JPS619288A - ペプチド類の製法 - Google Patents
ペプチド類の製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の目的）
本発明の目的は、遺伝子工学的手法により、医薬等に有
用な物質を生産する方法を提供することにあり、特に従
来に比して効率良く物質を生産する方法を提供すること
にあり、また、ウィルスＤＮＡを利用してｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ的にまたは生物体内において物質を生産する方法を
提供することにあり、更にはカイコ生体内において核多
角体病ウィルスを利用して種々の有用物質を効率よく生
産する方法を提供することにある。また、本発明は、こ
れらの方法に有用なベクター、組換ウィルスＤＮＡおよ
びそれらの製造法を提供することにある。また、本発明
は、これらの方法に有用なベクター、組換ウィルスＤＮ
Ａおよびそれらの製造法を提供することも目的とする０ （従来技術） 遺伝子組換技術によりプラスミド等を利用して大腸菌、
枯草菌、酵母等で有用物質を生産する方法が多数報告さ
れている。また、ウィルスＤＮＡの一種（Ａｕｔｏｇｒ
ａｐｈａ ｃａｌ：１ｆｏｒｎｉａａ ｎｕｃｌｅａｒ
ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｇ ｖｉｒｕｓ Ｄ Ｎ Ａ
）を利用してその構造遺伝子を置換して培養細胞中（５
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ負−ｇｉｐｅｒｃｌａの樹立培
養細胞中）においてβ−ガラクトシデースを生産させる
試みも報告された（ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
１ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ：３ Ｑ２） ２
１５ ａ〜２！１６５（１９８８）、＋（８）８９９〜
４０６（１９８４）。しかし、この方法は野外に生息す
る害虫であるＡ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａを利用する
点で問題があり１有用物質の製造法として満足できるも
のではない。本発明者は、さらに優れた有用物質の生産
方法を提供すべく研究の結果本発明を完成した。
用な物質を生産する方法を提供することにあり、特に従
来に比して効率良く物質を生産する方法を提供すること
にあり、また、ウィルスＤＮＡを利用してｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ的にまたは生物体内において物質を生産する方法を
提供することにあり、更にはカイコ生体内において核多
角体病ウィルスを利用して種々の有用物質を効率よく生
産する方法を提供することにある。また、本発明は、こ
れらの方法に有用なベクター、組換ウィルスＤＮＡおよ
びそれらの製造法を提供することにある。また、本発明
は、これらの方法に有用なベクター、組換ウィルスＤＮ
Ａおよびそれらの製造法を提供することも目的とする０ （従来技術） 遺伝子組換技術によりプラスミド等を利用して大腸菌、
枯草菌、酵母等で有用物質を生産する方法が多数報告さ
れている。また、ウィルスＤＮＡの一種（Ａｕｔｏｇｒ
ａｐｈａ ｃａｌ：１ｆｏｒｎｉａａ ｎｕｃｌｅａｒ
ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｇ ｖｉｒｕｓ Ｄ Ｎ Ａ
）を利用してその構造遺伝子を置換して培養細胞中（５
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ負−ｇｉｐｅｒｃｌａの樹立培
養細胞中）においてβ−ガラクトシデースを生産させる
試みも報告された（ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
１ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ：３ Ｑ２） ２
１５ ａ〜２！１６５（１９８８）、＋（８）８９９〜
４０６（１９８４）。しかし、この方法は野外に生息す
る害虫であるＡ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａを利用する
点で問題があり１有用物質の製造法として満足できるも
のではない。本発明者は、さらに優れた有用物質の生産
方法を提供すべく研究の結果本発明を完成した。
（発明の構成）
本発明は、カイコ核多角体病ウィルス（Ｂｏｍ−ｂｙｘ
Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉａ Ｖｉｒ
ｕｓ 、以下ＢｍＮＰＶと略す）のＤＮＡを利用して蛋
白または糖蛋白等の有用物質を遺伝子工学的に生産する
方法に関し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡのプロモーター領域
の機能を活用して有用物質を効率よく生産する方法に関
し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを有用物質生産用遺伝子で組
換（リコンビネーション）しだ組換ＤＮＡに関し、その
組換に有用な組換ベクターに関する。また本発明は、Ｂ
ｍ Ｎ Ｐ Ｖ Ｄ Ｎ Ａの多角体蛋白構造遺伝
子のプロモーター領域を含む５′上上流ＤＮＡ片、翻訳
開始コドン及び有用物質生産用遺伝子を有し、更にＢｍ
ＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子の８′下下流
ＤＮＡ片を含む又は含まない転移用組換ベクターとＢｍ
ＮＰＶ ＤＮＡを感染導入する方法に関す。また本発
明は転移用組換ベクターとＢｍＮＰＶ ＤＮＡの混合
物を培養細胞又はカイコ生体に接種してそれらの中で組
換ＢＨＮＰＶ を作らせたり、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ
と大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２との組換ＤＮＡを作成
し、更にこの多角体蛋白構造遺伝子部分を有用物質生産
用遺伝子と組換る等の方法により組換ＢｍＮＰＶ Ｄ
Ｍ Ａを作り、これを同様に培養細胞またはカイコ生
体に接種して増殖させ、有用物質を生産する方法に関す
る。
Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉａ Ｖｉｒ
ｕｓ 、以下ＢｍＮＰＶと略す）のＤＮＡを利用して蛋
白または糖蛋白等の有用物質を遺伝子工学的に生産する
方法に関し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡのプロモーター領域
の機能を活用して有用物質を効率よく生産する方法に関
し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを有用物質生産用遺伝子で組
換（リコンビネーション）しだ組換ＤＮＡに関し、その
組換に有用な組換ベクターに関する。また本発明は、Ｂ
ｍ Ｎ Ｐ Ｖ Ｄ Ｎ Ａの多角体蛋白構造遺伝
子のプロモーター領域を含む５′上上流ＤＮＡ片、翻訳
開始コドン及び有用物質生産用遺伝子を有し、更にＢｍ
ＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子の８′下下流
ＤＮＡ片を含む又は含まない転移用組換ベクターとＢｍ
ＮＰＶ ＤＮＡを感染導入する方法に関す。また本発
明は転移用組換ベクターとＢｍＮＰＶ ＤＮＡの混合
物を培養細胞又はカイコ生体に接種してそれらの中で組
換ＢＨＮＰＶ を作らせたり、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ
と大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２との組換ＤＮＡを作成
し、更にこの多角体蛋白構造遺伝子部分を有用物質生産
用遺伝子と組換る等の方法により組換ＢｍＮＰＶ Ｄ
Ｍ Ａを作り、これを同様に培養細胞またはカイコ生
体に接種して増殖させ、有用物質を生産する方法に関す
る。
次に本発明の態様を示しつつ更に詳細に説明する。
ＢｍＮＰＶはバキーａウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ ）に属する昆虫ウィルスの一種であり宿主特異性は
高くカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ）に感染してそ
の細胞中に多角体蛋白を多量に蓄積する。このウィルス
は約１４０ ｋｂｐの環状二重鎖ＤＮＡのゲノムを持ち
、これはウィルス粒子からプロテアーゼ処理、ラウリル
硫酸ナトリウム（ｓｎｓ）処理等及び抽出等の常法によ
り得ることができる。
ｓ ）に属する昆虫ウィルスの一種であり宿主特異性は
高くカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ）に感染してそ
の細胞中に多角体蛋白を多量に蓄積する。このウィルス
は約１４０ ｋｂｐの環状二重鎖ＤＮＡのゲノムを持ち
、これはウィルス粒子からプロテアーゼ処理、ラウリル
硫酸ナトリウム（ｓｎｓ）処理等及び抽出等の常法によ
り得ることができる。
この環状二重鎖ＤＮＡ（以下ウィルスＤＮＡまたはＢｍ
ＮＰＶ ＤＮＡと略す）は相当大きな環状ＤＮＡであ
るので、制限酵素処理により小さなりＮＡ断片を製し、
多角体蛋白構造遺伝子及びその前後（５′上流及び８′
下流部分）を含有すη る断片を選択し
て使用するのが適当である。制限酵素としては種々のも
のが知られ、かつ市販されているので適当なものを選ん
で用いればよく、使用条件も酵素に応じ適宜設定する。
ＮＰＶ ＤＮＡと略す）は相当大きな環状ＤＮＡであ
るので、制限酵素処理により小さなりＮＡ断片を製し、
多角体蛋白構造遺伝子及びその前後（５′上流及び８′
下流部分）を含有すη る断片を選択し
て使用するのが適当である。制限酵素としては種々のも
のが知られ、かつ市販されているので適当なものを選ん
で用いればよく、使用条件も酵素に応じ適宜設定する。
なお、本発明の技術内容におけるＤＮＡ断片の合成（化
学的合成、制限酵素処理による切断）、分離および検索
、ＤＮＡ配列の解析、大腸菌等の処理（形質転換、培養
、プラスミドの取得等）などはよく知られた遺伝子操作
技術を利用して行うことができる。
学的合成、制限酵素処理による切断）、分離および検索
、ＤＮＡ配列の解析、大腸菌等の処理（形質転換、培養
、プラスミドの取得等）などはよく知られた遺伝子操作
技術を利用して行うことができる。
ＢｍＮＰＶ ＤＮＡから得た多くのＤＮＡ断片より構
造遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を選択するには、常法に
よって製したプローブを用いたサザンハイブリダイゼー
ション等により行えばよい。選ぶべき断片は、構造遺伝
子部分を含んでいることが必要であるが、その５′側（
上流）及び場合によっては８′側（下流）にも相当の長
さのＤＮＡ鎖を有していることが重要である。
造遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を選択するには、常法に
よって製したプローブを用いたサザンハイブリダイゼー
ション等により行えばよい。選ぶべき断片は、構造遺伝
子部分を含んでいることが必要であるが、その５′側（
上流）及び場合によっては８′側（下流）にも相当の長
さのＤＮＡ鎖を有していることが重要である。
この長さをどの程度にするがは、目的の有用物質の生産
の効率に関して重要であり、かつ以下 □に述べる取
扱いの容易さにも関係してくるが、実験により確かめる
ことが可能であり、たとえ手数がかかるとしてもこの分
野での通常の知識を有する者にとって、以下の説明、特
に実施例を参考にすれば、困難ではない。この目的にか
なった一つは、ＥｃｏＲＩで切断して得た約１０．６ｋ
ｂｐの断片であるがその他の制限酵素を用いて得る種々
の断片が使用可能であろう。
の効率に関して重要であり、かつ以下 □に述べる取
扱いの容易さにも関係してくるが、実験により確かめる
ことが可能であり、たとえ手数がかかるとしてもこの分
野での通常の知識を有する者にとって、以下の説明、特
に実施例を参考にすれば、困難ではない。この目的にか
なった一つは、ＥｃｏＲＩで切断して得た約１０．６ｋ
ｂｐの断片であるがその他の制限酵素を用いて得る種々
の断片が使用可能であろう。
多角体蛋白の構造遺伝子及びその前後のＤＮＡ鎖を含む
断片から構造遺伝子部分を除去し、その上流側のプロモ
ーター領域を含む適当な長さのＤＮＡ鎖を取り出し、ま
た構造遺伝子の下流の適当な長さのＤＮＡ鎖を取り出し
て利用するには種々の手法が活用される。
断片から構造遺伝子部分を除去し、その上流側のプロモ
ーター領域を含む適当な長さのＤＮＡ鎖を取り出し、ま
た構造遺伝子の下流の適当な長さのＤＮＡ鎖を取り出し
て利用するには種々の手法が活用される。
すなわち、種々の制限酵素で処理して得た断片のＤＮＡ
配列を検索して構造遺伝子部分を同定し、その部分を制
限酵素で切断（例えばＢａ１３１による消化）して除去
することができる。
配列を検索して構造遺伝子部分を同定し、その部分を制
限酵素で切断（例えばＢａ１３１による消化）して除去
することができる。
必要とされる上流側および下流側のＤＮＡ鎖は、Ｂａｌ
８１消化によって残った部分として調整するなど、あ
るいはＤＮＡ配列を解明した後に制限酵素で切断して製
造するか、化学合成によって製造することも可能である
。
８１消化によって残った部分として調整するなど、あ
るいはＤＮＡ配列を解明した後に制限酵素で切断して製
造するか、化学合成によって製造することも可能である
。
カイコの多角体蛋白については、Ｓ、セレブリアニらが
アミノ酸分析を行い、２４４個のアミノ酸配列を発表し
ている（ Ｊ＊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐ２Ｌｔ
ｈ−ｏｌｏｇｙ ８１←４ｇ〜４４８ （１９７７）
）ｏ従って、ＢｍＮＰＶ 由来のＤＮＡ断片について
塩基配列を解明してそのコドンとアミノ酸を対応させて
アミノ酸配列を作成し、これをセレブリアニらの配列と
照合すれば多角体遺伝子のどの部分に相当するか、或い
は別の部分であるかを判断することができる。
アミノ酸分析を行い、２４４個のアミノ酸配列を発表し
ている（ Ｊ＊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐ２Ｌｔ
ｈ−ｏｌｏｇｙ ８１←４ｇ〜４４８ （１９７７）
）ｏ従って、ＢｍＮＰＶ 由来のＤＮＡ断片について
塩基配列を解明してそのコドンとアミノ酸を対応させて
アミノ酸配列を作成し、これをセレブリアニらの配列と
照合すれば多角体遺伝子のどの部分に相当するか、或い
は別の部分であるかを判断することができる。
本発明者は、構造遺伝子部分の除去およびその上流並び
に下流のＤＮＡ断片部分の利用のためには、ＢｍＮＰＶ
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断断片（約１０．６ ｋｂｐ
）が好適であり、かつそのものをＨｉｎｄ １１で切
断するとき使用に便利な二個の断片が得られることを確
かめた。ただし、本発明の目的を達するためには必ずし
もこの断片に限られることはないのであって、種々の制
限酵素を用いて検索を行うことにより、他にも好適な断
片を作成することが可能と考えられる。以下においては
、必要に応じて上記の好適な断片の例により説明する。
に下流のＤＮＡ断片部分の利用のためには、ＢｍＮＰＶ
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断断片（約１０．６ ｋｂｐ
）が好適であり、かつそのものをＨｉｎｄ １１で切
断するとき使用に便利な二個の断片が得られることを確
かめた。ただし、本発明の目的を達するためには必ずし
もこの断片に限られることはないのであって、種々の制
限酵素を用いて検索を行うことにより、他にも好適な断
片を作成することが可能と考えられる。以下においては
、必要に応じて上記の好適な断片の例により説明する。
なお、ＤＮＡ配列等の表示においては特に示す以外は一
般的方法により５′側を左に８′側を右にして行い制限
酵素名をハイフン（−）で継ぐことによりその断片を表
す。
般的方法により５′側を左に８′側を右にして行い制限
酵素名をハイフン（−）で継ぐことによりその断片を表
す。
この場合にも左右は同じ意味を有する。
上に述べた好適なＦａｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の概要を
次に示す。
次に示す。
この断片を更に小さな断片に分け、サザンハイプリダイ
ゼーション等の方法で検索すれば多角体蛋白遺伝子部分
を見出すことができる。この例では、Ｈｐａ ｌ−Ｈ１
ｎｄｌｌ断片（約１．４ ｋｂ）中にこの構造遺伝子の
存在が認められた。従って、構造遺伝子の上流部分及び
下流部分を利用するためにはＨｉｎｄ Ｉｔ［処理によ
りＨｉｎｄ ｘ−ｆ（ｉｎｄ ｘ （約８．９ｋｂ）お
よび１（ｉｎｄ ｌｌ−Ｈｌｎｃｌ ＩＨ（約８．１
ｋｂ ）の二種の断片を調整して利用するのが便利であ
る。
ゼーション等の方法で検索すれば多角体蛋白遺伝子部分
を見出すことができる。この例では、Ｈｐａ ｌ−Ｈ１
ｎｄｌｌ断片（約１．４ ｋｂ）中にこの構造遺伝子の
存在が認められた。従って、構造遺伝子の上流部分及び
下流部分を利用するためにはＨｉｎｄ Ｉｔ［処理によ
りＨｉｎｄ ｘ−ｆ（ｉｎｄ ｘ （約８．９ｋｂ）お
よび１（ｉｎｄ ｌｌ−Ｈｌｎｃｌ ＩＨ（約８．１
ｋｂ ）の二種の断片を調整して利用するのが便利であ
る。
この二種はアガロース電気泳動等の常法で分離できる。
分離した二種の断片は人ニリンカーを含有する別々のプ
ラスミドに組込んで操作するのが便利であり、例えば、
市販のプラスミドｐＵｃ９およびｐＵａＢ （いずれも
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ−ａ
ｌｓ社製）はこのために適している。
ラスミドに組込んで操作するのが便利であり、例えば、
市販のプラスミドｐＵｃ９およびｐＵａＢ （いずれも
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ−ａ
ｌｓ社製）はこのために適している。
下流側のＨｉｎｄ ｌ Ｈｉｎｄ Ｉ断片（約８． ｌ
ｋｂ ）はｐｕｃｓのＨｉｎｄ １１部位に組込んで
利用する。多角体蛋白遺伝子を含む上流側のＨｉｎｄ
Ｎ−Ｈｌｎｄ Ｉ断片はｐＵｃ９のＷｉｎ６１部位に組
込んだ後に、制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ ）で一箇所
切断し、得たＤＮＡ断片にＢａｌ ８１ を働らかすと
Ｄ Ｎ Ａ＠を切断点から両側に塩基を一個ずつ消化し
ていくので、Ｄ Ｎ Ａ鎖の長さの調節に便利である。
ｋｂ ）はｐｕｃｓのＨｉｎｄ １１部位に組込んで
利用する。多角体蛋白遺伝子を含む上流側のＨｉｎｄ
Ｎ−Ｈｌｎｄ Ｉ断片はｐＵｃ９のＷｉｎ６１部位に組
込んだ後に、制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ ）で一箇所
切断し、得たＤＮＡ断片にＢａｌ ８１ を働らかすと
Ｄ Ｎ Ａ＠を切断点から両側に塩基を一個ずつ消化し
ていくので、Ｄ Ｎ Ａ鎖の長さの調節に便利である。
反応時間を換えて幾種類かの長さの断片を作り、その塩
基配列を解析すれば多角体遺伝子の除去されたものを見
出すことができる。
基配列を解析すれば多角体遺伝子の除去されたものを見
出すことができる。
このようにして多角体遺伝子を除去し、その上流のウィ
ルス由来のプロモーター領域を含ｔｒＤＮＡ断片を得る
ことができる。このものは、もう一方の多角体遺伝子の
下流のＤＮＡ断片と組み合わせて、プラスミドに組込ん
でベクター用プラスミドとし、両断片の間の多角体遺伝
子が存在していた部位に有用物質生産用遺伝子を組込ん
で組換プラスミドを製造するために有用である。
ルス由来のプロモーター領域を含ｔｒＤＮＡ断片を得る
ことができる。このものは、もう一方の多角体遺伝子の
下流のＤＮＡ断片と組み合わせて、プラスミドに組込ん
でベクター用プラスミドとし、両断片の間の多角体遺伝
子が存在していた部位に有用物質生産用遺伝子を組込ん
で組換プラスミドを製造するために有用である。
例えば、上流部分はＨｉｎｃｌ Ｎ処理後ｐＵｃ９
に組込んでプラスミドを作り、下流部分はＨｉｎｄｌ［
−Ｗｉｎ（ｉｌ［断片（約３．１ ｋｂ ）をｐｕｃｓ
のＨｉｎｄ １１部位に組込んでプラスミドとなし、両
プラスミドの制限酵素の共通部位を利用して上流部分と
下流部分を同一プラスミドに組込む。この場合両者の間
に人ニリンカ一部分が存在するように設計すると有用物
質生産用遺伝子の組込みに便利なことがある。
に組込んでプラスミドを作り、下流部分はＨｉｎｄｌ［
−Ｗｉｎ（ｉｌ［断片（約３．１ ｋｂ ）をｐｕｃｓ
のＨｉｎｄ １１部位に組込んでプラスミドとなし、両
プラスミドの制限酵素の共通部位を利用して上流部分と
下流部分を同一プラスミドに組込む。この場合両者の間
に人ニリンカ一部分が存在するように設計すると有用物
質生産用遺伝子の組込みに便利なことがある。
なお、多角体遺伝子の翻訳開始コード近辺および終了コ
ード近辺が欠損している場合は、合成りＮＡで補充する
などの方法により修復してもよい。これらは一般的な組
換ＤＮＡ技術によって行う。
ード近辺が欠損している場合は、合成りＮＡで補充する
などの方法により修復してもよい。これらは一般的な組
換ＤＮＡ技術によって行う。
有用物質生産用遺伝子としては種々のものが報告され、
今後も多くのものの天然の遺伝子の単離および合成の報
告がされるであろうが、それらの利用が可能なことは容
易に理解できるであろう。例えば、有用物質として、イ
ンターフェロン類（α−インターフェロン、β−インタ
ーフェロン、γ−インターフェロン）、インシュリン、
ヒト成長ホルモン、ソマトメジン類、インターロイキン
、各種リンホカインなどペプチド類、蛋白類、糖蛋白類
を挙げることができる。通常この有用物質生産用遺伝子
に予め翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を結合して後の操作を
行うのが適当である。
今後も多くのものの天然の遺伝子の単離および合成の報
告がされるであろうが、それらの利用が可能なことは容
易に理解できるであろう。例えば、有用物質として、イ
ンターフェロン類（α−インターフェロン、β−インタ
ーフェロン、γ−インターフェロン）、インシュリン、
ヒト成長ホルモン、ソマトメジン類、インターロイキン
、各種リンホカインなどペプチド類、蛋白類、糖蛋白類
を挙げることができる。通常この有用物質生産用遺伝子
に予め翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を結合して後の操作を
行うのが適当である。
有用物質生産用遺伝子は、リンカ−を両端に結合させて
ベクターに組込むなど、常用される方法を利用して組換
プラスミドを製造する。その結果、得られた組換プラス
ミドは有用物質生産遺伝子の上流および下流にそれぞれ
ウィルス由来の断片、プリモーター領域を含むＤＮＡ断
片と終了コドンの下流のＤＮＡ断片が組込まれたもので
ある。以上の操作において、ＤＮＡ断片の組込みあるい
は切断等さらに断片の選択等で、塩基配列が逆になる場
合も考えられるが、各々の段階で正しい向きのものであ
ることを確認しながら先に進める必要のあることは当然
である。
ベクターに組込むなど、常用される方法を利用して組換
プラスミドを製造する。その結果、得られた組換プラス
ミドは有用物質生産遺伝子の上流および下流にそれぞれ
ウィルス由来の断片、プリモーター領域を含むＤＮＡ断
片と終了コドンの下流のＤＮＡ断片が組込まれたもので
ある。以上の操作において、ＤＮＡ断片の組込みあるい
は切断等さらに断片の選択等で、塩基配列が逆になる場
合も考えられるが、各々の段階で正しい向きのものであ
ることを確認しながら先に進める必要のあることは当然
である。
上述の如くして得た組換プラスミドは、それ自体大腸菌
に形質転換して増殖させることは可能であるが、ＢｍＮ
ＰＶの増殖力を利用することにより著しい効果が得られ
る。この効果を奏するために、組換プラスミド中に存在
するウィルス由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片
および終了コドン以下のＤＮＡ断片が極めて有用である
。ただし、場合によっては終了コドン以下の８′下下流
片が必ずしも必要とされないごともある。
に形質転換して増殖させることは可能であるが、ＢｍＮ
ＰＶの増殖力を利用することにより著しい効果が得られ
る。この効果を奏するために、組換プラスミド中に存在
するウィルス由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片
および終了コドン以下のＤＮＡ断片が極めて有用である
。ただし、場合によっては終了コドン以下の８′下下流
片が必ずしも必要とされないごともある。
詞
プロモーター領域を含む５′上流断片は、必ずしも元の
ＢｍＮｌＺ ＤＮＡに存在する塩基配列そのままであ
る必要はなく、多少の°修飾がありても同様の機能が期
待できる。例えば翻訳開始コドンの５′上流−９〜−１
の欠損または−１９〜−１の欠損した断片の利用によっ
ても優れた効果が得られ、−２９〜−１の欠損した断片
でも充分な効果が得られることが認められた。但し一８
０程度迄が欠損したものは好ましいとは言えない。また
この塩基配列を多少変更したものについては実験でその
効果を容易に確めることができ、そのような断片を合成
して利用することも本発明態様のうちである。
ＢｍＮｌＺ ＤＮＡに存在する塩基配列そのままであ
る必要はなく、多少の°修飾がありても同様の機能が期
待できる。例えば翻訳開始コドンの５′上流−９〜−１
の欠損または−１９〜−１の欠損した断片の利用によっ
ても優れた効果が得られ、−２９〜−１の欠損した断片
でも充分な効果が得られることが認められた。但し一８
０程度迄が欠損したものは好ましいとは言えない。また
この塩基配列を多少変更したものについては実験でその
効果を容易に確めることができ、そのような断片を合成
して利用することも本発明態様のうちである。
上述の組換プラスミドを利用して、有用物質生産用遺伝
子が組換された組換ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを得るには種
々の方法がある。例えば、一つは１ｙ１ ｖｉｔｒｏ的
な方法であり、一つはカイコを使う方法である。又この
様な組換プラスミドを利用せずに、ＢｍＮＰＶ ＤＮ
ＡとｐＢＲ８２２等との組換体を製し、その多角体遺伝
子を有用物質生産用遺伝子と組換る事により組換ウィル
スＤＮＡを作る方法も態様の一つである。
子が組換された組換ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを得るには種
々の方法がある。例えば、一つは１ｙ１ ｖｉｔｒｏ的
な方法であり、一つはカイコを使う方法である。又この
様な組換プラスミドを利用せずに、ＢｍＮＰＶ ＤＮ
ＡとｐＢＲ８２２等との組換体を製し、その多角体遺伝
子を有用物質生産用遺伝子と組換る事により組換ウィル
スＤＮＡを作る方法も態様の一つである。
培養細胞、例えばカイコ樹立細胞（８ｍ細胞）を用いて
ｉｎ ｖｉｔｒｏ的に、ＢｍＮＰｖ ＤＮＡと有用物質
生産用遺伝子を有する組換プラスミドを混合感染すると
、目的の遺伝子（有用物質生産用遺伝子）のウィルスＤ
ＮＡへの組換が起こり、組換ウィルスＤＮＡ（組換Ｂｍ
ＮＰＶ ＤＮＡ）が生じる。この組換としては、目的
の遺伝子と多角体蛋白構造遺伝子領域の置換の形態をと
ることもあり、ウィルスＤＮＡのその他の領域へ有用物
質生産用遺伝子が一個乃至複数個付加的に組込まれる形
態をとることもある。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
の混合感染を行えば組換ウィルスＤＮＡが増殖して有用
物質が蓄積される。培地中には非組換体と組換体のウィ
ルスが存在し得るが、希釈法またはプラーク法などの一
般的方法によって組換６イルスを単離することが可能で
ある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ的に、ＢｍＮＰｖ ＤＮＡと有用物質
生産用遺伝子を有する組換プラスミドを混合感染すると
、目的の遺伝子（有用物質生産用遺伝子）のウィルスＤ
ＮＡへの組換が起こり、組換ウィルスＤＮＡ（組換Ｂｍ
ＮＰＶ ＤＮＡ）が生じる。この組換としては、目的
の遺伝子と多角体蛋白構造遺伝子領域の置換の形態をと
ることもあり、ウィルスＤＮＡのその他の領域へ有用物
質生産用遺伝子が一個乃至複数個付加的に組込まれる形
態をとることもある。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
の混合感染を行えば組換ウィルスＤＮＡが増殖して有用
物質が蓄積される。培地中には非組換体と組換体のウィ
ルスが存在し得るが、希釈法またはプラーク法などの一
般的方法によって組換６イルスを単離することが可能で
ある。
又、上記の混合感染をカイコを用いて行うこともできる
。
。
８ｍ細胞で増殖されたウィルス（組換ウィルスと非組換
ウィルスの混合物１またはそれから組換体を単離したも
の）をｉｎ ｖｉｔｒｏでＢｎ＋細胞に感染させるか、
またはカイコに経皮的、あるいは体腔内輪注射して効率
よく目的の有用物質を生産することができ、これらは公
知の方法により単離精製することができる。
ウィルスの混合物１またはそれから組換体を単離したも
の）をｉｎ ｖｉｔｒｏでＢｎ＋細胞に感染させるか、
またはカイコに経皮的、あるいは体腔内輪注射して効率
よく目的の有用物質を生産することができ、これらは公
知の方法により単離精製することができる。
（発明の効果）
本発明によれば、有用なペプチド類、蛋白類、糖蛋白類
を、安全、且つ、経済的に多量に製造する事が可能であ
る。
を、安全、且つ、経済的に多量に製造する事が可能であ
る。
本発明により生産されるペプチドおよび蛋白質は、真核
細胞中において産生されるため、真核生物遺伝子を使用
した場合、その生体内におけると同様な修飾、すなわち
シグナルペプチドの切断、糖鎖の付加等を受けることが
でき、従来の細菌類を用いる遺伝子操作生産物より邊か
に有用性が高いと期待される。またこれらの生産物は細
胞外へ分泌される為、その精製は極で容易である。
細胞中において産生されるため、真核生物遺伝子を使用
した場合、その生体内におけると同様な修飾、すなわち
シグナルペプチドの切断、糖鎖の付加等を受けることが
でき、従来の細菌類を用いる遺伝子操作生産物より邊か
に有用性が高いと期待される。またこれらの生産物は細
胞外へ分泌される為、その精製は極で容易である。
更に、カイコは、人類の多年にわたる飼育経験、および
その研究蓄積により、大量飼育は容易であり、又、現在
では人工飼料による飼育も可能である。従って、ウィル
スベクターを用いる有用産物の生産を細胞レベルで行う
よりは、生体レベルで行う事が可能であれば、邊かに工
業的、且つ、経済的になると推定される。
その研究蓄積により、大量飼育は容易であり、又、現在
では人工飼料による飼育も可能である。従って、ウィル
スベクターを用いる有用産物の生産を細胞レベルで行う
よりは、生体レベルで行う事が可能であれば、邊かに工
業的、且つ、経済的になると推定される。
以下に有用遺伝子としてα−インターフェロン（α−Ｉ
’ＦＮ）遺伝子を用い医薬品として有用な蛋白質α−Ｉ
ＦＮを生産する例を挙げて、その実施の態様を示すが、
本発明の範囲がこれに限定されない事は勿論である。
’ＦＮ）遺伝子を用い医薬品として有用な蛋白質α−Ｉ
ＦＮを生産する例を挙げて、その実施の態様を示すが、
本発明の範囲がこれに限定されない事は勿論である。
実施例Ｉ
Ａ、ＢｍＮＰＶのプラーク法によるクローニングと増殖
ＢｍＮＰＶ を３令期のカイコに経口感染させ、数日
後、体液を採取した。これをＴＯ−１０培地（Ｊ、 Ｉ
ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５８
６８〜８７０（１９７５７）で希釈し、単層に培養した
８ｍ細胞（カイコ樹立側ａ ： Ａｐｐｌ。
後、体液を採取した。これをＴＯ−１０培地（Ｊ、 Ｉ
ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５８
６８〜８７０（１９７５７）で希釈し、単層に培養した
８ｍ細胞（カイコ樹立側ａ ： Ａｐｐｌ。
Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ４４ ２
２７〜２８８（１９８２７）に感染させた後、０．７５
％アガロースを含むＴＯ−１０培地に重層し、固化後、
２７°Ｃで数日間インキュベートした。このプレートに
形成したプラーク班をパスツールピペットで採取した。
２７〜２８８（１９８２７）に感染させた後、０．７５
％アガロースを含むＴＯ−１０培地に重層し、固化後、
２７°Ｃで数日間インキュベートした。このプレートに
形成したプラーク班をパスツールピペットで採取した。
このプラーク法による操作を２回繰返して遺伝的に均一
なウィルスを得た。このウィルスの代表的な株であるＢ
ｍＮＰＶ Ｔ ３株を以下の実験に使用した。
なウィルスを得た。このウィルスの代表的な株であるＢ
ｍＮＰＶ Ｔ ３株を以下の実験に使用した。
７３株を８ｍ細胞で増殖させた後、更に５令期のカイコ
に経皮接種感染させ、６日後、形成された多角体を含む
感染組織を蒸留水を加えて遠心しその沈殿を蒸留水に懸
濁し、磨細し、分画遠心（８，０００ｒｐｍ、８０分）
および４５％と５５％（％）の蔗糖溶液の不連続の密度
平衡遠心（２０，０００ｒｐｍ、８０分）により精製し
た。この多角体浮遊液より分画遠心（８，０００ｒｐｍ
、１０分）で蔗糖液を除去後、精製多角体を０．１Ｍ炭
酸ソーダ（ｐＨ１１）−０，０５Ｍ塩化ナトリウム液に
浮遊させ、２５℃で８０分反応させて多角体を溶解し、
ウィルス粒子を放出させる。
に経皮接種感染させ、６日後、形成された多角体を含む
感染組織を蒸留水を加えて遠心しその沈殿を蒸留水に懸
濁し、磨細し、分画遠心（８，０００ｒｐｍ、８０分）
および４５％と５５％（％）の蔗糖溶液の不連続の密度
平衡遠心（２０，０００ｒｐｍ、８０分）により精製し
た。この多角体浮遊液より分画遠心（８，０００ｒｐｍ
、１０分）で蔗糖液を除去後、精製多角体を０．１Ｍ炭
酸ソーダ（ｐＨ１１）−０，０５Ｍ塩化ナトリウム液に
浮遊させ、２５℃で８０分反応させて多角体を溶解し、
ウィルス粒子を放出させる。
このウィルス浮遊液を１０〜４０％（％）蔗糖液の密度
勾配平衡遠心（１８，００Ｏｒｐｍ。
勾配平衡遠心（１８，００Ｏｒｐｍ。
３０分）して、ウィルスを精製した。蔗糖は透析又は分
画遠心（４０，０００ｒｐｍ、８０分）により除去し、
精製ウィルス粒子を得た。
画遠心（４０，０００ｒｐｍ、８０分）により除去し、
精製ウィルス粒子を得た。
クローニング
Ｂ−１ウィルスＤＮＡの抽出
精製したウィルス溶液に、５ＤＳ（ラウリル硫酸ナトリ
ウム、１％％）およびプロテアーゼＫ（メルク社製１ｔ
ｎ９／ｄ）を加え、８７°Ｃで約２時間インキュベート
した。この溶液に等量のフェノール溶液（１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）−１＋ｎＭ ＥＤＴＡ飽
和）を加え静かに約５分間振とうし次に１２．００Ｏｒ
ｐｍ で５分間遠心した。水層を採り、同様のフェノ
ール処理を２回繰返した。このＤＮＡを含む水層に等量
のクロロホルムを加え、静かに約５分間振とうし、次い
で１２，０００ｒｐｍで２分間遠心した。水層を採り、
同様のクロロホルム処理を２回繰返した後、水層を１０
ｍＭ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに対して約２日間透析した。
ウム、１％％）およびプロテアーゼＫ（メルク社製１ｔ
ｎ９／ｄ）を加え、８７°Ｃで約２時間インキュベート
した。この溶液に等量のフェノール溶液（１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）−１＋ｎＭ ＥＤＴＡ飽
和）を加え静かに約５分間振とうし次に１２．００Ｏｒ
ｐｍ で５分間遠心した。水層を採り、同様のフェノ
ール処理を２回繰返した。このＤＮＡを含む水層に等量
のクロロホルムを加え、静かに約５分間振とうし、次い
で１２，０００ｒｐｍで２分間遠心した。水層を採り、
同様のクロロホルム処理を２回繰返した後、水層を１０
ｍＭ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに対して約２日間透析した。
得られたウィルスＤＮＡを以下の遺伝子のクローニング
及び８ｍ細胞に対する形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ ）に用いた。
及び８ｍ細胞に対する形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ ）に用いた。
Ｂ−２遺伝 のクローニング
プローブの作成：５今生期のカイコにＢｍＮＰＶＴａ株
を経皮感染させ、数日後、脂肪体組織より塩酸グアニジ
ン法により全ＲＮＡを抽出した。これをオリゴｃｌＴセ
ルロースカラムでポリＡを有するｍＲＮＡを精製した。
を経皮感染させ、数日後、脂肪体組織より塩酸グアニジ
ン法により全ＲＮＡを抽出した。これをオリゴｃｌＴセ
ルロースカラムでポリＡを有するｍＲＮＡを精製した。
このｍＲＮＡについて、ウサギ網状赤血球のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏの翻訳系により調べたところ、全ｍＲＮＡの９０
％以上が多角体のｍＲＮＡであった。このｍＲＮＡより
オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成した。この場合３２ｐを含むｄＯＴＰを基質に
用いてｃＤＮＡをラベルし、多角体遺伝子の検索の為の
プローブとした。
ｔｒｏの翻訳系により調べたところ、全ｍＲＮＡの９０
％以上が多角体のｍＲＮＡであった。このｍＲＮＡより
オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成した。この場合３２ｐを含むｄＯＴＰを基質に
用いてｃＤＮＡをラベルし、多角体遺伝子の検索の為の
プローブとした。
多角体遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片のクローニング：Ｂ
ｍＮＰＶ Ｔａ株の精製ＤＮＡをｇｏＯＲ１で消化し
、その断片を０．７％アガロースゲルにて電気泳動した
後、ニトロセルロースフィルターに転写（ｔｒａｎｓｒ
ｅｒ ） Ｌ／１前記のプローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行った０約１０．６ｋｂのＤＮＡ断片が特異的に
ハイブリダイズした。この断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏ
ＲＩ切断部位に挿入した。即ち、ウィルスＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、Ｂ−１で記述したと同様のフェノール
処理およびクロロホルム処理を行い、水層を分離した。
ｍＮＰＶ Ｔａ株の精製ＤＮＡをｇｏＯＲ１で消化し
、その断片を０．７％アガロースゲルにて電気泳動した
後、ニトロセルロースフィルターに転写（ｔｒａｎｓｒ
ｅｒ ） Ｌ／１前記のプローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行った０約１０．６ｋｂのＤＮＡ断片が特異的に
ハイブリダイズした。この断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏ
ＲＩ切断部位に挿入した。即ち、ウィルスＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、Ｂ−１で記述したと同様のフェノール
処理およびクロロホルム処理を行い、水層を分離した。
これに１／２０量の４Ｍ塩化ナトリウム溶液および２倍
量の冷エタノールを加えて沈殿したＤＮＡを少量のトリ
ス緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）−１ｍ
ＭＥＤＴｊ）に溶解した。一方、ｐＢＲ８２２はＥｃｏ
ＲＩで消化後、上記と同様に処１
理し、更にＢ Ａ Ｐ （ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋ
ａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐ−ｈａｔａｓｅ （Ｂｅ５ｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
７）で処理し、再びフェノール処理、クロロホルム処理
を行い、エタノールを加えて沈殿させ、これを少量のト
リス緩衝液に溶解した。
量の冷エタノールを加えて沈殿したＤＮＡを少量のトリ
ス緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）−１ｍ
ＭＥＤＴｊ）に溶解した。一方、ｐＢＲ８２２はＥｃｏ
ＲＩで消化後、上記と同様に処１
理し、更にＢ Ａ Ｐ （ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋ
ａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐ−ｈａｔａｓｅ （Ｂｅ５ｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
７）で処理し、再びフェノール処理、クロロホルム処理
を行い、エタノールを加えて沈殿させ、これを少量のト
リス緩衝液に溶解した。
これらのＥｃｏＲＩ消化したウィルスＤＮＡおよびｐＢ
Ｒ８２２にＴ４−リガーゼを加え、５℃で１０時間反応
、結合させた。これを大腸菌に１２ＪＭ８８に挿入した
。形質転換したテトラサイクリン耐性の大腸菌を前記の
ラベルしたｃＤＮＡをプローブとして用いたコロニーハ
イプリダイゼイションによりスクリーニングし、多角体
遺伝子を含む約１０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んだ
プラスミドを有する大腸菌を得た。これを培養し、セシ
ウムクロライド法でプラスミドＤＮＡを精製した。この
プラスミドをｐＢｍＫ ８６とした。ｐＢｍＥ８６の
ＥｃｏＲｌ −ＥｃｏＲＩ挿入部分の制限酵素地図は図
面に示す。前記のｃＤＮＡをプローブとしてサザン（５
ｏｕｔｈｅｒｎ ）ハイブリダイゼーション法により更
に挿入ＤＮＡ部分を検索したところ、Ｈｐａ Ｉ −Ｈ
ｌｎｄｕ 断片（約１．４ ｋｂ ）とのみハイブリ
ダイズした。
Ｒ８２２にＴ４−リガーゼを加え、５℃で１０時間反応
、結合させた。これを大腸菌に１２ＪＭ８８に挿入した
。形質転換したテトラサイクリン耐性の大腸菌を前記の
ラベルしたｃＤＮＡをプローブとして用いたコロニーハ
イプリダイゼイションによりスクリーニングし、多角体
遺伝子を含む約１０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んだ
プラスミドを有する大腸菌を得た。これを培養し、セシ
ウムクロライド法でプラスミドＤＮＡを精製した。この
プラスミドをｐＢｍＫ ８６とした。ｐＢｍＥ８６の
ＥｃｏＲｌ −ＥｃｏＲＩ挿入部分の制限酵素地図は図
面に示す。前記のｃＤＮＡをプローブとしてサザン（５
ｏｕｔｈｅｒｎ ）ハイブリダイゼーション法により更
に挿入ＤＮＡ部分を検索したところ、Ｈｐａ Ｉ −Ｈ
ｌｎｄｕ 断片（約１．４ ｋｂ ）とのみハイブリ
ダイズした。
Ｃ０多角体構造遺伝子部分の除去
前記のＨｐａ ｌ −Ｈｉｎｃｌ Ｉ断片を含む部分で
あるＨｉｎｄ ｍ −Ｈｉｎｄ Ｉ断片（約ａ、ｏｋｂ
）及び多角体遺伝子の下流部分を含むｎ１ｎｄｌ［−Ｈ
１ｎｄｌ断片（約８．１ ｋｂ ）を、市販のクローニ
ング、ベクターｐＵｃ９及びｐＵｃ８のＨｉｎｄ ＩＩ
切断部に組込み、夫々ｐ９Ｈ１８及びｐ８Ｈ２２５を作
成した。
あるＨｉｎｄ ｍ −Ｈｉｎｄ Ｉ断片（約ａ、ｏｋｂ
）及び多角体遺伝子の下流部分を含むｎ１ｎｄｌ［−Ｈ
１ｎｄｌ断片（約８．１ ｋｂ ）を、市販のクローニ
ング、ベクターｐＵｃ９及びｐＵｃ８のＨｉｎｄ ＩＩ
切断部に組込み、夫々ｐ９Ｈ１８及びｐ８Ｈ２２５を作
成した。
Ｇ−２多角体遺伝子部分の除去
プラスミドｐ９Ｈ１８をＥｃｏＲＩにて切断後、Ｂａｌ
８１にて処理し、切断点から両側を削り取らせたｈ
Ｂａｌ ３１の処理時間を変えて、種々の長さの断片を
製した。これをＨｉｎｄＮで処理し、０．７％アガロー
スゲル電気泳動で分離、抽出し、種々の長さのウィルス
由来のＤＮＡ断片を得た。
８１にて処理し、切断点から両側を削り取らせたｈ
Ｂａｌ ３１の処理時間を変えて、種々の長さの断片を
製した。これをＨｉｎｄＮで処理し、０．７％アガロー
スゲル電気泳動で分離、抽出し、種々の長さのウィルス
由来のＤＮＡ断片を得た。
ｐＵｃ９をＳｍａ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉで処理し、先
に得たＤＮＡ断片（平滑末端およびＨｉｎｄ Ｉ末端を
有する）をライゲートしてプラスミドを製し、大腸菌に
−１２ＪＭ８８を形質転換させた。これを増殖後、プラ
スミドを取り、挿入したウィルス由来のＤＮＡ断片の８
′側からの塩基配列をプライマー（Ｍ１３用１５ ｂａ
ｓｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ）を用い、
グイデオキシ（ａｉｅｏｘｙ）法により決定し、ウィル
スの多角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリアニ
らの文献記載の多角体蛋白のアミノ酸配列に対応する塩
基配列を、ウィルス由来のＤＮＡ断片の塩基配列中に見
出し、翻訳開始コドンＡＴＧも決定した。Ｂａｌ ８１
の処理時間に対応して得られた種々のプラスミドの内、
多角体遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの上流の２９ｂｐ
およびＡＴＧ以下の多角体蛋白構造遺伝子が欠損し
ているものをｐ９Ｂ２４１とした。
に得たＤＮＡ断片（平滑末端およびＨｉｎｄ Ｉ末端を
有する）をライゲートしてプラスミドを製し、大腸菌に
−１２ＪＭ８８を形質転換させた。これを増殖後、プラ
スミドを取り、挿入したウィルス由来のＤＮＡ断片の８
′側からの塩基配列をプライマー（Ｍ１３用１５ ｂａ
ｓｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ）を用い、
グイデオキシ（ａｉｅｏｘｙ）法により決定し、ウィル
スの多角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリアニ
らの文献記載の多角体蛋白のアミノ酸配列に対応する塩
基配列を、ウィルス由来のＤＮＡ断片の塩基配列中に見
出し、翻訳開始コドンＡＴＧも決定した。Ｂａｌ ８１
の処理時間に対応して得られた種々のプラスミドの内、
多角体遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの上流の２９ｂｐ
およびＡＴＧ以下の多角体蛋白構造遺伝子が欠損し
ているものをｐ９Ｂ２４１とした。
同様にしてＡＴＣの上流８２ ｂ′？′？Ｆ８ｂｐまた
は７ ｂｐ およびＡＴＧ以下が欠損しているものを夫
々ｐ９８５８７、ｐ９Ｂ８１０、換体ライブラリー（Ｌ
ａｖｍ等、Ｃｅ１ｌ １５１１５７（１９７８７）より
白血球工ＦＮ遺伝子を検索し、得られたα−ＩＦＮ−Ｊ
遺伝子を含むＤＮＡをＨｉｎｄ ＩおよびＥｃｏＲＩで
処理し、アガロースゲル電気泳動でα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝
子を含む断片を分離し、これをＨｉｎｄ ＩおよびＫＯ
ＯＲ工で処理したｐＵＯ９とライゲートした。得られた
プラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質転換させた。
は７ ｂｐ およびＡＴＧ以下が欠損しているものを夫
々ｐ９８５８７、ｐ９Ｂ８１０、換体ライブラリー（Ｌ
ａｖｍ等、Ｃｅ１ｌ １５１１５７（１９７８７）より
白血球工ＦＮ遺伝子を検索し、得られたα−ＩＦＮ−Ｊ
遺伝子を含むＤＮＡをＨｉｎｄ ＩおよびＥｃｏＲＩで
処理し、アガロースゲル電気泳動でα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝
子を含む断片を分離し、これをＨｉｎｄ ＩおよびＫＯ
ＯＲ工で処理したｐＵＯ９とライゲートした。得られた
プラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質転換させた。
このプラスミドを取り出し、ＭｓｔｌｌおよびＰｖｕ
ＩＩで処理し、α−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を分離し、その両端にＳａｇａ Ｉリンカ−（宝酒造製
）を結合させた。
ＩＩで処理し、α−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を分離し、その両端にＳａｇａ Ｉリンカ−（宝酒造製
）を結合させた。
これをＳｍａ Ｉ処理し、Ｄ項で得たプラスミドｐ８９
Ｂ２４１のＳｍａ Ｉ切断片とライゲートして組換えプ
ラスミドを製した。α−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向
に入っている事を確かめ、このプラスミドで大腸菌に−
１２ＪＭ８８を形質転換し、増殖させ、多量のプラスミ
ドを製した。このプラスミドをｐＩＦＮ−１−８２４１
とした。これは多角体遺伝子の上流部分（約−８ｋｂ目
から一３０番目まで）に続き、プラスミドル８９８２４
１構築の際に使用したリンカ−残基１８ｂｐおよび染色
体より得られたα−ｆＦＮ−Ｊ遺伝子の５′非翻訳領域
３２ｂｐの次にＡＴＧで始まるα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が
正しい方向に結合し、更に多角体遺伝子の下流部分（終
止コドンから下流約８００番目のｂｐから約ａ、１ｋｂ
ｐまで）が結合している。
Ｂ２４１のＳｍａ Ｉ切断片とライゲートして組換えプ
ラスミドを製した。α−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向
に入っている事を確かめ、このプラスミドで大腸菌に−
１２ＪＭ８８を形質転換し、増殖させ、多量のプラスミ
ドを製した。このプラスミドをｐＩＦＮ−１−８２４１
とした。これは多角体遺伝子の上流部分（約−８ｋｂ目
から一３０番目まで）に続き、プラスミドル８９８２４
１構築の際に使用したリンカ−残基１８ｂｐおよび染色
体より得られたα−ｆＦＮ−Ｊ遺伝子の５′非翻訳領域
３２ｂｐの次にＡＴＧで始まるα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が
正しい方向に結合し、更に多角体遺伝子の下流部分（終
止コドンから下流約８００番目のｂｐから約ａ、１ｋｂ
ｐまで）が結合している。
１１）α−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含む前記のＨｉｎｄｌ［
、ＥｃｏＲＩ切断片をｐＵｃｔ９にライゲートして得ら
れたプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質転換させ
、そのプラスミドを取り出し、Ｈｐａ ｎで処理し、α
−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、別途化
学合成したオリゴマー（ＣｉＴＡＯＧ＋ＧＧＧＣ）を３
２ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（
宝酒造社製）を用いてリン酸化し、別の合成オリゴマー
（（ｉＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣ）とアニーリングさせたも
のとライゲートさせた。これをアガロースゲル電気泳動
により分離抽出し、ふたたび３２ｐ −Ａ Ｔ Ｐおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した
のち０項で得たプラスミドｐ８９Ｂ２４１のＳｍａ Ｉ
切断片とライゲートして組換えプラスミドを製した
。α−ＸＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向に入っている事を
確かめ、このプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質
転換し、増殖させ多量のプラスミドを製し、これをｐＩ
ＦＮ−２−Ｂ−２４１とした。
、ＥｃｏＲＩ切断片をｐＵｃｔ９にライゲートして得ら
れたプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質転換させ
、そのプラスミドを取り出し、Ｈｐａ ｎで処理し、α
−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、別途化
学合成したオリゴマー（ＣｉＴＡＯＧ＋ＧＧＧＣ）を３
２ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（
宝酒造社製）を用いてリン酸化し、別の合成オリゴマー
（（ｉＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣ）とアニーリングさせたも
のとライゲートさせた。これをアガロースゲル電気泳動
により分離抽出し、ふたたび３２ｐ −Ａ Ｔ Ｐおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した
のち０項で得たプラスミドｐ８９Ｂ２４１のＳｍａ Ｉ
切断片とライゲートして組換えプラスミドを製した
。α−ＸＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向に入っている事を
確かめ、このプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ８８を形質
転換し、増殖させ多量のプラスミドを製し、これをｐＩ
ＦＮ−２−Ｂ−２４１とした。
これは多角体遺伝子の上流部分（約８ｋｂ上流から一８
０番目のｂｐ）に続き、プラスミドル８９Ｂ２４１構築
の際に使用したリンカ−残基１ａｂｐおよびＡＴＣで始
まるα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向に結合し、更に
多角体遺伝子の下流部分（終止コドンから下流約８００
番目のｂｐから約８．１ｋｂ下流まで）１
が結合している。
０番目のｂｐ）に続き、プラスミドル８９Ｂ２４１構築
の際に使用したリンカ−残基１ａｂｐおよびＡＴＣで始
まるα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子が正しい方向に結合し、更に
多角体遺伝子の下流部分（終止コドンから下流約８００
番目のｂｐから約８．１ｋｂ下流まで）１
が結合している。
同様にしてｐ８９８５８７、ｐ ８９ Ｂ ８．１０、
ｐ８９８２７６およびｐ８９８５８５を素材としてｐＩ
ＦＮ−２−８５８７、ｐＩＦＮ−２−Ｂ８１０、 ｐＩ
ＦＮ−２−Ｂ２７６およびｐＩＦＮ−２−８５８５を構
築した。
ｐ８９８２７６およびｐ８９８５８５を素材としてｐＩ
ＦＮ−２−８５８７、ｐＩＦＮ−２−Ｂ８１０、 ｐＩ
ＦＮ−２−Ｂ２７６およびｐＩＦＮ−２−８５８５を構
築した。
１１１）リンカ−の合成
オリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学合成：
Ｈ，Ｉｔｏらの報告（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃＷｓ Ｒｅ
５ｅａｒ−ｃｈ、匹 １７５５（１９８２７）に準じて
、ポリスチレン樹脂を用いた固相法により、オリゴマー
を合成した。完全に保護された二官能性ダイマー（１）
（約１００■）をｔ−ブチルアミン−ピリジン（１：ｏ
％）溶液により、対応する８′−燐酸ジエステル（ｎ）
に変換し、５′−遊離−ヌクレオシド樹脂（２７）と縮
合剤メシチレンスルホニル−ニトロトリアゾリド（ＭＳ
ＮＴ、ｔｏｏｙｎｇ）を用いて縮合させ、未反応の５′
−水酸基は無水酢酸−ピリジン（１： ９Ｖ／ｖ）溶液
によってアセチル化し、次いで２％トリクロル酢酸（Ｔ
ＣＡ）−塩化メチレンによって脱トリチル体（菊を得た
。これらの一連の反応を目的とするシーフェンスまで繰
り返した。
５ｅａｒ−ｃｈ、匹 １７５５（１９８２７）に準じて
、ポリスチレン樹脂を用いた固相法により、オリゴマー
を合成した。完全に保護された二官能性ダイマー（１）
（約１００■）をｔ−ブチルアミン−ピリジン（１：ｏ
％）溶液により、対応する８′−燐酸ジエステル（ｎ）
に変換し、５′−遊離−ヌクレオシド樹脂（２７）と縮
合剤メシチレンスルホニル−ニトロトリアゾリド（ＭＳ
ＮＴ、ｔｏｏｙｎｇ）を用いて縮合させ、未反応の５′
−水酸基は無水酢酸−ピリジン（１： ９Ｖ／ｖ）溶液
によってアセチル化し、次いで２％トリクロル酢酸（Ｔ
ＣＡ）−塩化メチレンによって脱トリチル体（菊を得た
。これらの一連の反応を目的とするシーフェンスまで繰
り返した。
得られたオリゴマー結合樹脂（約２０■）に０．５Ｍテ
トラメチルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム（
ピリジン−水（１５：４）中）０．５−を加えて８７℃
、８時間反応させ、次いで濃アンモニア水で５５°Ｃ，
８時間、処理した。溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −５
０ｆｉｎｅ （２，５Ｘ（ｌ Ｑ Ｃｍ ）のカラムで
ゲルろ化し、ＤＭＴｒオリゴマーを得た。これを高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、更に精製
した。カラムは逆相カラム（ｓｓｃ−ｏｎｓ−２７２，
０，６ｘ ２０ｃｍ ）を用い、溶液Ａ（０，０２Ｍ−
ＴＥＡＡ、Ｉ）Ｈ７，０）と溶液Ｂ（０，０２Ｍ Ｔ
Ｅ Ａ Ａ Ｎ ｐＨ７，０中５０％アセトニトリル
）による直線濃度勾配法を用いてＤＭＴｒオリゴマーを
精製した。これに８０％酢酸を加え、室温で２０分処理
し、脱トリチル化を行い、更に上述のＨＰＬＣによって
オリゴマーを得た。目的とするオリゴマーは１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／（ｐＨ７，５）−１ｍＭＫＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）で透析することにより得られた。この様にし
て得た完全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチド
の均一性（ｉ＋ｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ）は、逆相カラ
ムクロマトグラフィーで単一ピークで得られること、Ｔ
４−ポリヌクレオチドキナーゼを用い〔γ−３２ｐ）Ａ
ＴＰで５′−末端を標識した後、１５％ポリアクリルア
ミドゲル−７Ｍ尿素の電気泳動で単一バンドである事で
あることにより確認した。
トラメチルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム（
ピリジン−水（１５：４）中）０．５−を加えて８７℃
、８時間反応させ、次いで濃アンモニア水で５５°Ｃ，
８時間、処理した。溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −５
０ｆｉｎｅ （２，５Ｘ（ｌ Ｑ Ｃｍ ）のカラムで
ゲルろ化し、ＤＭＴｒオリゴマーを得た。これを高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、更に精製
した。カラムは逆相カラム（ｓｓｃ−ｏｎｓ−２７２，
０，６ｘ ２０ｃｍ ）を用い、溶液Ａ（０，０２Ｍ−
ＴＥＡＡ、Ｉ）Ｈ７，０）と溶液Ｂ（０，０２Ｍ Ｔ
Ｅ Ａ Ａ Ｎ ｐＨ７，０中５０％アセトニトリル
）による直線濃度勾配法を用いてＤＭＴｒオリゴマーを
精製した。これに８０％酢酸を加え、室温で２０分処理
し、脱トリチル化を行い、更に上述のＨＰＬＣによって
オリゴマーを得た。目的とするオリゴマーは１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／（ｐＨ７，５）−１ｍＭＫＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）で透析することにより得られた。この様にし
て得た完全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチド
の均一性（ｉ＋ｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ）は、逆相カラ
ムクロマトグラフィーで単一ピークで得られること、Ｔ
４−ポリヌクレオチドキナーゼを用い〔γ−３２ｐ）Ａ
ＴＰで５′−末端を標識した後、１５％ポリアクリルア
ミドゲル−７Ｍ尿素の電気泳動で単一バンドである事で
あることにより確認した。
（ＩＩ）
（ＩＶ）
Ｆ、Ｂｍｉ…包へのトランスフェクションＢｍＮＰＶ
Ｔａ株のウィルスＤＮＡとｐＩＦＮ−１−８２４１を
モル比で１ ： １００になる様にし、下記組成液ｌと
川を混合した。
Ｔａ株のウィルスＤＮＡとｐＩＦＮ−１−８２４１を
モル比で１ ： １００になる様にし、下記組成液ｌと
川を混合した。
■、蒸留水 ２．１４キヤリア
ＤＮＡ（鮭精巣、ｉｗｊ／ｎｌ） ５０ μｌＢ
ｍＮＰＶ ＤＮＡ １０ μ１ｐ
ＩＦＮ−１−Ｂ２４１ ＤＮＡ ５０ Ｐ
９２Ｍ塩化カルシウム液 ８００〜１１．０
．２８Ｍ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７，１） ２．５ｄリン酸緩衝液（８５
ｍＭ Ｎ２Ｌ２ＨＰＯ４−８５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）
５０ μ！生じた懸濁液の１４を４艷の８ｍ細胞培
養基に加え、カイコ細胞に上記ＤＮＡを導入した。２０
時間後、新鮮な培地と交換し、更に５日間培養後、培地
を回収した。遠心して清澄化した上清をとり、α−ＩＦ
Ｎの活性検定に用いた。
ＤＮＡ（鮭精巣、ｉｗｊ／ｎｌ） ５０ μｌＢ
ｍＮＰＶ ＤＮＡ １０ μ１ｐ
ＩＦＮ−１−Ｂ２４１ ＤＮＡ ５０ Ｐ
９２Ｍ塩化カルシウム液 ８００〜１１．０
．２８Ｍ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７，１） ２．５ｄリン酸緩衝液（８５
ｍＭ Ｎ２Ｌ２ＨＰＯ４−８５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）
５０ μ！生じた懸濁液の１４を４艷の８ｍ細胞培
養基に加え、カイコ細胞に上記ＤＮＡを導入した。２０
時間後、新鮮な培地と交換し、更に５日間培養後、培地
を回収した。遠心して清澄化した上清をとり、α−ＩＦ
Ｎの活性検定に用いた。
５令１日目のカイコに、Ｆ項記載の５日間培養後の培地
０．５１１Ｌ／／匹（１０’ ｐｆｕ ）を経皮的に注
入し、２５°Ｃで５日間、クワ葉を与えて飼育後、腹脚
に採取針をさし、体液を氷冷したエッペンドルフ・チュ
ーブに採取し、等量のＴＯ−Ｎｏ培地を加えて遠心しく
１０，０００ｒｐｍｓ ５分）、上清をとりα−ＩＦ
Ｎの活性検定に用いた。
０．５１１Ｌ／／匹（１０’ ｐｆｕ ）を経皮的に注
入し、２５°Ｃで５日間、クワ葉を与えて飼育後、腹脚
に採取針をさし、体液を氷冷したエッペンドルフ・チュ
ーブに採取し、等量のＴＯ−Ｎｏ培地を加えて遠心しく
１０，０００ｒｐｍｓ ５分）、上清をとりα−ＩＦ
Ｎの活性検定に用いた。
Ｈ０α−ＩＦＮのバイオアッセイ
ｌ）活性測定
Ｃ，Ｐｈ１ｌｉｐ等の報告（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ。
ｚｙｍｏｌｏｇｙ。
Ｖｏｌ、７８ ３８７〜８９４（１９８１７）に準じ、
ＦＬ細胞（ヒト羊膜由来）、Ｖ Ｓ Ｖ （ｖｅｓｉｃ
ｕ−１ａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ）を
用い、９６穴のマイクロタイター・トレーの中で、Ｎ工
Ｈのα−４ＩＦＮ標準品との比較で、５０％ｃｇｐ阻止
法（ｃｙｔｏｐａｔｈｉａ ｅｆｆｅｃｔ １ｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ ａｓｒ３ａｙ ）により測定した。結果を
表１に示す。
ＦＬ細胞（ヒト羊膜由来）、Ｖ Ｓ Ｖ （ｖｅｓｉｃ
ｕ−１ａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ）を
用い、９６穴のマイクロタイター・トレーの中で、Ｎ工
Ｈのα−４ＩＦＮ標準品との比較で、５０％ｃｇｐ阻止
法（ｃｙｔｏｐａｔｈｉａ ｅｆｆｅｃｔ １ｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ ａｓｒ３ａｙ ）により測定した。結果を
表１に示す。
表 １
なお、本発明で用いたＢｍＮＰＶおよび８ｍ細胞は微生
物工業技術研究所へ寄託申請したが受託を拒否された。
物工業技術研究所へ寄託申請したが受託を拒否された。
本発明の実験は、組換えＤＮＡ実験指針及び科学技術庁
へ提出した組換えＤＮＡ実験計画書に基づいて実施した
ものである。
へ提出した組換えＤＮＡ実験計画書に基づいて実施した
ものである。
第殉図は組換ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ作成例の概略図であ
る。
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶＤ
ＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子のプロモーター領域を含
む５′上流ＤＮＡ断片、翻訳開始コドン及び有用物質生
産用遺伝子を含み、更にＢｍＮＰＶＤＮＡの多角体蛋白
構造遺伝子の３′下流ＤＮＡ断片を含む、または含まな
い二重鎖ＤＮＡで組換（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）
されているＢｍＮＰＶ ＤＮＡを、培養細胞中または宿
主中で増殖させることを特徴とする有用物質の生産方法 （２）増殖がカイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で行
われる特許請求の範囲第１項の有用物質の生産方法 （３）カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ
ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子のプロモーター領域を
含む５′上流ＤＮＡ断片、翻訳開始コドン及び有用物質
生産用遺伝子を含み、更にＢｍＮＰＶ ＤＮＡの多角体
蛋白構造遺伝子の３′下流ＤＮＡ断片を含む、または含
まない二重鎖ＤＮＡで組換されているＢｍＮＰＶＤＮＡ
（４）ＢｍＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子のプ
ロモーター領域を含む５′上流ＤＮＡ断片及び３′下流
断片を含有するベクタ− （５）５′上流ＤＮＡ断片に続き翻訳開始コドン及び有
用物質生産用遺伝子を含んだ特許請求の範囲第４項のベ
クター （６）ＢｍＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子を、
プロモーター領域を含む５′上流部分及び３′下流部分
を含めて切り出し、得られたＤＮＡ断片の構造遺伝子部
分を有用物質生産用遺伝子と置換し、このものをベクタ
ーに導入して転移用組換ＤＮＡを製し、この組換ＤＮＡ
とＢｍＮＰＶＤＮＡを細胞または宿主に感染導入し、生
じた組換ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを増殖させることを特徴と
する有用物質の生産方法 （７）有用物質生産用遺伝子を外来遺伝子として遺伝子
組換えされた組換ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ（８）遺伝子組換
が多角体蛋白遺伝子領域の置換またはその他の領域への
挿入である特許請求の範囲第７項の組換ＢｍＮＰＶ Ｄ
ＮＡ （９）ＢｍＮＰＶ ＤＮＡをベクターとして利用するこ
とを特徴とする遺伝子工学的に有用物質を生産する方法 （１０）ＢｍＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子の
プロモーター領域を含む５′上流ＤＮＡ部分と、同遺伝
子の３′下流ＤＮＡ部分を利用することを特徴とする遺
伝子工学的に有用物質を生産する方法
Priority Applications (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59128215A JPS619288A (ja) | 1984-06-21 | 1984-06-21 | ペプチド類の製法 |
| FI852322A FI89184C (fi) | 1984-06-21 | 1985-06-11 | Foerfarande foer produktion av en genprodukt |
| NO852433A NO175215C (no) | 1984-06-21 | 1985-06-17 | Fremgangsmåte for fremstilling av et genprodukt i Bombyx mori eller i celler derav |
| PH32421A PH21679A (en) | 1984-06-21 | 1985-06-19 | A method of producing proteins or glycoproteins |
| CN 85104701 CN1016796B (zh) | 1984-06-21 | 1985-06-19 | 用重组的中国家蚕核多角体病毒制备异源基因产物的方法 |
| HU852434A HU202581B (en) | 1984-06-21 | 1985-06-20 | Process for producing valuable protein materials with utilizing recombinant dns of bomby mori polyhedrosis virus |
| IL7558485A IL75584A (en) | 1984-06-21 | 1985-06-20 | A recombinant IROM XYBMOB SISORDEHYLOP RAELCUN virus, an expression vector containing it and a method for producing proteins or polypeptides using it |
| PL1985254100A PL152355B1 (en) | 1984-06-21 | 1985-06-20 | Method for producing useful substances using genetically engineered viral DNA. |
| IE154885A IE59420B1 (en) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Method of producing useful substances |
| AU43943/85A AU588236B2 (en) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Novel vector comprising dna sequences from the bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, and the use of said vector to produce gene products by genetic engineering |
| DE8585107711T DE3585194D1 (de) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Verfahren zur herstellung von nuetzlichen substanzen durch verwendung von genetisch manipulierter virus-dns. |
| DK198502823A DK173054B1 (da) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Fremgangsmåde til fremstilling af nyttige polypeptider ved genteknik, rekombinant BmNPV-DNA og vektor, der er anvendelig ve |
| CA000484915A CA1284119C (en) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Expression method using recombinant bombyx mori nuclear polyhedrosis virus dna |
| EP85107711A EP0175852B1 (en) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Method for producing useful substances using genetically engineered viral dna |
| BG70778A BG60254B2 (en) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Method for the producing of proteins and glycoproteins |
| AT85107711T ATE71655T1 (de) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | Verfahren zur herstellung von nuetzlichen substanzen durch verwendung von genetisch manipulierter virus-dns. |
| KR1019850004412A KR930000273B1 (ko) | 1984-06-21 | 1985-06-21 | 약물의 유전공학적 제조방법 |
| US07/684,486 US5118616A (en) | 1984-06-21 | 1991-04-12 | Method of producing substances in living silkworms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59128215A JPS619288A (ja) | 1984-06-21 | 1984-06-21 | ペプチド類の製法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59227267A Division JPS619297A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | ペプチド類の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619288A true JPS619288A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH0573389B2 JPH0573389B2 (ja) | 1993-10-14 |
Family
ID=14979338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59128215A Granted JPS619288A (ja) | 1984-06-21 | 1984-06-21 | ペプチド類の製法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5118616A (ja) |
| EP (1) | EP0175852B1 (ja) |
| JP (1) | JPS619288A (ja) |
| KR (1) | KR930000273B1 (ja) |
| AT (1) | ATE71655T1 (ja) |
| AU (1) | AU588236B2 (ja) |
| BG (1) | BG60254B2 (ja) |
| CA (1) | CA1284119C (ja) |
| DE (1) | DE3585194D1 (ja) |
| DK (1) | DK173054B1 (ja) |
| FI (1) | FI89184C (ja) |
| HU (1) | HU202581B (ja) |
| IE (1) | IE59420B1 (ja) |
| IL (1) | IL75584A (ja) |
| NO (1) | NO175215C (ja) |
| PH (1) | PH21679A (ja) |
| PL (1) | PL152355B1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6474990A (en) * | 1987-09-17 | 1989-03-20 | Susumu Maeda | Vector, recombinant dna, virus and production of protein |
| JPH02103471A (ja) * | 1989-08-01 | 1990-04-16 | Tokuyama Soda Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病ウィルス感染診断薬 |
| WO2007135953A1 (ja) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Yamaguchi University | チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL80529A0 (en) * | 1985-11-14 | 1987-02-27 | Daiichi Seiyaku Co | Method of producing peptides |
| AU599348B2 (en) * | 1985-12-18 | 1990-07-19 | Microgenesys, Inc. | Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom |
| US5071748A (en) * | 1986-09-09 | 1991-12-10 | Genetics Institute, Inc. | Mixed baculovirus compositions and uses thereof |
| US5145775A (en) * | 1989-02-28 | 1992-09-08 | Research Association For Biotechnology Of Agricultural Chemicals | Polyhedrin gene and genetic engineering thereof |
| CA2019803C (en) * | 1989-06-29 | 2000-04-25 | Akira Yanai | Feline interferon and process for production thereof |
| CA2078525A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-03-19 | Sun Yukun | Expression vector and silkworm larvae transformant containing the same |
| JPH05227967A (ja) * | 1992-02-17 | 1993-09-07 | Katakura Kogyo Kk | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
| US6575013B2 (en) * | 2001-02-26 | 2003-06-10 | Lucent Technologies Inc. | Electronic odor sensor |
| EP1613909B1 (en) | 2003-03-18 | 2013-03-06 | Air Products And Chemicals, Inc. | Integrated multiple-loop refrigeration process for gas liquefaction |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| IE58011B1 (en) * | 1983-05-27 | 1993-06-16 | Texas A & M Univ Sys | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| ZA848495B (en) * | 1984-01-31 | 1985-09-25 | Idaho Res Found | Production of polypeptides in insect cells |
-
1984
- 1984-06-21 JP JP59128215A patent/JPS619288A/ja active Granted
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