KR0184771B1 - 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 - Google Patents
광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR0184771B1 KR0184771B1 KR1019950041475A KR19950041475A KR0184771B1 KR 0184771 B1 KR0184771 B1 KR 0184771B1 KR 1019950041475 A KR1019950041475 A KR 1019950041475A KR 19950041475 A KR19950041475 A KR 19950041475A KR 0184771 B1 KR0184771 B1 KR 0184771B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- growth hormone
- flounder
- flounder growth
- gene
- coli
- Prior art date
Links
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title claims abstract description 98
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract 16
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title description 4
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 claims abstract description 74
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 38
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims abstract description 16
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 claims description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 82
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 5
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 5
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 광어 성장 호르몬을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 종료코돈이 삽입되도록 한 본 발명의 방법에 의하면 기존의 방법보다 높은 수율로 광어 성장 호르몬을 대량 생산할 수 있다.
Description
제1도는 광어 성장 호르몬의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제2도는 광어 성장 호르몬 발현벡터에 있어서, 광어 성장 호르몬 유전자 단편의 5'-말단을 보여주는 것이고,
제3도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자 단편을 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것이고,
제4도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과이다.
본 발명은 연어 성장 호르몬 유전자의 일부와 인공합성 링커를 광어 성장 호르몬 유전자에 접합시킴으로써 광어 성장 호르몬을 높은 효율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
자연적으로 얻을 수 있는 어류의 수확량에는 한계가 있기 때문에 최근에는 인공양식이 크게 증가하고 있으며, 이에 따라 경제적 측면에서 어류의 먹이 전환효율(feed conversion efficiency)을 높이기 위해 성장 호르몬을 이용하려는 연구가 계속 진행되고 있다.
어류 성장 호르몬에 대해서는, 세카인(Sekine) 등에 의해 연어 성장 호르몬의 cDNA 가 처음 해석된 후(Sekine, S., Mizukami, T., Nishi, T., Kuwana, Y., Saito, A., Sato for salmon growth hormone in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4306-4310(1985)), 아젤론과 첸에 의해 무지개 송어 성장 호르몬의 cDNA가 분석되었고(Agellon, L. B. and Chen, T. T. Rainbow trout growth hormone; molecular cloning and expression in Escherichia coli, DNA, 5, 463-471(1986)), 또한 사이토(Saito) 등에 의해 장어 성장 호르몬의 cDNA가 규명된 후 대장균에서 재조합 장어 성장 호르몬을 발현시킨 것이 처음 보고되었다(Saito. N., Sekine, S., Komatsu, Y., Sato, M., Hirano, T., and Itoh, S., Molecular cloning of eel growth hormone cDNA and its expression in Escherichia coli, Gene, 72, 545-552(1988)). 한편, 수기모도(Sugimoto) 등은 대장균에서 발현된 봉입체(inclusion body) 형태의 재조합 장어 성장 호르몬을 고농도의 구아니딘 염산염(Guanidine hydrochloride)과 비이온성 계면 활성제인 트윈 80을 이용하여 용해시킨 후 투석을 거쳐, 음이온 교환수지인 DEAE Toyopearl을 사용하여 정제시키는 방법을 보고한 바 있다(Sugimoto, S., Yokoo, Y., Inui, Y., and Hirano, T. Growth hormone. Agric. Biol. Chem., 55(6), 1635-1637(1991)).
현재 국내에서 가장 많이 양식되고 있는 광어는 모모타 등에 의해 염기서열이 밝혀졌으며(Hiroshi Momota, et al., Nacleic Acids Res. 16, 3107(1988)), 모리(Mori) 및 와타히키(Watahiki) 등에 의해 cDNA 서열 및 아미노산 서열이 알려졌다(Hirotada Mori. et al., Nucleic Acids Res. 17, (1989); Masanori Watahiki, et al., J. Biol. Chem. 264, 312-316(1989)). 광어 성장 호르몬은 현재까지 보고된 성장 호르몬중 가장 크기가 작아서 171 내지 173개의 아미노산을 가지며 분자량이 약 19.4 내지 19.7 kDa임이 밝혀졌다. 제1도는 이와 같이 밝혀진 광어 성장 호르몬의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 사카다(Sakata) 등은 광어의 뇌하수체로부터 G-75 겔여과 크로마토그래피 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatograpy)를 통해 20 kDa의 분자량을 가진 광어 성장 호르몬을 분리정제하여 무지개 송어에 투여한 결과 성장 촉진에 큰 효과가 있음을 보고하였다(Sakata, S. et al., Gen. Comp. Endocrinol., 89, 396-404(1993)).
현재까지는 광어 성장 호르몬을 유전공학적인 방법으로 생산하는 것에 관한 보고가 없을 뿐 아니라, 기존의 염기서열로 대장균에서 발현시켰을 때에는 대장균 전체 단백질 대비 약 6% 정도로 적은 양만이 발현되므로 경제적인 측면에서 바람직하지 못하다는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 광어 성장 호르몬을 보다 높은 수율로 얻을 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구하던 중, 기존의 염기서열을 가진 광어 성장 호르몬 유전자를 연어 성장 호르몬이 발현될 수 있는 trp 프로모터를 지닌 대장균 발현벡터에 클로닝시키고 리보솜 결합부위와 시작 코돈인 ATG 사이에 mPNA 2차 구조가 생기지 않도록 고안된 합성링커를 연결하여 대장균에서 발현시키는 방법에 의해 광어 성장 호르몬을 높은 수율로 생산할 수 있게 되어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 광어 성장 호르몬을 높은 수율로 생산할 수 있는 대량 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균으로부터 높은 수율로 광어 성장 호르몬을 생산시킬 수 있는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자가 그의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 종료코돈이 삽입되도록 변형된 것임을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열 일부와 종료코돈이 삽입된 것을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
이하, 본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 광어의 뇌하수체(Pituitary glands)로부터 리보헥산(RNA)을 추출하여 이것을 역전사 효소의 주형으로 해서 올리고 d(T) 프라이머를 이용하여 cDNA를 만든다. 한편, 광어 성장 호르몬의 염기서열 정보(Masanori Watahiki, et al., J. Biol. Chem., 264, 312-316(1989))로부터 광어 성장 호르몬 단백질을 코딩하는 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합요소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction : PCR)용 시발체를 고안 합성한다. 이들 시발체는 5'-말단에 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인식부위가 존재하도록 하고 이에 대응되는 시발체에는 종료코돈과 제한효소 인식부위를 삽입하여, 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.
이 때, 본 발명이 태양에 의하면 광어 성장 호르몬의 5'-말단 유전자 앞에 연어 성장 호르몬의 시작코돈(ATG)에서 37 염기쌍의 부위와 리보솜 결합부위, 그리고 연어 성장 호르몬 합성을 중지시키기 위한 종료코돈(TAA)이 삽입된 바이시스트로닉용 시발체를 고안 합성한다.
상기 시발체를 이용하여 광어 뇌하수체 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응으로 광어 성장 호르몬 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 대장균 발현벡터인 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP)의 BGHRAN 유전자와 치환하여 발현벡터를 제조한다. 이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인할 수 있으며, 생성된 단백질은 배양된 대장균 또는 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리정제할 수 있다.
기존의 염기서열을 갖는 광어 성장 호르몬 유전자는 대장균 전 단백질 대비 약 6%의 광어 성장 호르몬을 발현시키는 것에 비해, 본 발명의 태양에 따라 기존의 염기서열을 가진 광어 성장 호르몬 유전자를 연어 성장 호르몬의 일부와 함께 발현되도록 하는 바이시스트로닉 방식에 의하면 대장균 전 단백질 대비 40%의 광어 성장 호르몬을 발현시킬 수 있었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
비교예 : 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭 및 발현
(단계 1) 광어 뇌하수체 RNA로부터 광어 성장 호르몬 cDNA 합성
콜로진스키(Cholozynski, P.)와 사키(Sacchi, N.)의 방법(Cholozynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, 156(1987))에 따라 광어 뇌하수체로부터 리보핵산(RNA)을 추출하였다. 즉, 광어 뇌하수체 1㎎에 10㎖의 RNA 추출액(4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 시트르산 나트륨, pH 7.0; 0.5% 사르코실(Sarcosyl); 0.1m 2-머캅토에탄올)을 가하여 세포균질기(Grass-Teflon Homogenizer, Thomas Scientific, USA)로 파쇄시킨 다음, 8㎖의 2M 아세트산 나트륨(pH 4.0), 8㎖의 페놀(BRL사, 증류수로 포화시켰음), 1.6㎖의 클로로포름-이소아밀알콜(49 : 1, v/v)을 가하여 잘 혼합하고 12,000×G에서 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 들어 있는 새 용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 방치한 다음 12,000×G, 4℃에서 20분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 진공하에서 10분간 건조시킨 후 500㎕의 TE완충액(10mM Tris, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.
상기 수득한 광어 뇌하수체 RNA를 역전사 효소의 주형으로 하여 스트라타젠사의 Zap-cDNA 합성키트(Cat No. 200400)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 이 때 역전사 효소의 시발체로는 올리고 d(T) 시발체(5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)18-3')를 핵산 합성기(Applied Biosystem Inc. U.S.A. 380B model)로 합성하여 사용하였다. cDNA 단일가닥을 합성하기 위해, 상기에서 얻은 광어 뇌하수체 RNA 용액 18㎕를 취하여 2㎕의 0.1M CH2HgOH를 가한 다음 상온에서 10분간 방치시켜 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 2㎕의 1M 2-머캅토에탄올을 가하여 5 분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 역전사 효소 반응용액(500mM Tris-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl2; 10mM DTT), 2.5㎕의 10mM dNTP(각 10mM dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP), 2㎕의 올리고 d(T) 시발체(1.4㎍/㎕), 15㎕의 DEPC (diethyl-pyrocarbonate) 처리된 증류수 및 1.0㎕의 RNase 억제제(RNase inhibitor, 1U/㎕, Promega, U.S.A) 순으로 가한 다음, 상온에서 10 분간 방치시켜 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게하고, 이어서 2.5㎕의 역전사 효소(18U/㎕, superscript RNase H-reverse transcriptase, BRL, U.S.A)를 가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.
(단계 2) 광어 성장 호르몬 유전자의 증폭
기존의 알려진 광어 성장 호르몬 유전자의 염기서열(Masanor and Watahiki, et al., J. Biol. Chem. 264, 312-316(1989)) 정보(제1도 참조)로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다 :
시발체 PNDEFGH : 5'-GGATCCATATGCAGCCAATCACAGAGAAC-3'(이는 5'-말단에 대응하며 제한효소 NdeI의 인식부위를 가지고 있고, 광어 성장 호르몬 시그날 서열 이후의 18개 염기를 포함함)
시발체 PSALFGH : 5'-AAAAAGTCGACTACAGGGTGCAGTTAGCTTC-3'(이는 3'-말단에 대응하며 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있고, 동시에 제한효소 SalI 인식 부위를 가짐).
반응 튜브에 단계 1에서 얻은 광어 뇌하수체 cDNA 1ng을 주형으로 시발체 PNDEFGH 2㎍과 시발체 PSALFGH 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.0% Trito X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP, 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피가 100㎕가 되도록 하여, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 중합효소연쇄반응(이하, PCR이라 함)을 40회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 약 540 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리정제하였다(이하 이 DNA 단편을 '단편 FGH'라 함).
(단계 3) 광어 성장 호르몬의 유전자 염기서열 확인
증폭된 유전자의 염기서열 확인은 생거(Sanger) 등의 방법(Sanger, F., PNAS, U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 다음과 같이 수행하였다. 먼저 증폭된 유전자 1㎍에 2㎕의 10배 농도 클레나우(Klenow) 완충용액(100mM Tris-HCl, pH 7.5, 50mM MgCl2, 75mM DTT), 10 단위의 클레나우 절편(New England Biolabs, U.S.A)을 넣고 증류수를 가하여 총부피가 20㎕가 되게 한 후 37℃에서 30 분간 반응시켜 증폭된 유전자의 양말단을 평활말단(blunt end)으로 만들고, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액에 용존시켰다.
플라스미드 M13mp18(Pharmacia U.S.A. Cat No. 27-1551-01) 2㎍을 제한효소 EcoRV로 NEB 완충용액 2(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단하여 0.7% 아가로오즈 겔로 분리하여 약 7kb 핵산절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산을 '단편 M13-RV'라 칭한다. 접합반응 용기에 상기에서 얻은 평활말단으로 처리한 유전자 100ng과 100ng의 단편 M13-RV, 2㎕의 10배 접합 반응용액(0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5㎎/㎖ BSA, pH 7.8), 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 이를 사용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 8㎕의 0.2M IPTG 용액을 넣고 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3㎖의 2XYT 상층아가(Soft agar, 1ℓ당 16g의 박토트립톤, 10g의 효모 추출물, 5g의 NaCl, 5g의 박토아가)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하여 최소 평판배지 A(Min Aplate, 1ℓ당 10.5g의 K2HPO4, 1g의 (NH4)SO40.5g의 시트르산 나트륨, 12g의 박토아가, 1㎖의 20% MgSO4, 0.5㎖의 1% Vit B, 10㎖의 50% 글루코즈) 위에 고르게 도포한 후 37℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 생성된 투명한 플라크(plaque)를 이쑤시개로 찍어서 2㎖의 2XYT 액체배지에서 37℃의 온도로 5 시간 동안 배양한 후 원심분리하였다. 수득한 상층액에 1/4 부피의 PEG/NaCl (20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화 나트륨)을 넣은 다음 M13 파아지(phage)를 수거해서 단일 가닥 핵산을 추출한 후 염기서열을 분석하였다. 제2도는 단편 FGH의 5'-말단 염기서열을 보여주는데, 이는 제1도의 광어 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열과 일치하고 있음을 알 수 있다.
(단계 4) 광어 성장 호르몬의 발현벡터 제조
본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP, 대한민국 특허출원 제94-40025호) 2㎍을 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM dTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 뒤 제한효소 NdeI으로 부분절단하고, 이를 0.7% 아가로오즈 겔로 분리하여 약 2.4kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 '단편 ptrp 3H-N/L'이라 한다. 한편, 단계 2에서 얻은 단편 FGH를 제한효소 NdeI 과 SalI으로 NEB 완충용액 3(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단할 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하고 20㎕의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 FGH-N/L'이라 한다. 접합 반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 ptrp 3H-N/L과 100ng의 단편 FGH-N/L, 2㎕의 10배 접합 반응용액(0.5M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5㎎/㎖ BSA, pH 7.8), 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 접합 반응이 끝난 다음 얻어진 '단편 FGH'를 함유한 광어 성장 호르몬의 발현벡터 'ptrp 3H FGH'를 가지고 대장균 W3110(ATCC 37339)를 형질전환시켰다.
제3도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것으로, (A)는 정상적 광어 성장 호르몬 유전자 단편 FGH를 ptrp 3H-N/L과 접합시켜 ptrp 3H FGH를 얻는 과정을 보여준다.
(단계 5) 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현
상기 단계 4에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화 나트륨)에서 12 시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖을 300㎖의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO40.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(Indole Acrylic Acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 발현을 확인하였다. 덴시토미터로 측정한 결과 플라스미드 ptrp 3H FGH로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 광어 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 6.2%의 발현율을 보임을 알 수 있었다.
[실시예] : 바이시스트로닉 시스템을 이용한 광어 성장 호르몬의 발현
(단계 1) 연어 성장 호르몬의 5'-말단 일부 유전자를 포함한 광어 성장 호르몬 유전자 증폭
본 출원이 선출원한 플라스미드 ptrp HS BGH 1-13(대한민국 특허출원 제86-11712호)의 염기서열 정보 및 기종의 광어 성장 호르몬 염기서열 정보(Masanori Watahiki, et al., J. Biol, Chem. 264, 312-316(1989))로부터 다음과 같은 시발체를 합성하였다 :
(이 시발체는 광어 성장 호르몬의 5'-말단에 대응하는데, 제한 효소 NedI 인식부위를 가지고 있다. 밑줄친 부분은 연어 성장 호르몬의 5'-말단 염기서열을 나타내며 box내 AGGA는 리보소옴 결합부위, box내 TAA는 연어 성장 호르몬 일부 유전자 종료코돈을 나타내고, 그 이후의 24개 염기쌍은 시작코돈(ATG)과 광어 성장 호르몬의 시그날 서열 이후의 염기서열을 나타낸다).
반응튜브에 상기 비교예 1의 단계 4에서 얻은 플라스미드 ptrp 3H FGH 1ng을 주형으로 넣고 시발체 P3HSFGH 2㎍, 시발체 PSALFGH 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합완충용액, 10㎕의 2mM dNTP, 2.5 단위체의 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분 (중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 약 600 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 폴리아크릴아미드 겔로 분리정제하였다. 이하 이 단편을 '단편 HSFGH'라 칭한다.
(단계 2) 바이시스트로닉 시스템을 이용한 광어 성장 호르몬의 발현벡터 제조
상기 단계 1에서 얻은 '단편 HSFGH'를 제한효소 NdeI과 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단할 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 용액에 용존시켰다. 이를 '단편 HSFGH-N/L'이라 한다. 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 '단편 ptrp 3H-N/L'과 100ng의 '단편 HSFGH-N/L', 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 반응시켰다. 접합반응이 끝난 다음 얻어진 단편 HSFGH를 함유한 광어 성장 호르몬의 발현벡터 ptrp 3HS FGH를 가지고 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질전환시켰다.
상기 형질전환된 대장균 W3110/ptrp 3HS FGH를 1995년 10월 6일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 0196BP호로써 기탁하였다.
제3도 (B)는 연어 성장 호르몬 유전자의 일부를 포함하는 광어 성장 호르몬 유전자 단편 HSFGH를 ptrp 3H-N/L과 접합시켜 ptrp 3HS FGH를 제조하는 과정을 보여준다.
(단계 3) 바이시스트로닉 시스템을 이용한 광어 성장 호르몬의 발현유도
상기 단계 2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아 배지에서 12 시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖ 씩을 300㎖의 M9 배지로 옮겨 37℃에서 약 4 시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 IAA를 최종농도 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물들을 램리의 방법에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 발현을 확인하였다. 이어서 덴시토미터로 측정한 결과, 플라스미드 ptrp 3HS FGH로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 광어 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 40.3%의 발현율을 보였다.
제4도는 정상 및 변형된 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 광어 성장 호르몬의 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다.
제4도에서 제1열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균, 제2 및 3열은 플라스미드 ptrp 3H FGH를 함유한 대장균, 제8 및 9열은 플라스미드 ptrp 3HS FGH를 함유한 대장균에서의 광어 성장 호르몬 발현을 나타낸 것이고, 제10열은 표준 분자량 표지 단백질이다.
상기 결과에서 보듯이, 기존의 광어 성장 호르몬 유전자 염기서열의 경우 매우 낮은 발현율을 보이는데 반해, 연어 성장 호르몬의 5'-말단 유전자를 이용한 바이시스트로닉 시스템을 도입한 결과 약 7배 이상의 발현율 증가를 보임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 생산방법에 따라 광어 성장 호르몬을 대량 생산할 수 있는 길이 열리게 되었다.
Claims (6)
- 광어 성장 호르몬 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 광어 성장 호르몬의 발현에 적합한 조건에서 배앙하는 단계를 포함하는 광어 성장 호르몬의 제조방법에 있어서, 상기 광어 성장 호르몬 유전자가 그의 시작코돈 앞에 연어 성장 호르몬 유전자의 시작코돈으로부터 37번째까지의 염기서열과 종료코돈을 포함하는 오픈 리딩 프레임이 삽입되도록 변형된 것임을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬의 제조방법.
- 제1항에 따른 광어 성장 호르몬 유전자의 변형을 위한 시발체 P3HSFGH :
- 광어 성장 호르몬 유전자의 시작코돈 앞에 연어 성장 호르몬 유전자의 시작코돈으로부터 37번째까지의 염기서열과 종료코돈을 포함하는 오픈 리딩 프레임이 삽입된 것을 특징으로 하는 광어 성장 호르몬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 제3항에 있어서, 발현벡터 ptrp 3HS FGH.
- 제3항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
- 제5항에 있어서, 대장균 W3110/ptrp 3HS FGH인 KCTC 0196BP.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950041475A KR0184771B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950041475A KR0184771B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR970027308A KR970027308A (ko) | 1997-06-24 |
| KR0184771B1 true KR0184771B1 (ko) | 1999-04-01 |
Family
ID=19434203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019950041475A KR0184771B1 (ko) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR0184771B1 (ko) |
-
1995
- 1995-11-15 KR KR1019950041475A patent/KR0184771B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR970027308A (ko) | 1997-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR860001230B1 (ko) | 이중 가닥 dna의 분할 방법 | |
| Noegel et al. | Complete sequence and transcript regulation of a cell adhesion protein from aggregating Dictyostelium cells | |
| Dalbøge et al. | A novel enzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli produced hGH–precursor | |
| CA1274481A (en) | Recombinant dna vectors capable of expressing apoaequorin | |
| Dougherty et al. | Nucleotide sequence at the 3′ terminus of pepper mottle virus genomic RNA: evidence for an alternative mode of potyvirus capsid protein gene organization | |
| GB2147902A (en) | Microbially produced bgh and its use | |
| HU196237B (en) | Process for producing human growth prehormone | |
| GB2241703A (en) | Preparation of IGF-1 and plasmids for use therein | |
| EP0437544A1 (en) | Recombinant pdgf and methods for production | |
| JPS6156199A (ja) | 新規ヒトインタ−フエロンα類 | |
| KR0184771B1 (ko) | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 | |
| AU643194B2 (en) | Recombinant fish hormone proteins | |
| SU1479005A3 (ru) | Способ получени интерлейкина-2 человека | |
| HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
| EP0622460B1 (en) | Plasmid and escherichia coli transformed with it | |
| KR0184770B1 (ko) | 광어 성장 호르몬의 대량 생산방법 | |
| US5017486A (en) | Cloning of DNA encoding antibacterial polypeptide precursor | |
| JP3709422B2 (ja) | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 | |
| Itoh et al. | Molecular cloning and sequence analysis of the ribosomal ‘A’protein gene from the archaebacterium, Halobacterium halobium | |
| KR100225514B1 (ko) | 조피볼낙 성장 호르몬의 대량생산 방법 | |
| KR100204736B1 (ko) | 대장균에서 조피볼낙 성장 호르몬의 제조방법 | |
| KR100232658B1 (ko) | 대장균에서 인간 혈소판 생성 촉진인자의 제조방법 | |
| FI84362C (fi) | Foeraendring av dna-sekvensen mellan shine-dalgarno-sekvensen och startcodon av trp-operon foer foerbaettring av proteinproduktionen. | |
| KR920003664B1 (ko) | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법 | |
| KR100260633B1 (ko) | 인간 미드카인 유전자의 발현 벡터 및 효모에서의 그의 발현 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20040922 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |