JPS6192575A - ヘテロローガスタンパク質の分泌およびペリプラズムタンパク質の回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本出願は、タンパク質を細菌内で製造する方法に関する
。更に詳しくは、本発明は、形質転換された細菌のペリ
プラズムから、真核性タンパク質を、該タンパク質の分
解、並びに非ペリプラズム性タンパク質による汚染を最
少限に止めて単離する方法に関する。また、本出願は、
細菌宿主内で成熟真核性タンパク質を合成する方法にも
関する。

さらに、本出願は、宿主細胞内で高収率にハイブリッド
プレタンパク質を発現し、このプレタンパク質からシグ
ナル配列を切りとり、成熟真核性タンパク質を宿主細胞
のペリプラズム間隙に分泌せしめる様なベクターを提供
せんとするものである。

従来技術 本出願に関して参照すべき文献は以下の通りである二米
国特許第４，３７５，５１４号および第４，４１１．９
９４号；英国特許出願第２，０９１，２６８Ａ号（１９
８２年公開）；１．パルバ（Ｐａ１ｖａ　）ら、ジー７
　（Ｇｅｎｅ　）７又：　２２９−２３５　（１９８３
）　：Ｈ−イノウニら、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔ、）　１４８　（２）　：４３
４−４３９（１９８３）；に、夕／Ｌ／　？　７ジ（Ｔ
ａｌｍａｄｇｅ　）ら、プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ、Ｕ
ＳＡ　（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ）ヱヱ（７）：３９８
８−３９９２（１９８０）；　Ｋ、タルマッシら、Ｐ、
Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡヱヱ（６）：３３６９−３３７３
（１９８０）；欧州特許出願第１１４，６９５号；Ｒ。

ピッケン（Ｐｉｃｋｅｎ　）ら、インフエクション・ア
ント−イム＝　７−　イ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　）４２（１）：　２６９−２７５
（１９８３）；Ｔ、シルハビイ（Ｓ　ｉ　Ｉｈａｖγ）
ら、マイクロバイオロジカル・レビューズ（Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）　４７　（
３）：３１３−３４４（１９８３年９月）；Ｊ、カドナ
ガら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストシ
イ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）２５９（４）：２１４９
　２］５４　　（１９８４年２月）：国際ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ８４１０Ｏ７７４（１９８４年３月）；０．ゼメルー
ドレーセン（０゜Ｚｅｍｅｌ　−Ｄｒｅａｓｅｎ　）ら
、ジーン冬ヱ：３１５−３２２（１（１８４）：Ｓ、ミ
バエリス（Ｍｉ　ｃｌｌａｅ　ｌ　ｉ　ｓ　）ら、ジャ
ーナル・オブ・バタテリオロジイ　１５４　（１）：３
６６−３７４（１９８３年４月）；　ヨーロッパ特許出
願第１１４，５９５号（１９８４年８月１日公開）；お
よびＧ、グレイ（Ｇｒａｙ　）ら、バイオチクノロシイ
ＰＰ１６１−１６５（１９８４年２月）。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　）　　の如きダラム陰性菌の
ペリプラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させること
は当該技術分野における長年の目標であった。

ペリプラズムへの分泌は、生産物が培養細胞の内膜と外
層膜との間の間隙に区切られる（とじこめられる）こと
になり、細胞外媒質の厳しい条件にさらされることかな
いので、望ましい目標である。

これらの厳しい条件（例えば、希釈、好ましくない塩類
またはｐＨ１およびタンパク分解酵素類等にさらされる
こと）が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）または酵母
を用いる非ペリプラズム分泌系の商業化を困難にしてき
た。本発明の方法によるペリプラズム内へのとじこめに
よって、所望の成熟真核性タンパク質の精製が単純化さ
れることになる。

多くの天然に生成される分泌タンパク質または膜タンパ
ク質は、まず、形成途中のプレタンパク質、あるいは細
胞内プレタンパク質として合成される。これらは、分泌
されたとき、成熟タンパク質のアミノ末端となるアミノ
酸残基に“シグナル”ポリペプチドが結合した形のタン
パク質である。

このシグナルポリペプチドは、成熟タンパク質の細胞膜
通過を可能にするためのペプチド配列である。このシグ
ナルペプチドは、細胞膜を通過する際に、目下研究中の
践構により、切り離される、即ち６プロセツシング（ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　）”される。もしも、このプロセッシン
グが適正に行なわれたならば、得られた成熟タンパク質
はアミノ末端に余分なシグナルアミノ酸残基を有さず、
適切なアミノ末端アミノ酸を持つことになる。即ち、宿
主であるダラム陰性細菌細胞により、シグナル配列をコ
ードしているＤＮＡを含むヘテロローガス（異質）な遺
伝子が発現され、次いで、該宿主によってシグナルが適
切に切り離されたならば、付加的なメチオニン部分を含
まない成熟タンパク質か宿主のペリプラズム間隙（即ち
、宿主の内膜または細胞膜と外層膜との間の間隙）に分
泌されることになる。また、シグナルタンパク質と、通
常このシグナルに付随している成熟タンパク質の少くと
もアミノ末端部分が、ヘテロローガスなタンパク質と結
合したままで発現され、プロセッシングされることによ
り、融合タンパク質か分泌される宿主−ベクター系が知
られている。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）の如きダラム陰性菌のペリ
プラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させることは当
該技術分野における長年の目標であったっペリプラズム
分泌は、生産物が培養細胞の内牧吉外層膜との間の間隙
にとしこめられることになり、細胞外媒質の厳しい条件
にさらされることかないので、望ましい目標である。こ
れらの厳しい条件（例えば、希釈、好ましくない塩類ま
たはｐＨ１およびタンパク分解酵素類等にさらされるこ
と）かバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）または酵母を用
いる非ペリプラズム分泌系の商業化を困難にしてきた。

本発明の方法によるペリプラズム内へのとじこめによっ
て、所望の成熟真核性タンパク質の精製が単純化される
ことになる。

本出願人の知る限り、これまて、グラム陰性菌における
ペリプラズム分泌のために採用されたベクター組立て方
法は、すべて、真核性シグナルを完全な形で、あるいは
部分的なハイブリッドの形で用いることを要件としてい
た２個の代表的な部分ハイブリッドをコードしている組
立て物を以下に図式化して示す。図中、分泌時に通常起
こる開裂の部位を矢印で示した。

式Ａで示される、部分的な細菌タンパク質−成熟真核性
タンパク質の融合物の如き組立て物によって分泌される
のは原核性タンパク質と真核性タンパク質との融合物で
ある。原核性ＤＮＡにコードされている余分なアミノ末
端アミノ酸を除去することは不都合であり、時には不可
能である。一方、式Ｂに示した組立て物によれば、成熟
タン／Ｎ＋’り質が分泌されることになるが、分泌され
る成熟タンパク質の収量は希望する量よりも少い。従っ
て、以下に示す様なハイブリッドベクター、即ち、原核
性シグナルと成熟真核性タンパク質の直結（直接）ハイ
ブリッドとして発現され、これが宿主によってプロセッ
シングされ、ペリプラズムに分泌される様なベクターを
組立てることが有用である。その様なベクターを以下に
示す。

Ｊ、カドナガら（前掲）は、β−ラクタマーゼシグナル
かニワトリのトリオース・ホスフェート・インメラーゼ
のためのＤＮＡに直接結合している、直結ハイブリッド
型のベクターを調製した。しかしなから、インメラーゼ
は、分泌もプロセッシングもされず、ハイブリッドの形
で、細胞質内に遊離した状態、並ひに内膜の細胞質側に
付着した状態のままで残存している様であった。著者ら
は、大腸菌の内膜を通過して分泌されるためには、分泌
された細菌性成熟タンパク質の少くともはじめの部分の
アミノ酸配列が絶対に必要であると結論している。

これまで、何故、直接ハイブリッド産物の分泌を達成す
ることが相当に困難なことであったのかは分らない。し
かしながら、出願人は、分泌およびプロセッシングの膿
構（組織）は細菌内に保持されているので（それ故、真
核性プレタンパク質がプロセッシングされた例がいくつ
かある）、即ち、該機構は幾分融通性を有するので（Ａ
型の融合物のプロセッシングに認められる様に）、分泌
を特に困難にする障害は、細菌が、発現産物を完全に人
工的な開裂部位（即ち、加水分解の起きる位置のいずれ
かの側の約１〜３個の残基については原核性でも真核性
でもない部位）でプロセッシングしなければならないと
いう組立て物の構造にあるのではないかと考えた。この
仮説、並ひにこれまでの失敗および当該技術者達の懐疑
的態度に反して、本出願人は、ペリプラズム性細菌が、
原核性シグナルと成熟真核性タンパク質との直結融合物
を実際にプロセッシングし、しかもそのことにより、本
出願人が以前に真核性プレタンパク質について得た収率
よりも高収率で成熟タンパク質を分泌し得る、というこ
とを見出した。このことは、特に哺乳類の成長ホルモン
の分泌に関して成功を収めた。

哺乳類成長ホルモンは脳下垂体の正常な生産物である。

今日では、哺乳類成長ホルモンは、ある程度、種間の交
差−特意性、似通ったアミノ酸配列の機能およびコンフ
ォメーションを示すことが知られている。ヒト成長ホル
モン（ｈＧＨ）は１９１個のアミノ酸からなり、分子量
は約２１，５００である。ｈＧＨは下垂体機能減退性小
人症の治療に臨床的に用いられている。それはまた、火
傷、創傷の治ゆ、発育異常、骨のゆ着、び慢性の胃出血
および偽関節の治療にも有効であることが提言されてい
る。

最近、組換え宿主細胞内でｈＧＨが合成された（例えば
、米国特許第４，３４２．８３２号参照）。

ｈ　Ｇ　Ｈは細菌細胞によって著しく破壊されるわけで
はなく、適切な位置に開始コドンを含んでいるｈＧＨ直
接発現のための遺伝子を適当なプロモーターと結合すれ
ば、直接、生産させることができる。原核性生物は、生
成したタンパク質からアミノ末端のメチオニンを除去し
ないことが多いので、米国特許第４．３４２，８３２号
の例に示される如く、細菌性プロモーターの存在下でヘ
テロローガスなｈＧＨ−ＤＮＡを発現させると、第１番
目のアミノ酸としてメチオニンを含んでいるｈ　Ｇ　ｌ
−１か得られる。この原因は、Ｄ　Ｎ　ＡのＡ　Ｔ　Ｇ
コドン（開始コドン）か最終的にメチオニンとして発現
されることによる。ｈＧＨの大腸菌内での生産に関して
これまでに得られた結果から、この宿主細胞は、ｈＧＨ
からメチオニンを開裂する細胞内機能をほんの僅かしか
持っていない事がわかっており、また、インビトロで上
記のことを行うための技術も限られたものであることが
分っている。

欧州特許公開第１２７３０５号は、原核性宿主をプレｈ
ＧＨ（通常の、自身の真核性シグナル配列を有するｈＧ
Ｈ）で形質転換することにより、該宿主内で成熟ｈ　Ｇ
　ｉ−１を合成し、分泌させることについて開示してい
る。宿主細胞はプレｈＧＨを発現し、真核性シグナルを
認識し、さらに、そのフレタンパク質を適切にプロセッ
シングするコトができた。次いで、ペリプラズムから成
熟ｈＧＨを回収した。しかし、その収率は期待される程
、高くなかった。

ペリプラズムからタンパク質を回収するのに、これまで
よく用いられてきた方法の１つにスフェロプラスト法が
ある（Ｈ，ノイ（Ｎｅｕ　）　ラ、”　ｔ＜イオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍ。

）″１ヱ：２１５（１９６４））。この方法では、細胞
壁を溶解するのにリゾチームを用いる必要がある。しか
し、この方法は、ペリプラズム性抽出物中に別の夾雑タ
ンパク質が加わることを余儀なくさせるばかりか、スフ
ェロプラストが、機械的にも浸透圧的にももろく壊れ易
いことから、特に、治療用のタンパク質を大規模に回収
する目的には不適当である。その上、リゾチームはかな
り高価である。

もう一つの方法は浸透性ショック法〔Ｈ，ノイら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ）　２４
０　：　（９）　：　３６８５〜３６９２（１９６５）
）と呼ばれるものである。この方法は、まず第一に生菌
を高張液で処理し、次いで、低張性の冷い洗浄水で処理
してペリプラズムタンパク質を放出させるという２工程
を行う必要があるという理由で不都合な方法である。

これらの方法は生菌を用いて行われた。しかし、生菌の
使用は、それらのタンパク分解酵素か完全に活性を有し
ていることから、望ましくない。出願人が、大腸菌の生
きている培養物中から、分泌されたｈＧＨを回収しよう
としたところ、起源不明のタンパク分解的な切断によっ
て、ｈ　Ｇ　Ｈの約１０〜２０％から、アミノ末端フェ
ニルアラニンが除去されてしまった。

本発明の目的は、ペリプラズムタンパク質の、改良され
た回収方法を提供することにある。本発明の改良法は、
回収の際の、タンパク分解酵素によるタンパク分解的破
壊を最少限に止めることができ、また、一般的にみて、
ペリプラズムタンパク質の、細胞内タンパク質による汚
染を最少にするという点て、充分に精巧なものである。

また、本発明方法によれば、より商業化に適した操作法
でペリプラズムタンパク質を大量に回収することができ
、従来利用し得た方法よりも大規模な使用か可能となり
、さらに、汚染されたタンパク質製剤を用いる必要がな
くなるのである。

また本発明は、細菌性宿主内で、真核性タンパク質を発
現させ、ペリプラズムに多量に分泌させることを目的と
するものである。

さらに本発明は、ペリプラズム内に、成熟ヒト成長ホル
モンを多量に得ることを目的とするものである。

さらにまた本発明は、真核性タンパク質の発現および分
泌を容易ならしめる原核性シグナルポリペプチドを提供
することを目的とするものである。

要約 以下に示す方法によって、真核性タンパク質を発現させ
、原核性生物のペリプラズム間隙に分泌させた： （ａ）　　分泌され得る直結ハイブリッドを発現するた
めのベクターであって、原核性分泌シグナル配列をコー
ドしているＤＮＡの３′末端と、成熟タンパク質をコー
ドしているＤＮＡの５′末端とが結合した配列を含むベ
クターを組立て； （ｂ）　　（ａ＞のベクターで原核性宿主生物を形質転
換し； （Ｃ）　　（ｂ）で形質転換した宿主を培養し；そして
、（ｄ）　　宿主のペリプラズムに成熟タンパク質をＮ
積させる。

ニワトリのトリオース・ホスフェート・インメラーゼ以
外の成熟真核性タンパク質をコードしているＤＮＡの５
′末端にその３′末端が結合している、ペリプラズム性
細菌の分泌シグナル配列をコードしているＤＮＡ配列が
提供される。この点に関し、大腸菌のエンテロトキシン
・シグナルをコードしているＤＮＡが特に有用である。

このシグナルＤＮＡは、（ａ）その３′末端か、成熟エ
ンテロトキシンをコードしているＤＮＡの５′末端に、
また、（ｂ）そ（７）５’末端がエンテロトキシンプロ
モーターの３′末端にいずれも結合していないという特
徴を有している。この配列は、エンテロトキシンシグナ
ル含有ベクターの組立てに、１つのカセットとして用イ
ルのに便利である。好ましいエンテロトキシンは５ＴＩ
Ｊである。

ＳＴＩＩシャインーダルガ／　（５ｈｉｎ　−Ｄａｒｇ
ａｎｏ　Ｓ。

Ｄ、）配列は、殊に強力なりボゾーム結合部位であり、
このことが収率の向上に寄与する。それは、一般に、ト
リプトファン（ｔｒｐ）プロモーターまたはアルカリ性
ホスファターゼ（ＡＰ　）プロモーターの様な、原核性
プロモーターと結合しており、どの様なプロモーター系
とでも用いることができる。

本発明の新規な原核細胞培養は、上記の方法を用いて宿
主細胞を形質転換し、培養することにより、生産される
。これらの培養物は、（ａ）成熟真核性タンパク質と、
（ｂ）成熟真核性タンパク質と原核性分泌シグナル配列
との直結ハイブリッド融合タンパク質とを含む。通常、
成熟タンパク質と融合タンパク質との合計重量の約２５
％以上、一般に約９０％までの物質は、細胞のペリプラ
ズムに存在する成熟タンパク質である。

本発明の一般的な方法は、ヘテロローガスな、即ち真核
性のタンパク質を分泌する様に形質転換された細胞を生
きたまま、または死滅した形で得、タンパク質が外層膜
から外へ通過し得る様、凍結と解凍の如き処理によって
外層膜を透過性にし、次いで、分泌された真核性タンパ
ク質を含むペリプラズムタンパク質を細胞の残余部分か
ら分離することからなる。ペリプラズムタンパク質の回
収を促進する様な変化を細胞膜にもたらすために、ホス
フェート（りん酸塩）制限条件下で細胞を培養すること
が有用である。

また、本発明は、形質転換した細胞をアルカノールと接
触させ、加熱することからなる新規な殺菌方法を提供す
るものである。次いで、これらの細胞を、凍結と解凍か
らなる冷ショック法で処理すれば、ペリプラズムタンパ
ク質を回収することができる。

これらの方法は、大腸菌ＳＴＩＩエンテロトキシンシグ
ナルと成熟ｈＧＨとの直結ハイブリッド融合物を発現し
得るダラム陰性菌から、ｈ　Ｇ　Ｈを回収するに際し、
特に便利な方法である。

図面の説明 第１図は、ＳＴＩＩ遺伝子、並びにその翻訳および非翻
訳領域のヌクレオチド配列を示す模式図である。そのＳ
、Ｄ、配列中、基本的な部分はヌクレオチド１５５−１
６１のオーバーラインを付した部分である。ＳＴＩＩシ
グナルの推定のアミノ酸配列は残基−２３〜−１，成熟
５ＴＩＪエンテロトキシンのそれは残基１〜４８に示さ
れている。

第１図にはまた、ＳＴＩＩのプロセッシングサイト（″
開裂部位”と称する）並びに様々な制限酵素の作用部位
か示されている。星印は、ＳＴＩＩプロモーターがオー
バーラインを付した８４−８９位および１０８−１１４
位の構造を含むとしたときの、ｍ　ＲＮ　Ａ合成開始点
と思われる部位を示している。

第２ａ図−第２ｄ図は、ｔｒｐプロモーターのコントロ
ール下において分泌可能なＳＴＩＩ−ｈＧＨ融合タンパ
ク質をコードすると共に、５ＴＩＢＳ、Ｄ。

配列を含有しているベクター（ｐｔｒｐ−５ＴＩ［−ｈ
　Ｇ　Ｈ）の組立て模式図である。

細な構造を示す模式図である。

第３ａ図はｐｔｒｐ−５ＴＩ［−ｈＧＨ）ｔｒｐプロモ
ーター領域、ＳＴＩＩシクナルおよびｈ　Ｇ　Ｈ遺伝子
のヌクレオチド配列を示す模式図である。

第４ａ図−節４Ｃ図は、ＡＰプロモーターのコントロー
ル下において分泌可能なＡＰ−ｈＧＨおよびＳ　Ｔ　Ｉ
ｆ　−ｈ　Ｇ　Ｈ融合タンパク質をコードシているベク
ターであるｐ　Ａ　Ｐ　−１およびｐＡＰ−５Ｔ■−ｈ
ＧＨ（たたし後者のベクターは、５ＴＩＪＳ。

Ｄ、配列をもコードしている）の組立て模式図である。

第５図はｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　Ｔ　’Ｊｌ　−ｈ　Ｇ　ｌ
−１のＡＰプロモーター領域・ＳＴＩＩシグナルおよび
ｈＧＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。

第６図はｐＡＰ−１のＡＰプロモーター領域、ＡＰシグ
ナルおよびｈＧＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式
図である。

詳しい記述 ヘテロローガスなタンパク質とは、通常は、細菌性細胞
が分泌しないタンパク質を指す。このヘテロローガスな
タンパク質は、該ヘテロローガスなタンパク質を分泌す
る様に処理された形質転換細胞にとって正常な細胞内タ
ンパク質であってもよく、あるいは他の微生物由来のＤ
ＮＡにコードされているタンパク質であってもよいが、
通常は、それは真核性タンパク質、そのフラグメント、
あるいは真核性タンパク質と原核性タンパク質またはそ
のフラグメントとの融合物である。好ましいペリプラズ
ムタンパク質は成熟真核性タンパク質、例えはｈＧＨの
如きホルモン、インターフェロンまたはリンホカインで
ある。

本発明において処理される細胞は、通常の培地あるいは
、ベクターまたはヘテロローガスなタンパク質を分泌さ
せるのに使用される突然変異宿主形質転換体のために調
整された培地、で増殖させた形質転換細菌の培養物から
得られる。

本出願人らは、宿主ベクター系か、プレタンパク質の合
成レベルおよび分泌レベルに関して複雑であるにもかか
わらず、原核性シグナルと所望の真核性タンパク質との
直結ハイブリッド融合物を分泌させることに成功した。

種々の直接結合した原核性シグナル配列と真核性タンパ
ク質配列を用い、ｔｒｐまたはＡＰプロモーターを用い
てプラスミドを組立てた。これらのプラスミドの各々を
用いて適当な宿主を形質転換し、ペリプラズムと細胞質
とにおける生成物の量および分布状況を調へた。これら
の実験の結果、直結ハイブリッド融合タンパク質により
、生物のペリプラズム間隙へ成熟真核性タンパク質か分
泌され、適切にプロセッシングされていることか証明さ
れた。この成功した実験結果を以下の表１に示す。通常
のｈ　Ｇ　Ｉ−１真核性シグナルを用いて得られた結果
を比較のために示した。

表１　真核性タンパク質の発現と分泌に及はすプロモー
ターおよびシグナルペプチドの影響０．１２ １．９〜 １、無機りん酸塩を含有しない培地。

２、大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６゜ ３、実験結果相互の間に、通常、変動が認められた。関
係のあるパラメーターには、培養物の密度、分泌された
タンパク質か回収された時期、その他の変動値か含まれ
る。成熟および融合真核性タンパク質の総量は、ペリプ
ラズムにおける割合（％）と同しく、概略値と考えるべ
きである。レベルは、ｙ１５５０ｎｍ＋ｃおけルＯＤ　
＝　５０　（！：　同等）培養ＩＩ／ｌとして求めた。

培養物は、振器フラスコを用い、１０−または２０　ｍ
ｅの量で培養した。

４、適正なプロセッシングとは、分泌されたタンパク質
が、天然起源のものから単離された場合に見られるもの
と同じアミン末端を有していることを意味する。

５、ＮＤとは、実施しなかったことを意味する。

６、ヒト白血球インターフェロン−Ａ。

７、ネズミモノクローナル抗−ＣＥＡイムノクロプリン
の軽鎖。

８、大腸菌ＡＴＣＣ２７３２５゜ 出願人は、当初、前記の構造式中の原核性シグナルを用
いていくつかの成熟真核性タンパク質を分泌させること
を試みた。その結果、ある例てはタンパク質が合成され
ず、また他の例では発現しても分泌か伴なわなかった。

ネズミーイムノグロブリン重鎖（ＳＴＩＩシグナルを利
用）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＡＰプロ
モーターオヨびシグナルを利用）またはウシ−プロレニ
ン（大腸菌宿主中、ｔｒｐプロモーターおよびＳＴＩＩ
シ／）−ナルを利用）、あるいはｈＧＨ（シュー１’モ
ーナスアエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）エンテロトキシンＡシグナルを利用
〕のためのベクターを用いて形質転換した培養物は、プ
レタンパク質または分泌された成熟タンパク質を極めて
少量、あるいは検出不可能な量、合成していることが分
った。その他の形質転換培養物では、ウシ−ガンマ−イ
ンターフェロン、プロレラキシン、インターロイキン−
２あるいはウシ−プロレニンとＳ　−Ｉ”　ＩＩシグナ
ルとの融合物をプロセッシングしなかった。これらの結
果は、限定的かつ予備的な実験により、得られたもので
ある。

この研究から、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質
との直結ハイブリッド融合物は、細菌細胞によって認識
される（即ち、プロセッシングされ、ペリプラズムに移
行する）ということか明らかになった。この様な知見を
得、本発明者らは、機能的な構造（組立て物）を決定す
るために努力を重ねた。

上記の努力は、まず第１に、様々なペリプラズム性細菌
タンパク質（例えば酵素やエンテロトキシン）から得た
シグナルとの直接（直結）ハイブリッド融合物をコード
しているベクターをスクリーニングすることに向けて払
われた。もしも、その様な組立て物で大腸菌を形質転換
し、培養しても成熟真核性タンパク質か分泌されなかっ
たならば、他の属のダラム陰性菌について、成熟タンパ
ク質を分泌する能力を有するか否かをスクリーンしなけ
ればならない。最終的には、シグナルペプチドのプロセ
ッシングに関する性質を強化したり、改良したりするた
めに、シグナルペプチドに突然変異を誘発することもで
きる。

本発明方法は、ダラム陰性菌がＳＴＩＩエンテロトキシ
ンノグナルペプチドとの直接（直結）融合物を認識し得
ることを見出した結果、可能となった。さらにまた本発
明は、Ｓ　Ｔ　ＩＩ　　Ｓ、Ｄ、配列の使用によって収
率を高めることができるという発見ｔこ基づくものでも
ある。

ｈＧＨおよびＳＴＩＩエンテロトキシンプレタンパク質
の部分的なアミノ酸配列を以下に示す。式中、それぞれ
の、成熟タンパク質の開始アミノ酸には下線を施した。

ｈＧＨ−−−１ｅｕ　ｇｌｎ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　ｓｅｒ
　ａｌａ　キｐｒｏ　ａｌａ　ｍｅｔ　Ｓｅｒ　ｔｅｕ
・−。

５ＴＵ−−−ａｌａ　ｔｈｒ　ａｓｎ　ａｌａ　ｔｙｒ
　ａｌａ　ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｇｌｎ　ｓｅｒ　ａｓｎ　
ｌｙｓ　−・・上の式から分る様に、これらの２個の配
列の、シグナル開裂部位の近辺には事実上、ホモロジイ
が認められない。従って、宿主細胞が５Ｔｎ−ｈＧＨハ
イブリッド結合部位を認識し、ＳＴＩＩ−ｈＧＩ−■プ
レタンパク質を正しくプロセッシングしてｈ　Ｇ　Ｉ−
１を分泌し得る、ということは驚ろくべきことである。

本発明ｌこ用いられる原核性シグナル配列は、細菌性の
、分泌タンパク質または細胞膜タンパク質。

あるいはそれらの突然変異体からのシグナル配列である
。適当なシグナルの例（こは、ハイドロラーゼ、ホスフ
ァターゼ、タンパク分解酵素（プロテアーゼ〕、抗生物
質耐性酵素類（例、β−ラクタマーゼ）、Ｍａ／ｌｉ（
マルトース結合タンパク質〕の如き結合タンパク質、並
びにエンテロトキシンに付随するシグナルを挙げること
ができる。β−ラクタブタゼシグナルは好ましくない。

好ましいものは、大腸菌の熱安定性（ＳＴ）および熱不
安定性（ＬＴ）エンテロトキシン類に見出される。

ＳＴエンテロトキシンの内、Ｓ　Ｔ　ＩＩか最も好まし
い。

ピッケンら（前掲）によると、５ＴＬＩシグナルポリペ
プチドのアミノ酸配列は、ＮＨ２−ｍｅ　ｔ　ｌ　ｙ　
５ｌｙｓ　ａｓｎ　ｉｌｅ　ａｌａ　ｐｈｅ　ｌｅｕ　
ｌｅｕ　ａｌａ　ｓｃｒ　ｍｅｔｐｈｅ　ｖａｌ　ｐｈ
ｅ　ｓｅｒ　ｉｌｅ　ａｌａ　ｔｈｒ　ａｓｎ　ａｌａ
か、あるいは上記配列のカルボキシ末端１こＬ）ｌｒａ
ｌａが付加したものである。実際、大腸菌は、このシグ
ナルをｔｙｒ　ａｈａ　　の後方で切断する。従つて、
本明細書中、以後に述べるベクターに用いられるＳ　Ｔ
　ＩＩ　シグナ／Ｌ／　Ｄ　Ｎ　Ａは、別Ｈ１ｔｙｒ　
ａｌａ　　をコードしているものも含む。

分泌される真核性タンパク質の割合を増加させるために
原核性シグナルに突然変異を誘発してもよい。一般に、
シグナルの疎水性核以外の位置のアミノ酸（例えば、残
基−１、−２または−３）をコードしているコドンに突
然変異をもたらすと。

シグナルの開裂についてより顕著な効果を発揮する仔で
ある。突然変異したＤＮＡは、突然変異の起きた位置に
、野生型のシグナルとは異るアミノ酸を発現させる。特
定の位置で、各々異なるアミノ酸をコードしている複数
個のコドンを置換するのが最も便利である。このことは
、当業者既知の方法で行うことができる。例えば、アル
カリ性ホスファターゼに関して行ったＳ、ミバエリスの
報告がある（前掲）。次いで、個々の組立て物を、発現
ベクター内において成熟ヒトタンパク質をコードしてい
るＤＮＡとライゲートし、このベクターを用いて宿主を
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、後に詳述す
る様に、各突然変異体毎ｌこ分泌レベルを測定する。最
適なレベル（濃度）の所望のタンパク質を分泌した形質
転換体を同定し、それに関与している組立て物を選出す
る。ＳＴＩＩシグナルに関する限り、疎水性領域（第１
図）こおいて、残基−５から−１７まで〕におけるアミ
ノ酸の置換は、置換されたアミノ酸が電荷をもたず、さ
らｌこ好ましくは疎水性で屍れば、シグナルの効力に不
利な影響を及ぼさないと予測される。また。

この領域内での１または２個程度の欠失あるいは挿入も
容認し得る。リーダー中、最も感受性の高い領域は、残
基−１および−２１から−２２の領域である（第１図）
。これらの残基１こおける突然変異（挿入または欠失を
含む）は、一般に破壊的であるが、時には、収率または
分泌イこ関して好結果を与えることもある。本明細書で
定義している原核性シグナル突然変異は、発現されたシ
グナルが所望のタンパク質、またはその他の真核性タン
パク質に通常付随している真核性シグナルに変ってしま
う、という程、広範囲に及ぶものではないっ突然変異に
よる適正化は、実質上同じシグナルを含むベクターを用
い、宿主をある宿主から他の宿主１こ切り換える場合に
特に望ましい。その理由は、ングナルー真核性タンパク
質融合物の開裂および成熟タンパク質の移送に関与して
いる細菌酵素系におけるアレル変異体は、適切に修飾さ
れた原核性シグナルを、より容易に認識し得ると思われ
るからである。

本発明１こよれば、適当なダラム陰性宿主とシグナルと
が選択されたなら、どの様な真核性タンパク質、突然変
異体または誘導体をも分泌させることができる（勿論、
そのタンパク質自体がダラム陰性菌内で発現され得るこ
とを条件とする）。その様な真核性タンパク質には、リ
ンホカイン、イムノグロブリンおよびホルモンが含まれ
る。本明細書中に用いる真核性タンパク質は通常、ウシ
、ブタおよびヒト起源の補元類タンパク質である。

ヒト成長ホルモンの様な成長ホルモンに関して、特に優
れた結果が得られる。

直結ハイブリッド融合物を発現させるために、宿主の形
質転換に用いられるベクターは、当業者に一般的に知ら
れている常法によって組立てられる。それらのベクター
内で、原核性シグナルをコードしているＤＮＡは所望の
タンパク質をコードしているＤＮＡと、直接結合してい
る。このことは、正常な細菌性開裂部位の直ぐ上流のア
ミノ酸をコードしているシグナルｒ）　Ｎ　Ａと、所望
の成熟真核性タンパク質の最初のアミノ酸をコードして
いるＤＮＡとが直結しており、その間には、成熟原核性
タンパク質または正常な真核性プレ配列に由来する介在
残基配列が全く存在していないことを意味する。その様
な直接結合は、実施例中に示したＭ１３欠失性突然変異
変異法等の既知の手法で行うことができる。別法として
、シグナルおよび開裂部位の領域をコニドしているＤＮ
Ａを化学合成することもできる。このＤＮＡを、残りの
真核性タンパク質をコードしているＤＮＡと、平滑末端
ライゲーションにより、あるいは適宜な制限酵素部位を
介してライゲートする。

アルカリ性ホスファターゼシグナルまたはＳＴＩＩシグ
ナルをコードしているＤＮＡは、所望の成熟真核性タン
パク質をコードしているＤＮＡと、以下番こ示すいずれ
かの形で直接的に結合する。真核性タンパク質が成長ホ
ルモンである場合、５′側の最初の２個のコドンとして
、少くとも、ｈＧＨのアミノ末端の最初の２個のアミノ
酸（即ち、ｈ−ｐｈｅ　ｐｒｏ）　　をコードしている
コドン、さらに好ましくは、ｈＧＨの最初の１５アミノ
末端アミノ酸をコードしているコドンを含有しているＤ
ＮＡに、シグナルを結合する。この配列は、一般に、ｈ
　Ｇ　Ｈ、ウシ成長ホルモン（アミノ末端配列ｐｒ。

ａｌａ　ｍｅｔ　ｓｅｒ　Ｉｅｕを有する）またはブタ
成長ホルモン（アミノ末端配列ｐｈｅ　ｐｒｏ　ａｌａ
　ｍｅｔ　ｐｒ。

Ｉｃｕを有する）等の成長ホルモン、並びにそのアレル
変異体をコードしているＤＮＡ配列の一部を構成してい
る。

本発明に用い不のに適したベクターは、直結ハイブリッ
ド融合物のＤＮＡを、複製および翻訳を行わせる配列と
、機能的（ｏｐｅｒａｂｌ　ｙ）　ｌこ結合させること
番こより、組立てられる。ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳を有効な
らしめる配列には、原核性シグナルの上流に位置するＳ
、Ｏ，配列が含まれる。本発明に用いるには、そのＳ、
Ｄ、配列がＳＴＩＩ由来のものであって、ＳＴＩＩ遺伝
子中に存在する天然の介在配列（ｒｒＴＩ″）により、
原核性シグナルの開始コドンと隔てられていることが好
ましい。この様な構造物は、以下に述べるように、　５
．０．配列と、ＳＴＩＩ遺伝子起源の正常・な介在配列
とを完備しているＳ　Ｔ　ＩＩングナルを単離すること
により、最も容易に得ることができる。しかしながら、
ＳＴｎ遺伝子のこの部分の長さはｓ　ｏ　ｂｐにしかす
ぎないので、既知の化学的手法でその必要な配列を単純
（こ合成することも実際的な方法である。この方法は、
広範な変異をシグナルにもたらそうと計画している場合
には特に好ましい。第３３図番こ示した組立て物は、２
個のＳ　、Ｄ、配列を含有しており、１つは上流にあっ
てｔｒｐプロモーターから与えられたＳ、Ｉ）、配列で
あり、もう１つは、Ｓ　Ｔ　ＩＩシグナルＤＮＡと正常
な関係にあるＳＴＩＩ　Ｓ、Ｄ、である。出願人は、上
流の非−５Ｔ　ｎ　Ｓ、Ｄ、配列は不要であると考えて
いる。

ＡＰシグナルの如きその池の原核性シグナル配列も、長
さかｔｏｏｂｐより短い傾向があるので、化学的に合成
することができる。

前記のＳ、Ｄ、−シグナル−タンパク質配列はプロモー
ターのコントロール下で転写される。そのプロモーター
は、選択された原核性シグナル（こ通常伴なっているプ
ロモーター以外の、原核性プロモーターであることが好
ましい。具体的に好ましいのはＡＰプロモーターである
が、ｔａｃ、ｔｒｐまたはラクトース［Ｄ、　　ゲラデ
ル（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ　）　　ら、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）２８１　：５４４（１９７９）］プロモーター
の様な他のプロモーターでもよい。これらが最も普通に
用いられるプロモーターであるか、その他の微生物プロ
モーターも発見されて使用されており、それらの詳しい
ヌクレオチド配列に関する報告もあるので、当業者はそ
れらをプラスミドベクターと機能的にライゲートするこ
とができル〔シーヘンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌ　１ｓｔ
）ら、セル（Ｃｅｌｌ）２０　：２６９（１９８０）］
。プロモーターは、分泌される真核性タンパク質の割合
には影響を及ぼさない様である。しかしながら、プロモ
ーターとシグナル配列の両要素の相互作用か発現レベル
に影響するので、発現（こ最適なこれら両要素の組合わ
せをスクリーンすることが望ましい。例えば、表１にお
いて、ＡＩ’プロモーターとの一退合わせ（こおいて、
ＡＰシグナルをＳ　Ｔ　ＩＩシグナルで置換した場合の
結果を比較されたい。

プロモーター−５，Ｄ、−シグナル配列１ま、宿主細胞
に適合し得るレプリコン配列を含有しているベクター内
に存在しているっこのベクターは、通常、ド ファージではなく、ブラスミｆある。ベクターは。

複製部位と共に、形質転換された細胞の同定を容易なら
しめるために、表現型標識配列を含んでいる。例えば、
大腸菌は一般に、アンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性に係る遺伝子を含有しているプラスミドであるｐ　
Ｂ　Ｒ３２２Ｃポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、ジーン
、２：９５（１９７７）］誘導体によって形質転換され
る。

ＤＮＡ配列が他の配列に゛機能的）こ、または操作可能
にライゲートまたは結合している″ということは、特定
の１）ＮＡが他のＤＮＡ配列に影響を及はすことを意味
する。このことは、一般に、第１のＤＮＡが、そのもの
が機能的にライゲートしているＩ）　Ｎ　Ａの転写また
は最終的な翻訳をコントロールしているか、あるいは、
翻訳されたタンパク質のプロセッシングに影゛響してい
ることを意味するっ例えば、プロモーターは、それが、
プレタンパク質ｍ艮ＮＡの翻訳速度に影響を及ぼしてい
る場合には、該ブレタンパク質をコードしているＤＮＡ
を機能的番こライゲートしていることになる。

また、シグナルポリペプチドは、それが、所望のタンパ
ク質をコードしているＤＮＡと解読棚内にあり、かつ該
ＤＮＡと直接ライゲートしている場合１こは、該タンパ
ク質をコードしているＤＮＡと機能的（こライゲートし
ていることになる。ある組成物について、゛ライゲート
している“という寺語句は、その組成物がライゲーショ
ンによって製造され得るという意味においてのみ定義さ
れると解釈すべきてない。そうではなく、プラスミド内
で機能的にライゲートしている要素を、一体のものとし
て化学的に合成することができる。

前記のベクターによって形質転換される宿主細胞は、（
ａ）２つの細胞膜の曲にペリプラズム間隙を有し、ｌｂ
ｌ　　細胞内部でベクターか複製可能であり、さらに（
ｃｌ　　；ＩＡ胞内部でプレタンパク質が発現されると
共に、プロセッシングされ得る細菌である。本発明シこ
係る宿主は通常ダラム陰性の生物、とりわけ、腸内１ｔ
−Ｉ１１菌（］’、ｎｔｃｒｏｂａｃｔｃｒｉａｃｃａ
ｃ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
に属する生物またはその突然変異体である。宿主ベクタ
ー系（ベクターで形質転換された宿主つとして好ましい
のは、ハイブリッド融合物の発現をコントロールするプ
ロモーターが＋１１成的に活性化され、あるいは抑制さ
れる様な系である。組織的な突然変異体とは、特定のタ
ンパク質（本明細書においては。

プロモート（促進）された直接ハイフリット融合物であ
り、ある場合には、通常の状唇てプロモートされるタン
パク質）を、プロモーターの抑制マたは活性化を想定し
た、誘導その他培養条件の変化をもたらすことなしに分
ｌ、させ得る様な突然変異を指す。宿主−ベクター系が
組織的にプロモートされる様、宿主および／またはプロ
モーター１こ突然変異を誘発させることができる。ベク
ター内）こ使用するプロモーターに、それが、もはやリ
プレッサータンパク質１こよって抑制され得ない様な突
然変異をもたらすことができる。その降な突然変異は知
られている。別法として、宿主細胞に、それが野生型ま
たは突然変異を起こしていないプロモーターのコントロ
ール下で組織的なものとなる様な突然変異を誘発するこ
とができる。その様な宿主は、突然変異体アレルを含む
、一般に入手可能な菌株から、形質導入を介して都合良
く調製することかできる。ｐｈｏ　Ｔ　またはｐｈｏ　
Ｒ突然変異体アレルを担っているＡＰプロモーター含有
ベクターで宿主細胞を形質転換することが好ましい。

前者は、りん酸イオン輸送タンパク質の暗号遺伝子にお
ける、不能化突然変異体と思われている。

また、ｐｈｏＲ突然変異体は、リプレッサータンパク質
の暗号遺伝子における、不能化突然変異体である。これ
らの突然変異体アレルは当該技術分野で広く知られてお
り、入手することができ、既知の技術によって宿主内に
導入することかできる。

驚ろくべきことに、組織的な宿主は、ホスフェート欠失
法によって誘導された野生型の宿主よりも高い比率（％
〕で発現産物をプロセシングした。

宿主細胞は、直結ハイブリッド融合物のＤＮＡの転写を
コントロールするために用いたプロモーターによって正
常にプロモートされた宿主タンパク質を発現する（必す
しもｔ１６成的である必要はない）。例えば、大腸菌ｐ
ｈｏＡ　　欠失突然変異体（これは活性なＡＰを発現し
得ない）またはＡＰ−合成細胞を宿主として用いること
かできる；細胞からのＡＰの活性な分泌は、必すしも真
核性タンパク質の分泌を妨げない。通常、宿主細菌はシ
グナルの起源である菌と同じ種のものを用いる。

宿主細胞の培養に通常用いられるあらゆる培地が形質転
換体の培養に適するが、野生型の宿主（Ｗ３１１０ｐｈ
ｏＡ、ｐｈｏ−ｒまたはｐｈｏＡ、ｐｈｏ　Ｒ以外）に
よる真核性タンパク質の分泌には、宿主培地の組成が強
い影響を及ぼす。酵母エキス含育培地は、トリプトン（
カゼインのトリプシン消化物）または１９アミノ酸の合
成混合物を含む培地に・比べて分泌を改善させた。酵母
エキスの１またはそれ以上の成分が分あの活性化に役立
つ様に思われる。

好ましい態様では、細胞を培地から収穫する前にホスフ
ェート制限条件下で培養するべきである。

このことは、その生物が、ホスフェートのプロセシング
に係るタンパク質のためのプロモーターのコントロール
下にある真核性タンパク質をコードしているベクターで
形質転換されたか否か、あるいは、その細胞がりん酸栄
養物の輸送または異化作用（こ関する能力を欠いている
かどうかに関係なくいえる。驚ろくべきことに、発酵の
最終段階において、細胞を収穫する前にホスフェート制
限培地を用いることにより、形質転換されたダラム陰性
生物のｈ賊的特性か大きく改良される。この様な特性の
改良は、下記の冷ショック抽出法の効果を増進する。例
えば、培地からホスフェートを沈殿させるか、培養物中
に制限された投与速度でホスフェートを加えるか、ある
いは、予定の；！ＩＩ胞密度以上に培養物を増殖させる
の番こ適する量よりも少量のホスフェートを最初に加え
ておく、等の方法（こより、培地をホスフェート制限状
態にする。

最初の供給量は、発酵の初期の訓胞増殖を最適Ｏこ行わ
せる（例えば指数増殖を行わせる、あるいは０Ｄ５５ｏ
　を約４５にする〕の（こ充分な量とするうホスフェー
トの飛は、培養物中（こ用いた他の栄養物や菌株【こ応
じて修正される。通常、大腸菌ｗ３１１０（ＡＴＣ：Ｃ
：　　２７３２５）に用いられる培地（こは２．５９／
ｌの割合でりん酸カリウム／ナトリウム塩を使用するが
、ｐｈｏＴ　突然変異体の如きホスフェート代謝欠損株
の場合にはより多量（約４．ｏｇ／ｅ）を用いる。この
値は、非制限的７Ｉ場合のホスフェート量（約９．０！
／ｌ）と対照的である。培養物がホスフェート制限状態
に至った時点での、制限培地中のりん酸イオン濃度は約
１ｍＭ以下である。一般に、この様な制限状態１こおい
て、収穫前約１時間、細胞を培養する。

好ましくは、以下に示す処理を開始する前に、通常、指
数増殖期に続く増殖期間中に、細胞がペリズム性のヘテ
ロローガスなタンパク質を最高のレベル（こまで蓄積す
る機番こしておく。この時点に達するや否や、あるいは
その直後に、細胞を殺すべきである。１殺す“という語
句は、少くとも、細胞が複製し得ない状態にあることを
意味する。

しかしながら、以下に示すアルカノールおよび熱による
処理（こよっては、複製とは直接関係のない代謝機能が
差し止めされる。または破壊される様）こ思われる。し
かしながら、ペリプラズム内番こあるｈＧＨに対して有
害な、大腸菌のタンパク分解活性が消失されることの外
に、代謝機能がどの様な影響を受けたかは不明である。

殺菌方法は、それによって宿主生物の細胞内膜が破裂、
溶解または弱体化するものであってはならない。

細胞が所望の増殖時点に達したら、即座に、細胞をアル
カノールと接触させ、加熱して殺すことが好ましい。用
いるアルカノールは、例えば、１−オクタツールの様な
、細胞膜溶解性のものであってはならない。一般に、適
当なアルカノール類には、ｌ−ブタノールやエタノール
の如き低級（Ｃ２〜Ｃ４）モノヒドロキシアルカノール
類が含まれ、中でも１−ブタノールが好ましい。アルコ
ールと細胞との接触は、アルカノールを連続的１こ撹拌
しながら発酵培養物中に加えることにより１行われる。

加えるアルコールの量は、培養物中のアルカノール濃度
カ０．５％〜１０％（Ｖ／Ｖ　）　ｌこなる唾な量であ
り、１−ブタノールを約１．５％（ｖ／り用いることが
好ましい。ブタノールは、約０．５％という低濃度でも
使用できる点で、好ましい；プロパツールまたはエタノ
ールを用いて同等の不活化を行うためには、もつと高濃
度１こしなければならない。

細胞培養へのアルカノールの添加と同時に、あるいはそ
の後に、アルカノールの作用に共同して細胞を殺すのに
充分な高さまで培養物の温度を上げ、その温度に保つ。

この処理は１通常、約５５℃〜３５℃の温度で約０．５
〜２０分間行うが、温度が高くなる程、作用時間を短か
くする。アルカノールの添加により、それがない場合に
必要とされる加熱温度よりも低い温度で操作することが
できるので、回収すべきタンパク質の活性の保存に仔益
である。

細胞を殺すことは臨界的な要件ではない。もしも、細胞
を素早く処理することができ、組換え細胞の取扱いにお
ける調整上必要な点が、他の方法でも容認し得るならば
、生産物の破壊を防止または遅延させるの番こ有用であ
るため、細胞を殺す操作をなしにすませることもできる
。しかしながら。

生産物の回収量は、回収された上清中の生成物タンハク
質の純度を減少することなく、約２倍番こ達することが
分った。

細胞を培養した後、そして／または殺した後、ペリプラ
ズムタンパク質を回収する。この方法には、一般に、細
胞ペーストを形成し、細胞を凍結ば、低速遠心により）
工程が必要である。分泌された真核性タンパク質をも含
めて、ペリプラズムタンパク質は上清に存在している。

この方法によれば、真核性ペリプラズムタンパク質の比
活性（即ち、純度）は、浸透圧ショック法によって達成
される値よりも高い。従って、２０％シュクロース等の
高張性物質による処理は必要でないが、ペリプラズムタ
ンパク質に関して細胞の外層膜を透過性にする様な、あ
らゆる方法を、殺した細胞に適用することができる。

凍結用の細胞ペーストは、細胞培養を遠心または濾過し
て細胞塊を回収することにより調製される。このペース
トには、普通、残存量の発酵培地、例えばＬ　Ｂ　［Ｉ
　ルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）　］培地
が含まれている；次の工程に進む前に、細胞を凍結用の
溶媒で洗う必要はない。本発明における冷ショック抽出
法で形成されたペーストが細胞の濃度と殆んど関係がな
い、ということは大きい問題ではない。しかしながら、
大岳の物質の凍結と解凍における経済性から、ペースト
容母が小さい方が好ましい。　　゛ 細胞凍結は、可能な限り早く行うべきである。

一般に、室温のペーストを、−２０℃のフリーザ−白で
凍結させ、次いで、以後の処理が必要になるまで、−８
０’Ｃて保存する。

凍結したペーストを解凍し、数倍の容量の水または水性
バッファー（約３倍またはそれ以上の容量の１０ｍｋｌ
）リス−１−ＩＣ（３バツフＴ　　、　ｐＨ８が好まし
い）によって希釈する。このバッファーは、宿主生物の
細胞内液に比べて低張性である。

以下の工程は約４℃で行う。希釈に用いるバッファーの
種類、濃度およびｐＨは回収すべきペリプラズムタンパ
ク質によって変動するが、バッファーで約３倍に希釈し
て行う。

細胞をバッファーに、完全に懸濁する。この工程は、ホ
モジナイザー装置を用い、実質的な溶菌か起こらない様
なスピードで、細胞を懸濁させることにより、簡単に行
える。

懸濁した細胞を約１０分〜６０分間、通常は約３０分間
、静かに撹拌する。次いで、遠心（一般に、１２，０Ｏ
ＯＸＳＩで３０分間）またはＰ遇することにより、細胞
片と細胞（細胞質タンパク質を含有）を除く。上清には
、ペリプラズムタンパク質、可溶化された外層膜タンパ
ク質、残存性培地および細胞外タンパク質、並びに少ｊ
Ｈ１の可溶性イ（ロ胞内タンパク質か含まれている。所
望の真核性タンパク質は、以後の方法に従って、上清か
ら望み通り、精製することができる。

上記の凍結−解凍抽出法は、殺したままの、あるいは殺
していない生の形質転換体のいずれの場合でも、バッフ
ァーだけで抽出する方法に比べて。

収量並びに、驚ろくべきことに純度において、相当に優
れている。凍結した、殺していない細胞からは、凍結さ
れていす、かつ殺されていない細胞のバッファー抽出に
比べて約５〜２６倍多量）ｈＧＨが回収された。殺され
、凍結された細胞の上清中の全タンパク質の１９重量係
がｈＧＨであったが、殺されたままのｉｎＤ胞に関して
は、約１６チしかｈＧＨは含まれていなかった。

上記の方法を、以下の実施例において、大腸菌熱安定性
エンテロトキシンＳＴＩＩシグナルペプチドとの直接ハ
イブリッド融合物として、成熟ｈ　ＧＨを発現させるベ
クターで形質転換された大腸菌からｈＧｌｌを回収する
のに用いた。しかしながら、本明細書に示した回収方法
は、形質転換された細菌細胞からペリプラズムタンパク
質を分離するのタルマッシ（Ｋ、Ｔａｌｍａｄｇｅ　）
ら（前掲）；０．ゼメルーＦ　Ｌ／　−セフ　（０，Ｚ
ｅｍｅｌ−Ｄｒｅａｓｅｎ）ら（前掲）並びにＧ、グレ
イ（Ｇ、Ｇｒａｙ）ら（前掲）］。

実施例を簡単にするため、組換え法による組立て；こ関
し、しばしば現われ、また用いられるいくつかの事柄を
短い語句または記号で表わす。

プラスミドは、小文字のＰで始まり、ついで／または大
文字、そして／または数字を続けて表わす。本発明に用
いる出発物質のプラスミドまたは１）　Ｎ　Ａ供給源は
市販品から入手できるか、あるいは、何ら制限のない施
設から誰でも入手することができ、または、公開された
方法に従い、入手したプラスミドまたはポリヌクレオチ
ドから組立てることができる。加えて、一般に、プラス
ミドはプレタンパク質のための複製ビヒクルおよびその
コントロール配列として、あるいは、中間体組立てにお
ける要素としてのみ機能するのであるから、その池の等
価なプラスミドも当業界で知られており１通常の技術者
にとっては自明である。

ＤＮＡの１消化“とは、ＤＮＡのある位置にのみ作用す
る酵素で該１）　Ｎ　Ａを触媒的に開裂することを意味
する。その様な酵素は、制限酵素と呼はれており、酵素
（ことって、各酵素に特異的な部位を制限部位と称する
。１部分″消化とは、制限酵素による不完全消化、即ち
、あるＤＮＡ基質中の、特定の制限エンドヌクレアーゼ
の作用部位の全てではなく、いくつかが開裂される様な
条件を選んで行う消化を指す。

本発明番こ用いる様々な制限酵素類は市販品から入手可
能であり、その反応条件、コファクター類およびその他
必要なものは酵素供給者により確立された指示に従った
。一般に、制限酵素類は、各制限酵素の最初の供給源で
ある微生物を表わす大文字、次いで他の文字、さらに、
通常数字の順（こ、略語で示される。一般に、約２０μ
ｅのバツファ−中で、プラスミドまたはＤＮＡフラグメ
ント約１μｇと酵素約１単位とを用いる。特定の制限酵
素（ことって適当なバッファーおよび基質の量は製造者
によって規定されている。通常、３７℃で１時間インキ
ュベーションするが、供給者の指示によって変動し得る
。インキュベーションの後、フェノールおよびクロロホ
ルムで抽出してタンパク質を除去し、水性フラクション
からエタンール沈殿によって消化された核酸を回収する
。時たま、制限酵素による消化の後、５′末端のホスフ
ェートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解する
ことがある。これはＤＮＡフラグメントの２つの制限的
開裂末端かライゲーション（後述）に際して１閉環（サ
ーキュライデイング）“したり、閉じたループを形成す
ることにより、該制限部位番こ他のＩ）　Ｎ　Ａフラグ
メントが挿入されにくくするのを防止するためである。

しかし明示しない限り、プラスミドの消化の後、５′末
端の脱りん酸反応は行なわないものとする。脱りん酸の
方法および試薬は常法に従う（Ｔ、マニアナイス（Ｔ、
隨ｎ１ａｔｉｓ　）ら、１９８２、モレキュラー・クロ
ーニング　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　にｔｏｎｉｎｇ）Ｉ
）、、　１３３　１３４　］　。

制制限部による消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トの１回収″または１単離″とは、この消化物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動（こかけて分離し、フラグメ
ントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメン
トのそれと比較して所望のフラグメントを同定し、該フ
ラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルから通
常、電気溶離法でＤＮＡを分離することを意味する。こ
の方法は一般的に知られている。例、ｋ、ローン（Ｒ。

Ｌａｗｎ　）ら、１９８１．’ヌクレイツク・アソツズ
・リサーチ“９　：６１０３−６１１４およびり、ゲラ
デル（Ｄ、Ｇｏ　ｅｄｄｃ　ｌ　）ら、１９８０’ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ″８　：　４０５７参照
。

１サザ一ン分析“とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物
中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識したオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡフラグメントドのハイブリダイゼ
ーション（こよって確認する方法である。本明細書中で
は、特に断らない限り。

サザーン分析という時は、Ｅ、サザーン（Ｅ、５ｏｕ−
ｔｈｅｒｎ）、１９７５’ジヤーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジイ（Ｊ　、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、　
）“　ｌｊ：５０３−５１７．の方法に従って、消化物
を１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニトロセ
ルロース上に移し、Ｔ、マニアナイスらの方法（１９７
８、’セル“↓５：６８７−７０１）に従ってハイブリ
ダイゼーションを行なうことを意味する。

１形質転換″とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組ろまれで複製されることを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法Ｇ
こはマンデル（Ｎｈｎｄｅ＋）らのＣａ　（−ｅ２法（
１９７０，’ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジイ“５３　：１５４）を１采用する。

゛ライゲーション（結合）″とは、２個の二重鎮咳酸フ
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ、マニアナイスら、前掲ｐ１４６．）。特に
明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件
を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフラグ
メント０．５μｙ当？、：すＴ４　ＤＮＡ　ＩＪ　カー
ゼ（”）ガー−ｔ／”）１０単位を用いて行う。

形質転換体から１）ＮＡを１調製する“とは、プラスミ
ドＩ）　Ｎ　Ａを微生物培養物中から単離することを意
味する。明示しない限り、マニアナイスらのアルカリ性
／ＳＯ５法（同上ｐ、９Ｑ）を採用する。

１オリゴヌクレオチド“とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであって。

既知方法によって化学的に合成され、次いてポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである、引用した文献
は全て参照例として示した。

実施例１　大腸菌熱安定性エンテロトキシン（Ｓ　Ｔ　
ＩＩ　）遺伝子シグナルペプチド配列をコードしている
プラスミドの組立て 以下の組立ては第２ａ図１こ示されている。プラスミド
ｐＷＭ　５０１　（ピッケンら、前掲〕は熱安定性エン
テロトキノン（ＳＴＩＩ）遺伝子を含有している。以下
の工程により、ｐｍ４５ｏ１（１）からＳ　Ｔ　ＩＩ遺
伝子をコードしているＤＮＡの部分（第２ａ図中、点描
法で示した部分）を回収した。ＰＷへ１５０１をＲ５ａ
Ｉで消化し、５５０ｂｐ　ＤＮＡ　７ラグメント（２）
を単離した。この遺伝子フラグメントを、予めＳｍａ　
ｌ　　ｉｐ化されたファージＭ１３ｍ　Ｐ　８　（Ｊ、
メツノング（Ｊ、Ｍｃｓｓｉｎｇ）ら、サード・クリー
ブランド・シンポジウム・オン・マクロモレキュールス
：リコンビナント・ＤＮＡ（Ｔｈｉｒｄ　Ｌ；１ｅｖｅ
ｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏ
　−１ｅｃｕｌｅｓ　：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ　
Ｎ　Ａ）　Ａ、ウォルト４組工／１ｚ−ｔｔビニ（Ｅｌ
　５ｅｖｒｅｒ）、アムステルダム（Ａｍｓ　−ｔｃｒ
ｄａｍ）　（１９８１）ＰＰ１４３　　１５３：］　　
ｌこライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを用いて、
Ｍ１３ファージ用（こ市販されている菌株である大腸菌
ＪＭ１０１を形質転換した。澄明なプラークを回収した
。憚準的な方法（Ｊ、メツンングら、前掲）を用いて、
このファージに感染した太Ｊｔ％［ｉＪＭｌｏｌから二
本鎖Ｍ　１３　ｍ　ｐ　８Ｓ　ＴＵ　Ｒｓａ銹導体（３
）を単離した。」−で述へたＭ　Ｉ−：３　ｍｐ　８サ
ブクローニング法を用いて、Ｓ　Ｔ　ＩＩ　ＩＪ−グー
遺伝子を含有している約５５０１）Ｉ）フラグメント（
２）を、ファージから提供される一連の顕る制限エンド
ヌクレアーゼ部位で囲む。次いで、Ｍ　１３　ｍｐ８５
ＴｌｌＲｓ　ａ　　誘導体（３）をＥｃｏｌζ■とＰｓ
ｔｌテ消化し、フラグメント（２）よりやや大きいｌ）
　Ｎ　Ａフラグメント（４）を単離した。

ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ　　フラグメント（４）をＰＢＲ
３２２にサブクローンした。これは、ＰＢＲ３２２をｌ
ｉｃ。

ＲＩとＰｓｔ　Ｉ　で消化し、ベクター（のを単離する
ことにより、行った。こうして単離したベクター（５）
とＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ　　Ｉ）ＮＡ　　フラグメント
（４）とをライゲートした。このＤＮＡ混合物を用いて
大腸菌２９４を形質転換し、テトラサイクリン耐性コロ
ニーを選択した。耐性大腸菌コロニーからプラスミド（
６）を単離し、これをＰｓｔ１１部分（Ｐｓｉ　ＩＩ　
ｐａｒｔｉａｌ）と命名した。

実施例２　　Ｔｒｐ　　プロモーターのコントａ−ル下
ｆこある、Ｓ　Ｔ　ＩＩシグナルペプチドをコードして
いるプラスミドの組立て この組立て方法は第２ｂ図１こ示されている。実施例１
で得りｐ　５　Ｔ　１１部分をＭｎｌ：ＩとＢａｍＨｌ
てｌ百化し、ＳＴＩＩＳ、υ、配列、ＳＴＩＩシグナル
配列、および成熟５ＴＬＩ遺伝子の最初の３０コドンを
含有する１　８０　ｂｐフラグメント（７）を単離した
。

このＤＮＡ７ラグメント（７）をｔｒｐ　　プロモータ
ー含有プラスミド（こライゲートした。その様なプラス
ミドの１っであるプラスミドｐＨＧＨ２０７−１（８）
は既（こ報告されているＣＨ，ド・ホエー（Ｈ。

ｄｅ　Ｂｏｅりら、１９８２、プロモーターズ：ストラ
クチュアー・アンド・ファンクション、ｋ、ロドレゲツ
ツ（Ｒ，Ｒｏｄｒｅｇｕｅｚ）ら編、チ’ｒ　７　バー
　Ｕン、ブレーガー（Ｃｈａｍｂｅｒｌ　ｉｎ、Ｐｒａ
ｅｇｅｒ）出版、ニューヨーク、ＮＹ、ｐｐ４６ｚ−４
８Ｄ。このプラスミドの誘導体であるｐ　ＨＧ　Ｈ２０
７−１’　　ＣＬｒｐプロモーター側の５’（１１，ｌ
ｌ　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１部位をＬ）ＮＡポリメラーゼＩ（
ＤＮＡ　　ｐｏ／Ｉ）で埋め（目■ｉｎ）、次いで、得
られた平滑末端をライゲーションすることにより、Ｅｃ
ｏＲＩ’に変換したもの。

Ｓ、キャビ’）　イ（Ｓ、Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、１９８
４、プロシーデインダス・オン・ザ・ナノヨナル・アカ
デミイ・オン・サイエンスイズ、ＵＳＡ、８１：３２７
３−３２７７〕を、この実施例では用いた。

このｔｒｐ　　プロモーター含有プラスミドをＸｂａｌ
で消化し、ＤＮＡ　ｐｕｅＩ　と４種のｄＮＴＰ全てを
用いて突出した配列を埋める様、処理した。このＤ　Ｎ
　Ａ　ＩＢ製物をＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化し、フラグメ
ント（９〕を含むベクターを単離した。次いで、ベクタ
ーフラグメント（９）を、上で単離した１８０ｂＰｓＴ
ｉｉソゲナル含？４’ＤＮＡフラグメント（７ンにライ
ゲートした。このライゲーション混合物を用いて、大腸
菌２９４をアンピシリン耐性に形質転換した。アンピシ
リン耐性コロニーから、プラスミドを単離し、Ｓ　Ｔ　
ＩＩリーダー（１０）と命名した。このプラスミドは、
ｔｒｐ　　プロモーターのコントロール下にある　Ｓ　
’［７ＩＩシグナル配列と成熟Ｓ　Ｔ　Ｈの暗号遺伝子
の一部とを含有している。以下の実施例では、Ｌ　ｒ　
ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　　シグナル配列り下流（こ、成熟
ｂ　Ｇ　ＨをコードしているＤＮＡ配列を機能的にライ
ゲートした。

実施例３　　ｈｃｉ−ｉのための、発現お・よび分泌プ
ラスミドの組立て この組立て方法番こついては、第２　Ｃ−２ｄ図を参照
されたい。Ｓ　Ｔ　ＩＩリーダー（１０）をＢｇｚｕで
消化し、次いで、ｐａｌ　Ｉと４種のＮＴＰ全てを用い
て突出した末端を埋め、ＢａｍＨＩ消化］こ付した。

ベクターａＷフラグメント（１１〕を単離した。実施例
２で（等だプラスミドｐｉ−ＩＧＨ２０７−１をＥｃ。

１ζｌて消化し、ＤＮＡｐｏＪＩと４種のＮＴＰ全てを
用いて突出した末端を埋め、次いで、Ｂａｍ１−１１消
化に付した。このＢａｍＨＩ消化により、約９２０ｂＰ
のｈＧＨ遺伝子含有フラグメント（１２）を単離した。

これらの２個のフラグメントをライゲートし、得られた
ＤＮＡ混合物を用いて大腸菌２９４をテトラサイクリン
耐性に形質転換した。

耐性を示す大腸菌コロニーからプラスミドを単離し　ｐ
ｔｒｐｓ　Ｔ　ＩＩ−［−１ＧＨ−融合（１３）と命名
した。

このプラスミドはまだ、Ｓ　Ｔ　ＩＩリーダーペプチド
配列とＩＩ　Ｇ　）Ｉ　構造遺伝子との間にＳＴＩＩ成
熟タンパク質の一部をコードしている余分なヌクレオチ
ドを含有している。これらのヌクレオチドを、Ｍ１３部
位特異的突然変異変異法で欠失させた［ＩＪ。

Ｐ、アデルマ７　（Ｊ　、Ｐ、　Ａｄｅｌｍａｎ）ら、
１９８３、ＤＮＡ、２：１８３−１９３１゜ ｐＬｒｐ　Ｓ　Ｔ　Ｉｆ　　Ｉ−１Ｇ　Ｈ融合（１３）
から得り遺伝子を一本領ファージＭ１３ｍＰ１０に挿入
した（Ｊ。

メツソングらおよびＪ、アデルマンら、共（こ前掲）。

Ｍ１３突然変異誘発ファージおよび大腸菌株は市販品か
ら入手可能である。突然変異の誘発；こは。

まずプラスミド（１３）をＸｂａ　ＩとＢａｍＨＩで消
化し、フラグメント（１４）を回収した。また、〜１１
３ｍｐｌｏはＸｌ）ａｌとＢ　ａｍ　ＨＩ　で消化し、
ファージフラグメント（図示せず〕を単離した。フラグ
メント（１４）をファージフラグメントにライゲートし
、得られたライゲーション混合物を用いてＪ　Ｍｌｏｌ
を形質転換した。形質転換された培養物をプレート（平
板培＆）シ、インキュベートした。

フラグメント（１４）を有するファージは、大腸菌色素
原インジケーターローン中で、青色のプラークです＜、
澄明なプラークとして同定された。それに相当するファ
ージを大腸菌ＪＭＩＯＩ上で増殖させ、培養物を遠心し
た。一本領ファージ（１５）は上清中に存在していた。

一本領ファージ（１５）ＤＮＡを調製し、合成オリゴヌ
クレオチドプライマー５’ｐＣＡＡＡＴＧＣ（、ＴＡＴ
ＧＣＡＴＴＣＣＣ品σＡＴＡＣＣニーＯＨ３’と７　ニ
ー　ルＬ、ＤＮＡ　Ｏｏｌ　Ｉ　ト４種０ＮＴＰ　トラ
用いてプライマーを延長して二本鎖ＤＮＡ（これらの鎖
の内、一本は、欠失を有している）を得、Ｔ４リガーゼ
処理に付し、抽出して大腸菌ＪＭＩ　Ｏｌの形質転換に
用いた（Ｊ、アデルマン、前掲）。

上記プライマーの前方の１４ヌクレオチドはＳＴＩＩシ
グナルの３′末端の暗号配列であり、後方の１４ヌクレ
オチドは成熟ｈＧＨ遺伝子の５′末端の暗号配列である
ことに注目されたい。形質転換されたＪ〜１１０１の絹
胞内各物から二本鎖ファージを得、平板培養した大腸菌
ＪＭＩ　０１に形質導入し、転移フイノＣ−ター印象を
平板からとり、プライマーと同じ１）　Ｎ　Ａ配列を有
する５’−３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを用いたサ
ザーン分析法により、フィルター上で、欠失を含んでい
る二本鎖ファージを同定した。二本９．１）　Ｎ　Ａ　
（１７）は、欠失のある遺伝子を含有しているＭ１３ｍ
ｐｌＯにより感染させた大腸菌から調製した。このＤＮ
ＡをＸｂａｌとＢａｍＨＩ　　で消化し、ＤＮＡフラグ
メント（１７）を単離した。これを、ｐ）ＩＧＨ２０７
−１を回帰に消化し、単離したフラグメン）　（１８）
の存在下でライゲートした。このライゲーション混合物
を用いて大腸菌２９４をテトラサイクリン耐性に形質転
換した。プラスミドｌ）　Ｌ　ｒ　ｐ　Ｓ　Ｔ　ＩＩ−
［−Ｉ　Ｇ　ｆ−Ｉ　（１９）を回収し、そのヌクレオ
チド配列を決定した。このプラスミドの詳しい制限地図
を第３図に示す。このプラスミドのｈ　Ｇ　Ｈ遺伝子近
辺のＤＮＡ配列を第３ａ図に示す。

実施例４ｈＣ，）Ｉの発現と分泌 実施例３で得たプラスミド（１９）を用い、搬信培養法
でｈ　Ｇ　１．１を合成した。プラスミド（１９）で大
腸菌２９４を形質転換し、５０または１２５ｄの振盪フ
ラスコ内３こ入れたテトラサイクリン５μ’ｊ、／ｒｎ
ｅ含有ＬＢ培地１０　２０ｍ１に接種した。このフラス
コを、それ以上培地を加えることなく、３７℃で１２−
２４時間培養し、次いで、遠心して細胞を回収した。超
音波処理した細胞のラジオイムノアッセイにより、全細
胞中のｈＧＨを測定した。

分泌されたｈ　Ｇ　Ｈを浸透圧ショック法によって回収
し、５Ｏ５−ＰＡＧＥおよびＮ−末端アミノ酸の末端配
列決定に基づいて、これが成熟ｈＧＨであることを確認
した。回収量は、ｔｒｐプロモーターのコントロール下
にあるヒトｈＧＨシグナルを用いて発現させた場合の約
１０倍であった。

実施例５　　ＡＰプロモーターおよびシグナル配列のコ
ントロール下でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現、分
泌するためのプラスミドｐＡＰ−１の組立て この組立て方法は第４ａ−４ｃ６に示されている。ＡＰ
遺伝子の一部を含有しているＤＮＡフラグメントをプラ
スミドｐ　Ｈ１−１（２０）から単離した〔イノウニ、
Ｈｏら、ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ、１４６
　：６６８−６７５（１９８１〕〕。これは、ＡＰ遺伝
子およびプロモーター配列の５′側に１ｉｃｏＲｆ部位
を導入するための数段階の工程を用いて行った。プラス
ミド（２ｏ）をＩＩｐａＩで消化した後、２個のＥｃｏ
ＲＩｉｌＳ位を直列に含んでいるリンカ−分子にライゲ
ートした。リガーゼ酵素を熱的に不活化した後、ＤＮＡ
をＥｃｏＲＩて消化し、１２００ｂＰの７ラグメントを
単離したつ次いで、このｌ）　Ｎ　Ａフラグメントを１
−１ｐａ■　で処理し、４６４　ｂｐフラグメント（２
１）を単離した。

ヒト成長ホルモンｍＲＮ　Ａ　　から調製されたｃ　Ｄ
ＮＡを含有しているプラスミド（２２）の組立ては、マ
ーシャルら［Ｍａｒｔｉａｌ　ｅｔ、ａｌ、、サイエン
ス２０５．６０２−６０６（１９７９）］およびロスケ
ムらＣＲｏｓｋｅｍ　ｅｔ、ａｌ、、　ヌクレイ’７　
り・７シツズ・リサーチ、７　：　３０５−３２０（１
９７９）］の方法によった（欧州特許公開第１２７３０
５号をも参照）。プラスミド（２２）をＨｐａＩＩ　で
消化し、４６１　ｂｐフラグメントを単離した。この４
６１ｂｐフラグメントをさらにＰｓｔｌで消化し、次い
で、ｈＧＨ遺伝子の一部を含有している２００ｂｐフラ
グメント（２３）を単離した。ＤＮＡフラグメン）　（
２１）とＤＮＡフラグメント（２３）とを、ｐＢＲ３２
２のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＰｓｔｌ　　消化により単
ｍした３６０９ｂｐＤＮＡフラグメントにライゲートし
た。このＤＮＡライゲーション混合物を用いて大腸菌２
９４をテトラサイクリン耐性に形質転換した。形質転換
体コロニーからプラスミド（財）を単離し、ｐ　ｃ）Ｉ
ＧＩ−１ｐｐ　ｓと命名した。

プラスミド（２４〕内では、ＡＰプロモーターの暗号遺
伝子と、ｐ　ｃＨＧＨｐ　ｐ　ｓ内のシグナル配列とが
同じ解読フレーム内で、ｈ　Ｇ　Ｉ−Ｉに結合している
。

しかしながら、シグナル配列と成熟ｈＧＨ遺伝子の開始
位置との間には多数の余分なヌクレオチド７Ｑ在してい
る。この余分なヌクレオチド配列を、突然変異誘発によ
り、欠失させた。即ち、ｐｃＨＧＨｐ　ｐ　ｓ　　をＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＰｓｔｌ　　消化に付し、６６３
　ｂｐフラグメント（２５）を単離した。フラグメント
（２５）を、Ｐｓｔ　Ｉ　　およびＥｃｏＲｌで消化し
ておいたＭ１３ｍｐ９　　に導入した。これをライゲー
トし、大腸菌ＪＭＩＯＩの形質転換に用いた。

ひ明なプラークを選択し、誘導体ファージ（２６）、Ｍ
１３ｍｐ９−ｃＨＧＨｐｐｓを同定し、単離した。ファ
ージ（２６）を合成オリゴヌクレオチドプライマー５１
ＰＣＴＴＣＴＩＣＡＣ：ＡＡＡＡＧにσ［ＣＣＣＡ／〜
ＧＧＡＴｒＣＣ−ＯＨ７＋Ｃアニーリングした。このプ
ライマーの最初の１４ヌクレオチドはＡＰシグナルペプ
チドの３′末端の配列に対応し、後方の１４ヌクレオチ
ドは成熟ｈ　Ｇ　Ｈ暗号配列の５′末端に対応している
。実施例３で示した如くにして（Ｊ、アデルマンら、前
掲をも参照）、部位特異的、欠失性突然変異誘発を行っ
た。所望の欠失を含むプラークを、この実施例に示した
５’−３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプライマーを用
いたサザーン分析法により、検出した。所望の遺伝型の
ための強化をすることなしに、スクリーンしたプラーク
の９チが標識プライマーとハイブリダイズした。陽性な
プラークの１つ、ファージＭｌ　３ｍｐ９−ＡＰ−１（
２７）は、ジデオキシ鎖末端スクレオチド配列決定法に
基づき、予測される配列を有していることが確認された
。次いで、ＡＰプロモーターおよびシグナル遺伝子と正
しく融合している部分的ｈＧＨ遺伝子を、ｐＨＧ１−１
２０７（２８）　（ｆ（、ド、ボエアら、前掲）に導入
した。即ち、ｐＨＧ１１２０７をＩ’ｓＬＩおよびＮｄ
ｃｌ消化に付し、次いで、２７５０ｂρフラグメントを
単離した。もう一つのｐ　Ｉ−ＩＧＩ−１２０７標本を
ＮｄｅｌおよびＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化番こ例し、２０６
４１）　Ｐ　　フラグメントを単離した。

Ｍｌ　：３ｍＰ９−ＡＰ−１７７−ジをＥｃｏＲＩおよ
びＰｓｔ■て消化し、６０２ｂｐ　ＡＰ　　ｈＧ［−１
部分遺伝子（２９）を単離した。上記の２７５０ｂｐ　
　フラグメントｐ と２０６４フラグメントとを、フラグメント（２９）△ との３成分ライゲーションでライゲートし、得られたラ
イゲーンヨン混合物を用いて大腸菌２９４をアンピンリ
ン耐性）こ形質転換した。耐性コロニーからｐＡＰ　−
１を単離し、制限酵素マツピング法およびヌクレオチド
配列決定法によって特性化した。

実施例６　　Ａ　Ｐ　７’ロモーターのコントロール下
でｈ　Ｇ　Ｉ−Ｉを発現、分泌させるためのプラスミド
（ｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ　Ｈ）の組立
てｐｔｒｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ｈ　ＧＨ（実施例３で
調製）をＨＩ）ａｌおよびＥｃｏＲＩ消化に付し、ベク
ターフラグメント（３１）を単離した。プラスミドＰＡ
Ｐ−１をＥｃｏＲ１消化し、１Ｌｓａｌ　　で部分消化
して４２０１）ＰのＡＰプロモーターフラグメント（３
２）を単離した。フラグメント（３１）と（３２）をラ
イゲートし、これを用いて大腸菌２９４をアンピンリン
耐性（こ形質転換した。プラスミドｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　
Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ１１を単離し、制限酵素マツピング
法およびヌクレオチド配列決定法）こよって特性化した
。ＡＰ−５Ｔｌｌ−ｈＧＨ組立て物のヌクレオチド配列
および翻訳されたアミノ酸配列を第５図に示す。

実施例７　プラスミドｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−
ｈ　Ｇ　Ｈを含有している大腸菌からのｈＧＨの回収大
腸菌Ｗ３１１０および２９４を２それぞれ、ｐ　Ａ　Ｐ
　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ　Ｈまたはｐ　Ａ　Ｐ　−
１で形質培 転換し、りん酸欠損則を用いる外は実施例４と同△ 様にして培養した。実施例４に記載した如くにして、ｈ
ＧＨの合成量、並び］こプロセシングされたｈＧＨとさ
れていないｈＧＨの分布状況を決定した。結果は表１に
示した通りである。表１から分る様に、容量が少い場合
ｔコは、ｐｔｒｐ−５Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ　ＬＩの方が
良好な結果をもたらすが、培養容量が１０ｅの場合には
、ｔｒｐ　　てプロモートされた生物よりも、ＡＰでプ
ロモートされた細胞の方が高衝度に増殖し得るので、プ
ラスミドｐ　Ａ　Ｐ　−ＳＴ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ１−１ノ
方カ好マシイ。

実施例８　犬規漠発酵およびｈ　Ｇ　Ｈの回収１０ｅで
の発酵の開始８時間前に５００ゴの接「ｌπ培養を増殖
させる。ｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ　Ｈを
含有している大腸菌Ｗ３１１０形質転換体（（ＯｎＡ　
、　ｐｈｏ　Ａ　−ｐｈｏ　Ｔ−実施例９で調製）を、
滅菌した２ｅのフラスコに入れた。テトラサイクリン０
．５１１１　／　ｒｎｅを含むＬＢ培地５００ｉｅに接
種した。この培養物をロータリー・シェーカー内で３７
℃において８時間インキュベートした。以下の成分を含
有する滅菌した１０Ｉ！の発酵培地を調製した：　Ｋ２
１１Ｐ０４２６！ｉ’、ＮａＦＩ２Ｐ０４・２■］２０
１３！　、ＫＣｅ１５Ｌ　（ＮＨ４）２５ｏ４５０’ｌ
、　クエン酸ナトリウム１０ｇ、５０％グルコース５０
ｍＪ、１０％ＮＺ　−７ミ７Ｙ−ｒ　１０１００Ｏ，１
ＭＭｇＳＯ４１００ｍｅ、２．７％Ｆ　ｅ　に　Ｉ！３
５ｍｇ、微量金属５ｍｅ、５ｍＶＬｅテトラサイクリン
１ｆｆｉｅ、消泡剤５ｒｎ／’および水６５１０培地の
開始ｐ　Ｈを、　ｆ−Ｔ２ｓ０４　を滴丁して加えるこ
とにより７．５に調節し、１０／の発酵装置（ファーメ
ンタ−）に接種培養物５００ｒｎｅを播き。

実験作業を開始した。実験中、温度を３７℃に維持し、
通気下で培養物を撹拌した。外部装置から、流速０．５
　ａｅ　７分で、細胞にグルコース（５０％）を与えた
。００５５０が１０−２５に達したら、Ｐ　Ｈ＝　７．
’５　、残留グルコースレベル＜　１／４　（％）番こ
なる様、グルコースの投与速度を、、１６１節した。０
Ｄ５５０が２５に達したならば、グルコース投与速度を
調節してｄＯ□レベルを３０１こし、それ以後は、ｄ　
Ｏ２レベルを３０％に維持する様、グルコースの投与速
度を定期的に調節した。発酵開始から３６時間後に細胞
を役し、収穫した。グルコースの供給と通気は止めたか
、撹拌（速度６５０ｒｐｍ）は維持した。ファーメンタ
−に、直ぐ（こ１−ブタノールを加えて終濃度を１，５
％１こし、即座に、ファーメンタ−ジャケット内へ蒸気
を樽き入れ、タンク内の温度を素早く５０℃に昇温した
。

温度か５０℃番こ達したら、この温度のまま、１０分間
、碓持した。次いで、ファーメンタ−を２０℃以下に急
冷し、ファーメンタ−内の；’ｌ（０胞内容物を遠心し
て収穫した。まず、細胞ペーストを一２０℃で冷凍して
から、−８０℃のフリーザーに移したつ −８０”Ｃで凍結されている細胞ペーストを、４゛Ｃて
一夜解凍し、以後の工程を４℃で行った。このペースト
を４倍量の１０ｍ〜■トリスーＨＣＪ（ｐ　Ｉ−１＝　
８．０　）と＞１　合し、ウルトラータレックス（Ｕｌ
　ｔ　ｒａ−Ｔｕｒｒｅｘ）ホモジナイザー中で３０秒
間。

懸濁した。この懸濁液を３０秒間撹拌した後、ｉｚ、ｏ
ｏｏｘｙで３０分間遠心することにより、細胞を除去し
た。上清中のペリプラズムタンパク質は、０．５〜１　
ｆＩ／７？／／１００（０１）５５０）の成熟ｈＧＨを
含んており、全ｈＧＨの約９５チがプロセシングされて
ペリプラズムに含有されていた（ベルオキシターゼー結
合抗ｈＧＨを用いたイムノプロット（免疫プロッティン
グ法〕により見積った。全細胞１ｈＧＨの約５０−６０
％を上清中に回収した。この上清に含まれるタンパク質
重用の約２０チはｈＧＨであった。

実施例９　宿主生物Ｗ：３１１０　　ｔｏｎＡ、Ｉ）＋
１０　Ａ。

ｐｈｏ　Ｔ　　の組立て 発酵のための宿主生物（よ、Ｐｌから導かれたファージ
を用いた。形質尋人を含む標準的な手法により、いくつ
かの工程で組立てたＣＪ、−、ラー（Ｊ。

Ｍｉｌｌｅｒ）、エクスペリメンタ・イン・モレキュラ
ー〇ジエネテツクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　
Ｍｏ１ｅｃ−ｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）］、ｐｈｏ
　Ｔおよびｐｈｏ　Ａ突然変異を、遺伝的に結合した抗
生物質耐性トランスポゾンを利用して、順次、大腸菌か
らＷ３１１０ｔｏｎＡ株に、共形質導入（コトランスジ
ュース〕した。最初に導入されたｐｈｏ　Ｔ　　突然変
異の存在は、これらの形質導入体が高ホスフェート、ホ
スホクロモゲン−含有プレート（５−７”コモ−４−ク
ロロ−３−インドイル−ホスフェート）上で青色のコロ
ニーを形成するととｌこより、確認された。ｐｈｏ　Ａ
　突然変異の導入は、その形質導入体が、低ホスフェー
ト、ホスホクロモゲン上で白色のコロニーを形成するこ
とにより確認されたっこのｐｈｏＴ突然変異体、または
同様にして組立てられたｐｈｏＲ突然変異体をｐ　Ａ　
Ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ｈ　Ｇ　［１て形質転換すると
、それらは、発酵の全過程を通じて、全ｈＧＨの９０％
以上をペリプラズム間隙（こ分泌する。池方、　Ｗ３　
ｉ　ｉ　ｏの様な、弁組、峨的な細菌は、ペリプラズム
に約５０チのｈＧＨＬか分泌せず、また、いくつかの例
では全ｈＧＨの発現レベルも幾分低かった。ｐｈｏ　Ａ
突然変異体の存在または不存在は、ヘテロローがスなタ
ンパク質の収量に、殆んど、または全く変化をもたらさ
なかった。しかしながら、ｐｈｏＡ　突然変異体はＡＰ
を分泌しないので、ｐｈｏＡ　突然変異体からペリプラ
ズム性ｈＧＨを精製する工程において、ＡＰの分離が必
要でない。

【図面の簡単な説明】

第１図はＳ　Ｔ　ＩＩ遺伝子の翻訳および非翻訳領域を
含めたヌクレオチド配列および、推定のアミノ酸配列の
模式図、第２ａ〜２ｄ図はプラスミドｐｔｒｐ−５−目
１−ｈＧＩＩの組立て模式図、第弘図はプラスミドｐｔ
ｒｐ　−Ｓ　’ｌ’　１１−　ｈ　Ｇ　［１の制限サイ
トおよび機能地図の模式図、第３ａ図はプラスミドｐｔ
ｒｐ　−ＳＴＩＩ−ｈＧ［ｌのｈＧＩＩ遺伝子の近辺Ｄ
ヌクレオチド配列を示す模式図、第４ａ−４ｃ図はプラ
スミドｐＡＰｌおよびｐ　Ａ　Ｐ　−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−
ｈＧＨの、組立て模式図、第５図はプラスミドｐ　ＡＰ
−Ｓ　Ｔ　ＩＩ　−ＩＩＧ　［１の、Ａ　Ｉ）プロモー
ター領域、Ｓ　Ｔ　ＩＩシグナルおよびｈ　ｃ　トを遺
伝子部分のヌクレオチド配列を示す模式図、第６図はｐ
ＡＰ−１のＡＩ’プロモーター領域、ＡＰシグナルおよ
びｈ　ＧＩ］遺伝子部分のヌクレオチド配列を示す模式
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ニワトリのトリオース・ホスフェート以外の成熟真
   核性タンパク質をコードしているＤＮＡの５′末端と、
   ３′末端で機能的に結合している細菌性分泌シグナル配
   列をコードしているＤＮＡ。 ２、成熟タンパク質が哺乳類のタンパク質である第１項
   記載の組成物。 ３、シグナル配列が大腸菌由来のシグナル配列である第
   １項記載の組成物。 ４、シグナル配列がエンテロトキシン・シグナル配列で
   ある第３項記載の組成物。 ５、タンパク質がｈＧＨ、ウシ成長ホルモンまたはブタ
   成長ホルモンである第２項記載の組成物。 ６、シグナル配列がＡＰシグナルである第２項記載の組
   成物。 ７、シグナル配列がβ−ラクタマーゼ以外のものである
   第２項記載の組成物。 ８、エンテロトキシンシグナルをコードしているＤＮＡ
   配列と機能的に結合した、少くとも、成熟ｈＧＨのアミ
   ノ末端配列を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
   配列。 ９、エンテロトキシンシグナルがＳＴIIシグナルである
   第８項記載の配列。 １０、第１項記載の組成物であつて、ＤＮＡが複製可能
   なベクターに機能的にライゲートされており、該ベクタ
   ーの５′側から３′側に向つて、ＤＮＡの転写をコント
   ロールするプロモーター、シヤインダルガノ配列、該Ｄ
   ＮＡおよび終止コドンを含む末端領域がこの順に、該ベ
   クターに含有されていることを特徴とする組成物。 １１、原核性宿主のペリプラズム間隙に成熟真核性タン
   パク質を分泌させる方法であつて、 ａ）分泌可能な直結ハイブリッドを発現するためのベク
   ターであつて、原核性分泌シグナルをコードしているＤ
   ＮＡの３′末端と、成熟真核性タンパク質をコードして
   いるＤＮＡの５′末端とが結合してなる、組成物を含む
   ベクターを組立て；ｂ）ａ）のベクターで宿主細胞を形
   質転換し；ｃ）ｂ）で形質転換された宿主細胞を培養し
   ；次いで、 ｄ）宿主のペリプラズムに成熟タンパク質を蓄積させる
   ことからなる方法。 １２、ａ）エンテロトキシンシグナルをコードしている
   ＤＮＡ配列と機能的にライゲートした、少くとも成熟ｈ
   ＧＨのアミノ末端を有するタンパク質をコードしている
   ＤＮＡを含有するベクターを組立て； ｂ）このベクターで宿主細胞を形質転換し；ｃ）形質転
   換された宿主細胞を培養し；そして、ｄ）該細胞のペリ
   プラズムからタンパク質を回収することからなる方法。 １３、エンテロトキシンシグナルをコードしているＤＮ
   ＡがＳＴIIシグナルをコードしており、かつ、ＳＴIIシ
   ヤイン−ダルガノ配列と機能的に結合していることを特
   徴とする第１２項記載の方法。 １４、ａ）成熟真核性タンパク質、およびｂ）成熟真核
   性タンパク質と原核性分泌シグナル配列との直結ハイブ
   リッド融合タンパク質とを含有する原核性細胞培養物で
   あつて、該成熟タンパク質が細胞のペリプラズムに存在
   していることを特徴とする細胞培養物。 １５、成熟タンパク質と融合タンパク質の総重量の２５
   ％以上が細胞のペリプラズムに存在する成熟タンパク質
   である第１４項記載の培養物。 １６、成熟タンパク質と融合タンパク質との総重量が、
   ５５０ｎｍにおける培養物の光学的密度を１としたとき
   、培養物中に約２ｍｇ／ｌ以上含まれており、しかも、
   成熟タンパク質の５０重量％以上がペリプラズムに存在
   していることを特徴とする第１４項記載の培養物。 １７、成熟タンパク質と融合タンパク質との総重量が、
   ５５０ｎｍにおける培養物の光学的密度を１としたとき
   、培養物中に約４ｍｇ／ｌ以上含まれており、しかも、
   成熟タンパク質の約８０重量％以上がペリプラズムに存
   在していることを特徴とする第１４項記載の培養物。 １８、タンパク質が成熟ｈＧＨである第１４項記載の培
   養物。 １９、エントロトキシンシグナルのカルボキシ末端と成
   熟真核性タンパク質のアミノ末端とが融合しているタン
   パク質。 ２０、ＳＴII遺伝子内に見い出される配列以外の配列で
   両側を囲まれていることを特徴とする式：５′ＧＡＧＧ
   ＴＧＡＴＴＴＴＡＴＧ３′ で示されるＤＮＡ配列。 ２１、５′末端がＳＴIIプロモーター以外のプロモータ
   ーとライゲートしており、３′末端が所望のタンパク質
   をコードしているＤＮＡ配列とライゲートしていること
   を特徴とする第２０項記載の配列。 ２２、所望のタンパク質をコードしているＤＮＡが、真
   核性プレタンパク質をコードしているＤＮＡである第２
   １項記載の配列。 ２３、成熟エンテロトキシンタンパク質をコードしてい
   るＤＮＡまたはそのフラグメントを含まない、エントロ
   トキシンシグナルペプチドをコードしているＤＮＡから
   なるＤＮＡ配列。 ２４、エンテロトキシンプロモーターＤＮＡを含まない
   エンテロトキシンシグナルポリペプチドをコードしてい
   るＤＮＡからなるＤＮＡ配列。 ２５、真核性タンパク質を分泌する様、形質転換された
   細菌細胞のペリプラズム間隙からタンパク質を回収する
   方法であつて、 ａ）細胞を凍結し； ｂ）細胞を解凍し；そして、 ｃ）真核性タンパク質を含むペリプラズムタンパク質を
   、細胞の残余部分から分離することからなる方法。 ２６、工程ａ）の前に細胞を殺すことを含む第２５項記
   載の方法。 ２７、細胞を、 ａ）アルカノールと接触させ；そして、 ｂ）加熱することにより、殺すことを含む、第２６項記
   載の方法。 ２８、細胞を約３５℃〜５５℃で約０．５〜２０分間加
   熱することを含む第２７項記載の方法。 ２９、細胞の水性懸濁液に、アルカノールを、アルカノ
   ール濃度が０．５〜１０容量％に達するまで混合するこ
   とを含む第２７項記載の方法。 ３０、細胞が大腸菌であり、タンパク質が成熟ｈＧＨで
   ある第２５項記載の方法。 ３１、細菌細胞からペリプラズムタンパク質を回収する
   方法であつて、 ａ）細胞を殺し； ｂ）約２０℃以下に細胞を冷却し；そして、ｃ）細胞の
   残余成分からペリプラズムタンパク質を分離することか
   らなる方法。 ３２、細胞を凍結するのに充分な温度まで冷却すること
   を含む第３１項記載の方法。 ３３、細胞を、アルカノールと熱にさらすことによつて
   殺すことを含む第３１項記載の方法。 ３４、工程ｂ）における冷却の前に、細胞を高張性溶液
   に懸濁しておかないことを特徴とする第３１項記載の方
   法。 ３５、細胞が大腸菌であり、タンパク質が成熟ｈＧＨで
   ある第３１項記載の方法。 ３６、真核性タンパク質を分泌する様、形質転換された
   細菌細胞のペリプラズム間隙から真核性タンパク質を回
   収する方法であつて、 ａ）細胞を殺し； ｂ）タンパク質が細胞外へ通過し得る様、細胞の外層膜
   を透過性にし；そして、 ｃ）細胞の残余部分から、真核性タンパク質を含むペリ
   プラズムタンパク質を分離することからなる方法。 ３７、真核性タンパク質を分泌する様、形質転換された
   、ｐｈｏＡ突然変異体以外の細菌細胞のペリプラズム間
   隙からタンパク質を回収する方法であつて、 ａ）細胞をホスフェート−制限栄養培地中で培養し； ｂ）タンパク質が細胞外へ通過し得る様、細胞の外層膜
   を透過性にし；そして、 ｃ）細胞の残余部分から、真核性タンパク質を含むペリ
   プラズムタンパク質を分離することからなる方法。 ３８、細胞が、アルカリ性ホスファターゼプロモーター
   のコントロール下でタンパク質を誘導するために、ホス
   フェート欠乏状況を必要としない突然変異体である第３
   ７項記載の方法。 ３９、細胞を凍結する前に、該細胞をホスフェート制限
   培地で培養することを含む第２５項記載の方法。 ４０、培地中のホスフェート含有量が約１ｍＭ以下であ
   る第３９項記載の方法。 ４１、プロモーターのコントロール下でタンパク質を発
   現する、形質転換された宿主−ベクター系から成熟真核
   性タンパク質をペリプラズムに分泌させる方法であつて
   、そのプロモーターのコントロール下でタンパク質を発
   現させるための構成的な突然変異体を、宿主−ベクター
   系に用いることからなる改良方法。 ４２、プロモーターがアルカリ性ホスファターゼプロモ
   ーターであり、宿主がｐｈｏＴまたはｐｈｏＲ突然変異
   体である第４１項記載の方法。 ４３、突然変異体が、プロモーターを抑制するリプレッ
   サーの活性を不能にする突然変異体である第４１項記載
   の方法。 ４４、突然変異体がプロモーター突然変異体である第４
   １項記載の方法。 ４５、突然変異体が宿主突然変異体である第４１項記載
   の方法。 ４６、宿主が構成的なアルカリ性ホスファターゼ突然変
   異体である第４１項記載の方法。