JPH03219891A - 機能的な昆虫特異的毒素遺伝子の哺乳動物細胞における発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ある種のサソリの毒液は、昆虫に対して選択的な毒性を
示す特定のタンパク質を含有している。

これらの昆虫毒素は、昆虫に対しては強力な神経毒であ
るが、甲殻動物、節足動物、および哺乳動物に対しては
無害である。この毒素の神経毒効果は、軸索におけるＮ
ａの透過性の不可逆的な増大に起因するものであり、こ
れは餌動物を収縮性麻痺および死に至らしめる。これら
毒素は、その生物分解性と相まってその特異性故に、化
学合成品の殺虫剤に替わる魅力的な天然の代替物と見な
されるものである。

アンドロクトヌス・オーストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏ
ｎｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ）昆虫毒素（ＡａｌＴ）タ
ンパク質は、アンドロクトヌス・オーストラリスという
サソリの毒液中に天然に存在する、上記の神経毒の１っ
である。このＡａｌ　Ｔタンパク質はす′ノリ毒液の全
タンパク質含量の１％にも満たないので、それを天然か
ら、商業的に実施し得る量で入手するのは不可能てない
としても、実際的ではない。本発明は、組換えＤＮＡ技
術によってＡａｌ　Ｔタンパク質を生産するための代替
の方法を提供するものであり、これは、機能的な昆虫毒
素のタンパク質を生産する、商業的に実行可能な方法で
ある。

従来、原核生物の環境下でこの遺伝子を発現させようと
努力されてきたが、機能的な産物を産生させることはで
きなかった。真核生物系特有のサブセルラー・コンパー
トメント化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｍｐａｒｔ
ｍｅｎｔａｌ　１ｚａｔ　１ｏｎ）と分泌は、適切な三
次構造の形成に必須である。このＡａｌＴタンパク質は
７０個のアミノ酸タンパク質の中に４つのジスルフィド
架橋を含有しており、高度に交差連結している。これら
の結合か適切に形成することは、Ａａｌ′「タンパク質
の機能性にとって重要である１ツｃ、７牛ン（Ｚｌｏｔ
ｋｉｎ、　Ｅ、　）のＩｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　１３２１９−２３６（１９８３）のサソリ毒
液由来の昆虫選択的毒素］。分泌タンパク質としてのＡ
ａｌＴタンパク質は、翻訳と同時に、一定の方向性をも
って小胞体（ＥＲ）の内腔内に放出されるという特徴を
有する。

ＥＲ内腔のサブセルラー環境が、ＡａｌＴタンパク質の
適切な折り畳みに必須であるイオン性および極性を帯ひ
ているのは明らかである。本発明は、商業的に実施可能
な生産を可能とする、分泌タンパク質の真核生物細胞培
養における生産方法を提示するものである。さらに、こ
の系によれば、ＡａｌＴは培養培地中に分泌されるので
、ＡａｌＴタンパク質を単離するために発現細胞を細胞
溶解しなければならないという必要性かない。

７グナルペプチト配列は、分泌タン□バク實、またはサ
ブセルラー・メンプラン（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ）に結合したコンパートメントにおける
局在化をめざすタンパク質の適切な翻訳および一定の方
向性を持った放出に必須であり、かつ特徴的なものであ
る［ティビス（Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、　）およびタイ（Ｔ
ａｉＰ）のＮａｔｕｒｅ　２ｇ３．４３３−４３８頁（
１９８０）３゜種々の供給源から単離したンクナルペプ
チトのアミノ酸配列を比較すると、−次構造の保存性は
在るにしても僅かであることか示されている１フオン・
ヘイン（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、　）のＥｕｒ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３３．１２−２１頁（１
９８３）］。種々の研究により、重要なのは、ングナル
ペブチトにおける要求される一次構造ではなく、全体と
してのコンホーメーション（立体ｔｊｆ　造）であるこ
とか示唆されている。しかし、当該分野の他の研究者は
、適切なトランスローケーション（ｔｒａｎｓ　１ｏｃ
ａｔ　１ｏｎ）を保持するためには、当該シグナルペプ
チドに固有のタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列を保
持する必要かあると考えている［エムル（Ｅｍｒ、　Ｓ
、　Ｄ、　）らのＪ、Ｃｅ１１−Ｂｉｏｌｏｇｙ、８６
．７０１−７１１頁（１９８０）、ウィレン（Ｖｉ　ｒ
ｅｎ、　Ｋ、　Ｍ、　）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　、　２６３、１９７７１１９７７７頁（１９８８
）Ｅ。この固有の引込み配列（ｌｅａｄ−ｉｎ　５ｅｑ
ｕｅｎｃｅ）を導入すると、発現させようとしている実
際の構造タンパク質とは異なった分泌産物か得られる。

したかって、所望のタンパク質を得るためには、得られ
た産物を後に（可能ならば）修飾することか必須である
。本明細書に記載している本発明方法は、あるタンパク
質の７グナル配列をＡａｌ　Ｔの構造遺伝子に直接結合
させることによって、この工程が排除されているので、
結果として機能的なＡａｌＴ分子を、以後の修飾工程を
必要とすることなく、産生ずることができる。さらに、
この引込み配列か存在しないことは、それか存在するこ
とによって引き起こされる、あり得るコンホーメーショ
ンの障害を排除するものである。

一方、適切な引込み配列は、タンパク質の適切な折り畳
みにとって重要でもある。タンパク質のアミン末端のコ
ンホーメーションは、タンパク質が急速に適切な折り畳
みを行う上での共同効果を与えている。したがって、シ
グナルペプチドに固有の引込み配列を使用すると、タン
パク質のアミノ末端か修飾されることになり、これは適
切な折り畳みに影響を与え、結果として機能性を損なう
ことかある。

本明細書に記載した用語について、以下に定義を与える
。

Ａ−デオキシアテノシン。

Ａｌａ−アラニン残基 同族体（アナログ）−構造および機能の点で他のものと
類似している分子。

ＡｐＲ−アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。

Ａｒｇ−アルキニン残基。

Ａｓｎ−アスパラキン残基。

Ａｓｐ−アスパラキン酸残基。

Ｃ−チオキンシトシン。

ＣｙＳ−システィン残基。

Ｇ−チオキングアノシン。

Ｇｌｎ−グルタミン残基。

Ｇｌｕ−グルタミン酸残基。

ｃｒｙ−グリシン残基。

Ｈｉｓ−ヒスチジン残基。

１１ｅ−イソロイノン残基。

昆虫Ｒ素−殆との昆虫には神経毒作用を示すが、甲殻類
、節足類または咄乳類には同様の作用を示さない、ある
種の動物の毒液中に見いたされるタンパク實毒素群の１
つ。

組込み配列−特定の宿主細胞において、あるヘクターの
自律的な複製または染色体への組込みを可能とするＤＮ
Ａ配列。

Ｌｅｕ−ロイシン残基。

Ｌｙｓ−リノン残基。

Ｍｅｔ−メチオニン残基。

形成期タンパク質−ｍＲＮＡ転写物の翻訳の際に産生さ
れるポリペプチドであって、翻訳後修飾前のもの。

ｐＡ−ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。

Ｐｈｅ−フェニルアラニン残基。

ｐＬ−バクテリオファージλの左方向プロモーターのプ
ロモーター活性を含有するＤＮＡセグメント。

Ｐｒｏ−プロリン残基。

プロモーター−ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令するＤＮ
Ａ配列。

ｒＡａｌＴ−天然のＡａＩＴの組換え誘導体。

組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ以
上の追加的なりＮＡ上セグメント付加することかできる
、または既に付加されているＤＮＡ分子を含有する、自
律的に複製する物質であり、これにはプラスミドおよび
ファージかあるが、これらに限定されない。

組換えＤＮＡ発現発現ダクターロモーターが既に組込ま
れている組換えＤＮＡクローニングベクター レプリコン−プラスミドまたは他のヘクターの自律的な
？ｔｔ［Ｒを制御し、それを可能ならしめているＤＮＡ
配列。

制限フラグメン）−１つまたはそれ以上の制限エントヌ
クレアーセ酵素の作用によって生成された線状ＤＮＡ配
列。

選択マーカー−薬物耐性もしくは栄養独立性を付与する
が、または生物内において形態学的変化を招来させ、組
換え体を元のタイプから選別することを可能ならしめる
ＤＮＡ配列。

感受性宿主細胞−ある特定の抗生物質または他の毒性化
合物の存在下では、それらに対する耐性を付与するＤＮ
Ａセグメントか無ければ、生育てきない宿主細胞。

５ｅｒ−セリン残基。

シグナルペプチド−膜結合コンパートメント内に隔離さ
れるへきタンパク質の一定の方向性を持った適切な放出
に必須であり、かつそれに特徴的である種々の長さおよ
び一次構造を有するアミノ末端ポリペプチド。この配列
は、ｌ！翻訳と同時または翻訳後に構造遺伝子産物から
開裂される。

シグナル認識粒子−翻訳の初期に形成期シグナルペプチ
ド配列の中央領域と相互作用し、膜通過を介するポリペ
プチドの一定方向性の放出を容易ならしめる膜結合タン
パク質（群）と翻訳器官とか相互作用するまで翻訳を停
止させる、と考えられる、組成か未確定であるサイドシ
ル（細胞質ツル）粒子。

Ｓ　Ｐ−Ｉ　Ｔ遺伝子−昆虫毒素遺伝子またはその機能
的誘導体をコードしているＤＮＡ配列か直接連結した、
哺乳類シグナルペプチド配列をコードしている組換えＤ
ＮＡ配列。

構造遺伝子−翻訳開始および停止シグナルを含む、機能
性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。

Ｔ−デオキシチミジン。

ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性表現型またはそれを付与
する遺伝子。

Ｔｈｒ−スレオニン残基。

翻訳器官−ｍＲＮＡのポリペプチド配列への適切な翻訳
に必要である因子群の集合体であって、これにはリホソ
ームＰｒＬ＝体、ｍＲＮＡ５ＧＴＰ。

Ｇ　Ｍ　Ｐ　、および特定の調節因子か包含されるが、
これらに限定されない。

Ｔｒｐ−トリプトファン残基。

Ｔｙｒ−チロメン残基。

Ｖａｌ−バリン残基。

第１図・実施例１に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミｌ”ｐＫＣ２８３の制限部位および
機能地図。

第２図：実施例２に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＫＣ２８３ｐＸの制限部位およ
び機能地図。

第３図、実施例４に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＫｃ２８３−Ｌの制限部位およ
び機能地図。

第４図二実施例５に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位お
よび機能地図。

第５図：実施例６に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＫｃ２８３ＰＲ８の制限部位お
よび機能地図。

第６図：実施例６に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地
図。

第７図　実施例７に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるブラスミ）”ｐＮＭ７８９の制限部位および
機能地図。

第８図ニブラスミドルＮＭ７８９およびＰｖｕｌｌＢａ
ｍＨＴ合成フラクメントからのプラスミドｐ１２０の作
成を示す、実施例７を説明する模式図。

第９図、実施例７に記載の操作法に実質的にしたかって
調製されるプラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地
図。

第１０図：実施例９に記載の操作法に実質的にしたかっ
て調製されるプラスミ１”ｐＲＢ−ＩＴの制限部位およ
び機能地図。

第１１図　５Ｐ−４Ｔハイブリツド遺伝子をコード口て
いるＤ　Ｎ　Ａ配列のポンチイブ・ストランドのコード
化配列である。この図には、ＳＰ弓Ｔ遺伝子産物の対応
するアミノ酸配列も示しである。

第１２図：実施例ＩＯに記載の操作法に実質的にしたか
−）で調製されるプラスミドｐＭＳＶ−ｒＴの制限部位
および機能地図。

本発明は、機能的な分泌昆虫毒素を組換え真核生物宿主
１−１ｌＩ胞において産生させる方法であって、Ａ、ｉ
）？ＨＭ起点または組込み配列、１１）該宿主細胞内で
機能するプロモーターまたは針訳活性化配列、 ｉｉｉ）哺乳動物シグナルペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列、 １〜・）昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列、
および ■）選択マーカー を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターによって真核生物
宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、次いで Ｂ　該機能的な昆虫毒素を発現し、分泌するのに適した
条件下で該真核生物宿主細胞を培養することを特徴とす
る方法に関するものである。

本明細書において最初に例示する本発明の１つの帖様と
しての合成毒素遺伝子は、アントロクトヌス・オースト
ラリスサソリの昆虫時１な毒素（ＡａｌＴ）をコードし
ているＤＮＡ配列と結合している、ヒトインターロイキ
ン−２シグナルペプチド（Ｉ　Ｌ−２−３Ｐ）をコード
しているＤＮＡ配列を含有している。さらに、本発明は
、ＩＬ−２ＳＰおよび昆虫毒素と同一のアミノ酸配列を
コードしているポリヌクレオチド配列の機能性等価物ま
たは誘導体に関するものである。「機能性等価物または
誘導体」なる用語は、特許請求しているプレタンパク質
と同等の性質および生物学的機能を有しているプレタン
パク質をコードしているヌクレオチド配列のフラグメン
ト、変異体または同族体を包含する用語である。

本発明の機能性キメラ遺伝子は、以下の幾つかの因子か
ら構成される； ａ　プロモーターまたは転写活性化配列、ｂ、ＡＴＧ開
始コトノを包含する関連した翻訳活性化配列の下流に位
置し、かつそれと適切な解読フレームにある、Ｕｍ乳類
／グナルペプチト＋Ｙ列をコードしているＤＮＡ配列、
および Ｃ／グナルベプチトをコードしている配列の直後にあり
、かつそれと適切な解読フレームにある昆虫毒素遺伝子
または誘導体をコードしているＤ　ＮＡＡ配列 既知のポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド
配列は、ＤＮＡアンヒキュイティー（ＤＮＡａｍｂｉｇ
ｕｉｔｉｅｓ）のためのスタンフォート・コードなとの
ような、容易に入手できる遺伝子コード配列を使用して
識別することかできる。ヌクレオチド配列は、アプライ
ド・ハイオシステムズの３８０−Ａ型ＤＮＡ合成機なと
のＩ）　Ｎ　Ａ合成機によって作成されるオリコヌクレ
オチトセグメントへと逆畦訳し、次いで確立された常套
手段により連結することによって、作成することかでき
る「マニアティス（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ、　）ら
のモレキュラー・クロニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ￥ａｎｕａ
ｌ）　（１９ｇ２）］。

本発明の遺伝子は２つのセグメントから構築した。分泌
タンパク質のプレタンパク質形態のアミノ酸配列を記載
する上では、開裂点を番号付けの起点として使用するこ
とが通常の方法である。これらのアミノ酸の上流（すな
わち、ングナル配列）は、シグナルペプチドの開裂点か
ら離れる分たけ１、−２、−３なとと記載される。これ
らのアミノ酸の下流は、同様に＋１１＋２なとと記載さ
れる。

サソリ毒素Ａａｌ　Ｔ誘導体を不ズミ細胞内で産生、分
泌させる上で最終的に使用するプラスミドは、３つの工
程によって構築した。最初の工程は、ＡａｌＴ誘導体遺
伝子を化学的に合成し、それをプラスミドｐＢＲ３２２
にクローニングすることに関連する。２２６ｂｐの合成
フラグメントは、アンドロクトヌス・オーストラリスサ
ソリの殺虫性毒素の開示されているアミノ酸配列［ツロ
ノキン（Ｚｌｏｔｋｉｎ、　Ｅ、）のＩｎ５ｅｃｔ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３．２１９２３６（１９８
３）］から、当業界周知の方法によって作成した。得ら
れた合成オリゴヌクレオチドフラグメントは、＋１から
＋６９のアミノ酸をコードしているＡａｌＴ誘導体遺伝
子であって、その両端にＢａｍＨＩエンドヌクレアーセ
認識配列を有している物質を含有しており、そのポジテ
ィブ・ストランド（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５ｔｒａｎｄ）
は以下の配列を有していた 次いで、Ｔ４ポリヌクレオチトキナーセ［ファルマンア
ーＬＫＢバイオテクノＯ’；’　　、　Ｉｎｃ、　、　
ＮＪ　０８８５４゜ビスカッタウェイ、セントラル・ア
ベニュー８００番］を使用し、そのフラグメントをリン
酸化して５リン酸基を付与し、Ｔ４ＤＮＡリガーセによ
って連結した後、得られた合成配列をプラス！”ｐＢＲ
３２２Ｅニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓｌ　ＭＡ　０１９１
５．　ヘハーリー、トノツィー・ロー１”３２［）Ｂ　
ａｍ８１部位に導入し、プラスミドｐＢＲ３２２−ＩＴ
を作成した。

第２の工程は、ヒトインターロイキン−２の２０個のア
ミノ酸の７グナルベプチト（ｒ　Ｌ　２−３　Ｐ）およ
びＡａｒＴの最初の８個のアミノ酸をコードしているＤ
ＮＡフラグメント（セグメントＡ）であって、その５”
および３′末端にそれぞれエントヌクレアーセＢｇｌＩ
ＩおよびＨｉｎＦｌの認識配列を有しているフラグメン
トの化学的合成に関するものであった。このセグメント
（セグメントＡ〉のポンチイブ・ストランドの配列は、 ＧＡＴ　　ＣＴＡ　　ＴＭ　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　Ｔ
ＡＣＡＧＧ　　ＡＴＧ　　ＣＡＡ　　ＣＴＣＣＴＧ　　
ＴＣ’Ｉ’　　ＴＧＣＡＴＴ　　ＧＣＡ　　Ｃ’Ｉ’Ａ
　　ＡＧＴ　　Ｃ’［’Ｔ　　ＧＣＡ　　ＣＴＴＧＴＣ
ＡＣＡ　　ＡＡＣＡＧＴ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡ
ＣＧＧＣＴＡＣＧＣＴＴＴ　　Ｇ である。

次いで、プラスミドｐＢＲ３２２−ＩＴをＢａｍＨＩお
よびＨｉｎＦ］制限エンドヌクレアーセで消化シ、セグ
メントＢを作成した。ＤＮＡセグメントＢは、配列 ＡＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＭＡ　ＧＣＴ　　ＣＣＧ　
ＧＡＡ　ＴＧＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴ　ＡＡＣＴ
ＡＣＴＧＣｋＡＣＡＡＣＣＡＧ　　ＴＧＣＡＣＴ　ＡＭ
　　ＧＴＴ　　ＣＡＴ　ＴＡＣＧＣＴ　　ＧＡＣＡＡＡ
　ＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　
ＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧ　ＡＡＣＧＡＣ
ＧＡＣＡＡＡ　ＡＡＡ　　ＧＴｒ　　ＣＴＧ　ＧＡＡ　
ＡＴＣＴＣＴ　　ＧＡＣＡＣＴ　　ＣＧＴ　ＡＡＡ　Ｔ
ＣＴ　ＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＣＴＡＣ’ｒ　　ＡＴＣＡ
ＡＣＴＭ　ＴＡＧで示されるポンチイブ・ストランドの
配列である、ＡａｒＴ誘導体タンパク質の＋９から＋６
９のアミノ酸をコードしている物質を含有していた。

昆虫神経毒遺伝子を発現させるために最終的に使用され
るプラスミドの作成における第３の工程は、ヒトインタ
ーロイキン−２のングナルベブチトおよびサソリの殺虫
性神経毒ＡａｌＴ誘導体をコードしているハイフリ、ド
遺伝子であって、その５゛および３”末端にそれぞれエ
ンドヌクレアーセＢｇｌＩＩＩおよびＢａｍＨＩの認識
配列を有する遺伝子を作成する、セグメントＡおよびＢ
の連結に関するものであった。次いで、得られたハイブ
リットＪＲ（云子をプラスミドｐＬ４７のＢｇｌｌＩお
よびＢａｍＨ１部位に挿入した。

プラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地図４７の構
築は、ますＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＢＥ　ｌ　２０
１／ｐＫＣ２８３からプラスミｌ”ｐＫＣ２８３を単離
することにより始めた。この培養物は、受託番号ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１５８３０の下、ＮＲＲＬから入手すること
かできる。プラスＥｌ”ｐＫＣ２８３は、ハタテリオフ
ァーンλのハイブリｙ　ト１ｐｐ−ｐＬプロモーターを
含有している。このプラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　
１２　　ＢＥ　］　２０１細胞が細胞性ＤＮＡに組み込
まれた湿度感受性ｒＡ’）ブレ、サーを含有しているの
で、その細胞から得られる。

プラスミドｐＫＣ２８３を制限酵素ＰＶＵＵて消化する
ことによって、そのプラスミド′がら不必要な１ａｃＺ
部分を切除した。次いで、特定のＤＮＡξノンカーを得
られた消化ＤＮＡに付加し、Ｐｖｕｆ１部位を単一のＸ
ｈｏ１部位に変換し、プラスミｌ”ｐＫＣ２８３ＰＸを
作成した［プラスミドｐ　ＫＣ２８３およびｐＫＣ２８
３ＰＸの詳細な単離方法は、それぞれ実施例１および２
に記載している］。プラスミドｐＫＣ２８３およびｐＫ
Ｃ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の第１図
および第２図に示す。常法によって、プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸをＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛）に
クローンする。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　Ｐｖｌｏ（
λ゛）は受託番号ＮＲＲＬＢ−１５９９３の下、ＮＲＲ
Ｌから入手することかできる。

次いで、プラスミＦｐＫＣ２８３ＰＸを制限酵素Ｂｇｌ
ＬｌおよびＸｈｏｌて消化した。得られたベクターを精
製した後、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｌ末端を有するＩ）
　Ｎ　Ａリンカ−をこのベクター内に連結し、プラスミ
ドｐＫｃ２８３−Ｌを形成させた。このＢｇｌＬＩ−Ｘ
ｈｏｌリンカ−はＸｂａ＋部位も含有していた。次いで
、プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌのｘｈ０１部位をＢａｍ
Ｈ１部位に変換した。これは、プラスミドｐＫＣ２８３
−Ｌを制限酵素Ｘｈｏｌで完全に消化した後、クレノー
処理し、次いでＢａｍＨｌリンカ−を付加することによ
って行い、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢを形成させた
。プラスミドｐＫＣ２８３−ＬおよびｐＫＣ２８３−Ｌ
Ｂの構築についての詳細は、それぞれ実施例４および５
に記載している。プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌおよびｐ
ＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図は添付の第
３図および第４図に示している。

次に、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを制限酵素５ａｉｉ
で完全消化した後、得られた〜４．Ｏｋｂヘクターをク
レノー処理し、次いでＥｃｏＲＴリンカ−を付加するこ
とで、このプラスミドから外来のＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ
を切除した。連結によって再環状化し、プラスミドｐＫ
Ｃ２８３ＰＲ３か形成された。次いで、プラスミドｐＫ
ｃ２８３ＰＲ３を制限酵素Ｐｓｔｌおよびｓ　ｐｈ　ｒ
で消化し、〜０８５ｋｂのＰｓｔｌ−３ｐｈｌ制限フラ
グメントを単離した。

同様に、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢを制限酵素Ｐｓ
ｔｌおよびＳ　ｐｈ　Ｔで消化し、〜０．３ｋｂのフラ
グメントを単離した。次いで、ｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜
０．８５ｋｂ　Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ　７ラグメントをｐ
ＫＣ２８３−Ｌ　Ｂノル３．　Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ−３ｐ
ｈｌベクターフラグメント内に連結し、プラスミドｐＬ
３２を作成した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ８および
ｐＬ３２の構築についての詳細は、実施例６て説明する
。プラスミＦｐＫＣ２８３ＰＲ３およびｐＬ３２の制限
部位および機能地図を添付の第５図および第６図に示す
。

次に、プラスミドｐ　Ｎ　Ｍ　７８９は、ＮＲＲＬにお
ける、受託番号Ｂ−１８２１６のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１
２　　ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８９から入手される。

プラスミｌ’ｐＮＭ７８９の制限部位および機能地図を
添付の第７図に示す。プラスミドｐＮＭ７８９を制限酵
素ＰｖｕｌＩで部分消化し、制限酵素ＢａｎＨｌて完全
ｉｆ”Ｊ　（ヒし、次いでアルカリホスファターセで処
理した。次に、新しいＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨｒリンカ−
を、この消化しリン酸化したベクターｐＮＮ・１７８９
内に連結し、プラスミ）”１２０を作成した。次いで、
プラスミド１２０を制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩ
て完全に消化し、〜０．６ｋｂＸｂａ１−ＢａｍＨＩの
ＥＫ−ＢＧＨ−１−ド化制限フラグメントを単離した。

プラスミドｐＬ３２も制限酵素ＸｂａＪおよびＢａｍＨ
Ｉて消化し、〜３，９ｋｂヘクターフラグメントを単離
した。次いで、プラスミド１２０の〜０６ｋｂ　Ｘｂａ
Ｉ　−ＢａｍＨ１フラグメントをプラスミドｐ　Ｌ、　
３２の〜３．９ｋｂへフタ−フラグメント内に連結し、
プラスミドｐＬ４７を作成した。プラスミド１２０およ
びｐＬ４７の構築についての詳細は、実施例６および実
施例７て説明する。プラスミド１２０およびｐ　Ｌ　４
．７の制限部位および機能地図を添付の第８図および第
９図に示す。

セクメントＡおよびＢを互いに連結すると、ＩＬ２−ｓ
　ｐ−ＡａＴ　Ｔ誘導体のハイブリ、トポリペプチドを
コードしているキメラ遺伝子か生成された。本明細書で
例示する好ましい態様は、５゛末端にＢｇｌｌＴ認識配
列を有し、かつ３゛末端にＢａｍＨ１認識配列を有して
いる、ｌ　Ｌ　２−３　Ｐ−ＡａｌＴ誘導体プロタンパ
ク質をコードしているキメラ遺伝子を、原核生物クロー
ニングベクターｐＬ４７の唯一のＢａｍＨＩ部位を利用
してこのｐＬ４７にクローンし、プラスミドｐＲＢ−Ｔ
Ｔを作成することである。ｐ　ＲＢ−Ｉ　Ｔの制限地図
を第１０図に示す。このプラスミドを常法によってＥ　
、　ｃｏｌｌに導入することで、増幅した。塩化センラ
ム密度勾配遠心によってこのプラスミドを単離した。

ｐＲＢｉＴプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩて
切断し、Ｓ　Ｐ−（Ｔ遺伝子をコードしている２８５ｂ
ｐフラグメントを単離した。その配列を第１１図に示し
ている。この２８５ｂｐフラグメントは、アカロースケ
ル電気泳動によって単離した。次いで、５Ｐ−ＩＴ遺伝
子をコードしているＤＮＡ配列を、真核生物細胞を形質
転換することかてきるプラスミドまたはウィルスベクタ
ーなとの発現ベクターに挿入した。好ましいベクターは
、そのケノムに組み込まれたプロウィルス配列のすへて
、またはその一部を有しているプラスミドを含有するレ
トロウィルスであった。このレトロウィルス遺伝子は、
両端にそれぞれ長い末端反復配列を有している。その５
゛および３゛末端の長い反復配列は、ウィルスｍＲＮＡ
の転写およびボリアテニル化を促進（プロモート）する
ものである。合成５Ｐ−ＩＴ遺伝子を、このウィルスの
長い末端反復（ＬＴＲ）配列の転写制御下にある、この
プラスミドのプロウィルス部分に挿入した。本発明の１
つの態様として、Ｓ　Ｐ−Ｉ　Ｔ遺伝子を好ましいレト
ロウィルスベクターｐＭＳＶに挿入した。このｐ　Ｍ　
Ｓ　Ｖ　（１９８８年１０月４日発行の米国特許筒４，
７７５．６２４号）プラスミドは、不ス゛ミレトロウイ
ルスであるＭｏ、　Ｍ　Ｓ　Ｖ　Ｃストラトーワ（Ｓｊ
ｒａｔｏｗａ、　Ｃ，）らのＥＭＢＯＪ、　１２；１９
７３−７８（１９８２）］のプロウィルス配配列体を含
有している。

組換えレトロウィルスベクターは、以下の４つの要素か
ら構成される Ａ、レトロウィルスパッケージングシグナル配列を含有
するＤＮＡに先導するレトロウィルス由来の５”ＬＴＲ
。

Ｂ１発現させようとしている具体的な遺伝子、すなわち
昆虫毒素遺伝子Ｓ　Ｐ−Ｉ　Ｔ、Ｃ１選択マーカー遺伝
子、および り、無傷のＬＴＲを含有しているが、またはウィルスの
エンハンサ−領域か欠失しているが、またはウィルスエ
ンハンサ−およびプロモーター領域か欠失している３’
ＬＴＲ０組換えレトロウィルスベクターは、形質転換体
か選択マーカーによって同定される運搬体セルラインに
遺伝子を移入することかできる。個々のコロニーを取り
上げ、継代培養すれば、形質転換された単一のセルライ
ンを得ることができる。

形態学的な変異または化学的依存性もしくは独立性を付
与する幾つかのタイプのマーカー遺伝子か人手可能であ
る。好ましいマーカーは、モロニー不ズミ肉腫ウィルス
（Ｍｏ−Ｍ　Ｓ　Ｖ　）の形質転換特異的遺伝子である
、ｖ−ｍｏｓ腫瘍遺伝子である［つ゛アン０ヘハーレン
（Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ）らのＮａｔｕｒｅ、　２８
９．２５８２６２（１９８１，）］。このｖ−ｍｏｓ腫
瘍遺伝子は、宿主細胞を形質転換し、容易に見ることの
できる形態学的変化を引き起こす。たとえば、形質転換
されていない３Ｔ３細胞は平坦であり、接触阻止を受け
る。

しかし、ｖ−ｍｏｓで形質転換された３Ｔ３細胞は、球
状または紡錘状形態であり、高い屈折力かあり、接触阻
止されない。このようなり−ｍｏｓ／　３　Ｔ　３形質
転換体は、トランスフェクトの数日後に現れ、２週間ま
でに形質転換体のフォーカスか明瞭に視覚化される。５
Ｐ４Ｔ遺伝子をｖ−ｍｏｓ遺伝子と同じＬＴＲ転写制御
下に置くと、ｖ−ｍｏｓに特徴的な形態学的変化によっ
て５Ｐ−ＩＴ遺伝子を発現する組換え体を単離すること
ができる。

他の選択マーカーも利用することかできる。通常は、抗
生物質耐性を付与する遺伝子か使用され、培養培地中に
存在する抗生物質に対する、形質転換された細胞の耐性
によって形質転換体を単離する。たとえば、発現させる
ために挿入する遺伝子に連結した不オマイノンまたはハ
イグロマイシン耐性遺伝子によって、これが無ければ毒
性を示すレヘルて抗生物質を含有する培地中で細胞を培
養することによって、形質転換体を単離することかでき
る。

ハイブリッド遺伝子をレトロウィルスのプラスミドに挿
入することは、制限エンドヌクレアーゼによる消化およ
び連結によって行った。プラスミドｐ　ＲＢ−Ｉ　Ｔの
ＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩ消化によって単離した、線
状化したキメラ遺伝子配列を、フラスミ）”ｐＭＳＶの
唯一のＢｇｌ１１部位を利用してｐＭＳＶに組み込んだ
。得られたプラスミド、ｐＭＳＶ−１丁を、実施例３に
記載の方法に実質的に従い、Ｅ、ｃｏｌｉ中で増幅させ
た。プラスミドｐＭＳＶ−■Ｔは、ＣｓＣ０密度勾配遠
心によって単離した。

得られたレトロウイルスヘクターを使用し、５Ｐ−ＴＴ
遺伝子を宿主細胞に導入した。この５ＰｒＴＪｆｉ伝子
、選択マーカー、および５′および３ＬＴＲ配列を含有
するプラスミドを、リン酸カル／ウム法［ウィグラー（
Ｍ、　Ｗｉｇｌｅｒ）らのＣｅ１１．１．４．７２５（
＋９７８）、ライ（Ｍ、　Ｔ、　Ｌａ１）およびハフ　
（１，Ｍ、　Ｖｅｒｍａ）のＶｉｒｏｌｏｇｙ、　１０
４４０７−４１７（１９８０）］なとのトトランスフェ
クンヨンによって宿主細胞に移した。これらのプラスミ
ド遺伝子の転写および翻訳は、宿主細胞の転写および翻
訳機構によって行われた。選択マーカーによって同定さ
れるトランスフェクトされた細胞を継代培養すれば、形
質転換された細胞か大量に得られる。

昆虫毒素を単離し、その適切な細胞外分泌を確実ならし
めるため、細胞か８０−９０％の全面成長するまで培養
した。次いで、血清を含有する培地を、血清不含のＤＭ
ＥＭ（タルへノコの改変イーグル培地）と置き換えた。

次いで、細胞を２４時間インキユヘートした。次いで、
組織培養液を採取し、低速の遠心によって細胞残骸を除
去し、ＹＭＩＯ膜フィルターを備え付けたアミコン限外
濾過装置によってａ縮した。濃縮が、約５倍、２０倍、
５０倍、１００倍、２００倍、および３００倍になった
ら、それらを以後に行う試験用の標本として採取した。

ｐＭＳＶ−ＩＴて形質転換したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ９２）の濃縮した培養培地における、黄熱
蚊（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ）の幼虫の致死能によ
って、分泌された昆虫毒素の機能を測定した。

黄熱蚊の幼虫は、実施例１２の教示に実質的に従うこと
で得た。断化ブロス５０μａ中、約１０１５匹の幼虫を
、ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換３Ｔ３細胞から得た濃縮培養
ブロス（ＤＣ，−１）の同量に暴露した。濃縮培養培地
への暴露後２．４および２４時間経過後に、死亡率をモ
ニターした。以下の第１表に、この操作結果を示す。こ
のデータは、ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換細胞（ＤＣ−１）
の培養培地か１変依存的に蚊の致死能を有していること
を明らかに示している。ｐＭＳＶ形質転換３Ｔ３細胞（
Ｄ　Ｂ　−２）の対、昭試料はこのような殺虫活性を示
しておらす、このことは殺虫活性か５Ｐ−ＩＴ遺伝子に
よる３Ｔ３細胞の形質転換に直接起因していることを証
明するものである。これらの結果は、ＡａｌＴ誘導体タ
ンパク質か適切に折り畳まれて分を必されたことを示唆
するものであり、それは、機能的な分泌ＡａｌＴ誘導体
タンパク質が、化学的または人工的な修飾をさらに必要
とすることなく産生されたことを意味する。

（以下余白） 第１表 蚊の幼虫で試験したｒＡａｌＴの殺虫活性培養ｆ夜の 供給元 以下のｌＲ度の組織培養液の同量を含有するブロス中に
おける蚊の幼虫の死亡率 ＩＸ　　　５Ｘ　　　２０Ｘ　　　５（ＩＸ　　　Ｉａ
ＯＸ　　　２ＱＱＸ　　　３Ｑ［ＸＤＣ１細胞ａ＋　　
−／、Ｃ１、Ｃ１＝、Ｃ１＋＋、Ｃ１、、。

ＤＢ−２細胞５ ａ）ｐＭＳＶ−ＩＴて形質転換したＮＩＨ／３Ｔ３細胞
ｂ）ｌ）ＭＳＶて形質転換したＮＩＨ／３Ｔ３細胞Ｃ〉
蚊の幼虫の死亡率は、毒素を昆虫に投入して２．４およ
び２４時間後に記録した。

／＋：２４時間以内で１００％よりも低度に死亡２４時
間以内で１００％の死亡 ＋＋、４時間以内で１００％の死亡 ＋＋＋：２時間以内で１００％の死亡 ｄ）　　１週間後に観察した。

シグナルペプチドは、個々のサブセルラー・コンパート
メントに分泌または局在化されるタンパク質である、と
いう特徴を有している。このノグナルベプチトは、以下
に記載の３つの基本的な機能を提供することによって、
正しいサブセルラー局在化または分泌を可能とする １　ングナル認識粒子（ＳＲＰ）との相互作用によりタ
ンパク質合成を阻止する、 ２　膜を介する一定方向の放出を可能ならしめる、およ
び ３　シグナル配列から構造遺伝子の−１から＋１の境界
面における適切なプロテアーセ活性の場所を提供する。

既知の／グナルペプチトはすへて同様に機能するが、種
々の供給源から得られる／グナルペプチトのアミノ酸配
列の保存性はあるにしてもほとんど僅かであることか示
されているＪｖｏｎ　Ｈｅｉ、ｉｎｅ、Ｇ。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３３．１７−２１
（１９８３）］。しかし、二次および三次構造的な要素
および疎水性／親水性の相互作用からみると、シグナル
ペプチドには、上記の３つの筬能に符号するホモロ／−
（相同性）領域か存在している。構造的ホモロン−のこ
の３つの保存された領域は、（ａ）アミン末端領域、（
ｂ）中央領域（ｃｅｎｔｒａｌ　ｒｅｇｉｏｎ）、およ
び（ｃ）カルホキ／末端領域と呼ばれている。

このアミ／末端領域は、正味の正電荷によって特徴付ら
れる。正味の負電荷はプロセッシングを阻害する。この
領域は、６個までのアミノ酸の長さの変動に対して影響
を受けない。しかし、１０から１３個のアミノ酸を付加
または取り出すと、トランスローケーンヨンか妨害され
る。シグナルペプチドの機能にとって、長さは重要でな
いよってあるが、機能性ホモロシーの他の領域とアミン
末端領域との物理的距離は重要である。さらに、個々に
特徴的なアミノ酸配列は存在しないが、この領域に存在
するアミノ酸残基には、β−ターンの存在か示唆される
ことが多い。シグナルペプチドのアミノ末端領域は一般
に、膜を介するポリペプチドの適切なトランスローケー
／ヨンに関連していると考えられる。

シグナルペプチドの中央領域は、α−へリノクスのコン
ホーメーションの形成に好ましい残基か高度に密集して
いることが特徴的である。この領域は強い疎水性を示す
。この領域でも、保存されたアミノ酸配列は存在しない
。この領域は一般に、膜を通過する一定方向の放出を行
わせる膜結合タンパク質との相互作用の継続中に翻訳を
阻止するンクナル認識粒子（ＳＲＰ）と相互作用すると
考えられる。

カルボキン末端領域は、−１から一３位の高度な（呆存
性か特徴である。−１位は、通常はアラニン、セリン、
グリシン、ンステイン、スレオニンまたはグルタミンな
と、小さな残基てなければならない。−３位の残基は、
芳香性、荷電性、または大きくて極性であってはならな
い。さらに、フロリンは−３から−１の領域から除外さ
れる［ｖａｎ［１ｅｉｊｎｅ、　Ｇ、　、　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４．４６８
３−９０（＋９８６）ｌ。

これら３つの要素を総合して考えると、適切な／グナル
配列の機能は、個々に特徴的な一次構造ではなく、特徴
的な二次および三次構造に主として由来するものである
ことを証明することかできる。しかし、他の研究者は、
シグナルペプチドの適切な開裂およびその機能に必須で
ある特性はシグナルペプチドの一次構造、および個々の
シグナルペプチドに通常付随するタンパク質の最初の幾
つかのアミノ酸残基に関係している、という理論を展開
している。これについては、エマ−（Ｅｍｒ、ＳＤ）ら
のＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８６．７０１−７１
１（１９８０）およびウィレン（Ｗｉｒｅｎ、　Ｋ、　
Ｍ、　）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６
３．１９７７１−１９７７７（１，９８８）を参照のこ
と。しかし、これらの例は、−次、二次および三次構造
の基本的な相互作用を無視している。シグナル配列に通
常付随するポリペプチドの最初の幾つかのアミノ酸から
構成される、シグナルペプチドに固有の導入配列を使用
する場合、翻訳産物は実際目的とするタンパク質てなく
、「導入Ｊ配列のアミノ末端を有するタンパク實誘導体
である。このようなアミノ末端の変化は時には無害であ
るが、所望のタンパク質の特性に応しては、不活性な構
造遺伝子産物を導く場合かある。

本明細書に記載している本発明方法は、ヒトインターロ
イキン−２のアミノ末端導入配列を有さプに発現される
構造遺伝子産物を導くものである。

この本発明の方法は、導入配列によって創製され得る折
り畳みのひずみを排除するものである。また、本発明方
法は、この配列を除去するためのさらなる化学的加工を
必要としないものでもある。

適切な折り畳みに関するあり得る効果は、昆虫毒素タン
パク質に関しては特に重要である。ＡａＩＴタンパク質
は、４つのジスルフィド架橋を含有している。これらの
ジスルフィド結合の適切な形成は、このタンパク質の機
能にとって重要である［ツロ、キン（Ｚｌｏｔｋｉｎ、
　Ｅ、　）のＩｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１
３、２１９−２３６（１９８３）］。分泌タンパク質に
関連した真核生物のシグナル配列発現系の重要性は、Ｅ
、ｃｏｌｉ（大腸菌）において機能性昆虫毒素タンパク
質を産生じようとする試みか失敗していることから、証
明される。昆虫毒素タンパク質は分泌タンパク質であり
、従って翻訳と同時に小胞体（ＥＲ）の内腔に通常放出
される。昆虫毒素タンパク質の適切な折り畳みを確実に
し、機能性を保持させるためには必須である、ＥＲへの
同時翻訳的放出には電気的、親水性および／または構造
的な影響が存在することは明らかである。本発明は、機
能的遺伝子産物かその構造遺伝子産物に固有のシグナル
ペプチドなしに適切に発現するのに必須である条件を保
持した組換えＤＮＡ系における、機能的分泌タンパク質
の生産方法を提供するものである。

上記議論したことから示されるように、ヒトインターロ
イキン−２シグナルペプチド配列を他の哺乳類分泌シグ
ナルペプチド配列と置き換えることによって、ＡａｌＴ
遺伝子産物は適切に三次構造か形成され、細胞外トラン
スローケーションされるはずである。このような種々の
シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ｖｏｎ　Ｈｅｉｊ
ｎｅＭＳＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３３．
１７−２１（１９８３）の「シグナル配列の開裂部位近
傍のアミノ酸のパターン」、およびその後の同著者、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４４
６８３−４６９０（１９８６）の「シグナル配列開裂部
位を予測するための新規な方法Ｊに例示されており、哺
乳類シグナルペプチド配列の機能的な類似性か証明され
ている。したがって、ＡａｌＴをコードしている配列は
、分ｉ・タンパク質由来の他のシグナルペプチドコード
化配列と機能的に連結することができるであろうし、こ
れにより、活性な分泌ＡａｌＴ昆虫毒素またはその誘導
体が得られるであろう。このような機能的な結合物の例
としては、ラットインスリン■シグナルペプチドをコー
ドしているＤＮＡ配列、またはラット成長ホルモンシグ
ナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列、またはヒト
成長ホルモンシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ
配列に、機能的に連結した、機能性昆虫毒素遺伝子をコ
ードしているＤＮＡ配列を挙げることかできよう。

分泌タンパク質の適切な細胞外トランスローケー／ヨン
は原理的にはシグナルペプチド配列によって指令を受け
ているが、そのタンパク質遺伝子産物の機能性は最終的
にはその一次アミノ酸配列に由来するものである。ある
種のアミノ酸残基は、α−ヘリックスおよびβ−ひた型
ノートなとの一次構造因子に特徴的なものである。同様
に、ある種のアミノ酸の物理的性質は、三次構造にも影
響を及はす。適切なタンパク質の三次構造の形成および
安定性は、以下の４つのタイプの相互作用に義的に由来
する （１）α−へワックスまたはβ−ひた型シートにおける
ようなペプチドグループ間の水素結合、（２）アミノ酸
側鎖間の水素結合、（３）非極性アミノ酸側鎖間の疎水
性相互作用、および（４）正および負に帯電した側鎖間
のイオン結合Ｆレーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、
　Ａ、　）のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２８．１４
２頁、ワース・パブリ／シング、ニューヨーク（１９７
５）］。しかし、１つ以上のアミノ酸が、上記の要因に
関して類似した物理的性質を有し得る。したがって、類
似の物理的性質を有するアミノ酸残基（群）を、天然タ
ンパク質本来のアミノ酸と置き換えると、一般に、機能
的に一致したタンパク質か得られるであろう。酵素活性
部位に関連しているアミノ酸におけるように、タンパク
質機能にとって必須である特定のアミノ酸が存在してい
ることは事実であるが、−次配列の大部分は、機能性を
保持するためにアミノ酸特異的である必要はない。同様
に、１つまたはそれ以上のアミノ酸を削除または付加し
たとしても、機能性タンパク質を得ることかできる。

ＡａｌＴタンパク質は例外でない。ＡａｌＴタンパク質
の構造的に重要でない領域のアミノ酸を軽微に改変した
としても、昆虫毒素は同一でない場合かあるが、機能的
に類似したものか得られるはすである。このようなＡａ
ｒＴ誘導体は、本発明の発現系によって同様に生産する
ことかできよう。

このような機能性誘導体の生産は本発明によって証明さ
れている。本発明によって発現される正確ｔアミノ酸配
列を天然のＡａｌＴタンパク質と比較することで、本発
明で発現されるタンパク質はカルホキン末端でイソロイ
ノン残基か欠如していることか判明している。しかし、
このＡａｒＴ誘導体は天然のＡａｌＴ毒素の機能性か保
持されている。

哺乳類タンパク質の翻訳後修飾は、おそらくは特定のプ
ロテアーゼの存在性故に、哺乳類セルライン間で異なっ
ている。ラマハドラン（Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎ、　Ｔ
、　Ｖ、　）らのＧｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、
　８５−９３頁、　Ｍｉ　１ｌｅｒ、　Ｊ、　、　Ｃａ
１ｏｓ、　Ｍ、編、コールド・スプリング・バーバー、
　（１９８７）、　［プロティン加工したタンパク質の
翻訳後修飾における宿主特異的変異」。

多くの哺乳類タンパク質が、機能性のために必須である
と考えられるグリコンル化なとを介して甚大な翻訳後修
飾を受けているが、ＡａｌＴタンパク質はただ１回の躬
訳後修飾プロセノ／ング工程、すなわちプレタンパク質
形態からのシグナルペプチドの開裂を受けるのみである
。既述したように、哺乳類シグナルペプチドのシグナル
配列は、特に重要な開裂ゾーンのコンホーメーションに
ついては、その全体の構造および機能は、はとんど普遍
的である［ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、Ｇ、前掲］。さらに
、個々の生物の種々の分泌タンパク質におけるシグナル
配列の開裂部位には、特定のホモロシー（相同性）は存
在しない。シグナルペプチドかプレタンパク質から開裂
するという機能は普遍的機能と言える程のものであり、
宿主特異的でないことは、明らかである。上記のような
事情から、シグナル配列をプレーＡａＩＴから適切に開
裂させることは、殆との哺乳類セルラインにおいて実施
可能である。

種々のセルラインにおいて、非天然の分泌タンパク質の
／グナル配列が適切に開裂されることか証明されている
。たとえば、タナキチ（Ｔａｎａｑｕｃｈｉ。

Ｔ）らは、サル細胞培養物中におけるヒトインターロイ
キン−２からシグナルペプチドを適切に開裂したことを
報告している［Ｎａｔｕｒｅ、　３０４．３０５−３１
０（１９８３）１゜したかって、ＡａｒＴのプレタンパ
ク質体は、ＨｅＬａＸＡｖｌ　２．３Ｔ３、ＢＨＫおよ
び２９３なとの他の汎用される哺乳類セルラインにおい
て齢訳後に適切に修飾されるものである。

へオーストラリスのサソリの粗製の毒液は、Ａａｌ　Ｔ
に加えてさらに、３つのマウス毒素（ＡａＭＴ）を含有
している。これらの１っであるＡａＭＴｌとＡａＩＴは
４つのジスルフィド架橋のうち３つか同一の局在を有し
ている［ツロワキン（Ｚｌｏｔｋｉｎ、Ｅ、）のＩｎ５
ｅｃｔ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３，２１９−２３６（１
９８３）コ。　ＡａＩＴ分子における４番目のジスルフ
ィド架橋の局在か異なっていることは、ＡａｒＴの神経
毒の選択性にとって重要であり得ることか提示された［
前掲″′、。したかって、ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換３Ｔ
３細胞（ＤＣ−１）によって産生されるＡａＩＴが昆虫
に対して選択的に毒性を示し、哺乳類に対しては無害で
あることが証明されたことは、重要なことである。

ｐＭＳＶ−ＩＴ−３Ｔ３細胞およびｐＭＳＶ形質転換３
Ｔ３（ＤＢ−１）対照細胞の両者由来の培養液の最高濃
度（３００Ｘ）を使用し、マウスにおいて毒性試験を行
った。３００　Ｘ　ｐＭＳ　Ｖ４　Ｔ−３Ｔ３（ＤＣ−
１）ａ縮物におけるＡａｒＴの量を測定すると、約１５
μｇ　／ｍ（ｌてあった。各グループ当たり３匹のＩＣ
Ｒ［カールス・リバー・ラボラトリーズ　Ｉ　ｎｃ、　
ＭＡ　０１８８７．ウィリントン、バラードバル・スト
リート２５１番］の雌性マウスにそれぞれ濃縮物約０５
蛙を静脈内投与した。この試験動物に投与したＡａｌＴ
’誘導体の量は、約０．３−０゜４μｇ／ｇ体重である
と評価された。精製されたサソリのマウス毒素は入手で
きなかったので、Ａ。

オーストラリスの粗製の毒液の市販された調製物［シグ
マ、　Ｍｏ　６３１７ｇ、Ｓｔ、ロイス、Ｐ、０．ホッ
クス１４５０８］をポジティブな対照として使用した。

粗製の毒液１５−２０ｇを各マウスに投与した。この投
与量は、文献に記載された２　Ｘ　Ｌ　Ｄ　ｓｏとたい
たい同してあった［ツロソキンらのＢｉｏｃｈｉｍｉｅ
　５３．１０７３−１０７８（１９７１）］。死亡率お
よび毒性症状（たとえば、機能低下、嗜眠、昏睡、後脚
麻痺、振せん、下痢、およびその池の徴候）を、投与口
には１時間毎に、そして２週の間は毎日観察した。得ら
れた結果を以下の第２表に示す。観察期間の最後ては、
３００ｘｐＭＳＶ−Ｉ　Ｔ−３Ｔ３（ＤＣ−１＞濃縮物
またはｐＭＳＶ−３Ｔ３（ＤＢ−２）ａ縮物のいｆれか
を注射したマウスは健康のままであり、毒性の症状は何
等示さなかった。サソリ毒液を投与した動物は一般に、
注射後数時間で死亡した。本試験では、平行実験するた
めの、精製されたマウス毒素を入手できなかったが、ツ
ロノキンらにより報告された結果（前掲）に基づいてお
おざっばな比較を行った。彼らは、サソリＡ、オースト
ラリスの精製マウス毒素（Ａ　ａＭ　Ｔ　＋、ＡａＭＴ
ｔおよびＡａＭＴ３）のしＤ５ｏはマウス１四角たり０
．１８μｇから０４５μｇの範囲にあることを教示して
いる。ｐＭＳＶ−Ｉ　Ｔ（ＤＣ−１）細胞から産生され
るＡａｌＴかマウスに対して毒性であるとすれば、本発
明者らの試験において投与した投与量（マウス１四角た
り７−８μｇ）は、致死的でないにしても毒性の臨床症
状を招来するはすである。しかし、２週間の観察期間で
のマウスの両グループでは、毒性症状は回答観察されな
かった。したがって、ｐＭＳＶ−Ｉ　Ｔ−３Ｔ３（ＤＣ
−１）細胞で合成されたＡａｌＴは、この毒素の上記２
つの重要な活性に関して天然のＡａｌ　Ｔと類似した挙
動を示した、と結論される。

第２表 （ａ度３００Ｘ） （Ｂ）ＤＢ−２培養培地　　０／３　　　０／３（ン農
度３００　×） （Ｃ）粗製の毒液６ゝ　　　　３／３　　　３／３ａ）
　　ｌ化合物当たり３匹のＩＣＲ雌性マウスｂ）グルー
プ（Ａ）および（Ｂ）については２週間、グループ（Ｃ
）については１日観察した。

ｃ）　〜０．３−０．４μｓ／ｇ体重で使用してＡａＩ
Ｔを評価した。

ｄ）シグマから入手した。〜ｌμｇ／ｇ体重を投与量と
して使用した。

以下に実施例を記載して本発明をさらに詳細に説明する
。以下の実施例に記載した、試薬または装置の供給元は
単に便宜的なものであるので、それらは本発明を限定す
るものでなく、また実施例のあらゆる点においても本発
明を限定するものでない。以下には、本発明を構成する
実際の操作法と共に、本発明の説明を適宜記載している
。

実施例１ プラスミドｐＫＣ２８３の単離 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　　Ｂ　Ｅ　１２０１
　／ｐＫ　Ｃ２８３の凍結乾燥品は、受託番号ＮＲＲＬ
　　Ｂ−１５８３０のもと、／−サン・リーショナル・
リサーチ嗜ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　Ｐｅｏｒｉａ、　１ｌｌｉｎｏｉｓ　６１６０４）か
ら入手される。この凍結乾燥品をＬＢ培地［ＩＱ中にバ
クトートリブトン１０ｇ１バクトー酵母エキス５ｇおよ
びＮａＣ（］Ｏｇを含有、ｐＩ（を７．５に調節］１０
ｚ＋２の入った試験管内にデカンテーンヨンし、３２°
Ｃで２時間インキュベートする。この時点で培養物を５
０μｇ／ｍＱアンピシリンに調節し、次いで３２°Ｃて
一晩インキユベートする。Ｅｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　Ｂ
Ｅ　ｌ　２０１／ｐＫＣ２８３細胞は細胞性ＤＮＡに組
込まれている温度感受性のｃｌリプレッサー遺伝子を含
有しているので、３２°Ｃて培養した。本明細書中、以
後の実施例に記載しているように、このプラスミドの単
離操作に野生型のラムグｐＬリプレッサー遺伝子を含む
細胞、またはラムタｐＬプロモーターを含まない細胞を
用いる場合には、インキュヘーンヨン温度は３７°Ｃと
する。

一晩培養物の少量をとり、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　
ＢＥ　１２ＯＬ／ｐＫＣ２８３の単一のコロニー単離体
か得られるような方法で、それを５０μｇ／ｍＱアンピ
シリンを含むＬＢ−寒天（１５ｇ／Ｃバクト寒天を含む
ＬＢ培地）平板上にプレートした。

得られた単一のコロニーを５０μｇ／ｍ（！アンピンリ
ンを含むＬＢ培地１０ｍ（ｌに接種し、激しく振盪しな
から３２°Ｃで一晩インキユベートした。この−夜培養
物１０ｍ（７を５０ｇｇ／ｚＣアンピシリン含有のＬＢ
培地５００ｚＣに接種し、激しく振盪しなから培養物か
定常相に達するまて３２°Ｃにおいてインキュベートし
た。

以下の操作は、マニアティスら［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔａｌ　　モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］の方法を脚
色したものである。

４°Ｃ，４０００ｇで１０分間遠心することによって細
胞を集め、その上清を捨てた。得られた細胞ペレットを
水冷したＳＴＥ緩衝液［０，１Ｍ　ＮａＣ（！：１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，８）　；および１ｍＭＥＤ
ＴＡコ１０Ｍで洗浄した。洗浄後、得られた細胞ペレッ
トを５　ｚ　ｇ　／ｍＱ　リソチームを含有する溶を夜
１［５０ｍＭ　グルコース：２５ｍＭ）Ｊス−ＨＣ（！
（ｐＨ８，０）；および１０ｍＭＥＤＴＡｌｌＯｍ（ｌ
に再懸濁し、室温で１０分間放置した。

次いで、このリソチーム処理した細胞に溶液２［０２Ｎ
ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ］２０ｆｆＲを加え、得られ
た溶液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を氷
上で１０分間インキュベートした。

この溶菌細胞混合物に水冷した５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４，８）　１５ｉ（を加え、溶液を反転混合した。この
溶液を水上で１０分間インキュベートした。水２８．５
ｉｆ２および５Ｍ酢酸カリウム６０ｍＱに氷酢酸１１５
村を加えることによって５Ｍ酢酸カリウム溶液を調製し
た；得られた溶液はカリウムについては３Ｍ、そしてア
セテートについては５Ｍである。

この溶菌細胞混合物を、ヘックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）
ＳＷ２７（またはその同等の機器）中、４°Ｃ，２００
０Ｏｒｐｍで２０分間遠心した。細胞ＤＮＡとその残骸
は管の底にペレットを形成した。上清約３６Ｒ（を回収
し、０．６容量のインプロパツールを加えて混合し、得
られた溶液を室温で１５分間放置した。室温において１
２．０００９で３０分間遠心することによってプラスミ
ドＤＮＡを採取した。

上清を捨て、ＤＮＡペレットを７０％エタノールによっ
て室温で洗浄した。このエタノール洗液をテカントし、
得られたペレットを真空テンケータ−中で乾燥した。次
いで、このペレットをＴＥ緩衝液Ｅ］　ＯｍＭ）リス−
Ｈ（Ｊ！（ｐＨ８，０）およびＩｎＭ　ＥＤＴＡ］８ｍ
（ｌ中に再懸濁した。

このＤＮＡ溶液にＣｓＣｆ２８ｇを加えた。各１０．１
のＣ５（Ｊ！−ＤＮＡ溶液に１０ｙｔｔｇ／ＩＱ臭化エ
チンウム水溶液約０．８ｍρを加えた。最終の溶液密度
は約１　５５ｇ／ｚ（！てあり、臭化エチジウム濃度は
約６００ｕｇ／ｒｔｔｆｆてあった。この溶液をヘノラ
マン５０型遠心管に移し、パラフィンオイルで上端まで
満たし、封をし、そして２００Ｃにおいて４５．０００
ｒｐｍて２４時間遠心した。遠心後、普通光のもとて２
つのＤＮＡバンドか観察された。

管からキャップを取った後、＃２１皮下注射針の注射器
で遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮＡハントを採取
した。

水胞モ０の１−ブタノールて数回抽出して臭化エチジウ
ムを除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析することによっ
てＣ５ＣＱを除去した。緩衝化フェノール、次いでクロ
ロホルムで抽出した後、ＤＮＡを７０％エタ／−ルで沈
澱させ、洗浄し、そして乾燥した。約１ｚｇのプラスミ
ドｐＫＣ２８３か得られ、これをＴＥ緩衝液中、約１μ
ｇ／μｅの濃度て、４°Ｃにおいて保存した。プラスミ
ドｐＫＣ２８３の制限部位および機能地図を添付の第１
図に示す。

実施例２ プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの構築 実施例１で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ約１
０μＣを、１０×中−塩制限緩衝液［５００ｍＭ　Ｎａ
Ｃｆｆ；　１００ｍＭ　　トリス−ＨＣρ（ｐＨ７５）
　；　１００　ｍＭ　ＭｇＣＱ２；および１０　ｍＭ　
Ｄ　Ｔ　Ｔ　］２０ｕ（１、ｆｍｇ／ｍｃ　Ｂ　Ｓ　Ａ
　２０　μ（１、制限酵素ＰｖｕＩＩ５μａ「〜５０単
位（ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　；ＢＲＬ）の定義）；本明細書中て用いる制限酵素の
すへてはここから入手した］、および水１４５μｅと混
合し、得られた反応液を３７°Ｃて２時間インキユヘー
トした。本明細書中に記載の制限酵素反応は、フェノー
ル、次いでクロロホルムで抽出することによって常法通
り停止させ、続いてＤＮＡを沈澱させ、エタノール洗浄
し、そしてＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁させた。このよ
うにしてＰｖｕ［消化を停止させた後、ＰｖｕＩｌ消化
プラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、次いでＴＥ
緩衝液５μＱに再懸濁した。

Ｘｈｏｌリンカ−（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３す〔約
６００ピコモルＪを、５×キナーセ緩衝液［３００ｍＭ
）リス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，８）；　５０ｍＭ　ＭｇＣ
ｆｆ−；および２５ｍＭ　ＤＴＴ］１０１１Ｑ、５ｍＭ
　ＡＴ　Ｐ　５１１（１゜水２４μ＆、Ｔ４ポリヌクレ
オチトキナーセ［ＰＬ　ハイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の定義で約２５単位］０．５
　ｕＱ、　　１　ｍｇ／ｙ、Ｑ　Ｂ　Ｓ　Ａ　５　μ（
１゜および１０ｍＭスペルミジン５μＱを含む混合物中
、該混合物を３７°Ｃて３０分間インキュベートするこ
とによりキナーゼ処理した。

このキナーゼ処理したＸｈｏｌリンカ−約１２５ａ（ｌ
　をＰ　ｖｕ　ｌｌ−１肖化プラスミドｐＫＣ２８３Ｄ
ＮＡ５μＱに加え、次いでこのＤＮＡに、ＩＯＸリガー
ゼ緩衝液［３００ｍＭトリス−ＨＣρ（ｐＨ７６）；　
１００ｍＭ　ＭｇＣＱ２：および５０ｍＭＤＴＴ１２．
５μｆ２．ｆｍｇ／ｕＱ、Ｂ５Ａ２．５μｆ２，５ｍＭ
　ＡＴＰ７μｍ２．Ｔ４ＤＮＡリカーセ［約２，５単位
（ＰＬハイオケミカルズの定Ｕ］２．５μａ、ＩｏｎＭ
スペルミジン２．５μρ、および水３μａを加えた。得
られたライゲーション（連結）反応液を４°Ｃて一晩イ
ンキユヘートした。連結反応の後、反応混合物の組成を
高−塩緩衝液［０，ＬＭ　ＮａＣ（！・００５Ｍトリス
−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）；　ｌ　Ｏ，ＯｍＭ　ＭｇＣ
（ｂ：および１ｍＭＤＴＴ］の組成に調節した。

この混合物に制限酵素ＸｈｏＩ（約１０μｆ２．１００
単位）を加え、得られた反応物を３７°Ｃて２時間イン
キュベートした。

連結混合物にＸ、ｈｏＩリンカ−を加えないということ
以外は上記と同様にして反応を停止させ、Ｘｈｏｌ消化
ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁し、そして連結させた。得ら
れた連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを
構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位
および機能地図を添付の第２図に示す。

実施例３ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３
ＰＸの構築 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ°）は、／−サンー
リーショナル・リサーチ・ラホラトリーズから、受託番
号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９９３のもと、凍結乾燥品の形て
入手することかてきる。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（
λ゛）は野生型のラムダｐＬｃｌリフツノサー遺伝子を
含有しているので、本発明のハイブリットｐＬ−１ｐＨ
＋プロモーターからの転写は、このＥ、ｃ。

１ｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛）細胞内では起こらない。

この凍結乾燥品を復元し、ＭＯ（λ゛）の単一コロニー
を単離し、そしてインキュベーション温度が３７°Ｃで
あることと増殖培地にアンピシリンを用いないこと以外
は、実質的に実施例１の方法にしたがってＭＯ（λ゛）
細胞の一夜培養物（１０ｍのを調製した。

一晩培養物５０μｇを１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ、および
１０ｍＭ　ＭｇＣＱ２含有のＬＢ培地５ＲＱに接種した
。

この培養物を、激しく振盪しなから３７℃で一晩インキ
ユヘートした。翌朝、得られた培養物を１０　ｍＭ　Ｍ
ｇ　Ｓ　Ｏ＜および１０　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ！２含有のＬ
Ｂ培地で２００ｍ（に希釈した。この希釈培養物を激し
い振盪下において、５５０ｎｍでの吸光度（Ａ５５ｏ）
か約０．５（これは約Ｉ×１０８細胞／ｆｆｃの細胞密
度に相当する）に達するまて、３７°Ｃてインキュベー
トした。氷−水浴中で１０分間、培養物を冷却し、次に
４°Ｃにおいて、４０００９で１０分間遠心して細胞を
採取した。得られた細胞ペレットを冷１０ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４１００ｍ０．に再懸濁し、その直後に遠心して再度
ペレット化した。この細胞ペレットを３０ｍＭ　ＣａＣ
（！２１００ｍ（ｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキ
ュベートした。

遠心して細胞を再ひ集め、３０ｍＭ　ＣａＣＱｘ　ｌＯ
ｍＱ中に再懸濁した。細胞０．５ｍρつつを実施例２て
調製した連結ＤＮＡに加えた（このＤＮＡはＣａＣ（１
２中、３０ｍＭに調節しておいた）。この細胞−ＤＮＡ
混合物を水上で１時間インキュベートし、４２℃で９０
秒間熱ンヨ、りを与えた後、水上で約２分間冷凍した。

この細胞−ＤＮＡ混合物を１２５１容量のフラスコ中、
ＬＢｔａ地１０ｖａに希釈し、３７°Ｃて１時間インキ
ュベートした。

この１００μＱ部分量つつをアンピシリン含有のＬＢ−
寒天平板上にプレートし、コロニーが現われるまて３７
°Ｃてインキュベートした。

コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドＤ　
Ｎ　Ａを制限酵素分析およびケル電気泳動によって調べ
た。プラスミドＤＮＡの単離を、実施例１の方法にした
がってより小さなスケールで行ったが、所望のＥ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λａ／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転
換体が同定されるまて、Ｃ５ＣＱ勾配の工程を削除した
。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地
図を添付の第２図に示す。

実施例４ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（λ”）／ｐＫ　Ｃ２８３
−Ｌの実施例１の方法にしたがって調製したプラスミド
ｐＫｃ２８３ＰＸ　　ＤＮＡリンカｇを、１０×高塩緩
衝Ｗｉ２０ｕ（１、ｆｍｇ／ｚｃ　Ｂ　Ｓ　Ａ　２０１
ｔ（１，制限酵素ＢｇｌｌＩ（５μに〜５０単位）、制
限酵素ｘｈｏｒ（５μａ：〜５０単位）、および水１５
０μｇに溶解し、得られた反応液を３７°Ｃて２時間イ
ンキュベートした。反応を止め、８μ劃−Ｘｈｏｒ消化
ＤＮＡを沈澱させた後、このＤＮＡをＴＥｌ衝１５μｇ
に再懸濁した。

ＢｇｌｌＩおよびＸｈｏｌ制限酵素切断の特徴を有する
１本鎖ＤＮＡ末端のＤＮＡリンカ−を合成し、キナーゼ
処理した。このリンカ−のキナーゼ処理は実質的に実施
例２の方法にしたがって行った。

このＤＮＡリンカ−は次の構造を有しているこのリンカ
−は、当業界でよく知られている方法により、１本鎖の
デオキシオリゴヌクレオチドから合成した。その１本鎖
のデオキシオリゴヌクレオチドは、市販の装置、例えば
アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　８５０　ＬｉｎｃｏｌｎＣｅｎｔ
ｒｅ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ
　９４４０４）から市販されている３８０Ａ　ＤＮＡ合
成機によって合成することかできる（この装置はホスホ
ルアミタイトの化学を利用するものである）。ＤＮＡを
合成するための他の方法も当業界で知られている。

１本鎖ＤＮＡ合成のための通常の改良ホスホ）　ＩＪエ
ステル法は、イタクラら［Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ
、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６．１９７７］
、およびフレアら［Ｃｒｅａ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：５７６
５，１９７ｇ］に開示されている。さらに、ＤＮＡ合成
に特に好ましい方法は、ノングら［Ｈｓｉｕｎｇ　ｅｔ
　ａｔ、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　１１：３２２７．１９８３］、およびナラシら［Ｎ
ａｒａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８：９０．１９８０］に開示
されている。

このリンカ−とＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ消化プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＸとを実質的に実施例２の方法にしたがっ
て連結させた。連結したＤＮＡは所望のプラスミドｐＫ
Ｃ２８３−Ｌを構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３
−Ｌの制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。

実質的にしっしれい３の方法にしたがって、プラスミド
ｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡを用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ
　１２　ＭＯ（λ°）を形質転換し、得られたＥ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３−Ｌ形質
転換体を同定した。

実施例５ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８
３−Ｌ　Ｂの構築 実質的に実施例１の方法にしたがってＭｌしたプラスミ
ドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡ約１０μｇを、１０Ｘ高
−塩緩衝液２０μ（１，１μｇ／ｙＱ　Ｂ５Ａ２０ｕＱ
、制限酵素Ｘｈｏｌ（５μ！２；　〜５０単位）、およ
び水１５５μＱに溶解し、得られた反応物を３７℃で２
時間インキュベートした。次いで、３容量の９５％エタ
／−ルと１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムとを加え、
トライアイス−エタノール浴中て５分間インキュベート
することにより、反応混合物からＸｈｏｌ−消化プラス
ミドｐＫＣ２８３Ｌ　　ＤＮＡを沈澱させ、そして遠心
した。得られたＤＮＡＮレベレを７０％エタノールで洗
浄して乾燥し、１０×ニック−トランスレーション緩衝
液［０，５Ｍ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，２）；　Ｏ，Ｉ
Ｍ　Ｍｇｓｏ４．および１ｍＭ　ＤＴＴ］２μｆｆ、デ
ｔキン５Ｚクレオチド三リン酸各２ｍＭつつを含む溶液
１μＱ、水１５μＱ１クレ／−（大腸１ｌＤＮＡボリメ
ラーセＩの大きいフラグメント）（１μＱ、〜６単位（
ＰＬハイオケミカルズの定義））、およびｌｕｇ／ｍＱ
ＢＳＡ　１μρ中に再懸濁した。得られた反応液を２５
°Ｃで３００分間インキュベート、このｌ１ｆｆｌを７
０°Ｃて５分間インキュベートすることにより反応を止
めた。

ＢａｍＨＩリンカ−（５’　−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−
３’　）をキナーゼ処理し、Ｘｈｏｌ−消化してクレノ
ー処理したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡに、
実質的に実施例２の方法にしたかって連結させた。この
連結反応の後、高−塩緩衝液中、３７°Ｃで約２時間、
このＤＮＡをＢａｍＨＩ（約１００単位）で消化した。

このＢａｍＨ１消化の後、実質的に実施例２の方法にし
たがってＤＮＡを連結用に調製した。

実質的に実施例２および３の方法にしたかい、得られた
〜５．９ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを連結反応
によって環化し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ°
）に導入した。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）
／ｐＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体を同定した後、実質的
に実施例１の方法に従ってプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ
Ｂ　　ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ
Ｂの制限部位および機能地図を添付の第４図に示す。

実施例６ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）／ｐＬ　３２の
構築使用する出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−
が異なる以外は、実質的に実施例５の方法にしたかい、
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ約１０μｇを高−塩緩衝液
中て制限酵素５ａｉｉにより消化し、クレノー処理し、
ＥｃｏＲＩリンカ−（５°−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ
−３りに連結させた。制限酵素ＥｃｏＲｒで消化して〜
２．ｌｋｂのＤＮＡを除去し、次いで連結により〜４．
Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを環化し、プラス
ミＦｐＫＣ２８３ＰＲ３を得た。

この連結したＤ　Ｎ　Ａを使用し、実質的に実施例３の
方法にしたかってＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛
）を形質転換した。得られたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　
ＭＯ（λ”）／ｐＫＣ２８３ＰＲ３形質転換体を同定し
た後、実質的に実施例１の方法にしたかってプラスミド
ｐＫＣ２８３ＰＲ３ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫ
Ｃ２８３ＰＲ３の制限部位および機能地図を添付の第５
図に示す。

プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３約１０μｇを、高−塩緩
衝液２００μａ中、制限酵素ＰｓｌｌおよびＳ　ｐｈ　
Ｉ　（それぞれ約５０単位）で消化した。反応液を３７
°Ｃて約２時間インキユヘートした後、得られた反応混
合物を、トリス−アセテート緩衝液中、０６％低−ケル
化温度アカロース［ＦＭＣコーポレインヨン（ＦＭＣＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉ
ｄｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉ
ｎｅ　０４８４１）］ケルにより、〜１３０Ｖ、〜７５
ｍＡにおいて２〜３時間電気泳動した。

そのケルを臭化エチジウムの希薄溶液で染色し、〜０．
８５ｋｂ　Ｐｓｔｆ−３ｐｈ丁制限フラグメントを構成
するＤＮＡバンドを長波長のＵＶ光で視覚化し、これを
小さなセグメントとしてケルから切り取った。このセグ
メントの容積をセグメントの重量と密度とから計算し、
それと同量の１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ７，６）
をセグメントの入っている試験管に加えた。次いで、こ
のセグメントを７２°Ｃてインキュベートして溶融した
。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ　Ｐ
ｓｊＩ−ｓｐｈＩ制限フラグメント約１μｇを約１００
μＱ容量中に得た。同様にして、プラスミｌ”ｐＫＣ２
８３ＬＢを制限酵素Ｐｓｔｌおよび５ｐｈｌて消化し、
アカロースケル電気泳動によって〜３．Ｏｋｂ制限フラ
グメントを単離し、連結反応用に調製した。

実質的に実施例２の方法にしたかい、プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ　　Ｐｓｔｌ−３ｐｈＩ
制限フラグメントをプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの〜
３．Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ制限フラグメントと連
結した。得られた連結ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ３
２を構成していた。プラスミドｐＬ３２の制限部位およ
び機能地図を添付の第６図に示す。

実質的に実施例３の方法にしたがい、プラスミドｐＬ３
２をＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ゛）細胞に導入
した。実質的に実施例１の方法にしたかい、得られたＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）／ｐＬ　３２形質
転換体からプラスミドｐＬ３２　　ＤＮＡを調製した。

プラスミド’　ｐＬ３２　ＤＮＡの分析の結果、プラス
ミドｐＫＣ２８３ＰＸのクレノー処理した５ａｌＩ末端
には１つ以上のＥｃｏＲＩリンカ−が結合していること
か判明した。この１つ以上のＥｃｏＲＩリンカ−の存在
はプラスミドｐＬ３２またはプラスミドｐＬ３２誘導体
の有用性には何ら影響を及ぼさず、またそのことは、２
個のＥｃｏＲＩリンカ−か相互に連結した場合には必す
生成するＸｈｏｌ制限部位の存在によって検出すること
ができる。

別法として、ｐＬ３２プラスミドは、プラスミドｐＫＣ
２８３〜ＬＢに対して、本実施例の第１パラグラフに記
載しているＳａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ切除および連結反
応を行うことによっても構築することができる。

実施例７ Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＭＯ（λ”）／ｐＬ　４７の
構築Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＲＶ３０８／ｐＮＭ７
８９は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラホラト
リーズから受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２１６のもと
、凍結乾燥品として人手することがてきる。ｐＮＭ７８
９の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。イ
ンキュベート温度を３７°Ｃとしたこと以外は実質的に
実施例１の教示にしたがって、その培養物からプラスミ
ドＤＮＡを抽出する。ｐＮＭ７８９（１０ｔｔｇ）をＰ
ｖｕ［Ｉ緩衝液［５０ｍＭ）リス〜ＨＣｆ２（ｐＨ７，
５）；　６０ｍＭ　ＮａＣＣ：および６ｍＭ　ＭｇＣｇ
、］２００μρ中に懸濁させる。１単位のＰｖｕｌＩを
加え、得られた反応混合物を３７℃で５分間インキュベ
ートする。６５°Ｃに１０分間加熱することによって、
その酵素を失活させる。次に、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液
［２００ｍｔＶｆトリスーＨＣｆｆ（ｐＨａ、　Ｏ）　
：　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ（；および７０ｍＭＭｇＣ（！２］
３０　ａ（１、水７０μｊ、およびＢａｍＨ１１０単位
を加え、この反応液を３７°Ｃで１時間インキュベート
する。これに続いて、アルカリホスファターゼ５単位を
加え、６５°Ｃで１時間インキュベートする。得られた
ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、
１カ所切断フラグメントのサイズのＤＮＡフラグメント
（第３図）を精製する。

平滑末端およびＢａｍＨＩ末端を有するＤＮＡＩ、１ン
カーを、実質的に実施例４の教示にしたかって合成する
。このリンカ−（第３図に示す）は次の構造を有してい
る 実質的に実施例２の教示にしたがって、このリンカ−を
キナーセ処理し、ＢａｍＨＴ　−ＰｖｕｌＩ消化したプ
ラスミドｐＮＭ７８９内に連結する。実質的に実施例３
の教示にしたかい、この連結混合物を使用してＥ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８細胞を形質転換し、得られた
形質転換体についてプラスミドの単離を行う。適切な大
きさのＰｖｕ（Ｉフラグメント（４９４ｂｐ）およびＸ
ｂａｒ−ＢａｍＨＩフラグメント（６２８ｂｐ）を含む
プラスミド数個を選択する。

これらの内の少なくとも２つの配列について、ＢａｍＨ
Ｉ部位から唯一のＳ　ｍａ　１部位に向かって配列決定
を行い、所望の配列を有する１つのクローンを選択する
。この中間体プラスミドをプラスミド１２０と命名する
。この方法の工程の模式図、ならびにプラスミド１２０
の制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。

ＥＫ−ＢＧＨ−コード化ＤＮＡを単離するため、プラス
ミド１２０（約１０μｇ）を、制限酵素ＸｂａＩおよび
ＢａｍＨｒをそれぞれ約５０単位含有する高−塩緩衝液
２００μｇ中で消化した。実質的に実施例６の方法にし
たかい、得られた消化産物をアガロースゲル電気泳動で
分離し、ＥＫ−ＢＧＨをコードしている〜０．６ｋｂ　
ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離して連結
反応に備えた。

プラスミドｐＬ３２も制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨ
Ｉて消化し、〜３．９ｋｂ制限フラグメントを単離し、
連結反応用に備えた。実質的に実施例２の方法にしたが
って、プラスミｌ”ｐＬ３２の〜３９ｋｂ　ＸｂａＩ　
−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをプラスミド１２０の〜
０．６ｋｂ　Ｘｂａｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントに
連結し、プラスミドｐＬ４７を得た。

プラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地図を添付の
第９図に示す。実質的に実施例３の方法と同様にしてプ
ラスミドｐＬ４７をＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（λ°
）に導入し、得られたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２Ｍ０（λ
°）／ｐＬ４７形質転換体を同定した。実質的に実施例
１と同様にして、この形質転換体からプラスミドｐＬ４
７　　ＤＮＡを調製した。

（以下余白） 実施例８ ｐＢＲ３２２−［Ｔの構築 当業界周知の方法によって、ＡａｌＴをコードしている
合成遺伝子をアンドロクトヌス・オーストラリスサソリ
［ツロノケンのＩｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３
、２１９−２３６（１９８３）］の殺虫性神経毒素のア
ミノ酸配列に基づいて作成した。このＤＮＡフラグメン
トは、＋１から＋６９までのＡａＩＴアミノ酸をコード
している物質を含有しており、そのポジティブ・ストラ
ンドは以下のようである。

この合成ＡａＩＴ遺伝子は、その５′および３の両末端
に、プラスミドｐＢＲ３２２に適切に挿入されるための
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列を含有し
ていた。プラスミドｐＢ　Ｒ３２２（二ニー・イングラ
ンド・バイオラプス、！ＩＩＡＯＩ９１５、ヘバリー２
トノツイー・ロード３２番、）をエンドヌクレアーゼＢ
ａｍＨＩで消化した。実施例３の教示に実質的にしたが
い、Ｔ４ボリヌクレオチトキナーセ（ファルマシアーＬ
　Ｋ　Ｂ　　ＮＪ　０８８５４　ビスカッタウェイ、セ
ンテンニアル・アベニューａｏｏｌ）でリン酸化した後
、得られた合成Ａａｌ　Ｔ遺伝子をＢａｍＨＩ〆肖化し
たプラスミドｐＢＲ３２２にクローンし、プラスミドｐ
ＢＲ３２２−ＩＴを作成した。

実施例９ プラスミドｐＲＢ−ＩＴの構築 ＡａｌＴ遺伝子と適切な解読フレームにあり、かつその
直ぐ上流のヒトインターロイキン−２の７グナルペブチ
トをコードしているＤＮＡ配列を付加するため、Ａａｌ
Ｔアミノ酸の＋８および＋９位に相当する位置にあるエ
ンドヌクレアーゼＨｉｎＦ　１開裂部位を使用し、合成
りＮＡセグメントＡを結合させた。ＤＮＡセグメントＡ
は、ヒトインターロイキン−２の−２０から一１位のア
ミノ酸残基、およびＡａｌＴの最初の８個のアミノ酸残
基をコードしている物質を含有しており、そのポジティ
ブ・ストランドの配列は、以下の通りである ＧＡＴ　ＣＴＡ　　ＴＡＡ　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　Ｔ
ＡＣＡＧＧ　　Ａ’Ｉ’Ｇ　　ＣＭ　　ＣＴＣＣＴＧ　
　ＴＣＴ　　ＴＧＣＡＴＴ　　ＧＣＡ　　ＣＴＡ　　Ａ
ＧＩ’　　ＣＴＴ　　ＧＣＡ　　ＣＴＴＧＴＣＡＣＡ　
　ＡＡＣＡＧＴ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＣＧＧＣ
ＴＡＣＧＣＴＴＴ　　Ｇ ＤＮＡセグメントＡは、その５゛末端および３′末端に
それぞれエンドヌクレアーゼＢｇｌｌｒおよびＨｉｎＦ
　１を認識する配列を含有しており、それは、ブラウン
（Ｂｒｏｗｎ、　Ｅ、　Ｌ、　）、ベラガｙ　’；　（
Ｂｅｌａｇａｊｅ、　Ｒ，）、リアン（Ｒｙａｎ、　Ｍ
、　Ｊ、　）およびコラン（Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｈ，Ｇ
、　）のＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　６８：１０９−１５１（ウー（Ｗｕ、　Ｒ。

ｍ））、アカデミツク・プレス、ニューヨークの教示に
したがった標準的な方法によって合成した。

上述のようにして調製したプラスミドｐＢＲ３２２−［
Ｔ約１０μＱをＩＯ×高塩制限緩衝液（実施例２）２０
　ｔｔ（ｌ、１　ｍｇ／ｚｃ　Ｂ　Ｓ　Ａ　２０　ｔｔ
（１，ＢａＩＩＩＨＩ　５ａＱ、　ＨｉｎＦ　１（５μ
の、水７５μ（と混合した。得られた反応物を３７°Ｃ
て２時間インキユヘートした。次いで、ＢａｍＨ［ｉ！
ｌ化したＤ　Ｎ　Ａをエタノールおよび３Ｍ酢酸ナトリ
ウムて沈殿させ、１％低溶融アガロースゲルの電気泳動
によって精製した。小さいほうのフラグメントをそのケ
ルから切除し、エリチップ−ｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ）
カラム法［７ユレイチヤー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）お
よびジュール（Ｓｃｈｕｅｌ　ｌ）、キーン、ニューヨ
ーク］によってＤＮＡを単離した。沈殿させ、遠心した
後、得られたＤＮＡペレットを１０ＸＨｉｎＦ１制限緩
衝液［ＩＭＮａＣＱ、６０ｍＭ　　トリス−ＨＣ（ｌ　
ｐＨ７，４，６０ｍＭ　ＭｇＣ（１２，６０ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、１＋ｇ／肩ＣＢ５Ａｌ０μＱ］１
０μρ中に再懸濁した。ＨｉｎＦｌからＢａｍＨＩの配
列（セグメントＢ）を１％低溶融アガロースゲルの電気
泳動によって分離した。セグメントＢに相当する大きい
ほうのフラグメントをＥｌｕｔｉｐ−ｄカラム法によっ
てゲルから切除した。沈殿させ、乾燥した後、得られた
ＤＮＡを１０ｍＭ　　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ８，０＜２
０ｕ１２）中で保存した。ＤＮＡセグメントＢは、Ａａ
ｌＴのアミノ酸の＋９から＋６９をコードしている物質
を含有しており、その配列のポジティブストラントは以
下の配列を有している。

ＡＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＣＣＧ　
ＧＡＡ　ＴＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＭＣＴＡＣＴ
ＧＣＭＣＭＣＣＡＧ　ＴにＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　
ＣＡＴ　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＧＣＴＡＣＴ
ＧＣＭ；ＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＧＣＴＡＣＴＧ
ＣＴｒＣＧＧＣＣＴＧ　　ＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡ　
　ＡＡＡ　　ＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣＴ
ＣＴ　ＧＡＣＡ（ｊ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　’Ｉ’ＣＴ　Ｔ
ＡＣＴＧＣＧＡＣＡＣＴＡＣＴ　ＡＴＣＭＣＴＡＡ　Ｔ
ＡＧ セグメントＡおよびセグメントＢがＨｉｎＦ１部位にお
ける結合を介して適切に結合した場合に、ヒトインター
ロイキン−２シグナルペプチドの−１から一２０位のア
ミノ酸、およびＡａｌＴの＋１から＋６９位のアミノ酸
をコードしているキメラ遺伝子であるＳ　Ｐ−Ｉ　Ｔで
あって、その５′末端にＢｇｌｌＩ部位を、およびその
３°末端にＢａｍＨＩ部位を有している遺伝子か生成さ
れた。このハイブリッドＳ　Ｐ−Ｉ　Ｔ遺伝子のポジテ
ィブ・ストランド配列は以下のようである。

実施例７において調製したプラスミドｐＬ４７（約１０
μのを、生塩制限緩衝液２０μｇ、ｌｚｇ／ｚ（Ｂ　Ｓ
　Ａ　２０　ｕ　Ｑ、制限酵素ＢｇｌＩ［およびＢａｍ
ＨＩそれぞれＩＯ単位、および水と混合し、最終容量２
００μＱとした。この混合物を３７°Ｃて２時間インキ
ュベートし、エタノールｌｚｊおよび３Ｍ酢酸ナトリウ
ム２０μＱを使用し、ＤＮＡを沈殿させた。得られたＤ
ＮＡを１％低低溶溶融アガロースケル電気泳動によって
精製した。大きいほうのフラグメントをそのケルから切
除し、エリチ。

ブーｄ操作法によってＤＮＡを回収した。沈殿させ、乾
燥した後、得られたＤＮＡペレットを１０ｘＣＩ　ＰＡ
緩衝液［５０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ２ｐ）１８　、０
　Ｓｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＩ２２．１　ｍＭ　Ｚ　ｎｃＬ
］　７０１１Ｑ１水８５μｅ１および子牛−腸アルカリ
ホスファターゼ［ベーリンガーーマンハイム番バイオケ
ミカルズ、　ＩＮ　４６２５０．インデイアナポリス、
ＰＯ，ボックス５０４１４］　５μＱに溶解した。得ら
れた反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートし、次い
でフェノール／りｏｏホルム（１：Ｌ　ｖ／ｖ）１００
μｊで抽出した。この反応混合物を０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウムに調節し、３容量のエタノールを加え、混合するこ
とによってＤＮＡを沈殿させ、−７０℃に冷凍し、遠心
した。得られたＤＮＡベレｙｈを１０ｍＭ　　）リス−
ＨＣＱ　ｐＨ８，０（２０ｕＱ）、１ｍＭＥＤＴＡに溶
解し、１％低溶融アガロースゲルの電気泳動によって精
製した。ＤＮＡバンドをそのゲルから切除し、エリチッ
プ−ｄ操作法によってＤＮＡを単離した。沈殿して乾燥
した後、得られたＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ！　
ｐＨ８，０（２０μＱ）中に保存した。このＤＮＡは、
プラスミトｐＬ４７のヘクタ一部分に相当する約３．９
ｋｂのＢ　ｇｌ　ＩＩ　−Ｂ　ａｍＨＩフラグメントで
ある。このベクターＤＮＡをＤＮＡセグメントＡおよび
Ｂと連結し、プラスミドｐＲＢ−ＩＴを作成した。実施
例３の教示にしたかって、このプラスミドのトランスフ
ユク／ヨン、増幅および単離を行った。プラスミドｐＲ
Ｂ−ＩＴの制限部位および機能地図を添付の第１Ｏ図に
示す。また、Ｓ　Ｐ−Ｉ　Ｔ遺伝子の配列を添付の第１
１図に示す。

実施例１０ ｐＭＳＶ−ＪＴプラスミドの構築 実施例１に概略示すように、塩化センラム−臭化エチジ
ウム密度勾配遠心法によってｐＲＢ−ＩＴプラスミドを
単離し、次いで実施例１ｏに記載のようにＢｇｉおよび
ＢａｍＨＩエンドヌクレアーセで消化した。Ｓ　Ｐ−Ｉ
　Ｔ遺伝子をコードしている２８５ｂｐフラグメントを
アガロースゲル電気泳動法によって単離し、得られたケ
ル物質から溶解した。実施例３に記載の操作法に実質的
にしたがって、ｐＭＳＶプラスミド（ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１５９２９）をＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＨＢ　Ｉ　Ｏ
１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５６２６）中で増幅させ、単離し
た。

ｐＭＳＶプラスミド約１０μａを、１０×中塩制限緩衝
液２０μρ、１ｔｔｔｇ／ｍＱ　Ｂ５Ａ２０ｔｔ０．８
ｇｌｎ制限エンドヌクレアーゼ５μＱ１および水１４５
μρと混合し、３７°Ｃで２時間インキュベートした。

フェノール／クロロホルム抽出によって、制限酵素反応
を停止させた。エタノールでＤＮＡを沈殿させた後、７
０％エタノール中で洗浄し、ＴＥ緩衝液５μσ中に再懸
濁した。

線状化した５ＰＩＴフラグメント（２８５ｂｐ）約１０
μｇをＢｇｌＩＩ消化ｐＭ消化９ラＳＶプラスミド。１
０×リガーゼ緩衝液約２，５μＱ、１１ｇ１ｉＣＢ５Ａ
２．５μ１２，５ｉｉＡＴＰ７．ｃｌＳＴ４ＤＮＡｌＳ
−ゼ２．５単位、１０Ｍｍスペルミジン２６５μＣ５お
よび水５μＱを加え、得られた反応物を４°Ｃで一晩イ
ンキユベートした。

５ＰｉＴ遺伝子をｐＭＳＶプラスミド内に融合すること
によって作成したｐＭＳＶ−ＩＴプラスミドを、実施例
３に記載の教示に実質的にしたかりて、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｋ　１２　ＨＢ　１０１（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２６
）に直接導入し、そのプラスミドを増幅させ、単離した
。プラスミドｐＭＳＶ−ＪＴの制限部位および機能地図
を添付の第１２図に示す。

実施例１１ １０％ウシ胎子血清（ＥＦＩＯ）を含有するＤＭＥ　Ｍ
　３　ｍ（ｌ中に懸濁した約０．５ＸＩＯ６個のＮＴＨ
／３Ｔ３マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）を３
．５ｃＩＩ組織培養皿上にプレートした。培養物を湿潤
化ＣＯ２インキュヘーター内に３７°Ｃで一晩維持させ
た。塩化セシウム密度勾配精製したプラスミドｐＭＳＶ
およびｐＭＳＶ−ＩＴＩ○μＱをＨＢＳＩＩ２Ｏｎ＋Ｍ
　ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ　ＮａＣＱ、５ｍＭ　ＫＣＱ
、０．７ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ４，６ｍＭテキストロース
、最終ｐＨ７，０３４５０μσの分離管中に再懸濁した
。２ＭＣａＣρ２３０μＣを容管に加え、終濃度［Ｃａ
’ＣＬ］−１２５ｍＭとした。

次いで、得られた管を室温で２０−３０分間インキュベ
ートした。

ＤＮＡを沈殿させる間、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１００
単位／１ｙｔ（ｌへ＝シリンおよヒ１００１１’ｇ／Ｉ
ＩＱストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）で洗浄し、ＥＦ１ｏ培地［タルへ、７コ最小
培地＋１０％つ／胎仔血清１１ｍＲを再度加えた（ｒｅ
ｆｅｄ）。ＤＮＡ？ｊ：、殿物を細胞培養物に加えた。

得られた平板を穏やかに渦巻かせ、均一にＤＮＡを分配
させた。次いで、得られた細胞をＣＯ２−インキュベー
ター中、３７°Ｃて５時間インキュベートした。培地を
除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ中２５
％ＤＭＳ○で手短に（４５−６０秒）処置した。ＤＭＳ
Ｏショック処置の後、細胞をＰＢＳで１回穏やかに洗浄
し、ＥＦＩＯ（２ＩＲＱ）を再度加え、ＣＯ３−インキ
ュベーターに戻した。ｖ−ｍｏｓによって形質転換され
た細胞が出現したか否かを顕微鏡によって毎日チエツク
した。Ｖｍｏｓ形質転換細胞を含有するフォーカスが十
分樹立し、肉眼で観察できるようになったら、それを取
り上げ、９６−ウェルのマイクロタイターブレ−トに移
し、個々の形質転換クローンを樹立させた。そのクロー
ンか全面成長したなら、トリプ７ン処理し、大量培養へ
と規模を拡大した。ｐＭＳＶ−ＩＴおよび類似のプラス
ミドｐＭＳＶによって形質転換されたＮＩＨ／３Ｔ３細
胞から、幾つかのセルラインか樹立された。

ＲＮＡのノーザンプロット分析によって、ＡａＩＴを高
度に産生ずるセルラインを同定した。７５−８０％全面
成長した約５Ｘ１０６個の細胞を使用し、ＲＮＡを調製
した。シーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らによって開
発されたグアニジウム・イノンアネート操作法によって
、ＲＮＡ調製物をＮＴＨ／３Ｔ３、ＤＣ−１およびＤＢ
−２細胞から調製した。

各試料から得たＲＮＡ調製物ｇをグリオキサールと共に
熱処置し、１２５％ホルムアルデヒド／アガロースゲル
に適用した。電気泳動にかけた後、ＲＮＡをニトロセル
ロースペーパーに移し、プラスミドｐＲＢ−ＩＴから単
離した５Ｐ−ＩＴ配列を含有する３２Ｐ−標識化Ｂｇｌ
Ｉ［−ＢａｍＨＩフラグメントとハイブリクイズした。

このプローブはＢＲＬニック・トランスレーション・キ
ットを使用したニック・トランスレーションによって標
識した。

コタノク（Ｋｏｄａｋ）Ｘ　Ａ　Ｒ−５−フィルムおよ
びテユボン・クロ不ノクス補カスクリーン（Ｄｕｐｏｎ
ｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　５ｃｒ
ｅｅｎｓ）を使用し、オートラジオグラフィーを行った
。

これらのセルライン由来の細胞質ＲＮＡを予備ド、トー
ブロソトハイブリダイセーション分析することにより、
これらすへてのセルラインがｖ−ｍ。

Ｓ関連の転写物を含有し、他方、ｐＭＳＶ−ＩＴによっ
て形質転換されたセルラインのみがＡａＩＴ関連ＲＮＡ
転写物を発現したことか判明した。グアニジウム・イン
チオシアネート操作法によって調製したすべてのＲＮＡ
をホルムアルデヒド／アガロースゲルで分離し、ニトロ
セルロースペーパーに移し、キメラＳ　Ｐ−Ｉ　Ｔ遺伝
子を含有する３２Ｐ−標識化Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂ　ａｍ
ＨＩフラグメントとハイブリクイズした。ＬＴＲから誘
導され、ＬＴＲのＲ領域で開始する５Ｐ−ＩＴ配列の、
ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換細胞内における発現により、長
さ５５２８塩基であるゲノム長−転写物か得られるはず
である。予想されるように、ｐＭＳＶ−ｒＴによって形
質転換されたＤＣ−１およびＤＣ−ＩＡ細胞は、約５．
７キロベースの長さのＡａｒＴとハイブリダイスするＲ
ＮＡ転写物を合成した。これとは対照的に、同様のプラ
スミドｐＭＳＶによって形質転換されたＮＩＮ／３Ｔ３
細胞またはＤＢ−２はいずれも、５Ｐ−ＩＴプローブと
ハイブリクイズするＲ　Ｎ　Ａ転写物を何ら産生じなか
った。

ｐＭｓＶＩＴによって形質転換した細胞が、生物学的に
活性なｒＡａｌＴを培養培地中に分泌したか否かを試験
するため、ＡａｒＴ含有転写物を最も高いレヘルて合成
していると思われるＤＣ−１細胞、およびｐＭＳ〜ｒて
形質転換したＤＢ−２細胞をマス培養物（それぞれ〜４
−５Ｘ１０８細胞）中に拡大した。その培養物が７５−
８０％全面成長したなら、通常の血清を含有するＤＭＥ
を血清不含のＤＭＥと置き換えた。２４時間後、馴化培
地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａ）を採取し、
この工程を１回繰り返した。低速遠心し、次いでＹＭＩ
Ｏ膜フィルターを備えたアミコン濃縮機によって、まと
めた培養液から細胞残骸を除去した。培養液が約５倍、
２０倍、５０倍、１００倍、２００倍および３００倍に
濃縮されたなら、試料を採取した。得られた濃縮物は濃
縮工程の終了後直ちに、毒性試験に直接使用した。

実施例１２ 殺−蚊の幼虫スクリーニング検定 分泌昆虫毒素を含有する培養培地における蚊の幼虫の死
亡能によって、分泌昆虫毒素の効能を確認した。黄熱蚊
（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ）に血液ミールを与え、
次いでその卵を湿らせた紙タオル上に置いた。次いで、
その卵を、酵母少ｆｆ１（＜５ｍｇ）および微細プリナ
・ラホラトリー・チュー（Ｐｕｒｉｎａ　１ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　ｃｈｏｗ）を含有する滅菌蒸留水１リツトル
から調製した郷化水を含有する容器に移した。卵は迅速
に（１０−１５分）で郷化した。２白目に、幼虫に再び
微細プリナ・ラホラトリー・チュー５ｍｇを与えた。約
３日後、蚊は、試験に理想的である２回目の幼虫期に達
した。

１０−１５匹の幼虫、およびｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換３
Ｔ３（ＤＣ−１）細胞由来の組織培養濃縮物を含有する
卿化水５０μｇ（同量）を、９６ウエルのマイクロタイ
タープレート中に入れた。この操作を、実施例１１にお
いて調製した培養培地の各濃縮度毎に繰り返した。死亡
率は培養培地の暴露後２時間、４時間および２４時間目
に記録する。

第１表は、これらの検定操作の結果を示すものである。

ｐＭＳＶによって形質転換されたＮ　Ｉ　Ｎ／３Ｔ３細
胞を、ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換（ＤＢ−２）細胞につい
ての対照として使用した。

ｐＭＳＶ−ＩＴ形質転換細胞の培養培地が、対照試料中
では現れなかった昆虫毒素を含有していたことは、第１
表に示しているデータから明らかである。このデータは
さらに、昆虫毒素の効能か濃度−依存的であることを示
している。このデータは、５Ｐ−ＩＴ遺伝子を含有する
ｐＭＳＶ−ＩＴプラスミドによって形質転換されたＮＩ
Ｎ／３Ｔ３細胞が培養培地中に機能的な昆虫毒素タンパ
ク質を分泌したことを証明するものである。

実施例１３ マウスにおける毒性試験 適切な毒素遺伝子か単離されたこと、およびそれが哺乳
動物に対して毒性でないことを確認するタメ、ｐＭＳＶ
−ＩＴ形質転換３Ｔ３（ＤＣ−１）細胞、ｐＭＳＶ形質
転換３Ｔ３（ＤＢ−２）細胞の培養ブロスの濃縮物なら
ひに粗製のサソリ毒液（シグマ、ＭＯ６３１７ｇ、セン
ト・ルイス、　Ｐ、　０．ボックス１４５０ｇ）をマウ
スに注射した。培養ブロスは３００Ｘ濃縮物を使用し、
試験を行った。ｐＭＳ　Ｖ−Ｉ　Ｔ−３Ｔ３培養ブロス
の３００×濃縮物中のＡａｌＴは、１５μｇ　／ＭＱと
評価された。３匹のＩＣＲ雌性マウス（カールス・リバ
ー・ラボラトリーズ、　ＭＡ　０１８８７、ウィルミン
トン、バラートバル・ストリート２５１番）それぞれに
各濃縮物約０．５ｘＣを静脈内注射した。投与したＡａ
Ｉ　Ｔの量は、約０．３−０．４ｇ／ｇ体重であった。

３匹のマウスの３番目のグループには、１５μｇ　／ｍ
Ｑ粗製サソす毒液０．５ｍｇを注射した。１５μｇ　／
ｍ（ｌは、報告されているサソリ毒液のＬＤ、。の約２
倍である［ツロソキンらのＢｉｏｃｈｉｍｉｅ　５３．
１０７３−１０７８（１９７１）］。注射した日は１時
間毎に、その後は２週間毎日、マウスにおける機能低下
、嗜眠、昏睡、後脚麻痺、振せん、および下痢なとの毒
性の致死性徴候を観察した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機能
地図、第２図はプラスミドｐＫＣ２８３ｐｘの制限部位
および機能地図、第３図はプラスミド’ｐ　ＫＣ２８３
−Ｌの制限部位および機能地図、第４図はプラスミドｐ
ＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図、第５図は
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の制限部位および機能地
図、第６図はプラスミドｐＬ３２の制限部位および機能
地図、第７図はプラスミドｐＮＭ７８９の制限部位およ
び機能地図、第８図はプラスミドｐＮ　Ｍ　７８９およ
びＰｖｕＩＩ〜ＢａｍＨＩ合成フラグメントからのプラ
スミ）”ｐ１２０の作成を説明する模式図、第９図はプ
ラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地図、第１０図
はプラスミド’ｐＲＢ−ｒＴの制限部位および機能地図
、第１１図は５ＰｉＴハイブリツド遺伝子をコードして
いるＤＮＡ配列のポジティブ・ストランドのコード化配
列および対応するアミノ酸配列、ならびに第１２図はプ
ラスミドｐＭＳＶ−ＩＴの制限部位および機能地図、を
それぞれ示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、機能的な分泌昆虫毒素を、組換え真核生物宿主細胞
   内において産生させる方法であって、Ａ、ｉ）複製起点
   または組込み配列、 ｉｉ）該宿主細胞内で機能するプロモーターまたは翻訳
   活性化配列、 ｉｉｉ）哺乳動物シグナルペプチドをコードしているＤ
   ＮＡ配列、 ｉｖ）昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列、お
   よび ｖ）選択マーカー を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターによって
   真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし
   、次いで Ｂ、該機能的な昆虫毒素を発現し、分泌するのに適した
   条件下で該真核生物宿主細胞を培養することを特徴とす
   る方法。 ２、哺乳動物シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ
   配列が、ヒトインスリンシグナルペプチドをコードして
   いるＤＮＡ配列、ラットインスリン I シグナルペプチ
   ドをコードしているＤＮＡ配列、ラットインスリンIIシ
   グナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列、ラット成
   長ホルモンシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ配
   列、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドをコードしてい
   るＤＮＡ配列、およびヒトインターロイキン２シグナル
   ペプチドをコードしているＤＮＡ配列の中から選ばれた
   ものである請求項１に記載の方法。 ３、哺乳動物シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ
   配列がヒトインターロイキン２シグナルペプチドをコー
   ドしているＤＮＡ配列である請求項２に記載の方法。 ４、昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列が、Ａ
   ａＩＴ毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列、昆虫毒
   素遺伝子の機能的誘導体をコードしているＤＮＡ配列、
   および配列： 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列の中から選ばれる請求項１、請求項２また
   は請求項３のいずれかに記載の方法。 ５　昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列がＡａ
   ＩＴ昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列である
   請求項４に記載の方法。 ６、昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列がＡａ
   ＩＴ昆虫毒素遺伝子の機能的誘導体をコードしているＤ
   ＮＡ配列である請求項４に記載の方法。 ７、ＤＮＡ配列が 【遺伝子配列があります】 である請求項４に記載の方法。 ８、該真核生物宿主細胞が、ＡＶ１２細胞、ＨｅＬａ細
   胞、ＢＨＫ２１細胞、２９３細胞、および３Ｔ３細胞の
   中から選ばれる請求項１に記載の方法。 ９、該真核生物宿主細胞が３Ｔ３細胞である請求項８に
   記載の方法。 １０、該選択マーカーが、ｖ−ｍｏｓ遺伝子をコードし
   ているＤＮＡ配列、ネオマイシン耐性をコードしている
   ＤＮＡ配列、およびハイグロマイシン耐性をコードして
   いるＤＮＡ配列の中から選ばれる請求項９に記載の方法
   。 １１、該選択マーカーがｖ−ｍｏｓ遺伝子をコードして
   いるＤＮＡ配列である請求項１０に記載の方法。 １２、昆虫毒素遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配列が
   ＡａＩＴ昆虫毒素遺伝子をコードしているＤＮＡ配列で
   ある請求項３に記載の方法。 １３、昆虫毒素遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配列が
   ＡａＩＴ昆虫毒素遺伝子の機能的誘導体をコードしてい
   るＤＮＡ配列である請求項３に記載の方法。 １４、昆虫毒素遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配列が
   、配列： 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列である請求項３に記載の方法。 １５、該真核生物宿主細胞が３Ｔ３細胞である請求項１
   ２、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の方
   法。 １６、該選択マーカーがｖ−ｍｏｓである請求項１３、
   請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の方法。 １７、該組換えベクターがｐＭＳＶ−ＩＴである請求項
   １３、請求項１４、請求項１５または請求項１６のいず
   れかに記載の方法。 １８、請求項１から請求項１７のいずれかに記載の方法
   によって産生される昆虫毒素。 １９、ａ）組換えＤＮＡクローニングベクター、および ｂ）ＳＰ−ＩＴ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列 を含有する組換えＤＮＡ化合物。 ２０、ｃ）プロモーターまたは翻訳活性化配列をさらに
   含有する請求項１９に記載の組換えＤＮＡ化合物。 ２１、ｄ）選択マーカー をさらに含有する請求項２０に記載の組換えＤＮＡ化合
   物。 ２２、ＳＰ−ＩＴ遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配列
   が、ＡａＩＴ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列と機能
   的に連結している、ヒトインターロイキン２シグナルペ
   プチドをコードしているＤＮＡ配列である請求項２１に
   記載の化合物。 ２３、ＳＰ−ＩＴ遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配列
   が、ＡａＩＴ遺伝子の機能的誘導体に機能的に連結して
   いる、ヒトインターロイキン２シグナルペプチドをコー
   ドしているＤＮＡ配列である請求項２１に記載の化合物
   。 ２４、該ＳＰ−ＩＴ遺伝子をコードしている該ＤＮＡ配
   列が、ＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 と機能的に連結している、ヒトインターロイキン２シグ
   ナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列である請求項
   ２１に記載の化合物。 ２５、プラスミドｐＭＳＶ−ＩＴである請求項２４に記
   載の化合物。