KR0184770B1 - 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 - Google Patents
광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 광어 성장 호르몬을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단을 아미노산 변화없이 염기서열만을 변형시키도록한 본 발명의 방법에 의하면 기존의 방법보다 높은 수율로 광어 성장 호르몬을 대량 생산할 수 있다.
Description
제1도는 광어 성장 호르몬의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제2도는 광어 성장 호르몬 발현벡터에 있어서, 정상 및 5'-말단 변형된 광어 성장 호르몬 유전자 단편의 5'-말단을 보여주는 것이고,
제3도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자 단편을 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것이고,
제4도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과이다.
본 발명은 광어 성장 호르몬의 5'-말단 유전자의 일부를 아미노산 변화없이 염기서열 만을 변형시킴으로써 광어 성장 호르몬을 높은 효율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
자연적으로 얻을 수 있는 어류의 수확량에는 한계가 있기 때문에 최근에는 인공양식이 크게 증가하고 있으며, 이에 따라 경제적 측면에서 어류의 먹이 전환효율(feed conversion efficiency)을 높이기 위해 성장 호르몬을 이용하려는 연구가 계속 진행되고 있다.
어류 성장 호르몬에 대해서는, 세카인(Sekine) 등에 의해 연어 성장 호르몬의 cDMA가 처음 해석된 후(Sekine, S., Mizukami, T., Nishi, T., Kuwana, Y., Saito, A., Sato for salmon growth hormone in Escherichia coli, Proc. Natl, Acad, Sci, USA. 82, 4306-4310(1985)), 아젤론과 첸에 의해 무지개 송어 성장 호르몬의 cDNA가 분석되었고(Agellon, L. B. and Chen, T. T. Rainbow trout growth hormone; molecular cloning and expression in Escherichia coli, DNA, 5, 463-471(1986)), 또한 사이토(Saito) 등에 의해 장어 성장 호르몬의 cDNA가 규명된 후 대장균에서 재조합 장어 성장 호르몬을 발현시킨 것이 처음 보고되었다(Saito, N., Sekine, S., Komatsu, Y., Sato, M., Hirano, T., and Itoh, S., Molecular cloning of eel growth hormone cDNA and its expression in Escherichia coli, Gene, 72, 545-552(1988)). 한편, 수기모도(Sugimoto) 등은 대장균에서 발현된 봉입체(inclusion body) 형태의 재조합 장어 성장 호르몬을 고농도의 구아니딘 염산염(Guanidine hydrochloride)과 비이온성 계면활성제인 트윈 80을 이용하여 용해시킨 후 투석을 거쳐, 음이온 교환수지인 DEAE Toyopearl을 사용하여 정제시키는 방법을 보고한 바 있다(Sugimoto, S., Yokoo, Y., Inui, Y., and Hirano, T. Growth hormone, Agric. Biol. Chem., 55(6), 1635-1637(1991)).
현재 국내에서 가장 많이 양식되고 있는 광어는 모모타 등에 의해 염기서열이 밝혀졌으며(Hiroshi Momota, et al., Nacleic Acids Res. 16, 3107(1988)), 모리(Mori) 및 와타히키(Watahiki) 등에 의해 cDNA 서열 및 아미노산 서열이 알려졌다(Hirotada Mori, et al., Nucleic Acids Res. 17, (1989); Masanori Watahiki, et al., J. B i ol. Chem. 264, 312-316(1989)). 광어 성장 호르몬은 현재까지 보고된 성장 호르몬중 가장 크기가 작아서 171 내지 173개의 아미노산을 가지며 분자량이 약 19.4 내지 19.7 kDa임이 밝혀졌다. 제1도는 이와 같이 밝혀진 광어 성장 호르몬의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 사카다(Sakata) 등은 광어의 뇌하수체로부터 G-75 겔여과 크로마토그래피 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatograpy)를 통해 20 kDa의 분자량을 가진 광어 성장 호르몬을 분리정제하여 무지개 송어에 투여한 결과 성장 촉진에 큰 효과가 있음을 보고하였다(Sakata, S. et al., Gen. Comp. Endocrinol., 89, 396-404(1993)).
현재까지는 광어 성장 호르몬을 유전공학적인 방법으로 생산하는 것에 관한 보고가 없을 뿐 아니라, 기존의 염기서열로 대장균에서 발현시켰을 때에는 대장균 전체 단백질 대비 약 6% 정도 적은 양만이 발현되므로 경제적인 측면에서 바람직하지 못하다는 문제가 있었다. 이에 본 발명자들은 광어 성장 호르몬을 보다 높은 수율로 얻을 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구하던 중, 광어 성장 호르몬의 5'-말단을 아미노산 변화없이 염기서열만 무작위로 변이시켜 mRNA의 2차 구조 생성을 최소화한 염기서열의 유전자를 대장균에서 발현시키는 방법에 의해 광어 성장 호르몬을 높은 수율로 생산할 수 있게 되어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 광어 성장 호르몬을 높은 수율로 생산할 수 있는 대량 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균으로부터 높은 수율로 광어 성장 호르몬을 생산시킬 수 있는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자가 그의 5'-말단이 아미노산 변화없이 염기서열만이 변형된 것임을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 5'-말단이 아미노산 변화없이 염기서열만이 변형된 광어 성장 호르몬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
이하, 본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 광어의 뇌하수체(Pituitary glands)로부터 리보핵산(RNA)을 추출하여 이것을 역전사 효소의 주형으로 해서 올리고 d(T)프라이머를 이용하여 cDNA를 만든다. 한편, 광어 성장 호르몬의 염기서열 정보(Masanori Watahiki, et al., J. Biol. Chem., 264, 312-316(1989))로부터 광어 성장 호르몬 단백질을 코딩하는 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)용 시발체를 고안 합성한다. 이들 시발체는 5'-말단에 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인식부위가 존재하도록 하고 이에 대응되는 시발체에는 종료코돈과 제한효소 인식부위를 삽입하여, 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.
이 때, 본 발명의 태양에 따르면 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단에 대응하는 시발체는 아미노산 서열에는 변화없이 염기서열 만을 무작위로 변형시켜 mRNA의 2차 구조 생성을 최소화 하도록 설계한다.
상기 시발체를 이용하여 광어 뇌하수체 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응으로 광어 성장 호르몬 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 대장균 발현벡터인 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP)의 BGHRAN 유전자와 치환하여 발현벡터를 제조한다. 이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인 할 수 있으며, 생성된 단백질은 배양된 대장균 또는 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리정제할 수 있다.
기존의 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬 유전자는 대장균 전 단백질 대비 약 6%의 광어 성장 호르몬을 발현시키는 것에 비해, 본 발명의 태양에 따라 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열만을 무작위로 변형시킨 광어 성장 호르몬 유전자를 이용한 경우에는 대장균 전 단백질 대비 약 25% 정도의 광어 성장 호르몬을 발현시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[비교예 : 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭 및 발현]
(단계 1) 광어 뇌하수체 RNA로부터 광어 성장 호르몬 cDNA 합성
콜로진스키(Cholozynski, P.)와 사키(Sacchi, N.)의 방법(Cholozynski, P. a nd Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, 156(1987))에 따라 광어 뇌하수체로부터 리보핵산(RNA)을 추출하였다. 즉, 광어 뇌하수체 1mg에 10ml의 RNA 추출액(4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨, pH 7.0; 0.5% 사르코실(Sarcosyl); 0 .1m 2-머캅도에탄올)을 가하여 세포균질기(Grass-Teflon Homogenizer, Thomas Scientific, USA)로 파쇄시킨 다음, 8ml의 2M 아세트산 나트륨(pH 4.0), 8ml의 페놀(BRL사, 증류수로 포화시켰음), 1.6ml의 클로로포름-이소아밀알콜(49 : 1, v/v)을 가하여 잘 혼합하고 12,000×G에서 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 들어 있는 새 용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 방치한 다음 12,000×G, 4℃에서 20 분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 진공하에서 10 분간 건조시킨 후 500㎕의 TE 완충액(10mM Tris, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.
상기 수득한 광어 뇌하수체 RNA를 역전사 효소의 주형으로 하여 스트라타젠사의 Zap-cDNA 합성키트(Cat No. 200400)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 이때 역전사 효소의 시발체로는 올리고 d(T) 시발체(5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)18-3')를 핵산 합성기(Applied Biosystem Inc. U.S.A. 380B model)로 합성하여 사용하였다. cDNA 단일가닥을 합성하기 위해, 상기에서 얻은 광어 뇌하수체 RNA 용액 18㎕를 취하여 2㎕의 0.1M CH2HgOH를 가한 다음 상온에서 10 분간 방치시켜 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 2㎕의 1M 2-머캅토에탄올을 가하여 5 분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 역전사 효소 반응용액(500mM Tris-HCl, pH 8.3 750mM KCI, 30mM MgCl2; 10mM DTT), 2.5㎕의 10mM dNTP(각 10mM dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP), 2㎕의 올리고 d(T) 시발체(1.4㎕/㎕), 15㎕의 DEPC (d iethyl-pyrocarbonate) 처리된 증류수 및 1.0㎕의 RNase 억제제(RNase inhibitor, 1U/㎕, Promega, U.S.A) 순으로 가한 다음, 상온에서 10 분간 방치시켜 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게하고, 이어서 2.5㎕의 역전사 효소(18U/㎕, superscript RNase H-reverse transcriptase, BRL, U.S.A)를 가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.
(단계 2) 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭
기존의 알려진 광어 성장 호르몬 유전자의 염기서열(Masanor and Watahiki, et al., J. Biol. Chem. 264, 312-316(1989)) 정보(제1도 참조)로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다 :
시발체 PNDEFGH : 5'-GGATCCATATGCAGCCAATCACAGAGAAC-3'(이는 5'-말단에 대응하며 제한효소 NdeI의 인식부위를 가지고 있고, 광어 성장 호르몬 시그날 서열 이후의 18개 염기를 포함함)
시발체 PSALFGH : 5'-AAAAAGTCGACTACAGGGTGCAGTTAGCTTC-3'(이는 3'-말단에 대응하며 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있고, 동시에 제한효소 SalI 인식 부위를 가짐).
반응 튜브에 단계 1에서 얻은 광어 뇌하수체 cDNA 1ng을 주형으로 시발체 PNDEFGH 2㎕과 시발체 PSALFGH 2㎕을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.0% Trito X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP, 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피가 100㎕가 되도록 하여, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 중합효소연쇄반응(이하, PCR이라 함)을 40회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 약 540 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리정제하였다(이하 이 DNA 단편을 '단편 FGH'라 함).
(단계 3) 광어 성장 호르몬의 유전자 염기서열 확인
증폭된 유전자의 염기서열 확인은 생거(Sanger) 등의 방법(Sanger, F., PNAS, U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 다음과 같이 수행하였다. 먼저 증폭된 유전자 1㎕에 2㎕의 10배 농도 클레나우(Klenow) 완충용액(100mM Tris-HCl, pH 7.5, 50mM MgCl2, 75mM DTT), 10 단위의 클레나우 절편(New England Biolabs, U.S.A)을 넣고 증류수를 가하여 총부피가 20㎕가 되게 한 후 37℃에서 30 분간 반응시켜 증폭된 유전자의 양말단을 평활말단(blunt end)으로 만들고, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)용액에 용존시켰다.
플라스미드 M13mp18(Pharmacia U.S.A. Cat No. 27-1551-01) 2㎍을 제한효소 EcoRV로 NEB 완충용액 2(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단하여 0.7% 아가로오즈 겔로 분리하여 약 7kb 핵산절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산을 '단편 M13-RV'라 칭한다. 접합반응 용기에 상기에서 얻은 평활말단으로 처리한 유전자 100ng과 100ng의 단편 M13-RV, 2㎕의 10배 접합 반응용액(0.5m Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml BSA, pH 7.8), 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 이를 사용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 8㎕의 0.2M IPTG 용액을 넣고 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3ml의 2XYT 상층아가(Softagar, 1ℓ당 16g의 박토트립톤, 10g의 효모 추출물, 5g의 NaCl, 5g의 박토아가)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하여 최소 평판배지 ACMin Aplate, 1ℓ당 10.5g의 K2HPO4, 1g의 (NH4)SO4, 0.5g의 시트르산 나트륨, 12g의 박토아가, 1ml의 20% MgSO4, 0.5ml의 1% Vit B, 10ml의 50% 글루코즈) 위에 고르게 도포한 후 37℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 생성된 투명한 플라크(plaque)를 이쑤시개로 찍어서 2ml의 2XYT 액체배지에서 37℃의 온도로 5 시간 동안 배양한 후 원심분리하였다. 수득한 상층액에서 1/4 부피의 PEG/NaCl (20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨)을 넣은 다음 M13 파아지(phage)를 수거해서 단일 가닥 핵산을 추출한 후 염기서열을 분석하였다. 제2a도의 단편 FGH의 5'-말단 염기서열을 보여주는데, 이는 제1도의 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열과 일치하고 있음을 알 수 있다.
(단계 4) 광어 성장 호르몬의 발현벡터 제조
본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP, 대한민국 특허출원 제94-40025호) 2㎕을 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM dTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 뒤 제한효소 NdeI으로 부분절단하고, 이를 0.7% 아가로오즈 겔로 분리하여 약 2.4kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 '단편 ptrp 3H-N/L'이라 한다. 한편, 단계 2에서 얻은 단편 FGH를 제한효소 NdeI과 SalI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 후 이들을 페놀/글로로포름으로 추출하고 20㎕의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 FGH-N/L'이라 한다. 접합 반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 ptrp 3H-N/L과 100ng의 단편 FGH-N/L, 2㎕의 10배 접합 반응용액(0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml BSA, pH 7.8), 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝난 다음 얻어진 '단편 FGH'를 함유한 광어 성장 호르몬의 발현벡터 'ptrp 3H FGH'를 가지고 대장균 W3110(ATCC 37339)를 형질전환시켰다.
제3도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것으로, a도는 정상적 광어 성장 호르몬 유전자 단편 FGH를 ptrp 3H-N/L과 접합시켜 ptrp 3H FGH를 얻는 과정을 보여준다.
(단계 5) 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현
상기 단계 4에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화 나트륨)에서 12 시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml을 300ml의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/ml Vit. B1, 40㎍/ml 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(Indole Acrylic Acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/ml이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, Ja14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 발현을 확인하였다. 덴시토미터로 측정한 결과 플라스미드 ptrp 3H FGH로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 광어 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 6.2%의 발현율을 보임을 알 수 있었다.
[실시예 : 5'-말단에 변형된 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭 및 발현]
(단계 1) 변형된 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭
기존의 광어성장 호르몬 염기서열(Masanori Watahiki, et al., J. Biol. Chem. 264, 312-316(1989)) 정보(제1도 참조)로부터 다음과 같은 무작위 시발체를 합성하였다.
시발체 PFGHRAN :
5'-CCGCTCATATGCA(A/G)CCNAT(A/C/T)
ACNGA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)CGNCTNTT
(T/C)TCNAT(A/C/T)GCNGTNGGTCGAGT
TCAGTATCT-3'
(이는 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단에 대응되며 제한효소 NdeI 인식부위를 가지고 있고, 광어 성장 호르몬의 시그날 서열 이후 14개 아미노산에 대해서는 아미노산 변화없이 염기서열만 변형시키고 그 이후 17 염기쌍은 광어 성장 호르몬의 14 번째 아미노산 이후의 염기서열과 일치함).
반응튜브에 상기 비교예의 단계 4에서 얻은 플라스미드 ptrp 3H FGH 1ng을 주형으로 넣고 시발체 PFGHRAN 2㎍, 시발체 PSALFGH 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, 9.0, 1.0% Triton X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 약 540 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고 동일 조건의 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리정제하였다. 이하 이 '단편을 RFGH'라 칭한다.
(단계 2) 변형된 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬 유전자의 발현벡터 제조
상기 단계 1에서 얻은 '단편 RFGH'를 제한효소 NdeI과 SalI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 RFGH-N/L'이라 한다. 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 RFGH-N/L, 100ng의 단편 ptrp 3H-N/L(비교예 (단계 4)에서 얻은 것), 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 반응시켰다. 접합반응이 끝난 다음 얻어진 '단편 RFGH'를 함유한 광어 성장 호르몬의 발현벡터 'ptrp 3H RFGH'를 가지고 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질전환시켰다.
상기 형질전환된 대장균 W3110/ptrp 3H RFGH중 발현율이 높은 것을 선별하여 각각 선별하여 각각 대장균 W3110/ptrp 3H RFGH #16과 대장균 W3110/ptrp 3H RFGH #36를 1995년 11월 7일자로 한국과학기술원 생명과학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 8699P호 및 제KCTC 8700P호 기탁하였다.
제3b도는 5'-말단 변형된 광어 성장 호르몬 유전자 단편 RFGH를 ptrp 3H-N/L과 접합시켜 ptrp 3H RFGH를 얻는 과정을 보여준다.
(단계 3) 변형된 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬의 발현유도 및 염기서열 확인
상기 실시예 1에서 얻은 재조합 대장균 200 여개의 콜로니를 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화 나트륨)에서 12 시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml 씩을 300ml의 M9 배지로 옮겨 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아가 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 IAA를 최종농도 50㎍/ml이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포침전물을 램리의 방법에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과, 대조군에 비해 약 3 내지 4배 발현이 증가된 클론을 선별할 수 있었으며 이를 ptrp 3H RFGH #16, ptrp 3H RFGH #36이라 명명하였다. 덴시토미터로 측정한 결과, 플라스미드 ptrp 3H RFGH #16으로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 광어 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 약 22%의 발현율을 보였으며, 플라스미드 ptrp 3H RFGH #36으로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 광어 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 약 26.5%의 발현율을 보였다.
상기에서 얻은 ptrp 3H RFGH #16, ptrp 3H RFGH #36 클론으로부터 광어 성장 호르몬의 5'-말단의 염기서열을 생거 등의 방법에 따라 다음과 같이 확인하였다. 먼저 각각의 플라스미드 2㎍을 제한효소 HindIII로 NEB 완충용액 2(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 후 제한효소 EcoRI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단하였으며, 이를 7% 폴리아크릴아미드 겔로 분리하여 약 290 염기쌍의 핵산절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산 절편들을 각각 'RFGH16-H/R' 및 'RFGH36-H/R'이라 한다. 한편, 플라스미드 M13mp18 2㎍을 제한효소 HindIII와 제한효소 EcoRI로 NEB 완충용액 2의 조건하에서 완전절단하였으며 이를 0.7% 아가로오즈 겔로 분리하여 약 7Kb의 핵산절편을 분리하였다. 이하, 이 핵산 절편을 '단편 M13-H/R'이라 한다. 접합반응 용기 A에 상기에서 얻은 'RFGH16-H/R' 100ng, 접합반응 튜브 B에 'RFGH36-H/R' 100ng을 넣은 뒤 각각의 튜브에 100ng의 단편 M13-H/R, 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 이들 각각을 사용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 8㎕의 0.2MIPTG 용액을 넣고 미리 배양된 헬퍼세포 (대장균 JM105) 100㎕, 3ml의 상층아가 및 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하여 Min A 플레이트 위에 고르게 도포한 후 37℃에서 12 시간 배양하였다. 생성된 투명한 플라크를 이쑤시개로 찍어서 2ml의 2XYT 액체배지에서 37℃의 온도에서 5 시간 동안 배양한 후 원심분리하여 얻은 상층액에, 1/4 부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌 글리콜, 2.5M 염화 나트륨)을 넣은 다음 M13 파아지를 수거해서 단일가락 핵산을 추출한 후 광어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열을 확인하였다.
제2b도 및 c도는 5'-말단 변형된 광어 성장 호르몬 유전자 단편을 포함하는 ptrp 3H RFGH #16 및 ptrp 3H RFGH #36에서 광어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열을 보여준다.
제4도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다.
제4도에서 제1열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균, 제2 및 3열은 플라스미드 ptrp 3H FGH를 함유한 대장균, 제4 및 5열은 플라스미드 ptrp 3H RFGH #16을 함유한 대장균, 제6 및 7열은 플라스미드 ptrp 3H RFGH #36을 함유한 대장균에서의 광어 성장 호르몬 발현을 나타낸 것이고, 제10열은 표준 분자량 표지 단백질이다.
상기 결과에서 보듯이, 기존의 광어 성장 호르몬 유전자 염기서열의 경우 매우 낮은 발현율을 보이는데 반해, 광어 성장 호르몬의 5'-말단의 염기서열을 변화시킨 결과 약 3 내지 4배 이상의 발현율 증가를 보임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 생산방법에 따라 광어 성장 호르몬을 대량 생산할 수 있는 길이 열리게 되었다.
Claims (6)
- 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자가 그의 5'-말단이 하기 염기서열의 어느 하나로 변형된 것임을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬의 제조방법 :또는
- 제1항에 따른 광어 성장 호르몬 유전자의 변형을 위한 다음 염기서열의 시발체 PFGHRAN :
- 5'-말단이 하기 염기서열의 어느 하나로 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 발현벡터.또는
- 제3항에 있어서, 발현벡터 ptrp 3H RFGH #16 또는 ptrp 3H RFGH #36.
- 제3항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
- 제5항에 있어서, 대장균 W3110/ptrp 3H RFGH #16인 KCTC 8699P 또는 대장균 W3110/ptrp 3H RFGH #36인 KCTC 8700P.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950041474A KR0184770B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1019950041474A KR0184770B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR970027307A KR970027307A (ko) | 1997-06-24 |
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Family
ID=19434202
Family Applications (1)
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| KR1019950041474A KR0184770B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| KR (1) | KR0184770B1 (ko) |
-
1995
- 1995-11-15 KR KR1019950041474A patent/KR0184770B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR970027307A (ko) | 1997-06-24 |
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