNの糖鎖の分析 前記（８）項のFeIFNを用い、SDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動後、PAS染色によってFeIFNの糖鎖を分析し
た。
ド電気泳動後、PAS染色によってFeIFNの糖鎖を分析し
た。
つまり、アクリルアミド濃度が４〜20％濃度勾配の泳
動ゲル、TEFCO mini（TEFCO社製）にFeIFN20μｇをの
せ、BIO−RAD社製SDS−PAGE Standards,Low Rangeおよ
びAmesham社製rainbow markersを分子量マーカーにし
て、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動後、常法のクマ
シー染色およびPAS染色した。クマシー、PASの両染色と
も分子量25,000のバンドが見られた。つまり、FeIFNに
糖鎖があることが確認された。
動ゲル、TEFCO mini（TEFCO社製）にFeIFN20μｇをの
せ、BIO−RAD社製SDS−PAGE Standards,Low Rangeおよ
びAmesham社製rainbow markersを分子量マーカーにし
て、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動後、常法のクマ
シー染色およびPAS染色した。クマシー、PASの両染色と
も分子量25,000のバンドが見られた。つまり、FeIFNに
糖鎖があることが確認された。
（13） FeIFNの抗ウィルス効果 96ウェルプレートでコンフルエントに増殖したネコ細
胞Fc9（文献１）またはCRFK（文献１）の培養液100μ
に、前記（８）項で得た5.8×105U/mlのFeIFNまたは培
地100μを入れ、37℃で炭酸ガスインキュベーター中
で24時間培養後、培養液を除去し、TCID50/mlが105.5の
ネコカリシウィルスFRI−14（C14）を含むウィルス液15
0μを加え、さらに37℃で24時間培養した。ウィルス
液を除去し、クリスタルバイオレットでウェル底面に接
着している細胞を染色し、590nmの光の吸光度（OD590）
を測定した。その結果を表−３に示した。FeIFNは、ネ
コカリシウィルスに対して抗ウィルス活性を有してい
た。
胞Fc9（文献１）またはCRFK（文献１）の培養液100μ
に、前記（８）項で得た5.8×105U/mlのFeIFNまたは培
地100μを入れ、37℃で炭酸ガスインキュベーター中
で24時間培養後、培養液を除去し、TCID50/mlが105.5の
ネコカリシウィルスFRI−14（C14）を含むウィルス液15
0μを加え、さらに37℃で24時間培養した。ウィルス
液を除去し、クリスタルバイオレットでウェル底面に接
着している細胞を染色し、590nmの光の吸光度（OD590）
を測定した。その結果を表−３に示した。FeIFNは、ネ
コカリシウィルスに対して抗ウィルス活性を有してい
た。
［発明の効果］ 本発明によれば、ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤とし
て期待されるFeIFNを大量生産することができる。
て期待されるFeIFNを大量生産することができる。
［参考文献］ 1. J.K.Yamamotoら:Vet.Immunol.and Immunopathol.,1
1,1−19,（1986）． 2. T.Horiuchiら:Agric.Biol.Chem.,51,1573−1580,
（1987）． 3. T.Maniatisら編:Moleculer Cloning,A Laboratory
Manual,（1982）p86〜96,Cold Spring Harbor Laborato
ry,New York. 4. G.R.Gardiner and H.Stockdale:J.Invertebrate Pa
thology,25,363−370,（1975）． 5. D.Hanahan:J.Mol.Biol.,166,577−580,（1983）． 6. M.J.Casadabanら:J.Mol.Biol.,138,179−207（198
0）． 7. Y.Gluzman:Cell,23,175−182（1981）．
1,1−19,（1986）． 2. T.Horiuchiら:Agric.Biol.Chem.,51,1573−1580,
（1987）． 3. T.Maniatisら編:Moleculer Cloning,A Laboratory
Manual,（1982）p86〜96,Cold Spring Harbor Laborato
ry,New York. 4. G.R.Gardiner and H.Stockdale:J.Invertebrate Pa
thology,25,363−370,（1975）． 5. D.Hanahan:J.Mol.Biol.,166,577−580,（1983）． 6. M.J.Casadabanら:J.Mol.Biol.,138,179−207（198
0）． 7. Y.Gluzman:Cell,23,175−182（1981）．
第１図は、ネコインターフェロンの蛋白質をコードする
DNAを含むプラスミドpFeIFN1の制限地図である。第２図
は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含む組換
え体プラスミドpBmFeIFN1の作製例の概略図、第３図
は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含む組換
え体プラスミドpBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２およびpB
mFeIFN2−３の作製例の概略図である。第４図は、組換
え体プラスミドpBmFeIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2
−２、およびpBmFeIFN2−３のネコインターフェロンを
コードするDNAの開始コドンATG周辺の塩基配列である。
第５図は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含
む組換え体プラスミドpYU871の作製例の概略図である。
第６図は、FeIFNをコードするDNAの塩基配列ならびにFe
IFNのアミノ酸配列である。
DNAを含むプラスミドpFeIFN1の制限地図である。第２図
は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含む組換
え体プラスミドpBmFeIFN1の作製例の概略図、第３図
は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含む組換
え体プラスミドpBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2−２およびpB
mFeIFN2−３の作製例の概略図である。第４図は、組換
え体プラスミドpBmFeIFN1、pBmFeIFN2−１、pBmFeIFN2
−２、およびpBmFeIFN2−３のネコインターフェロンを
コードするDNAの開始コドンATG周辺の塩基配列である。
第５図は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含
む組換え体プラスミドpYU871の作製例の概略図である。
第６図は、FeIFNをコードするDNAの塩基配列ならびにFe
IFNのアミノ酸配列である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (56)参考文献 特開 昭62−501469（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−224690（ＪＰ，Ａ) Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎ ｏｐａｔｈ．，Ｖｏｌ．11（1986）Ｐ. １−19 Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．７（1987）Ｐ．173−183 Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．６（1986）Ｐ．349−360 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．51，Ｎｏ．６（1987）Ｐ．1573 −1580 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．315，Ｎｏ. 6020（1985）Ｐ．592−594
Claims (5)
- 【請求項１】下記に示すネコインターフェロンの蛋白質
をコードするDNAにより、遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウィルス。 - 【請求項２】請求項（１）記載の組換えカイコ核多角体
病ウィルスを増殖させることを特徴とするネコインター
フェロンの製造法。 - 【請求項３】カイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で増
殖させることを特徴とする請求項（２）記載のネコイン
ターフェロンの製造法。 - 【請求項４】請求項（１）記載の組換えカイコ核多角体
病ウィルスを増殖させて得られ、かつ下記に示すアミノ
酸配列を有するネコインターフェロン。 - 【請求項５】分子量が約25,000であり、かつ下記に示す
アミノ酸配列を有する請求項（４）記載のネコインター
フェロン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-167415 | 1989-06-29 | ||
| JP16741589 | 1989-06-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03139276A JPH03139276A (ja) | 1991-06-13 |
| JP2513909B2 true JP2513909B2 (ja) | 1996-07-10 |
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ID=15849275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2173517A Expired - Fee Related JP2513909B2 (ja) | 1989-06-29 | 1990-06-29 | ネコインタ―フェロンおよびその製造法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0414355B1 (ja) |
| JP (1) | JP2513909B2 (ja) |
| KR (1) | KR970002670B1 (ja) |
| CA (1) | CA2019803C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2071612T3 (es) * | 1987-12-29 | 1995-07-01 | Toray Industries | Plasmido sintetico, transformante, gen del interferon felino y metodo para producir interferon felino. |
| DE69431320T2 (de) * | 1993-04-09 | 2003-04-17 | Hayashibara Biochem Lab | Verwendung von menschlichem Interferon-d zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Atemwegserkrankungen in Katzen |
| JP3845915B2 (ja) * | 1996-10-31 | 2006-11-15 | 東レ株式会社 | ネコのアトピー性皮膚炎治療剤および治療方法 |
| WO1999006429A1 (fr) * | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Toray Industries, Inc. | Stabilisation de proteines utiles et compositions a base de proteines utiles |
| AU4102099A (en) | 1998-05-29 | 1999-12-13 | Heska Corporation | Canine Interleukin -4 Proteins, Nucleic Acid Molecules, and Uses Thereof |
| US6482403B1 (en) | 1998-05-29 | 2002-11-19 | Heska Corporation | Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
| USRE40374E1 (en) | 1998-05-29 | 2008-06-10 | Heska Corporation | Canine IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
| US20020127200A1 (en) | 1998-05-29 | 2002-09-12 | Shumin Yang | Canine and feline immunoregulatory proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof |
| AU2002228886B2 (en) * | 2000-11-03 | 2007-08-30 | Pestka Biomedical Laboratories, Inc. | Interferons, uses and compositions related thereto |
| CN100371449C (zh) * | 2005-01-25 | 2008-02-27 | 苏州大学 | 改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法 |
| CN109206501B (zh) * | 2018-09-26 | 2022-03-04 | 东北农业大学 | 猫干扰素ω、其编码基因及其在抗病毒方面的应用 |
| CN109206502B (zh) * | 2018-09-26 | 2022-03-04 | 东北农业大学 | 一种猫干扰素ω及其制备方法和在抗病毒中的应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| EP0165942A1 (en) * | 1983-12-23 | 1986-01-02 | Monash University | PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-$g(a) |
| US4879236A (en) * | 1984-05-16 | 1989-11-07 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
| JPS62501469A (ja) * | 1984-12-18 | 1987-06-18 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング | イヌおよびウマインタ−フエロン |
| US4861720A (en) * | 1986-07-03 | 1989-08-29 | Regents Of The University Of California | Oncornavirus vaccines and feline alpha-type interferon |
| ES2071612T3 (es) * | 1987-12-29 | 1995-07-01 | Toray Industries | Plasmido sintetico, transformante, gen del interferon felino y metodo para producir interferon felino. |
-
1990
- 1990-06-26 CA CA002019803A patent/CA2019803C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-27 US US07/544,504 patent/US5194381A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 KR KR1019900009603A patent/KR970002670B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-06-29 DE DE69033519T patent/DE69033519T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-29 JP JP2173517A patent/JP2513909B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-29 EP EP90307159A patent/EP0414355B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-23 US US08/200,297 patent/US5480956A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．６（１９８７）Ｐ．１５７３−１５８０ |
| Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ．，Ｖｏｌ．６（１９８６）Ｐ．３４９−３６０ |
| Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ．，Ｖｏｌ．７（１９８７）Ｐ．１７３−１８３ |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１５，Ｎｏ．６０２０（１９８５）Ｐ．５９２−５９４ |
| Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．，Ｖｏｌ．１１（１９８６）Ｐ．１−１９ |
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|---|---|
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| US5194381A (en) | 1993-03-16 |
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| DE69033519T2 (de) | 2000-10-12 |
| EP0414355B1 (en) | 2000-04-26 |
| CA2019803C (en) | 2000-04-25 |
| EP0414355A1 (en) | 1991-02-27 |
| DE69033519D1 (de) | 2000-05-31 |
| US5480956A (en) | 1996-01-02 |
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| JPH04305599A (ja) | プロラクチン |
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