KR100232658B1

KR100232658B1 - 대장균에서 인간 혈소판 생성 촉진인자의 제조방법

Info

Publication number: KR100232658B1
Application number: KR1019970010763A
Authority: KR
Inventors: 김천형; 조중명; 이재형
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 1999-12-01
Also published as: KR19980074788A

Abstract

본 발명은 인간 혈소판 생성 촉진인자(thrombopoietin: TPO) 단백질의 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자(TPO153) 단백질을 대장균에서 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, TPO153 유전자의 5'-말단의 염기서열을 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형시키고, 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결된 것을 특징으로 하는 TPO153 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 TPO153 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 방법에 의하면 기존의 방법보다 높은 수율로 대장균에서 TPO153 단백질을 생산할 수 있다.

Description

대장균에서 인간 혈소판 생성 촉진인자의 제조방법

본 발명은 인간 혈소판 생성 촉진인자(thrombopoietin; 이하 TPO라 함) 단백질의 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자(이하 TPO153이라 함)을 대장균에서 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TPO153 유전자의 5'-말단 염기서열을 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형시키고, 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 앞에는 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결되도록 하여 대장균에서 발현시킴으로써 TPO153 단백질을 높은 효율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

골수의 근세포가 거핵아구(megakaryoblast)를 거쳐 거핵구(megakayocyte)로 분화되는 과정에는 여러 조혈 성장인자들이 관여한다. 즉, 근세포는 초기에 거핵구 콜로니 자극인자(megakaryocyte colony-stimulating factors: MK-CSFs)와 비특이성 분화계열 사이토카인의 일종인 인터루킨-3(IL-3), 과립구 거식 콜로니 자극인자(GM-CSF)와 근세포 성장인자(SCF)에 의해 거핵아구로 분화되고 이후에 특이성 분화계열에 속하는 사이토카인의 일종인 TPO에 의해 성숙과정을 거치게 된다(Gordon, M. S. et al., Blood, 80, 302(1992)).

1960년대 이후 혈소판 감소증 동물의 혈장으로부터 TPO를 정제하려는 많은 노력이 있었으나, 혈장내에는 수많은 다른 단백질이 존재할 뿐 아니라 TPO 단백질의 활성측정을 위한 방법도 확립되어 있지 않아서 순수한 TPO를 얻는데 실패하였다. 그런데 생쥐에서 혈액암을 일으키는 골수증식성 백혈병 바이러스 (myeloproliferative leukemia virus: MPLV)의 암유전자(oncogene)인 v-mpl로부터 원암유전자(protooncogene)인 C-mpl 유전자가 클로닝되었고, 이어서 이 C-mpl의 N-말단 부위는 잘 보존된 4개의 Cys 잔기와 생체막 인접부위에 트립토판(Trp)-세린(Ser)-X-트립토판-세린 모티브를 포함하는 것으로 밝혀져, C-mpl는 조혈인자 수용체 계열에 속한다는 것이 알려졌다(Souyri, M. et al., Cell, 63, 1137(1990); Vignon, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5640(1992); Skoda, R. C. et al., EMBO, J., 12, 2645(1993); 및 Bazan, J. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6934(1990)). 또한 메티아 등은 C-mpl이 거핵구 형성을 조절하는 사이토카인 수용체라는 결과를 보고하였는데, 이는 C-mpl 유전자의 mRNA가 거핵구 형성이 일어나는 세포에서만 특이하게 관찰되고, 또한 C-mpl 유전자에 대한 항-올리고뉴클레오티드를 조혈 근세포에 도입하여 이 유전자의 발현을 억제시키면 거핵구 형성 과정이 선택적으로 저지된다는 결과에서 비롯된다(Methia, N. et al., Blood, 82, 1395(1993)). 최근 C-mpl 유전자를 이용하여 쥐를 형질전환시키고 이들 형질전환된 쥐의 특성을 연구함으로써 C-mpl의 기능을 더욱 분명하게 보고한 바 있다(Gurney A. L. et al., Science, 265, 1445(1994)).

한편, 이러한 보고들과 C-mpl의 수용성 부분만 발현시킨 재조합 C-mpl과 방사선이 조사된 동물의 혈청을 혼합시키면 TPO 활성이 없어진다는 보고는 C-mpl의 리간드(ligand)가 TPO일 수 있다는 가능성을 제시하는 것으로, 이를 바탕으로 하여 제넨텍(Genentech)사와 암젠(Amgen)사에서는 C-mpl 유전자의 수용성 부분만을 발현시키고 이를 고정화한 친화 크로마토그래피 방법을 이용하여 혈소판 감소증 혈장으로부터 리간드를 분리정제하는데 성공하였다. 또한 분리정제된 리간드 단백질의 5'-말단 아미노산 서열을 확인한 후 이를 이용하여 만든 올리고뉴클레오티드를 탐침(probe)으로 하여 사람, 쥐 그리고 개의 TPO 유전자 염기서열을 최초로 보고하였다(Bartley, T. D. et al., Cell, 77, 1117(1994); De Sauvage, F. J. et al., Nature, 369, 533(1994)).

TPO 단백질은 인간의 경우 353개의 아미노산, 개와 쥐의 경우에는 각각 352개 및 356개의 아미노산으로 구성되어 있고, 이들 간의 아미노산 서열은 매우 유사한 것으로 알려져 있다. TPO 단백질의 아미노산 서열은 다른 성장인자들과의 유사성으로 볼 때 2개의 영역으로 구분된다. N-말단 영역은 152개 또는 153개의 아미노산으로 이루어져 있고 EPO와는 약 25%의 아미노산 유사성을 가지는 반면, C-말단 영역은 기존에 알려진 어떤 폴리펩티드와도 유사성이 발견되지 않았고 6개의 N-당화부위가 존재한다. 인간 TPO 단백질에서 C-말단 영역을 제거(truncation)시켜 얻은 절단된 TPO, 즉 시그날 서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 TPO153과 천연형 TPO의 활성도를 비교하였을 때 생체외(in vitro)에서 매우 유사한 활성을 나타낸 것으로 보아, C-말단 영역은 TPO 활성에 무관한 것으로 보고되었다(De Sauvage, F. J. et al., Nature, 369, 533(1994)).

또한 재조합 TPO를 생쥐에 주사했을 때 골수와 지라에서 거핵구의 형성과 혈소판 양이 4배 정도 증가한다는 사실이 보고되었고(Kaushansky K. Lok S. et al., Nature, 369, 568(1994)), 이로부터 TPO가 혈소판 생성을 촉진하는 기능을 갖는 체액성 인자임이 확인되었다.

이처럼 TPO는 혈소판 생성조절에 특이하게 관여하는 체액성 인자로서, 혈소판 감소증 환자에게 투여할 경우 혈소판 양의 회복을 촉진시키는 치료제로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

최근에는 사람의 TPO 유전자를 동물세포에서 발현시키는 방법들이 개발되었다(Bartley, T. D. et al., Cell, 77, 1117(1994); De Sauvage, F. J. et al., Nature, 369, 533(1994)). 그러나 동물에서 발현된 TPO는 당화된 형태로 3차 구조를 연구하기에는 적합하지 않다는 단점이 있다. 따라서 TPO의 3차 구조 연구를 위해 대장균에서 비당화된 형태의 TPO 만을 발현시키고자 하는 시도가 있었으나 그 발현량이 현저히 낮아 실용성이 없었다.

이에 본 발명자들은 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 TPO153이 천연형 TPO의 활성과 매우 유사하다는 보고로부터 착안하여(De Sauvage, F. J. et al., Nature, 369, 533(1994)) trp 프로모터 하에서 TPO153 유전자의 5'-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형되고, 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부 및 이후의 리보소옴 결합부위와 시작코돈인 ATG 사이에 2차 구조가 생기지 않도록 고안된 합성링커를 연결시킨 TPO153 유전자 발현벡터를 대장균에서 발현시킴으로써 비당화된 TPO153 단백질을 대장균에서 높은 수율로 발현시키는데 성공하였으며, 이에 따라 현재까지 밝혀지지 않은 TPO 단백질의 3차 구조분석 및 변이체 제조가 가능하게 되었다.

본 발명의 목적은 TPO153을 대장균에서 높은 수율로 대량 발현시킬 수 있도록 변형된 재조합 인간 TPO153 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 그리고 이를 사용하여 인간 TPO153를 높은 수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 인간 혈소판 생성 촉진인자의 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자 단백질(TPO153)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 TPO153 유전자를 포함하는 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자를 포함하는 발현벡터 ptrp 3HIS RTPO153의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 4는 TPO153 유전자 및 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153 및 ptrp 3HIS RTPO153으로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자의 염기서열을 기존의 TPO153 유전자의 염기서열과 비교한 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 TPO153 유전자의 5'-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형되고, 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 시작코돈(ATG)에서 37개 염기쌍 부위와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결된 것을 특징으로 하는 TPO153의 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균, 그리고 상기 형질전환된 대장균을 인간 혈소판 생성 촉진인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 TPO153의 제조방법을 제공한다.

여기에서, TPO153 유전자의 5'-말단 앞에 연결된 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈은 하기 서열 1인 것이 바람직하다.

[서열 1]

또한, 본 발명에 따라 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 염기서열은 하기 서열 2 내지 4와 같은 것이 바람직하다.

[서열 2]

[서열 3]

[서열 4]

이하, 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다.

먼저, 인간 태아 간으로부터 리보핵산(RNA)을 추출하여 이것을 올리고 d(T) 프라이머 또는 무작위 프라이머를 이용하여 역전사 효소로 cDNA를 만든다. 한편 TPO 유전자의 염기서열 정보(D. C. Foster, et al., PNAS, USA, 91, 13023(1994); T. D. Bartley, et al., Cell, 77, 1117(1994))로부터, TPO153 단백질을 코딩하는 TPO153 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR이하 함)용 프라이머를 고안합성한다. TPO153 유전자의 5'-말단에 대응하는 프라이머는 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인지부위가 존재하고, TPO153 유전자의 5'-말단 앞에는 연어 성장 호르몬의 시작코돈(ATG)에서 37개 염기쌍 부위와 리보소옴 결합부위, 그리고 연어 성장 호르몬의 합성을 중지시키기 위한 종료코돈(TAA)이 삽입된 바이시스트로닉용 프라이머로 만들며, 이에 대응되는 3'-말단 프라이머에는 종료코돈과 제한효소 인지부위를 삽입하여, 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.

인간 태아 간 cDNA를 주형으로 하고 상기 프라이머들을 이용하여 PCR 반응에 의해 TPO153 유전자를 증폭한다. 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 대장균 발현벡터인 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP)의 복제 원점 부위(ori) 부근의 NdeI 인지부위를 제거하고, BGHRAN 유전자와 치환하여 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153을 제조한다.

이 때 본 발명에 따라 TPO153의 발현율을 증가시키기 위하여, TPO153 유전자의 5'-말단 일부가 아미노산 서열에는 변화없이 염기서열 만이 무작위로 변형되도록 TPO153 유전자의 5'-말단에 대응하는 PCR용 프라이머를 고안합성한다. 이에 대응되는 프라이머는 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153의 Amp 유전자 부위에 위치하며 제한효소 PvuI 인지부위를 포함하도록 고안 합성하다. 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153를 주형으로 하고 상기 프라이머들을 이용하여 PCR 반응에 의해 변형된 TPO153 유전자를 증폭한다. 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 ptrp 3HIS TPO153의 TPO153 유전자와 치환하여 발현벡터 ptrp 3HIS RTPO153을 제조한다.

이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인할 수 있으며, 생성된 단백질은 배양된 대장균 또는 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

비 교 예 1 : 바이시스트로닉 시스템을 이용한 TPO153의 발현

(단계 1) 인간 태아 간으로부터 cDNA 합성

콜로진스키와 사키의 방법(Cholozynski, P. & Sacchi, N. et al., Anal. Biochem., 162, 156(1987))에 따라 인간 태아 간으로부터 다음과 같이 RNA를 추출하였다. 인간 태아 간 1㎎에 RNA 추출액(4M 구아니디움 티오시아네이트, 25mM 구연산 나트륨, pH 7.0, 0.5% 사르코실(sarcosyl), 0.1M 2-머캅토에탄올) 10㎖를 가하고 세포균질기(Grass-Teflon Homogenizer, Thomas Scientific, U.S.A.)로 파쇄시킨 다음, 2M 아세트산 나트륨(pH 4.0) 8㎖, 페놀(BRL사, 증류수로 포화됨) 8㎖, 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v) 1.6㎖를 가하여 잘 혼합한 후 12,000 x G로 4℃에서 15 분간 원심분리하였다. 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 들어 있는 새 용기에 옮기고 -20℃에서 약 1 시간 동안 방치한 후, 12,000 X G로 4℃에서 20 분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 진공하에서 10 분간 건조시킨 후 500㎕의 TE 완충액(10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.

상기에서 수득한 인간 태아 간 RNA를 역전사 효소의 주형으로 하여 Zap-cDNA 합성 키트(스트라타젠사 Cat No. 200400)를 사용하여 cDNA를 제조하였으며, 이 때 역전사 효소의 프라이머로는 올리고 d(T) 프라이머

를 핵산 합성기(Applied Biosystems Inc. U.S.A. 380B model)를 이용하여 합성하였다. cDNA 단일가닥을 합성하기 위해서, 상기에서 얻은 인간 태아 간 RNA 용액 18㎕를 취하여 0.1M Hg(CH₂)₂2㎕를 가하고 상온에서 10 분간 방치하여 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 1M의 2-머캅토에탄올 2㎕를 가하여 5 분간 반응시켰다. 여기에 역전사 효소 반응용액(500mM 트리스-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨) 5㎕, 10mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP) 2.5㎕, 디에틸피로카보네이트(DEPC, diethylpyrocarbonate)가 처리된 증류수 15㎕, 올리고 d(T) 프라이머(1.4㎍/㎕) 2㎕, RNase 억제제(RNase inhibitor, 1U/㎕, Promega, U.S.A.) 1.0㎕의 순으로 가하고 상온에서 10 분간 방치시켜 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게 한 다음, 2.5㎕의 역전사 효소(18U/㎕, Superscript RNase H^-Reverse transcripase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.

(단계 2) 연어 성장 호르몬의 5'-말단 일부의 유전자를 포함한 TPO153 유전자의 합성

본 출원인의 선출원 명세서 중에 기재된 플라스미드 ptrp HS BGH 1-13의 염기서열 정보(대한민국 특허출원 제 86-11712 호) 및 기존의 TPO 염기서열 정보(D. C. Foster, et al., PNAS, USA, 91, 13023(1994); T. D. Bartley, et al., Cell, 77, 1117(1994)로부터 다음과 같은 프라이머를 합성하였다.

프라이머 P3HSTPO153:

(이 프라이머는 TPO153 유전자의 5'-말단에 대응하는데, 제한효소 NdeI 인지부위를 가지고 있고, 밑줄친 부분은 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열을 나타내며 박스내 AGGA는 리보소옴 결합부위, 박스내 TAA는 연어 성장 호르몬 일부 유전자의 종료코돈을 나타낸다. 그 이후의 24개 염기쌍은 시작코돈(ATG)과 TPO 유전자의 시그날 서열 이후의 염기서열을 나타낸다).

프라이머 PSALTPO153

(이 프라이머는 TPO153 유전자의 3'-말단에 대응하며, TPO 유전자의 시그날 서열 이후 153번째 아미노산에서 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있고, 동시에 제한효소 SalI 인지부위를 갖는다).

반응튜브에 상기 단계 1에서 얻은 인간 태아 간 cDNA 1ng을 주형으로 하여 프라이머 P3HSTPO153 2㎍과 프라이머 PSALTPO153 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1.0% 트리톤 X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP 및 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕가 되도록 하여, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(어닐링단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리하여 약 480 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 젤로 분리정제하였다. 이하 이 단편을 '단편 HSTPO153'이라 칭한다.

(단계 3) TPO153 유전자의 염기서열 확인

증폭된 유전자의 염기서열 확인은 생거 등의 방법(Sanger, F. PNAS USA 74, 5463(1977))에 따라 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 증폭된 유전자 단편 HSTPO153 1㎍을 2㎕의 10배 농도 클레나우(Klenow) 완충용액(100mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM MgCl₂, 75mM DTT), 10 단위의 클레나우 절편(New England Biolabs, USA)을 넣고 증류수를 가하여 총부피가 20㎕가 되게 한 후 37℃에서 30 분간 반응시켜 증폭된 유전자의 양말단을 평활말단으로 만들고, 이를 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용존시켰다.

플라스미드 M13mp18(Pharmacia USA Cat. no. 27-1551-01) 2㎍을 NEB 완충용액 2(10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 제한효소 EcoRV로 완전절단한 후 이를 0.7% 아가로즈 겔로 분리하여 약 7kb의 핵산 절편을 분리정제하였다. 이하, 이 핵산 절편을 '단편 M13-RV'라 칭한다.

접합반응 용기에 상기에서 얻은 평활말단으로 처리한 유전자 100ng과 단편 M13-RV 100ng, 2㎕의 10배 접합 반응용액(0.5M 트리스-HCl, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5㎎/㎖ BSA, pH 7.8), 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 이를 이용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)을 형질전화시키고, 형질전환된 세포에 0.2M IPTG(이소프로필-β-D-디오갈락토피라노시드) 용액 8㎕을 넣고 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3㎖의 2XYT 상층아가(소프트 아가, 1ℓ당 16g의 박토트립톤, 10g의 효모 추출물, 5g의 NaCl, 5g의 박토아가)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하고 최소 평판배지 A(min A plate, 1ℓ당 10.5g의 K₂HPO₄, 1g의 (NH₄)₂SO₄, 0.5g의 시트르산 나트륨, 12g의 박토아가, 1㎖의 20% MgSO₄, 0.5㎖의 1% Vit B, 10㎖의 50% 글루코즈) 위에 고르게 도포한 후, 37℃에서 12 시간 배양하였다. 생성된 투명한 플라크(plaque)를 이쑤시개로 찍어서 2㎖의 2XYT 액체 배지에서 37℃, 5 시간 동안 배양한 후 원심분리하고, 수득한 상등액에 1/4 부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨)을 넣은 다음, M13 파아지(phage)를 수거해서 단일가닥 핵산을 추출한 후 이들의 염기서열을 분석한 결과 인간 TPO의 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 TPO153 단백질의 염기서열을 가짐을 확인하였다.

(단계 4) 바이시스트로닉 시스템을 이용한 TPO153의 발현벡터 제조 및 대장균 형질전환

본 출원인의 선출원(대한민국 특허출원 제 94-40025 호) 명세서 중에 기재된 플라스미드 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP)의 복제 원점 부위(ori) 부근의 NdeI 인지부위를 제거한 플라스미드 2㎍을 NEB 완충용액 3(10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 제한효소 NdeI과 SalI으로 완전절단한 뒤, 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 2.4kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 '단편 ptrp 3HI-N/L'이라 한다. 한편, 상기 단계 2에서 얻은 '단편 HSTPO153'를 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 NdeI과 SalI으로 완전절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하고 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 HSTPO153-N/L'이라 한다. 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 '단편 ptrp 3HI-N/L'과 100ng의 '단편 HSTPO153-N/L', 2㎕의 10배 접합 반응용액 및 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝나면 대장균 W3110(ATCC 37339)에 형질전환시킨 후, 형질전환된 균체로부터 단편 HSTPO153를 함유하는 대장균 발현벡터 'ptrp 3HIS TPO153'을 얻었다.

(단계 5) 바이시스트로닉 시스템을 이용한 TPO153 유전자의 발현유도

상기 단계 4에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트리톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탄배양한 다음, 이중 3㎖을 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B1, 40㎍/㎖ 앰피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도가 650㎚에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종 농도가 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한 지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정하고 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000 rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물들을 램리의 방법(Laemmli, Nature, 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리크릴아미드 젤 전기영동하여 발현을 측정하였다.

도 4에는 TPO153 유전자를 포함하는 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153으로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과가 나타나 있는데, 여기에서 보면 TPO153 단백질(제 2 열)이 거의 발현되지 않았음을 알 수 있다.

실 시 예 1 : 바이시스트로닉 시스템을 이용하는 변형된 TPO153 유전자의 증폭 및 발현

(단계 1) 연어 성장 호르몬의 5'-말단 일부의 염기서열을 포함하며 5'-말단에 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자의 합성

기존의 TPO의 염기서열 정보로부터 TPO153 유전자의 염기서열을 아미노산의 변화없이 대장균에서 선호하는 염기코돈으로 치환, 변형시키기 위해 다음과 같은 무작위 프라이머를 고안 합성하였다:

프라이머 PTPO153RAN:

(이 프라이머는 TPO153 유전자의 5'-말단으로부터 23개 아미노산에 대해서는 아미노산 변화없이 염기서열 만을 변형시키고, 24번째 아미노산과 25번째 아미노산 위치에 제한효소 XbaI의 인지부위(AGCAGA가 TCTAGA로 아미노산 변화없이 치환변형됨)가 존재한다).

프라이머 PXTPO153:

(이 프라이머는 TPO153 유전자의 26번째 아미노산부터 32번째 아미노산과 동일한 염기서열을 포함하며, 24번째 아미노산과 25번째 아미노산 위치에 제한효소 XbaI의 인지부위(AGCAGA가 TCTAGA로 아미노산 변화없이 치환변형됨)가 존재한다).

프라이머 PPBR3720:

(이 프라이머는 플라스미드 ptrp 3HIS TPO153의 Amp 유전자 부위에 위치하며, 제한효소 PvuI의 인지부위를 포함한다).

반응튜브 A에는 프라이머 PTPO153RAN 2㎍, 프라이머 PPBR3720 2㎍을 넣고, 반응튜브 B에는 프라이머 PXTPO153 2㎍, 프라이머 PSALPTO153 2㎍을 넣은 다음, 각각의 튜브에 상기 비교예 1의 단계 4에서 얻은 플라스미드 ptrp 3HIS TPO153 1ng을 주형으로 넣고 10㎕의 10배 중합 완충용액, 10㎕의 2mM dNTP, 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(어닐링단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤에서 분리한 결과, 반응튜브 A에서는 약 1000 염기쌍의 핵산, 반응튜브 B에서는 약 420 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 젤로부터 분리 정제하였다. 이하, 이 단편을 각각 '단편 RTPO153' 및 '단편 XLTPO153'라 칭한다

(단계 2) 바이시스트로닉 시스템을 이용하는 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자의 발현벡터 제조 및 대장균 형질전환

상기 비교에 1의 단계 4에서 얻은 플라스미드 ptrp 3HIS TPO153 2㎍을 NEB 완충용액 3 조건하에서 제한효소 SalI와 PvuI로 완전절단한 후, 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 1.6kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 '단편 ptrp 3HI-L/P'이라 칭한다.

한편, 상기 단계 1에서 얻은 단편 RTPO153를 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 XbaI과 PvuI으로 완전절단한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 RTPO153-X/P'라 한다. 또한 상기 단계 1에서 얻은 단편 XLTPO153를 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 XbaI과 SalI으로 완전절단한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 XLTPO153-X/L'라 한다. 이어서, 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 RTPO153-X/P와 100ng의 단편 XLTPO153-X/L, 의 단편 ptrp 3HI-L/P, 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝나면 대장균 W3110(ATCC 37339)에 형질전환시킨 후, 형질전환된 균체로부터 '단편 RTPO153'을 함유하는 대장균 발현벡터 'ptrp 3HIS RTPO153'를 얻었다.

(단계 3) 대장균에서 바이시스트로닉 시스템을 이용하는 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자의 발현

상기 단계 2에서 얻은 제조합 대장균 200 여개의 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 액체 루리아 배지에서 12 시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖를 300㎖의 M9 배지로 옮겨서 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 IAA를 최종농도가 50㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. IAA를 첨가한 지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정하고 원심분리기를 이용하여 11,000 rpm에서 25 분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 발현을 확인하였고, 상기 비교에의 대조군에 비해 발현이 증가된 클론을 선별하여 각각 'ptrp 3HIS RTPO153 #13', ptrp 3HIS RTPO153 #15' 및 ptrp 3HIS RTPO153 #74'라 명명하였다.

상기 형질전환된 대장균 W3110/ptrp 3HIS RTPO153 #13, 15, 74를 1996년 7월 11일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0262BP 호로서 기탁하였다.

도 4는 TPO153 유전자 및 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 TPO153 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터 ptrp 3HIS TPO153 및 ptrp 3HIS RTPO153으로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 제 1 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균, 제 2 열은 플라스미드 ptrp 3HIS TPO153을 함유한 대장균, 제 3, 10 및 18 열은 각각 플라스미드 ptrp 3HIS RTPO153 #13, 플라스미드 ptrp 3HIS RTPO153 #15 및 플라스미드 ptrp 3HIS RTPO153 #74를 함유한 대장균, 제 M 열은 표준 분자량 단백질을 나타낸 것이고, 나머지 열들은 플라스미드 ptrp 3HIS RTPO153을 함유한 대장균을 나타낸 것이다. 여기에서 보면 기존의 TPO153 유전자를 함유한 발현벡터로 형질전환된 대장균에서는 TPO153 단백질이 거의 발현되지 않은데 비해, 본 발명에 따라 변형된 TPO153 유전자를 함유한 발현벡터로 형질전환된 대장균, 특히 ptrp 3HIS RTPO153 #13, ptrp 3HIS RTPO153 #15 및 ptrp 3HIS RTPO153 #74의 경우에는 TPO153 단백질의 발현율이 월등히 높은 것을 알 수 있다.

(단계 4) 바이시스트로닉 시스템을 이용하는 변형된 TPO153 말단의 염기서열 확인

상기에서 얻은 ptrp 3HIS RTPO153 #13, ptrp 3HIS RTPO153 #15 및 ptrp 3HIS RTPO153 #74 클론으로부터 TPO153의 5'-말단 염기서열을 확인하기 위하여 생거 등의 방법에 따라 다음과 같이 행하였다. 먼저 각각의 플라스미드 2㎍을 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 PstI와 EcoRI로 완전절단하였으며, 이를 7% 폴리아크릴아미드 젤로 분리하여 약 420 염기쌍의 핵산절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산 절편들을 각각 '단편 RTPO15313-P/R', '단편 RTPO15315-P/R' 및 '단편 RTPO15374-P/R'이라 한다.

한편, 플라스미드 M13mp18 2㎍을 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 PstI와 EcoRI로 완전절단하였으며, 이를 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 7kb의 핵산절편을 분리하였다. 이하, 이 핵산절편을 '단편 M13-P/R'이라 한다.

각각의 접합반응 용기에 상기에서 얻은 단편 RTPO15313-P/R, 단편 RTPO15315-P/R 및 단편 RTPO15374-P/R을 각각 100ng씩 넣은 뒤 각각의 튜브에 100ng의 단편 M13-P/R, 2㎕의 10배 접합반응 용액, 및 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 이들 각각을 이용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 8㎕의 0.2M IPTG 용액을 넣은 후 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3㎖의 2XYT 상층아가(Soft Agar: 16g, 박토트립톤, 10g 효모 추출물, 5g NaCl, 5g 박토아가/ℓ)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하여 최초 평판배지 A 위에 고르게 도포한 다음 37℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 생성된 투명한 플라크를 이쑤시개로 찍어서 2㎖의 2XYT 액체 배지에서 37℃, 5 시간 동안 배양한 후 원심분리하여 얻은 상층액에 1/4 부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨)을 넣고 M13 파아지를 수거해서 단일가닥 핵산을 추출한 후 변형된 TPO153의 5'-말단 염기서열을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 기존의 TPO153 유전자의 경우 대장균에서 매우 낮은 발현율을 보이는데 비해, 본 발명에 따라 TPO153 유전자의 5'-말단 염기서열을 아미노산 변화없이 치환변형시키고, 치환변형된 TPO153 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결되도록 한 결과 발현율이 현전히 향상됨을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 생산방법에 따르면 TPO153 단백질을 효율적으로 대량 생산할 수 있으며, 이를 이용하여 현재까지 밝혀지지 않은 TPO 단백질의 3차 구조 분석 및 변이체 제조에 기여할 수 있다.

Claims

인간 혈소판 생성 촉진인자(TPO) 단백질의 시그날서열 이후부터 153번째 아미노산까지를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자(TPO153) 유전자가 하기 서열 2, 3 또는 4의 5'-말단 염기서열을 갖고, 상기 5'-말단 서열 앞에는 하기 서열 1의 염기서열이 연결된 것을 특징으로 하는 TPO153 유전자:

서열 1

ATG ATC GAA AAT CAG CGT TTA TTC AAC ATT GCA GTT TCT AGC ATG GAG GAA TTA TAA

서열 2

ATG AGC CCC GCA CCT CCG GCG TGT GAT CTC CGC GTT CTA AGC AAG CTC CTC CGC GAC TCC CAC GTC CTT CAC

서열 3

ATG AGC CCA GCA CCC CCC GCC TGC GAC CTA CGA GTT CTA AGC AAA CTC CTA CGG GAT TCT CAT GTC CTC CAC

서열 4

ATG AGC CCA GCA CCA CCC GCA TGC GAC CTT CGC GTT CTC AGC AAA CTC CTA CGA GAT TCG CAC GTG CTA CAC
제 1 항의 유전자를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자 발현벡터.
제 2 항에 있어서,

발현벡터 ptrp 3HIS RTPO153.
제 2 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 4 항에 있어서,

대장균 W3110/ptrp 3HIS RTPO153 #13, #15, #17(KCTC 0262BP).
제 4 항의 대장균을 인간 혈소판 생성 촉진인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 혈소판 생성 촉진인자 단백질의 제조방법.