KR20040088059A - 절두된 아그레카나제 분자 - Google Patents

절두된 아그레카나제 분자 Download PDF

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Abstract

절두된 아그레카나제 단백질 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 이를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 추가로, 천연 또는 본래의 아그레카나제에 비해 안정성 및 발현 수준의 증가를 초래하는 아미노산 돌연변이를 갖는 아그레카나제가 또한 기술되어 있다. 본 발명의 아그레카나제는 골관절염과 같은 질환의 치료를 위한 조성물의 개발에 특히 유용하다. 아그레카나제 효소의 억제제, 및 아그레칸의 분해를 특징으로 하는 상태를 치료하기 위한 당해 효소에 대한 항체를 개발하는 방법이 또한 기술된다.

Description

절두된 아그레카나제 분자{Truncated aggrecanase molecules}
관련 출원
본 출원은 전문이 본원에서 참조로 인용되는, 미국 가특허 출원 제60/354,592호의 우선권의 이점을 주장한다.
아그레칸은 관절연골의 주요 세포외 성분이다. 이는 연골에 이의 압축성 및 탄력성의 물리적 특성을 제공하는 프로테오글리칸이다. 아그레칸의 손실은 골관절염과 같은 관절 질환에 있어 관절 연골의 분해와 관련되어 왔다.
골관절염은 3천만명 이상의 미국인들이 앓고 있는 쇠약성 질병이다[참조:MacLean et al., J Rheumatol 25:2213-8 (1998)]. 골관절염은 관절 연골의 분해 및 이로 인한 만성 통증으로 인해 생활의 질을 심각하게 감소시킬 수 있다. 골관절염 과정의 초기의 중요한 특징은 세포외 매트릭스로부터 아그레칸의 손실이다[참조: Brandt and Mankin, Pathogenesis of Osteoarthritis, in Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA, at 1355-1373 (1993)]. 이로 인해서, 아그레칸의 당을 함유하는 상당 부분이 세포외 매트릭스로부터 손실됨으로써 연골의 생체역학적 특징이 결핍된다.
"아그레카나제"로서 명명되는 단백질분해 활성은 아그레칸의 분해를 초래함으로써 골관절염 및 염증성 관절 질환과 동반되는 연골 분해에서 역할을 하는 것으로 사료된다. 사람 골관절염성 연골에서 아그레칸의 분해를 초래하는 효소를 확인하고자 하는 연구가 수행되어 왔다. 아그레칸은 단백질분해 활성 민감성 구체사이(interglobular) 도메인, 이어서 글리코사미노글리칸 부착 영역 및 C-말단 구형 도메인 G3에 의해 분리된, 2개의 N-말단 구형 도메인, G1 및 G2를 함유한다. 2개 이상의 효소 분해 부위가 아그레칸의 구체사이 도메인 내에서 확인되었다. 아그레칸의 구체사이 도메인 내의 하나의 효소 분해 부위(Asn341- Phe342)는 몇가지 공지된 메탈로프로테아제에 의해 분해되는 것으로 관찰되었다[참조: Flannery et al., J Biol Chem 267:1008-14 (1992); Fosang et al., Biochemical J. 304:347-351 (1994)]. IL-1 유도된 연골 아그레칸 분해로 인한 아그레칸내의 제2 아그레칸 분해 부위(Glu373- Ala374)에서의 분해는 사람 윤활액에서 발견되는 아그레칸 단편을생성시킨다[참조: Sandy et al., J Clin Invest 69:1512-1516 (1992); Lohmander et al., Arthritis Rheum 36: 1214-1222 (1993); Sandy et al., J Biol Chem 266:8683-8685 (1991)]. (Glu373- Ala374)에서의 아그레칸 분해는 아그레카나제 활성에 기인하여 왔다[참조:Sandy et al., J Clin Invest 69: 1512-1516 (1992)]. 이러한 Glu373-Ala374분해 부위는 아그레카나제 분해 부위로서 지칭될 것이다.
최근에는, IL-1 자극된 연골에 의해 합성되며 Glu373-Ala374부위에서 아그레칸을 분해하는, "트롬보스폰딘 1형 모티프를 갖는 디스인테그린-유사 및 메탈로프로테아제"(ADAMTS) 계통내의 2가지 효소, 즉 아그레카나제-1(ADAMTS-4) 및 아그레카나제-2(ADAMTS-11)가 동정된 바 있다[참조: Tortorella et al., Science 284: 1664-6 (1999); Abbaszade et al, J Biol Chem 274: 23443-23450 (1999)]. 아그레카나제-1은 적어도 6개의 도메인; 시그널; 프로펩타이드; 촉매적; 디스인테그린; TSP 1형 모티프 및 C-말단을 포함한다. 아그레카나제-2는 또한 멀티도메인 단백질이다. 시그널 서열; 프로도메인; 메탈로프로테이나제 도메인; 디스인테그린 도메인 및 단백질 C-말단에서 TSP 모티프 및 TSP 서브모티프 사이의 스페이서 도메인 을 갖는 것으로 보고되어 있다. 일반적으로 TSP 도메인 및 스페이서 도메인이 기질 인식에 중요한 것으로 간주되고 있다. 구체적으로는 토토렐라(Tortorella) 등은 "[T]이 영역은 아그레칸 기질의 글리코사미노글리칸에 아그레카나제-1을 결합시키는 역할을 할 수 있을 것이다"라고 기재하고 있다[참조:Tortorella et al., Science 284: 1664-6 (1999)].
Glu373-Ala374결합에서 아그레칸을 분해할 수 있고 골관절염에서 아그레칸 분해에 기여할 수 있는 ADAMTS 계통의 기타 관련 효소가 있는 것으로 고려된다. 상기 효소들이 골관절염성 사람 관절 연골에 의해 합성될 수 있을 가능성이 있다. 그러나, 아그레카나제는 이들 분자의 안정성이 불량하고 일반적으로 발현 수준이 낮아 다량으로 분리하고 정제하는 것이 곤란했었기 때문에 아그레칸 분해와 관련되는 질환을 치료하기 위한 치료 요법 및 억제제의 개발이 곤란했었다. 따라서, 신규한 형태의 아그레카나제를 확인하고 더욱이 아그레카나제를 다량으로 분리하고 정제하는 방법을 개발하여 질환 상태에서의 이들의 역할을 조사하고 또한 아그레칸 분해와 관련된 질환을 치료하는 치료요법 및 조성물을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 절두된 아그레카나제 단백질 및 이의 변이체 및 단편; 본 발명의절두된 아그레카나제 효소 및 이의 단편 및 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 절두된 아그레카나제 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 절두된 아그레카나제는 생물학적으로 활성이고 이의 전체길이 대응물에 비해 안정성이 더 크고 발현 수준도 더 높다. 더 구체적으로는, 본 발명은 전체길이 아그레카나제-1 및 아그레카나제-2 효소 각각에 비해 안정성이 더 크고 발현 수준이 더 높은 절두된 아그레카나제-1 및 아그레카나제-2 효소; 본 발명의 아그레카나제-1 및 아그레카나제-2 및 이의 단편 및 변이체를 암호화하는 핵산 서열; 및 절두된 아그레카나제-1 및 아그레카나제-2 및 이의 단편 및 변이체를 제조하는 방법을 특징으로한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제는 하나 이상의 TSP 도메인이 결실된 아그레카나제를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제는 2개 이상의 TSP 도메인이 결실된 아그레카나제를 포함한다. 비록, 아그레카나제의 TSP 도메인이 기질 인식에 중요하다고 생각되어 왔고, 따라서, 인식하고후속적으로 아그레칸을 분해하는 아그레카나제의 능력 때문에, 본 발명의 아그레카나제 단백질은, 단백질 내의 1개 또는 둘다의 TSP 도메인의 결실에도 불구하고 생물학적으로 활성이다.
본 발명의 절두된 아그레카나제는 전체질이 아그레카나제 단백질에 비해 안정성이 더 크고 더 높은 수준으로 발현되기 때문에, 분리 및 정제를 용이하게 하고, 질환 치료용 치료요법 및 억제제의 개발에서의 본 발명의 아그레카나제 사용을 용이하게 한다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 치료요법 및 억제제 개발에 사용할 수 있는 정제된 절두된 아그레카나제를 다량으로 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 절두된 아그레카나제를 포함하는 조성물 및 골관절염을 포함하는 질환의 치료용 아그레카나제 억제제의 개발을 위한 이러한 조성물의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 효소 활성을 차단하는 아그레카나제 억제제을 확인하고 개발하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 효소에 대한 항체, 하나의 양태에서 예를 들어, 아그레카나제 활성을 차단하는 항체를 포함한다. 이러한 억제제 및 항체는 각종 검정 및 관절 연골의 분해를 특징으로 하는 상태 치료용 치료요법에서 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 억제제는 아그레카나제를 결합하는 펩타이드 분자이다.
본 발명은 전체길이 아그레카나제 단백질에 비해 안정성이 더 큰 생물학적으로 활성인 절두된 아그레카나제 분자의 아미노산 서열을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 TSP 도메인이 결실된 생물학적으로 활성인 절두된 아그레카나제-2 분자, 예를 들어, 치환 돌연변이체를 포함하여 아그레카나제 활성을 나타내는 서열 4의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 753번(Glu); 서열 6의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 752번(Pro); 및 서열 8의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 628번(Phe)의 아미노산 서열 및 이의 변이체 및 단편을 갖는 단백질을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 TSP 도메인이 결실된 절두된 아그레카나제-1 분자, 예를 들면, 치환 돌연변이체를 포함하여, 아그레카나제 활성을 나타내는 서열 13의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 520번(Ala)의 아미노산 서열 및 이의 변이체 및 단편을 갖는 아그레카나제-1 단백질을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 TSP 도메인이 결실된 생물학적으로 활성인 절두된 아그레카나제-2 분자; 예를 들면, 아그레카나제 활성을 나타내는, 서열 10(도 10)의 아미노산 1번 내지 아미노산 527번(His); 및 치환 돌연변이체를 포함하는, 이의 변이체 및 단편으로부터의 아미노산 서열을 갖는 아그레카나제-2 단백질을 특징으로 한다.
하나 또는 둘 다의 TSP 도메인 결실된 절두된 아그레카나제는 생물학적으로활성으로 전체길이 아그레카나제 효소보다 더 안정하다.
본 발명은 또한 본 발명의 절두된 아그레카나제을 암호화하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 예를 들면 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 분자를 암호화하는 핵산 분자는, 서열 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 3의 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 뉴클레오타이드 2259번(gaa) (도 3); 서열 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 5의 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 뉴클레오타이드 2256번(cct)(도 5); 서열 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 7의 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 뉴클레오타이드 1884번(도 7); 및 서열 10의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 9의 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 뉴클레오타이드 1701번(도 9)를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 분자를 암호화하는 서열 3, 5, 7 및 9의 단편 및 변이체; 중간 정도 내지 엄격한 조건하에 서열 3, 5, 7 또는 9의 뉴클레오타이드 서열 및 이의 단편 또는 변이체에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열; 천연 사람 대립유전자 서열; 및 본원에 기재된 아그레카나제-2 핵산 서열의 등가 변성 코돈 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 절두된 아그레카나제-1 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 예를 들면 서열 12 및 13(각각 도 23 및 도 24에 기재)의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드, 본 발명의 절두된 아그레카나제-1 분자를 암호화하는 핵산의 단편 및 변이체, 중간 정도 내지 엄격한 조건하에 본 발명의 절두된 아그레카나제-1 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들면 도 23 및 24에 기재된 핵산 서열 및 이의 단편 및 변이체에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열; 천연 사람 대립유전자 서열; 및 아그레카나제-1 핵산 서열의 등가 변성 코돈 서열을 포함한다. 전체길이 아그레카나제-1 분자는 수탁번호 NM_005099하에 GenBank에 있다(도 22). 따라서, 당업자는 당해 서열을 사용하여 서열 11에 기재된 전체길이 아그레카나제-1 분자를 생성시키거나 당해 서열의 일부를 사용하여 절두된 단백질, 예를 들면 도 12 또는 도 13에 기재된 아그레카나제 단백질을 생성시킬 수 있다. 예를 들면 공개된 NM_005099 서열의 뉴클레오타이드 407번 내지 뉴클레오타이드 2132번(도 23)(서열 32)을 사용하여 서열 12의 절두된 아그레카나제-1 단백질을 생성시킬 수 있다 유사하게, NM_005099 서열의 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 1967번(도 24)(서열 33)을 사용하여 도 13의 절두된 아그레카나제-1 단백질을 생성시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 전체길이 대응물에 비해 절두된 아그레카나제 분자의 안정성 및 발현 수준을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 아그레카나제 분자를 포함한다. 이들의 활성 부위에서 돌연변이를 갖는 아그레카나제는 아그레카나제의 억제제 합성에 특히 유용하다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 촉매적 도메인내에서 활성부위에서 아미노산 411에서의 돌연변이(E411-Q411 돌연변이)를 갖는 아그레카나제-2 분자를 특징으로 한다. E411-Q411 돌연변이를 갖는 아그레카나제-2 분자의 아미노산 서열은 도 21에 도시되어 있다(서열 30). 이들의 천연 대응물에 비해 아그레카나제 단백질의 안정성을 증가시키는 돌연변이는 절두된 것 뿐만 아니라 전체길이 아그레카나제 단백질 둘 다에서 이루어질 수 있다. 아그레카나제 분자의 안정성을 변경시키는 돌연변이는 아그레카나제 단백질의 촉매적 도메인내에서 또는 촉매적 도메인밖에서 이루어 질 수 있는 것으로 생각되어 진다. 이러한 돌연변이를 갖는 아그레카나제 단백질은 천연에서 발견될 수 있거나 인공적으로 합성할 수 있다. 당업자는 제공된 다수의 검정중의 하나에 의해 아그레카나제 분자의 안정성에 대한 돌연변이의 영향을 시험할 수 있다. 본 발명의 돌연변이는 예를 들면, 아미노산 치환 또는 변형을 포함한다. 본 발명의 아그레카나제에서의 아미노산 돌연변이는 돌연변이유발, 화학적 변형, 또는 폴리펩타이드를 제조하는데 사용되는 DNA 서열의 변형에 의해 일어날 수 있다.
아그레카나제-1 분자를 또한 촉매적 도메인에서 돌여변이를 포함하도록 제조하여 이들의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 도 17은, 절두된 아그레카나제-1 분자의 촉매적 도메인에 E에서 Q로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 플래그 태그된 절두된 아그레카나제-1 단백질을 특징으로 하는데, 이의 천연형 서열은 서열 12 및 13에 기재하였고, 이로써 서열 11에 기재된 전체길이 천연형 아그레카나제-1 단백질에 비해 아그레카나제-1 단백질의 안정성이 증가한다. 이들 아그레카나제는 아그레카나제의 신규한 억제제 확인 뿐만 아니라 개발에 특히 유용하다.
본 발명은 결실 또는 아미노산 치환 돌연변이가 본 발명의 아그레카나제에 필적할 만한 단백질의 영역에서 일어난, 결실 및/또는 치환 돌연변이를 갖는 절두된 및/또는 돌연변이체 아그레카나제 계통원 및 아그레카나제 유사 단백질을 추가의 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 생물학적으로 활성인 절두된 아그레카나제 폴리펩타이드을 암호화하는 본원에 기재된 핵산 서열의 변이체 및 등가 변성 코돈 서열을 포함한다. 또한, 중간 정도 내지 엄격한 조건하에 본 발명의 핵산, 대립유전자 변이체;및 본원에 기재된 핵산 분자의 치환 및 결실 돌연변이체에 하이브리드화하는 핵산 분자를 포함한다. 하나의 양태에서, 절두된 아그레카나제 및/또는 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 아그레카나제는 상응하는 전체길이 아그레카나제 단백질보다 더 안정하고 당해 전체길이 단백질보다 높은 수준에서 발현될 수 있다. 하나의 양태에서, 돌연변이는 돌연변이를 유발하는 본 발명의 아그레카나제를 암호화하는 핵산 분자에 도입되는데, 예를 들면 돌연변이를 함유하는 핵산에 의해 암호화된 단백질에서의 아미노산 치환이다. 이러한 돌연변이의 한 예는, 분자의 활성 부위에서 E에서 Q로의 돌연변이를 갖는 아그레카나제-2 단백질을 암호화하는 핵산 서열이다. 다른 양태에서, 본 발명은 촉매적 도메인에서 E에서 Q로의 돌연변이를 포함하여, 결국 전체길이 아그레카나제 1 및 2에 비해 안정성이 크고, 반감기가 길고 발현 수준이 높은 분자를 생성시킬 수 있게 하는, 아그레카나제-1 단백질을 암호화하는 아그레카나제-1 핵산 분자를 포함한다.
기타의 종이 본원에 기재된 사람 아그레카나제 효소와 유사하거나 동일한 DNA 서열을 갖는 것으로 예기된다. 따라서, 본 발명은 추가로, 사람을 제외한 종뿐만 아니라 사람으로부터, 이들의 생물학적 활성을 변경시키는 아미노산 치환을 갖는 절두된 아그레카나제 또는 아그레카나제 유사 분자 또는 아그레카나제를 암호화하는 기타의 핵산 분자를 수득하는 방법을 포함한다. 하나의 양태에서 본 발명의 아그레카나제를 암호화하는 핵산 서열을 분리하는 방법은 본원에 기재된 핵산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편, 예를 들면 서열 1 또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 3 또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 5 또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 7또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 9 또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 31 또는 이의 단편 또는 변이체; 서열 32 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 서열 33 또는 이의 단편 또는 변이체의 사용을 포함하여, 아그레카나제 활성이 있는 단백질/펩타이드를 암호화하는 유전자의 영역을 암호화하거나 기타 종으로부터의 상응하는 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브를 고안한다. 따라서, 본 발명은 사람 아그레카나제 서열 또는 이의 단편 또는 변이체에 동종이고, 본원에 기재된 DNA 서열 중의 하나 이상을 사용하여 수득될 수 있는 기타 종으로부터의 DNA 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 아그레카나제의 단편 또는 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 아그레카나제 단백질의 기능적 단편, 및 이러한 기능적 단편을 암호화하는 DNA 서열 뿐만 아니라 기타 관련 단백질의 기능적 단편을 또한 포함할 수 있다. 이러한 기능을 위한 단편의 능력은 아그레카나제 단백질 검정에 기재된 다수의 생물학적 검정중의 하나에서 단백질 검정에 의해 측정가능하다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 분리 절두된 아그레카나제를 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 사람 아그레카나제 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편은 예를 들면, 서열 3에 기재된 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2259번; 도 5에 기재된 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2256번; 도 7에 기재된 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 1884번; 및 도 9에 기재된 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 1701번의 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양시키고, 도 4에 기재된 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 753번(Glu); 도6에 기재된 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 752번(Pro); 및 도 8에 기재된 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 628번(Phe); 또는 도 10에 기재된 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 567번(His)으로부터의 아미노산 서열에 의해 특징지워지는 아그레카나제-2 단백질을 배양 배지로부터 회수하고 정제함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 절두된 아그레카나제-1 분자를 발현하는 핵산 서열; 예를 들면 도 23 및 24에 기재된 핵산을 사용하여 도 12 및 도 13에 기재된 절두된 아그레카나제-1 단백질 제조에 사용할 수 있고, 여기서 아그레카나제-1 단백질은 동시에 생성될 수 있는 기타의 단백질성 물질을 거의 함유하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제 단백질은 아그레카나제의 전체길이 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 절두된 아그레카나제 단백질을 회수함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 서열 4에 기재된 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 753번(Glu)을 포함하는 절두된 아그레카나제-2를 아그레카나제-2용 전체길이 핵산 분자, 예를 들면 서열 1에 기재된 핵산 분자로 형질전환된 세포를 배양 배지로부터 회수한다. 다른 양태에서, 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 752번(Pro)을 포함하는 절두된 아그레카나제-2를 전체길이 아그레카나제-2용 핵산 분자로 형질전환된 세포의 배양 배지로부터 회수한다. 서열 4의 절두된 아그레카나제 단백질은 서열 2, E753-G754에 기재된 전체길이 아그레카나제 단백질의 분해로부터 생성된 것이고 55kDa 단백질이다. 전체길이 아그레카나제-2 분자의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열 1 및 서열 2 각각(기탁 번호: NM_007038 및 NP_008969)(도 1A 내지 1C 및 도 2)에 기재되어 있다.
세포 배양 배지로부터 정제된 본 발명의 절두된 아그레카나제는 기타의 단백질성 물질을 거의 함유하지 않는다. 결실된 하나 이상의 TSP 도메인을 갖는 회수된 정제된 아그레카나제 단백질은 기술된 바와 같이, 아그레칸을 분해함으로써 단백질분해 활성 아그레카나제 활성을 일반적으로 나타낸다. 따라서, 본 발명의 절두된 단백질은 아그레칸-분해 분자의 존재하에 측정하는 검정에서 아그레칸 단백질 분해 활성을 나타내는 능력에 의해 추가로 특징지워질 수 있다. 이들 검정 또는 이의 개발은 당업자의 지식 내에 있다. 이러한 검정은 아그레칸 기질을 절두된 어크리카나제 분자와 접촉시키고 아그레칸 단편의 생성을 탐지함을 포함할 수 있다[참조: Hughes et al., Biochem J 305: 799-804(1995); Mercur etal., J. Bio Chem. 274; 32387-32395(1999)]. 포유 동물 세포에서의 제조용으로, 본 발명의 절두된 아그레카나제의 발현용으로 사용되는 DNA 서열은 추가로 아그레카나제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 프레임내에 5' 결합되어 있는, 적합한 프로펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 아그레카나제 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 이러한 항체는 아그레카나제 활성을 억제하거나 길항한다. 본 발명은 추가로, 예를 들면 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 13 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 절두된 아그레카나제 단백질의 사용을 포함하는 아그레카나제 활성의 억제제를 개발하고 확인하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 아그레카나제 활성의 억제제는아그레칸의 분해를 방지한다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 본 발명에 따른 항체와 하나 이상의 약제학적 담체를 포함하는, 아그레카나제의 단백질분해 활성을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물에게 아그레카나제 활성을 억제하기에 유효한 양의 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 당해 포유동물에서 아그레카나제 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 아그레카나제의 억제제를 확인하거나 개발하는 방법 및 이로써 제조된 억제제를 포함하는 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 억제제는 아그레카나제가 아그레칸 분자에 결합하는 것을 방지한다. 추가의 양태에서, 본 발명의 억제제는 아그레카나제에 의한 아그레칸의 분해를 방지한다.
당해 방법은 본 발명의 하나 이상의 아그레카나제 단백질을 하나 이상의 시험 샘플과 합하고 시험 샘플이 아그레카나제 단백질의 활성을 억제하는지를 측정함을 포함하는 검정에 기초하여 억제제를 확인할 수 있다. 시험 샘플은 공지되거나 미지의 샘플을 포함할 수 있고, 이러한 샘플은 펩타이드, 단백질, 화학적 화합물(종종 소분자로서 언급됨) 또는 항체일 수 있다. 이들은 개별적으로, 또는 뱃취로 , 예를 들어 라이브러리로부터, 선택될 수 있다. 당해 기술은 이러한 방법에 용이하게 사용될 수 있는 아그레카나제 활성 검정을 제공하는 것이다. 억제제의 검정은 아그레칸과 억제제의 혼합물을 아그레카나제 분자와 접촉한 다음, 아그레카나제 억제제를, 예를 들면 아그레카나제-감수성 부위에서 분해에 의해 생성된 아그레칸 단편의 탐지 및 측정에 의해 측정함을 포함할 수 있다.
본 방법은 또한 아그레카나제의 아미노산 서열 하나 이상 및 아그레카나제의 3차원 구조 및 임의의 아그레칸을 기본으로 한 결합 부위의 측정을 포함할 수 있다. 이 정보를 기본으로 하여, 당업자는, 결합 부위와의 예측된 구조 상호작용과 같은 구조상 분석을 기본으로 한 아그레카나제 활성을 억제할 수 있는 후보 분자를 개발 또는 확인할 수 있을 것이다. 하나의 양태에서, 이러한 분자는 펩타이드, 단백질, 화학적 화합물 또는 항체을 포함할 수 있다. 후보 분자는 논의한 바와 같이 아그레카나제 효소의 실제 억제 활성을 나중에 검정할 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 측면에서, 약제학적으로 허용되는 비히클중에 치료학적 유효량의 아그레카나제 억제제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
연골중의 아그레칸의 아그레카나제 매개된 분해는 골관절염 및 기타 염증 질환과 관련되어 있다. 따라서, 본 발명의 이들 조성물은 아그레카나제의 분해 및/또는 아그레카나제의 상향 조절을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 당해 조성물을 이들 상태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 아그레칸의 분해를 특징으로 하는 질환으로 고생하는 환자를 치료하거나 이러한 질환을 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명에 따라서, 이들 방법은이러한 치료가 필요한 환자에게 아그레카나제 효소의 단백질분해 활성을 억제하는 아그레카나제 억제제를 포함하는 치료학적 조성물을 투여를 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은 예를 들면 세포 군집에서 mRNA의 탐지를 위한 프로브로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 아그레카나제와 관련된 유전자 장애, 또는 아그레카나제가 불규칙적으로 전사되거나 발현되는 세포, 기관 또는 조직 장애를 포함하는 장애를 탐지하거나 진단하는 방법을 포함한다. DNA 서열은 또한 하기에 기재된 유전자 요법 적용을 위한 벡터를 제조하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 상기한 바와 같은 DNA 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 이들 벡터는, 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된, 아그레카나제 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 형질전환된 세포주를 적합한 배양 배지에서 배양하고 그로부터 아그레카나제 단백질을 회수하고 정제하는, 본 발명의 아그레카나제 단백질을 제조하는 신규한 방법에 사용할 수 있다. 당해 방법은 폴리펩타이드 발현을 위한 숙주세포로서 다수의 공지된 세포, 원핵 세포 및 진핵 세포 기원 둘 다를 사용할 수 있다. 벡터는 유전자 요법 적용에서 사용할 수 있다. 이러한 사용에서, 벡터를 생체외에서 환자의 세포로 형질감염될 수 있고, 이 세포를 환자에 재도입할 수 있다. 또는, 벡터는 표적 형질감염을 통해 생체내에서 환자에 도입될 수 있다.
본원의 추가의 양상은 부분적으로 하기 설명 부분에서 제시될 것이며 부분적으로 이러한 설명 부분으로부터 명백하거나 본 발명의 실시로부터 습득할 수 있다. 본 발명은 청구의 범위에 제시, 특히 교시되어 있으며, 그 내용은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다음의 상세한 설명은 본 발명의 다양한 양태의 예시적 설명을 포함하며, 이는 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는다. 첨부한 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 설명과 함께 양태를 도시하기 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명은 절두된 아그레카나제 분자, 이의 제조방법, 및 이들 분자를 사용하여 아그레카나제 효소에 대한 억제제를 개발하는 방법의 발견에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아그레카나제 효소에 대한 억제제 뿐만 아니라 아그레카나제 효소에 대한 항체에 관한 것이다. 이들 억제제 및 항체는 골관절염을 포함하는 각종 아그레카나제 관련 상태의 치료용으로 유용할 수 있다.
도 1A 내지 1C는 전체길이 아그레카나제-2/ADAMTS-5 분자의 뉴클레오타이드 서열(서열 1)을 도시한 것이다.
도 2는 서열 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2915번에 의해 암호화된 전체길이 아그레카나제-2/ADAMTS-5 분자(서열 2)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 3은 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 뉴클레오타이드 2959번(gaa)의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 뉴클레오타이드 서열(서열 3)을 도시한 것이다.
도 4는 서열 3에 기재된 뉴클레오타이드에 의해 암호된 아미노산 1번 내지 아미노산 753번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 서열(서열 4)을 도시한 것이다.
도 5는 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 뉴클레오타이드 2256번(cct)로의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2/ADAMT-5 단백질의 뉴클레오타이드 서열(서열 5)을 도시한 것이다.
도 6은 서열 5에 기재된 뉴클레오타이드에 의해 암호된 아미노산 1번 내지 아미노산 752번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 서열(서열 6)을 도시한 것이다.
도 7은 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 1884번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 분자의 뉴클레오타이드 서열(서열 7)을 도시한 것이다.
도 8은 서열 7에 기재된 뉴클레오타이드에 의해 암호된 아미노산 1번 내지 아미노산 628번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 서열(서열 8)을 도시한 것이다.
도 9는 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 1701번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 분자(서열 9)을 도시한 것이다.
도 10은 서열 9에 기재된 뉴클레오타이드에 의해 암호된 아미노산 1번 내지 아미노산 567번의 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 서열(서열 9)을 도시한 것이다.
도 11은 전체길이 아그레카나제-1 분자의 아미노산 서열(서열 11)을 도시한 것이다.
도 12는 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 575번(Pro)으로부터의 본 발명의 절두된 아그레카나제-1 분자의 아미노산 서열(서열 12)을 도시한 것이다.
도 13은 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 520번(Ala)으로부터의 본 발명의 절두된 아그레카나제-1 분자의 아미노산 서열(서열 13)을 도시한 것이다.
도 14는 펩타이드 링커 및 스트렙타비딘 태그를 포함하는 재조합 절두된 아그레카나제-2 단백질의 뉴클레오타이드 서열(서열 14)을 도시한 것이다.
도 15는 서열 14에 기재된 뉴클레오티드에 의해 암호화된 재조합 절두된 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 서열(서열 15)을 도시한 것이다.
도 16은 아그레카나제 ELISA 검정에 의해 탐지된 바와 같은 야생형(ADAMTS-5 WT) 또는 활성 부위 돌연변이체(ADAMTS-5 ASM)를 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지의 아그레카나제 활성을 도시한 것이다.
도 17은 촉매적 도메인에서 E에서 Q로의 돌연변이로 플래그 태그된 절두된 아그레카나제-1 분자의 도식적 설명을 도시한 것이다.
도 18은 스트렙타비딘 태그된 절두된 아그레카나제-2 분자의 도식적 설명을도시한 것이다.
도 19는 전체길이 아그레카나제-2 단백질과 비교된 절두된 아그레카나제-2 단백질의 발현을 갖는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 20은 3B3 ELISA 검정으로 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 분자에 의한아그레칸 분해를 도시한 것이다.
도 21은 아미노산 위치 411번에서 E에서 Q로의 돌연변이를 갖는 전체길이 ADAMTS-5 단백질에 대한 아미노산 서열(서열 30)을 도시한 것이다.
도 22A 및 도 22B는 전체길이 아그레카나제-1 분자를 암호화하는 핵산 서열(서열 31)을 도시한다.
도 23은 절두된 아그레카나제-1 분자, 예를 들면 도 12에 기재된 단백질을 암호화하는 핵산 서열(서열 32)을 도시한 것이다.
도 24는 절두된 아그레카나제-1 분자, 예를 들면 도 13에 기재된 단백질을 암호화하는 핵산 서열(서열 33)을 도시한 것이다.
I. 정의
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있기 위해서, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
"아그레카나제"란 용어는 아그레칸 단백질을 분해할 수 있는 폴리펩타이드 계통을 의미한다. 일반적으로, 이들은 Glu373-Ala374아그레카나제 분해 부위에서 아그레칸을 분해하는 단백질이다. 본 발명의 아그레카나제는 서열 11(아그레카나제-1) 및 서열 2(아그레카나제-2)의 아미노산 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "아그레카나제"란 용어는 서열 11 및 2에 제시된 아미노산 서열의 천연 변이체 뿐만 아니라, 제공되는 하나 이상의 검정에서 활성인 서열 11 및 2의 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 정의에는 서열 11 또는 2의 아미노산 또는 이의 단편과 실질적으로 유사하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 11 또는 2의 아미노산 서열 또는 이의 단편과 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상 동일한 아미노산 서열이 포함된다.
아그레카나제라는 용어는 추가로 기술되는 서열 31 및 1(아그레카나제-1 및 아그레카나제 2)의 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 이의 단편 및 변이체를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 핵산은 천연 아그레카나제 암호화 유전자로부터 유래되거나 천연 아그레카나제 암호화 유전자의 변이체인 서열 또는 이의 단편인 서열을 지닐 것이다.
"항체"란 용어는 면역글로불린 또는 이의 단편을 의미하며, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 용어에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일특이성 항체, 다특이성 항체, 비특이성 항체, 사람화 항체, 사람 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이된 항체, 이식된 항체 및 시험관내 생성된 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 달리 언급하지 않는 한, 상기 용어에는 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원 결합 작용을 유지하는 기타 항체 단편도 또한 포함된다.
"생물학적 활성"이란 용어는 아그레칸에 결합하는 아그레카나제 효소에 의해 방해되거나 개시되는 하나 이상의 세포 과정을 의미한다. 일반적으로, 활성은 아그레카나제에 의한 아그레칸의 단백질분해성 분해를 의미한다. 아그레카나제 활성으로는 아그레카나제의 아그레칸에의 결합 및 아그레카나제에 의한 아그레칸의 분해가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 활성은 아그레칸의 본 발명의 아그레칸에의 결합 및 본 발명의 아그레카나제에 의한 아그레칸의 분해로부터 야기되는 생물학적 반응을 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "결실"이란 용어는 아그레카나제의 전체길이 아미노산 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거이다. 용어 결실은 또한 아그레카나제을 암호화하는 핵산 서열로부터의 뉴클레오타이드의 제거를 언급하며, 이는 절두된 단백질을 암호화하는 핵산을 생성한다.
아그레카나제 또는 아그레카나제 단백질을 암호화하는 핵산 분자내에서의 결실은 원하는 핵산 분자 또는 단백질의 어느 부분에서도 이루어질 수 있다. 예를들면, 결실은 단백질, 예를 들면, N-말단, C-말단 또는 아그레카나제의 임의의 기타 부분의 어느 부분에서도 일어날 수 있는데, 예를 들면 약 1 내지 약 5개의 아미노산, 약 5 내지 약 10개의 아미노산, 약 10 내지 약 20개의 아미노산, 약 20 내지 약 30개의 아미노산, 약 30 내지 약 50개의 아미노산, 약 50 내지 약 100개의 아미노산, 약 100 내지 약 150개의 아미노산, 약 150 내지 약 200개의 아미노산, 약 200 내지 약 250개의 아미노산, 약 250 내지 약 300개의 아미노산, 약 300 내지 약 350개의 아미노산, 약 350 내지 약 400개의 아미노산, 약 400 내지 약 450개의 아미노산, 약 450 내지 약 500개의 아미노산, 또는 500초과의 아미노산으로부터의하나 이상의 아미노산의 제거를 포함할 수 있다.
결실은 본 발명의 아그레카나제를 암호화하는 핵산 분자에서 또한 이루어질 수 있는데; 예를 들면, 결실은 아그레카나제의 TSP 도메인용으로 암호화하는 핵산의 영역에서 이루어질 수 있다. 이러한 결실은 전형적으로 본 발명의 아그레카나제를 암호화하는 핵산 분자의 3' 영역을 포함한다. 그러나, 결실은 아그레카나제 분자를 발현하는 핵산에서의 어느 부분에서도 이루어질 수 있다. 당업자는 기술된 다수의 검정법중의 하나에서 활성에 대하여 본 발명의 절두된 아그레카나제를 시험할 수 있다.
본 발명의 따르는 아미노산 결실은 아그레카나제 단백질의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거를 포함한다. 다른 양태에서, 결실은 아그레카나제 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거를 포함한다. 또 다른 양태에서, 결실은 아그레카나제 분자의 N-말단과 C-말단사이에 있는 영역으로부터의아미노산의 게거를 포함한다. 하나의 양태에서, 이러한 결실은 본 발명의 아그레카나제의 전체 도메인의 제거를 포함한다. 예를 들면, 결실을 포함하는 본 발명의 아그레카나제는 결실된 하나의 TSP 도메인을 갖는 아그레카나제-1 분자 또는 결실된 2개의 TSP 도메인을 갖는 아그레카나제-1 분자, 또는 결실된 하나의 TSP 도메인을 갖는 아그레카나제-2 분자 또는 결실된 2개의 TSP 도메인을 갖는 아그레카나제-2 분자를 포함한다. 본 발명에 따른 아그레카나제는 아그레카나제 단백질내에서 모든 TSP 도메인의 결실을 포함할 수 있다. 아그레카나제 분자내에서의 기타 도메인을 또한 결실시켜 전체길이 대응물보다 더 안정한 생물학적 활성 절두된 아그레카나제를 생성시키는 것이 고려된다.
본원에서 "단편"이란 용어는, 본 발명의 아그레카나제 단백질 부분, 예를 들면, 서열 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12 및 13에 기재된 아미노산 서열의 부분을 언급한다. 하나의 양태에서, 단백질의 단편은 제공된 다수의 검정법중의 하나에서 아그레카나제 활성을 갖는 아미노산 서열을 언급한다. "단편"이란 용어는 또한 아그레카나제 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하기에 충분히 긴 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함한다. 그러나, 뉴클레오타이드 서열의 단편은 아그레카나제 생물학적 활성을 보유한 단백질 단편을 암호화할 수 있거나 하지 않을 수 있다. 본 발명의 단백질 및 핵산 단편은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 31, 32 또는 33에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 부분 또는 서열 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12 또는 13에 기재된 아미노산 서열의 하나 이상의 부분 각각에 실질적으로 동일한 기타 핵산 분자 또는 단백질의 부분을 포함한다. 핵산 서열의 단편은 예를 들면 약 20개 이상의뉴클레오타이드, 약 50개 이상의 뉴클레오타이드, 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 약 150개 이상의 뉴클레오타이드, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드, 약 250개 이상의 뉴클레오타이드, 약 300개 이상의 뉴클레오타이드, 약 400개 이상의 뉴클레오타이드, 약 500개 이상의 뉴클레오타이드, 약 600개 이상의 뉴클레오타이드, 약 700개 이상의 뉴클레오타이드, 약 800개 이상의 뉴클레오타이드 내지 서열 1에 기재된 핵산 서열의 전체길이의 범위일 수 있다. 하나의 양태에서, 핵산 단편은 아그레카나제 활성을 갖는 펩타이드를 암호화한다. 단백질 단편은 예를 들면 약 5개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 20개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 40개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 100개의 아미노산, 약 150개의 아미노산, 약 200개의 아미노산, 약 250개의 아미노산, 약 300개의 아미노산, 약 350개의 아미노산, 약 400개의 아미노산 내지 서열 2에 기재된 아미노산의 전체길이의 범위일 수 있다. 본 발명의 핵산의 단편은 핵산 서열의 3' 부분, 5'부분 또는 임의의 기타 다른 부분으로부터 생성될 수 있다. 유사하게, 단백질 단편은 단백질의 N-말단 부분, C-말단 부분 또는 기타 다른 부분으로부터 생성될 수 있다. 하나의 양태에서, 단백질의 단편은 아그레카나제 활성을 보유한다. 다른 양태에서, 본 발명의 단백질 단편은 아그레카나제 활성을 갖는 단백질의 부분으로부터 생성될 수 있다.
"유효량"이란 용어는 환자를 치료하기에 충분한 본 발명의 하나 이상의 아그레카나제 억제제 또는 항체를 포함하는 조성물의 투여량 또는 양을 의미한다.
아그레카나제 또는 아그레카나제를 "억제하다" 또는 "억제"란 용어는 아그레카나제 또는 아그레칸에 억제제가 결함됨으로 인한 아그레카나제의 하나 이상의 활성의 감소, 억제 또는 저하를 의미한다. 결합의 감소, 억제 또는 저하는 제공되는 다수의 검정 중 하나를 이용하여 측정할 수 있다. 아그레카나제 활성의 억제가 반드시 아그레카나제 활성의 완전한 결여를 나타내는 것은 아니다. 활성의 감소는 예를 들어, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상일 수 있다. 하나의 양태에서, 억제는 아그레칸의 분해 산물의 검출량의 감소에 의해 측정한다. 본 발명의 억제제는 항체, 단백질, 펩타이드 및 화학적 화합물(소분자로서 흔히 언급된다)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"분리된"이란 용어는 실질적으로 천연 환경으로부터 유리되어 있는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자를 기술한다. 예를 들어, 분리된 단백질은 실질적으로 세포성 물질 또는 이러한 분리된 단백질이 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 기타 오염 단백질을 함유하지 않는다. "분리된"이란 용어는 또한 다른 프로테아제와의 결합으로부터 유리되어 있으며 아그레카나제 단백질분해 활성을 유지하는 아그레카나제 단백질을 의미한다. 또한, "분리된"이란 용어는 본 발명의 아그레카나제를 암호화하며 기타 세포성 물질 및 오염원을 함유하지 않는 핵산 분자를 의미한다.
"신에피토프(neoepitope) 항체"란 용어는 단백질분해성 분해에 의해 생성되는 새로운 N- 또는 C-말단 아미노산 서열은 특이적으로 인식하지만 무손상(분해되지 않은) 기질 상의 이러한 에피토프에는 결합하지 않는 항체를 의미한다.
발현 조절 서열과의 "작동적 결합"이란 용어는 서열에 연결된 뉴클레오타이드 분자의 전사 속도 또는 효율을 조절하는 특정 뉴클레오타이드 서열 또는 서열들의 존재를 의미한다. 예를 들어, 아그레카나제 암호화 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 프로모터 서열은 아그레카나제 암호화 뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 결합된 것일 수 있다. 발현 조절 서열로는 예를 들어, 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 아그레카나제 암호화 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하기 위해 아그레카나제 암호화 뉴클레오타이드 서열에 대해 5' 또는 3'에 있는 기타 발현 조절 서열 또는 이러한 요소들의 임의의 조합이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 당해 분야의 숙련가라면, 예를 들어, 목적하는 발현 수준에 따라서 본 발명의 아그레카나제에 대한 적절한 발현 조절 서열을 선택할 수 있다.
항체의 "특이적 결합"이란 용어는 항체가 하나 이상의 본 발명의 신규 아그레카나제 분자에 결합하고 항체가 하나 이상의 당해 신규 아그레카나제 분자 이외의 분자에 대한 어떠한 실질적 결합도 나타내지 않을 수 있는 것을 의미한다. 상기 용어는, 예를 들어, 항체의 항원 결합 도메인이 수많은 항원에서 제시되는 특정 에피토프에 대해 특이적이고 이러한 항원 결합 도메인을 보유하는 특이적 결합 구성원(항체)이 이러한 에피토프를 보유하는 각종 항원에 결합할 수 있는 경우에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 다수의 신규 아그레카나제 단백질상의 에피토프에 결합할 수 있는 것으로 고려된다. 통상적으로, 결합은 친화상수 Ka가 108M-1이상인 경우에 특이적인 것으로 고려된다. 항체는 적절하게 선택된 조건하에 결합이 실질적으로 억제되지 않으면서 동시에 비특이적 결합이 억제되는 경우에 항원에 "특이적으로 결합"된다고 말한다. 상기 조건은 일반적으로 항체의 농도,용액의 이온 강도, 온도, 결합을 위해 허용되는 시간, 결합 반응과 관련되는 추가 분자(예: 혈청 알부민, 우유 카제인)의 농도 등의 측면에서 정의된다. 조건은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 당해 분야의 숙련가라면, 통상적 기술을 이용하여 적절한 조건을 선택할 수 있다.
본원에 사용된 "안정성"이란 용어는 일반적으로 단백질의 분해율의 감소를 의미하는데 이로써 이의 반감기, 용해도 및/또는 발현 수준이 증가된다. 몇몇 인자들이 단백질 안정성에 시험관내에서 및 생체내에서 영향을 미치는데, 예를 들면 pH, 염 농도, 온도, 예를 들면 프로테아제에 의한 단백질 분해, 금속 이온, 단백질의 자가촉매분해, 소수성등에 의해서이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 이들의 전체길이 대응물보다 더 안정한 절두된 아그레카나제를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 천연 대응물보다 더 안정한 아그레카나제 활성 부위 돌연변이체를 포함한다. 단백질을 더 안정하게 만드는 조건은 일반적으로 정상보다 더 긴 폴딩된 입체형태에서 단백질을 유지하는 조건을 포함하고, 이로써 그의 생물학적 활성이 더 장기간 동안 유지된다. 단백질의 안정성에서의 증가는 일반적으로 반감기 및 발현 수준을 증가시키고, 이로 인해 치료학적 목적 및 억제제 개발을 위한 다량으로 단백질을 정제하는 것이 가능하다.
"고도로 엄격한" 또는 "높은 엄격성"이란 용어는 핵산-핵산 상호작용을 측정하기 위해 사용되는 하이브리드화 및 세척의 조건을 기술한다. 핵산 하이브리드화는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 인식될 수 있는 바와 같이, 염기 조성, 상보 쇄의 길이와 하이브리드화되는 핵산들 간의 뉴클레오타이드 염기 미스매치(mismatch)의 수 이외에도 염 농도, 온도 또는 유기 용매와 같은 이러한 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 엄격성 조건은 핵산의 길이 및 핵산의 염기 조성에 따라 좌우되며 당해 분야에 익히 공지된 기술로 측정할 수 있다. 일반적으로, 엄격성은 예를 들어, 하이브리드화 및 세척 동안에 온도 및 염 농도를 조작함으로써 변경하거나 조절할 수 있다. 예를 들어, 높은 온도와 낮은 염 농도의 조합은 엄격성을 증가시킨다. 이러한 조건은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조; "Current Protocols in Molecular Biology, "John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 당해 분야에 기재되어 있는 수성 조건 및 비수성 조건 둘다를 사용할 수 있다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 한가지 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)에서 하이브리드화한 다음, 50℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 두번째 예는 약 45℃에서 6X SSC에 하이브리드화한 다음, 55℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 또 다른 예는 약 45℃에서 6X SSC에서 하이브리드화한 다음, 60℃에서 0.2X SSC에서의 1회 이상 세척하는 것이다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 추가 예는 약 45℃에서 6X SSC에서 하이브리드화한 다음, 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다. 고도로 엄격한 조건으로는 65℃에서 0.5M 인산 나트륨, 7% SDS에서 하이브리드화한 다음, 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다.
"중간 정도로 엄격한" 또는 "중간 정도의 엄격성" 하이브리드화란 어구는 핵산이 이 핵산과 약 60% 이상, 약 75% 이상 또는 약 85% 이상 동일한, 특히 바람직하게는 이 핵산과 약 90%를 초과하여 동일한 상보적 핵산에 결합하도록 하는 조건을 의미한다. 중간 정도로 엄격한 조건은 예를 들어, 42℃에서 50% 포름아미드, 5X 덴하르트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS에서의 하이브리드화 다음에 65℃에서 0.2X SSPE, 0.2% SDS에서의 세척을 포함하나 이에 제한되지는 않는다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].
"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 유사한"이란 어구는 관련 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 기술되는 서열과 비교하여 (보존된 아미노산 서열 치환을 통해) 동일하거나 근소한 차이를 가질 수 있음을 의미한다. 본 발명의 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에는 예를 들어, 기술하는 핵산 분자 및 폴리펩타이드와 서열이 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일한 것들이 포함된다.
폴리펩타이드의 경우에는, 20개 이상, 30개, 50개 또는 100개 이상의 아미노산이 본래의 폴리펩타이드와 이러한 본래의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 변이체 폴리펩타이드 간에 비교될 것이다. 핵산의 경우에는, 50개 이상, 100개, 150개 또는 300개 이상의 뉴클레오타이드가 본래의 핵산과 이러한 본래의 핵산과 실질적으로 동일한 변이체 핵산 간에 비교될 것이다. 따라서, 변이체는 영역 또는 영역들이 실질적으로 동일할 수 있으나 다른 것들은 상이할 수 있으며, 여전히 "실질적으로 동일한"의 정의에 부합된다. 두 서열 간의 동일율(%)은 예를 들어, 문헌[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)]에 기재되어 있는 Basic Local Alignment Tool(BLAST), 문헌[참조: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)] 또는 문헌[참조: Meyers et al., Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)]의 알고리듬과 같은 표준 정렬 알고리듬에 의해 측정한다.
"치료하다" 또는 "치료"란 용어는 치료학적 처리 및 예방 또는 방지 수단 둘다를 의미한다. 치료가 필요한 개체로는 이미 특정 의학 장애를 앓고 있는 개체뿐만 아니라 결국에는 장애를 획득할 수 있는 개체(즉, 방지 수단이 필요한 개체)가 포함된다. 치료는 아그레카나제 활성 또는 아그레카나제의 수준을 조정하여 하나 이상의 질환의 임상적 증상을 예방하거나 개선시킬 수 있다. 억제제 및/또는 항체는 예를 들어, 아그레칸에 대한 아그레카나제의 상호작용 또는 결합을 방지하거나 아그레카나제 활성을 감소 또는 억제함으로써 작용할 수 있다.
본원에 사용된 "절두된"이란 용어는 전체길이 아그레카나제 핵산 분자 또는 아미노산 서열 각각에서 발견되는, 하나 이상의 뉴클레오타이드이 결실된 본 발명에 따른 아그레카나제 또는 하나 이상의 아미노산이 결실된 본 발명의 아그레카나제를 암호화하는 뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 절두된 단백질은 통상 절두된 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 또는 상응하는 전체길이 단백질의 하나 이상의 아미노산에서의 결실로 인해, 일반적으로 이들의 전체길이 대응물에 비해길이가 더 짧다.
하나의 양태에서, 예를 들면 본 발명의 절두된 아그레카나제는 서열 11에 기재된 전체길이 아그레카나제-1 단백질의 아미노산 576번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 12; 및 서열 11에 기재된 전체길이 아그레카나제-1 절두 단백질의 아미노산 521번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 절두된 아그레카나제-1 단백질을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제는 예를 들면 서열 2에 기재된 전체길이 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 754번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 4; 서열 2에 기재된 전체길이 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 753번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 6; 서열 2에 기재된 전체길이 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 629번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 8; 서열 2에 기재된 전체길이 아그레카나제-2 단백질의 아미노산 568번 내지 C-말단의 결실을 포함하는 서열 10에 기재된 아그레카나제-2 절두 단백질을 포함한다. 이러한 결실은 아그레카나제를 암호화하는 핵산에서 이루어질 수 있거나 단백질의 형성에 후속적인 단백질 그 자체에서 이루어질 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "절두된"이란 용어는 절두된 아그레카나제 그 자체 뿐만 아니라 절두된 아그레카나제를 암호화하는 핵산을 의미한다. 본 발명의 절두된 단백질을 암호화하는 핵산은 서열 3, 5, 7, 9, 11, 32 및 33에 도시되어 있다. 본 발명은 절두된 단백질은 융합 단백질로서 표현될 수 있다.
본 발명의 절두된 아그레카나제는 상응하는 전체길이 아그레카나제 분자보다 안정성이 더 크다. 본 발명의 절두된 아그레카나제는 또한 생체내 및 시험관내 둘다에서 상응하는 전체길이 아그레카나제 단백질보다 더 높은 수준에서 발현될 수 있다. 본 발명의 절두된 아그레카나제는 생물학적으로 활성이고 단백질의 다른 부분에서의 아미노산 치환, 변형, 또는 결실을 포함할 수 있다.
"변이체"란 용어는 제공되는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 각각 실질적으로 동일하거나 유사한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 의미한다. 변이체는 아그레카나제 또는 아그레카나제-유사 단백질을 암호화하는 천연, 예를 들어, 천연 사람 및 비사람 뉴클레오타이드 서열일 수 있거나 인공적으로 제조할 수 있다. 변이체의 예는 본 발명의 아그레카나제의 3' 및 5' 스플라이싱된 변이체, 점 돌연변이 및 기타 돌연변이 또는 아그레카나제 단백질의 단백질분해성 분해를 포함하여, 아그레카나제 mRNA의 선택적 스플라이싱으로부터 야기되는 아그레카나제이다. 본 발명의 아그레카나제의 변이체로는 각각 다른 핵산((또는 적절한 삽입 또는 결실과 함께) 최적으로 정렬되는 경우에 이의 상보 쇄) 또는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 상이한 핵산 분자 또는 이의 단편 및 아미노산과 이의 단편이 포함된다. 하나의 양태에서, 최적으로 정렬될 경우 각각 본 발명의 핵산 분자 또는 단백질과 또 다른 핵산 또는 단백질 간에는 약 50% 이상의 동일성, 약 55% 이상의 동일성, 약 60% 이상의 동일성, 약 65% 이상의 동일성, 약 70% 이상의 동일성, 약 75% 이상의 동일성, 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상, 약 92% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 94% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 96% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 98% 이상의 동일성 또는 약 99% 이상의 동일성이 존재한다. 정의된 바와 같이, 변이체는 본발명의 아그레카나제의 천연 핵산 서열 뿐만 아니라 상응하는 변성 코돈 서열 둘 다를 포함한다. 추가로, 변이체는 정의된 바와 같은 아그레카나제 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서 및 도면에 기재된 서열들의 확인을 돕기 위해, 서열 번호, 도면 위치 및 각 서열의 간단한 설명을 기재한 다음 표(표 1a 및 1b)을 제공한다.
서열 도면 설명
서열 1 도 1A 내지 1C ADAMTS-5(아그레카나제-2)의 전체길이 뉴클레오타이드 서열
서열 2 도 2 서열 1에 의해 암호화되는 ADAMTS-5의 전체길이 a.a. 서열
서열 3 도 3 서열 1의 뉴클레오타이드 123번 내지 뉴클레오타이드 2382번의 뉴클레오타이드 서열
서열 4 도 4 서열 3에 의해 암호화되는 절두된 아그레카나제-2의 a.a. 서열
서열 5 도 5 서열 1의 뉴클레오타이드 123번 내지 뉴클레오타이드 2379번의 뉴클레오타이드 서열
서열 6 도 6 서열 5에 의해 암호화되는 절두된 아그레카나제-2 분자의 뉴클레오타이드 서열
서열 7 도 7 서열 1의 뉴클레오타이드 123번 내지 뉴클레오타이드 2007번의 뉴클레오타이드 서열
서열 8 도 8 서열 7에 의해 암호화되는 절두된 아그레카나제-2 분자의 a.a. 서열
서열 9 도 9 서열 1의 뉴클레오타이드 123번 내지 뉴클레오타이드 1824번의 뉴클레오타이드 서열
서열 10 도 10 서열 9에 의해 암호화되는 절두된 아그레카나제-2의 a.a. 서열
서열 11 도 11 서열 31에 의해 암호화되는 전체길이 아그레카나제-1 단백질의 a.a. 서열
서열 12 도 12 서열 32에 의해 암호화되는 a.a. 1번(Met) 내지 a.a. 575번(Pro)를 포함하는 절두된 아그레카나제-1의 a.a 서열
서열 도면 설명
서열 13 도 13 서열 33의 a.a. 1번(Met) 내지 a.a. 520번(Ala)를 포함하는 절두된 아그레카나제-1의 a.a. 서열
서열 14 도 14 펩타이드 링커 및 스트렙타비딘 태그를 갖는 재조합 절두된 아그레카나제-2 단백질의 뉴클레오타이드 서열
서열 15 도 15 서열 14에 의해 암호화되는 재조합 아그레카나제-2 단백질의 a.a. 서열
서열 16 프라이머
서열 17 프라이머
서열 18 프라이머
서열 19 프라이머
서열 20 올리고뉴클레오타이드
서열 21 올리고뉴클레오타이드
서열 22 펩타이드 링커
서열 23 도 18 스트렙타비딘-태그
서열 24 올리고뉴클레오타이드
서열 25 올리고뉴클레오타이드
서열 26 촉매성 모티프
서열 27 뉴클레오타이드 삽입부
서열 28 Xho1 부위를 함유하는 삽입체
서열 29 68bp 어댑터
서열 30 도 21 위치 411에 E에서 Q로의 돌연변이를 갖는 아그레카나제-2 단백질
서열 31 도 22A 및 22B 아그레카나제-1의 전체길이 뉴클레오타이드
서열 32 도 23 절두된 아그레카나제-1의 뉴클레오타이드 서열
서열 33 도 24 절두된 아그레카나제-1의 뉴클레오타이드 서열
a.a.=아미노산
II. 신규한 아그레카나제 분자
하나의 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제-2의 뉴클레오타이드 서열은 서열 3에 제시되어 있는데, 여기서 뉴클레오타이드는 서열 1에 제시된 아그레카나제-2의 전체길이 서열의 뉴클레오타이드 123번(atg) 내지 뉴클레오타이드 2382번(gaa)을 포함한다. 다른 양태에서, 절두된 아그레카나제-2의 뉴클레오타이드 서열은 (atg)의 "A"로 시작되는 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2256번(cct)을 포함하여 도 5에 제시되어 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제-2의 뉴클레오타이드는 도 7에 제시된 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)을 포함하고, 이는 TSP 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 결실을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 절두된 아그레카나제-2 단백질의 핵산 서열은 TSP 도메인 둘 다가 결실된 아그레카나제-2 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 뉴클레오타이드 1701번(cat)을 포함한다. 본 발명은 추가로 천연 핵산 서열과 이의 단편 및 변이체 뿐만 아니라 도 3, 5, 7 및 9에 제시된 상기에서 기재된 인공적으로 생성된 것 및 등가 변성 코돈 서열뿐만 아니라 아그레카나제 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 이의 단편을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 절두된 아그레카나제-1 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들면, 도 12에 제시된 절두된 아그레카나제-1 단백질은 도 23(서열 32)에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 본 발명의 또 다른 절두된 아그레카나제-1 단백질은 TSP 도메인의 결실을 포함하여 도 13에 제시되어 있다. 이러한 절두된 아그레카나제-1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 도 24(서열 33)에 제시되어 있다.
분리 절두된 아그레카나제-2의 아미노산 서열은 아미노산 1번(Met) 내지 753번(Glu)으로서 도 4에 제시되어 있다. 본 발명은 또한 절두된 아그레카나제-2 단백질을 암호화하는 도 5, 7 및 9의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 특징으로 하는데, 이의 아미노산 서열은 아미노산 1번(Met) 내지 752번(Pro)를 포함하는 도 6; 아미노산 1번(Met) 내지 628번(Phe)를 포함하는 도 8; 아미노산 1번(Met) 내지 567번(His)를 포함하는 도 10에 제시되어 있다. 본 발명은 추가로 절두된 아그레카나제-1 분자의 아미노산 서열을 포함한다. 절두된 아그레카나제-1 분자의 아미노산 서열은 도 23에 제시되어 있는데, 이는 도 12의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명의 또다른 절두된 아그레카나제-1 분자는 도 13에 제시되어 있는데, 이는 도 24의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명은 추가로 아그레카나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단편 및 변이체를 포함한다.
본 발명의 사람 아그레카나제 단백질 또는 이의 단편은 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3의 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 동시에 생성된 기타 단백질성 물질을 실질적으로 함유하지 않는, 아미노산 1번(Met) 내지 753번(Glu)의 도 4에 제시된 아미노산 서열에 의해 특징지워진 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 아그레카나제 단백질은 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 도 5의 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 동시에 생성된 기타 단백질성 물질을 실질적으로 함유하지 않는, 아미노산 1번(Met) 내지 752번(Pro)의 도 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 아그레카나제 단백질은 CCT에 이어서 추가의 GAA를 갖는, 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 도 5의 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 동시에 생성된 기타 단백질성 물질을 실질적으로 함유하지 않는, 아미노산 1번(Met) 내지 753번(Glu)의 도 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 아그레카나제 단백질은 도 1A 내지 1C(서열 1)의 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 서열 2에 제시된 전체길이 아그레카나제-2 단백질의 분해로 인해 제조된, 아미노산 1번 내지 752번(서열 6), 또는 아미노산 1번 내지 753번(서열 4)을 포함하는 절두된 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다.
추가의 양태에서, 세포 배양 배지로부터 회수된 단백질은 아미노산 1번 내지 628번(서열 8); 아미노산 1번 내지 567번(서열 10); 아미노산 1번 내지 575번(서열 12) 또는 아미노산 1번 내지 520번(서열 13)을 포함한다. 정제된 발현된 단백질은 기타 오염 물질뿐만 아니라 동시에 생성된 기타 단백질성 물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 회수된 정제된 단백질은 아그레칸 분해에 의해 단백질분해성 아그레카나제 활성을 나타내는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 아그레칸-분해 분자의 존재를 측정하는 검정에서 아그레칸 단백질분해 활성을 나타내는 이들의 능력에 의해 추가로 특징지워질 수 있다. 이들 검정 또는 이의 개발은 당업자의 지식의 범주내에 있다. 이러한 검정은 아그레칸 기질을 아그레카나제 분자와 접촉시키고 아그레칸 단편의 생성을 탐지함을 포함할 수 있다[참조: Hughes et at., Biochemi J 305: 799-804(1995); Mercuri et al, J. Bio Chem. 274:32387-32395(1999)].
포유동물 세포에서의 제조의 경우, DNA 서열은 아그레카나제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 프레임내에서 5' 연결된, 적합한 프로펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 배양 배지로부터 회수된 본 발명의 아그레카나제 단백질은, 이들을 동시에 생성되는 기타 단백질성 물질 및 존재하는 기타 오염 물질로부터 분리함으로써 정제한다. 분리 정제된 단백질은 아그레카나제 기질을 분리하는 능력에 의해 특징지워진다.
본원에 제공된 아그레카나제 단백질은 또한 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3의 서열; 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2256번(cct)의 도 5의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 도 7의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 도 9의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1725번(cca)의 도 23의 서열; 및 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1560번(gct)의 도 24의 서열과 유사한 서열에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는데, 여기에 변형 또는 결실이 천연적으로 제공되거나(예를 들어 뉴클레오타이드 서열내에서 대립유전자 변이로 폴리펩타이드내에 아미노산 변화가 초래될 수 있다) 정교하게 조작된다. 예를 들면, 합성 폴리펩타이드는 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 753번(Glu)의 도 4; 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 752번(Pro)의 도 6; 및 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 628번(Phe)의 도 8; 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 567번(His)의 도 10; 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 575번(His)의 도 12; 또는 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 520번(Ala)의 도 13의 아미노산 잔기의 연속적 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 복제할 수 있다. 이들 서열은 아그레카나제 단백질과 1차, 2차 또는 3차 구조적 및 입체형태적 특징을 공유하기 때문에 서로 공통되는 생물학적 특성을 지닐 수 있다.
예를 들어, 단백질의 구조 및 입체형태를 현저하게 변형시키지 않으면서 수많은 보존적 아미노산 치환이 가능하므로 단백질의 생물학적 특성을 유지할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 라이신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R) 및 히스티딘(His 또는 H)과 같은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산; 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루탐산(Glu 또는 E)과 같은 산성 측쇄를 갖는 아미노산; 아스파라긴(Asn 또는 N), 글루타민(Gln 또는 Q), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T) 및 티로신(Tyr 또는 Y)과 같은 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산; 및 알라닌(Ala 또는 A), 글리신(Gly 또는 G), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 이소류신(lie or I), 프롤린(Pro 또는 P), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 메티오닌(Met 또는 M), 트립토판(Trp 또는 W) 및 시스테인(Cys 또는 C)과 같은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 간에 이루어질 수 있는 것으로 인정되고 있다. 따라서, 이러한 천연 아그레카나제의 변형 및 결실을 천연 아그레카나제에 대한 생물학적 활성 대용물로서 억제제 및 치료 목적을 위한 기타 단백질의 개발에서 사용할 수 있다. 아그레카나제 및 소정의 아그레카나제 변이체 둘 다뿐만 아니라 이의 억제제를 하기 실시예에서 기술하는 검정에 도입시킴으로써 상기 아그레카나제 변이체가 아그레카나제의 생물학적 활성을 유지하는지를 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 아그레카나제 분자의 안정성을 증가시키는 아미노산 치환을 포함하는 아그레카나제 분자를 포함한다. 예를 들면, 단백질의 위치 411에서 E에서 Q로의 돌연변이를 갖는 아그레카나제-2 분자의 아미노산 서열이 서열 30에 제공된다. 도 17은 추가로 도 12 및 도 13의 절두된 아그레카나제-1 분자의 촉매적 도메인내에 아미노산 돌연변이를 개략적으로 제시한다. 당해 E에서 Q로의 돌연변이가 분자의 활성 부위에 있어 본 발명의 아그레카나제의 분해를 방지하는 역할을 하여 아그레카나제의 안정성 및 반감기를 증가시키곤 있지만, 아미노산 돌연변이는 아그레카나제 분자의 안정성을 증가시키는 단백질의 기타 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 생각된다.
하나의 양태에서, 활성 부위 돌연변이를 아그레카나제에 도입하여 효소의 촉배적 활성을 의도적으로 차단한다. 이는 아그레카나제의 결정화 및 구조적 측정에 특히 유용하여 후속적으로 아그레카나제를 확인하고 개발한다. 본 발명의 절두된또는 활성 부위 돌연변이체 아그레카나제의 증가된 안정성으로 인해 질환 치료를 위한 억제제에서의 후속 사용을 위한 다량의 아그레카나제 분자를 정제하고 분리할 수 있게 된다. E에서 Q로의 돌연변이는 아그레카나제를 생물학적으로 비활성으로 만들어, 이로 인해 환자에 유전자 요법에 사용하고 또한 억제제의 개발을 위해 다량으로 비활성 단백질의 정제를 가능케한다.
목적하는 아미노산 치환(보존적인지 또는 비보존적인지에 관계없이)은 이러한 치환이 요망되는 때에 당해 분야의 숙련가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드의 중요한 아미노산 잔기를 확인하거나 기술되는 본 발명의 아그레카나제의 활성을 증가 또는 감소시키기는데 사용할 수 있다. 예시적 아미노산 치환은 하기 표 2에 제시한다.
아미노산 치환
본래의 잔기 예시적 치환 보다 보존적인 치환
Ala(A) Val, Leu, Ile Val
Arg(R) Lys, Gln, Asn Lys
Asn(N) Gln Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser, Ala Ser
Gln(Q) Asn Asn
Gly(G) Pro, Ala Ala
His(H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile(I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신 Leu
Leu(L) 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys(K) Arg, 1,4 디아미노-부티르산, Gln, Asn Arg
Met(M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe(F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro(P) Ala Gly
Ser(S) Thr, Ala, Cys Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr, Phe Tyr
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val(V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신 Leu
특정 양태에서, 보존적 아미노산 치환은 통상적으로 생물학적 시스템에서의 합성 보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 혼입된 비천연 아미노산 잔기를 또한 포함한다.
기술되는 아그레카나제 단백질의 서열의 기타 특이적 돌연변이는 글리코실화 부위의 변형을 포함한다. 이러한 변형은 O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위와 관련될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화의 부재 또는 단지 부분적인 글리코실화의 존재는 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위에서의 아미노산 치환 또는 결실로부터 초래될 수 있다. 아스파리긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 적절한 세포의 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩타이드 서열을 포함한다. 이러한 트리펩타이드 서열은 일반적으로 아스파리긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린(여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다)이다. 글리코실화 인식 부위(및/또는 제2 위치에서의 아미노산 결실)의 제1 또는 제3 아미노산 중 하나 또는 둘 다에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실은 변형된 트리펩타이드 서열에서 비글리코실화를 야기한다. 추가로, 글리코실화 부위가 변형되지 않은 상태로 남겨진다 해도 아그레카나제-관련 단백질의 세균성 발현도 비글리코실화된 단백질의 생산을 초래할 수 있다.
III. 아그레카나제 뉴클레오타이드 서열
본 발명의 범주내에서 핵산 서열은 중간정도 내지 고도의 엄격성 조건하에 기술되는 천연 아그레카나제 DNA 서열에 하이브리드화하는 분리된 DNA 및 RNA 서열을 포함한다. 염격한 조건 또는 높은 엄격성 조건이란, 보다 높은 온도와 보다 낮은 염 농도를 사용하는 하이브리드화 및 세척 조건을 의미한다. 추가로, 포름아미드의 포함도 엄격성을 증가시킨다. 예를 들어, 포름아미드의 부재하에 60 내지 65℃에서의 하이브리드화 조건 또는 50% 포름아미드하에 42℃에서의 하이브리드화 조건은 둘다 높은 엄격성 조건이다.
추가로 본 발명에는, 고 내지 중간정도로 엄격한 조건하에 서열 3, 5, 7, 9, 32 또는 33의 DNA 서열과 하이브리드화하고 아그레칸을 분해하는 능력을 갖는 절두된 아그레카나제 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 포함된다. 하나의 양태에서, DNA 서열은 높은 엄격성 조건하에 하이브리드화하는 DNA 서열을 포함한다[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring HarborLaboratory, at 387-389 (1982)]. 이러한 엄격한 조건은 예를 들어, 65℃에서의 0.1X SSC, 0.1% SDS를 포함한다. 하이브리드화로 확인되는 DNA 서열은 예를 들어, 서열 4, 6, 8, 10, 12 및 13에 제시된 서열과 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 동일한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열 3, 5, 7, 9, 32 또는 33의 DNA와 동등한 DNA도 또한 중간정도의 엄격한 조건하에 서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 13 각각의 펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 서열에 하이브리드화할 것이다. 그러나, 특정 조건하에, 절두된 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 전체길이 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화할 것이다.
중간정도의 엄격성 조건은 당해 분야에 공지되어 있으며 문헌[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, Cold Spring Harbor Press. (1989)]에 기재되어 있다. 하나의 양태에서, 예를 들어, 중간정도의 엄격성 조건은 5X SSC/0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 예비세척 용액의 사용 및 약 55℃ 내지 60℃ 온도의 하이브리드화 조건 및 약 55℃에서 5X SSC에서 밤새 세척함을 포함한다. 당해 숙련가라면 상기 조건이 핵산 서열의 길이와 조건과 같은 요인에 따라 조정될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 또 하나의 추가의 측면에서, 아그레카나제 단백질분해 활성을 갖거나 아그레카나제의 기타 다른 개시되지 않거나 발견되지 않은 활성을 갖는 절두된 아그레카나제를 암호화하는 DNA 서열이다.
또다른 양태에서, 본 발명의 핵산은 이러한 분자의 안정성을 증가시킬 수 있는 돌연변이를 포함하는 아그레카나제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
최종적으로, 서열 4, 6, 8, 10, 12 및 13 각각에 제시된 아미노산 서열 또는 아그레카나제 활성을 갖는 본 발명의 아그레카나제의 펩타이드 서열 변이체를 암호화하는 예를 들면 서열 3, 5, 7, 9, 32 및 33의 본 발명의 서열의 대립유전자 변이 또는 기타 변이가 또한 본 발명에 포함된다. 추가로, 본 발명은 아그레카나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 본 발명의 DNA 서열의 단편 및 이러한서열의 변이체를 포함한다.
마찬가지로, 아그레카나제 단백질을 암호화하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 또는 대립유전자 변이(아미노산 변화를 초래하거나 초래할 수 있거나 초래하지 않을 수 있는 종 집단에서의 천연 염기 변화)로 인해 코돈 서열이 상이한 DNA 서열도 본원에서 기술하는 신규 아그레카나제를 암호화한다. 점 돌연변이 또는 유도된 변형(삽입, 결실 및 치환을 포함)에 의해 유발되어, 암호화되는 폴리펩타이드의 활성, 반감기 또는 생산을 증가시키는 도 1, 3, 5, 7, 9, 31, 32 및 33의 DNA 서열에서의 변이도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 측면은 이들 신규한 아그레카나제 폴리펩타이드의 발현 방법에 사용하기 위한 벡터를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 벡터는 본 발명의 절두된 아그레카나제 또는 활성 부위 변이체 아그레카나제를 암호화화는 상기 기재한 DNA 서열을 함유한다. 추가로, 벡터는 본 발명의 아그레카나제 단백질 서열의 발현을 가능케하는 적합한 발현 조절 서열을 함유한다. 또는, 상기 기술한 변형된 서열을 혼입한 벡터는 또한 본 발명의 양태이다. 추가로, 뉴클레오타이드 1번 (atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3; 뉴클레오타이드 1번 내지 뉴클레오타이드 2256번(cct)의 도 5; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 도 7; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 도 9; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 번(cca)의 도 23; 및 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 번(gct)의 도 24의 서열, 또는 아그레카나제 단백질을 암호화하는 기타 서열을 조작하여 복합 아그레카나제 분자를 조작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 아그레카나제 폴리펩타이드를 암호하하는 DNA 서열에 정확한 판독 프레임내에서 연결된 서열 3, 5, 7, 9, 32 및 33에 기재된 뉴클레오타이드로부터의 단편을 포함하는 아그레카나제 단백질을 암호화하는 키메릭 DNA 분자를 포함한다. 서열 3, 5, 7, 9, 32 또는 33에 제시된 DNA 분자, 또는 이의 변이체 또는 단편은 상이한 아그레카나제를 암호화하는 DNA에 3' 또는 5'를 연결시킬 수 있다.
IV. 아그레카나제 단백질의 제조
본 발명의 또 다른 양상은 신규 아그레카나제 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 공지된 조절 서열의 조절하에 본 발명의 아그레카나제 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 형질전환된 적합한 세포주를 배양하함을 포함한다. 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 분리한다. 정제된 단백질은 동시에 생산되는 기타 단백질뿐만 아니라 기타 오염원을 실질적으로 함유하지 않는다.
적합한 세포 또는 세포주는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포일 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 선택과 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 산물 생산 및 정제의 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Gething andSambrook, Nature, 293:620-625 (1981); Kaufman etal., Mol Cell Biol, 5(7):1750-1759 (1985); Howley et al., 미국 특허 제 4,419,446호]. 첨부되는 실시예에서 기술되는 또 다른 적합한 포유동물 세포는 원숭이 COS-1 세포주이다. 포유동물 CV-1 세포를 사용할 수도 있다.
세균 세포가 또한 적합한 숙주일 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주(예: HB101, MC1061)가 생물공학 분야에서 숙주 세포로서 익히 공지되어 있다. 비. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 기타 간상균 등의 다양한 균주를 또한 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 세포 세포에서의 단백질 발현의 경우, 아그레카나제의 프로펩타이드를 암호화하는 DNA가 일반적으로 필수적인 것은 아니다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 효모 세포의 다수의 균주가 본 발명의 폴리펩타이드의 발현용 숙주 세포로서 또한 유용할 수 있다. 추가로, 경우에 따라, 곤충 세포를 본 발명의 방법에서 숙주 세포로서 사용할 수 있다[참조: Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986)].
기술된 여러가지 벡터를 선택된 숙주 세포에서 이의 복제 및 발현을 지시할 수 있는 본 발명의 DNA 암호화 서열과 작동적으로 결합된 선택된 조절성 서열을 통상 함유한다. 이러한 벡터의 조절성 서열은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고 숙주세포에 따라 선택될 수 있다. 이러한 선택은 통상적인 것으로서 본 발명의 부분을 형성하지 않는다.
당해 분야의 숙련가라면, 예를 들어, 서열 1, 3, 5, 7, 9, 31, 32 및 33에제시된 핵산 서열을 사용함으로써 포유 동물 벡터을 작제할 수 있다.
본 발명의 절두된 아그레카나제 단백질은 또한 예를 들면 서열 4, 6, 8, 10, 12 또는 13에 제시된 단백질 서열, 이의 단편 또는 변이체 및 예를 들면, 태그; 즉, 제2 단백질 또는 아그레카나제 단백질의 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체의 아미노산 말단, 카복시 말단 또는 어떠한 지점에도 가해지는 하나 이상의 아미노산, 약 2 내지 약 50개의 아미노산으로부터의 또는 약 50 내지 약 100개의 아미노산을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 전형적으로, 이러한 아미노산 태그를 만들어 생성되는 융합 단백질을 안정화시키거나 상응하는 아그레카나제 단백질 또는, 예를 들면 본 발명의 아그레카나제 단백질의 절두된 형태를 포함하는, 이러한 단백질의 단편 또는 변이체의 발현된 재조합의 정제를 단순화하기 위해 이루어진다. 이러한 태그는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 태그의 대표적인 예는 일련의 히스티딘 잔기, 에피토프 태그, 플래그(FLAG), 헤르페스 단순 당단백질 D, 베타-갈락토시다제, 말토오즈 결합 단백질, 스트렙타비딘 태그 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 암호화하는 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 태그를 암호화하는 핵산 서열은 태그를 포함하는 재조합 또는 융합 아그레카나제 단백질의 후속적인 제조를 위해 본 발명의 아그레카나제를 암호화 하는 핵산 서열에 프레임내에서 결합한다. 이러한 재조합 또는 융합 아그레카나제 단백질을 예를 들면 도 17에 도시된 바와 같이 C-말단 플래그 태그를 갖는 절두된 아그레카나제-1 효소, 및 도 18에 도시된 바와 같이 C-말단 스트렙타비딘 태그를 갖는 아그레카나제-2 효소를 포함한다. 스트렙타비딘을 포함하는 절두된 아그레카나제-2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 도 14(서열 14)에 제시되어 있는데, 이는 도 15에 기재된 절두된 아그레카나제-2 융합 단백질을 암호화한다.
유사하게, 증가된 안정성, 발현 수준, 및/또는 반감기를 초래하는 아미노산 돌연변이를 함유하는 아그레카나제를 또한 융합 단백질로서, 예를 들면 서열 30에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편 또는 변이체, 및 예를 들면 상기에서 논의한 카그를 사용하여 제조할 수 있다. 촉매적 도메인에 아미노산 돌연변이을 갖는 아그레카나제를 포함하여 본 발명의 아그레카나제-1 및 -2 융합 단백질은 도 14, 15, 17 및 18에 제시되어 있다.
V. 항체의 제조
본 발명의 분리된 단백질은, 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있는 항체 제조방법을 이용하여 아그레카나제 및/또는 기타 아그레카나제 관련 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 아그레카나제 또는 기타 관련 단백질에 대한 항체를 또한 포함한다. 항체는 아그레카나제 활성을 차단하는 항체 및 차단하지 않는 항체 둘다를 포함한다. 항체는 아그레카나제 또는 관련 단백질의 검출 및/또는 정제를 위해 또는 아그레카나제의 효과를 억제 또는 방지하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 아그레카나제 또는 이의 일부분을 이용하여 아그레카나제에 특이적으로 결합하는 항체를 제조할 수있다.
항체는 예를 들어, 종래의 하이브리도마 기술[참조: Kohler and Milstein,Nature 256:495-499 (1975)], 재조합 DNA 방법[참조: 예를 들어 미국 특허 제4,816,567] 또는 항체 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이(phage display) 기술[참조: Clackson et al., Nature 352: 624-628(1991); Marksetal., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]을 통해 제조할 수 있다. 다양한 항체 제조 기술에 대해 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]을 참조.
본 발명의 항체는 하기하는 질병의 치료시에 사용할 수 있다. 항체는 또한 기술하는 검정 및 검출 방법에서 사용할 수 있다.
VI. 억제제의 개발
골관절염과 같은 다양한 상태는 아그레칸의 분해로 특성화되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 아그레카나제의 증가된 안정성 및 발현 수준을 초래하는 돌연변이을 갖는 아그레카나제 및 본 발명의 절두된 아그레카나제는 아그레카나제 억제제를 개발하기 위하여 다량의 양으로 아그레카나제 분자를 생성시키는 것을 가능하게 한다.
그러므로, 본 발명은 아그레카나제 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 억제제는 아그레칸 기질의 혼합물을 아그레카나제 활성의 억제제와 관련시킨 다음, 아그레칸에 노출시키는 스크리닝 검정에서 아그레카나제 분자를 사용하여 개발할 수 있다. 억제제는, 예를 들어, 억제제의 라이브리를 스크리닝함으로써 고처리량 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 억제제는 또한 3차원 구조 분석 및/또는 컴퓨터 보조된 약물 디자인을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 방법은 아그레카나제 및 아그레칸의 3차원 구조에 기초하여 억제제에 대한 결합 부위를 측정하고 아그레카나제 또는 아그레칸상의 결합 부위와 반응성인 분자를 개발함을 포함할 수 있다. 후보 분자는 억제 활성에 대해 검정한다. 아그레카나제 분자의 억제제를 개발하기 위한 추가의 표준 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 아그레카나제의 억제제의 확인 및 개발을 위한 검정은 아그레칸과 억제제의 혼합물을 아그레카나제 분자와 접촉시킨 다음, 예를 들어, 아그레카나제 감수성 부위에서의 분해에 의해 생성되는 아그레카나제 단편을 검출 및 측정함으로써 아그레카나제 억제 정도를 측정함을 포함한다. 억제제는 단백질, 펩타이드, 항체이거나 화학적 화합물일 수 있다. 하나의 양태에서, 억제제는 아그레카나제 분자상에 있는 활성 부외에 결합하는 펩타이드 분자이다. 예를 들면, 아그레카나제-1 및 아그레카나제-2 분자의 활성 부위는 펩타이드 억제제 개발에 사용할 수 있다. 촉매적 도메인내에 E에서 Q로의 아미노산 변이를 포함하는 아그레카나제-1 분자는 도 17에 제시되어 있다. 유사하게, 촉매적 도메인내에 위치 411에 E에서 Q로의 변이를 갖는 아그레카나제-2 분자의 아미노산 서열은 도 21(서열 30)에 제시되어 있다.
VII. 질병 치료 및 진단
아그레카나제 활성의 억제제는 하기하는 질병의 치료시에 사용할 수 있다. 억제제는 또한 기술하는 검정 및 검출 방법에서 사용할 수 있다. 본 발명의 아그레카나제의 억제제를 사용함으로써 치료가능할 것으로 고려되는 다양한 질병으로는, 골관절염, 암, 염증성 관절 질환, 류마티스 관절염, 화농성 관절염, 치주 질환, 각막 궤양, 단백뇨, 죽상경맥동화증 플라크 파열로 인한 관상 혈전증, 동맥류 대동맥성 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 페기종, 급성 호흡 곤란 증후군, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 알쯔하이머병, 뇌 및 조혈 악성종양, 골다공증, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 말초 신경병증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 안구 혈관신생, 황반변성, 대동맥류, 심근경색, 자가면역 질환, 외상성 관절 손상 후의 퇴행성 연골 손실, 두부 외상, 이영양성 수포성 표피 박리증, 척수 손상, 급성 및 만성 신경퇴행성 질환, 골감소증, 악관절 질환, 신경계의 탈수초성 질환, 기관 이식 독성 및 거부, 악액질, 알레르기, 조직 궤양, 재협착증 및 변경된 아그레카나제 활성 또는 변경된 아그레카나제 수준을 특징으로 하는 기타 질환이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
아그레카나제의 활성을 억제하는 본 발명의 억제제 및 항체 및/또는 아그레카나제의 발현을 저하시킬 수 있는 화합물은 아그레카나제 및 아그레카나제 관련 단백질에 의한 아그레칸과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 분해와 관련된 포유동물의 임의의 질환의 치료시에 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 약제학적으로 허용되는 비히클내에서 하나 이상의 아그레카나제 항체 또는 억제제의 유효량을 골관절염, 또는 아그레카나제 및 아그레카나제 관련 단백질에 의해 아그레칸과 같은 매트릭스 단백질의 분해에 의해 특징지워지는 기타 기술된 질환의 치료에 사용할 수 있다.
VIII. 투여
본 발명의 또 다른 양상은 하나 이상의 아그레카나제 억제제 또는 항체의 치료학적 유효량을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 이러한 본 발명의 조성물을 아그레카나제 효소 또는 아그레카나제 유사 활성을 갖는 단백질에 의한 아그레칸의 분해를 특징으로 하는 질병의 치료시에 사용할 수 있다.
본 발명은 아그레칸의 분해를 특징으로 하는 상태를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 이러한 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 단백질분해 활성을 억제하는 아그레카나제 억제제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함을 포함한다. 본 발명의 억제제가 아그레카나제 활성을 억제하거나 질환 상태에서 아그레카나제의 수준을 단순히 조절함으로써 기능하는 것으로 고려된다.
본 발명의 억제제는 사람 또는 동물에서 다양한 의학 장애를 진단하거나 치료하는데 유용하다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 동일한 항체에 의해 결합되지 않은 아그레카나제 단백질에 비해서 아그레카나제 단백질과 관련된 하나 이상의 활성을 억제 또는 감소시키는데 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 억제제는 항체에 의해 결합되지 않은 아그레카나제에 비해서 아그레카나제 분자의 하나 이상의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 특정 양태에서, 아그레카나제의 활성은 본원에서 기술하는 항체 중 하나 이상에 의해 결합된 경우에 50% 이상 억제되며, 본원에서 기술하는 항체 중 하나 이상에 의해 결합되지 않은 아그레카나제 단백질에 비해서 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 또는 88% 이상 억제될 수 있거나, 90, 91, 92, 93 또는 94% 이상 억제될 수 있거나 95%이상 내지 100% 억제될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 항체 또는 이의 결합 단편이 약 1㎍/kg 내지 약 20mg/kg, 약 1㎍/kg 내지 약 10mg/kg, 약 1㎍/kg 내지 약 1mg/kg, 약 10㎍/kg 내지 약 1mg/kg, 약 10㎍/kg 내지 약 100㎍/kg, 약 100㎍ 내지 약 1mg/kg 또는 약 500㎍/kg 내지 약 1mg/kg의 범위인 투여량으로 투여되도록 환자에게 투여한다. 항체는 거환 투여로서 투여하여, 항체가 환자에게 투여된 후에 환자의 체내에서 순환될 수 있는 시간 간격이 최대가 되도록 한다. 또한, 초기 거환 투여 후에 연속 주입을 사용할 수도 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 단백질, 펩타이드, 항체 및 화학적 화합물과 같은 아그레카나제의 억제제의 투여에 관한 것이다. 억제제의 유효량은 아그레카나제의 활성을 감소시켜 목적하는 생물학적 결과를 달성하는데 유용한 투여량이다. 일반적으로, 억제제를 투여하기에 적절한 치료학적 투여량은 예를 들어, 약 5mg 내지 약 100mg, 약 15mg 내지 약 85mg, 약 30mg 내지 약 70mg 또는 약 40mg 내지 약 60mg의 범위일 수 있다. 억제제는 단일 투여로서 또는 1일 1회, 주 1회 또는 월 1회의 간격으로 투여할 수 있다. 아그레카나제 억제제의 투여에 대한 투여량 스케쥴은 예를 들어, 이의 아그레카나제 표적에 대한 억제제의 친화성, 억제제의 반감기 및 환자의 상태의 중증도에 기초하여 조정할 수 있다. 일반적으로, 억제제는 거환 투여로서 투여하여 이의 순환 수준이 최대화되도록 한다. 거환 투여 후에 연속 주입을 사용할 수도 있다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%를 치사시키는 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 양)을 측정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물 모델에서 표준 약제학적 과정으로 측정할 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 간의 투여량 비가 치료 지수이며 이는 LD50/ED50비로서 표현할 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 억제제가 일반적으로 바람직하다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득한 데이터는 사람에서 사용하기 위한 투여량 범위의 제형화시에 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는 ED50을 나타내는 순환 농도의 범위내에 해당될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이의 범위가 달라질 수 있다. 본 발명에 따라서 사용되는 임의의 항체 또는 억제제의 경우, 치료학적 유효량은 세포 배양물 검정으로부터 초기에 산정할 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 제형화하여, 세포 배양물 검정으로 측정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 1/2을 달성하는 시험 항체의 농도)를 나타내는 순환 혈장 농도를 달성할 수 있다. 혈장중 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는 적합한 생물검정으로 탐지할 수 있다. 적합한 생물검정의 예로는 DNA 복제 검정, 전사 기반 검정, GDF 단백질/수용체 결합 검정, 크레아틴 키나제 검정, 전구지방세포의 분화에 기초한 검정, 지방세포내의 글루코즈 흡수량에 기초한 검정 및 면역학적 검정이 포함된다.
본 발명의 치료학적 방법은 아그레카나제 억제제 조성물을 국소, 전신 또는 이식물 또는 장치로서 국부 투여함을 포함한다. 투여량 섭생은 아그레카나제 단백질의 작용, 병리 부위, 질병의 중증도, 환자의 연령, 성별 및 식이, 임의의 염증의 중증도, 투여 시간을 변형시키는 각종 요소 및 기타 임상 요소에 기초하여 담당 주치의가 결정할 수 있다. 일반적으로 전신 또는 주사에 의한 투여는 최소로 효과적인 투여량에서 시작하여 투여량을 긍정적 효과가 관찰될 때까지 미리 선택된 시간 경과에 따라 증가시킬 수 있다. 이어서, 투여량의 점진적 증가는 나타날 수 있는 모든 부작용을 고려하여, 상응하는 효과의 증가를 생성하는 수준으로 제한될 수 있다. 최종 조성물에 기타 공지된 요소의 추가가 또한 투여량에 영향을 미칠 수 있다.
진행은 질병 진행을 정기적으로 평가하여 탐지할 수 있다. 진행은 예를 들어, X-선, MRI 또는 기타 영상 기법, 윤활액 분석 및/또는 임상 검사로 탐지할 수 있다.
IX. 검정 및 검출 방법
본 발명의 억제제 및 항체는 샘플 중의 아그레카나제의 존재나 부재 또는 양을 측정하기 위한 검정 및 검출 방법에서 사용할 수 있다. 본 발명의 억제제 및 항체를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 아그레카나제 단백질을 검출할 수 있다. 이들 단백질의 존재 또는 수준과 질병을 상호관련시킴으로써, 당해 분야의 숙련가는 동반 질병을 진단하거나 이의 중증도를 측정할 수 있다. 본원에서 기술하는 억제제 및 항체로 진단할 수 있는 질병은 상기에 제시되어 있다.
항체를 이용하기 위한 검출 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 ELISA, 방사선면역검정, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역형광법, 면역침전법 및 기타 유사한 기술이 포함된다. 항체는 추가로 단백질(예: 아그레카나제 단백질)을 검출하는 상기 기술들 중 하나 이상을 포함하는 진단 키트내에 제공될 수 있다. 이러한 키트는 기타 성분, 포장재, 지침서 또는 아그레카나제 단백질의 검출을 보조하는 기타 물질 및 당해 키트 사용에 관한 지침서를 함유할 수 있다. 단백질 억제제를 이러한 진단 검정에서 사용하는 경우, 단백질-단백질 상호작용 검정을 사용할 수 있다.
억제제를 진단 목적으로 의도하는 경우, 이들을, 예를 들어, 리간드 그룹(예: 바이오틴) 또는 검출가능한 마커 그룹(예: 형광 그룹, 방사선동위원소 또는 효소)로 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 경우에 따라, 항체(폴리클로날 또는 모노클로날인지에 관계없이)는 통상의 기술을 사용하여 태그화할 수 있다. 적합한 태그로는 형광발색단, 발색단, 방사성 원자, 전자 고밀도 시약, 효소 및 특이적 결합 파트너를 갖는 리간드가 포함된다. 효소는 통상적으로 이의 활성으로 검출한다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제는 테트라메틸벤지딘(TMB)을 분광광도계로 정량화할 수 있는 청색 색소로 전환시키는 능력으로 측정할 수 있다. 기타 적합한 결합 파트너로는 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, IgG 및 단백질 A, 및 당해 분야에 공지된 다수의 수용체-리간드 커플이 포함된다.
하기 실시예는 사람 아그레카나제 및 기타 아그레카나제-관련 단백질을 분리하고 특성화한 다음 사람 단백질을 수득하고 재조합 기술에 의해서 단백질을 발현하는데 본 발명의 실시를 예시한 것이다.
실시예 1: ADAMTS-5(아그레카나제-2)의 클로닝
PCR 프라이머를 사람 ADAMTS-5(GenBank 수탁번호 AF142099)용으로 공지된 서열로 디자인하였다. ADAMTS-5에 대한 전체길이 암호화 서열을 사람 자궁 cDNA 라이브러리(Genetics Institute/Wyeth Research)로부터 Advantage-GC PCR 키트(Clontech)를 사용하여 증폭시켰다.
ADAMTS-5를 PCR을 사용하여 분리시켰다. 아그레카나제-5의 조직 발현 패턴을 태반, 뇌, 근육, 폐, 심장, 자궁 및 척수를 포함하여 7개의 상이한 올리고 dT 프라이밍된 사람 cDNA 라이브러리의 PCR 증폭에 의해 측정하였다. ADAMTS-5 cDNA의 5' 및 3' 영역을 증폭시킨 PCR 프라이머를 사용하였다. ADAMTS-5의 5' 부분을 증폭시키는 프라이머 서열은 다음과 같다: 5' 프라이머:
5'GACTGACTGAATTCATACCCATAAAGTCCCAGTCGCGCA (서열 16) [이는 8bp 테일(GACTGACT) 및 ADAMTS-5 서열의 개시 코돈(ATG)의 상부에 있는 EcoR1 부위(GAATTC)를 포함한다] 및 3' 프라이머: 5' CAGGGCTTAGATGCATCAATGCTGG(서열 17). ADAMTS-5의 3' 부분을 증폭시키는 프라이머 서열은 다음과 같다 : 5' 프라이머: 5'TACCAGCATTGATGCATCTAAGCCCT(서열 18) 및 3' 프라이머 5'AAATGGGCGCGGCCGCTGCATCGGTGCTGAATCCTCCAGTTATCT(서열 19)[이는 8bp 테일 (AAATGGGC) 및 ADAMTS-5 서열의 개시 코돈(TAG)의 하부에 있는 Not1 부위(GCGGCCGC)을 포함한다]. 적합한 크기의 PCR 산물, 1404bp의 5' 증폭 산물 및 1519의 3' 증폭 산물이 기질로서 자궁 cDNA 라이브러리를 사용하여 발견되었다. Clontech로부터의 Advantage-GC PCR 키트를 PCR 반응용으로 사용하였다. 반응 조건은 다음을 제외하고는 제조원에 의해 추천된 것이었다: 사용된 GC 용융물의 양은 50㎕ 반응물당 10㎕이었고; 사용된 Not1 선형화된 라이브러리의 양은 0.2ng/반응물 ㎕이었으며; 각각의 사용된 올리고의 양은 2 pmol/반응물 ㎕이었다. 사이클링 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 1분동안 1회 사이클; 이어서 95℃에서 15초/68℃에서 2분동안으로 이루어지는 30회 사이클. 증폭으로부터 생성된 2개의 중첩 PCR 산물을, 표준 결찰 효소, 완충제 및 조건을 사용하여, EcoR1 및 Nsi1 (5' 산물) 또는 Nsi1 및 Not1(3'산물)로 분해하고 CHO 발현 벡터 pHTop_new에 결찰시키고, EcoR1 및 Not1로 분해시켰다. 결찰된 산물을 사용하여 ElectroMAX DH10B 세포[공급원: Life Technologies (Carlsbad, CA)]를 형질전환시켰다. 클로닝된 ADAMTS-5의 PCR 단편를 서열분석하여 서열을 밝혀내었다.
전체길이 ADAMTS-5 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 PCR 산물로부터 유도된 컨센서스(consensus) 서열이었다. 공지된 ADAMTS-5에 대한 서열에 비해 2개의 사일런트(silent) 변화가 서열에 반영되어 있다. 이들 변화는 뉴클레오타이드 711번에서 G에서 A로 및 뉴클레오타이드 2046번에서 A에서 G로였다(번호는 ADAMTS-5의 ATG 개시 코돈의 A에 대해 1에서 시작된다). ADAMTS-5 ORF에 대한 개방 판독 프레임(ORF) 및 5' 및 3' 비해독 영역 (UTR)을 포함하는 전체길이 cDNA를 포유동물 발현 벡터 pED6-dpc2로 서브클로닝하였다.
사람 아그레카나제-2(hAgg-2)/ADAMTS-5 단백질을 발현하는 cDNA를 발현 플라스미드 pHTop로 클로닝하였다. 이 플라스미드는 아데노 주요 후기 프로모터의 다수를 제거하고 tet 오페이터의 6개의 반복부위를 삽입함으로써[참조:Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 5547-5551 (1992)] pED [참조:Kaufman, etal., Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490 (1991)]로부터 유도시켰다. hAgg-2를 안정하게 발현하는 CHO 세포주는 pHTop/hAgg-2를 CHO/A2세포내로 형질감염시켜 .05 uM 메토트렉세이트중에서 클론을 선택하였다. 클론을 아그레카나제-2에 특이적인 폴리클로날 항체를 사용하여 조건화된 배지의 웨스턴 분석에 의해 아그레카나제-2 발현용으로 스크리닝하였다. CHO/A2 세포주는 전사 활성화제, 융합을 tet 리프레서와 헤르페스 VP16 전사 활성화 도메인 사이에 안정하게 통합시킴으로써[참조:Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 : 5547-5551 (1992)] CHO DUKX B11 세포[참조: Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 4216-4220 (1980)]로부터 유도시켰다.
C-말단 단백질 정제 태그를 포함하는 절두된 ADAMTS-5 단백질을 3 DNA 단편을 사용하여 상기에 기재한 전체길이 ADAMTS-5 작제물 및 합성 DNA 이중체로부터 작제하였다. ADAMTS-5는 전체길이 아그레카나제 단백질의 아미노산 잔기 752 (Pro)에서 절두되었다. 전체길이 단백질에서 752에서의 프롤린은 전체길이 단백질의 분해 부위의 N-말단이다. 3개의 DNA 단편은 pHTop_new 벡터 골격과 ADAMTS-5의 5'부분을 함유하는 5777 bp SgrA1/Not1 단편, ADAMTS-5를 함유하는 1756 bp SgrA1/BspH1 단편, 및 ADAMTS-5를 함유하는 304 bp BspH1/BsrG1 단편으로 이루어졌다. 110 bp 합성 이중체를 구성하는데 사용하는 4개의 올리고뉴클레오타이드 단편은 다음과 같았다: 올리고뉴클레오타이드 단편 1: 5'GTACAAAGATTGTTGGAACCTTTAATAAGAAAAGTAAGGGTTACACTGACGTGGTGAGGATTC (서열 20); 올리고뉴클레오타이드단편 2: 5'CTGGATCCGGATCTGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAAGGC (서열 21)[이는 GSGSA(서열 22) 펩타이드 링커에 이어서 WSHPQFEK(서열 23) 절두된 ADAMTS-5 단백질의 IBA 융합된 C-말단부터 아미노산 752번까지의 스트렙타비딘-태그II 단백질 정제 태그를 암호화한다], 올리고뉴클레오타이드 단편 3: 5'GGCCGCCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCAGATCCGGATCCAGGAATCCTCAC (서열 24) 및올리고뉴클레오타이드 단편 4: 5'CACGTCAGTGTAACCCTTACTTTTCTTATTAAAGGTTCCAACA ATCTTT (서열 25). 각각의 올리고뉴클레오타이드 분획을 최종 농도 10 pmol/㎕ 멸균수에 희석하였다. 올리고뉴클레오타이드 단편 1 및 4의 동등 용적(10 ㎕ 각각)을 혼합하였다. 올리고뉴클레오타이드 단편 2 및 3의 동등 용적(10 ㎕ 각각)을 혼합하였다. 혼합물을 95℃로 5분 동안 가열한 다음 실온으로 냉각하였다. 각각의 혼합물 1㎕를 상기에서 기재한 바와 같은 3개의 ADAMTS-5 DNA 단편과의 최종 결찰에서 사용하였다. 표준 결찰 효소, 완충액 및 조건을 사용하였다. 결찰된 산물을 사용하여 ElectroMAX DH10B 세포[공급원: Life Technologies (Carlsbad, CA)]를 형질전환시켰다. 클로닝된 합성 올리코뉴클레오타이드를 시퀀싱하여 적합도를 측정하고 서열을 확인하였다. 도 18은 본 발명의 스트렙바비딘-태그된 아그레카나제-2 단백질을 개략적으로 도시한 것이다.
실시예 2: ADAMTS-5-야생형 (WT)과 활성 부위 돌연변이체 (ASM)의 발현
CHO/A2 세포를 리포펙틴(Lipofectin; 제조원: Life Technologies,Inc.)을 사용하여 ADAMTS-5-WT 또는 ASM 발현 벡터로 형질감염시켰다. 당해 세포를 .02, .05, 및 0.1 mM 메토트렉세이트(MTX) 선택의 존재하에 플레이팅하고 37℃, 5% C02에서 2주 동안 항온처리하였다. 콜로니를 수거하고 선택 배지에서 배양하면서 세포주로 증식시켰다.
다른 실험에서, CHO 세포를 도 17에 도시된 바와 같은 아그레카나제-1 활성 부위 돌연변이체로 형질감염시켰다.
실시예 3: ADAMTS-5 활성 부위 돌연변이체의 서브클로닝
ADAMTS-5에서의 E411-Q411 점 돌연변이를 QuickChange 부위-지시된 돌연변이유발 키트(제조원: Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 유발시켰다. 돌연변이유발을 QuickChange 부위-지시된 돌연변이 키트(제조원: Stratagene, 카탈로그 번호 200518)를 사용하여 pHTop/Agg-2상에서 수행하였다. 단일 염기쌍 돌연변이인 2597-G에서 2597-C로의 변이로 아그레카나제-2 단백질(서열 30)의 촉매 도메인내의 411 위치에서의 단일 아미노산 변화(E에서 Q)가 유발되었다. 이러한 돌연변이는 미니-스트로멜리신-1의 촉매활성을 불활성화시키는 것으로 나타났다[참조:Steele et al., Protein Engineering 13: 397-405 (2000)]. hAgg-2(E411Q) 활성 부위 돌연변이체를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 pHTop/hAgg-2(E411 Q)에서 CHO/A2 세포로형질감염시키고 0.05 μM 메토트렉세이트중에서 클론을 선택함으로써 수득하였다. 클론을 아그레카나제-2에 특이적인 폴리클로날 항체를 사용한 조건화된 배지의 웨스턴 분석으로 아그레카나제-2 발현에 대해 스크리닝하였다.
추가로, 본 발명의 아그레카나제-1 분자의 활성 부위에서의 E 에서 Q로의 돌연변이가 유발된다. 도 17은 촉매 도메인내의 E에서 Q로의 돌연변이를 포함하는 본 발명의 재조합 절두된 아그레카나제-1 분자를 개략적으로 도시한 것이다. 이들 아그레카나제-1 분자를 암호화하는 핵산 서열을 적합한 벡터, 예를 들면, 기술된 pHTop내로 클로닝하고 이어서 적합한 세포주, 예를 들면 CHO 세포로 형질감염시킨다. 본 발명의 아그레카나제에 적합한 형질전환제는 상기에서 기재한 바와 같이 선택될 수 있다. 활성 부위 아그레카나제의 발현 수준은 발현되는 아그레카나제에 특이적인 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
실시예 4: 웨스턴 블로팅
ADAMTS-5 WT 또는 ASM을 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지를 환원 조건하에 12% SDS-PAGE 겔에 부가하였다. 이어서 샘플을 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켰다. ADAMTS-5 단백질을 ADAMTS-5에 대한 폴리클로날 항체, 이어서 염소-항-래빗 IgG-HRP 및 화학발광성 기질(Pierce, Milwaukee, WI)로 검출하였다.
다른 실험에서, 아그레카나제-2 단백질을 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지를 12% SDS- PAGE에 부가하였다. 이러한 실험 결과는 도 19에 나타내었다. 요약컨대, CHO 세포를 아미노산 1번 내지 아미노산 567번의 절두된 아그레카나제-2, 또는 아미노산 1번 내지 아미노산 628번의 절두된 아그레카나제-2를 암호화하는 핵산으로 형질 감염시켰다. 안정한 CHO 세포주는 아미노산 1번 내지 아미노산 567번의 아그레카나제-2, 또는 아미노산 1번 내지 628번의 아그레카나제-2 또는 전체길이 아그레카나제-2 분자를 발현하는 것으로 나타났다. 이어서, 세포를 단백질에 대해 수거하고 여러가지 아그레카나제-2 분자용 발현 수준을 아그레카나제-2에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 도 19에 기재된 실험에 의해 입증된 바와 같이, 절두된 아그레카나제 단백질은 전체길이 아그레카나제-2 단백질에 비해 더 높은 안정성으로 인해 높은 수준으로 발현된다.
실시예 5:
모세관 HPLC-질량 분석
재조합 ADAMTS-5-WT 또는 ASM 단백질을 HP-HPLC로 정제하고 1D-SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 추가로 분석하였다. 단백질을 쿠마시(Coommassie) 불루 염색으로 가시화하여, 관심대상의 단백질 밴드를 손으로 절단한 다음, 환원시키고, 알킬화시킨 다음, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C(Promega, Madison, WI)로 동일반응계에서 자동화된 겔내장 분해 로봇을 사용하여 분해하였다. 분해 후, 펩타이드 추출물을 농축시키고 미세전자분무 역상 HPLC에 의해 분리하였다. 펩타이드 분석을 Finigan LCB 이온 트랩 질량 분석기(ThermoQuest, San Jose, CA)상에서 행하였다. 자동화된 분석 MS/MS 데이터는 완전한 게놈으로부터 유래된 단백질의 데이터베이스를 사용하여 Finnigan Bioworks 데이터 분석 패키지(ThermoQuest, San Jose, CA)에 통합된 SEQUEST 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 수행하였다.
실시예 6: 발현된 아그레카나제의 생물학적 활성
발현된 아그레카나제-관련 단백질, 예를 들어, 본 발명의 절두된 아그레카나제의 생물학적 활성을 측정하기 위해, 단백질을 세포 배양물로부터 회수하고, 동시에 생성되는 기타 단백질성 물질뿐만 아니라 기타 오염원으로부터 아그레카나제 관련 단백질을 분리함으로써 제정한다. 정제는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기술을 이용하여 수행한다. 분리된 단백질은 다음 검정에 따라서 검정할 수 있다:
단백질이 아그레카나제 분해 부위에서 아그레칸을 분해할 수 있는 효소인지를 명확하게 측정하기 위한 검정:
형광 펩타이드 검정: 발현된 단백질을 아그레칸의 아그레카나제 분해 부위에 있는 아미노산을 포함하는 합성 펩타이드와 함께 항온처리한다. 합성 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 중 하나를 형광발색단으로 태그화시키고, 나머지 말단에는 소광제(quencher)를 포함시킨다. 펩타이드의 분해는 형광발색단과 소광제를 분리시켜 형광을 유도한다. 상기 검정으로부터, 발현된 아그레카나제 단백질이 아그레카나제 부위에서 아그레칸을 분해시킬 수 있는지가 측정되며, 상대적 형광이 발현된 단백질의 상대적 활성의 측정인자이다.
신에피토프 웨스턴:발현된 아그레카나제 단백질을 무손상 아그레칸과 함께 항온처리한다. 수득되는 샘플을 수차례 생화학적으로 조작(투석, 콘드로이티나제 처리, 동결건조 및 재구성)한 후, 샘플을 SDS PAGE 겔 상에 전개시킨다. 상기 겔을 아그레카나제 분해 후에만 노출되는 아그레칸상의 부위에 대해 특이적인 항체와함께 항온처리한다. 겔을 니트로셀룰로즈지로 옮기고, 아그레카나제에 의해 생성된 아그레칸의 분해 산물과 일치하는 분자량을 갖는 산물의 표시하는 밴드 패턴을 후속적으로 생성시키는 2차 항체를 이용하여 현상하였다(웨스턴 검정으로 지칭됨), 상기 검정으로, 발현된 아그레카나제 단백질이 아그레카나제 분해 부위에서 천연 아그레칸을 분해시켰는지를 알아낼 수 있으며 또한 분해 산물의 분자량을 알 수 있다. 밴드의 상대 밀도는 상대적 아그레카나제 활성의 지표를 제공할 수 있다.
발현된 단백질이 아그레칸 내의 어떠한 위치에서라도 아그레칸을 분해시킬 수 있는지(아그레카나제 부위에 대해 특이적이지 않은지)를 측정하기 위한 검정:
아그레칸 ELISA:발현된 단백질을 플라스틱 웰에 미리 부착시킨 무손상 아그레칸과 함께 항온처리한다. 상기 웰을 세척한 다음, 아그레칸을 검출하는 항체와 함께 항온처리한다. 웰을 2차 항체를 이용하여 현상하였다. 본래 양의 아그레칸이 웰내에 잔류한다면, 항체 염색은 농후할 것이다. 반면에, 아그레칸이 발현된 아그레카나제 단백질의 아그레카나제 활성에 의해 분해되었다면, 아그레칸이 플레이트로부터 방출되어 항체에 의한 아그레칸 피복된 웰의 후속적 염색이 감소될 것이다. 상기 검정은 발현된 단백질이 (아그레카나제 부위뿐만 아니라 아그레칸 단백질 내의 어떠한 위치에서도) 아그레칸을 분해할 수 있는지를 말해주며 상대적 아그레칸 분해를 추가로 측정할 수 있다.
하나의 이러한 실험 결과가 도 20에 제시되어 있는데, 여기서 아그레칸 분해는 아그레칸을 절두된 아그레카나제-2 분자와 함께 항온처리한 후 3B3 ELISA 검정을 사용하여 검출하였다. 도 20에 나타낸 이러한 실험 결과는 절두된 아그레카나제; 예를 들면 아미노산 1번 내지 567번의 아그레카나제-2 및 아미노산 1번 내지 628번의 아그레카나제-2와 함께 항온처리한 후의 % 아그레카나제 분해율을 포함한다. 도 20에 나타난 바와 같이, 하나 또는 두 개의 TSP 도메인이 결실된 본 발명의 절두된 아그레카나제는 생물학적으로 활성이다.
분리된 단백질의 단백질 분석은 은[참조: Oakley, et al., Anal Biochem. 105: 361 (1980)]으로 염색된 SDS-PAGE 아크릴아미드[참조: Laemmli, Nature 227: 680 (1970)] 및 면역블롯[참조: Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)]과 같은 표준 기술을 이용하여 수행한다. 상기한 검정을 이용함으로써, 발현된 아그레카나제-관련 단백질이 이의 활성에 대해 평가되고 유용한 아그레카나제 관련 분자가 확인된다.
활성 검정: 미세역가 플레이트(Costar)를 히알루론산(ICN),이어서 콘드로이티나제(Seikagaku Chemicals)-처리된 소의 아그레칸으로 피복하였다. WT ADAMTS-5 또는 ADAMTS-5 ASM을 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지를 아그레칸-피복된 플레이트에 가하였다. 구체사이 도메인내의 E373-A374에서 분해된 아그레칸을 세척제거하였다. 잔류하는 미분해된 아그레칸을 3B3 항체(ICN), 이어서 항-IgM-HRP 2차 항체(Southern Biotechnology)로 검출하였다. 최종 발색은 3,3",5,5" 테트라메틸벤지딘(TMB, BioFx Laboratories)을 이용한 것이었다.
ADAMTS-5를 불활성 전구형태(~90kDa)로 합성하고 푸린에 의해 가공처리하여 ~70kDa의 성숙 종을 수득하였다. ADAMTS-5로 형질감염된 CHO로부터의 조건화된 배지는 소량의 활성인 성숙한 단백질을 발현시켰다. 발현된 주된 종은 ~55kDa의 단백질인데 이는 성숙 단백질의 분해산물을 나타내는 것이다.
ADAMTS-5로 형질감염된 안정한 CHO 세포주로부터의 조건화된 배지는 효소가 분해되어 ~55kDa 종을 산출했음을 나타내었다. 단축형의 질량 분석 및 N-말단 서열분석으로부터, 분해가 스페이서 도메인내의 E753-G754잔기 사이에서 발생한 것으로 나타났다. EDTA 또는 비특이적 하이드록사메이트 메탈로프로테아제 억제제의 존재하에, 전체길이의 성숙한 ~70kDa 단백질이 보존되었다. 이러한 분해는 자가 촉매적이고 CHO 조건화된 배지에 존재하는 효소로 인한 것이 아니다. 부위 특이적 돌연변이유발을 수행하여 ADAMTS-5의 촉매적 HELGH 모티프(서열 26)내에서 E411-Q411를돌연변이시켰다. 안정한 CHO 세포주를 이러한 ADAMTS-5 활성 부위-돌연변이체(ADAMTS-5 ASM)를 사용하여 제조하였다. ADAMTS-5 ASM으로 형질감염된 CHO 안정한 세포주는 ELISA에 의해 나타나 바와 같이(도 16) 아그레카나제 활성이 결여되었다. 단축된 55kDa 형태보다 오히려 전체길이 ~70kDa 단백질이 ADAMTS-5 ASM을 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지의 웨스턴 블롯에서 주성분이었다.
상기 기술한 실시예는 재조합 ADAMTS-5가 스페이서 도메인내에서 잔기 E753-G754에서의 단백질분해성 분해에 대해 감수성임을 입증하는 것이다. 이러한 분해로 성숙 단백질의 크기가 ~55kDa로 감소되었고 EDTA 및 비특이적 하이드록사메이트 메탈로프로테아제 억제제에 의해 억제되었다. ADAMTS-5의 촉매적 도메인내에서의 점돌연변이는 단백질의 효소 활성을 불활성화하고 전체길이 단백질이 분해되지 못하도록 하였다. 따라서 단백질분해 과정은 자가 촉매적이고 CHO 세포의 조건화된 배지에 존재하는 프로테아제로 인한 것이 아닌 것으로 생각된다.
실시예 7: 아그레카나제의 발현
쥐, 사람 또는 기타 포유동물 아그레카나제 관련 단백질을 제조하기 위해, 아그레카나제 단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 발현 벡터내로 클로닝하고, 통상의 유전공학 기술을 사용하여 포유동물 세포 또는 곤충 숙주 세포 배양 시스템을 포함하는 기타 바람직한 원핵 또는 진핵 숙주내로 도입시켰다. 생물학적 활성 재조합 사람 아그레카나제에 대한 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 포유동물, 곤충, 효모 또는 세균성 세포를 포함하는 것으로 고려된다.
당업자는 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3의 뉴클레오타이드 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 도 5의 뉴클레오타이드 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 도 7의 뉴클레오타이드 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 도 9의 뉴클레오타이드 서열; 또는 아그레카나제 또는 아그레카나제 유사 단백질을 암호화하는 기타 DNA 서열 또는 기타 변형된 서열 및 공지된 벡터, 예를 들면 pCD[참조:Okayamaet al., Mol. Cell Biol., 2: 161-170 1982)], pJL3, pJL4[참조: Gough et al., EMBO J., 4: 645-653(1985)] 및 pMT2 CXM을 사용하여 포유동물 발현 벡터를 작제할 수 있다.
포유동물 발현 벡터 pMT2 CXM은 p91023(b)[참조문헌: Wong et al., Science228:810-815 (1985)]의 유도체이며, 테트라사이클린 내성 유전자 대신에 암피실린 내성 유전자를 함유하고 cDNA 분자를 벡터내로 삽입하기 위한 XhoI 부위를 추가로 함유한다는 점에서 p91023(b)와 상이하다. pMT2 CXM의 작용적 요소는 기술된 바 있으며[참조: Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985)] 아데노바이러스 VA 유전자, 72bp 인핸서를 포함하는 SV40 복제 오리진, 5' 스플라이싱 부위 및 아데노바이러스 후기 mRNA상에 존재하는 대다수의 아데노바이러스 3부분 리더 서열(adenovirus tripartite leader sequence)을 포함하는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, DHFR 삽입체, SV40 초기 폴리아데닐화 부위(SV40) 및 이. 콜라이내에서의 증식에 필요한 pBR322 서열을 포함한다.
플라스미드 pMT2 CXM은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Rockville, MD, USA)에 수탁번호 제ATCC 67122호로서 기탁된 pMT2-VWF를 EcoRI로 분해시켜 수득하였다. EcoRI 분해는 pMT2-VWF내에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 연결될 수 있으며 이. 콜라이 HB 101 또는 DH-5를 형질전환시키는데 사용할 수 있는 직쇄 형태의 pMT2를 산출하였는데, 이는 암피실린에 대해 내성이다. 플라스미드 pMT2 DNA는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 이어서, pMT2 CXM을 루프아웃(loopout)/루프인(loopin) 돌연변이유발 기술[참조: Morinaga, et al., Biotechnology 84:636 (1984)]을 이용하여 작제한다. 이로써 SV40 복제 오리진 및 pMT2의 인핸서 서열 부근의 Hind III 부위에 대해 염기 1075번 내지 1145번이 제거된다. 또한, 이는 뉴클레오타이드 1145번에 다음 서열을 삽입시킨다: 5'PO-CATGGGCAGCTCGAG 3'(서열 27). 상기 서열은 제한 엔도뉴클레아제 Xho I에 대한 인식 부위를 함유한다.pMT23로 명명되는, pMT2 CXM의 유도체는 제한 엔도뉴클레아제 PstI, EcoRI, SaII 및 XhoI에 대한 인식 부위를 함유한다. 플라스미드 pMT2 CXM 및 pMT23 DNA는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
또한, pMT21로부터 유도된 pEMC2β1이 본 발명의 실행에 있어 적합할 수 있다. pMT21은 pMT2-VWF로부터 유도된 pMT2로부터 유도하였다. 상기한 바와 같이, EcoRI 분해는 pMT-VWF 내에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 후속적으로 연결될 수 있고 이. 콜라이 HB 101 또는 DH-5를 형질전환하는데 사용하여 암피실린 내성을 초래할 수 있는 직쇄 형태의 pMT2를 생성시킨다. 플라스미드 pMT2 DNA는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
pMT21은 다음의 2가지 변형을 통해 pMT2로부터 유도하였다. 먼저, cDNA 클로닝을 위해 G/C-말단으로부터의 19개 G 잔기의 신장부를 포함하는, DHFR cDNA의 76bp의 5' 비전사된 영역을 결실시킨다. 이 과정에서는, XhoI 부위를 삽입시켜 DHFR로부터 바로 상부에 위치하는 다음의 서열을 수득하였다:
(서열 28 )
두번째, EcoRV 및 XbaI로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편으로 처리하고 ClaI 링커(CATCGATG)에 연결시켜 고유의 ClaI 부위를 도입시켰다. 이로써 아데노바이러스 관련 RNA(VAI) 영역으로부터 250bp 절편이 결실되지만, VAI RNA 유전자 발현 또는 기능은 손상되지 않는다. pMT21을 EcoRI 및 XhoI로 분해시키고 벡터 pEMC2B1를 유도하는데 사용하였다.
EMCV 리더의 일부분은 pMT2-ECAT1[참조: S. K. Jung, et al., J. Virol 63 : 1651-1660 (1989)]을 EcoRI 및 PstI로 분해시켜 2752bp 단편을 수득함으로써 수득하였다. 상기 단편을 TaqI로 분해하여 508bp의 Eco RI-TaqI 단편을 수득하고, 이를 저융점 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리시켰다. 68bp의 어댑터 및 이의 상보 쇄를 다음 서열을 갖는 5'TaqI 돌출 말단 및 3'XhoI 돌출 말단으로 합성하였다:
(서열 29)
상기 서열은 뉴클레오타이드 763번 내지 827번의 EMC 바이러스 리더 서열에 매치된다. 이는 또한 EMC 바이러스 리더내의 위치 10에 있는 ATG를 ATT로 변화시키며 이 다음에 XhoI 부위가 위치한다. pMT21 EcoRI-XhoI 단편, EMC 바이러스 EcoRl-TaqI 단편 및 68bp 올리고뉴클레오타이드 TaqI-XhoI 어댑터의 3방향 연결(three way ligation)로 벡터 pEMC2β1를 수득하였다.
상기 벡터는 포유동물 세포에서 목적하는 cDNA의 고수준 발현을 지시하기에 적절한 관련성이 있게 SV40 복제 오리진과 인핸서, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 아데노바이러스 3부분 리더 서열 중 대다수의 cDNA 복사체, 소형 하이브리드 개재 서열, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 아데노바이러스 VAI 유전자, DHFR 및 β-락타마제 마커 및 EMC 서열을 함유한다.
벡터의 작제는 아그레카나제 관련 DNA 서열의 변형을 포함할 수 있다. 예를들면, 아그레카나제를 암호화하는 cDNA는 암호화 영역 5' 및 3' 말단에서 비암호화 뉴클레오타이드를 제거함으로써 변형시킬 수 있다. 제거된 비암호화 뉴클레오타이드는, 발현에 유익한 것으로 공지된 다른 서열에 의해 대체되지 않거나 대체될 수 있다. 이들 벡터는 아그레카나제 또는 아그레카나제 유사 단백질 발현을 위한 적합한 숙주 세포로 형질전환된다. 추가로, 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 도 5의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 도 7의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 도 9의 서열 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 본 발명의 아그레카나제 또는 아그레카나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 기타 서열을, 아그레카나제 암호화 폴리펩타이드 서열을 제거하고 이를 기타 아그레카나제 단백질의 완전 폴리펩타이드를 암호화하는 서열로 대체함으로써 아그레카나제 또는 아그레카나제 유사 단백질을 발현하도록 조작할 수 있다.
당업자는, 절두된 아그레카나제 분자의 세포내 또는 세포외 발현을 위한 세균성 벡터를 생성시키기 위해 암호화 서열을 플랭킹하는 포유동물 조절 서열을 제거하거나 이를 세균 서열로 대체함으로써 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2259번(gaa)의 도 3의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 도 5의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 도 7의 서열; 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 도 9의 서열; 또는 도 23 및 도 24에 제시된 도 12 및 도 13의 아그레카나제 분자를 암호화하는 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 조작할 수 있다. 예를 들면, 암호화 서열을 추가로 조작할 수 있다(예를 들어 기타공지된 링커에 결찰시키거나 비암호화 서열을 암호화 서열로부터 제거하거나 기타 공지된 기술에 의해 암호화 서열내의 뉴클레오타이드를 변경함으로써 조작할 수 있다). 이어서, 변형된 아그레카나제 암호화 서열을 문헌[참조: T. Taniguchiet al., Proc.Natl Acad. Sci. USA, 77: 5230-5233 (1980)]에 기술된 방법으로 공지된 세균성 벡터에 삽입할 수 있었다. 이어서 이들 예시적인 세균성 벡터를 세균성 숙주 세포로 형질전화시켜 본 발명의 아그레카나제 단백질을 발현시킬 수 있었다. 세균성 숙주 세포에서의 아그레카나제 관련 단백질의 세포외 발현을 제조하기 위한 전략은 예를 들어, 유럽특허원 EPA 제177,343호를 참조할 수 있다.
유사한 조작을 수행하여 곤충 세포에서의 발현을 위해 곤충 벡터를 작제할 수 있다[참조예: 공개된 유럽 특허원 제155,476호에 기재된 방법). 효모 벡터를 또한 효모 세포에 의한 본 발명의 인자의 세포내 또는 세포외 발현을 위한 효모 조절성 서열을 사용하여 작제할 수 있었다[참조예: 공개된 PCT W086/00639 및 유럽특허원 EPA 제123,289호에 기재된 방법].
고 수준의 본 발명의 아그레카나제 관련 단백질을 포유동물, 세균, 효모 또는 곤충 숙주 세포 시스템에서 제조하는 방법은 이종 아그레카나제 관련 유전자의 다수의 복사체를 함유하는 세포를 작제함을 포함할 수 있다. 이종 유전자는 증폭가능한 마커, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자에 연결시키는데, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)에 대해 증가된 유전자 복사체를 함유할 수 있는 세포를 문헌[참조: Kaufman and Sharp, J Mol Biol, 159:601-629 (1982)]의 방법에 따라 증가되는 메토트렉세이트(MTX) 농도하에 증식에 대해 선택할 수 있다.이러한 접근 방식은 다수의 상이한세포 유형으로 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 아그레카나제 관련 단백질이 발현될 수 있게 하는 다른 플라스미드 서열과 작동적으로 결합된 본 발명의 아그레카나제 관련 단백질에 대한 DNA 서열을 함유하는 플라스미드와 DHFR 발현 플라스미드 pAdA26SV(A)3[참조: Kaufman and Sharp, Mol Cell Biol 2:1304 (1982)]를 인산칼슘 공침전 및 형질감염, 전기천공 또는 원형질체 융합을 포함하는 방법에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII내로 동시도입시킬 수 있다. DNFR 발현 형질전환체는 투석된 태아 송아지 혈청을 함유하는 알파 배지에서의 성장에 대해 선별한 다음, 문헌[참조: Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983)]에 기재되어 있는 바와 같이 증가되는 MTX 농도(예: 0.02, 0.2, 1.0 및 5μM MTX의 연속적 단계)하에서 성장에 의한 증폭에 대해 선별한다. 형질전환체를 클로닝하고, 생물학적 활성 아그레카나제 발현을 상기한 검정으로 모니터링한다. 아그레카나제 단백질 발현은 MTX 내성의 수준이 증가됨에 따라 함께 증가할 것이다. 아그레카나제 단백질은35S 메티오닌 또는 시스테인으로의 펄스 표지화 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 당해 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 특성화한다. 유사한 방법을 수행하여 다른 관련된 아그레카나제 관련 단백질을 제조할 수 있다.
하나의 예로서, 서열 1에 제시된 본 발명의 아그레카나제 뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 pED6[참조: Kaufman et al., Nucleic Acid Res 19:44885-4490 (1991)]내로 클로닝시킬 수 있다. COS 및 CHO DUKX B11 세포를 리포펙션(lipofection)(LF2000, 제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 본 발명의 아그레카나제 서열로 일시적으로 형질감염시켰다(+/- 개별적 pED6 플라스미드상의 PACE의 공형질감염). 2중 형질감염을 각 관심대상의 유전자에 대해 수행하였다: (a) 활성 검정용으로 조건화된 배지를 수거하기 위한 형질감염 및 (b)35S 메티오닌/시스테인 대사성 표지화를 위한 형질감염.
1일째에, 배지를 활성 검정을 위해 수거될 한 세트의 형질감염(a)을 위해 DME(COS) 또는 알파(CHO) 배지 + 1% 열-불활성화된 태아 송아지 혈청 +/-100㎍/ml 헤파린으로 교체하였다. 48시간(4일째) 후, 조건화된 배지를 활성 검정을 위해 수거하였다.
3일째에, 2중 세트의 형질감염(b)의 세포용 배지를 MEM(메티오닌 비함유/시스테인 비함유) 배지 + 1% 열-불활성화된 태아 송아지 혈청 +100㎍/ml 헤파린 + 100pCi/ml35S-메티오닌/시스테인(RedivueTMPro mix, 제조원: Amersham, Piscataway, NJ)로 교체하였다. 37℃에서 6시간 동안 항온처리한 후, 조건화된 배지를 수거하고 환원 조건하에 SDS-PAGE 겔상에서 전개시켰다. 단백질을 자가방사선술로 가시화하였다.
실시예 8: 발현된 아그레카나제의 생물학적 활성
상기 실시예에서 수득된 발현된 아그레카나제 관련 단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위해서, 단백질을 세포 배양물부터 회수하고 동시 생성되는 기타 단백질성 물질 뿐만 아니라 기타 오염원으로부터 아그레카나제 관련 단백질을 분리함으로써 정제한다. 정제된 단백질을 상기 기재된 검정법에 따라서 검정할 수 있다. 정제는 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행한다.
단백질 분석은 은[참조: Oakley, et al., Anal Biochem. 105: 361 (1980)]으로 염색된 SDS-PAGE 아크릴아미드[참조: Laemmli, Nature 227: 680 (1970)] 및 면역블롯[참조: Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)]과 같은 표준 기술을 이용하여 수행한다.
상기 설명은 본원에서 본 발명의 바람한 양태를 상술한다. 이의 실시에 있어 다수의 변형 및 변화가 상기 설명의 고려시에 상기 설명의 당해 분야의 숙련가에게 발생할 것으로 예상된다. 이러한 변형 및 변화는 본원에 첨부되는 청구의 범위내에 포함되는 것으로 사료된다.
<110> WYETH <120> Truncated Aggrecanase Molecules <130> 5-1998-071710-7 <150> 60/354,592 <151> 2002-02-05 <160> 33 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 5533 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cttgactcaa tcctgcaagc aagtgtgtgt gtgtccccat cccccgcccc gttaacttca 60 tagcaaataa caaataccca taaagtccca gtcgcgcagc ccctccccgc gggcagcgca 120 ctatgctgct cgggtgggcg tccctgctgc tgtgcgcgtt ccgcctgccc ctggccgcgg 180 tcggccccgc cgcgacacct gcccaggata aagccgggca gcctccgact gctgcagcag 240 ccgcccagcc ccgccggcgg cagggggagg aggtgcagga gcgagccgag cctcccggcc 300 acccgcaccc cctggcgcag cggcgcagga gcaaggggct ggtgcagaac atcgaccaac 360 tctactccgg cggcggcaag gtgggctacc tcgtctacgc gggcggccgg aggttcctct 420 tggacctgga gcgagatggt tcggtgggca ttgctggctt cgtgcccgca ggaggcggga 480 cgagtgcgcc ctggcgccac cggagccact gcttctatcg gggcacagtg gacgctagtc 540 cccgctctct ggctgtcttt gacctctgtg ggggtctcga cggcttcttc gcggtcaagc 600 acgcgcgcta caccctaaag ccactgctgc gcggaccctg ggcggaggaa gaaaaggggc 660 gcgtgtacgg ggatgggtcc gcacggatcc 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ggcgcaggag caaggggctg gtgcagaaca 240 tcgaccaact ctactccggc ggcggcaagg tgggctacct cgtctacgcg ggcggccgga 300 ggttcctctt ggacctggag cgagatggtt cggtgggcat tgctggcttc gtgcccgcag 360 gaggcgggac gagtgcgccc tggcgccacc ggagccactg cttctatcgg ggcacagtgg 420 acgctagtcc ccgctctctg gctgtctttg acctctgtgg gggtctcgac ggcttcttcg 480 cggtcaagca cgcgcgctac accctaaagc cactgctgcg cggaccctgg gcggaggaag 540 aaaaggggcg cgtgtacggg gatgggtccg cacggatcct gcacgtctac acccgcgagg 600 gcttcagctt cgaggccctg ccgccgcgcg ccagctgcga aacccccgcg tccacaccgg 660 aggcccacga gcatgctccg gcgcacagca acccgagcgg acgcgcagca ctggcctcgc 720 agctcttgga ccagtccgct ctctcgcccg ctgggggctc aggaccgcag acgtggtggc 780 ggcggcggcg ccgctccatc tcccgggccc gccaggtgga gctgcttctg gtggctgacg 840 cgtccatggc gcggttgtat ggccggggcc tgcagcatta cctgctgacc ctggcctcca 900 tcgccaatag gctgtacagc catgctagca tcgagaacca catccgcctg gccgtggtga 960 aggtggtggt gctaggcgac aaggacaaga gcctggaagt gagcaagaac gctgccacca 1020 cactcaagaa cttttgcaag tggcagcacc aacacaacca gctgggagat gaccatgagg 1080 agcactacga tgcagctatc ctgtttactc gggaggattt atgtgggcat cattcatgtg 1140 acaccctggg aatggcagac gttgggacca tatgttctcc agagcgcagc tgtgctgtga 1200 ttgaagacga tggcctccac gcagccttca ctgtggctca cgaaatcgga catttacttg 1260 gcctctccca tgacgattcc aaattctgtg aagagacctt tggttccaca gaagataagc 1320 gcttaatgtc ttccatcctt accagcattg atgcatctaa gccctggtcc aaatgcactt 1380 cagccaccat cacagaattc ctggatgatg gccatggtaa ctgtttgctg gacctaccac 1440 gaaagcagat cctgggcccc gaagaactcc caggacagac ctacgatgcc acccagcagt 1500 gcaacctgac attcgggcct gagtactccg tgtgtcccgg catggatgtc tgtgctcgcc 1560 tgtggtgtgc tgtggtacgc cagggccaga tggtctgtct gaccaagaag ctgcctgcgg 1620 tggaagggac gccttgtgga aaggggagaa tctgcctgca gggcaaatgt gtggacaaaa 1680 ccaagaaaaa atattattca acgtcaagcc atggcaactg gggatcttgg ggatcctggg 1740 gccagtgttc tcgctcatgt ggaggaggag tgcagtttgc ctatcgtcac tgtaataacc 1800 ctgctcccag aaacaacgga cgctactgca cagggaagag ggccatctac cgctcctgca 1860 gtctcatgcc ctgcccaccc aatggtaaat catttcgtca tgaacagtgt gaggccaaaa 1920 atggctatca gtctgatgca aaaggagtca aaacttttgt ggaatgggtt cccaaatatg 1980 caggtgtcct gccagcggat gtgtgcaagc tgacctgcag agccaagggc actggctact 2040 atgtggtatt ttctccaaag gtgaccgatg gcactgaatg taggccgtac agtaattccg 2100 tctgcgtccg ggggaagtgt gtgagaactg gctgtgacgg catcattggc tcaaagctgc 2160 agtatgacaa gtgcggagta tgtggaggag acaactccag ctgtacaaag attgttggaa 2220 cctttaataa gaaaagtaag ggttacactg acgtggtgag gattcctgga tccggatctg 2280 cttggagcca cccgcagttc gaaaaataag gcggccgc 2318 <210> 15 <211> 763 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly 20 25 30 Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu 50 55 60 Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg 85 90 95 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catalytic motif <400> 26 His Glu Leu Gly His 1 5 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 27 catgggcagc tcgag 15 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 28 ctgcaggcga gcctgaattc ctcgagccat catg 34 <210> 29 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic adapter sequence <400> 29 cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 60 acgattgc 68 <210> 30 <211> 930 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly 20 25 30 Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly 35 40 45 Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu 50 55 60 Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu 65 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ttgacaagtg catggtgtgc ggaggggacg gttctggttg 2460 cagcaagcag tcaggctcct tcaggaaatt caggtacgga tacaacaatg tggtcactat 2520 ccccgcgggg gccacccaca ttcttgtccg gcagcaggga aaccctggcc accggagcat 2580 ctacttggcc ctgaagctgc cagatggctc ctatgccctc aatggtgaat acacgctgat 2640 gccctccccc acagatgtgg tactgcctgg ggcagtcagc ttgcgctaca gcggggccac 2700 tgcagcctca gagacactgt caggccatgg gccactggcc cagcctttga cactgcaagt 2760 cctagtggct ggcaaccccc aggacacacg cctccgatac agcttcttcg tgccccggcc 2820 gaccccttca acgccacgcc ccactcccca ggactggctg caccgaagag cacagattct 2880 ggagatcctt cggcggcgcc cctgggcggg caggaaataa cctcactatc ccggctgccc 2940 tttctgggca ccggggcctc ggacttagct gggagaaaga gagagcttct gttgctgcct 3000 catgctaaga ctcagtgggg aggggctgtg ggcgtgagac ctgcccctcc tctctgccct 3060 aatgcgcagg ctggccctgc cctggtttcc tgccctggga ggcagtgatg ggttagtgga 3120 tggaaggggc tgacagacag ccctccatct aaactgcccc ctctgccctg cgggtcacag 3180 gagggagggg gaaggcaggg agggcctggg ccccagttgt atttatttag tatttattca 3240 cttttattta gcaccaggga aggggacaag gactagggtc ctggggaacc tgacccctga 3300 cccctcatag ccctcaccct ggggctagga aatccagggt ggtggtgata ggtataagtg 3360 gtgtgtgtat gcgtgtgtgt gtgtgtgtga aaatgtgtgt gtgcttatgt atgaggtaca 3420 acctgttctg ctttcctctt cctgaatttt attttttggg aaaagaaaag tcaagggtag 3480 ggtgggcctt cagggagtga gggattatct tttttttttt ttctttcttt ctttcttttt 3540 tttttttgag acagaatctc gctctgtcgc ccaggctgga gtgcaatggc acaatctcgg 3600 ctcactgcat cctccgcctc ccgggttcaa gtgattctca tgcctcagcc tcctgagtag 3660 ctgggattac aggctcctgc caccacgccc agctaatttt tgttttgttt tgtttggaga 3720 cagagtctcg ctattgtcac cagggctgga atgatttcag ctcactgcaa ccttcgccac 3780 ctgggttcca gcaattctcc tgcctcagcc tcccgagtag ctgagattat aggcacctac 3840 caccacgccc ggctaatttt tgtattttta gtagagacgg ggtttcacca tgttggccag 3900 gctggtctcg aactcctgac cttaggtgat ccactcgcct tcatctccca aagtgctggg 3960 attacaggcg tgagccaccg tgcctggcca cgcccaacta atttttgtat ttttagtaga 4020 gacagggttt caccatgttg gccaggctgc tcttgaactc ctgacctcag gtaatcgacc 4080 tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgagc caccacgccc ggtacatatt 4140 ttttaaattg aattctacta tttatgtgat ccttttggag tcagacagat gtggttgcat 4200 cctaactcca tgtctctgag cattagattt ctcatttgcc aataataata cctcccttag 4260 aagtttgttg tgaggattaa ataatgtaaa taaagaacta gcataac 4307 <210> 32 <211> 1726 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 atgtcccaga caggctcgca tcccgggagg ggcttggcag ggcgctggct gtggggagcc 60 caaccctgcc tcctgctccc cattgtgccg ctctcctggc tggtgtggct gcttctgcta 120 ctgctggcct ctctcctgcc ctcagcccgg ctggccagcc ccctcccccg ggaggaggag 180 atcgtgtttc cagagaagct caacggcagc gtcctgcctg gctcgggcac ccctgccagg 240 ctgttgtgcc gcttgcaggc ctttggggag acgctgctac tagagctgga gcaggactcc 300 ggtgtgcagg tcgaggggct gacagtgcag tacctgggcc aggcgcctga gctgctgggt 360 ggagcagagc ctggcaccta cctgactggc accatcaatg gagatccgga gtcggtggca 420 tctctgcact gggatggggg agccctgtta ggcgtgttac aatatcgggg ggctgaactc 480 cacctccagc ccctggaggg aggcacccct aactctgctg ggggacctgg ggctcacatc 540 ctacgccgga agagtcctgc cagcggtcaa ggtcccatgt gcaacgtcaa ggctcctctt 600 ggaagcccca gccccagacc ccgaagagcc aagcgctttg cttcactgag tagatttgtg 660 gagacactgg tggtggcaga tgacaagatg gccgcattcc acggtgcggg gctaaagcgc 720 tacctgctaa cagtgatggc agcagcagcc aaggccttca agcacccaag catccgcaat 780 cctgtcagct tggtggtgac tcggctagtg atcctggggt caggcgagga ggggccccaa 840 gtggggccca gtgctgccca gaccctgcgc agcttctgtg cctggcagcg gggcctcaac 900 acccctgagg actcggaccc tgaccacttt gacacagcca ttctgtttac ccgtcaggac 960 ctgtgtggag tctccacttg cgacacgctg ggtatggctg atgtgggcac cgtctgtgac 1020 ccggctcgga gctgtgccat tgtggaggat gatgggctcc agtcagcctt cactgctgct 1080 catgaactgg gtcatgtctt caacatgctc catgacaact ccaagccatg catcagtttg 1140 aatgggcctt tgagcacctc tcgccatgtc atggcccctg tgatggctca tgtggatcct 1200 gaggagccct ggtccccctg cagtgcccgc ttcatcactg acttcctgga caatggctat 1260 gggcactgtc tcttagacaa accagaggct ccattgcatc tgcctgtgac tttccctggc 1320 aaggactatg atgctgaccg ccagtgccag ctgaccttcg ggcccgactc acgccattgt 1380 ccacagctgc cgccgccctg tgctgccctc tggtgctctg gccacctcaa tggccatgcc 1440 atgtgccaga ccaaacactc gccctgggcc gatggcacac cctgcgggcc cgcacaggcc 1500 tgcatgggtg gtcgctgcct ccacatggac cagctccagg acttcaatat tccacaggct 1560 ggtggctggg gtccttgggg accatggggt gactgctctc ggacctgtgg gggtggtgtc 1620 cagttctcct cccgagactg cacgaggcct gtcccccgga atggtggcaa gtactgtgag 1680 ggccgccgta cccgcttccg ctcctgcaac actgaggact gcccaa 1726 <210> 33 <211> 1561 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atgtcccaga caggctcgca tcccgggagg ggcttggcag ggcgctggct gtggggagcc 60 caaccctgcc tcctgctccc cattgtgccg ctctcctggc tggtgtggct gcttctgcta 120 ctgctggcct ctctcctgcc ctcagcccgg ctggccagcc ccctcccccg ggaggaggag 180 atcgtgtttc cagagaagct caacggcagc gtcctgcctg gctcgggcac ccctgccagg 240 ctgttgtgcc gcttgcaggc ctttggggag acgctgctac tagagctgga gcaggactcc 300 ggtgtgcagg tcgaggggct gacagtgcag tacctgggcc aggcgcctga gctgctgggt 360 ggagcagagc ctggcaccta cctgactggc accatcaatg gagatccgga gtcggtggca 420 tctctgcact gggatggggg agccctgtta ggcgtgttac aatatcgggg ggctgaactc 480 cacctccagc ccctggaggg aggcacccct aactctgctg ggggacctgg ggctcacatc 540 ctacgccgga agagtcctgc cagcggtcaa ggtcccatgt gcaacgtcaa ggctcctctt 600 ggaagcccca gccccagacc ccgaagagcc aagcgctttg cttcactgag tagatttgtg 660 gagacactgg tggtggcaga tgacaagatg gccgcattcc acggtgcggg gctaaagcgc 720 tacctgctaa cagtgatggc agcagcagcc aaggccttca agcacccaag catccgcaat 780 cctgtcagct tggtggtgac tcggctagtg atcctggggt caggcgagga ggggccccaa 840 gtggggccca gtgctgccca gaccctgcgc agcttctgtg cctggcagcg gggcctcaac 900 acccctgagg actcggaccc tgaccacttt gacacagcca ttctgtttac ccgtcaggac 960 ctgtgtggag tctccacttg cgacacgctg ggtatggctg atgtgggcac cgtctgtgac 1020 ccggctcgga gctgtgccat tgtggaggat gatgggctcc agtcagcctt cactgctgct 1080 catgaactgg gtcatgtctt caacatgctc catgacaact ccaagccatg catcagtttg 1140 aatgggcctt tgagcacctc tcgccatgtc atggcccctg tgatggctca tgtggatcct 1200 gaggagccct ggtccccctg cagtgcccgc ttcatcactg acttcctgga caatggctat 1260 gggcactgtc tcttagacaa accagaggct ccattgcatc tgcctgtgac tttccctggc 1320 aaggactatg atgctgaccg ccagtgccag ctgaccttcg ggcccgactc acgccattgt 1380 ccacagctgc cgccgccctg tgctgccctc tggtgctctg gccacctcaa tggccatgcc 1440 atgtgccaga ccaaacactc gccctgggcc gatggcacac cctgcgggcc cgcacaggcc 1500 tgcatgggtg gtcgctgcct ccacatggac cagctccagg acttcaatat tccacaggct 1560 g 1561

Claims (30)

  1. 하나 이상의 TSP 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 생물학적으로 활성인 아그레카나제 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 하나의 TSP 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 아그레카나제 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 서열 4, 6, 8 및 13, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아그레카나제 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 두개의 TSP 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 아그레카나제 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 서열 10, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아그레카나제 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 아그레카나제 단백질에 결합하는 항체.
  7. 제6항에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일특이성 항체, 다특이성 항체, 비특이적 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이된 항체, 이식된 항체, 및 시험관내에서 생성된 항체중의 하나 이상으로부터 선택되는 항체.
  8. 제6항에 있어서, 아그레카나제 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
  9. 제6항에 있어서, 전체길이 항체, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd 및 dAb로부터 선택되는 항체.
  10. 제1항의 아그레카나제 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    (a) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2259번(gaa)의 서열 3의 서열;
    (b) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 2256번(cct)의 서열 5의 서열;
    (c) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1884번(ttt)의 서열 7의 서열;
    (d) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1701번(cat)의 서열 9의 서열;
    (e) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1725번(cca)의 서열 32의 서열;
    (f) 뉴클레오타이드 1번(atg) 내지 1560번(gct)의 서열 33의 서열;
    (g) 엄격한 조건(stringent condition)하에 서열 3, 5, 7, 9, 32 및 33과 하이브리드화하는 서열 및
    (h) (a) 내지 (g)의 단편 및 변이체로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자.
  12. 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 제11항에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제11항에 따른 DNA 서열로 형질전환된 숙주 세포.
  14. (a) 제10항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및
    (b) 당해 DNA 분자에 의해 암호화되는 절두된 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 정제된 절두된 아그레카나제 단백질의 제조방법.
  15. (a) 서열 3, 5, 7, 9, 32, 33, 또는 이의 단편 또는 변이체 중 하나 이상의 DNA 분자로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및
    (b) 서열 4, 6, 8, 10, 12 및 13 각각 중 하나 이상, 또는 이의 단편 또는 변이체의 아미노산 서열을 갖는 절두된 아그레카나제 단백질을 배양 배지로부터회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 정제된 절두된 아그레카나제 단백질의 제조방법.
  16. 제14항 또는 제15항의 정제된 절두된 아그레카나제 단백질에 결합하는 항체.
  17. 제16항에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일특이성 항체, 다특이성 항체, 비특이적 항체, 사람화 항체, 사람 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이된 항체, 이식된 항체, 및 시험관내에서 생성된 항체중의 하나 이상으로부터 선택되는 항체.
  18. 제16항에 있어서, 아그레카나제 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
  19. 제16항에 있어서, 전체길이 항체, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 및 dAb로부터 선택되는 항체.
  20. (a) 서열 4, 6, 8, 10, 12, 13에 제시된 하나 이상의 아그레카나제 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 하나 이상의 시험 샘플과 배합하는 단계 및
    (b) 시험 샘플이 단계(a)의 아그레카나제 활성을 억제하는지를 평가하는 단계를 포함하여, 아그레카나제의 억제제를 개발하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 시험 샘플이 펩타이드, 단백질, 화학적 화합물 또는 항체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  22. (a) (i) 서열 4, 6, 8, 10, 12, 13에 제시된 하나 이상의 아그레카나제 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체의 아미노산 서열 및 (ii) 서열 4, 6, 8, 10, 12, 13에 제시된 하나 이상의 아그레카나제 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체의 3차원 구조 중 하나 이상을 사용하는 단계; 및
    (b) 구조 분석에 기초하여 아그레카나제 활성을 억제할 수 있는 후보물질을 확인하는 단계를 포함하여, 아그레카나제의 억제제를 개발하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    (c) 서열 4, 6, 8, 10, 12, 13에 제시된 하나 이상의 아그레카나제 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 단계(b)의 하나 이상의 후보물질과 배합하는 단계 및
    (d) 상기 후보물질이 아그레카나제 활성을 억제하는지를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 후보물질이 단백질, 펩타이드, 화학적 화합물 또는 항체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  25. 포유동물에게 제1항에 따른 아그레카나제의 억제제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함을 포함하여, 포유동물에서 아그레칸 분해를 억제하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 억제제가 단백질, 펩타이드, 화학적 화합물 또는 항체 중 하나 이상을 포함하는 방법
  27. 천연 아그레카나제 단백질에 비해 아그레카나제 단백질의 안정성을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 아그레카나제 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 돌연변이가 아미노산 치환을 포함하는 아그레카나제 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 아미노산 치환이 아그레카나제 단백질의 활성 부위에서 E에서 Q로의 변화인 아그레카나제 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 아그레카나제 단백질.
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