KR920003664B1 - 합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법 - Google Patents

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Description

합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법

제 1 도는 전체 소성장호르몬 유전자에 해당되는 27종류의 합성 올리고 뉴믈리오티드의 염기순서를 5'말단에서 3'말단순서로 나타낸 것이며,

제 2 도는 제 1 도의 올리고 뉴클리오티드의 접합전략을 도시한 것이며,

제 3 도는 합성 올리고 뉴클리오티드를 대장균 운반체_pUC18에의 클로닝 과정을 도시한 것이며,

제 4 도는 확인된 소성장호르몬 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이며,

제 5 도는 효모내에서 소성장호르몬의 대량생산을 위하여 대장균 운반체_pBS100 및 효모 발현 운반체_pC1/1 로의 클로닝 과정을 도시한 것이며,

제 6 도는 효모 세포내에서 생산된 소성장호르몬을 SOS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동법에 의해 확인한 결과이다.

본 발명은 합성유전자에 의해 효모 세포내에서 소장호르몬을 제조하는 방법에 관한 것으로 이는 소성장촉진, 젖소우유분비 증가, 및 사료효율을 증진시키는데 사용된다.

지금까지 가축업계에서는 소성장촉진 및 사료효율을 높이는 목적으로 스테로이드 계통(i.e.;Estradiol-Compudose by Eli Lilly, U.S.A; Estradiol benzoate-Synovax by syntax. U.S.A)의 합성 화학제품을 많이 사용하여 왔다. 그런데, 이러한 스테로이드 계통 합성화학제품을 사용후 오랜기간 체내에 잔류하여, 사람에게 악영향을 미치는 것이 미국을 위시한 선진 각국에서 발견되어, 점점 그 사용이 금지되어 가고 있다.

그러나, 소자체의 단백질인 소성장호르몬은 사용후에도 체내에 잔류하지 않고 종 특이성(Species-Specific)을 나타내므로, 이상적인 물질이지만 1980년대까지 소의 뇌하수체에서 추출, 정제하여 생산한 것에 불과하였기 때문에 그 양에 크게 제한을 받아 가축업에 응용할 수 없었다.

따라서, 본 발명자들은 이제까지 알려진 타제조장법[Henny등 DNA 4(1985, 273; Seeburg 등 DNA 2(1983), 37; Schoner 등 Proc. Natl. Acad Sci USA 81(1984), 5403]과는 상이하게 효모세포를 이용하고 또한 유도가능한 프로모터를 사용한 결과 정상적인 효모세포의 발효조건에서 세포들은 소성장호르몬을 만들지 않고 있다가 배양액내에 이용가능한 포도당이 고갈되었을때 유도 생산되므로 대량 배양시 효모세포에 자신의 단백질이 아닌 외래의 단백질인 소성장호르몬에 기인한 저해요인이 없이 높은 농도로 세포 배양이 가능하며, 이러한 높은 세포농도에 부응하여 단위 배양액당 소성장호르몬의 생성량을 증가시킬 수 있으며, 또한 이들 효모세포내에서 생산된 소성장호르몬은 아미노말단이 알라닌으로부터 시작되는 자연상태의 성숙형 소성장호르몬과 동일하다는 것을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 방법은 다음과 같다.

본 발명은 소성장호르몬의 cDNA 유전자 염기배열순서에 따라 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 접합전략에 따라 접합시켜 대장균 운반체에 클로닝하여 아미노말단의 일부가 없는 소성장호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노말단 합성 유전자와 접합시킨 후 이를 프로모터와 터미네이트가 있는 대장균운반체에 클로닝하여 프로모터-시작 아미노산코돈이 포함된 소성장호르몬 유전자-터미네이터의 카세트를 제조한 다음 이를 효모 발현 운반체에 재클로닝시켜 최종 효모 발현 운반체를 만든 후 이를 효모내에서 발현시킴을 특징으로 하는 소성장호르몬 제조방법으로서, 상기 합성 올리고 뉴클리오티드에는 제한효소 SacI, PstI 및 SalI의 인지부위가 존재하며, 상기 아미노 말단의 일부가 없는 소성장호르몬 유전자는 합성올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 PstI/ SalI 의 절편과 아미노쪽 SacI/PstI 의 절편을 PstI, SacI, SacI의 제한효소 인지부위가 존재하는 대장균 운반체(_pUC18)에 각각 클로닝시켜 증식시킨 후 이를 다시 분리하여 접합시킨 후 대장균운반체(_pUC18)에 재클로닝시켜 제조된 것이며, 상기 합성 아미노 말단 아미노산코돈은 NcoI 인지부위 및 SacI 인지부위가 존재하는 58mer 및 50mer 로 된 다음과 같은 염기서열

상기 최종 효모 발현 운반체는 효모 발현 운반체를 효소 BamHI으로 처리한 후 프로모터-시작 아미노산 코돈이 포함된 소성장호르몬 유전자-터미네이터 카세트를 크로닝시킨 운반체(_pC1/1-BGH)이다.

본 발명의 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

밀리등(J. Biol. Chem. 255(1980), 7521)에 의해 보고된 소성장호르몬의 cDNA 유전자 염기배열 순서에 의거하여 본 발명자들은 효모세포에서 선택적으로 사용되는 아미노산 코오돈으로 소성장호르몬 염기서열의 5'-말단부위를 바꾸면서 동시에 자연상태에서 존재하는 성숙형 성장호르몬중 아미노말단이 알라닌이 되도록(Li, C.H. ＆ Ash, L.J. Biol. Chem 203,419-424)전체 유전자를 유전인자 합성기(Applied Biosystem. Model 38QB. USA)로 포스포라미디트 방법에 의하여 화학합성후 제 3 도에서와 같이 이들 합성 올리고 뉴클리오티드를 접합시키고 대장균 운반체인_pUC18(Norrander 등 Gene 36(1983)101-106)에 클로닝하여 전체 소성장호르몬 유전자 절편 SalI/SacI 제한효소절편 526 염기쌍을 포함하는 운반체_pBGH(526)를 제조하였다. 전체 소성장호르몬을 가지고 있는 유전자 클론을 제조하고 또한 효모내 발현을 위하여 효모프로모터와 터미네이터유전자를 가지고 있는 운반체_pBS100[Chiron Corp, Emeryville, CA 94608 U.S.A. Yeast 2.72(1986)]의 NcoI 과 SalI 위치에 제한효소 NcoI 인지부위와 시작코오돈 그리고 아미노 말단부위에 해당하는 아미노산 코돈을 화학합성하여_pBGH(526)에서 얻어진 절편 SacI/SalI(526염기쌍)와 함께 삽입하여 pBS-BGH(576)을 얻었다(실시예 2참조).

이_pBS-BGH(576)으로부터 BamHI을 처리하여 프로모터와 소성장호르몬 유전자 및 터미네이터를 포함하는 BamHI 절편(약 2.7kb)을 분리하여 대장균과 효모에서 자발적으로 복제할 수 있는 효모용 발현 운반체_pC1/1[ATCC 37115 ; Brake 등 Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81(1984), 4642]의 BamHI 부위에 삽입시켜_pC1/1-BGH를 제조하였다.(제 5 도)

이 DNA를 힌넨(Hinnen)등의 방법에 의해 효모균주 2130-2.3[Broach, J.R. ＆ Hicks, H.B.Cell 21. 50(1980)] 에 프로토 플라스트 형질전환시킨 후 형질전환된 효모세포를 실시예 4에서와 같이 2%포도당이 함유된 와이피디(YEPD)배지에서 48시간 배양하여 소성장호르몬이 포도당 농도가 고갈되면서 자발유도 되도록하여 리터 배양당 500mg 정도되는 소성장호르몬을 얻을 수 있었다.

이하 실시예에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

[합성 소성장호르몬 올리고 뉴클리오티드의 접합(Ligation) 및 운반체 pUC18 에로의 클로닝]

전체 합성 올리고 뉴클리오티드중 카복시쪽의 PstI과 SalI 절편에 속하는 올리고 뉴클리오티드(U7-U8/L7-L14)를 각각 260nm 에서 흡광도가 0.05되도록 취한뒤 각각을 건조시키고 전체 부피 30㎕ 50mM Tris-HCI(pH7.5), 1mM ATP, 1mM DTT, 10mM Mgcl₂의 완충액 조건하에 T₄폴리뉴클리오티드 키나제 4unit 를 가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 올리고 뉴클리오티드의 5'말단 잔기를 인산화시킨 후에 이들을 전부 모아 같은 부피의 페놀과 클로로포름을 처리한 후 에탄올과 이들을 침전시킨 다음 완충액(60mM Tris-HCI(pH7.5),1mM DTT, 10mM Mgcl₂) 53㎕ 에 녹이고 95℃수조에 넣은 후 이를 온도가 서서히 내려가도록 상온에 6시간동안 방치하여 각각의 올리고 뉴클리오티드들이 서로 상보적인 가닥들로 염기쌍을 형성하도록 한뒤 여기에 20unit 의 T4 DNA 리가제, 10mM ATP5㎕ 를 가하여 상온에서 10분동안 올리고머의 5'말단과 3'말단들을 연결시킨 후 다시 페놀과 클로로포름을 처리 및 에탄올로 침전시켰다. 침전시킨 핵산을 60mM Tris(pH7.6), 10mM NaCl 이 있는 완충액 조건하에서 우선 제한효소 PstI 와 SalI을 각기 10units씩 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다

그리고, 이들 반응액을 7%폴리아크릴아마이드겔 전기영동을 시킨 후 겔에서 280-330염기쌍에 해당하는 부분을 절단시켜 전기용출(Electroelution)한후 에탄올 침저시켜 다시 20㎕ 의 증류수에 녹였다. 이 DNA 3㎕ 와 제한효소 PstI 과 SalI 로 절단된 운반체_pUC18(10ng)을 접합반응조건(60mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM DTT, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10units T₄DNA Ligase)하에서 14℃에서 16시간 접합반응시켰다.

이어 접합반응액에 E. coli JM103[BRL, U.S.A. Messing J. (1983) 101,99,20-78 Methods in Enzymology]컴피턴트 세포를 가하여 하나한(Hanahan)방법(J. Mol. Biol 166,557 (1983))에 따라 형질전환시킨 후 37℃에서 하룻밤 숙성시킨 다음 하얀 콜로니를 비른보임과 들리방법(Nucleic Acid Res. 7, 1513 (1979))으로 제조합된 운반체_p3'-BGH 을 지니 콜론을 선별하였다.

한편 전체 소성장호르몬중 5'말단 부위의 SacI - PstI 제한 효소 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들도 상기 언급한 동일방식으로 접합시켜 제한효소 SacI - PstI 으로 절단된 pUC18에 클로닝시켜 제 3 도에서와 같이_p5'-BGH 를 제조하였다.

이어서 생거의 디디옥시 시퀴엔싱(dideoxy sequencing)방법(Proc. natl. Acad Sci. USA 74,5473-5477)으로 염기 배열 순서를 확인하였다. 그리고_p3'-BGH로부터 PstI - SalI 절편과_p5'-BGH로부터 SacI - PstI 절편을 분리해내어 제한효소 SacI, SalI으로 절단된 운반체_pUC18 에 삽입하여_pBGH(526)를 제조하였다. (제 3 도)

[실시예 2]

합성 소성장호르몬 유전자의 효모세포내 발현을 위한 유전자 조작

_pBGH(526)은 소성장호르몬 전체 유전자중 5'부분 19개의 아미노산이 없는 상태이므로 전체 유전자를 클로닝 및 효모세포내에 발현하기 위하여 5'말단 결여부분을 유전자합성기를 통하여 합성하였다. 합성은 제한 효소 NcoI의 인지부위를 포함하여 시작코돈 및 18개의 아미노산에 해당하는 코돈을 효모세포에서 주로 사용되는 코돈으로 합성하였으며, 최종적으로 SacI 인지부위를 만들어 넣었다. (제 5 도 참조)

이들의 클로닝 과정은 다음과 같다._pBGH로부터 SacI과 SalI를 처리하여 526염기쌍에 해당하는 제한효소 절편을 아가로스 전기 영동을 통하여 분리해내고 이를 유도가능한 프로모터와 터미네이터가 포함된 운반체_pBS100의 NcoI과 SalI사이에 상기 설명한 합성연결체와 함께 삽입하였다.

합성 연결체 각각을 실시예 1에서와 같이 T₄폴리뉴클레오티드 키나제로 5'말단을 인산화시켰으며, 인산화 반응액 각각 1㎕ 와 분리된 소성장호르몬의 SacI/SalI 절편 3㎕(30ng) 와 NcoI 및 SalI으로 절단된 운반체_pBS100 1㎕(7ng)을 가하여 65℃에서 15분동안 방치하고 상온에서 서서히 냉각함으로서 단일 가닥의 상보적인 합성 연결체들이 서로 이중나선 구조를 형성토록 한뒤에 다시 10mM ATP 2㎕,10배 농축된 접합반응 완충 2㎕, , 리가제 1㎕, 및 증류수 8㎕를 가해 14℃에서 16시간 반응시켰다.

그후 실시예 1에서와 같은 방법으로 대장균세포 HB101[ATCC 33694]에 형질전환시켜 효모내 발현을 위한 프로모터와 소성장호르몬 전체 유전자 및 터미네이터를 포함하는_pBS-BGH(576)를 제조하였다.(제 5 도) 효모내 발현을 위한_pBS100 운반체는 알코올 디하이드로게나제 II의 프로모터와 글리세르알데히드 3'-포스페이트 디하이드로게나제의 프로모터와의 혼성형 프로모터로서 낮은 농도의 포도당에서 발현되는 유도 가능한 프로모터를 가지고 있다._pBS-BGH(576)로부터 BamHI 을 처리하여 소성장호르몬 유전자 및 글리세르알데히드3'- 인산 디하이드로게나제의 터미네이트가 포함된 2700 염기쌍 정도의 BamHI 절편을 분리하고 이를 효모세포내에서 복제할 수 있는 발현용운반체_pC1/1의 BamHI 부위에 삽입시켜_pC1/1-BGH 를 제조하였다.(제 5 도).

이_pC1/1-BGH 유전자 10μg을 힌넨(Proc. nati. Acad. Sci. USA 75(1978),1929)의 방법에 준하여 효모균주 2130-2.3에 프로토 플라스트(Protoplast) 형질전환시키고 루이신 결핍아가 플레이트(리터 배양액당6.7g Yeast Nitrogen Base without amino acid, 182g sorbitol, 2% glucose, 0.25g Leu-deficient supplements, 20g Bactoagar)에 플레이팅하여 30℃에서 5일간 배향후 자라난 콜로니를 이용 소성장 호르몬의 발현을 실시예 3에서와 같이 실시하였다.

[실시예 3]

[소성-장호르몬 생산을 위한 효모 배양 및 동정]

운반체 PC1/1-BGH로 형질전환된 효모균주들을 각각 3ml 루이신 결핍 배양액(l 배양액당 6.7g Yeast Nitrogen Base without amino acids, 0.25g Leu-deficient supplements,, 6% glucose)에서 24시간 30℃에서 배양시킨 후 이를 100ml YEPD 배양액(2% peptone, 1% Yeast extract, 2% glucose)에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양후 에탄올을 4ml가하여 24시간 배양하였다. 이때 최종 흡광도는 650nm 에서 40정도였으며, 여기서 ml 당 10 O.D를 취하여 원심분리시키고 400㎕ 완충액(10mM Tris-HCL, pH7.5, 1mM EDTA, 2Mm Phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 8M UREA)에 용존시키고 같은 부피의 직경 0.45mm의 유리구슬을 가하여 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴하여 완충액으로 소성장호르몬이 용출되도록 한뒤 4㎕ 의 용출액을 12.5% SDS폴리아크릴 아마이드겔전기영동시켰다.

그 결과를 제 6 도에 나타냈으며, 여기서 레인 1은 단백질 표준분자량이고 레인 10은 소성장호르몬 유전자가 없는 효모세포(_pC1/1 자체를 형질전환)에서의 전체 단백질이며, 레인 2-8은 소성장호르몬을 생산하는_pC1/1/-BGH로 형질전환된 효모 세포의 전체 단백질을 전기영동한 사진이다.

제 6 도의 레인 3에서 알수 있듯이 22000달톤 정도되는 부분에서 소성장호르몬이 전체 단백질의 20% 정도에 해당되는 양으로 생성됨을 젤 스캐닝 결과 알 수 있었다. 그리고 소성장호르몬을 순수분리한 뒤 아미노산 배열을 동정한 결과 메타이오닌은 아미노팹티다아제에 의해 잘려나간 알라닌으로부터 시작되는 성숙형 소성장호르몬이었다.

Claims (5)

1. 소성장호르몬의 cDNA 유전자 염기배열 순서에 따라 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 접합전략에 따라 접합시켜 대장균 운반체에 클로닝하여 아미노 말단의 일부가 없는 소성장호르몬 유전자를 제조한 다음 이 유전자를 아미노말단 합성유전자와 접합시킨 후 이를 프로모터와 터미네이터가 있는 대장균 운반체에 클로닝하여 프로모터-시작 아미노산코돈 및 전체 소성장호르몬 유전자-터미네이터의 카세트를 제조한 다음 이를 효모 발현 운반체에 재클로닝시켜 최종 효모 발현 운반체를 만든후 이를 효모세포내에서 발현시킴을 특징으로 하는 소성장 호르몬의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 합성 올리고 뉴클리오티드에는 제한효소 SacI, PstI 및 SalI 의 인지부위가 존재함을 특징으로 하는 소성장 호르몬의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 아미노 말단의 일부가 없는 소성장호르몬 유전자는 합성 올리고 뉴클리오티드의 카복시쪽 PstI/SalI 의 절편과 아미노쪽 SacI/PstI의 절편을 PstI/SacI/SalI의 제한효소 인지부위가 존재하는 대장균 운반체(_pUC18)에 각각 클로닝시켜 증식시킨 후 이 절편들을 다시 분리하여 접합시킨 후 대장균 운반체(_pUC18)에 재클로닝시켜 제조된 것임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 아미노 말단 합성 유전자는 NcoI 인지부위 및 SacI 인지부위가 존재하는

   

   임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
5. 제 1 항에 있어서, 최종 효모 발현 운반체는 효모 발현 운반체를 효소 BamHI 으로 처리한 후 프로모터-시작 아미노산코돈 및 전체 소성장호르몬 유전자-터미네이터의 카세트 클로닝시킨 운반체(_pC1/1-BGH)임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.

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