JPS61173780A - 融合遺伝子産物を発現させるための、改良トリプトフアンオペロン誘導体 - Google Patents
融合遺伝子産物を発現させるための、改良トリプトフアンオペロン誘導体Info
- Publication number
- JPS61173780A JPS61173780A JP60216080A JP21608085A JPS61173780A JP S61173780 A JPS61173780 A JP S61173780A JP 60216080 A JP60216080 A JP 60216080A JP 21608085 A JP21608085 A JP 21608085A JP S61173780 A JPS61173780 A JP S61173780A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- vector according
- tryptophan
- item
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 94
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 98
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 33
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 11
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 7
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 7
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 7
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 108010057578 pregrowth hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 2
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 claims 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 claims 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 102220074245 rs142969817 Human genes 0.000 claims 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 19
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 18
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 12
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000985498 Mus musculus Hermansky-Pudlak syndrome 4 protein homolog Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101150062285 PGF gene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 1-nitroso-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CN(N=O)C2=C1 WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trichloroprop-2-enoyl chloride Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)C(Cl)=O BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLWOQMRVOZVGEB-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-3-hydroxypropanoyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-hydroxypr Chemical compound NC(N)=NCCCC(NC(=O)C(N)CO)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O ZLWOQMRVOZVGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 101100162401 Arabidopsis thaliana ALE2 gene Proteins 0.000 description 1
- AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100083507 Caenorhabditis elegans acl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100400452 Caenorhabditis elegans map-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459439 Caenorhabditis elegans nac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100129922 Caenorhabditis elegans pig-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N Cys-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100520057 Drosophila melanogaster Pig1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025027 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM69 Human genes 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000830203 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM69 Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108700012441 IGF2 Proteins 0.000 description 1
- LSPYFSHXDAYVDI-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LSPYFSHXDAYVDI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GLBNEGIOFRVRHO-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLBNEGIOFRVRHO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100286588 Mus musculus Igfl gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100083333 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PIB1 gene Proteins 0.000 description 1
- NRCJWSGXMAPYQX-LPEHRKFASA-N Ser-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O NRCJWSGXMAPYQX-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N Val-Cys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- QPUKANZXOGADOB-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n-methylnitrous amide Chemical group CCCCCCCCCCCCN(C)N=O QPUKANZXOGADOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 description 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium atom Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、短縮された、改良トリプトファンオペロン誘
導体に関するものである。
導体に関するものである。
大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）のトリ
プトファン（ｔｒｐ）オペロンは、事実上、アミノ酸代
謝、オペロンの構造、並びに遺伝子の構造および機能に
関する研究におけるあらゆる場合に用いられできた。こ
れまでにミオザリ（Ｍｉｏｚｚａｒｉ ）らは、ｔｒｐ
プロモーター−オペレーター、並びに、リーダー配列お
よびｔｒｐＥ遺伝子の一部を含有しているプラスミドを
組立てたしジャーナル・オブ・ハクテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ） １３３ ：１４５７−１
４４６ （１９７８））。リーダーペプチドのカルボキ
シ末端部分、リーダー配列の全アテニユエイター領域、
およびｔｒｐＥのアミノ末端部分の暗号配列を欠失除去
することにより、融合遺伝子産物であるＬＥが得られる
。この様な欠失によって得られたｔｒｐ オペロン誘
導体は、ＬＥペプチドと、研究または商業的価値のある
ポリペプチドからなる融合遺伝子産物を生産するのに有
用である。
プトファン（ｔｒｐ）オペロンは、事実上、アミノ酸代
謝、オペロンの構造、並びに遺伝子の構造および機能に
関する研究におけるあらゆる場合に用いられできた。こ
れまでにミオザリ（Ｍｉｏｚｚａｒｉ ）らは、ｔｒｐ
プロモーター−オペレーター、並びに、リーダー配列お
よびｔｒｐＥ遺伝子の一部を含有しているプラスミドを
組立てたしジャーナル・オブ・ハクテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ） １３３ ：１４５７−１
４４６ （１９７８））。リーダーペプチドのカルボキ
シ末端部分、リーダー配列の全アテニユエイター領域、
およびｔｒｐＥのアミノ末端部分の暗号配列を欠失除去
することにより、融合遺伝子産物であるＬＥが得られる
。この様な欠失によって得られたｔｒｐ オペロン誘
導体は、ＬＥペプチドと、研究または商業的価値のある
ポリペプチドからなる融合遺伝子産物を生産するのに有
用である。
本発明はミオザリによって組立てられた上記の修飾され
たｔｒｐ オペロンの改良誘導体に関するものである
。本発明の改良誘導体は、ＬＥ暗号領域に欠失を生ぜし
めることにより、得られた。充分に特性化された２つの
欠失、即ち、ｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２が特に有
用である。大腸菌内で融合遺伝子産物を発現させるため
に、これらｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２のいずれか
を含有する発現ベクターを組立てた、インシユリン様成
長因子工や■の様な、低分子量のタンパク質と融合させ
た場合、これらの改良ＬＥタンパク質は本来のＬＥタン
パク質がそのまま残存ｔ、Ｌ場合に比べて、融合遺伝子
産物内ではるかに小さいフラクションとして存在するこ
とになる。その結果、所望のタンパク質をより多く回収
できることになるので、上記のことは極めて有益である
。
たｔｒｐ オペロンの改良誘導体に関するものである
。本発明の改良誘導体は、ＬＥ暗号領域に欠失を生ぜし
めることにより、得られた。充分に特性化された２つの
欠失、即ち、ｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２が特に有
用である。大腸菌内で融合遺伝子産物を発現させるため
に、これらｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２のいずれか
を含有する発現ベクターを組立てた、インシユリン様成
長因子工や■の様な、低分子量のタンパク質と融合させ
た場合、これらの改良ＬＥタンパク質は本来のＬＥタン
パク質がそのまま残存ｔ、Ｌ場合に比べて、融合遺伝子
産物内ではるかに小さいフラクションとして存在するこ
とになる。その結果、所望のタンパク質をより多く回収
できることになるので、上記のことは極めて有益である
。
本発明はまた、インシュリン様成長因子■の遺伝子をコ
ードしている新規なりＮＡ配列およびインシュリン様成
長因子工の遺伝子をコードしている新規な制限フラグメ
ントを提供するものである。
ードしている新規なりＮＡ配列およびインシュリン様成
長因子工の遺伝子をコードしている新規な制限フラグメ
ントを提供するものである。
さらＣζ、本発明は、前記の各ＤＮＡ配列を含有してい
る発現ベクターおよび形質転換体をも゛包含する。
る発現ベクターおよび形質転換体をも゛包含する。
本発明は、一般的にヨーロッパ特許公開番号第００３６
７７６Ａ２号（１９８１年９月３０日公開）に関連して
いる。上記の出願では、発現システムとして有用とされ
ていた修飾トリプトファンオペロン（ミオザリら、１９
７８）を用いたプラスミドが開示された。この発明に係
る欠失により、トリプトファンオペロンの脱抑制が最大
となり、ポリペプチドの発現が高められた。しかしなが
ら、この出願には、本発明で提供する修飾トリプトファ
ンオペロンは開示されていないばかりか、それらのオペ
ロンを、発現ベクターや発現手段を改良するための重要
な要素として利用することについて示唆するものも含ま
れていない。
７７６Ａ２号（１９８１年９月３０日公開）に関連して
いる。上記の出願では、発現システムとして有用とされ
ていた修飾トリプトファンオペロン（ミオザリら、１９
７８）を用いたプラスミドが開示された。この発明に係
る欠失により、トリプトファンオペロンの脱抑制が最大
となり、ポリペプチドの発現が高められた。しかしなが
ら、この出願には、本発明で提供する修飾トリプトファ
ンオペロンは開示されていないばかりか、それらのオペ
ロンを、発現ベクターや発現手段を改良するための重要
な要素として利用することについて示唆するものも含ま
れていない。
本発明はまた、大腸菌または近縁生物を用いて合成イン
シュリン様成長因子工およびＩＩ（ＩＧＦ工およびＩＧ
Ｆ■）遺伝子配列をクローニングし、発現させる方法を
提供するものである。ＩＧＦ工およびＩＧＦ■の如きソ
マトメジン類は、インビトロ並びにインビボで成長促進
作用を示す、重要な、ヘテロジーニアス（異種）なペプ
チド群である。それらのペプチド群は成長ホルモンの成
長促進作用を仲介するものであって、次の症状の治療；
こ有用と考えられている：即ち短小発育症、骨多孔症、
軟骨の変性、心筋詔よび骨格筋の劣化、損傷、並びにタ
ンパク質および炭水化物代謝異常などである。これまで
、ＩＧＦ類はヒト血漿から単離し得たが、このヒト血漿
中にはそれらは極（少量しか存在していない。ＩＧＦの
機能に関する研究は、利用し得る純化ＩＧＦの量が一般
的に不足していたために、極めて制限されてきた。本発
明は、この様な制限を克服するものであり、組換えＤＮ
Ａ技術によってこれらの合成遺伝子をクローニングし、
発現させることにより、これらの重要なタンパク質を大
量生産するのに有効な方法を提供するものである。この
様な理由から、本発明は当該技術の著しい進歩を意味す
るものである。
シュリン様成長因子工およびＩＩ（ＩＧＦ工およびＩＧ
Ｆ■）遺伝子配列をクローニングし、発現させる方法を
提供するものである。ＩＧＦ工およびＩＧＦ■の如きソ
マトメジン類は、インビトロ並びにインビボで成長促進
作用を示す、重要な、ヘテロジーニアス（異種）なペプ
チド群である。それらのペプチド群は成長ホルモンの成
長促進作用を仲介するものであって、次の症状の治療；
こ有用と考えられている：即ち短小発育症、骨多孔症、
軟骨の変性、心筋詔よび骨格筋の劣化、損傷、並びにタ
ンパク質および炭水化物代謝異常などである。これまで
、ＩＧＦ類はヒト血漿から単離し得たが、このヒト血漿
中にはそれらは極（少量しか存在していない。ＩＧＦの
機能に関する研究は、利用し得る純化ＩＧＦの量が一般
的に不足していたために、極めて制限されてきた。本発
明は、この様な制限を克服するものであり、組換えＤＮ
Ａ技術によってこれらの合成遺伝子をクローニングし、
発現させることにより、これらの重要なタンパク質を大
量生産するのに有効な方法を提供するものである。この
様な理由から、本発明は当該技術の著しい進歩を意味す
るものである。
本明細書中に開示した発明の目的に鑑みて、以下の如く
語句を定義する。
語句を定義する。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
のＤＮＡセグメントを付加することができる、または既
に付加された、ＤＮＡ分子からなる自律的複製可能な、
または組込み可能な物質であって、これにはプラスミド
が含まれるがこれに限定されない。
のＤＮＡセグメントを付加することができる、または既
に付加された、ＤＮＡ分子からなる自律的複製可能な、
または組込み可能な物質であって、これにはプラスミド
が含まれるがこれに限定されない。
組換えＤＮＡ発現ベクター＝１またはそれ以上の転写お
よび翻訳活性化配列が挿入された組換えＤＮＡクローニ
ングベクター。
よび翻訳活性化配列が挿入された組換えＤＮＡクローニ
ングベクター。
転写活性配列：ＤＮＡのｍＲＮＡ転写物への転写を指令
し、または転写を与えるＤＮＡ配列つ翻訳活性化配列：
ｍＲＮＡ転写物のペプチドまたはポリペプチドへの翻
訳を与えるＤＮＡ配列。
し、または転写を与えるＤＮＡ配列つ翻訳活性化配列：
ｍＲＮＡ転写物のペプチドまたはポリペプチドへの翻
訳を与えるＤＮＡ配列。
リーダー配列：オペロン中の、転写活性化配列と構造遺
伝子（類）との間のセグメン）：ｌｐオペロン中では、
リーダーペプチドをコードしているリーダー配列の部分
。
伝子（類）との間のセグメン）：ｌｐオペロン中では、
リーダーペプチドをコードしているリーダー配列の部分
。
ＴｒｐＬＥ：）リプトファンオペロンの一部、即ち、プ
ロモーター、オペレーター、並びにリーダーペプチドの
アミノ末端部分の暗号配列およびｔｒｐＥ のカルボキ
シ末端部分の暗号配列をコードしているＤＮＡセグメン
ト；即ち、ｔｒｐＬＥはＬＥと称される融合遺伝子産物
を発現に導くものである。
ロモーター、オペレーター、並びにリーダーペプチドの
アミノ末端部分の暗号配列およびｔｒｐＥ のカルボキ
シ末端部分の暗号配列をコードしているＤＮＡセグメン
ト；即ち、ｔｒｐＬＥはＬＥと称される融合遺伝子産物
を発現に導くものである。
機能的ポリペプチド：回収可能な、生物活性を有するヘ
テロローガスなポリペプチドまたはその前駆物質、ヘテ
ロローガスなポリペプチドとホモローガスなポリペプチ
ドの一部または全部から成る回収可能で生物学的に活性
なポリペプチド、あるいはヘテロローガスなポリペプチ
ドと生物学的に非活性のホモローがスなポリペプチドか
ら成る回収可能で、生物学的に非活性な融合ポリペプチ
ドであって、特異的に開裂され得るもの。
テロローガスなポリペプチドまたはその前駆物質、ヘテ
ロローガスなポリペプチドとホモローガスなポリペプチ
ドの一部または全部から成る回収可能で生物学的に活性
なポリペプチド、あるいはヘテロローガスなポリペプチ
ドと生物学的に非活性のホモローがスなポリペプチドか
ら成る回収可能で、生物学的に非活性な融合ポリペプチ
ドであって、特異的に開裂され得るもの。
制限フラグメント：１または１以上の制限酵素の作用に
よって生じた。あらゆる線状ＤＮＡ配列。
よって生じた。あらゆる線状ＤＮＡ配列。
融合遺伝子生成物：ホモローガスなポリペプチドの一部
または全体と融合している、回収可能な、ヘテロローガ
スなポリペプチド。
または全体と融合している、回収可能な、ヘテロローガ
スなポリペプチド。
レプリコン：組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
組換えＤＮＡ発現ベクターの複製をコントロールする配
列。
組換えＤＮＡ発現ベクターの複製をコントロールする配
列。
ランチウェイレプリコン：コピー数のコントロール機構
を有していないか、またはその機構を除去することが可
能なレプリコン；その様な喪失によって、該レプリコン
が導入されたＤＮＡの複製は非コントロール下におかれ
、ＤＮＡのコピー数は極度に増加することになる。
を有していないか、またはその機構を除去することが可
能なレプリコン；その様な喪失によって、該レプリコン
が導入されたＤＮＡの複製は非コントロール下におかれ
、ＤＮＡのコピー数は極度に増加することになる。
形質転換：宿主細胞にＤＮＡを導入し一遺伝型を変化さ
せ、その結果、該宿主に変化をもたらすこと。
せ、その結果、該宿主に変化をもたらすこと。
形質転換体：形質転換を受けた宿主受容細胞。
Ａ Ｒ：アンビシリン耐性表現型。
ｍ：カナマイシン耐性表現型。
Ｅに−ＢＧＨ：エンテロキナーゼーウシ成長ホルモン配
列。
列。
本発明は、プロモーター−オペレーター／リーダー／ト
リプトファンＥ遺伝子からなる大腸菌のトリプトファン
オペロンから、リーダーペプチドのカルボキシ末端、リ
ーダー配列のアテニユエイター領域、並びにｔｒｐＥ遺
伝子の近接領域を除去したトリプトファンオペロンであ
って、約４２８〜約５４８デオキシリボヌクレオチド対
の範囲内のリーダー／トリプトファンＥ遺伝子配列を含
有することを特徴とする短縮された改良トリプトファン
オペロン誘導体を提供するものである。本発明はまた、
上記のＤＮＡを含有する発現ベクターおよび形質転換体
を提供するものである。
リプトファンＥ遺伝子からなる大腸菌のトリプトファン
オペロンから、リーダーペプチドのカルボキシ末端、リ
ーダー配列のアテニユエイター領域、並びにｔｒｐＥ遺
伝子の近接領域を除去したトリプトファンオペロンであ
って、約４２８〜約５４８デオキシリボヌクレオチド対
の範囲内のリーダー／トリプトファンＥ遺伝子配列を含
有することを特徴とする短縮された改良トリプトファン
オペロン誘導体を提供するものである。本発明はまた、
上記のＤＮＡを含有する発現ベクターおよび形質転換体
を提供するものである。
既述した如く、本発明は、大腸菌内で様々な機能的ポリ
ペブチを発現させるために用いることができる。大腸菌
内で外来性遺伝子を発現させるためにトリプトファンオ
ペロンの調節領域（ｒｃｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉ
ｏｎ ）を用いることについては、多くの研究者が報告
している。現時点で利用可能なトリプトファンオペロン
を含有しているベクターの大多数が【ｒＰリーダー配列
を含んでいる〔二Ｆ７７ （Ｅｄｍａｎ ）ら、１９８
１、ネイチャー２９１：５０３：ミオザリら、１９７８
、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）１３３ ニー１４５７ ：フレイド（
Ｋｌｅｉｄ）ら、ヨーロッパ特許公開番号第００３６７
７０Ａｉ号：およびゲラ７” ／Ｌ／ （Ｇｏｃｄｄｅ
ｌ ）ら、１８８０、ネイチャー２８７：４１１）。こ
れらのベクターは発現系としては実に有用であるが、融
合遺伝子産物中に占めるｔｒｐ＋７−グー誘導ポリペプ
チドの比率（％）が大きいので、所望のタンパク質を効
率良（生産する能力が制限されている。
ペブチを発現させるために用いることができる。大腸菌
内で外来性遺伝子を発現させるためにトリプトファンオ
ペロンの調節領域（ｒｃｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉ
ｏｎ ）を用いることについては、多くの研究者が報告
している。現時点で利用可能なトリプトファンオペロン
を含有しているベクターの大多数が【ｒＰリーダー配列
を含んでいる〔二Ｆ７７ （Ｅｄｍａｎ ）ら、１９８
１、ネイチャー２９１：５０３：ミオザリら、１９７８
、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）１３３ ニー１４５７ ：フレイド（
Ｋｌｅｉｄ）ら、ヨーロッパ特許公開番号第００３６７
７０Ａｉ号：およびゲラ７” ／Ｌ／ （Ｇｏｃｄｄｅ
ｌ ）ら、１８８０、ネイチャー２８７：４１１）。こ
れらのベクターは発現系としては実に有用であるが、融
合遺伝子産物中に占めるｔｒｐ＋７−グー誘導ポリペプ
チドの比率（％）が大きいので、所望のタンパク質を効
率良（生産する能力が制限されている。
本発明に係るｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ ２配列
はそれぞれ、約４２８および約５４８塩基対からなる。
はそれぞれ、約４２８および約５４８塩基対からなる。
ｔｒｐＬＥｌ暗号鎖のヌクレオチド配列は、式：
（、Ａ ＡＴＴ ＣＡＣＧｃＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴ
Ａ ＴＧＧＴＣＧ ＧＴＧ ＧＴＣＧＣＴ ＡＧＣ，Ｇ
ＴＧ ＣＣＣ，ＡＣＧＣＧＣＡＴＣＴＣＧ ＡＣＴ Ｇ
ＣＡ ＣＧＧ ＴＧＣＡＣＣＡＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ
ＧＧＣＧＴＣＡＧＧ （：ＡＧ ＣＣＡＡＴＣＧＧＡ
ＡＧＣＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＧ Ｃ，ＣＴ ＧＴＧＣＡ
Ｇ Ｃ，ＴＣＧＴＡ ＴＡＡ ＴＣＡ ＣＣ：Ｇ ＣＡ
Ｔ ＡＡＴＴＣＧ ＡＧＴ Ｃ（、ＣＴＣＡ ＡＧＧ
ＣＧＣＡＣＴ ＣＣＣＧＴＴ （：ＣＧ ＧＡＴ ＡＡ
Ｔ ＧＴＴ ＴＴＴ ＴＧＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡ
ＡＣＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴＡＴＴ Ｃ
ＴＧ ＡＡＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＣＡＡＴ
ＴＡＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＡＡＣＴＡＧ ＴＴＡ ＡＣ
Ｔ ＡＧＴＡＣＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＣＧＴ
Ａ ＡＡＡ ＡＧＧ Ｇ丁ＡＴＣＧ ＡＣＡ Ａ
ＴＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＣＧＴＡＣＴＧ
ＡＡＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣＡＧＡ ＧＡ
ＴＣＡＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＧ
ＧＡＡ ＧＣＣＧＡＣＧＡＡ ＡＣＣＣＧＴ ＡＡＣＡ
ＡＡ ＧＣＣＣＧＣＧＣ丁ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＣＡＣＣＧＣＧ ＣＡＴ Ｃ
ＡＴ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣで示され、ｔｒ
ｐＬＥ ２暗号鎖のヌクレオチド配列は式： ％式％ ： ： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルを表す） で示される。
Ａ ＴＧＧＴＣＧ ＧＴＧ ＧＴＣＧＣＴ ＡＧＣ，Ｇ
ＴＧ ＣＣＣ，ＡＣＧＣＧＣＡＴＣＴＣＧ ＡＣＴ Ｇ
ＣＡ ＣＧＧ ＴＧＣＡＣＣＡＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ
ＧＧＣＧＴＣＡＧＧ （：ＡＧ ＣＣＡＡＴＣＧＧＡ
ＡＧＣＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＧ Ｃ，ＣＴ ＧＴＧＣＡ
Ｇ Ｃ，ＴＣＧＴＡ ＴＡＡ ＴＣＡ ＣＣ：Ｇ ＣＡ
Ｔ ＡＡＴＴＣＧ ＡＧＴ Ｃ（、ＣＴＣＡ ＡＧＧ
ＣＧＣＡＣＴ ＣＣＣＧＴＴ （：ＣＧ ＧＡＴ ＡＡ
Ｔ ＧＴＴ ＴＴＴ ＴＧＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡ
ＡＣＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴＡＴＴ Ｃ
ＴＧ ＡＡＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＣＡＡＴ
ＴＡＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＡＡＣＴＡＧ ＴＴＡ ＡＣ
Ｔ ＡＧＴＡＣＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＣＧＴ
Ａ ＡＡＡ ＡＧＧ Ｇ丁ＡＴＣＧ ＡＣＡ Ａ
ＴＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＴＣＧＴＡＣＴＧ
ＡＡＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣＡＧＡ ＧＡ
ＴＣＡＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＧ
ＧＡＡ ＧＣＣＧＡＣＧＡＡ ＡＣＣＣＧＴ ＡＡＣＡ
ＡＡ ＧＣＣＣＧＣＧＣ丁ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＣＡＣＣＧＣＧ ＣＡＴ Ｃ
ＡＴ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣで示され、ｔｒ
ｐＬＥ ２暗号鎖のヌクレオチド配列は式： ％式％ ： ： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルを表す） で示される。
上記の配列は、ｔｒｐＬＥのＬＥ暗号配列中の様々な領
域を内部から欠失させることにより、組立てられた。そ
の様な欠失は、以後の、所望のタンパク質の暗号遺伝子
とのライゲーションに際し、翻訳解読相が変化すること
のない様に行なわれたつＬＥ配列の内部領域を欠失させ
ることにより、本発明に係るｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐ
Ｌ Ｅ ２配列と境を接するＥｃｏＲｌ 制限部位（
複数）を、以後のライゲーションのために無傷のまま残
存させた５ ＥｃｏＲ１部位が望ましくない場合には、
前記のｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２配列を、ライゲ
ーションを容易にするためｌζ常法通り修飾することも
できる。本明細書に示したｔｒｐＬＥ １ およびｔ
ｒｐ Ｌ Ｅ ２ 配列以外にも、所望の解読相を保
持して内部欠失を行うことができ、これＪこよって本発
明の範囲内に含まれる種々のｔｒｐＬＥ配列を組立てる
ことができる。これらの配列を、ヌクレオチドの付加、
欠失または置換によって修飾し、その性質を変化させた
り、種々の特異的（ユニーク）な、または付加的な制限
部位を与えることもできる。当業者はヌクレオチドの化
学および遺伝暗号を理、解しているので、どのヌクレオ
チドが交換可能であり、特定の目的にとってどの欅な］
：）ＮＡ修飾法が望ましいかを知っている。
域を内部から欠失させることにより、組立てられた。そ
の様な欠失は、以後の、所望のタンパク質の暗号遺伝子
とのライゲーションに際し、翻訳解読相が変化すること
のない様に行なわれたつＬＥ配列の内部領域を欠失させ
ることにより、本発明に係るｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐ
Ｌ Ｅ ２配列と境を接するＥｃｏＲｌ 制限部位（
複数）を、以後のライゲーションのために無傷のまま残
存させた５ ＥｃｏＲ１部位が望ましくない場合には、
前記のｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２配列を、ライゲ
ーションを容易にするためｌζ常法通り修飾することも
できる。本明細書に示したｔｒｐＬＥ １ およびｔ
ｒｐ Ｌ Ｅ ２ 配列以外にも、所望の解読相を保
持して内部欠失を行うことができ、これＪこよって本発
明の範囲内に含まれる種々のｔｒｐＬＥ配列を組立てる
ことができる。これらの配列を、ヌクレオチドの付加、
欠失または置換によって修飾し、その性質を変化させた
り、種々の特異的（ユニーク）な、または付加的な制限
部位を与えることもできる。当業者はヌクレオチドの化
学および遺伝暗号を理、解しているので、どのヌクレオ
チドが交換可能であり、特定の目的にとってどの欅な］
：）ＮＡ修飾法が望ましいかを知っている。
本明細書中で述べる欠失により、著しく短縮されたＬＥ
ポリペプチドが得られるので、宿主が費やす総エネルギ
ー量およびアミノ酸前駆体の数を減することができ、細
胞経済および細胞効率を向へ さいポリペプチドを所望する場合には、非常に便利であ
る。当業者ならば知っていることであるが、直接的な発
現法で小さいポリペプチドを得ることは極めて来電であ
る：それ故、所望のタンパク質の回収率を高めるために
は、融合タンパク質を利用した発現系がしばしば好まし
い。ＬＥＩおよびＬＥ２はその有用性と適応性が相まっ
て、より大きい発現成果達成の機会を与えることになる
。非常に短かいペプチドの場合には、ｔｒｐＬＥ２に含
まれている配列の様に、やや中程度の長さのＬＥ暗号配
列の方がｔｒｐＬＥｌに含まれている配列の様に極端に
短かいＬＥ暗号配列よりも好ましい。
ポリペプチドが得られるので、宿主が費やす総エネルギ
ー量およびアミノ酸前駆体の数を減することができ、細
胞経済および細胞効率を向へ さいポリペプチドを所望する場合には、非常に便利であ
る。当業者ならば知っていることであるが、直接的な発
現法で小さいポリペプチドを得ることは極めて来電であ
る：それ故、所望のタンパク質の回収率を高めるために
は、融合タンパク質を利用した発現系がしばしば好まし
い。ＬＥＩおよびＬＥ２はその有用性と適応性が相まっ
て、より大きい発現成果達成の機会を与えることになる
。非常に短かいペプチドの場合には、ｔｒｐＬＥ２に含
まれている配列の様に、やや中程度の長さのＬＥ暗号配
列の方がｔｒｐＬＥｌに含まれている配列の様に極端に
短かいＬＥ暗号配列よりも好ましい。
例えば、３０アミノ酸から成る極めて短かいポリペプチ
ドであるインシュリンＢ鎖の発現効果は、ｔｒｐＥｌと
の融合の場合よりも、ｔｒＰＥ゛２との融合の場合の方
が大きい。また、ある場合には、融合遺伝子産物のサイ
ズを小さくシ、複雑さを軽減することにより、所望のタ
ンパク質の最終的な精製が容易になる。
ドであるインシュリンＢ鎖の発現効果は、ｔｒｐＥｌと
の融合の場合よりも、ｔｒＰＥ゛２との融合の場合の方
が大きい。また、ある場合には、融合遺伝子産物のサイ
ズを小さくシ、複雑さを軽減することにより、所望のタ
ンパク質の最終的な精製が容易になる。
本発明のｔｒｐＬＥ配列はまた、融合遺伝子産物の化学
組成、並びにアミノ酸配列に変化をもたらすことによっ
ても寄与するところがある。例えば、ｔｒｐＬＥｌ配列
にはシスティンコドンか含まれていないことから、ＬＥ
１ペプチド内（こは、確実に、内部ジスルフィド結合が
生成しないことになる。
組成、並びにアミノ酸配列に変化をもたらすことによっ
ても寄与するところがある。例えば、ｔｒｐＬＥｌ配列
にはシスティンコドンか含まれていないことから、ＬＥ
１ペプチド内（こは、確実に、内部ジスルフィド結合が
生成しないことになる。
また、ｔｒｐＬＥｌ中には１個、ｔｒｐＬＥ２中には２
個しかメチオニンコドンが存在していないことから、融
合遺伝子産物の臭化シアン開裂によって生成するタンパ
ク質フラグメントの量が非改良型のｔｒｐＬＥを用いた
場合に比べて少ないので、分離しなＬすればならないタ
ンパク質の量が少なくてすみ；、精製にとって極めて有
利とな不。他方、既知のｔｒｐＬＥ配列中には７個のメ
チオニンコドンが含まれているので、融合遺伝子の臭化
シアン開裂後の精製は困電であり、時間を要することに
なる、 ｔｒｐ ＬＥ ｌまたはｔｒＰＬＥ２ Ｘクレオチド配
列のいずれかを含有している発現ベクターが組立てられ
た。上記の配列を、ウシ成長ホルモン、プロインシュリ
ン、インシュリンＡ鎖またはＢ鎖、並びにＩＧＦＩおよ
びＩＧＦｆｉ等の短かいタンパク質を大腸菌内で発現さ
せるために、これらタンパク質の暗号遺伝子と、個別に
融合させる。即ち、本発明は、ヘテロローガスなポリペ
プチド産物を大腸菌およびその近縁種内で発現させるた
めの組換えＤＮＡ発現ベクターであって、 ａ）トリプトファンオペロンのプロモーター−オペレー
ターおよび短縮されたリーダー暗号配列、ｂ）ヘテロロ
ーガスなポリペプチドの構造遺伝子をコードしているヌ
クレオチド配列であって、トリプトファンプロモーター
−オペレーターおよび短縮されたリーダー暗号配列の下
流に位置しており、翻訳解読相内にあるヌクレオチド配
列、および Ｃ）該ベクターで形質転換された微生物内で、該ベクタ
ーを複製し、それを選択せしめるための、レプリコンお
よび選択マーカー からなるベクターを包含するものである。
個しかメチオニンコドンが存在していないことから、融
合遺伝子産物の臭化シアン開裂によって生成するタンパ
ク質フラグメントの量が非改良型のｔｒｐＬＥを用いた
場合に比べて少ないので、分離しなＬすればならないタ
ンパク質の量が少なくてすみ；、精製にとって極めて有
利とな不。他方、既知のｔｒｐＬＥ配列中には７個のメ
チオニンコドンが含まれているので、融合遺伝子の臭化
シアン開裂後の精製は困電であり、時間を要することに
なる、 ｔｒｐ ＬＥ ｌまたはｔｒＰＬＥ２ Ｘクレオチド配
列のいずれかを含有している発現ベクターが組立てられ
た。上記の配列を、ウシ成長ホルモン、プロインシュリ
ン、インシュリンＡ鎖またはＢ鎖、並びにＩＧＦＩおよ
びＩＧＦｆｉ等の短かいタンパク質を大腸菌内で発現さ
せるために、これらタンパク質の暗号遺伝子と、個別に
融合させる。即ち、本発明は、ヘテロローガスなポリペ
プチド産物を大腸菌およびその近縁種内で発現させるた
めの組換えＤＮＡ発現ベクターであって、 ａ）トリプトファンオペロンのプロモーター−オペレー
ターおよび短縮されたリーダー暗号配列、ｂ）ヘテロロ
ーガスなポリペプチドの構造遺伝子をコードしているヌ
クレオチド配列であって、トリプトファンプロモーター
−オペレーターおよび短縮されたリーダー暗号配列の下
流に位置しており、翻訳解読相内にあるヌクレオチド配
列、および Ｃ）該ベクターで形質転換された微生物内で、該ベクタ
ーを複製し、それを選択せしめるための、レプリコンお
よび選択マーカー からなるベクターを包含するものである。
本発明のベクターは、所望のタンパク質を発現させる上
で、極めて有用である。Ｊ本発明に係るｔｒｐＬＥｌま
たはｔｒｐＬＥ２と所望のタンパク質の暗号遺伝子とを
融合させることにより、該所望のタンパク質の生産率を
高めることができる。細菌細胞内に有限量の生産物が蓄
積されるときには、その結果は明らかである。即ち、望
ましくない生産物（ＬＥタンパク質）の量が減少され、
結果的に所望のタンパク質の量が増加することになる。
で、極めて有用である。Ｊ本発明に係るｔｒｐＬＥｌま
たはｔｒｐＬＥ２と所望のタンパク質の暗号遺伝子とを
融合させることにより、該所望のタンパク質の生産率を
高めることができる。細菌細胞内に有限量の生産物が蓄
積されるときには、その結果は明らかである。即ち、望
ましくない生産物（ＬＥタンパク質）の量が減少され、
結果的に所望のタンパク質の量が増加することになる。
この様に、本発明のｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２配
列を使用する本発明のベクターは、特に、商業上望まし
いタンパク質の土竜に用いるのに非常に優れたものであ
る。
列を使用する本発明のベクターは、特に、商業上望まし
いタンパク質の土竜に用いるのに非常に優れたものであ
る。
発現ベクターｐｃＺ２０ｆ；ｉ約１１ｋｂであり、ｔｒ
ｐＬＥｌをコードしている遺伝子配列、ＩＧＦＩの合成
遺伝子、およびランナウェイレプリコンを含有している
。プラスミドｐＬＥＢＧＨ２は約６ｋｂであり、ｔｒｐ
ＬＥ２をコードしている遺伝子配列、およびエンテロキ
ナーゼ結合ウシ成長ホルモン（ＥＫ−ｂＧＨ） をコ
ードしている遺伝子配列とを含有している。プラスミド
ｐｃＺ２０およびｐＬＥＢＧＨ２はそｔＬ！：れ大腸ｆ
ＭＫ１２ ＲＶ３０８／ｐｃＺ２０ および大腸菌Ｋ
１２ ＲＲｌ ／ｐＬＥＢＣ，Ｈ２から単離すること
ができる。これらの菌株は／−ザン、リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス６１６０
４に寄託され、そのストックカルチャーコレクションの
一部を構成しており、これらプラスミドの供給源および
保管体として寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８１および
Ｂ−１５８８２の下、誰でも入手し得る菌株である。プ
ラスミドｐＣＺ２０およびＰＬＡＨ２の△ 詳しい制限サイトおよび機能を表わす地図をそれぞれ添
付の第１図および第２図に示す。本出願の目的に鑑みて
、第１図および以後の図面は全て等縮尺で描かれていな
い。
ｐＬＥｌをコードしている遺伝子配列、ＩＧＦＩの合成
遺伝子、およびランナウェイレプリコンを含有している
。プラスミドｐＬＥＢＧＨ２は約６ｋｂであり、ｔｒｐ
ＬＥ２をコードしている遺伝子配列、およびエンテロキ
ナーゼ結合ウシ成長ホルモン（ＥＫ−ｂＧＨ） をコ
ードしている遺伝子配列とを含有している。プラスミド
ｐｃＺ２０およびｐＬＥＢＧＨ２はそｔＬ！：れ大腸ｆ
ＭＫ１２ ＲＶ３０８／ｐｃＺ２０ および大腸菌Ｋ
１２ ＲＲｌ ／ｐＬＥＢＣ，Ｈ２から単離すること
ができる。これらの菌株は／−ザン、リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス６１６０
４に寄託され、そのストックカルチャーコレクションの
一部を構成しており、これらプラスミドの供給源および
保管体として寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８１および
Ｂ−１５８８２の下、誰でも入手し得る菌株である。プ
ラスミドｐＣＺ２０およびＰＬＡＨ２の△ 詳しい制限サイトおよび機能を表わす地図をそれぞれ添
付の第１図および第２図に示す。本出願の目的に鑑みて
、第１図および以後の図面は全て等縮尺で描かれていな
い。
組立ての便宜と容易性から、プラスミドｐＣＺ２０から
〜０．４３ ｋｂＥｃｏＲ工ｔｒｐＬＥｌ含有制限フラ
グメントを単離し、多数のプラスミド誘導体の組立てに
おける８発物質として用いた。例えば、プラスミドｐＬ
ＥＢＧＨｌを組立てるには。
〜０．４３ ｋｂＥｃｏＲ工ｔｒｐＬＥｌ含有制限フラ
グメントを単離し、多数のプラスミド誘導体の組立てに
おける８発物質として用いた。例えば、プラスミドｐＬ
ＥＢＧＨｌを組立てるには。
まず最初にプラスミドｐＬＥＢＧＨ２をＥｃｏＲＩ制限
酵素で消化し、ｔｒｐＬＥ２配列を含有する〜０．５５
ｋｂ ＥｃｏＲＪ制限フラグメントから〜５．５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ 制限フラグメント（ＥＫ−ＢＧＨポリペ
プチドおよび大腸菌レプリコンの暗号遺伝子を含有する
）を分離する。次いで、ｔｒｐＬＥｌ配列を含有してい
る〜０．４３ ｋｂ Ｅ ｃｏ ＲＩ制限？ラグメント
を〜５．５ ｋｂ Ｅｃｏλ工制限フラグメントとライ
ゲートさせ、プラスミドｐＬＥＢＧＨ１を組立てる。ま
た、ｔｒｐＬＥｌおよび（ｒｐＬＥ２を個別に、大腸菌
レプリコン、機能的な抗生物質耐性遺伝子、および合成
されたＩＧＦｎ暗号遺伝子とライゲートさせることによ
り、それぞれプラスミドｐｌＧＦ２０１およびｐｌＧＦ
２０２を得る゛。
酵素で消化し、ｔｒｐＬＥ２配列を含有する〜０．５５
ｋｂ ＥｃｏＲＪ制限フラグメントから〜５．５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ 制限フラグメント（ＥＫ−ＢＧＨポリペ
プチドおよび大腸菌レプリコンの暗号遺伝子を含有する
）を分離する。次いで、ｔｒｐＬＥｌ配列を含有してい
る〜０．４３ ｋｂ Ｅ ｃｏ ＲＩ制限？ラグメント
を〜５．５ ｋｂ Ｅｃｏλ工制限フラグメントとライ
ゲートさせ、プラスミドｐＬＥＢＧＨ１を組立てる。ま
た、ｔｒｐＬＥｌおよび（ｒｐＬＥ２を個別に、大腸菌
レプリコン、機能的な抗生物質耐性遺伝子、および合成
されたＩＧＦｎ暗号遺伝子とライゲートさせることによ
り、それぞれプラスミドｐｌＧＦ２０１およびｐｌＧＦ
２０２を得る゛。
プラスミドｐＩＧＦ２０１およびｐｌＧＦ２０２は、そ
れぞれ、ｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２のコントロー
ル下で、ｌＧＦ■ポリペプチドを発現させるために組立
てられた。本発明以前にはＩＧＦ■の暗号遺伝子のヌク
レオチド配列は単離されておらず、また、同定されてい
なかったので、合成遺伝子を組立てた。ＩＧＦＩ遺伝子
の暗号領域の合成は、ＩＧＦ］ｉが配列： Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ ＣｙｓＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈｅ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ ＴｙｒＰｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ にｌｕ
ＧＩｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙ
ｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＡｌａＬｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒ。
れぞれ、ｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥ２のコントロー
ル下で、ｌＧＦ■ポリペプチドを発現させるために組立
てられた。本発明以前にはＩＧＦ■の暗号遺伝子のヌク
レオチド配列は単離されておらず、また、同定されてい
なかったので、合成遺伝子を組立てた。ＩＧＦＩ遺伝子
の暗号領域の合成は、ＩＧＦ］ｉが配列： Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ ＣｙｓＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈｅ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ ＴｙｒＰｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ にｌｕ
ＧＩｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙ
ｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＡｌａＬｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒ。
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
で示される６７アミノ酸からなっているという知見〔例
えば、ブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ）ら、ネイチャ
ー２８７：７８１−７８７（１９８０）参照〕を得て完
成された。
えば、ブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ）ら、ネイチャ
ー２８７：７８１−７８７（１９８０）参照〕を得て完
成された。
上記のアミノ酸配列から、数多くの特異で、これまで知
られていない判定基準に基づいて対応する合成遺伝子配
列を考案すると共に、−緒−こしたときＩＣ，ＦＩＪを
コードしている合成遺伝子を形成する様、オリゴヌクレ
オチドフラグメントを合成したつ合成フラグメントを、
予め定めておいた段階でハイブリダイズし、ライゲート
してＩＣＦＢ遺伝子の２つの部分を組立てた。これらの
２部分をプラスミドｐ Ｂ Ｒ３２２にクローンし、プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡのみで両側を囲まれている
、完全な長さのＩＧＦ■遺伝Ｔを生産した。次にｔｒｐ
ＬＥ１含有フラグメントおよびｔｒｐＬＥ２含有フラグ
メントをＩＧＦ：［含有ｐＢＲ３２２ベクターに挿入し
、大腸菌および近縁種内での該遺伝子の発現を最大限に
高めた。ＩＧＦｆｉを含有する融合遺伝子産物は、大腸
菌内で発現した。
られていない判定基準に基づいて対応する合成遺伝子配
列を考案すると共に、−緒−こしたときＩＣ，ＦＩＪを
コードしている合成遺伝子を形成する様、オリゴヌクレ
オチドフラグメントを合成したつ合成フラグメントを、
予め定めておいた段階でハイブリダイズし、ライゲート
してＩＣＦＢ遺伝子の２つの部分を組立てた。これらの
２部分をプラスミドｐ Ｂ Ｒ３２２にクローンし、プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡのみで両側を囲まれている
、完全な長さのＩＧＦ■遺伝Ｔを生産した。次にｔｒｐ
ＬＥ１含有フラグメントおよびｔｒｐＬＥ２含有フラグ
メントをＩＧＦ：［含有ｐＢＲ３２２ベクターに挿入し
、大腸菌および近縁種内での該遺伝子の発現を最大限に
高めた。ＩＧＦｆｉを含有する融合遺伝子産物は、大腸
菌内で発現した。
上記アミノ酸配列および遺伝子暗号の同義性により、Ｉ
ＧＦＩをコードしている多数のヌクレオチド配列を予測
することができる。これら、多数の、可能性を有する配
列から適当な配列を見出し、決定するには、幾つかの従
来未知の基準を採用した。まず、配列中に使用するトリ
ヌクレオチドコドンを、大腸菌ｆこ受は入れられる、あ
るいは好まれることが知られているものから選んだ。第
２番目には、分子の末端番こ異なる制限酵素認識部位を
配し、プラスミド内Ｃζ所望の方向性で挿入することが
できるようにした。更に、プラスミドｐＢＲ３２２の如
き良く理解されているクローニングベクター類を用い得
る様に部位を選出することにした、実際ｉｃハ、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＲａｍ ＨＩ 認２部位を選び、ＩＧＦｌｉ
暗号配列の５′および３′末端に、それぞれを導入した
。第３番目に、遺伝子を特性化し、要すれば、突然変異
誘発を行なうためにこの遺伝子を特異的に分離すること
ができる様、一連の制限エンドヌクレアーゼ′ｍｍ部位
を分子に沿って計画的に配した。特に、遺伝子の中央位
置にＰｓｔ１部位を導入した。この制限酵素認識部位の
設置により、分子の２つの部分を段階的に（ｉｎｓｔａ
ｇｅｓ ）クローンすることができるようになった。第
４番目に、細菌細胞内で完全に発現されたタンパク質は
融合産物の形をとっているために、その様な融合産物か
ら、ＩＧＦＩＩ部分を切り雇す手段が備えられているこ
とが望ましい。そこで、１ＧＦｌｉアミノ末端に対応す
る遺伝子の末端付近にアミノ酸メチオニンを指定するコ
ドンを導入することにより、融合タンパク質の該位置に
メチオニンを存在せしめ、臭化シアン開裂における基質
として役立てる様にした。第５番目に、通読翻訳（７ｅ
ａｄ −ｔｈｒｏｕｇｂ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ）
を避けるために、遺伝子の末端に２個の終止コドンを配
した。
ＧＦＩをコードしている多数のヌクレオチド配列を予測
することができる。これら、多数の、可能性を有する配
列から適当な配列を見出し、決定するには、幾つかの従
来未知の基準を採用した。まず、配列中に使用するトリ
ヌクレオチドコドンを、大腸菌ｆこ受は入れられる、あ
るいは好まれることが知られているものから選んだ。第
２番目には、分子の末端番こ異なる制限酵素認識部位を
配し、プラスミド内Ｃζ所望の方向性で挿入することが
できるようにした。更に、プラスミドｐＢＲ３２２の如
き良く理解されているクローニングベクター類を用い得
る様に部位を選出することにした、実際ｉｃハ、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＲａｍ ＨＩ 認２部位を選び、ＩＧＦｌｉ
暗号配列の５′および３′末端に、それぞれを導入した
。第３番目に、遺伝子を特性化し、要すれば、突然変異
誘発を行なうためにこの遺伝子を特異的に分離すること
ができる様、一連の制限エンドヌクレアーゼ′ｍｍ部位
を分子に沿って計画的に配した。特に、遺伝子の中央位
置にＰｓｔ１部位を導入した。この制限酵素認識部位の
設置により、分子の２つの部分を段階的に（ｉｎｓｔａ
ｇｅｓ ）クローンすることができるようになった。第
４番目に、細菌細胞内で完全に発現されたタンパク質は
融合産物の形をとっているために、その様な融合産物か
ら、ＩＧＦＩＩ部分を切り雇す手段が備えられているこ
とが望ましい。そこで、１ＧＦｌｉアミノ末端に対応す
る遺伝子の末端付近にアミノ酸メチオニンを指定するコ
ドンを導入することにより、融合タンパク質の該位置に
メチオニンを存在せしめ、臭化シアン開裂における基質
として役立てる様にした。第５番目に、通読翻訳（７ｅ
ａｄ −ｔｈｒｏｕｇｂ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ）
を避けるために、遺伝子の末端に２個の終止コドンを配
した。
合成ＩＧＦＩＪ遺伝）の特に好ましい暗号領域として、
式： ％式％ ： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシアデニル
、Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルを表す） で示される配列を選択した。
式： ％式％ ： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシアデニル
、Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルを表す） で示される配列を選択した。
本発明に係る、大腸菌内で機能的なポリペプチドを発現
させるためのベクターは、著しい技術的進歩を意味する
ものである。前記のｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥＺ
ＤＮＡ配列を、大腸菌および近縁の生物内であらゆるポ
リペプチド暗号遺伝子を普遍的に発現させる目的で用い
ることができる。後述する実施例では、本発明の特殊な
態様のみが示され、記述されているのであり、多（の変
形が可能である。例えば、本発明の機能性にとって、特
定の配列の選択は臨界的でなく、本発明の用途は、特定
のポリペプチド暗号遺伝子に限定されるべきではない。
させるためのベクターは、著しい技術的進歩を意味する
ものである。前記のｔｒｐＬＥｌおよびｔｒｐＬＥＺ
ＤＮＡ配列を、大腸菌および近縁の生物内であらゆるポ
リペプチド暗号遺伝子を普遍的に発現させる目的で用い
ることができる。後述する実施例では、本発明の特殊な
態様のみが示され、記述されているのであり、多（の変
形が可能である。例えば、本発明の機能性にとって、特
定の配列の選択は臨界的でなく、本発明の用途は、特定
のポリペプチド暗号遺伝子に限定されるべきではない。
機能的なポリペプチドの暗号遺伝子を、本明細書中で例
示したＥＫ−ＢＧＨ，ＩＧＦｉ、ＩＧＦＩ、インシュリ
ンＡ鎖、インシュリンＢ鎖およびプロインシュリン等の
暗号遺伝子の代りとすることができる。その様な暗号配
列には、ヒト成長ホルモン、ヒトプレ成長ホルモン、ブ
タ成長ホルモン、哺乳動物成長ホルモン、鳥類成長ホル
モン、成長ホルモン放出因子、ヒトプレプロインシュリ
ン、ヒトおよび非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、イ
ンターロイキンＩＩ、あらゆるペプチドホルモン、あら
ゆる酵素、あるいは、研究上、または商業上の価値を有
する事実止金てのポリペプチドをコードしている配列が
含まれ゛るが、これらに限定されるものではない。
示したＥＫ−ＢＧＨ，ＩＧＦｉ、ＩＧＦＩ、インシュリ
ンＡ鎖、インシュリンＢ鎖およびプロインシュリン等の
暗号遺伝子の代りとすることができる。その様な暗号配
列には、ヒト成長ホルモン、ヒトプレ成長ホルモン、ブ
タ成長ホルモン、哺乳動物成長ホルモン、鳥類成長ホル
モン、成長ホルモン放出因子、ヒトプレプロインシュリ
ン、ヒトおよび非ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、イ
ンターロイキンＩＩ、あらゆるペプチドホルモン、あら
ゆる酵素、あるいは、研究上、または商業上の価値を有
する事実止金てのポリペプチドをコードしている配列が
含まれ゛るが、これらに限定されるものではない。
本発明のベクターは、特定の大腸菌プラスミドから得た
特殊なレプリコンの使用に限定されない。
特殊なレプリコンの使用に限定されない。
本明細書で例示したベクターの大多数に含まれるレプリ
コンはプラスミドｐＢＲ３２２に由来しているが、例え
ば、プラスミドｐＢＲ３２４（ポリｔ＜ −Ｆ、（Ｂｏ
ｌ １ｖａｒ 、 Ｆ、 ）ジーン（Ｇｅｎｅ） ４
：１２１（１９７８））、ｐＢＲ３２５［ソベロンＸ
、（Ｓｏｖｅｒｏｎ、 Ｘ、）ジーン９：２８７（１９
８０）〕、プラスミｌ’ｐＫＮ４０２ （ウーリ７（Ｕ
ｈｌｉｎ）ら、ジーン６ ： ９１−１０６ （１９７
９）３等からも新規なベクターの組立てのために、′大
腸゛菌レプリコン含有フラグメントを得ることができる
。
コンはプラスミドｐＢＲ３２２に由来しているが、例え
ば、プラスミドｐＢＲ３２４（ポリｔ＜ −Ｆ、（Ｂｏ
ｌ １ｖａｒ 、 Ｆ、 ）ジーン（Ｇｅｎｅ） ４
：１２１（１９７８））、ｐＢＲ３２５［ソベロンＸ
、（Ｓｏｖｅｒｏｎ、 Ｘ、）ジーン９：２８７（１９
８０）〕、プラスミｌ’ｐＫＮ４０２ （ウーリ７（Ｕ
ｈｌｉｎ）ら、ジーン６ ： ９１−１０６ （１９７
９）３等からも新規なベクターの組立てのために、′大
腸゛菌レプリコン含有フラグメントを得ることができる
。
当業者ならば、これら、またはその他の大腸菌レプリコ
ン含有フラグメントをライゲーションすることにより、
本発明の範囲内に含まれるベクターが得られるというこ
とを理解し得るであろう。
ン含有フラグメントをライゲーションすることにより、
本発明の範囲内に含まれるベクターが得られるというこ
とを理解し得るであろう。
本発明の発現ベクターは例えば、大腸菌、大腸１１に１
２、大腸菌に１２ ＲＶ３０８ 、大腸菌に１２大腸菌
に１２ＲＲ１、大腸菌に１２ＭＭ２９４グラム陰性原核
生物からなる広範囲シこ及ぶ宿主生物に適用し得る。本
発明の全ての態様が有用であるが、幾つかのベクター、
および形質転換体が好ましい。
２、大腸菌に１２ ＲＶ３０８ 、大腸菌に１２大腸菌
に１２ＲＲ１、大腸菌に１２ＭＭ２９４グラム陰性原核
生物からなる広範囲シこ及ぶ宿主生物に適用し得る。本
発明の全ての態様が有用であるが、幾つかのベクター、
および形質転換体が好ましい。
好マシイヘクターハ、ｐＣＺ２０ 、 ＰＬＥＢＧＨＩ
、 ＰＬＥＢＧＨ２。
、 ＰＬＥＢＧＨ２。
ｐＩＧＦ２０１．ｐＩＧＦ２０２．ＰＩＡＬＥＩ、ＰＬ
ＡＬＥ２゜ｐＩＢＬＥＩ 、ｐＩＢＬＥ２ 、ｐＰＩＬ
ＥＩおよびｐＰＩＬＥ２である。好ましい形質転換体に
は、大Ａ！菌に１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ２ｏ、大腸菌に
１２ ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＧＨ２，大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＧＨ１゜大腸菌に１２ ＲＶ３０
８／ｐｌＧＦ２０１．大腸菌に１２ＲＶ３０８／Ｐ Ｉ
ＧＦ２０２ 、 大腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐｌＧＦ
２０１．大腸菌に１２ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０２゜大
腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐｌＡＬＥｌ、大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐｌＢＬＥ２． お、及び大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐＰＩＬＥｌ カー含まれる。更に、上
記の好ましい群の内、プラミＦｐｃｚ２０．ｐＬＥＢＧ
Ｈ１。
ＡＬＥ２゜ｐＩＢＬＥＩ 、ｐＩＢＬＥ２ 、ｐＰＩＬ
ＥＩおよびｐＰＩＬＥ２である。好ましい形質転換体に
は、大Ａ！菌に１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ２ｏ、大腸菌に
１２ ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＧＨ２，大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＧＨ１゜大腸菌に１２ ＲＶ３０
８／ｐｌＧＦ２０１．大腸菌に１２ＲＶ３０８／Ｐ Ｉ
ＧＦ２０２ 、 大腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐｌＧＦ
２０１．大腸菌に１２ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０２゜大
腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐｌＡＬＥｌ、大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐｌＢＬＥ２． お、及び大腸菌に１２
ＲＶ３０８／ｐＰＩＬＥｌ カー含まれる。更に、上
記の好ましい群の内、プラミＦｐｃｚ２０．ｐＬＥＢＧ
Ｈ１。
ｐｌＧＦ２０１ およびｐＩＢＬＥ２、並びに形質転換
体大腸１ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ２０、大腸菌に１
２ ＲＶ３０８／ＰＬＥＢＧＨＩ、大腸菌に１２ＲＶ３
０８／ｐｌＧＦ２０１ お、ｌび大Ｍ菌に１２ＲＶ３
０８／ｐｌＢＬＥ２ が特に好ましい。
体大腸１ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ２０、大腸菌に１
２ ＲＶ３０８／ＰＬＥＢＧＨＩ、大腸菌に１２ＲＶ３
０８／ｐｌＧＦ２０１ お、ｌび大Ｍ菌に１２ＲＶ３
０８／ｐｌＢＬＥ２ が特に好ましい。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。本
発明を組立てるための説明および実際の手法を適宜記載
した。
発明を組立てるための説明および実際の手法を適宜記載
した。
ＩＪ１図はプ５ ｘ ｉ ｌ’ ｐＣＺ２０ （１０，
７ｋｂ）ノ制限サイトおよび機能地図である。
７ｋｂ）ノ制限サイトおよび機能地図である。
１Ｎ２図はプラスミドｐＬＥＢＧＨ２（６，０ｋｌ））
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第３図はプラスミドｐｌＧＦ２０１（４，６ｋｂ）の制
限サイトおよび機能地図である。
限サイトおよび機能地図である。
第４図はプラスミドＰ ＩＧＦ２０２ （４，８ｋｂ）
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第５図はプラスミドｐＩＡＬＥ１（４，８ｋｂ）の制限
サイトおよび機能地図である。
サイトおよび機能地図である。
第６図はプラスミドｐｌＢＬＥ２（５，Ｏｋｂ ）の制
限サイトおよび機能地図である。
限サイトおよび機能地図である。
第７図はプラスミドｐＰＩＬＥｌ（５，Ｉｋｂ）の制限
サイトおよび機能地図である。
サイトおよび機能地図である。
第８図はＩＧＦ■融合生産物を含有している細胞タンパ
ク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動ｆこよる解析像
を撮影した写真の模写図である。
ク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動ｆこよる解析像
を撮影した写真の模写図である。
実施例１ 大腸！ＩＲＶ３０８／ｐｃＺ２０（７）ｆ
ｉ４およびプラスミドｐＣＺ２０の単離 Ａ、大腸菌ＲＶ３０８／ｐＣＺ２０（７）培養カナマイ
シン硫酸塩５０βｇ／−を含有するＴＹブロス（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、およびＮａＣ１５ｇを１
！中に含有させて調製）１００−ニ大場菌ＲＶ３０８／
ｐｃＺ２０ （ＮＲＲＬＢ−１５８８１） の培養物
を接種し、２０〜２５℃番こおいて、振盪しながら、〜
１６時間インキュベートした。次いで、培養物１００−
を５０μｇ／ｍｔのカナマイシンを含んだＴＶブロス９
００−の入ったフラスコに移した。次いで、この希釈さ
れた培養物を３７℃において振盪しながら２−３時間イ
ンキユヘートシタ。インキュベーション温度３７℃にお
いて、プラスミドのコピー数が高くなる、Ｂ、プラスミ
ドｐＣＺ２０の単離 遠心（１０，０００ｒＰｍ Ｘ Ｓ分間、４℃）して
細胞をペレット化し、このペレットを、２５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８）、ＩＱｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭ
グルコースを含有し、リゾチーム２ｗ９／−を補充した
溶液２０−に懸濁した細胞を氷上で１５分間インキュベ
ートした後、１％ＳＤＳおよび０゜２ Ｎ ＮａＯＨを
含有する溶液４０−を加えて混合した。完全に細胞が溶
菌した後、冷却した５ＭＮａ０Ａｃ（ｐＨ４，８）３０
−を加えて混合し、得られた溶液を氷上で１時間インキ
ュベートした。次いでこの溶液を２ｏ、ｏｏｏｒｐｍで
３０分間遠心した。遠芯後、ペレットを捨て、上清に３
容量の冷たい無水エタノールを加えた。得られた混合物
を一７０℃で１０〜２０分間冷却した後、１０．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡをペレット化した。
ｉ４およびプラスミドｐＣＺ２０の単離 Ａ、大腸菌ＲＶ３０８／ｐＣＺ２０（７）培養カナマイ
シン硫酸塩５０βｇ／−を含有するＴＹブロス（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、およびＮａＣ１５ｇを１
！中に含有させて調製）１００−ニ大場菌ＲＶ３０８／
ｐｃＺ２０ （ＮＲＲＬＢ−１５８８１） の培養物
を接種し、２０〜２５℃番こおいて、振盪しながら、〜
１６時間インキュベートした。次いで、培養物１００−
を５０μｇ／ｍｔのカナマイシンを含んだＴＶブロス９
００−の入ったフラスコに移した。次いで、この希釈さ
れた培養物を３７℃において振盪しながら２−３時間イ
ンキユヘートシタ。インキュベーション温度３７℃にお
いて、プラスミドのコピー数が高くなる、Ｂ、プラスミ
ドｐＣＺ２０の単離 遠心（１０，０００ｒＰｍ Ｘ Ｓ分間、４℃）して
細胞をペレット化し、このペレットを、２５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８）、ＩＱｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭ
グルコースを含有し、リゾチーム２ｗ９／−を補充した
溶液２０−に懸濁した細胞を氷上で１５分間インキュベ
ートした後、１％ＳＤＳおよび０゜２ Ｎ ＮａＯＨを
含有する溶液４０−を加えて混合した。完全に細胞が溶
菌した後、冷却した５ＭＮａ０Ａｃ（ｐＨ４，８）３０
−を加えて混合し、得られた溶液を氷上で１時間インキ
ュベートした。次いでこの溶液を２ｏ、ｏｏｏｒｐｍで
３０分間遠心した。遠芯後、ペレットを捨て、上清に３
容量の冷たい無水エタノールを加えた。得られた混合物
を一７０℃で１０〜２０分間冷却した後、１０．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡをペレット化した。
このＤＮＡペレットをＴＥバッファー（１３ｍＭトリフ
、−ＨＣｌｐＨ７，５および］ ｍＭ ＥＤＴＡ ）
１０−に懸濁し、次いで、５キ／−のＲＮＡ５ｅＡ 溶
液０．１ ｒｎｌと、２５００単位／−のＲＮＡ５ｅＴ
溶液１０μｊを加えた。ＲＮＡ５ｅ を溶液中１こ混
合した後、得られた混液を６５℃で２０分間インキュベ
ートした。次いで、ＣｓＣ１３０ｇ を加え、ＴＥバ
ッファーを用いて総容量を３８−に調節した。
、−ＨＣｌｐＨ７，５および］ ｍＭ ＥＤＴＡ ）
１０−に懸濁し、次いで、５キ／−のＲＮＡ５ｅＡ 溶
液０．１ ｒｎｌと、２５００単位／−のＲＮＡ５ｅＴ
溶液１０μｊを加えた。ＲＮＡ５ｅ を溶液中１こ混
合した後、得られた混液を６５℃で２０分間インキュベ
ートした。次いで、ＣｓＣ１３０ｇ を加え、ＴＥバ
ッファーを用いて総容量を３８−に調節した。
エチジウムプロミド２−を加え、次いで、プラス・
ミドＤＮＡのバンドを得るために、垂直ローター内で、
４９．ＯＯＯｒｐｍにおいて１７時間、超遠心処理を行
った。
ミドＤＮＡのバンドを得るために、垂直ローター内で、
４９．ＯＯＯｒｐｍにおいて１７時間、超遠心処理を行
った。
遠心用チューブからプラスミドバンドを除去し、インプ
ロパツール（ＣｓＣ／およびＨ２０飽和）でエチジウム
プロミドを抽出した後、ＴＥバッファーに対して透析す
ることにより、ＣｓＣ１を除去した。得られたプラスミ
ドｐｃＺ２０ ＤＮＡを濃度１μｇ／−でＴＥバッファ
ーに懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドｐＣＺ２
０ の制限サイトおよび機能地図を添付の第１図に示
す。
ロパツール（ＣｓＣ／およびＨ２０飽和）でエチジウム
プロミドを抽出した後、ＴＥバッファーに対して透析す
ることにより、ＣｓＣ１を除去した。得られたプラスミ
ドｐｃＺ２０ ＤＮＡを濃度１μｇ／−でＴＥバッファ
ーに懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドｐＣＺ２
０ の制限サイトおよび機能地図を添付の第１図に示
す。
実施例２ プラスミドｐＣＺ２０からの、ｔｒｐＬＥｌ
をコードしている〜Ｑ、４３ｋｂＥｃｏＲ工制限フラグ
メントの単離 上で得たプラスミドｐＣＺ２０ＤＮＡ 約３０μ！（３
０μｇ） ヲ１０Ｘ ＥｃｏＲ工ｚ＜７７７−（１，５
Ｍトリｘ−ＨＣＩ（ｐＨ７，２＞、５ Ｑ ＱｍＭ Ｎ
ａｃｌおよび１０ｍＭジチオトレイトール）１０μｌ。
をコードしている〜Ｑ、４３ｋｂＥｃｏＲ工制限フラグ
メントの単離 上で得たプラスミドｐＣＺ２０ＤＮＡ 約３０μ！（３
０μｇ） ヲ１０Ｘ ＥｃｏＲ工ｚ＜７７７−（１，５
Ｍトリｘ−ＨＣＩ（ｐＨ７，２＞、５ Ｑ ＱｍＭ Ｎ
ａｃｌおよび１０ｍＭジチオトレイトール）１０μｌ。
ＥＣ０ＲＩ 制瀝酵素２μ！（〜６０単位）および水
５８μｌの混合物に加えた。混合後、３７℃の水浴中で
１時間反応させ、次いで、この溶液を１％アガロースゲ
ル上で、所望の〜０．４３ｋｂＥｃ。
５８μｌの混合物に加えた。混合後、３７℃の水浴中で
１時間反応させ、次いで、この溶液を１％アガロースゲ
ル上で、所望の〜０．４３ｋｂＥｃ。
Ｒ４フラグメントが他の消化産物から明確に分離するま
で、電気泳動させた。このゲルをエチジウムプロミドの
希釈液（０，５μｇ／−）中で染め、染色されたゲル番
こ長波長のＵＶ光を照射することにより、電気泳動した
ＤＮＡを観察した。所望のフラグメントの位置決めを行
ってから、ゲルに示さい間隙（スリット）を形成し、こ
の間隙にシライヒヤ−（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ）およ
びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ ）〔ケーン（Ｋｅｅｎｅ
）、ＮＨ０３４３１）のＮ、Ａ−４５ＤＥＡＥ膜を置
いた。再度電気泳動すると、ＤＮＡはこのＤＥＡＥ膜と
、非共有結合的に結合した。
で、電気泳動させた。このゲルをエチジウムプロミドの
希釈液（０，５μｇ／−）中で染め、染色されたゲル番
こ長波長のＵＶ光を照射することにより、電気泳動した
ＤＮＡを観察した。所望のフラグメントの位置決めを行
ってから、ゲルに示さい間隙（スリット）を形成し、こ
の間隙にシライヒヤ−（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ）およ
びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ ）〔ケーン（Ｋｅｅｎｅ
）、ＮＨ０３４３１）のＮ、Ａ−４５ＤＥＡＥ膜を置
いた。再度電気泳動すると、ＤＮＡはこのＤＥＡＥ膜と
、非共有結合的に結合した。
このＤＥＡＥ膜に所望のフラグメントが結合して後、護
膜を取り除き、低塩バッファー（１５０ｍＭＨｚＣＩ、
Ｑ、１ｍＭＥＤＴＡおよび２ＱｍＭトリスーＨＣ／ｐＨ
８）で洗浄した。次いで、膜を小さいチューブに入れ、
高塩バッファー（ＩＭＮａＣＩＳＱ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
および２０ ｍＭ ）リス−ＨＣ／（ＰＨ８））に浸漬
し、６５℃で１時間インキュベートすることにより、Ｄ
ＮＡをＤＥＡＥペーパーから除いた。インキュベーショ
ン後、インキュベーションバッファーを集め、膜を高塩
バッファーで洗った。この洗液とインキュベーションバ
ッファーを一緒にプールし、所望の１）ＮＡフラグメン
、トを回収するのに用いた。
膜を取り除き、低塩バッファー（１５０ｍＭＨｚＣＩ、
Ｑ、１ｍＭＥＤＴＡおよび２ＱｍＭトリスーＨＣ／ｐＨ
８）で洗浄した。次いで、膜を小さいチューブに入れ、
高塩バッファー（ＩＭＮａＣＩＳＱ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
および２０ ｍＭ ）リス−ＨＣ／（ＰＨ８））に浸漬
し、６５℃で１時間インキュベートすることにより、Ｄ
ＮＡをＤＥＡＥペーパーから除いた。インキュベーショ
ン後、インキュベーションバッファーを集め、膜を高塩
バッファーで洗った。この洗液とインキュベーションバ
ッファーを一緒にプールし、所望の１）ＮＡフラグメン
、トを回収するのに用いた。
高塩ＤＮＡ溶液の容量を調節してＮ ｚ Ｃｌ濃度を０
．２５Ｍにした後、３倍量の冷却した無水エタノールを
加えた。得られた溶液を混合し、−７０℃で１０〜２０
分間放置した。今後、この溶液を１５、ＯＯＯｒＰｍ
で１５分間遠心した。残留塩類を除くためにもう一回
沈殿させた後、ＤＮＡベレットをエタノールで洗浄し、
乾燥してＴＥバッファー２０μｌに懸濁すると、この懸
濁液は所望のｔｒｐ ＬＥＩ暗号ＥｃｏＲ工制限フラグ
メント〜０．２５Ｍｇを含有していた。
．２５Ｍにした後、３倍量の冷却した無水エタノールを
加えた。得られた溶液を混合し、−７０℃で１０〜２０
分間放置した。今後、この溶液を１５、ＯＯＯｒＰｍ
で１５分間遠心した。残留塩類を除くためにもう一回
沈殿させた後、ＤＮＡベレットをエタノールで洗浄し、
乾燥してＴＥバッファー２０μｌに懸濁すると、この懸
濁液は所望のｔｒｐ ＬＥＩ暗号ＥｃｏＲ工制限フラグ
メント〜０．２５Ｍｇを含有していた。
実施例３ 大Ｍ菌ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＧＨ２ｃｒ）
培養およびプラスミドＰＬＥＢＧＨ２の単離Ａ、大腸菌
Ｆ１．．Ｖ３０８／ＰＬＥＢＨＧ２ の培養アンピシリ
ン５０μｇ／−およびトリプトファンＺｏｏμｇ／−を
含有するＴＹｌｏｏ、ｎｌに大腸菌ＲＶ３０８／ｐＬＥ
ＢＧＨ’２（ＮλＲＬ Ｂ−１５８８２）を接種し、次
いで、振盪しながら３７℃で１６時間インキュベートし
た。次いでこの培養物を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
およびトリプトファン１００μｇ／、ｎｔを含有するＴ
Ｙブロスで１ｊに希釈し、ｓ ｓ ｏ ｎｍにおける光
学的密度が〜０．５吸収単吸収水すまでインキュベーシ
ョンを続けた。
培養およびプラスミドＰＬＥＢＧＨ２の単離Ａ、大腸菌
Ｆ１．．Ｖ３０８／ＰＬＥＢＨＧ２ の培養アンピシリ
ン５０μｇ／−およびトリプトファンＺｏｏμｇ／−を
含有するＴＹｌｏｏ、ｎｌに大腸菌ＲＶ３０８／ｐＬＥ
ＢＧＨ’２（ＮλＲＬ Ｂ−１５８８２）を接種し、次
いで、振盪しながら３７℃で１６時間インキュベートし
た。次いでこの培養物を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
およびトリプトファン１００μｇ／、ｎｔを含有するＴ
Ｙブロスで１ｊに希釈し、ｓ ｓ ｏ ｎｍにおける光
学的密度が〜０．５吸収単吸収水すまでインキュベーシ
ョンを続けた。
この密度に達した時点で、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）
１ｇをフラスコ内（こ加えた。このウリジンと細胞を１
５分間インキュベーションした後、クロラムフェニコー
ル１７０■を加えた。振盪しながら、３７℃で、培養物
をさらに〜１６時間インキュベーションした。ある種の
大腸菌プラスミドを増幅するためにウリジンおよびクロ
ラムフェニコールを加える方法は良く知られている。
１ｇをフラスコ内（こ加えた。このウリジンと細胞を１
５分間インキュベーションした後、クロラムフェニコー
ル１７０■を加えた。振盪しながら、３７℃で、培養物
をさらに〜１６時間インキュベーションした。ある種の
大腸菌プラスミドを増幅するためにウリジンおよびクロ
ラムフェニコールを加える方法は良く知られている。
Ｂ、プラスミドｐ Ｌ Ｅ Ｂ Ｇ Ｈ２の単離実質上
、実施例ＩＢの方法に従い、上記の培養物からプラスミ
ドＰＬＥＢＧＨ２を単離した。得られたプラスミドＰＬ
ＥＢＧＨ２を濃度ｌμｇ／μｌでＴＥバッファーに懸濁
し、−２０℃で保存した。プラスミドｐ ＬＥＢＣ；Ｈ
２の制限サイトおよび機能地図を添付の茅２図に示す。
、実施例ＩＢの方法に従い、上記の培養物からプラスミ
ドＰＬＥＢＧＨ２を単離した。得られたプラスミドＰＬ
ＥＢＧＨ２を濃度ｌμｇ／μｌでＴＥバッファーに懸濁
し、−２０℃で保存した。プラスミドｐ ＬＥＢＣ；Ｈ
２の制限サイトおよび機能地図を添付の茅２図に示す。
実施例４ プラスミドｐＬＥＢＧＨ２のＥｃｏＲｉ消化
実質上、実施例２の方法に従い、プラスミドｐＬＥＢＧ
Ｈ２ＤＮＡ （実施例３で調製）約３゜μｌをＥｃｏ
Ｒ１消化に付し、制限処理産物を単離した。２個のＥｃ
ｏ Ｒｌフラグメントを単離し、精製した： 即ち、１）ｔｒｐＬＥ２配列をコードしている〜０゜５
５ ｋｂＥｃｏＲ工７ラグメント；および２） ＥＫ−
ＢＧＨ，ｐＢＲ３２２レプリコンおよびβ−ラクタマー
ゼ遺伝子をコードしている〜５．５ｋｂＥｃｏＲＪフラ
グメントである。ｔｒｐＬＥ２暗号フラグメント約０．
６５μｇを得、これをＴΣ２０ｔｔｌに懸濁し、他方、
〜５．５ｋｂフラグメント約６．５μｇを得、これをホ
スファターゼバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （
ｐｉ（８’） 、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＱ、Ｑ
ｌ ｍＭ ＺｎＣ／２） １００ ／Ｊ／ ｉｃＭ濁
した。
Ｈ２ＤＮＡ （実施例３で調製）約３゜μｌをＥｃｏ
Ｒ１消化に付し、制限処理産物を単離した。２個のＥｃ
ｏ Ｒｌフラグメントを単離し、精製した： 即ち、１）ｔｒｐＬＥ２配列をコードしている〜０゜５
５ ｋｂＥｃｏＲ工７ラグメント；および２） ＥＫ−
ＢＧＨ，ｐＢＲ３２２レプリコンおよびβ−ラクタマー
ゼ遺伝子をコードしている〜５．５ｋｂＥｃｏＲＪフラ
グメントである。ｔｒｐＬＥ２暗号フラグメント約０．
６５μｇを得、これをＴΣ２０ｔｔｌに懸濁し、他方、
〜５．５ｋｂフラグメント約６．５μｇを得、これをホ
スファターゼバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （
ｐｉ（８’） 、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＱ、Ｑ
ｌ ｍＭ ＺｎＣ／２） １００ ／Ｊ／ ｉｃＭ濁
した。
実施例５ 大腸菌ＲＶ３Ｑｇ／ｐＬＥＢＧＩ（１（７）
組立て Ａ、プラスミドｐＬＥＢＧＨ１の組立てホスファターゼ
バッファーに懸濁した〜５．５ｋｂＥｃｏＲ工 制限フ
ラグメント（実施例４で調製）を６５℃で５分間インキ
ュベートした後、分生の腸から得たアルカリ性ホスファ
ターゼ１μｌ （ベーリンガー・マンハイム、７単位）
を加゛えて“混合し、６５℃で更に５分間インキュベー
ションした。
組立て Ａ、プラスミドｐＬＥＢＧＨ１の組立てホスファターゼ
バッファーに懸濁した〜５．５ｋｂＥｃｏＲ工 制限フ
ラグメント（実施例４で調製）を６５℃で５分間インキ
ュベートした後、分生の腸から得たアルカリ性ホスファ
ターゼ１μｌ （ベーリンガー・マンハイム、７単位）
を加゛えて“混合し、６５℃で更に５分間インキュベー
ションした。
さらに６０℃で３０分間インキュベーションした後、反
応混合物をフェノール：ＣＨＣｌ３（５０：５０）で１
回、ＣＨＣｌ３で１回抽出した。抽出後、反応混合物を
Ｎａ０ＡＣＱ、３ Ｍにし、３容量のエタノールを加え
、溶液を混合して一７０℃に冷却した後、遠心し、ホス
ファターゼ処理されたフラグメントをペレット化した。
応混合物をフェノール：ＣＨＣｌ３（５０：５０）で１
回、ＣＨＣｌ３で１回抽出した。抽出後、反応混合物を
Ｎａ０ＡＣＱ、３ Ｍにし、３容量のエタノールを加え
、溶液を混合して一７０℃に冷却した後、遠心し、ホス
ファターゼ処理されたフラグメントをペレット化した。
得られたＤＮＡペレットをＴＥバッファー２５μｌに懸
濁したところ、この忍濁液は、プラスミドｐＬＥＢＧＨ
２のホスファターゼ処理された（脱りん酸化された）〜
５゜５ｋｂＥｃｏＲＪ制限フラグメント〜５μｇを含有
していた。
濁したところ、この忍濁液は、プラスミドｐＬＥＢＧＨ
２のホスファターゼ処理された（脱りん酸化された）〜
５゜５ｋｂＥｃｏＲＪ制限フラグメント〜５μｇを含有
していた。
ホスファターゼ処理された〜５．５ ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ
エフラグメント約１μｇを実施例２で得た、ｔｒｐＬＥ
Ｉをコードしている精製〜（１４３ｋｂ Ｅｃｏ Ｒｌ
フラグメント４ ａｔ、 ５ ｍＭＡＴＰ ２ ａｔ
、 １０ｍＭジチオトレイトール２μ！、 ＩＯＸ
リガーゼバッファー（６６０ｍＭ）リス−ＨＣｊＰＨ８
および６０ ｍＭ ＭｇＣｒ２ ） ２ Ａｌｌ 、水
８μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μ！にューイングラ
ンド・バイオラボ、８００単位）と混合した。この反応
混合物を２０℃で２時間インキュベートした。次いで、
このライゲートされたＤＮＡを大腸菌に１２ＲＶ３０８
の形質転換に用いた。
エフラグメント約１μｇを実施例２で得た、ｔｒｐＬＥ
Ｉをコードしている精製〜（１４３ｋｂ Ｅｃｏ Ｒｌ
フラグメント４ ａｔ、 ５ ｍＭＡＴＰ ２ ａｔ
、 １０ｍＭジチオトレイトール２μ！、 ＩＯＸ
リガーゼバッファー（６６０ｍＭ）リス−ＨＣｊＰＨ８
および６０ ｍＭ ＭｇＣｒ２ ） ２ Ａｌｌ 、水
８μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μ！にューイングラ
ンド・バイオラボ、８００単位）と混合した。この反応
混合物を２０℃で２時間インキュベートした。次いで、
このライゲートされたＤＮＡを大腸菌に１２ＲＶ３０８
の形質転換に用いた。
Ｂ、 大腸１Ｋ１２ ＲＶ３０８／ＰＬＥＢＧＨ１
ｆ７）ｍ立て １、凍結された、コンピテントな大腸菌Ｋ １２Ｒｖ３
０８ および大腸菌に１２ＭＭ２９４の調製大腸菌に１
２ ＲＶ ３０Ｂ （ＮＲＲＬｔＳ−１５６２４）およ
び大腸菌に１２ ＭＭ２ ｇ ４ （ＮＲＲＬＢ −１
５６２５）を、それぞれ、５ｔｎｌのＴＹブロスに接種
し、得られた培養物を振盪下、３７℃で一夜インキユベ
ートした。この−夜培養物をＴＹブロスで終容量１！に
希釈すると、各培養物の光学的密度の読みは６０００ｍ
において〜０．１吸収単位を示した。６００ ｎｒｎに
おける光学的密度が０．５５〜０．６５吸収単位の範囲
に達するまで３７℃において°振盪しながらインキュベ
ーションを行い、その後、遠心して細胞を集めた。
゛ −各細胞ペレットを個別に、冷却した５ＱｍＭＣ
ａＣ／２５００−に懸濁し、得られた混合物を氷上で１
５−３０分間インキュベートした。次いで遠心して細胞
を集め、得られたペレットを冷却した５ ０ ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２中の２０％グリセリン溶液２〇−中に懸濁した
。次いで、この細胞懸濁液をあらかじめ冷却しておいた
チューブ内に０．２−づつ加え、即座に一７０℃にし、
その温度で保存した。
ｆ７）ｍ立て １、凍結された、コンピテントな大腸菌Ｋ １２Ｒｖ３
０８ および大腸菌に１２ＭＭ２９４の調製大腸菌に１
２ ＲＶ ３０Ｂ （ＮＲＲＬｔＳ−１５６２４）およ
び大腸菌に１２ ＭＭ２ ｇ ４ （ＮＲＲＬＢ −１
５６２５）を、それぞれ、５ｔｎｌのＴＹブロスに接種
し、得られた培養物を振盪下、３７℃で一夜インキユベ
ートした。この−夜培養物をＴＹブロスで終容量１！に
希釈すると、各培養物の光学的密度の読みは６０００ｍ
において〜０．１吸収単位を示した。６００ ｎｒｎに
おける光学的密度が０．５５〜０．６５吸収単位の範囲
に達するまで３７℃において°振盪しながらインキュベ
ーションを行い、その後、遠心して細胞を集めた。
゛ −各細胞ペレットを個別に、冷却した５ＱｍＭＣ
ａＣ／２５００−に懸濁し、得られた混合物を氷上で１
５−３０分間インキュベートした。次いで遠心して細胞
を集め、得られたペレットを冷却した５ ０ ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２中の２０％グリセリン溶液２〇−中に懸濁した
。次いで、この細胞懸濁液をあらかじめ冷却しておいた
チューブ内に０．２−づつ加え、即座に一７０℃にし、
その温度で保存した。
この方法で調製した細胞は１年間、生長能力を保持して
おり、形質転換に適合性を有している。
おり、形質転換に適合性を有している。
２．形質転換
コンピテントな大腸菌に１２ＲＶ３０８ 細胞の入っ
ているチューブ一本を一７０℃の保存状態から取り出し
、解凍して実施例５ＡのＤＮＡとライゲートさせた。こ
の細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベートし
た。次いで細胞を集め、上清を捨て、ペレットを、トリ
プトファン１００μｇ／−を補充したＴＹブロス０，５
−に懸濁した。
ているチューブ一本を一７０℃の保存状態から取り出し
、解凍して実施例５ＡのＤＮＡとライゲートさせた。こ
の細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベートし
た。次いで細胞を集め、上清を捨て、ペレットを、トリ
プトファン１００μｇ／−を補充したＴＹブロス０，５
−に懸濁した。
３７℃で３０分間インキュベートした後、アンピシリン
５０μｇ／−およびトリプトファン１００μｇ／−を補
充したＴＹ平板上にプレートした。
５０μｇ／−およびトリプトファン１００μｇ／−を補
充したＴＹ平板上にプレートした。
これらの平板を３７℃で一夜インキユベートした。
３、分析
実施例５Ａで調製したライゲーション産物は所望のプラ
スミドｐＬＥＢＧＨ１とその他の望ましくないプラスミ
ドの両方を含有しているので、どの形質転換体中にプラ
スミドｐＬＥＢＧＨｌが存在しているかを決定するため
に、各形質転換体を分析した。
スミドｐＬＥＢＧＨ１とその他の望ましくないプラスミ
ドの両方を含有しているので、どの形質転換体中にプラ
スミドｐＬＥＢＧＨｌが存在しているかを決定するため
に、各形質転換体を分析した。
プラスミドｐＬＥＢＧＨ１の全ＤＮＡ配列は予測され得
るので、反応産物がプラスミドｐＬＥＢＧＨ１について
予測されるものであるか否かを調べるために、形質転換
された大腸菌細胞から単離したプラスミドＤＮＡを様々
な異った制限酵素類で開裂させ、電気泳動とゲル分析法
にかけた。形質転換体によって発現されたタンパク質を
トリプトファンの非存在下で分析し、ＬＥｌ−ＥＫ−Ｂ
ＧＨ（３８，０００ダルトン）の生産に基づき、所望の
形質癲換体を同定した。ＬＥｌ−ＥＫ−ＢＧＨおよびＬ
Ｅ２−Ｅに−ＢＧＨはいずれもｐＢＲ３２２ＤＮＡがコ
ードしているタンパク質を含んでいる。
るので、反応産物がプラスミドｐＬＥＢＧＨ１について
予測されるものであるか否かを調べるために、形質転換
された大腸菌細胞から単離したプラスミドＤＮＡを様々
な異った制限酵素類で開裂させ、電気泳動とゲル分析法
にかけた。形質転換体によって発現されたタンパク質を
トリプトファンの非存在下で分析し、ＬＥｌ−ＥＫ−Ｂ
ＧＨ（３８，０００ダルトン）の生産に基づき、所望の
形質癲換体を同定した。ＬＥｌ−ＥＫ−ＢＧＨおよびＬ
Ｅ２−Ｅに−ＢＧＨはいずれもｐＢＲ３２２ＤＮＡがコ
ードしているタンパク質を含んでいる。
この様な方法で、大腸菌に１２ＲＶ３０８／ｐＬＥＢＣ
Ｈ１形質転換体を同定し、単離した。
Ｈ１形質転換体を同定し、単離した。
実施例６° ＩＧＦ■をコードしているＤＮＡの組立て
ＩＧＦＸ遺伝子の暗号領域の合成は次の一般的な方法に
従って行われた：Ａ）改良ホスホトリエステル法により
、それぞれ９〜１５デオキシリポスクレオチドを含有し
ている３８個の一本鎖デオキシリボヌクレオチドを合成
する：Ｂ）３８個の一本鎖デオキシリボヌクレオチドの
内、幾つかをりん酸化する；Ｃ）一連のアニーリングお
よびライゲーション反応を行い、それぞれ、遺伝子の暗
号領域の約半分を構成している２個の２本鎖ＤＮＡ分子
を形成する。
従って行われた：Ａ）改良ホスホトリエステル法により
、それぞれ９〜１５デオキシリポスクレオチドを含有し
ている３８個の一本鎖デオキシリボヌクレオチドを合成
する：Ｂ）３８個の一本鎖デオキシリボヌクレオチドの
内、幾つかをりん酸化する；Ｃ）一連のアニーリングお
よびライゲーション反応を行い、それぞれ、遺伝子の暗
号領域の約半分を構成している２個の２本鎖ＤＮＡ分子
を形成する。
上で形成した２個のフラグメントを最終的にプラスミド
ｐＢＲ３２２に挿入してＩＧＦＩ暗号配列の全てを含む
一本鎖ＤＮＡ分子を組立てた（実施例７）。次に、上記
のＡ−Ｃの工程を詳しく説明する。
ｐＢＲ３２２に挿入してＩＧＦＩ暗号配列の全てを含む
一本鎖ＤＮＡ分子を組立てた（実施例７）。次に、上記
のＡ−Ｃの工程を詳しく説明する。
Ａ、一本ＭＤＮＡフラグメントの合成
シウング（Ｈｓ ｉｕｎｇ ） らの改良ホスホトリ
エステル法〔ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） １１
： ３２２７ （１９８３））により、以下の表１
に列記した３８個のデオキシリボヌクレオチドを合成し
た。また、良く知られた、−重鎖フラグメントの合成に
適した様々なりＮＡ合成装置を利用したう 表１ １ ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴ １１２
ＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＣＴ １２
３ ＧＣ；ＣＧＧＣＧＡＡＣＴΩ １２４ Ａ
ＡＣ，ＣＣＡＣＣ；ＧＴ １０５ ＧＴＴＧＡ
ＣＡＣＴＣＴＧ １２５ ＣＧＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＧＡ １２７ ＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣ１１ ８ＴＣＴＣＧＴＣＣＧＧ １０ ９ ＣＴ丁ＣＴＣＧＴＧＴτ丁
１２ＩＱ ＣＴＡＧＡＣＧＴＴＣ１０ １１ＴＣＧＴＣ，ＧＣＡＴ ９１２ ＣＧＴ
ＴＧＡＡＧＡＡＴＧ １２１３ ＴＣＴＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＧ １２１４ ＣＡＧＴＴＣＧＴＴ
ＴＧＣ１２１５ＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧ １０１６
ＡＡＡＣＴＴＡＣＴＧＣ１１１７ＧＣＴＡＣ
ＴＣＣＴＧＣＴ １２１８ＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴ
ＡＡＴＡＧ １５１９ ＣＧＡＴＡＡＧＣＣＡＴ
Ｇ １２２０ ＧＴＴＴＣＡＧＡＣＣ，ＧＴ
１２２１ ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣ１２２２
ＡＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴ １２２３ ＣＴＧ
ＣＴＴＣＣＧＣＩＱ ２４ ＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧ ｌ。
エステル法〔ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） １１
： ３２２７ （１９８３））により、以下の表１
に列記した３８個のデオキシリボヌクレオチドを合成し
た。また、良く知られた、−重鎖フラグメントの合成に
適した様々なりＮＡ合成装置を利用したう 表１ １ ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴ １１２
ＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＣＴ １２
３ ＧＣ；ＣＧＧＣＧＡＡＣＴΩ １２４ Ａ
ＡＣ，ＣＣＡＣＣ；ＧＴ １０５ ＧＴＴＧＡ
ＣＡＣＴＣＴＧ １２５ ＣＧＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＧＡ １２７ ＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣ１１ ８ＴＣＴＣＧＴＣＣＧＧ １０ ９ ＣＴ丁ＣＴＣＧＴＧＴτ丁
１２ＩＱ ＣＴＡＧＡＣＧＴＴＣ１０ １１ＴＣＧＴＣ，ＧＣＡＴ ９１２ ＣＧＴ
ＴＧＡＡＧＡＡＴＧ １２１３ ＴＣＴＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＧ １２１４ ＣＡＧＴＴＣＧＴＴ
ＴＧＣ１２１５ＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧ １０１６
ＡＡＡＣＴＴＡＣＴＧＣ１１１７ＧＣＴＡＣ
ＴＣＣＴＧＣＴ １２１８ＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴ
ＡＡＴＡＧ １５１９ ＣＧＡＴＡＡＧＣＣＡＴ
Ｇ １２２０ ＧＴＴＴＣＡＧＡＣＣ，ＧＴ
１２２１ ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣ１２２２
ＡＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴ １２２３ ＣＴＧ
ＣＴＴＣＣＧＣＩＱ ２４ ＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧ ｌ。
２５ ＧＡＧＡＧＡＡＧＴＡＧ １１２６
ＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＩＱ ２７ ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣＧＡ １２２８
ＡＣＧＡＧＡＡＣＧＴ １０表 １ （つづき
） ２ｇ ＡＡＣＧＡＴ（、ＣＣ９ ３０ＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＣ１４３１ＴＣＧＣＡ
ＡＧＡＧＣＧＧ １２３２ ＣＡ
ＧＡＧＣＣＡＧＧ １０３３
ＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧ １０３４
ＡＧＴＡＧＣＧＣＡＧＴ １
１３５ ＡＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＧ
１２３６ ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＴＴＣ１３
３７ＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣ１２ ３８ＣＧＣＣＧＣＡＣＡＧＡ １１Ｂ
、りん酸化 上記のオリゴヌクレオチドの各々を薄層クロマトグラフ
ィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した
後、表１に示した３８の一重鎖ＤＮＡフラグメントの内
、幾つかをシウングらの方法（１９８３）に従ってりん
酸化し、ライゲーションおよびＩＧＦＩ遺伝子暗号ＤＮ
Ａフラグメントの組立てを容易にした。このりん酸化反
応に機微の（ｒ−３２ｐ）−ＡＴＰを用いたので、幾つ
かのフラグメントの５′末端には１３２Ｐ”の表示が付
されている。
ＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＩＱ ２７ ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣＧＡ １２２８
ＡＣＧＡＧＡＡＣＧＴ １０表 １ （つづき
） ２ｇ ＡＡＣＧＡＴ（、ＣＣ９ ３０ＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＣ１４３１ＴＣＧＣＡ
ＡＧＡＧＣＧＧ １２３２ ＣＡ
ＧＡＧＣＣＡＧＧ １０３３
ＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧ １０３４
ＡＧＴＡＧＣＧＣＡＧＴ １
１３５ ＡＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＧ
１２３６ ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＴＴＣ１３
３７ＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣ１２ ３８ＣＧＣＣＧＣＡＣＡＧＡ １１Ｂ
、りん酸化 上記のオリゴヌクレオチドの各々を薄層クロマトグラフ
ィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した
後、表１に示した３８の一重鎖ＤＮＡフラグメントの内
、幾つかをシウングらの方法（１９８３）に従ってりん
酸化し、ライゲーションおよびＩＧＦＩ遺伝子暗号ＤＮ
Ａフラグメントの組立てを容易にした。このりん酸化反
応に機微の（ｒ−３２ｐ）−ＡＴＰを用いたので、幾つ
かのフラグメントの５′末端には１３２Ｐ”の表示が付
されている。
Ｃ，アニーリングおよびライゲーションフラグメント１
，２，３，１９，２０，２１゜３７および３８をアニー
リングし、ライゲートす ′ることにより、二
本鎖ＤＮＡ （Ｄｕｐｌｅｘ ） 工：を組立てた。
，２，３，１９，２０，２１゜３７および３８をアニー
リングし、ライゲートす ′ることにより、二
本鎖ＤＮＡ （Ｄｕｐｌｅｘ ） 工：を組立てた。
フラグメント５，１４．２４，２２．６および４をアニ
ーＪＪ、ングし、ライゲートすること番こより、二本鎖
ＤＮＡ■： ５’ ３２Ｐ−ＧＴＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣ；ＣＡＧＴ
ＴＣＧＴＴＴ−３’ＨＯ−ＴＧＴＧＡＧＡＣＧＴＧＡＡ
ＧＣＡＡＡ−■ を組立てた。
ーＪＪ、ングし、ライゲートすること番こより、二本鎖
ＤＮＡ■： ５’ ３２Ｐ−ＧＴＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣ；ＣＡＧＴ
ＴＣＧＴＴＴ−３’ＨＯ−ＴＧＴＧＡＧＡＣＧＴＧＡＡ
ＧＣＡＡＡ−■ を組立てた。
フラグメント７．８．９，２５．２６および２７をアニ
ーリングし１、ライゲートすることにより、二本鎖ＤＮ
Ａ［： を組立てた。
ーリングし１、ライゲートすることにより、二本鎖ＤＮ
Ａ［： を組立てた。
次いで、二本鎖ＤＮＡ分子、■、■および■を混合し、
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで処理して一方の末端にＥｃｏＲ
ニオ−バーラップ（重複）を、他方の末端齋こｘｂａ■
オーバーラツプを有する二本鎖分子を形成した。このラ
イゲーション反応で得た、二本鎖ＤＮＡ工、■および■
を含有する生産物を１０％ポリアクリルアミドゲルを用
いて精製したところ、これは、ＩＧＦＵ暗号領域の約１
／２ を構成していた。
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで処理して一方の末端にＥｃｏＲ
ニオ−バーラップ（重複）を、他方の末端齋こｘｂａ■
オーバーラツプを有する二本鎖分子を形成した。このラ
イゲーション反応で得た、二本鎖ＤＮＡ工、■および■
を含有する生産物を１０％ポリアクリルアミドゲルを用
いて精製したところ、これは、ＩＧＦＵ暗号領域の約１
／２ を構成していた。
同様にして、残りのＩＧＦ］ｉ暗号領域も合成した。即
ち、フラグメント１０，１１，１２．２８゜２９および
３０をアニーリングし、ライゲートすることにより、二
本鎖ＤＮＡ ｌ’％ｒ：１１＋１１１１１ −ＣＴＴＣＴＴＡＣ（１；ＡＣＧＡＡ−Ｐ ５’を組立
てた。
ち、フラグメント１０，１１，１２．２８゜２９および
３０をアニーリングし、ライゲートすることにより、二
本鎖ＤＮＡ ｌ’％ｒ：１１＋１１１１１ −ＣＴＴＣＴＴＡＣ（１；ＡＣＧＡＡ−Ｐ ５’を組立
てた。
フラグメント２３，１３，１５，１６，３１゜３２．３
．３および３４をアニー、ｌｌングし、ライゲートする
こと畜こより、二本鎖ＤＮＡＶ ：を組立てた。
．３および３４をアニー、ｌｌングし、ライゲートする
こと畜こより、二本鎖ＤＮＡＶ ：を組立てた。
フラグメント１７．１８．３５および３６をアニーリン
グし、ライゲートすることにより、二本鎖ＤＮＡＶＩ： を組立てた。
グし、ライゲートすることにより、二本鎖ＤＮＡＶＩ： を組立てた。
次いで、二本鎖ＤＮＡ分子■、■および■をライゲート
シ、ＩＧＦＩＪ暗号領域の残余部分を形成させた。この
ライゲーションにより、一方の末端にＸｂａ Ｉオーバ
ーラツプを、他方の末端にＢ＠ｍＨ１オーバーラツプを
有するＤＮＡ分子が生産された。このライゲーション産
物を１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。
シ、ＩＧＦＩＪ暗号領域の残余部分を形成させた。この
ライゲーションにより、一方の末端にＸｂａ Ｉオーバ
ーラツプを、他方の末端にＢ＠ｍＨ１オーバーラツプを
有するＤＮＡ分子が生産された。このライゲーション産
物を１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。
実施例７ プラスミドｐＩＧＦ２０１ およびｐＩＧ
Ｆ２０２の組立て Ａ、プラスミドｐ ＩＧＦ２の組立て ５μｇのｐＢＲ３２２をＴＥバッファー５μｌ＋Ｃ溶カ
Ｌ、１０ Ｘ Ｂａｍ Ｈ１バツフアー（１，５ＭＮａ
Ｃ！、６０ｍＭ ）リス−ＨＣｊ ｐＨ７，９、６０ｒ
ｎＭ ＭｇＣ／２および１”７７ｍ１Ｂｓｋ ）２ｆｉ
！。
Ｆ２０２の組立て Ａ、プラスミドｐ ＩＧＦ２の組立て ５μｇのｐＢＲ３２２をＴＥバッファー５μｌ＋Ｃ溶カ
Ｌ、１０ Ｘ Ｂａｍ Ｈ１バツフアー（１，５ＭＮａ
Ｃ！、６０ｍＭ ）リス−ＨＣｊ ｐＨ７，９、６０ｒ
ｎＭ ＭｇＣ／２および１”７７ｍ１Ｂｓｋ ）２ｆｉ
！。
Ｒａｍ ＨＩ 制限酵素１μｌ（〜１０単位）および水
１２μｌを加え、静かに混合した後、３７℃で２時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、ＢａｍＨＩ
消化ＤＮＡを沈殿させ、次いで、１０ＸＥｃｏ Ｒエハ
ッフ７−２ ｔｔｌ 、 ＥｃｏＲＩ制限酵素１μ！（
〜１０単位）および水１７μｌに懸濁した。静かに混合
した後、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし
た。
１２μｌを加え、静かに混合した後、３７℃で２時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、ＢａｍＨＩ
消化ＤＮＡを沈殿させ、次いで、１０ＸＥｃｏ Ｒエハ
ッフ７−２ ｔｔｌ 、 ＥｃｏＲＩ制限酵素１μ！（
〜１０単位）および水１７μｌに懸濁した。静かに混合
した後、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし
た。
このＥｃｏＲ工消化およびＢａｍＨ工消化デシスミドＰ
龜３２２をフェノール−ＣＨＣｌ３ （５０：５０）で
１回抽出し、次いで、ＣＨＣｌ ’３単独で抽出した。
龜３２２をフェノール−ＣＨＣｌ３ （５０：５０）で
１回抽出し、次いで、ＣＨＣｌ ’３単独で抽出した。
この混合物をＮａ０ＡＬＱ０．３ Ｍにし、２゜５〜３
容量のエタノールを加えて混合し、−７０℃に冷却し、
遠心することにより、ＤＮＡの沈殿を得た。得られたＤ
ＮＡペレットはＥｃｏＲ工消化デシびＢａｍＨＩ消化プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ−５μｇで構成されていた
。このＤＮＡをＴＥバッファー２５μｌに懸濁した後、
実施例６で調製した合成ＩＧＦ■暗号遺伝子フラグメン
トとのライゲーションに使用するため、−２０℃で保存
した。
容量のエタノールを加えて混合し、−７０℃に冷却し、
遠心することにより、ＤＮＡの沈殿を得た。得られたＤ
ＮＡペレットはＥｃｏＲ工消化デシびＢａｍＨＩ消化プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ−５μｇで構成されていた
。このＤＮＡをＴＥバッファー２５μｌに懸濁した後、
実施例６で調製した合成ＩＧＦ■暗号遺伝子フラグメン
トとのライゲーションに使用するため、−２０℃で保存
した。
ＥｃｏＲＩ 消化およびＢ１ｍＨ工消化デシスミドｐ
ＢＲ３２２１μＥを、実施例６で調製した。Ｅｃ。
ＢＲ３２２１μＥを、実施例６で調製した。Ｅｃ。
Ｒ１−Ｘｂａ工、ＩＧＦＩｒ暗号フラグメントおよびＸ
ｂａ ニー Ｂａｍｔ（Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ暗号フラグメ
ント（１ピコモルづつ）に加えた。実質上、実施例５の
ライゲーション法１こ従い、ＤＮＡ分子をライゲートシ
た。このライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例
５の形質転換法に従って大腸菌ＲＶ３０８を形質転換し
た。所望の形質転換体を、それらに予測されるアンピシ
リン耐性およびテトラサイタリン感受性表現型、並びに
そのプラスミドＤＮＡの分析に基づき、同定した。こう
して同定された形質転換体は、所望の大腸菌ＲＶ３０８
／ｐＩＧＦ２を構成していた。実質上、実施例３と同様
にしてプラスミドｐ Ｉ Ｇ Ｆ ２を調製し、精製し
た。
ｂａ ニー Ｂａｍｔ（Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ暗号フラグメ
ント（１ピコモルづつ）に加えた。実質上、実施例５の
ライゲーション法１こ従い、ＤＮＡ分子をライゲートシ
た。このライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例
５の形質転換法に従って大腸菌ＲＶ３０８を形質転換し
た。所望の形質転換体を、それらに予測されるアンピシ
リン耐性およびテトラサイタリン感受性表現型、並びに
そのプラスミドＤＮＡの分析に基づき、同定した。こう
して同定された形質転換体は、所望の大腸菌ＲＶ３０８
／ｐＩＧＦ２を構成していた。実質上、実施例３と同様
にしてプラスミドｐ Ｉ Ｇ Ｆ ２を調製し、精製し
た。
Ｂ、プラスミドｐＩＧＦ２の消化および脱りん酸化
５μｊの単離プラスミドｐＩＧＦ２を、実質上、実施例
４と同様多こして全ＸＳＯμｍ＋こおいて、ＥｃｏＲＩ
により、消化した。得られたＥｃｏＲ４消化プラスミ
ドｐ ＩＧＦ２を遠心してペレット化し、実質上、実施
例５Ａの方法に従い、このペレットをホスファターゼバ
ッファー１００μｊに懸濁し、次いで子牛の腸から得た
アルカリ性ホスファターゼで処理した。酵素ホスファタ
ーゼを除去した後、脱りん酸化されたＥｃｏＲ工消化デ
シスミドｐＩＧＦ２をＴＥバッファー２５μｊに懸濁し
、−乏Ｏ℃で保存した。
４と同様多こして全ＸＳＯμｍ＋こおいて、ＥｃｏＲＩ
により、消化した。得られたＥｃｏＲ４消化プラスミ
ドｐ ＩＧＦ２を遠心してペレット化し、実質上、実施
例５Ａの方法に従い、このペレットをホスファターゼバ
ッファー１００μｊに懸濁し、次いで子牛の腸から得た
アルカリ性ホスファターゼで処理した。酵素ホスファタ
ーゼを除去した後、脱りん酸化されたＥｃｏＲ工消化デ
シスミドｐＩＧＦ２をＴＥバッファー２５μｊに懸濁し
、−乏Ｏ℃で保存した。
Ｃ，ライゲーションおよび形質転換
１μｌの脱りん酸化ＥｃｏＲ工消化プラスミドｐ ＩＧ
Ｆ ２を実施例２で単離したｔｒｐＬＥｌ暗号化Ｅｃｏ
Ｒ４制限フラグメント４μｌに加え、実質上、実施例５
Ａと同様多こしてライゲートさせた。
Ｆ ２を実施例２で単離したｔｒｐＬＥｌ暗号化Ｅｃｏ
Ｒ４制限フラグメント４μｌに加え、実質上、実施例５
Ａと同様多こしてライゲートさせた。
ライゲートされたＤＮＡは所望のプラスミドｐＩＧＦ２
０１を構成していた。ｔｒｐＬＥ１暗号化ＥｃｏＲエ
フラグメントの代りに実施例４で調製したｔｒｐＬＥ
２暗号化ＥｃｏＲ工制限フラグメント４μｌを使用し、
同様の方法でプラスミドＰＩＣＦ２０２を組立てた。
０１を構成していた。ｔｒｐＬＥ１暗号化ＥｃｏＲエ
フラグメントの代りに実施例４で調製したｔｒｐＬＥ
２暗号化ＥｃｏＲ工制限フラグメント４μｌを使用し、
同様の方法でプラスミドＰＩＣＦ２０２を組立てた。
プラスミドｐ Ｉ ＣＦ ２０１およびｐｌＧＦ２０２
を構成する、これらのライゲートされたＤＮＡの各々を
用いて、実質上、実施例５Ｂ２の形質転換法に従い、大
腸菌ＫＡ！ＲＶ３０８および大腸菌に１２ＭＭ２９４の
両者を形質転換した。所望の形ａｉｎ体、大腸ＩＷＫ１
２ＲＶ３０８／ｐＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ＭＭ２９
４／ｐ ＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ＲＶ３ ｏｓ／ｐ
ＩＧＦ２０２諮！び大腸菌に１２ＭＭ２９４／Ｐ Ｉ
ＧＦ２０２を、それらのプラスミドＤＮＡの分析、並び
Ｓこトリプトファン非存在下でのタンパク質の産性に基
づき、同定した。
を構成する、これらのライゲートされたＤＮＡの各々を
用いて、実質上、実施例５Ｂ２の形質転換法に従い、大
腸菌ＫＡ！ＲＶ３０８および大腸菌に１２ＭＭ２９４の
両者を形質転換した。所望の形ａｉｎ体、大腸ＩＷＫ１
２ＲＶ３０８／ｐＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ＭＭ２９
４／ｐ ＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ＲＶ３ ｏｓ／ｐ
ＩＧＦ２０２諮！び大腸菌に１２ＭＭ２９４／Ｐ Ｉ
ＧＦ２０２を、それらのプラスミドＤＮＡの分析、並び
Ｓこトリプトファン非存在下でのタンパク質の産性に基
づき、同定した。
実施例８ インシュリンＡ鎖発現ベクター、インシュリ
ン°Ｂ鎖発現ベクターおよびプロインシュリン発現ベク
ターの組立て Ａ、構造遺伝子の単離 １、インシュリンＡ鎖構造遺伝子の単離インシュリンＡ
鎖構造遺伝子は、プラスミドＰＩＡＩから得られた：こ
のプラスミドの組立てはゲラ７” ル（Ｇｏｃｄｄｅｌ
） らにより開示されている〔フロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ（Ｐｒｏｃ。
ン°Ｂ鎖発現ベクターおよびプロインシュリン発現ベク
ターの組立て Ａ、構造遺伝子の単離 １、インシュリンＡ鎖構造遺伝子の単離インシュリンＡ
鎖構造遺伝子は、プラスミドＰＩＡＩから得られた：こ
のプラスミドの組立てはゲラ７” ル（Ｇｏｃｄｄｅｌ
） らにより開示されている〔フロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ（Ｐｒｏｃ。
Ｎａ ｔ １・ Ｓｃｉ・’）ＵＳＡ ７６ ： １０
６（１９７９）〕。プラスミドｐＩＡｌ約５０μｇを実
質上、実施例７Ａと同様にしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに
電気溶離によって所望の〜０．４２５ｋｂインシュリン
Ａ鎖構造遺伝子含有ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限フ）グ
メントを単離した。所望のフラグメン） 約０．５μｇ
を得、これをＴＥバッファー２“５μｊに懸濁し、−２
０”Ｃで保存した。
６（１９７９）〕。プラスミドｐＩＡｌ約５０μｇを実
質上、実施例７Ａと同様にしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに
電気溶離によって所望の〜０．４２５ｋｂインシュリン
Ａ鎖構造遺伝子含有ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限フ）グ
メントを単離した。所望のフラグメン） 約０．５μｇ
を得、これをＴＥバッファー２“５μｊに懸濁し、−２
０”Ｃで保存した。
２、インシュリンＢ鎖構造遺伝子の単離インシュリンＢ
鎖構造遺伝Ｔは、プラスミドＰＩＢｌから得られた：こ
のプラスミドの組立ては、ゲラデルら（１９７９）によ
って開示されている。
鎖構造遺伝Ｔは、プラスミドＰＩＢｌから得られた：こ
のプラスミドの組立ては、ゲラデルら（１９７９）によ
って開示されている。
プラスミドｐＩｇ１約５０μｇを、実質上、実施例７Ａ
と同様にしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動差引こ電気溶離によって
所望の〜０．４５３１ｋｂインシュリンＢ鎖＃造遺伝子
含有ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し
た。所望の７ラグメント約０．５μｇを得、これをＴＥ
バッファー２５１１Ｃｃ！！、濁し、−２０℃で保存し
た、３、 プロインシュリン構造遺伝子の単離プロイン
シュリン構造遺伝子は、プラスミドＰＨＩ７△４△１か
ら得られた：このプラスミドの組立ては、ヨーロッパ特
許出願公開番号第１０５６０８ＡＩ号（１９８４年４月
１８日公開）の実施例２および実施例４１こ開示されて
いる。プラスミドｐＨｌ７△４Δ１約５０μｇを、実質
上、実施例７Ａと同ｓｔｃしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに
電気溶離によって所望の〜０．７０５ｋｂプロインシュ
リン構造遺伝Ｔ含有ＥｃｏＲニーＢａｍＨｒ制限フラグ
メントを単離した。所望のフラグメント約０．５μｇを
得、これをＴＥバッファー２５μｌに懸濁し、−２０’
Ｃで保存した。
と同様にしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動差引こ電気溶離によって
所望の〜０．４５３１ｋｂインシュリンＢ鎖＃造遺伝子
含有ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し
た。所望の７ラグメント約０．５μｇを得、これをＴＥ
バッファー２５１１Ｃｃ！！、濁し、−２０℃で保存し
た、３、 プロインシュリン構造遺伝子の単離プロイン
シュリン構造遺伝子は、プラスミドＰＨＩ７△４△１か
ら得られた：このプラスミドの組立ては、ヨーロッパ特
許出願公開番号第１０５６０８ＡＩ号（１９８４年４月
１８日公開）の実施例２および実施例４１こ開示されて
いる。プラスミドｐＨｌ７△４Δ１約５０μｇを、実質
上、実施例７Ａと同ｓｔｃしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに
電気溶離によって所望の〜０．７０５ｋｂプロインシュ
リン構造遺伝Ｔ含有ＥｃｏＲニーＢａｍＨｒ制限フラグ
メントを単離した。所望のフラグメント約０．５μｇを
得、これをＴＥバッファー２５μｌに懸濁し、−２０’
Ｃで保存した。
Ｂ、ライゲーション
実質上、実施例５Ａの方法に従って以下のライゲーショ
ンを行った。実施例８Ａで単離した３種類の構造遺伝子
のそれぞれについて、ＥｒｐＬＥｌおよびｔｒＰＬＥ２
誘導体を組立てるためｆζ６つの’Ａる５イ’ｙ’−ジ
ョンを行った。各ライ）ｆ −’ｉジョン合物中には次
のものが含まれる：実施例７Ａで調製したＥｃｏＲＪ
消化およびＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａ１μｌ：実施例２および４で調製したｔｒｐ ＬＥ
１暗号化ＥｃｏＲ４制限フラグメントまたはＬｒｐＬＥ
２暗号化ＥＣ０ＲＩ制限フラ°グメント４μｌ ：実施
例８Ａで単離したＥｃｏ ＲＩ −ＢａｍＨ工構造遺伝
子暗号化制限シラグメントの内、いずれか１つ、４μ！
。 この様にして得られたプラスミドｐ Ｉ ＡＬＥ
ｌおよヒＰＩＡＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥｌ−イン
シュリンＡ鎖およびｔｒｐＬＥ２−インシュリンＡ鎖で
示される各誘導体遺伝子を；プラスミドｐ Ｉ ＢＬＥ
ｌおよびｐＩＢＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥｌ−イン
シュリンＢ鎖およびｔｒｐ Ｌ Ｅ ２−インシュリン
Ｂ鎖で示される各誘導体遺伝子を；そしてプラスミドｐ
ＰＩＬＥｌおよびｐＰＩＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥ
ｌ−プロインシュリンおよびｔｒｐＬＥ２−プロインシ
ュリンで示される各遺伝子誘導体を含有している。
ンを行った。実施例８Ａで単離した３種類の構造遺伝子
のそれぞれについて、ＥｒｐＬＥｌおよびｔｒＰＬＥ２
誘導体を組立てるためｆζ６つの’Ａる５イ’ｙ’−ジ
ョンを行った。各ライ）ｆ −’ｉジョン合物中には次
のものが含まれる：実施例７Ａで調製したＥｃｏＲＪ
消化およびＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａ１μｌ：実施例２および４で調製したｔｒｐ ＬＥ
１暗号化ＥｃｏＲ４制限フラグメントまたはＬｒｐＬＥ
２暗号化ＥＣ０ＲＩ制限フラ°グメント４μｌ ：実施
例８Ａで単離したＥｃｏ ＲＩ −ＢａｍＨ工構造遺伝
子暗号化制限シラグメントの内、いずれか１つ、４μ！
。 この様にして得られたプラスミドｐ Ｉ ＡＬＥ
ｌおよヒＰＩＡＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥｌ−イン
シュリンＡ鎖およびｔｒｐＬＥ２−インシュリンＡ鎖で
示される各誘導体遺伝子を；プラスミドｐ Ｉ ＢＬＥ
ｌおよびｐＩＢＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥｌ−イン
シュリンＢ鎖およびｔｒｐ Ｌ Ｅ ２−インシュリン
Ｂ鎖で示される各誘導体遺伝子を；そしてプラスミドｐ
ＰＩＬＥｌおよびｐＰＩＬＥ２はそれぞれ、ｔｒｐＬＥ
ｌ−プロインシュリンおよびｔｒｐＬＥ２−プロインシ
ュリンで示される各遺伝子誘導体を含有している。
Ｃ９形質転換
実質上、実施例５Ｂ２の方法に従い、実施例８Ｂで得た
６個のライゲーション産物の各々を用いて大腸菌に１２
ＲＶ３０８を形質転換した。所望の形質転換体を、
そのアンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性表
現型、並びに形質転換体のプラスミドＤＮＡに関する分
析に基づいて同定した。
６個のライゲーション産物の各々を用いて大腸菌に１２
ＲＶ３０８を形質転換した。所望の形質転換体を、
そのアンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性表
現型、並びに形質転換体のプラスミドＤＮＡに関する分
析に基づいて同定した。
実施例９ 細胞エキスの調製および分析Ａ、細胞培養
トリプトファンおよびアンピシリンを１００μｇ１ｍｔ
づつ補充したＴＹ培地中で、大腸菌に１２ＲＶ ３０８
／ｐＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＩＧ
Ｆ２０２、大ＭＩＩＫ１２ ＲＶ ３０８／ｐＩＧＦ２
０３、大腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐｌＧＦ２０１、大
腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０２および大腸菌
に１２ＭＭ２９４／Ｐ ＩＧＦ２０３の一夜培養物を調
製した。プラスミドｐＩＧＦ２０３はＩＧＦ■構造遺伝
子の先端部分の解読相内に改良されていないｔ ｒｐ
Ｌ Ｅ配列を有していることを除き、他の全てにおいて
プラスミドｐｌＧ’Ｆ２０１およびｐＩＧＦ２０２
と同じである。これらの−夜培養物を、ｓ ｓ ｏ ｎ
ｍにおける光学的密度が〜４．５吸収単位になるまで増
殖させた。これら−夜培養物をＭ９培♂（トリプトファ
ンは加えず）で希釈した；即ち、各−夜培養物毎に、指
数増殖期の早期お°よび定常期早期において起こってい
るタンパク質の細胞内での合成を観察するために、°い
くつかの希釈操作を行った。こうして、明確に区別され
る１２個の培養物を調製した。次いで、これらの培養物
を３７℃で４−８時間インキュベートした。
づつ補充したＴＹ培地中で、大腸菌に１２ＲＶ ３０８
／ｐＩＧＦ２０１、大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＩＧ
Ｆ２０２、大ＭＩＩＫ１２ ＲＶ ３０８／ｐＩＧＦ２
０３、大腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐｌＧＦ２０１、大
腸菌に１２ ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０２および大腸菌
に１２ＭＭ２９４／Ｐ ＩＧＦ２０３の一夜培養物を調
製した。プラスミドｐＩＧＦ２０３はＩＧＦ■構造遺伝
子の先端部分の解読相内に改良されていないｔ ｒｐ
Ｌ Ｅ配列を有していることを除き、他の全てにおいて
プラスミドｐｌＧ’Ｆ２０１およびｐＩＧＦ２０２
と同じである。これらの−夜培養物を、ｓ ｓ ｏ ｎ
ｍにおける光学的密度が〜４．５吸収単位になるまで増
殖させた。これら−夜培養物をＭ９培♂（トリプトファ
ンは加えず）で希釈した；即ち、各−夜培養物毎に、指
数増殖期の早期お°よび定常期早期において起こってい
るタンパク質の細胞内での合成を観察するために、°い
くつかの希釈操作を行った。こうして、明確に区別され
る１２個の培養物を調製した。次いで、これらの培養物
を３７℃で４−８時間インキュベートした。
４Ｍ９培地は水１／中に下記の成分を含む：Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４，７Ｈ２０１０ｇ 、 にＨ２ＰＯ４３ｇ。
Ｏ４，７Ｈ２０１０ｇ 、 にＨ２ＰＯ４３ｇ。
ＮａＣ１０，５ｇ、およびＮＨ４Ｇ７１ ｇ、 この
培地に以下の物質を補充した； Ｉ ＭＭｇ ５０４４
００μｌ。
培地に以下の物質を補充した； Ｉ ＭＭｇ ５０４４
００μｌ。
ＩＭＣａＣｊ２４０１１１． ２０％カザミノ酸１２．
５−１４０％グルコース１２．５ｄ、および１０η／−
アンピシリン。
５−１４０％グルコース１２．５ｄ、および１０η／−
アンピシリン。
Ｂ、細胞エキス（抽出物）の調製
トリプトファンの非存在下において、培養物を様々な時
間、増殖させた。次いで、各培養物から１−をとり、５
５ Ｑ ｎｍにおける光学的密度を測定し、遠心して細
胞を収獲した。
間、増殖させた。次いで、各培養物から１−をとり、５
５ Ｑ ｎｍにおける光学的密度を測定し、遠心して細
胞を収獲した。
得られた細胞ベレットを、細胞収穫前（遠心前）と同様
に測定したとき、光学的密度が２０吸収曜位／−を示す
様な懸濁液を得るのに充分な量の充填（ｌｏａｄｉｎｇ
）バッファー（０，１２５Ｍ）リス−ＨＣｌ％ ｐＨ
６，８，２％ＳＤＳ、３３％グリセリン、ｏ、ｏｏｓ％
ブロムフェノールブルー、および６Ｍ尿素）に懸濁した
。試料を５−１０分間沸騰させた後、各試料７μｌづつ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＣ，
Ｅ）に充填し、次いで、ブロモフェノールブルーがゲル
の下端に達するまで、〜５ＱｍＡの電流により、電気泳
動させたう このゲルを、以下の組成からなるフェアーバンクの染料
Ａ （Ｆ＠１ｒｂａｎｋ’ｓ Ａ ｓｔ＠ｉｎ ）によ
り、−夜、染色した：クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
）ブリリアンドブＩレー０．５ｇ、インプロパツール
２５〇−１氷酢酸１００−１および水６５０−６次いで
、ゲルを以下の組成からなるフェアーバンクの染料Ｂで
３−４時間染色した：クーマシー・ブリリアントブルー
０．０５ｇインプロパツール１００−１氷酢酸１００−
および水８００−０次いで１０％酢酸中でゲルの過剰の
染色を脱色し、写真撮影した。。
に測定したとき、光学的密度が２０吸収曜位／−を示す
様な懸濁液を得るのに充分な量の充填（ｌｏａｄｉｎｇ
）バッファー（０，１２５Ｍ）リス−ＨＣｌ％ ｐＨ
６，８，２％ＳＤＳ、３３％グリセリン、ｏ、ｏｏｓ％
ブロムフェノールブルー、および６Ｍ尿素）に懸濁した
。試料を５−１０分間沸騰させた後、各試料７μｌづつ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＣ，
Ｅ）に充填し、次いで、ブロモフェノールブルーがゲル
の下端に達するまで、〜５ＱｍＡの電流により、電気泳
動させたう このゲルを、以下の組成からなるフェアーバンクの染料
Ａ （Ｆ＠１ｒｂａｎｋ’ｓ Ａ ｓｔ＠ｉｎ ）によ
り、−夜、染色した：クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
）ブリリアンドブＩレー０．５ｇ、インプロパツール
２５〇−１氷酢酸１００−１および水６５０−６次いで
、ゲルを以下の組成からなるフェアーバンクの染料Ｂで
３−４時間染色した：クーマシー・ブリリアントブルー
０．０５ｇインプロパツール１００−１氷酢酸１００−
および水８００−０次いで１０％酢酸中でゲルの過剰の
染色を脱色し、写真撮影した。。
細胞を収獲する前のｓ ｓ ｏ ｎｍにおける光学的密
度を表■に示す。染色したゲルの写真像を添付の第８図
に示す。
度を表■に示す。染色したゲルの写真像を添付の第８図
に示す。
表 ■
ＲＶ３０８／ＰＩＣＦ２０１ １ ０．６５
４．５ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０２ ２ ０．４
８ ４．５ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０３ ３ ０．５１
６．０ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０１ ４ ２．９
８．０ＲＶ３０ａ／ｐＩＧＦ２０２ ５ ２．
３ ８．０ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０３ ６
０．８０ ８．０ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０１ ７ ０
．６７ ４．５ＭＭ２９４／ＰＩＣＦ２０２ ８
０．４６ ４．５閘２９４／ｐｌＣＦ２０３
９ ０．２７ ６．０ＭＭ２９４／ｐ
ＩＧＦ２０１ １０ ２．４ ８．０■句
９４／ｐｌＧＦ２０２ １１ １．９ ８
．０ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０３ １２ ０．６
８．０レーン１３（第８図）の試料にはバイ
オ・ラット社（Ｂｉｏ −Ｒａｄ、 ３２ ｎｄおよび
グリッツイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ ）、リッチモンド（Ｒ
ｉ ｃｈｍｏｎｄ ） 、ＣＡ９４８０４）供給の低分
子量タンパク質標準品（Ｌｏｗ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ
Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｔａｎｄａｒｄ
ｓ）が含有されている。
４．５ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０２ ２ ０．４
８ ４．５ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０３ ３ ０．５１
６．０ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０１ ４ ２．９
８．０ＲＶ３０ａ／ｐＩＧＦ２０２ ５ ２．
３ ８．０ＲＶ３０ａ／ＰＩＣＦ２０３ ６
０．８０ ８．０ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０１ ７ ０
．６７ ４．５ＭＭ２９４／ＰＩＣＦ２０２ ８
０．４６ ４．５閘２９４／ｐｌＣＦ２０３
９ ０．２７ ６．０ＭＭ２９４／ｐ
ＩＧＦ２０１ １０ ２．４ ８．０■句
９４／ｐｌＧＦ２０２ １１ １．９ ８
．０ＭＭ２９４／ｐＩＧＦ２０３ １２ ０．６
８．０レーン１３（第８図）の試料にはバイ
オ・ラット社（Ｂｉｏ −Ｒａｄ、 ３２ ｎｄおよび
グリッツイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ ）、リッチモンド（Ｒ
ｉ ｃｈｍｏｎｄ ） 、ＣＡ９４８０４）供給の低分
子量タンパク質標準品（Ｌｏｗ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ
Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｔａｎｄａｒｄ
ｓ）が含有されている。
表ＩＩＩζ示したデータから、プラスミドｐＩＧＦ２０
３を含有する細胞は、プラスミドｐｌＧＦ２０１ また
はｐＩＧＦ２０２ を含有する細胞のいずれよりも増
殖が遅いことが分る。即ち、短縮されたｔｒｐＬＥ配列
の存在および発現による大腸ｍＫ１２ＭＭ２９４ およ
び大腸１！１Ｋ１２ ＲＶ３０８１７）増殖遅延効果は
、未改良のｔｒｐＬＥ の存在および発現によるそれ
よりも軽度である。第８図の７〜１２レーンは、大腸菌
に１２ＭＭ２９４内においで、未改良ｔｒｐＬＥよりも
ｔｒｐＬＥｌおよびｔ ｒｐ ＬＥ２の方がＩＧＦｌ［
を多量に産生させ、蓄積さ、貨ることを示している。発
酵の分野では、細胞の増殖速度、生産物の合成および生
産物の蓄積の全てが重要な因子である。上記の事実は、
ｔｒｐＬＥｌ−ＩＧＦｌｉまたはｔｒｐＬＥ２−ＩＧＦ
ｌ［融合ポリペプチドを発現する細胞の増殖速度が、未
改良ｔｒｐＬＥ−ＩＧＦ］ｉ融合ポリペプチドを発現す
る細胞のそれよりも早いことを証明するものであり、本
発明に係る誘導体が改良された性質を有することを支持
している。その上、融合遺伝子産物を生産するために大
腸菌に１２ＭＭ２９４ に対してｔｒｐＬＥｌまたは
ｔｒｐＬＥ２を用いた場合、未改良ｔｒｐＬＥを用いた
場合よりも、所望の生産物が全細胞タンパク質中１こ占
める割合（％）が大きくなるのである。
３を含有する細胞は、プラスミドｐｌＧＦ２０１ また
はｐＩＧＦ２０２ を含有する細胞のいずれよりも増
殖が遅いことが分る。即ち、短縮されたｔｒｐＬＥ配列
の存在および発現による大腸ｍＫ１２ＭＭ２９４ およ
び大腸１！１Ｋ１２ ＲＶ３０８１７）増殖遅延効果は
、未改良のｔｒｐＬＥ の存在および発現によるそれ
よりも軽度である。第８図の７〜１２レーンは、大腸菌
に１２ＭＭ２９４内においで、未改良ｔｒｐＬＥよりも
ｔｒｐＬＥｌおよびｔ ｒｐ ＬＥ２の方がＩＧＦｌ［
を多量に産生させ、蓄積さ、貨ることを示している。発
酵の分野では、細胞の増殖速度、生産物の合成および生
産物の蓄積の全てが重要な因子である。上記の事実は、
ｔｒｐＬＥｌ−ＩＧＦｌｉまたはｔｒｐＬＥ２−ＩＧＦ
ｌ［融合ポリペプチドを発現する細胞の増殖速度が、未
改良ｔｒｐＬＥ−ＩＧＦ］ｉ融合ポリペプチドを発現す
る細胞のそれよりも早いことを証明するものであり、本
発明に係る誘導体が改良された性質を有することを支持
している。その上、融合遺伝子産物を生産するために大
腸菌に１２ＭＭ２９４ に対してｔｒｐＬＥｌまたは
ｔｒｐＬＥ２を用いた場合、未改良ｔｒｐＬＥを用いた
場合よりも、所望の生産物が全細胞タンパク質中１こ占
める割合（％）が大きくなるのである。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＣＺ２０の制限サイトおよび機能
地図の模式図、第２図はプラスミドＰＬＥＢＧＨ２の制
限サイトおよび機能地図の模式図、第３図はプラスミド
ｐＩＧＦ２０１の制限サイトおよび機能地図の模式図、
第４図はプラスミドＰＩＣＦ２０２の制限サイトおよび
機能地図の模式図、第５図はプラスミドｐｌＡＬＥ１の
制限サイトおよび機能地図の模式図、第６図はプラスミ
ドｐｌＢＬＥ２の制限サイトおよび機能地図の模式図、
第７図はプラスミドｐＰＩＬＥｌの制限サイトおよび機
能地図の模式図、第８図はＩＣ，ＦＢＩ融合産物を含有
している細胞タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気
泳動による解析像の写真の模写図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カン／ずニー 代 理 人 弁理士 青白 葆（外１名）ＦＩＧ、ｌ Ｆ１ａ１１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｖｕｌｌ ＦＩＧ、４ ｖｕｌｌ ＦＩＧ、５ Ｐｖｕｌｌ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ Ｐｖｕｌｌ １ ■
地図の模式図、第２図はプラスミドＰＬＥＢＧＨ２の制
限サイトおよび機能地図の模式図、第３図はプラスミド
ｐＩＧＦ２０１の制限サイトおよび機能地図の模式図、
第４図はプラスミドＰＩＣＦ２０２の制限サイトおよび
機能地図の模式図、第５図はプラスミドｐｌＡＬＥ１の
制限サイトおよび機能地図の模式図、第６図はプラスミ
ドｐｌＢＬＥ２の制限サイトおよび機能地図の模式図、
第７図はプラスミドｐＰＩＬＥｌの制限サイトおよび機
能地図の模式図、第８図はＩＣ，ＦＢＩ融合産物を含有
している細胞タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気
泳動による解析像の写真の模写図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カン／ずニー 代 理 人 弁理士 青白 葆（外１名）ＦＩＧ、ｌ Ｆ１ａ１１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｖｕｌｌ ＦＩＧ、４ ｖｕｌｌ ＦＩＧ、５ Ｐｖｕｌｌ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ Ｐｖｕｌｌ １ ■
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、プロモーター−オペレーター／リーダー／トリプト
フアンＥ遺伝子からなる大腸菌のトリプトフアンオペロ
ンから、リーダーペプチドのカルボキシ末端をコードし
ている配列、リーダー配列のアテニユエイター領域、並
びにｔｒｐＥ遺伝子の近接領域を除去したトリプトフア
ンオペロンであつて、約４２８〜約５４８デオキシリボ
ヌクレオチド対の範囲内に含まれるリーダー／トリプト
フアンＥ遺伝子配列を含有することを特徴とする短縮さ
れた改良トリプトフアンオペロン誘導体。 ２、リーダー／トリプトフアンＥ遺伝子配列が約４２８
デオキシリボヌクレオチド対の範囲内に含まれる第１項
記載の誘導体。 ３、該遺伝子がｔｒｐＬＥ１である第２項記載の誘導体
。 ４、リーダー／トリプトフアンＥ遺伝子配列が約５４８
デオキシリボヌクレオチド対の範囲内に含まれる第１項
記載の誘導体。 ５、該遺伝子配列がｔｒｐＬＥ２である第３項記載の誘
導体。 ６、組換えＤＮＡ発現ベクターであつて、 ａ）トリプトフアンプロモーター−オペレーターおよび
約４２８〜約５４８ヌクレオチドの範囲内に含まれるリ
ーダー／トリプトフアンＥ遺伝子；ｂ）発現のため、ａ
）の下流であつて、翻訳解読相内に位置した、ヘテロロ
ーガスポリペプチドをコードしている構造遺伝子；およ
び、 ｃ）該ベクターで形質転換された微生物内で該ベクター
を複製させ、さらに選択するためのレプリコンおよび選
択マーカー を含有するベクター。 ７、プラスミドである第６項記載のベクター。 ８、レプリコンおよび選択マーカーが、ベクターを大腸
菌内で複製させ、選択することができるものである、第
６項または第７項記載のベクター。 ９、選択マーカーが抗生物質耐性を付与するものである
、第６、７または８項記載のベクター。 １０、レプリコンおよび耐性付与選択マーカーがプラス
ミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２４または
ｐＢＲ４０２のいずれかに由来するものである第９項記
載のベクター。 １１、構造遺伝子が、インシユリン様成長因子 I 、イ
ンシユリン様成長因子II、ウシ成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン、ヒトプレ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、
哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒトインシユ
リンＡ鎖、ヒトインシユリンＢ鎖、ヒトプロインシユリ
ン、ヒトプレプロインシユリン、インターフエロン、ウ
ロキナーゼ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、成
長ホルモン放出因子またはインターロイキンIIをコード
している第６〜１０項のいずれかに記載のベクター。 １２、構造遺伝子が、発現のために、約４２８〜約５４
８ヌクレオチド対のリーダー／トリプトフアンＥ遺伝子
配列のすぐ下流に隣接し、かつその翻訳解読相内に位置
していることを特徴とする第１１項記載のベクター。 １３、構造遺伝子が、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、ＣはデオキシシチジルそしてＴはチミジルを表す） で示されるヌクレオチド配列を有するインシユリン様成
長因子II構造遺伝子である第１１項または１２項記載の
ベクター。 １４、リーダー／トリプトフアンＥ遺伝子配列がｔｒｐ
ＬＥ１である第１１項または１２項記載のベクター。 １５、リーダー／トリプトフアンＥ遺伝子配列がｔｒｐ
ＬＥ２である第１１項または１２項記載のベクター。 １６、プラスミドＬＥＢＧＨ１である第１４項記載のベ
クター。 １７、プラスミドＬＥＢＧＨ２である第１５項記載のベ
クター。 １８、プラスミドｐＣＺ２０、ｐＩＡＬＥ１、ｐＩＢＬ
Ｅ１またはｐＰＩＬＥ１である第１４項記載のベクター
。 １９、プラスミドｐＩＡＬＥ２、ｐＩＢＬＥ２またはｐ
ＰＩＬＥ２である第１５項記載のベクター。 ２０、プラスミドｐＩＧＦ２０１である第１３項または
第１４項記載のベクター。 ２１、プラスミドｐＩＧＦ２０２である第１３項または
第１５項記載のベクター。 ２２、構造遺伝子が、プラスミドｐＣＺ２０の〜２３０
ｂｐＥｃｏＲ I −ＢａｍＨ I 制限フラグメント中に含
まれているインシユリン様成長因子 I 遺伝子からなる
ことを特徴とする第６〜１２項のいずれかに記載のベク
ター。 ２３、大腸菌Ｒ／Ｒ′（ここに、ＲはＫ１２、Ｋ１２Ｒ
Ｖ３０８、Ｋ１２ＨＢ１０１、Ｋ１２Ｃ６００Ｒｋ−Ｍ
ｋ−、Ｋ１２ＲＲ１、またはＫ１２ＭＭ２９４であり、
Ｒ′は第６項〜２２項のいずれかに記載のベクターを表
す）で示される形質転換された宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US655183 | 1984-09-27 | ||
| US06/655,183 US4738921A (en) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61173780A true JPS61173780A (ja) | 1986-08-05 |
Family
ID=24627868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60216080A Pending JPS61173780A (ja) | 1984-09-27 | 1985-09-27 | 融合遺伝子産物を発現させるための、改良トリプトフアンオペロン誘導体 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4738921A (ja) |
| EP (1) | EP0176341B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61173780A (ja) |
| CA (1) | CA1253092A (ja) |
| DE (1) | DE3580084D1 (ja) |
| DK (1) | DK433885A (ja) |
| IL (1) | IL76476A (ja) |
| MY (1) | MY102555A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0380096A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-04-04 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| JP2008525041A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 可溶性多膜貫通型タンパク質の産生方法 |
Families Citing this family (112)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5691181A (en) * | 1984-08-21 | 1997-11-25 | Celltech Limited | DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue |
| EP0193112A3 (en) * | 1985-02-22 | 1987-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cdna encoding mammalian insulin-like growth factor ii |
| US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
| EP0213472A1 (en) * | 1985-08-12 | 1987-03-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for producing fusion proteins |
| ES2001203A6 (es) * | 1985-08-12 | 1988-05-01 | Syntex Inc | Procedimiento para preparar el polipeptido factor liberador de la hormona del crecimiento bovina |
| EP0212532A1 (en) * | 1985-08-12 | 1987-03-04 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for producing fusion proteins |
| US5496924A (en) * | 1985-11-27 | 1996-03-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion |
| US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| CA1322714C (en) * | 1986-11-14 | 1993-10-05 | Harry N. Antoniades | Wound healing and bone regeneration |
| US5019559A (en) * | 1986-11-14 | 1991-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Wound healing using PDGF and IGF-II |
| US5270180A (en) * | 1986-12-31 | 1993-12-14 | Lucky, Ltd. | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene |
| US5200509A (en) * | 1987-04-06 | 1993-04-06 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |
| US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
| US5256644A (en) * | 1988-05-20 | 1993-10-26 | Institute Of Molecular Biology, Inc. | Wound healing using IGF-II and TGF |
| US4983581A (en) * | 1988-05-20 | 1991-01-08 | Institute Of Molecular Biology, Inc. | Wound healing composition of IGF-I and TGF-β |
| DE3834079A1 (de) * | 1988-10-06 | 1990-04-12 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Wachstumstimulierendes pdgf-bb und dessen verwendung sowie ein verfahren zu seiner herstellung und der des monomeren |
| IL92816A0 (en) * | 1988-12-22 | 1990-09-17 | Biogrowth Inc | Recombinant dna molecules,hosts,processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |
| WO1990010069A1 (en) * | 1989-02-28 | 1990-09-07 | Institut Organicheskogo Sinteza Akademii Nauk Latviiskoi Ssr | RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2 |
| USRE37919E1 (en) | 1989-05-12 | 2002-12-03 | The General Hospital Corporation | Recombinant DNA method for production of parathyroid hormone |
| US5171670A (en) * | 1989-05-12 | 1992-12-15 | The General Hospital Corporation | Recombinant dna method for production of parathyroid hormone |
| GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
| ATE222117T1 (de) * | 1990-05-30 | 2002-08-15 | Harvard College | Kombination aus igf-i und tgf-beta zur knochenregenerierung |
| ATE158816T1 (de) | 1990-11-26 | 1997-10-15 | Genetics Inst | Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung |
| SE9100099D0 (sv) * | 1991-01-11 | 1991-01-11 | Kabi Pharmacia Ab | Use of growth factor |
| US5977070A (en) * | 1992-07-14 | 1999-11-02 | Piazza; Christin Teresa | Pharmaceutical compositions for the nasal delivery of compounds useful for the treatment of osteoporosis |
| US5589452A (en) * | 1992-07-14 | 1996-12-31 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis |
| US5464934A (en) * | 1993-05-14 | 1995-11-07 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Metal chelates as spacer compounds in biologically active peptides |
| US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| US5446024A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-29 | Genentech, Inc. | Purification of insulin-like growth factor |
| US5629167A (en) * | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| WO1996007744A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
| US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
| HUP0001650A3 (en) * | 1996-11-08 | 2001-09-28 | Neose Technologies Inc Horsham | Improved expression vectors |
| NZ335207A (en) * | 1996-11-15 | 2000-09-29 | Genentech Inc | Process to isolate recombinant human neurotrophin using hydrophobic chromatography resin |
| US6265542B1 (en) | 1997-10-24 | 2001-07-24 | Genentech, Inc. | Purification of molecules |
| AU9363798A (en) | 1997-11-06 | 1999-05-31 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
| CA2317815A1 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
| GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
| ES2304065T3 (es) | 1998-05-01 | 2008-09-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenos y composiciones de neisseria meningitidis. |
| NZ581940A (en) | 1999-04-30 | 2011-07-29 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Conserved neisserial antigens |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| RU2281956C2 (ru) | 1999-10-29 | 2006-08-20 | Чирон С.Р.Л. | Антигенные пептиды neisseria |
| DK2289545T3 (en) | 2000-01-17 | 2016-09-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Supplemented OMV vaccine against meningococcus |
| FR2810675B1 (fr) * | 2000-06-22 | 2002-09-27 | Pf Medicament | Construction modifiee en aval du codon d'initiation pour la surexpression de proteines recombinantes |
| HUP0303854A2 (hu) * | 2000-09-08 | 2004-03-01 | Gryhon Therapeutics, Inc. | Szintetikus erythropoiesis-stimuláló proteinek |
| EP2189473A3 (en) | 2000-10-27 | 2010-08-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B |
| DE60138127D1 (de) | 2000-11-03 | 2009-05-07 | Genentech Inc | Stoffwechseländerungen in gärungen zur produktion rekombinanter proteine |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| JP4592284B2 (ja) | 2001-07-27 | 2010-12-01 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 髄膜炎菌付着因子 |
| JP4413617B2 (ja) | 2001-12-12 | 2010-02-10 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対する免疫化 |
| AU2003239863A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Restoragen Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| EP1513945A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Restoragen Inc | PROCESS FOR UNIVERSAL ENZYMATIC PRODUCTION OF BIOACTIVE PEPTIDES |
| WO2003100020A2 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen, Inc. | Methods and constructs for high yield expression of clostripain |
| AU2003231862A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Restoragen, Inc. | Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides |
| DK2279746T3 (da) | 2002-11-15 | 2013-11-25 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Overfladeproteiner i neisseria meningitidis |
| GB0227346D0 (en) | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| EP2392582A3 (en) | 2003-04-25 | 2012-03-07 | North Carolina State University | Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding cell surface protein homologues and uses therefore |
| WO2005001057A2 (en) | 2003-06-23 | 2005-01-06 | North Carolina State University | Lactobacillus acidophilus nucleic acids encoding fructo-oligosaccharide utilization compounds and uses thereof |
| ME01366B (me) * | 2003-11-21 | 2013-12-20 | Nps Allelix Corp | POSTUPAK ZA PROIZVODNJU PEPTIDA 2 NALIK NA GLUKAGON l NJIHOVIH ANALOGA |
| JP2007519422A (ja) | 2004-02-02 | 2007-07-19 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用 |
| US7459289B2 (en) | 2004-03-08 | 2008-12-02 | North Carolina State University | Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding carbohydrate utilization-related proteins and uses therefor |
| MXPA06014684A (es) * | 2004-06-18 | 2007-02-12 | Ambrx Inc | Novedosos polipeptidos de enlace antigeno y sus usos. |
| AU2005327906B2 (en) * | 2004-07-21 | 2010-05-13 | Ambrx, Inc. | Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids |
| SG161210A1 (en) | 2004-12-22 | 2010-05-27 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| WO2006069246A2 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| AU2005322019B2 (en) * | 2004-12-22 | 2010-08-26 | Ambrx, Inc. | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
| ATE541934T1 (de) * | 2004-12-22 | 2012-02-15 | Ambrx Inc | Zusammensetzungen von aminoacyl-trna-synthetase und verwendungen davon |
| BRPI0519430A2 (pt) | 2004-12-22 | 2009-02-10 | Ambrx Inc | hormânio do crescimento humano modificado |
| EP1871868A2 (en) | 2005-04-15 | 2008-01-02 | North Carolina State University | Methods and compositions to modulate adhesion and stress tolerance in bacteria |
| KR20080026135A (ko) * | 2005-06-03 | 2008-03-24 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 개선된 인간 인터페론 분자 및 이의 용도 |
| MX2008002149A (es) * | 2005-08-18 | 2008-04-22 | Ambrx Inc | Composiciones de arnt y sus usos. |
| PT1954710E (pt) * | 2005-11-08 | 2011-06-07 | Ambrx Inc | Aceleradores para a modificação de aminoácidos nãonaturais e polipeptídeos de aminoácidos não-naturais |
| EP2339014B1 (en) * | 2005-11-16 | 2015-05-27 | Ambrx, Inc. | Methods and compositions comprising non-natural amino acids |
| GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
| KR101423898B1 (ko) * | 2005-12-14 | 2014-07-28 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도 |
| PT2054431E (pt) | 2006-06-09 | 2011-11-03 | Novartis Ag | Confórmeros de adesinas bacterianas |
| WO2008005533A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Aaron Thomas Tabor | Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance |
| EP2069396B1 (en) | 2006-09-08 | 2015-10-21 | Ambrx, Inc. | Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses |
| US8420792B2 (en) * | 2006-09-08 | 2013-04-16 | Ambrx, Inc. | Suppressor tRNA transcription in vertebrate cells |
| NZ574721A (en) * | 2006-09-08 | 2012-02-24 | Ambrx Inc | Hybrid suppressor trna for vertebrate cells |
| BRPI0809583B1 (pt) * | 2007-03-30 | 2022-02-22 | Ambrx, Inc | Polipeptídeo fgf-21 modificado, composição compreendendo o mesmo, método para produzir o referido polipetídeo fgf-21 e célula compreendendo um polinucleotídeo |
| CA2685596A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| NZ603812A (en) * | 2007-11-20 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their uses |
| SG188143A1 (en) | 2008-02-08 | 2013-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| CA2716212A1 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
| NZ591235A (en) * | 2008-07-23 | 2012-07-27 | Ambrx Inc | Modified bovine g-csf polypeptides comprising non natural amino acid and their uses treating infections such as mastitis |
| TR201802361T4 (tr) | 2008-09-26 | 2018-03-21 | Ambrx Inc | Doğal olmayan amino asit replikasyonuna bağımlı mikroorganizmalar ve aşılar. |
| PL2342223T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania |
| US9132202B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-09-15 | Aaron T. Tabor | Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance |
| JP2013502918A (ja) | 2009-08-27 | 2013-01-31 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎菌ｆＨＢＰ配列を含むハイブリッドポリペプチド |
| EP2493499A1 (en) | 2009-10-27 | 2012-09-05 | Novartis AG | Modified meningococcal fhbp polypeptides |
| CN104017063A (zh) | 2009-12-21 | 2014-09-03 | Ambrx公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
| NZ600361A (en) | 2009-12-21 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses |
| WO2011146715A1 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | North Carolina State University | Compositions and methods for the delivery of therapeutic peptides |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| MY162837A (en) | 2010-08-17 | 2017-07-31 | Ambrx Inc | Modified relaxin polypeptides and their uses |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| WO2015059690A1 (en) | 2013-10-24 | 2015-04-30 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Polynucleotides encoding brex system polypeptides and methods of using s ame |
| UY36370A (es) | 2014-10-24 | 2016-04-29 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware | Polipéptidos fgf-21 modificados y sus usos |
| US10590426B2 (en) | 2016-08-22 | 2020-03-17 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Genetic control of cell size |
| IL250479A0 (en) | 2017-02-06 | 2017-03-30 | Sorek Rotem | Genetically engineered cells expressing a disarm system that confers resistance to phages and methods for their production |
| ES2963839T3 (es) | 2017-02-08 | 2024-04-02 | Bristol Myers Squibb Co | Polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un potenciador farmacocinético y usos de los mismos |
| IL258467A (en) | 2018-03-29 | 2018-07-04 | Ilana Kolodkin Gal | Methods of disrupting a biofilm and/or preventing formation of same |
| HRP20240016T1 (hr) | 2018-09-11 | 2024-03-29 | Ambrx, Inc. | Konjugati polipeptida interleukina-2 i njihove uporabe |
| EP3946611A2 (en) | 2019-03-31 | 2022-02-09 | Yeda Research and Development Co. Ltd | Anti-viral and anti-tumoral compounds |
| WO2021183832A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Ambrx, Inc. | Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof |
| IL288680A (en) | 2021-12-05 | 2023-07-01 | Yeda Res & Dev | Genetically modified phages and their use |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0036776A2 (en) * | 1980-03-24 | 1981-09-30 | Genentech, Inc. | A method of creating an expression plasmid |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3486491T2 (de) * | 1983-04-25 | 2003-01-16 | Chiron Corp | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| SE8303626D0 (sv) * | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Kabigen Ab | A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
-
1984
- 1984-09-27 US US06/655,183 patent/US4738921A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-09-23 CA CA000491359A patent/CA1253092A/en not_active Expired
- 1985-09-23 IL IL76476A patent/IL76476A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-09-24 DE DE8585306764T patent/DE3580084D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-24 EP EP85306764A patent/EP0176341B1/en not_active Expired
- 1985-09-25 DK DK433885A patent/DK433885A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-09-27 JP JP60216080A patent/JPS61173780A/ja active Pending
-
1987
- 1987-09-23 MY MYPI87001896A patent/MY102555A/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0036776A2 (en) * | 1980-03-24 | 1981-09-30 | Genentech, Inc. | A method of creating an expression plasmid |
| EP0154133A2 (en) * | 1980-03-24 | 1985-09-11 | Genentech, Inc. | Plasmidic expression vehicles, and method of producing a polypeptide therewith |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0380096A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-04-04 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| JP2008525041A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 可溶性多膜貫通型タンパク質の産生方法 |
| US8323902B2 (en) | 2004-12-22 | 2012-12-04 | Genentech, Inc. | Methods for producing soluble membrane-spanning proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK433885D0 (da) | 1985-09-25 |
| US4738921A (en) | 1988-04-19 |
| EP0176341B1 (en) | 1990-10-10 |
| EP0176341A1 (en) | 1986-04-02 |
| CA1253092A (en) | 1989-04-25 |
| IL76476A (en) | 1991-07-18 |
| DE3580084D1 (de) | 1990-11-15 |
| IL76476A0 (en) | 1986-01-31 |
| DK433885A (da) | 1986-03-28 |
| MY102555A (en) | 1992-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS61173780A (ja) | 融合遺伝子産物を発現させるための、改良トリプトフアンオペロン誘導体 | |
| JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ | |
| JP2766781B2 (ja) | ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 | |
| JP3043803B2 (ja) | 融合タンパク質、その調製及び用途 | |
| EP0067540B1 (en) | Microbial gene promoter/operators | |
| JP2620479B2 (ja) | 豚成長ホルモンのポリペプチドおよびその製造方法 | |
| DE2848053A1 (de) | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung | |
| CS238645B2 (en) | Design method of plasmide capable to separate heterological gen | |
| JPH0673096A (ja) | 成長ホルモン前駆体 | |
| EP0545999B1 (en) | Process for the preparation of biologically active IGF-1 using IGF-1 having an amino-terminal extension | |
| US4795706A (en) | Novel expression control sequences | |
| JPH03503596A (ja) | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 | |
| US5254463A (en) | Method for expression of bovine growth hormone | |
| EP0159123A2 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
| US5378613A (en) | Method for increased expression of low molecular weight recombinant polypeptides | |
| EP0040466B1 (en) | Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products | |
| JPS61274686A (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチドをコ−ドする遺伝子 | |
| Mayne et al. | Direct expression of human growth in Escherichia coli with the lipoprotein promoter | |
| EP0154539A2 (en) | Recombinant DNA expression vectors and method for gene expression | |
| US5576190A (en) | Bacteriophage Lambda pL promoters | |
| CA1307482C (en) | Vectors and expression sequences for production of polypeptides | |
| RU1838412C (ru) | Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста | |
| US5395761A (en) | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith | |
| EP0471514A2 (en) | Improved bacteriophage lambda pL promoters | |
| EP0547873B1 (en) | A novel translational activating sequence |