JPH04502615A

JPH04502615A - 組換え魚類ホルモン蛋白質

Info

Publication number: JPH04502615A
Application number: JP2501047A
Authority: JP
Inventors: ランティエール―デルリュ，フランソワ; マルシャル，ジョセフ; ルナール，アンドレ
Original assignee: ユーロジェンテック・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1989-01-06
Filing date: 1990-01-05
Publication date: 1992-05-14
Also published as: EP0377540A1; EP0387457A1; KR910700340A; IL92978A0; WO1990007578A1; AU643194B2; AU4802490A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１４、請求項１１又は１２記載のベクターによって形質転換されるＥ、ｃｏｌｉである請求項１６記載の宿主細胞。

１５、請求項１３又は１４記載の形質転換宿主細胞によって発現される核酸の発現物質。

１６、請求項１及び２のポリペプチドを少なくとも一つを含有する魚類°用組成物、又は、それらを有効量で含有する混合物、特に１日につき魚１ｇ当たり５ｎｇ〜１μｇのポリペプチドを含有する注入可能な組成物。

１７、古典的栄養成分に加えて、請求項１及び２のいずれかにより得られるもののようなポリペプチドの少なくともいずれかを、例えば１日につき魚類用飼料Ｉｇ当たりポリペプチド１μｇ−１ｍｇであるような有効量で含有する魚類用飼料。

明細書組換え魚類ホルモン蛋白質本発明は、成長刺激及び浸透調節作用を示す組換え魚類ホルモンに関する。本発明は、さらに上記成長ホルモンをコードする暖流魚種からクローニングされた遺伝子を、有する微生物における大量のホルモンの製造方法に関する。

成長ホルモン（以後ＧＨで表す）は、全を推動物の下垂体線で産生される系統的発達蛋白質群から成る。

一般に、これらの下垂体ホルモン蛋白質は、多面発現性の生物活性を示す、魚類では、これらの活性は、成長刺激及び浸透調節順応から水中塩度までの範囲に及ぶ。これらのホルモンについての研究の大半は、それらの成長促進及び浸透調節活性に焦点を当て、海水順応におけるそれらの役割を立証し、魚類養殖の分野におけるそれらの使用の可能性を示唆している。最近、いくつかの成長ホルモンが、サケ、ニジマス、コイ、及びマグロといった種々の寒流魚種から単離され、クローン化されている（Ｓｅｂｉｎｅら、１９８５゜Ａｇｅｌｌｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｎ　１　９　８　６　；Ｎ１ｃｏｌｌら、１９８８；　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　 −Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ　１９８８；５ａｔｏら、１９８８　：Ｙａｓｕｄａら、１９８７；Ｓｏｎｇら、１９８８）、このように、微生物中でこれらの魚からクローン化された遺伝子を発現することにより組換え成長ホルモンを産生ずる試みは、ずっと、はとんど成功を見ていない。

本発明では、クローニング法を用いて、テラピア、ナマズ、又はブリといった暖流魚種の異なる成長促進及び浸透調節下垂体ホルモンをコードする遺伝子を単離した。暖流魚テラピアは、海水並びに淡水中で繁殖可能な広塩性魚である。最近の生塩水又は海水中でのテラピア養殖の発展により、成長促進及び塩度耐性に、故にこの魚種の浸透調節の生理学に関心が集まっている。テラピアＧＨについてはほとんど分かっていない。

本発明は、熱に関して安定性を示し、暖流魚種に用い得る新規の蛋白質及びポリペプチドに関する。

−例として、テラピア種、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉ　５ｎｉｌｏｔｉｃｕｓが用いられ、成長促進及び／又は浸透調節活性を示すひとつのホルモン即ち、ひとつの成長ホルモン蛋白質（以後ＴＧＨで表す）が単離され得ることが示されている。

本発明は、さらにコード配列の転写、並びに翻訳開始及び終止シグナルを制御するプロモーターシグナルを含む宿主生物中で、コード配列を発現させるコード配列に先行するテラピア又はナマズの成長ホルモン、及び調節シグナルをコードする後述の核酸に関する。

本発明は、さらにテラピア又はナマズの成長ホルモン及びその複製に不可欠な遺伝子成分をコードする核酸配列を含有する組換えＤＮＡ、プラスミド、コスミド及びファージに関する。

本発明の特定の適用において、後述の組換えＤＮＡは、複製の機能源を含有するプラスミド発現ベクター、テラピア又はナマズ成長ホルモンをコードする配列の宿主中での発現を可能にする調節成分、上記の宿主生物中で活性であるプロモーター、そして特に誘導プロモーターである。

本発明は、さらに上記宿主生物中で複製可能であり、この宿主生物中でテラピア又はナマズ成長ホルモンを発現させる調節成分を含有する前述の組換えＤＮＡで形質転換される宿主生物に関する。

好適な宿主生物は、以下の実施例に記載されるような組換えＤＮＡで形質転換された大腸菌、Ｅ、ｃｏｌｉである。

本発明は、さらに暖流魚種、特にテラピア又はナマズから単離された上記のホルモン蛋白質をコードする遺伝子を用いた微生物中での組換え魚類成長ホルモンの製造方法に関する。

本発明は、宿主生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター、並びに翻訳開始及び終止シグナルのような調節成分の制御下にあるテラピア又はナマズ成長ホルモンをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡで予め形質転換された適切な宿主生物の培養、及び宿主生物によって合成される蛋白質物質の精製に関する。

本発明は、さらに特に、下記のように形質転換され、本発明によりテラピア又はナマズ成長ホルモンを産生できる宿主生物の培養に関する。

本発明は、さらに養殖する場合に魚の成長の増強及びそれらの養殖条件の順応性を改良するための、魚の産業的養殖でのテラピア成長ホルモン蛋白質に基づいた産生物に関する。

本発明は、さらに注射、水溶剤（ｂａｌｎｅａｔｉｏｎ）、又は噴霧などの方法を用いて養殖魚に投与し得るテラピア成長ホルモン蛋白質又はその混合物に基づいた製剤に関する。

本発明は、さらに古典的成分に加えて、本発明の方法により産生される組換えポリペプチド又は蛋白質を十分量含有する魚用飼料に関する。

本発明は、そのポリペプチド鎖中に以下のアミノ配列：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊　Ｍ　ｅ　ｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、の一つに含まれるアミノ酸配列を含有する安定した組換えポリペプチドに関する。

“安定したポリペプチド”という表現は、得られたポリペプチドが、それが生成される培地から単離後でも安定していることを意味する。さらに正確に言えば、ポリペプチドが、宿主細胞中で合成され、任意の急速な変性を受けず、したがって上記の宿主細胞の総細胞蛋白質の実質的分画、例えば、宿主細菌においては総細胞蛋白質の少なくとも１０％〜８０％、又は酵母菌宿主細胞においては総細胞蛋白質の少な（とも３％〜５０％を意味する実質的分画を含む大量において発現し得る条件である２８℃〜４２℃という温度で安定していることを意味している。

“組換えポリペプチド”という表現は、単にアミノ酸配列に限定されるものではな（、グリコジル化ポリペプチド又はジスルフィド橋をも包含する。グリコシル化ポリペプチドは、前述及び後述の核酸を適切な宿主細胞中、例えば、酵母菌中で発現することにより直接得られるか、又は非グリコジル化組換えポリペプチドの区鋏宣ヨグリコシル化により得られる。

さらに本発明は、とりわけ以下のポリペプチドニーそれらのポリペプチド鎖中に以下の配列：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊Ｍｅｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、を含有するもの、又は −上記のアミノ酸配列の一つで構成されるもの、に関する。

本発明は、さらに以下のアミノ酸配列ニー図２のアミノ酸（−２０）からアミノ酸（−１）まで、で構成されるシグナルペプチドに関する。

本発明は、魚の成長ホルモンのような他の任意のホルモンと結合し上記の任意のシグナルペプチドで構成された任意の組換えポリペプチドに関する。

本発明のポリペプチドの製造方法は、クローン化遺伝子でコードされた大量の安定したポリペプチド又は蛋白質を得る手段として、選択微生物により約２８℃から約４２℃までの温度で、大腸菌及び酵母菌のような一般的微生物中で、組換えポリペプチド又は蛋白質を産生ずることを含む。

さらに正確に言えば、本発明の安定した組換え成長ホルモンの製造方法は、以下の工程ニーテラピア又はナマズの天然成長ホルモンのポリペプチド配列、あるいは生成されたポリペプチド配列が成長促進及び／又は浸透調節特性を有するかぎりにおいて、テラピア又はナマズの天然成長ホルモンの配列の一部又は全部を含有するポリペプチド配列、を有するポリペプチドをコードする核酸を含有する適切なベクターによって予め形質転換される宿主細胞を、選択微生物により約２８℃から約４２℃までの温度で適切な培地中で培養し、一上記形質転換宿主細胞により生成されるポリペプチドが上記培地から回収し、必要により精製する、工程から成る。

ジスルフィド橋を含有するポリペプチドは、適切な宿主細胞例えば、酵母菌中で、上記及び後記の核酸を発現することにより直接的に、あるいは適切な標準酸化還元電位を含有する緩衝液中での組換えポリペプチドの精製分画の変性及び再生により間接的に得られる。

使用温度は、宿主細胞中で蛋白質を合成させるのに必要な条件に合うように選択される。温度範囲の上限は、その温度を越えると宿主細胞中の全ての高分子合成が停止するため、臨界的である。温度範囲の下限は、その温度より低い場合には高分子合成及び蛋白質合成を含む全ての酵素反応が、ポリペプチドが上記のように大量に産生されない程度に減速されるため、臨界的である。

本発明の有利な製法において、天然成長ホルモンをコードする核酸は、宿主生物のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター、翻訳開始及び終止シグナルのような調節成分の制御下にある。

本発明の製法において、宿主細胞は、その増殖が指数期に停止されるＥ、ｃｏｌｉであるのが有利であり、そして上記の形質転換宿主細胞により産生されるポリペプチドは、Ｅ、ｃｏｌｉによって産生されるその他の蛋白質からの細胞の培養から回収される。

Ｅ、ｃｏｌｉは、必要な実験条件が充分に記載されているように、非常に大量の製造に有利に用いられる。

宿主細胞は、サツカロミセス（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｃｅｓ）株のような酵母菌であってもよい。酵母菌は、ポリペプチドをコードする遺伝子がシグナルペプチドを含有する場合、ポリペプチドが培地中に分泌されるような培地におけるポリペプチドの製造に有利に用いられる。

さらに、酵母菌は、この宿主中で天然に生じるジスルフィド橋が新規に合成された蛋白質中に形成されるため、生物的に活性なポリペプチドの製造に有利に用いられる。

本発明の製法において、組換えポリペプチドは、シグナルペプチドに、特にテラピア又はナマズの天然シグナルペプチドと同じアミノ酸配列を有するシグナルペプチドに先行され得る。

本発明の製法において、組換えポリペプチドは、ポリペプチドのコード配列がイニシエーターメチオニンコドンに先行されている遺伝子により有利にコードされる。

後者は、ポリペプチドの翻訳を正確なコドンで開始させるために必要である。先行するメチオニンは、その合成中にポリペプチドから切り離されることもある。

本発明のポリペプチドは、本発明の方法によってのみ調製され得るわけではな（、古典的化学合成といつた任意の製造方法によっても調製され得る。

本発明のポリペプチドを調製する別の方法は、Ｃ−末端アミノ酸から出発し、必要な順序で連続するアミノアシル、あるいは予め生成されそして適切な順序にいくつかのアミノアシル残基を既に含有するアミノアシル及び断片、又はこの方法で予め調製されたいくつかの断片が、対で連続的に縮合され（それは、ペプチド合成等において公知の方法により、特にカルボニル基の活性化後にペプチド結合に一般に参加する一端のアミノ基及び他端のカルボニル基（あるいはその逆）以外のこれらのアミノアシル又は断片が保有する全ての反応基を予め保護するよう注意することと理解される）、順次Ｎ−末端アミノ駿まで進むことを特徴とする。

本発明は、さらに以下のアミノ酸配列；−以下の配列：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊Ｍｅｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、の一つに含まれるもの、又は一上記のアミノ酸配列の一つを含むものか、又は上記のアミノ酸配列の一つで構成されるもの、をコードするヌクレオチド鎖を含む核酸に関する。

本発明の有利な核酸は、以下のヌクレオチド配列二本図２のヌクレオチド（−２６＞からヌクレオチド（ｚ）まで、＊図２のヌクレオチド（１）からヌクレオチド（６２１）まで、＊図２のヌクレオチド（６１）からヌクレオチド（６２１）まで、＊ＡＵＧコドンに先行される図２のヌクレオチド（６１）からヌクレオチド（６２１）まで、の一つの一部又は全部を含有するものであり得、あるいは上記ヌクレオチド配列の一つから成るものである。

本発明は、さらに上記に定義されたシグナルペプチドをコードする核酸に関する。

本発明はさらに、その複製に不可欠ではなく、そして特に以下のポリペプチド：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊　Ｍ　ｅ　ｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、の一つをコードする核酸を含有する、特にその部位の一つにおいてテラピア又はナマズの天然ポリペプチド−成長促進及び／又は浸透調節特性を示す−をコードする核酸を含有する、特にプラスミド、コスミド又はファージ型の、特にクローニング及び／又は発現に関する組換えベクターに関する。

本発明の核酸は、化学的方法又は他の方法で調製してもよい。

本発明の核酸（多くて２００ヌクレオチド−又は二本鎖核酸の場合には２００ｂｐを含有する）の適切な化学的製造方法は、以下の工程ニーＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｆｓｔｒｙ　４．２７４−３２５．１９８６に記載の自動β−シアノエチルホスホラミダイト法を用いるＤＮＡ合成、−それによって得られるＤＮＡの好適なプラスミドベクター中へのクローニング及び好適なプローブを用いたハイブリダイゼイションによるＤＮＡの回収、の工程を含む。

２００ヌクレオチド−又はｂｐ（二本鎖核酸の場合）−より長い核酸の化学的製造方法は、以下の工程：　−異なる制限部位を有するそれらの末端で、その配列が天然ペプチドのアミノ酸列に適合する場合には、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０．７４６１−７４６５．１９８３に記載された原理に従って、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを集め、 −それによって得られたＤＮＡを好適なプラスミドベクター中へのクローニング及び好適なプローブを用いたハイブリダイゼイションにより所望の核酸を回収する、工程から成る。

ｍＲＮＡから本発明の核酸を製造する別の方法は、以下の工程ニーＵｌｌｒｉｃｈら、１９７７．５ｃｉｅｎｃｅ１９６：　１３１３−１３１９；及びＣｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１　８　。

５２９４−５２９９により記載された技術により、下垂体から細胞ＲＮＡを調製し、一固定化オリゴー（ｄＴ）によるクロマトグラフィーを用いて全細胞ＲＮＡを通してｍＲＮＡを回収及び精製し、 −Ｇｅｎｅ　２５：２６３，１９８３により記載された技術により、精製ｍＲＮＡからｃＤＮＡ鎖を合成し、 −それによって適切なプラスミドベクター中へ、得られた核酸をクローニングし、そして適切なへイプリダイゼイションブローブを用いて所望の核酸配列を回収する、工程から成る。

本発明の核酸を製造するために、以下の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼイションブローブ：ＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧ（この配列は図２から得られたものである）を、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）が記載したパイプリダイゼイション条件下で用いてもよい。

ｃＤＮＡ鎖の合成、及びその後の試験管内増幅は、図２の配列から限定される、２つの化学的に合成されたアンブリマー（ａｒｎｐｌｉｍｅｒｓ）を用いて、例えば、Ｇｏｂｌｅｔら（１９８９）の例で記載されたようにポリメラーゼ鎖反応法を用いて実現し得る。２つの適切なアンブリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）は、例えば、ＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＴＣ，又はＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧ、及びＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧである。

次に、増幅された核酸断片が前述のようにクローン化される。

本発明の有利な組換えベクターは、以下のものニー宿主細胞中でテラピア又はナマズの成長促進及び／又は浸透調節特性を示すポリペプチドのアミノ酸配列を発現させるのに必要な調節成分、並びに−あるいはプロモーター、特に誘導しつるブロモ一本発明は、さらに本発明の組換えベクターにより形質転換され、そしてこの宿主中でテラピア又はナマズの成長促進及び／又は浸透調節特性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させる調節成分を含有する宿主細胞に関する。

有利な宿主細胞は、本発明のベクターのいずれか一つにより形質転換されたＥ、ｃｏｌｉである。

本発明は、さらに本発明のもののような少な（とも一つのポリペプチド又はその混合物を含有する魚類用産生物に関する。

本発明は、さらに古典的栄養成分に加えて、本発明のポリペプチドの少なくとも一つを、例えば１日につき魚類用飼料１ｇ当たり１ｇｇ〜１ｍｇのポリペプチドであるような有効量で含有する魚類用飼料に関する。

結　果以下の開示において、テラピア種、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓから得られた一つの好ましい蛋白質産生物、即ち一つの成長ホルモン（以後ＴＧＨと示す）を単なる例示として説明する。成長ホルモン物質は、後述の操作によって、ｃＤＮＡライブラリーからこのホルモンをコードする遺伝子を単離し、Ｅ、ｃｏｌｉの株中でクローン化遺伝子を発現させることにより得た。

ｃＤＮＡライブラ１ブリルモン遺伝子の単離を促進するために、これらのホルモンが大量に合成される下垂体前葉から単離されるｍＲＮＡ製剤を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。先ず、イソチオシアン酸グアニジン法（Ｕｌｒｉｃｈら、１９７７；Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）を用いて１グラムの組織から全ＲＮＡを調製し、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロース上でのクロマトグラフィーによって、ポリＡ” ｍＲＮＡ分画を精製した。次に、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）が記載した手法にしたがって、ポリＡ′″ｍＲＮＡを用いて二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。二本鎖ｃＤＮＡを、セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）上でのりｏｖトゲラフイーによってサイズ分画し、７００塩基対より多いＤＮＡ断片を含有する分画をプールした。平滑末端ｃＤＮＡ分子を、予めＳｍａＩで消化し、脱燐酸化したｐＵｃ１３プラスミド（ＶｉｅｒｉａとＭｅＳＳｉｎｇ＋１９８２）に挿入した。次に結紮産生物を、Ｍ　ａ　ｎ　ｄ　ｅ　１とＨｉ　ｇａ　（１９７０）の手法に従ってＥ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩＸＸＭ１５　（１ａｃＺ、Ｍ１５、　Ｆ’　、　ｌａｃ　ＩＱ、　２Ｍ１５．　ｐｒｏＡ）中へ形質転換し、組換えプラスミドを含有するクローンを、１００ｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）　、及び０．０１％　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ −ｇａｌ）を含有するＬｕｒ　ｉ　ａブロス平板上で選択した。これらの平板上で、再結紮ｐｕｃ１３ベクターを含有する形質転換株は、青色コロニーを生じ、一方組換えｐＵＣ１３プラスミドを含有する形質転換株は、白色コロニーを生じる。２ｇのポリＡ”　ｍＲＮＡから出発して、約４，２００個の組換え形質転換株のｃＤＮＡライブラリーを得た。

クローンのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーの２０００個の白色コロニーを、Ｍａｎｉａｔｉｓ　（１９８０）に記載されているようにニトロセルロースフィルターに移して、−晩増殖させ、溶解し、中和し、そして固定した。次いで、そのフィルターを、下記の適切な”ｐ−標識化クローンとハイブリダイズした。前ハイブリダイゼイション及びハイブリダイゼイションは、４５℃の温度で１６時間、煮沸し、刈り込まれたサケ精子ＤＮＡを含有する６、ｘ　５ＳＣ−１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中で実施した（１ｘＳＳＣ：０．１５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　１０．０１５Ｍ　クエン酸Ｎａ　；　１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液：各々０．０２％のフィコール、ポリビニルピロリドン、及びウシ血清アルブミン）。フィルターを先ず、６ｘＳＳＣ／１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中で、室温で３０分間１、次いで５４℃で３０分間洗浄した。

テラピア成長ホルモン（ＴＧＨ）をコードするｃＤＮＡクローンを、マスＧＨ遺伝子を含有するプラスミドから単離した３　２．　ｐ標識化プローブで、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。プローブとして、マスＧＨ遺伝子の５°−末端に対応する３９４ｂｐのＦｏｋｒ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの　２０００個の組換え白色コロニーのスクリーニングにより、２４個の陽性コロニーが生じた。これらのクローンの各々の組換えプラスミドを抽出し、１％アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。

６つのプラスミドが同じ大きさで、全長ＴＧＨｍＲＮＡに対応するｌ　ｏｏｏｂｐのｃＤＮＡ挿入体を含有した。制限分析により、全クローンが同一であることを確証し、ｐｔｉＧＨ６と命名されたこれらのうちの一つをさらに分析するために選択した。全クローン化ｃＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８とＭ　１３　ｍ　ｐ　１９ベクター（ＶｉｅｒｉａとＭｅｓｓｉｎｇ、１９８２）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位間に移し、そのヌクレオチド配列を、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）のジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて確定した。

ｐｔｉＧＨ６のＴＧＨｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図２に示す。ｃＤＮＡ断片は、ｌ　０００ヌクレオチドの長さを有し、６２１ヌクレオチドの開放読み枠及びそれに続（ポリ（Ａ）末端の上流１８ヌクレオチドに位置するポリアデニル化シグナルを有する３゛未翻訳領域を含有する。ポリ（Ａ）末端は、約１５０ｂｐ長である。ヌクレオチド３６でのＡＴＧ開始コドンは、共働開始配列ＰＣＣＡＴＧＰ　（Ｋｏｚａｋ。

１９８６）の一部としての推定上の翻訳開始部位を示す。開放読み枠は、２３，１１４ダルトンの算出分子量を有する２０４アミノ酸残基の蛋白質をコードする（図２）、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）が記載したアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて確定された推定アミノ酸配列の水油療法（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロフィールは、ＮＨ２末端が疎水性が高く、シグナルペプチドの全特徴を示すことを明示する。このペプチドシグナルは、プロセッシング中におそら（切り離されて、４個のシスティン残基を有する１８７ＡＡ残基の成熟蛋白質を生じる。

我々は、ＴＧＨ蛋白質の誘導されたアミノ酸配列を、その他の公知の魚類成長ホルモン、例えば、マグロ、ブリ、マス及びサケの成長ホルモンのアミノ酸配列と比較した。ＴＧＨとマグロＧＨ間では８９％の、そしてＴＧＨとブリ（３Ｈ間では８４．５％の相同性が観察されたが、一方マスＧＨ及びサケＧＨとの相同性は６６％に過ぎなかった。これらの結果は、これらの魚の分類学的類別と一致する。テラピア、マグロ、及びブリは、スズキ目に属し、サケはサケ目に属する。さらに、これらの配列比較は、ＴＧＨ蛋白質の最初の１７アミノ酸がシグナル配列を含有し、成熟蛋白質はグルタミン残基１で開始するという上記の結論を支持する。

ＴＧＨ゛のＥ、ｃｏｌｉ中でＴＧＨ遺伝子を発現するために用いる方法は、５ｔｕｄｉｅｒとＭ　ｃ　ｆ　ｆ　ａ　ｔ（１９８６）が記載したものと本質的に同じであった。要するに、ＴＧＨ遺伝子を、挿入遺伝子の翻訳が遺伝子１０のリポソーム結合部位で開始するような方法でバタテリオファージＴ７の遺伝子１ｏの強力なプロモーターのうしろに挿入する。さらに、シグナルペプチドコーディング領域を除去するために、イニシェーク−ＡＴＧの直後に成熟ＴＧＨ蛋白質の最初のコドンが存在するように、ＴＧＨ遺伝子の初めの部分を修飾した。この方法では、細菌は、そのそれぞれのシグナルペプチドを伴わずに、成熟ＴＧＨ蛋白質を直接合成する。

図３に示したＴＰＲＬ遺伝子を発現するプラスミド作製の一般的模式図は、２つの工程を含む：第一工程では、遺伝子の内部制限酵素断片と、制限断片までの遺伝子のミッシングコドンに続（イニシエータ−ＡＴＧを含有する合成オリゴヌクレオチドとを結合することによりＴＧＨ遺伝子の５°端を修飾した。

第二工程では、遺伝子の修飾５°端を遺伝子の外りの部分とともに発現ベクターｐＡＲＡＥのバクテリアファージエフプロモーターのうしろに挿入した。

ｐＡＲＡＥプラスミドは、遺伝子１０のバクテリオファージエフプロモーター及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼに関するその天然ターミネータ−を含有するプラスミドベクターｐＡＲ３０４０（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８７）に由来する。ｐＡＲＡＥ誘導体においては、Ｐｖｕｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片を除去し、ベーターラクタマーゼ遺伝子のＰｓｔＩ部位を欠失させた。

ＴＧＨ遺伝子を発現するために、同じ原理を用いた（図１）。第一工程では、コドン１５で開始する遺伝子のＨｉｎｄＩ　Ｉ−ＰｖｕＩ断片と成熟ＴＧＨ蛋白質の最初の１４コドンに続くイニシエーターＡＴＧを含有する合成オリゴヌクレオチドとを結合して、ＴＧＨ遺伝子の修飾５′端を作製した。第二工程では、Ｎｄｅ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｉ断片上のＴＧＨ遺伝子の修飾５゜端をＴＧＨ遺伝子の残りのＰｖｕ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片とともに発現ベクターｐＡＲＡＥに挿入した。

図３に図示したプラスミドｐＴ７ＴＧＨの作製は、以下のように実施した。第一工程では、図３に記載の合成オリゴヌクレオチドをＨｉｎｃＩ　Ｉ−ＰｖｕＩ断片とともにプラスミドｐＴＴＣＴＢＲ中に挿入することによって、ＴＧＨ遺伝子の修飾５゛端を含有するプラスミドｐＴＧＨＭを作製した。ｐＴ７ＣＴＢＲは、ｐＡＲＡＥの誘導体であって、ｐＡＲＡＥと同様にそれは独特のＮｄｅ　Ｉ部位を有する。さらに、それは又プロモーターとターミネータ−の間にＰｖｕＩＩ及びＰｓｔＩ部位を含有する。ｐＴ７ＣＴＢＲをＮｄｅ　Ｉで、そして部分的にＰｖｕ　Ｉで切断し、大きな断片を合成オリゴヌクレオチド及びプラスミドｐＴＧＨから単離したＨｉｎｃｌ　Ｉ−ＰｖｕＩ断片と一緒に結紮した。結紮混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌへ形質転換し、所望の組換えプラスミドｐＴＧＨＭを含有する形質転換株を標準プラスミド分析技法を用いて同定した。第二工程では、それぞれプラスミドｐＴＧＨＭ（ｔｉＧＨ遺伝子の修飾５゛端を含有する）からのＮｄｅＩ−５ＳｔＩ断片と、プラスミドｐｔｉＧＨ（ＴＧＨｃＤＮＡの残りを含有する）からのＳｓｔｌ−ＢａｍＨＩ断片であるＴＧＨ遺伝子の２つの断片を発現ベクターｐＡＲＡＥ中に挿入することによって、プラスミドｐＴ７７ＧＨを作製した。２つの断片は、２つのプラスミドをそれぞれの制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動により精製し、酵素Ｎｄｅ　Ｉ及びＢ　ａｍＨＩで消化したプラスミドｐＡＲＡＥと一緒に結紮した。次いで、結紮混合物を用いてＥ。

ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、ｐＴ７ＴＧＨと命名された所望の組換えプラスミドを含有する形質転換株を、標準プラスミド分析技法を用いて同定しＴＧＨ蛋白質を発現するために、ｐＴ７ＴＧＨプラスミドを前述のＥ、ｃｏｌ　ｉ　ＢＬ２１　（ＤＥ３）中へ導入した。ｐＴ７ＴＧＨプラスミドを含有するＥ。

ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で５ｍ１Ｌｕｒｉａ−ブロス中で一夜増殖させた。この培養物のうち、０．４ｍｌを用いて、アンピシリン（１００μｇ／ｍ　ｌ　）を補充した１０ｍ１の同一培地に植えつけ、培養がＡａａｏ　ｍ＝０．８に達した時に０．４ｍＭ　ＩＰＴＧを加えた。３時間後、細胞を収集してＳＤＳ試料緩衝液中で溶解しくＬａｅｍｍｌ　ｉ、１９７０）、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を施してドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。

非誘導培養及びＩ　ＰＴＧ誘導培養の抽出物中の総細胞蛋白質の比較は、新規の豊富な２４ｋｄ蛋白質が産生されることを明示する。

新規の合成ＴＧＨ蛋白質は、大量に製造されて、総細胞蛋白質の２５％に達する。サケ成長ホルモン抗血清を用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥのウェスターンプロット分析は、新規の合成蛋白質が抗血清と交叉反応し、したがってＴＧＨ蛋白質がテラピア成長ホルモンに対応することを立証するということを明示する。

過剰に産生されたＴＧＨ蛋白質は１．封入体中に含有されることが判明しており、これは、音波破砕及び遠心分離によって細胞を溶解後、容易に精製される。成長ホルモン蛋白質は、８Ｍ　尿素の存在下で精製封入体を可溶化し、その後その溶液を、プロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液に対して透析することにより容易に精製される。その蛋白質をさらに、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１００上でクロマトグラフィーにより精製する。

図の説明図１：Ｅ、ｃｏｌｉ中の成熟ＴＧＨ蛋白質の発現に関する一般模式図。

（ａ）シグナルペプチドコード領域（中空矩形）を欠失するための遺伝子の５° 端の修飾に関する模式（ｂ）修飾遺伝子のバクテリオファージエフプロモーター（ＰＴ７）ベクターへの工作に関する模式ニプラスミドｐＴＧＨのＴＧＨｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列由来のＴＧＨ蛋白質のアミノ酸配列。成熟ＴＧＨのアミノ酸に番号をつけた。負の番号のアミノ酸はシグナルペプチドに対応する。

全ヌクレオチド配列に（−２６）から（ｚ）までの番号をつけた。

コード配列は、（１）から（６２１）までの番号をｐＴ７７ＧＨ発現ベクターの作製。

（ａ）ＴＧＨ遺伝子の修飾５°端の作製。

（ｂ）バクテリオファージエフプロモーターのうしろに修飾ＴＧＨ遺伝子の作製。

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Ｂｉｏｌ、１８６゜ −Ｐｒｕｎｅｔ　及びＢｏｒｎａｎｃ　ｉ　ｎ。

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“ポリメラーゼ鎖反応を用いる全ＲＮＡにおける転写の一工程増幅”。

Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ＾ＦＩＧＵＲＥ　ＩＩム？Ａ　ＣＧ？　ＧＣテ　ＣテＧ　テＡＧ　ＣＣＣＣＡＣＣＣ？　ＣＪ？　Ｇテテ　ｃｃｃ　λＪｕＣ〒Ｃ↑ＧＣτ丁Ａ　Ｃ＾τｙｗｃｕＲＥｕ　ＣＭｌき）０７Ｇ　ＴＴＡ　ＧＣ入　’ＩＩ？ム　ｃｃ入　ム丁入　ｃｃ入　丁λ入　τ入ムＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＴＡ入　ＴＣＧ　τＧ＾　Ｃ０s ＧＡＧ　ＪＩＡｃ　ＧＴＴ　〒〒７　ＴＣＴ　ａｈｃ　ＡＴＡ　入ＣＴ　ｊｚ　ＡＴＣ（：ＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ｙｃ　ｃｃｃ　入λｒ入ム丁　ＧＴＴ　ＡＴＣＴＣＴ　Ｇ０入　λ丁入　入Ａτ　ＧＴＧ　ＴＴＧ　Ｃ入丁　ＴＧ入　入入入　入入入　λ０！”丁ＧＬＩＲＥ　工Ｉ工補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年７月に日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリペプチド鎖中に、以下のアミノ配列：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊Ｍｅｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、の一つに含まれるアミノ酸配列を含有する安定な組換えポリペプチド。
２．そのポリペプチド鎖中に、以下のアミノ酸配列：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊Ｍｅｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、を含むか、又は −上記のアミノ酸配列の一つで構成される請求項１記載の組換えポリペプチド。
３．以下の工程： −テラピア又はナマズの天然成長ホルモンのポリペプチド配列、あるいは生成されるポリペプチド配列が成長特性を有するかぎりにおいて、テラピア又はナマズの天然成長ホルモンの配列の一部又は全部を含有するポリペプチド配列、を有するポリペプチドをコードする核酸を含有する適切なベクターによって予め形質転換される宿主細胞を、選択微生物により約２８℃から約４２℃までの温度で適切な培地中で培養し、 −上記形質転換宿主細胞により生成されるポリペプチドを上記培地から回収し、必要により精製すること、から成る請求項１又は２記載の安定な組換えポリペプチドの製造方法。
４．成長促進及び／又は浸透調節特性を示す天然ポリペプチドをコードする核酸が、宿主生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター、翻訳開始及び終止シグナルのような調節成分の制御下にある請求項３記載の方法。
５．宿主細胞が、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉであり、その成長が指数期に停止され、上記形質転換宿主細胞により生成されるポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉによって分泌されがちなその他の蛋白質及び細胞外酵素を含まない培地から回収される請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
６．宿主細胞が、酵母菌である請求項３又は４のいずれかに記載の方法。
７．組換えポリペプチドがシグナルペプチド、特にテラピア又はナマズの天然シグナルペプチドと同じアミノ酸配列を有するシグナルペプチドに先行される請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．組換えポリペプチドがメチオニンに先行される請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
９．請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド鎖を含有する核酸。
１０．以下のヌクレオチド配列：＊図２のヌクレオチド（−２６）からヌクレオチド（Ｚ）まで、＊図２のヌクレオチド（１）からヌクレオチド（６２１）まで、＊図２のヌクレオチド（６１）からヌクレオチド（６２１）まで、＊ＡＵＧコドンに先行される図２のヌクレオチド（６１）からヌクレオチド（６２１）まで、の一つの一部又は全部を含有する、あるいは上記ヌクレオチド配列の一つから成る請求項９記載の核酸。
１１．特に、以下のポリペプチド：＊図２に示されるアミノ酸（−２０）からアミノ酸（１８７）まで、＊図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、＊Ｍｅｔが先行する図２に示されるアミノ酸（１）からアミノ酸（１８７）まで、の一つをコードする核酸を含有する、その複製に不可欠でない特にその部位の一つにおいてテラピア又はナマズの天然ポリペプチドー成長促進及び／又は浸透調節特性を示すーをコードする核酸を含有する、特にプラスミド、コスミド又はファージ型の、特にクローニング及び／又は発現に関する組換えベクター。
１２．次の： −宿主細胞中で、テラピア又はナマズの成長促進及び／又は浸透調節特性を示すポリペプチドのアミノ酸配列を発現させるのに必要な調節成分、並びに−あるいはプロモーター、特に誘導プロモーターを含有する請求項１１記載の組換えベクター。
１３．請求項１１及び１２のいずれかに記載の組換えベクターにより形質転換される宿主細胞であって、この宿主中でのテラピア又はナマズのポリペプチドー成長促進及び／又は浸透調節特性を示すーをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする調節成分を含有する宿主細胞。
１４．請求項１１又は１２記載のベクターによって形質転換されるＥ．ｃｏｌｉである請求項１６記載の宿主細胞。
１５．請求項１３又は１４記載の形質転換宿主細胞によって発現される核酸の発現物質。
１６．請求項１及び２のポリペプチドを少なくとも一つを含有する魚類用組成物、又は、それらを有効量で含有する混合物、特に１日につき魚１ｇ当たり５ｎｇ〜１μｇのポリペプチドを含有する注入可能な組成物。
１７．古典的栄養成分に加えて、請求項１及び２のいずれかにより得られるもののようなポリペプチドの少なくともいずれかを、例えば１日につき魚類用飼料１ｇ当たりポリペプチド１μｇ〜１ｍｇであるような有効量で含有する魚類用飼料。