KR101423898B1 - 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도 - Google Patents

비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도 Download PDF

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Abstract

비-천연 아미노산, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 및 이러한 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 개시된다. 비-천연 아미노산은 그 자체로 또는 폴리펩티드의 일부로서 매우 광범위한 가능한 작용기를 포함할 수 있지만, 전형적으로 하나 이상의 방향족 아민 기를 갖는다. 번역 후 추가로 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 이러한 변형을 수행하는 방법, 및 이러한 폴리펩티드의 정제 방법도 본원에 개시된다. 전형적으로, 상기 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 알킬화 아민 기를 포함한다. 또한, 치료 용도, 진단 용도 및 다른 생명공학적 용도를 포함하는, 상기 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 사용 방법도 개시된다.

Description

비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도{COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES}
관련 출원
본원은 2005년 12월 14일 출원된 미국 가출원 제60/743,041호(발명의 명칭: "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides") 및 2005년 12월 14일 출원된 미국 가출원 제60/743,040호(발명의 명칭: "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides")에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가출원들은 본원에 참고로 도입된다.
기술 분야
비-천연 아미노산 물질을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 기재된다.
비-유전적으로 코딩된 아미노산(즉, "비-천연 아미노산")을 단백질 내로 도입하는 능력은 천연-발생 작용기 예컨대, 라이신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 설프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 대한 가치있는 대체물을 제공할 수 있는 화학적 작용기의 도입을 가능하게 한다. 일부 화학적 작용기는 유전적으로 코딩된 20종의 공통된 아미노산에서 발견된 작용기에 대해 불활성을 나타내지만 명백히 효율적으로 반응하여 비-천연 아미노산에 도입될 수 있는 작용기와 안정한 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다.
20종의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 작용기들 모두에 대해 화학적 불활성을 나타내며 특정 작용기를 포함하는 물질과 효율적 및 선별적으로 반응하여 안정한 공유결합을 형성하는 데 사용될 수 있는, 단백질 내에서 발견되지 않는 화학적 작용기를 선별적으로 도입하는 방법이 현재 이용가능하다.
비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법, 조성물, 기법 및 수단이 본 명세서에 기재되어 있다. 한 측면에서, 비-천연 아미노산 및/또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도화하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단이 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 방법, 조성물, 기법 및 수단은 화학적 유도화를 수반하고, 다른 실시양태에서는 생물학적 유도화를 수반하고, 다른 실시양태에서는, 물리적 유도화를 수반하고, 다른 실시양태에서는, 유도화의 조합을 수반한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 위치선별적 유도화이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 비-천연 아미노산 함유 시약과 유도화제 둘 다에 있어서 화학양론적, 거의 화학양론적 또는 화학양론적-유사 유도화이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 원하는 기를 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상에 화학양론적으로, 거의 화학양론적으로 또는 화학양론적-유사 방식으로 도입할 수 있는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 원하는 기를 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상에 화학양론적으로, 거의 화학양론적으로 또는 화학양론적-유사 방식으로 도입할 수 있는 수단, 반응 혼합물 및 합성 조건이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 주위 온도에서 신속히 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 수용액 중에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 약 4 내지 약 10의 pH에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 약 4 내지 약 7의 pH에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 약 4 내지 약 5의 pH에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 약 5의 pH에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이러한 유도화는 약 4의 pH에서 일어난다.
한 측면에서, 방향족 아민 기의 반응성에 기초한 펩티드 및 단백질의 화학적 유도화를 위한 비-천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 전술한 비-천연 아미노산 중 하나 이상이 폴리펩티드 내로 도입된다. 즉, 이러한 실시양태는 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 그들 자신과 유도화 분자의 반응이 아민 연결을 발생시키도록 그들의 측쇄 상에 작용기를 보유한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 방향족 아민 측쇄를 가진 아미노산으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 차폐된(masked) 방향족 아민 기를 포함하는 차폐된 측쇄를 포함한다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 방향족 아민 측쇄를 포함하며, 이때 방향족 아민은 아릴 아민 또는 헤테로아릴 아민으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 구조 면에서 천연 아미노산과 유사하나 방향족 아민 기를 함유한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 페닐알라닌 또는 티로신(방향족 아미노산)과 유사하다. 한 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 천연 아미노산의 성질과 상이한 성질을 가진다. 한 실시양태에서, 이러한 상이한 성질은 측쇄의 화학적 반응성이고, 추가 실시양태에서, 이 상이한 화학적 반응성은 한 폴리펩티드의 단위체(unit)로 존재하는 동안 반응이 비-천연 아미노산의 측쇄에서 일어나게 하지만, 동일한 폴리펩티드 내의 천연-발생 아미노산 단위체의 측쇄에서는 상기 반응이 일어나지 않는다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 천연-발생 아미노산의 측쇄에 대한 화학적 오르토고날성(orthogonal)을 가진다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 친핵체-함유 부분(moiety)을 포함하고, 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 친핵체-함유 부분에서 아민 유도화 단백질을 발생시키는 반응이 일어날 수 있다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 친전자체-함유 부분을 포함하고, 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체-함유 부분에서 아민 유도화 단백질을 발생시키는 친핵성 공격 반응이 일어날 수 있다. 본 단락에서 전술한 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 별개의 분자로 존재할 수 있거나 임의의 길이의 폴리펩티드 내로 도입될 수 있고, 폴리펩티드 내로 도입되는 경우, 폴리펩티드는 천연-발생 또는 비-천연 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 아민 연결에 기초한 유도화 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 카르보닐-치환 분자 예컨대, 알데히드 및 케톤이 제공된다. 추가 실시양태에서, 유도화 분자와 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 아민 연결의 형성을 통해 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도화하는 데 사용되는 알데히드-치환 분자가 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-치환 분자는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제(photocrosslinker); 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머(dendrimer); 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된(photocaged) 부분; 화학선 방사 여기 부분(actinic radiation excitable moiety); 리간드; 광이성질체화성(photoisomerizable) 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성(chemically cleavable) 기; 광절단성(photocleavable) 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성(phosphorescent) 기; 화학발광성 기; 전자 밀집(electron dense) 기; 자성(magnetic) 기; 인터칼레이팅(intercalating) 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들)(quantum dot(s)); 나노트랜스미터(nanotransmitter); 래디오트랜스미터(radiotransmitter); 항체효소(abzyme); 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸(aglycan); 알레르간(allergan); 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머(aptamer); 가이드(guide) RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프(mimotope); 수용체; 리버스 미셀(reverse micelle); 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된 기를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-치환 분자는 알데히드-치환 글리콜(PEG) 분자이다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 알데히드-치환 분자와 선별적으로 반응하게 하는 천연-발생 아미노산의 측쇄에 대한 화학적 오르토고날성을 가진다. 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 알데히드-함유 분자와 선별적으로 반응하는 방향족 아민-함유 부분을 포함하고; 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 방향족 아민-함유 부분에서 알킬화 아민-유도화 단백질을 발생시키는 반응이 일어날 수 있다. 본 단락에 기재된 실시양태와 관련된 추가 측면에서, 유도화 분자와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로부터 발생되는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 추가 실시양태는 기존의 5개 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.
또 다른 측면에서, 아민 연결에 기초한 유도화 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 방향족 아민-치환 분자 예컨대, 아릴 아민 및 헤테로아릴 아민이 제공된다. 추가 실시양태에서, 유도화 분자와 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 아민 연결의 형성을 통해 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도화하는 데 사용되는 방향족 아민-치환 분자가 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 방향족 아민-치환 분자는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된 기를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 방향족 아민-치환 분자는 방향족 아민-치환 글리콜(PEG) 분자이다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 방향족 아민-치환 분자와 선별적으로 반응하게 하는 천연-발생 아미노산의 측쇄에 대한 화학적 오르토고날성을 가진다. 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 방향족 아민-함유 분자와 선별적으로 반응하는 알데히드-함유 부분을 포함하고; 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 알데히드-함유 부분에서 알킬화 아민-유도화 단백질을 발생시키는 반응이 일어날 수 있다. 본 단락에 기재된 실시양태와 관련된 추가 측면에서, 유도화 분자와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로부터 발생된 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 추가 실시양태는 기존의 5개 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.
또 다른 측면에서, 아민 연결에 기초한 유도화 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 발생을 위한 일작용성, 이작용성 및 다작용성 링커가 제공된다. 한 측면에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분자에 연결시키는 데 사용될 수 있는 (이작용성 및 다작용성) 분자 링커가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 아릴 아민 또는 헤테로아릴 아민 측쇄를 포함한다. 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 실시양태에서, 분자 링커는 그의 말단 중 한 말단에서 알데히드 기를 함유한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-치환 링커 분자는 알데히드-치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 추가 실시양태에서, "다른 분자"라는 표현은 예를 들어, 단백질, 다른 중합체 및 소분자를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-함유 분자 링커는 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응 시 생성물이 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 단독-다량체가 되도록 모든 말단 상에서 동일한 또는 동등한 기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 단독-다량체는 단독-이량체이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 분자 링커는 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응 시 생성물이 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이종-다량체가 되도록 모든 말단 상에 하나 이상의 알데히드 기 및 상이한 기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 이종-다량체는 이종-이량체이다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 알데히드-치환 링커 분자와 선별적으로 반응하게 하는 천연-발생 아미노산의 측쇄에 대한 화학적 오르토고날성을 가진다. 본 단락에 기재된 실시양태와 관련된 추가 측면에서, 링커 분자와 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로부터 발생되는 연결된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 추가 실시양태는 이미 연결된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형체를 포함한다.
한 측면에서, 방향족 아민 및 알데히드 반응물과 알킬화 아민-유도화 단백질의 반응을 통해 단백질을 유도화하는 방법이 제공된다. 본 측면은 알킬화 아민-유도화 단백질 부가물을 발생시키기 위한 방향족 아민-함유 반응물 및 알데히드-함유 반응물의 환원성 알킬화에 기초한 단백질의 유도화 방법을 포함한다. 추가 또는 다른 실시양태에서, 방향족 아민-함유 단백질을 알데히드-작용화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 유도화하는 방법이 제공된다. 추가 또는 다른 측면에서, 알데히드-치환 분자는 단백질, 다른 중합체(비-분지형 중합체 및 분지형 중합체) 및 소분자를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 방향족 아민-치환 단백질의 유도화를 위한 알데히드-치환 분자의 화학적 합성 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 알데히드-치환 분자는 펩티드, 다른 중합체(비-분지형 중합체 및 분지형 중합체) 및 소분자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 유도화에 적합한 알데히드-치환 분자의 제조 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않는 비-천연 아미노산은 단백질의 생체내 번역 도중에 부위 특이적으로 도입된다. 추가 또는 대안적 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않는 비-천연 아미노산은 리보좀 번역에 의해 부위 특이적으로 도입된다. 추가 또는 대안적 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않는 비-천연 아미노산은 시험관 내 번역 도중에 부위 특이적으로 도입된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-치환 분자는 부위 특이적 방식으로 알킬화 아민-유도화 폴리펩티드를 형성하기 위한 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화를 통해 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산의 부위 특이적 유도화를 허용한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-치환 분자의 제조 방법은 부위 특이적으로 유도화된 매우 다양한 폴리펩티드에의 접근을 제공한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알데히드-작용화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 합성하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 알데히드-함유 이작용성 링커를 사용하는 방향족 아민-치환 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 유도화 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 아민 연결을 발생시키기 위한 환원성 알킬화 반응을 통해 알데히드-치환 링커를 방향족 아민-치환 단백질에 부착시키는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 방향족 아민-치환 비-천연 아미노산은 아릴 아민 또는 헤테로아릴 아민-치환 비-천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 알데히드-함유 이작용성 링커를 사용하여 부위 특이적 방식 및/또는 3차원적 구조의 정확한 조절을 통해 유도화한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 (일작용성, 이작용성 및 다작용성) 분자 링커를 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부착시키는 데 사용되는데, 이때 상기 링커 말단 중 하나 이상의 말단은 아민 연결을 통해 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결될 수 있는 알데히드 기를 함유한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 이들 링커는 예를 들어, 단백질, 다른 중합체(분지형 중합체 및 비-분지형 중합체) 및 소분자를 포함하는 다른 분자에 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 연결시키는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 동일하고, 다른 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 아미노산 폴리펩티드에 비해 단백질분해효소 내성, 혈청 반감기, 면역원성 및/또는 발현을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 작용제(agonist), 불완전 작용제, 길항제, 불완전 길항제, 또는 역(inverse) 작용제이다. 일부 실시양태에서, 작용제, 불완전 작용제, 길항제, 불완전 길항제 또는 역 작용제는 수용성 중합체에 연결된 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 연결된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 상응하는 수용체의 이량체화를 방해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 연결된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 결합 파트너, 리간드 또는 수용체와 폴리펩티드의 결합을 조절한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 연결된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 그 폴리펩티드의 하나 이상의 성질 또는 활성을 조절한다.
일부 실시양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버(amber) 코돈, 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈, 독특한(unique) 코돈, 희귀(rare) 코돈, 비-천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드는 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 갖는다: (1) 방향족 아민의 아민 부분이 일차 아민임; (2) 방향족 아민의 아민 부분이 2차 아민임; (3) 방향족 아민의 방향족 부분이 헤테로방향족 부분임; (4) 방향족 아민의 방향족 부분이 아릴 부분임; (5) 방향족 아민이 알데히드 작용화 기와 반응함; (6) 수용성 중합체에 커플링됨; (7) PEG화됨; (8) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 치료 반감기를 가짐; (9) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 혈청 반감기를 가짐; (10) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 순환 시간을 가짐; (11) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 수용성을 가짐; (12) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증강된 생체이용성을 가짐; (13) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 조절된 면역원성을 가짐; (14) 비-천연 방향족 아민 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 조절된 생물학적 활성을 가짐; (15) 약학 조성물의 일부임; (16) 세포 배양물로부터 수득됨; (17) 화학적으로 합성됨; (18) 라이브러리 검색 방법에서 사용됨; (19) 어레이와 함께 사용됨; (20) 단백질 어레이와 함께 사용됨; (21) 유전자 발현 분석을 위해 사용됨; (22) 하나 이상의 물질에 커플링됨; (23) 표지에 커플링됨; (24) 염료에 커플링됨; (25) 중합체에 커플링됨; (26) 세포독성 화합물에 커플링됨; (27) 약물에 커플링됨; (28) 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체에 커플링됨; (29) 항체 또는 항체 단편에 커플링됨; (30) 탄수화물에 커플링됨; (31) 폴리뉴클레오티드에 커플링됨; (32) 안티센스 폴리뉴클레오티드에 커플링됨; (33) 사카라이드에 커플링됨; (34) 형광단에 커플링됨; (35) 화학적 절단성 기에 커플링됨; (36) 광절단성 기에 커플링됨; (37) 에너지 전달제에 커플링됨; (38) 방사성뉴클레오티드에 커플링됨; (39) 번역 후 변형될 수 있음; (40) 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (41) 약 4 내지 약 10의 pH 범위에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (42) 번역 후 환원성 알킬화에 의해 부위 특이적으로 유도화될 수 있음; (43) 실온에서 환원성 알킬화에 의해 신속히 번역 후 변형될 수 있음; (44) 수성 조건에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (45) 화학양론적인 반응 조건을 이용한 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (46) 거의-화학양론적인 반응 조건을 이용한 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (47) 화학양론적-유사 반응 조건을 이용한 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (48) 질환, 장애 또는 증상(condition)을 앓는 포유동물을 치료하는 데 사용됨; (49) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 인간을 치료하는 데 사용됨; (50) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 포유동물을 진단하는 데 사용됨; (51) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 인간을 진단하는 데 사용됨; (52) 지속-방출 조성물의 일부임; (53) 아민 부분이 차폐된 아민 부분의 번역 후 환원에 의해 형성됨; (54) 아민 부분이 이민 부분의 번역 후 환원에 의해 형성됨; (55) 아민 부분이 아지드 부분의 번역 후 환원에 의해 형성됨; (56) 아민 부분이 히드라진 부분의 번역 후 환원에 의해 형성됨; (57) 아민 부분이 니트로 부분의 번역 후 환원에 의해 형성됨; (58) 프로-드러그에 커플링됨; (59) 세포 용해물로부터 수득됨; (60) 리보좀에 의해 번역됨; (61) 약 4 내지 약 7의 pH 범위에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형됨; (62) 약 4 내지 약 5의 pH 범위에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형됨; (63) 약 5의 pH에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형됨; (64) 약 4의 pH에서 환원성 알킬화에 의해 번역 후 변형됨; (65) 환원성 알킬화 반응에서 신속히 반응함; (66) 환원성 알킬화 반응에서 약 10시간 미만의 시간 내에 반응함; (67) 환원성 알킬화 반응에서 약 8시간 미만의 시간 내에 반응함; (68) 환원성 알킬화 반응에서 약 6시간 미만의 시간 내에 반응함; (68) 환원성 알킬화 반응에서 약 4시간 미만의 시간 내에 반응함; (69) 환원성 알킬화 반응에서 약 2시간 미만의 시간 내에 반응함; (70) 환원성 알킬화 반응에서 약 1시간 미만의 시간 내에 반응함; 및 (71) 환원성 알킬화 반응에서 약 30분 미만의 시간 내에 반응함.
다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 2개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 3개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 4개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 방향족 아민 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 5개 이상의 특징을 갖는다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 알데히드-기재(based) 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 알데히드-기재(based) 아미노산 폴리펩티드는 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 갖는다: (1) 보호된 또는 차폐된 알데히드 부분을 함유함; (2) 탈보호된 또는 차폐되지 않은 알데히드 부분을 함유함; (3) 방향족 아민과 반응할 수 있는 탈보호된 또는 차폐되지 않은 알데히드 부분을 함유함; (4) 헤테로방향족 아민과 반응할 수 있는 탈보호된 또는 차폐되지 않은 알데히드 부분을 함유함; (5) 환원성 아민화에 의해 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민과 반응할 수 있는 탈보호된 또는 차폐되지 않은 알데히드 부분을 함유함; (6) 수용성 중합체에 커플링됨; (7) PEG화됨; (8) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 치료 반감기를 가짐; (9) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 혈청 반감기를 가짐; (10) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 순환 시간을 가짐; (11) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 수용성을 가짐; (12) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 증강된 생체이용성을 가짐; (13) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 조절된 면역원성을 가짐; (14) 비-천연 알데히드-기재 아미노산을 갖지 않는 상응하는 폴리펩티드에 비해 조절된 생물학적 활성을 가짐; (15) 약학 조성물의 일부임; (16) 세포 배양물로부터 수득됨; (17) 화학적으로 합성됨; (18) 라이브러리 검색 방법에서 사용됨; (19) 어레이와 함께 사용됨; (20) 단백질 어레이와 함께 사용됨; (21) 유전자 발현 분석을 위해 사용됨; (22) 환원성 아민화를 통해 물질에 커플링됨; (23) 표지에 커플링됨; (24) 염료에 커플링됨; (25) 중합체에 커플링됨; (26) 세포독성 화합물에 커플링됨; (27) 약물에 커플링됨; (28) 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체에 커플링됨; (29) 항체 또는 항체 단편에 커플링됨; (30) 탄수화물에 커플링됨; (31) 폴리뉴클레오티드에 커플링됨; (32) 안티센스 폴리뉴클레오티드에 커플링됨; (33) 사카라이드에 커플링됨; (34) 형광단에 커플링됨; (35) 화학적 절단성 기에 커플링됨; (36) 광절단성 기에 커플링됨; (37) 에너지 전달제에 커플링됨; (38) 방사성뉴클레오티드에 커플링됨; (39) 번역 후 변형될 수 있음; (40) 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (41) 약 4 내지 약 10의 pH 범위에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (42) 번역 후 환원성 아민화에 의해 부위 특이적으로 유도화될 수 있음; (43) 실온에서 환원성 아민화에 의해 신속히 번역 후 변형될 수 있음; (44) 수성 조건에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (45) 화학양론적인 반응 조건을 이용한 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (46) 거의-화학양론적인 반응 조건을 이용한 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (47) 화학양론적-유사 반응 조건을 이용한 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있음; (48) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 포유동물을 치료하는 데 사용됨; (49) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 인간을 치료하는 데 사용됨; (50) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 포유동물을 진단하는 데 사용됨; (51) 질환, 장애 또는 증상을 앓는 인간을 진단하는 데 사용됨; (52) 지속-방출 조성물의 일부임; (53) 프로-드러그에 커플링됨; (54) 세포 용해물로부터 수득됨; (55) 리보좀에 의해 번역됨; (56) 약 4 내지 약 7의 pH 범위에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형됨; (57) 약 4 내지 약 5의 pH 범위에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형됨; (58) 약 5의 pH에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형됨; (59) 약 4의 pH에서 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형됨; (60) 환원성 아민화 반응에서 신속히 반응함; (61) 환원성 아민화 반응에서 약 10시간 미만의 시간 내에 반응함; (62) 환원성 아민화 반응에서 약 8시간 미만의 시간 내에 반응함; (63) 환원성 아민화 반응에서 약 6시간 미만의 시간 내에 반응함; (68) 환원성 아민화 반응에서 약 4시간 미만의 시간 내에 반응함; (64) 환원성 아민화 반응에서 약 2시간 미만의 시간 내에 반응함; (65) 환원성 아민화 반응에서 약 1시간 미만의 시간 내에 반응함; 및 (66) 환원성 아민화 반응에서 약 30분 미만의 시간 내에 반응함.
다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 2개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 3개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 4개 이상의 특징을 갖는다. 다른 또는 대안적 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비-천연 알데히드-기재 아미노산 폴리펩티드는 전술한 특징들 중 5개 이상의 특징을 갖는다.
수용성 중합체에 연결된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조 방법도 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 비-천연 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체를 비-천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입되는 비-천연 아미노산은 20종의 공통된 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해 달리 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산들 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물도 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 하나 이상의 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물도 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩티드에 연결된다.
셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포도 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 세포 배양물 중의 세포인 반면, 다른 실시양태에서는, 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물을 비롯한 다세포 유기체의 일부인 세포이다. 임의의 세포 실시양태에서, 추가 실시양태는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 시험관 내에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 용해물 중에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 리보좀에 의한 번역에 의해 생성된다.
비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법도 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 폴리펩티드, 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 세포를, 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 라이브러리, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 본 명세서에 기재된 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 이들의 조합 라이브러리도 본 명세서에 기재된다. 하나 이상의 비-천연 아미노산, 하나 이상의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형 비-천연 아미노산을 함유하는 어레이도 본 명세서에 기재된다. 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 어레이도 본 명세서에 기재된다. 본 명세서에 기재된 어레이는 (폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 검출하거나 폴리펩티드의 번역을 검출함으로써) 유기체 내에서의 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 검색하는 데 사용될 수 있다.
원하는 활성에 대해 본 명세서에 기재된 라이브러리를 검색하는 방법, 본 명세서에 기재된 라이브러리를 검색하기 위해 본 명세서에 기재된 어레이를 사용하는 방법, 또는 원하는 활성에 대해 화합물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 다른 라이브러리를 검색하는 방법도 본 명세서에 기재된다. 또한, 치료제 자체뿐만 아니라 새로운 치료제를 개발하고 발견하는 데 있어서 라이브러리 검색으로부터 얻은 상기 활성 데이타의 용도도 기재된다.
폴리펩티드의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법도 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 천연 발생 폴리펩티드에서 임의의 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 비-천연 아미노산으로 치환시키는 단계, 및/또는 폴리펩티드를 수용성 중합체에 연결시키는 단계를 포함한다.
비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 사용하여 이러한 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법 또한 본 명세서에 기재된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 본 명세서에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 구축물 및 시약에 한정되지 않고 그 자체가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이지 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 범위를 제한하기 위한 것이 아니고 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되어야 함을 이해할 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 용어는, 그 문맥이 명백히 달리 명시하지 않은 한, 복수 형태에 대한 언급도 포함한다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있다 하더라도, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이하에 기재된다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허는 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 문헌에 기재된 구축물 및 방법을 기술하고 개시하기 위해 참고로 본 명세서에 도입된다. 본 명세서에서 논의된 문헌들은 본원의 출원일 전 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서에서 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "친화성 표지"는 또 다른 분자에 가역적으로 비가역적으로 결합하여, 상기 또 다른 분자를 변형시키거나, 파괴하거나, 상기 또 다른 분자와 함께 화합물을 형성하는 표지를 말한다. 예를 들어, 친화성 표지는 효소 및 이의 기질, 또는 항체 또는 이의 항원을 포함한다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"는 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 각각 산소 원자, 아미노 기, 황 원자를 통해 분자에 연결된 알킬 기를 말한다.
그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 완전 포화, 단-포화 또는 다-포화될 수 있는 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 의미하며, 표시된 수의 탄소 원자를 가진 (즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함) 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 상동체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 불포화 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가진 알킬 기이다. 불포화 알킬 기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐, 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 상동체 및 이성질체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 하기에 보다 상세히 정의된 알킬의 유도체들 예컨대, "헤테로알킬", "할로칼킬" 및 "동종알킬"을 포함한다.
그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬렌"은, (-CH2-)m으로 예시된 바와 같은 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 이때 n은 1 내지 약 24일 수 있다. 예를 들면, 이러한 기로는 10개 이하의 탄소 원자를 가진 기 예컨대, 식 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 가진 보다 짧은 쇄의 알킬 또는 알킬렌 기이다. 용어 "알킬렌"은, 달리 명시하지 않은 한, "헤테로 알킬렌"으로서 하기에 기재된 기들도 포함한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비-천연 발생 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 공통된 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기를 가진 화합물, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형 R 기 (예를 들면, 노르류신) 또는 변형 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 유사체의 비-제한적 예로는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3-문자 또는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭될 수 있다.
"아미노 말단 변형 기"는 말단 아민 기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 예를 들면, 이러한 말단 아민 기는 중합체성 분자의 말단에 존재할 수 있고, 이때 이러한 중합체성 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 말단 변형 기로는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질이 있다. 예를 들면, 말단 변형 기로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민이 있다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는, 중합체성 분자의 치료적 특징을 개질시키는 데 사용될 수 있다.
"항체 단편"은 전장 형태 이외의 항체의 임의의 형태를 의미한다. 본 명세서에서 항체 단편은 전장 항체 내에 존재하는 보다 작은 성분인 항체 및 개조된 항체를 포함한다. 항체 단편으로는 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR, 가변성 영역, 골격 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄 및 가변 영역의 조합물, 및 대안적 스카폴드(scaffold) 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다(Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 또 다른 작용성 하위구조(substructure)는 펩티드 링커로 공유결합되어 있는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄로 이루어진 가변 영역으로 구성된 단쇄 Fv(scFv)이다(S-z Hu et al, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). 이들 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 내의 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하며, 보다 큰 항원-특이적 분자에 대한 편리한 구축 블록을 제공할 수 있다. 달리 구체적으로 명시하지 않은 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 문장 및 청구범위는 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "방향족 아민"은 아미노 부분을 함유하는 아릴 부분을 지칭한다. 이러한 아미노 부분으로는 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 차폐된 아민 또는 보호된 아민이 있을 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 3차 아민, 차폐된 아민 또는 보호된 아민은 1차 아민 또는 2차 아민 부분으로 전환될 수 있다. 추가로, 아민 부분은 화학적 반응성을 포함하나 이로 한정되지 않는 아민 부분과 유사한 화학적 특징을 가진 아민-유사 부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "방향족" 또는 "아릴"은 접합된 pi 전자 시스템을 가진 하나 이상의 고리를 가진 폐쇄된 고리 구조를 지칭하며, 카르보시클릭 아릴 및 헤테로시클릭 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기 둘 다를 포함한다. 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 5 내지 20개의 고리 원자를 함유할 수 있다. 상기 용어는 1환 고리가 공유결합된 또는 융합된 고리인 다환 (즉, 인접하는 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다. 방향족 기는 비치환되거나 치환될 수 있다. "방향족" 또는 "아릴" 기의 비-제한적 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 안쓰라세닐 및 펜안쓰라세닐이 있다. 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기들은 하기 허용가능한 치환기들로 구성된 군으로부터 선택된다.
간결하게 기재하기 위해, (아릴옥시, 아릴티옥시, 아르알킬을 포함하나 이들로 한정되지 않는) 다른 용어들과 함께 사용될 때 용어 "방향족" 또는 "아릴"은 상기 정의한 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 "아르알킬" 또는 "알크아릴"은 탄소 원자(메틸렌 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)가 헤테로원자 예를 들어, 산소 원자로 치환된 알킬 기를 포함하는 알킬 기에 아릴 기가 부착된 라디칼(벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 의미한다. 이러한 아릴 기의 예로는 펜옥시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
"이작용성 링커"로도 지칭되는 "이작용성 중합체"는 다른 부분과 특이적으로 반응하여 공유결합 또는 비-공유결합을 형성할 수 있는 2개의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 이러한 천연 또는 비-천연 아미노산을 함유하는 펩티드 상의 측쇄가 있을 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 이작용성 링커는 제1 펩티드 상의 기와 반응하는 작용성 기, 및 제2 펩티드 상의 기와 반응하는 또 다른 작용성 기를 가짐으로써, 제1 펩티드, 이작용성 링커 및 제2 펩티드를 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 다양한 화합물을 펩티드에 부착시키기 위한 많은 방법 및 링커 분자가 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제188,256호; 미국특허 제4,671,958호; 미국특허 제4,659,839호; 미국특허 제4,414,148호; 미국특허 제4,699,784호; 미국특허 제4,680,338호; 및 미국특허 제4,569,789호를 참조한다. "다작용성 링커"로도 지칭되는 "다작용성 중합체"는 다른 부분과 특이적으로 반응할 수 있는 2개 이상의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 공유결합 또는 비-공유결합을 형성하는, 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 이러한 천연 또는 비-천연 아미노산을 함유하는 펩티드 상의 측 기(아미노산 측 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)가 있을 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고 화합물에 연결된 하나 이상의 분자와 그가 결합하는 분자 또는 상기 화합물 사이에 특정한 소정의 공간 또는 입체구조를 제공하도록 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생체이용성"은 물질 또는 그의 활성 부분이 약학적 제형으로부터 전달되고 작용 부위 또는 일반적 순환에서 이용될 수 있는 속도 및 정도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존(transposon), 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유기체에 관한 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물에서 질환을 진단하거나, 치유하거나, 완화하거나, 치료하거나, 예방하기 위한, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 복지를 증가시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종(radionuclide), 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 마이크로입자 및 미셀이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류에는 약물, 프로드러그, 방사성핵종, 조영제(imaging agent), 중합체, 항생제, 진균제, 항바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관제, 항-불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물로부터 유래된 독소 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물질"은 생물반응기 및/또는 재조합 방법 및 기법으로부터 수득된 물질을 포함하나 이로 한정되지 않는 생물학적 유래의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물리적 프로브"는 분자에서의 구조적 변화를 검출하거나 모니터링할 수 있는 프로브를 지칭한다. 이러한 분자로는 단백질이 있으나, 이로 한정되지 않고, "생물리적 프로브"는 단백질과 다른 거대분자의 상호작용을 검출하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 생물리적 프로브의 예로는 스핀-표지, 형광단 및 광활성화성 기가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "바이오틴 모사체"로도 지칭되는 용어 "바이오틴 유사체"는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘에 대한 높은 친화성을 가지면서 결합하는, 바이오틴 이외의 임의의 분자이다.
"카르복시 말단 변형 기"는 말단 카르복시 기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 예를 들면, 이러한 말단 카르복시 기는 중합체성 분자의 말단에 존재할 수 있고, 이때 이러한 중합체성 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 말단 변형 기로는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질이 있다. 예를 들면, 말단 변형 기로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민이 있다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는, 중합체성 분자의 치료적 특징을 개질시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "화학적 불활성 기"로도 지칭되는 용어 "화학적 절단성 기"는 산, 염기, 산화제, 환원제, 화학적 개시제 또는 라디칼 개시제에의 노출 시 깨지거나 절단되는 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "본 명세서에 사용된 용어성 기"는 열을 가하지 않은 상태에서 화학적 반응의 결과로서 광을 방사하는 기를 지칭한다. 예를 들면, 루미놀(5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온)은 염기 및 금속 촉매의 존재 하에 과산화수소(H2O2)와 같은 산화물과 반응하여 여기된 상태의 생성물(3-아미노프탈레이트, 3-APA)을 생성한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발색단"은 가시광선 파장, UV 파장 또는 IR 파장의 광을 흡수하는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보조인자"는 큰 분자의 작용에 필수적인 원자 또는 분자를 지칭한다. 보조인자로는 무기 이온, 보조효소(coenzyme), 또는 효소의 활성에 필요한 몇몇 다른 인자들이 있나 이들로 한정되지 않는다. 예로는 헤모글로빈 중의 헴(heme), 클로로필 중의 마그네슘 및 단백질에 대한 금속 이온이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "코폴딩(cofolding)"은 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자를 사용하며 언폴딩된(unfolded) 또는 부적절하게 폴딩된(folded) 분자를 적절하게 폴딩된 분자로 변환시키는 리폴딩(refolding) 과정, 반응 또는 방법을 지칭한다. 예를 들면, "코폴딩"은 서로 상호작용하며 언폴딩된 (또는 부적절하게 폴딩된) 폴리펩티드를 적절하게 폴딩된 천연 폴리펩티드로 변환시키는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용한다. 이러한 폴리펩티드는 천연 아미노산 및/또는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "비교 창"은 약 20 내지 약 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택된 인접 위치들의 수 중 어느 하나를 갖는 절편에 대한 언급을 포함하며, 이때 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치를 갖는 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]의 국소(local) 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85; 2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 수단에 의해 수행될 수 있다.
예를 들면, % 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘은 각각 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402] 및 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어길이(wordlength; W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 턴 오프된(turned off) "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 사용하여 수행한다.
또한, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다(예를 들면, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치(match)가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
"보존적 변형 변이체"는 천연 및 비-천연 아미노산, 천연 및 비-천연 핵산 서열 및 이들의 조합물에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 대해, "보존적 변형 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 천연 및 비-천연 아미노산 서열을 코딩하는 천연 및 비-천연 핵산을 지칭하거나, 천연 및 비-천연 핵산이 천연 및 비-천연 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 전술한 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 한 종류인 "침묵 변이(silent variation)"이다. 따라서, 본 명세서에서 천연 및 비-천연 폴리펩티드를 코딩하는 모든 천연 및 비-천연 핵산 서열은 천연 및 비-천연 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 천연 및 비-천연 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 천연 및 비-천연 폴리펩티드를 코딩하는 천연 및 비-천연 핵산의 각각의 침묵 변이는 기재된 각각의 서열에 내포되어 있다.
아미노산 서열의 경우, 단일 천연 및 비-천연 아미노산 또는 코딩된 서열 내의 적은 %의 천연 및 비-천연 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가는 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로의 천연 및 비-천연 아미노산의 치환이 발생된 경우, "보존적 변형 변이체"이다. 기능적으로 유사한 천연 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자 이외의 것이나, 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 하기 8개의 군 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라진(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M).
(예를 들면, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)
그 자체로서 또는 다른 용어와 함께 사용되는 용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은, 달리 명시되지 않은 한, "알킬" 및 "헤테로알킬" 각각의 환형 버젼을 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화 및 불포화 고리 결합을 포함한다. 추가로, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로시클이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 상기 용어는 2환 및 3환 고리 구조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다환 구조를 포함한다. 유사하게, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "시클로알킬렌"은 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "시클로덱스트린"은 고리 형성에 있어서 6개 내지 8개 이상의 글루코즈 분자로 구성된 환형 탄수화물을 지칭한다. 고리의 외부 부분은 수용성 기를 함유하고, 고리의 중심에는 소분자를 수용할 수 있는, 비교적 비극성을 나타내는 캐비티(cavity)가 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성"은 세포에게 유해한 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "변성화제(denaturing agent)" 또는 "변성제(denaturant)"는 중합체의 가역적 언폴딩을 야기할 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 예를 들어, "변성화제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 언폴딩을 초래할 수 있다. 변성화제 또는 변성제의 강도는 구체적인 변성화제 또는 변성제의 성질 및 농도 둘 다에 의해 결정될 것이다. 예컨대, 변성화제 또는 변성제는 카오트로프(chaotrope), 세제, 유기 용매, 수 혼화성 용매, 인지질, 또는 이들의 조합물일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 카오트로프의 비-제한적 예로는 우레아, 구아니딘 및 소듐 티오시아네이트가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 세제의 비-제한적 예로는 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대, 트윈 또는 트리톤 세제), 사르코실(Sarkosyl)과 같은 강한 세제, 약한 비-이온성 세제(예컨대, 디지토닌), 약한 양이온성 세제 예컨대, N->2,3-(디올레이옥시(Dioleyoxy))-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 약한 이온성 세제(예컨대, 소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트), 또는 설포베테인(쯔비터전트), 3-(3-클로르아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 쯔비터이온성 세제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 변성제로서 사용될 수 있는 유기 수 혼화성 용매의 비-제한적 예로는 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C2-C4 알칸올 예컨대, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C2-C4 알칸디올 예컨대, 에틸렌-글리콜)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 인지질의 비-제한적 예로는 천연 발생 인지질 예컨대, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체 예컨대, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "검출가능한 표지"는 형광, 화학발광, 전자-스핀 공명, 자외선/가시광선 흡수 분광법, 질량 분광측정법, 핵 자기 공명, 자기 공명 및 전기화학적 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 분석 기법을 이용하여 관찰할 수 있는 표지를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "디카르보닐"은 1,2-디카르보닐 기, 1,3-디카르보닐 기 및 1,4-디카르보닐 기; 및 하나 이상의 케톤 기, 및/또는 하나 이상의 카르복시 기, 및/또는 하나 이상의 에스테르 기, 및/또는 하나 이상의 카르복실산 기, 및/또는 하나 이상의 티오에스테르 기를 함유하는 기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- 및 -C(S)-로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 부분을 함유하는 기를 지칭한다. 이러한 디카르보닐 기로는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르가 있다. 또한, 이러한 기는 직쇄, 분지쇄 또는 환형 분자의 일부일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약물"은 질환 또는 증상의 예방, 진단, 경감, 치료 또는 치유에 사용되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "염료"는 발색단을 함유하는 가용성 착색 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료할 질환 또는 증상의 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 경감시키는, 투여될 물질 또는 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 경감 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 예를 들면, 투여될 물질 또는 화합물로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증강 및/또는 치료 처치를 위해 투여될 수 있다. 임의의 개개의 경우에서 적절한 "유효량"은 투여량 상승 연구와 같은 기법을 이용하여 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전자 밀집 기"는 전자 빔을 조사한 경우 전자를 산란시키는 기를 지칭한다. 이러한 기로는 암모늄 몰리브데이트, 비스무쓰 서브니트레이트 캐드뮴 요오다이드, 99% 카르보히드라지드, 염화철(II) 헥사히드레이트, 헥사메틸렌 테트라민, 98.5% 인듐 트리클로라이드 무수물, 란타늄 니트레이트, 납 아세테이트 트리히드레이트, 납 시트레이트 트리히드레이트, 납 니트레이트, 과요오드산, 포스포몰리브드산, 포스포텅스트산, 포타슘 페리시아니드, 포타슘 페로시아니드, 루테늄 레드, 실버 니트레이트, 실버 프로테이네이트(Ag 분석: 8.0-8.5%) "강", 실버 테트라페닐포핀(S-TPPS), 소듐 클로로아우레이트, 소듐 텅스테이트, 탈륨 니트레이트, 티오세미카르바지드(TSC), 우라닐 아세테이트, 우라닐 니트레이트 및 바나딜 설페이트가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "에너지 전달제"는 또 다른 분자에 에너지를 줄 수 있거나 또 다른 분자로부터 에너지를 받을 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들면, 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 공여 분자의 여기 상태 에너지가 여기되지 않은 수용 분자에 비-방사적으로 전달되고, 이 수용 분자가 더 긴 파장에서 공여된 에너지를 형광적으로 방사하는 쌍극자-쌍극자 커플링 과정이다.
용어 "증강시키다" 또는 "증강"은 원하는 효과의 효능 또는 지속 기간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제의 효과를 증강시키는 것은 질환, 장애 또는 증상의 치료 과정 동안 치료제의 효과를 효능 또는 지속 기간 면에서 증가시키거나 연장시키는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "증강-유효량"은 질환, 장애 또는 증상의 치료에 있어서 치료제의 효과를 증강시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질환, 장애 또는 증상의 심각도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 달려 있을 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "진핵생물"은 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충 및 원생생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 계통발생적 도메인 진핵생물류(Eucarya)에 속하는 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "지방산"은 약 C6 또는 더 긴 탄화수소 측쇄를 가진 카르복실산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형광단"은 여기 시 광자를 방사함으로써 형광을 나타내는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈 기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"은 화학 반응이 일어나는 분자의 부분 또는 단위체를 지칭한다. 상기 용어들은 화학 분야에서 어느 정도 동의어이고 몇몇 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응하는 분자의 일부를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "할로아실"은 -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 할로겐 부분을 함유하는 아실 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "할로알킬"은 -CF3 및 -CH2CF3 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 할로겐 부분을 함유하는 알킬 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로알킬"은 O, N, Si 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 알킬 기로 구성된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 지칭하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 경우에 따라 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 존재할 수 있거나, 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 예로는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적으로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 예시된 바와 같은 (그러나, 이들로 한정되지 않음) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자가 쇄의 말단 중 하나 또는 쇄의 말단 양쪽에 존재할 수도 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 배향은 결합 기의 화학식이 기재된 방향에 의해 전혀 암시되지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 다를 표시한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기를 지칭하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되어 있고, 상기 질소 원자(들)은 경우에 따라 4급화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 헤테로아릴 기의 비-제한적 예로는 페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "호모알킬"은 탄화수소 기인 알킬 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "동일한"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열(subsequence)을 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은, 비교 알고리즘을 사용하여 측정할 때 또는 수동 정렬 및 육안 조사로 측정할 때, 비교 창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응에 대해 비교하고 정렬한 경우 일정 %의 동일한 서열 단위체를 가진 2개 이상의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 2개 이상의 서열은 서열 단위체가 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"할 수 있다. 이러한 %는 2개 이상의 서열의 "% 동일성"을 기술하기 위한 것이다. 서열의 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 서열 단위체 길이를 가진 영역, 약 50개 서열 단위체 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 또한, 이 정의는 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 예를 들면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"하다. 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 아미노산 길이를 가진 영역, 약 50개 아미노산 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리펩티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 또한, 예를 들면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"하다. 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 핵산 길이를 가진 영역, 약 50개 핵산 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교 시, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이 기준 서열과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 하위서열 배위가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트(Default) 프로그램 매개변수를 사용하거나, 대체가능한 매개변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인터칼레이팅 기"로도 지칭되는 용어 "인터칼레이팅제"는 한 분자의 분자내 공간 또는 분자들 사이의 분자간 공간 내로 삽입될 수 있는 화학적 기를 지칭한다. 예를 들면, 인터칼레이팅제 또는 인터칼레이팅 기는 DNA 이중 나선의 적층 염기 내로 삽입되는 분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단리된"은 원하는 성분을 원하지 않는 성분들로부터 분리하고 제거하는 것을 지칭한다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 수용액을 포함하나 이로 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 단리된 성분은 균질한 상태일 수 있거나, 단리된 성분은 추가의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 일부일 수 있다. 순도 및 균질성은 분석 화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 원하는 성분이 단리되고 제제 중에 존재하는 우세한 종인 경우, 상기 성분은 본 명세서에서 실질적으로 정제되었다고 기술된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "정제된"은 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 원하는 성분을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 핵산 또는 단백질은 이러한 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합되어 있는 세포 성분들 중 적어도 일부를 실질적으로 갖지 않거나, 핵산 또는 단백질이 그의 생체 내 또는 시험관 내 제조의 농축물보다 더 높은 수준으로 농축된 경우 "단리되어" 있다. 예를 들면, 유전자는 상기 유전자를 플랭킹하며 원하는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리되어 있을 때 단리되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "표지"는 화합물 내로 도입되고 용이하게 검출됨으로써 그의 물리적 분포가 검출될 수 있고/있거나 모니터링될 수 있는 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "연결"은 링커의 작용기와 또 다른 분자 사이의 화학 반응으로부터 형성된 결합 또는 화학적 부분을 지칭한다. 이러한 결합으로는 공유결합 및 비-공유결합이 있을 수 있으나 이들로 한정되지 않는 반면, 이러한 화학적 부분은 에스테르, 카르보네이트, 이민 포스페이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 연결 및 올리고뉴클레오티드 연결이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 가수분해적으로 안정한 연결은 연결이 물 중에서 실질적으로 안정하고 연장된 기간 동안, 아마도 심지어 무한한 기간 동안 생리학적 조건을 포함하나 이로 한정되지 않는 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는다. 가수분해적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 연결이 물 중에서 또는 예를 들면, 혈액을 포함하는 수용액 중에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 연결이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 내에서 분해가능한 연결을 포함할 수 있거나, 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기 내에서 불안정한 연결을 포함할 수 있다. 이러한 분해가능한 연결로는 생물학적 활성제 상의 알코올과 PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결이 있으나 이로 한정되지 않는데, 이때 이러한 에스테르 기는 생리학적 조건 하에서 일반적으로 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 불안정한 연결로는 카보네이트 연결; 아민과 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 연결; 알코올과 포스페이트 기를 반응시켜 형성한 포스페이트 에스테르 연결; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연결; 알데히드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결; PEG와 같은 중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는 아민 기 및 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 연결; 및 중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는 포스포르아미다이트 기 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 연결이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배지"는 세포, 및/또는 이러한 세포에 의해 발현되고/되거나 분비된 생성물을 생장시키고 회수하는 데 사용되는 임의의 배양 배지를 지칭한다. 이러한 "배지"는 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 이. 콜라이 또는 슈도모나스 숙주 세포를 포함하는 임의의 숙주 세포 및 세포 내용물을 지지할 수 있거나 함유할 수 있는 용액, 고체, 반-고체 또는 강성 지지체를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는 숙주 세포가 생장되어 있는 배지 예를 들어, 증식 단계 전 또는 후의 배지를 비롯한, 폴리펩티드가 분비되어 있는 배지를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는 예를 들어, 세포 내에서 폴리펩티드가 생성되고 숙주 세포가 용해되거나 파괴되어 상기 폴리펩티드를 방출하는 경우 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대사물질"은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성된 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체를 지칭한다. 용어 "활성 대사물질"은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성된 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성 유도체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대사된"은 특정 물질이 유기체에 의해 변화되는 총체적인 과정을 지칭한다. 이러한 과정으로는 가수분해 반응 및 효소에 의해 촉진되는 반응이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 대사에 대한 추가 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 입수할 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 숙주에게 투여하고 숙주로부터 얻은 조직 샘플을 분석함으로써 확인할 수 있거나, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관 내에서 간 세포와 함께 항온처리하고 생성된 화합물들을 분석함으로써 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "금속 킬레이터"는 금속 이온과의 금속 착물을 형성하는 분자를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 분자는 중심 금속 이온과 2개 이상의 배위 결합을 형성할 수 있고 고리 구조를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "금속-함유 부분"은 금속 이온, 원자 또는 입자를 함유하는 기를 지칭한다. 이러한 부분으로는 시스플라틴, 킬레이팅된 금속 이온(예컨대, 니켈, 철 및 백금), 및 금속 나노입자(예컨대, 니켈, 철 및 백금)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중원자를 도입하는 부분"은 통상적으로 탄소보다 더 무거운 원자의 이온을 도입하는 기를 지칭한다. 이러한 이온 또는 원자로는 규소, 텅스턴, 금, 납 및 우라늄이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "변형"은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드에게 가해진 변화의 존재를 지칭한다. 이러한 변화 또는 변형은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 합성 후 변형, 또는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형에 의해 얻어질 수 있다. "(변형)"의 형태로 사용되는 용어는 논의되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 경우에 따라 변형되는 것, 즉 논의되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절된 혈청 반감기"는 비-변형 형태와 비교할 때 변형 생물학적 활성 분자의 순환 반감기에서의 양(positive)의 또는 음(negative)의 변화를 지칭한다. 예를 들면, 변형 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 혈청 반감기는 생물학적 활성 분자 또는 변형 생물학적 활성 분자의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하여 각 샘플 중의 해당 분자의 농도를 결정함으로써 측정한다. 혈청 농도와 시간의 상관관계는 혈청 반감기의 계산을 가능하게 한다. 예를 들면, 조절된 혈청 반감기는 개선된 투여 섭생법을 가능하게 할 수 있거나 독성 효과를 피하게 할 수 있는, 혈청 반감기에서의 증가일 수 있다. 혈청에서의 이러한 증가는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절된 치료 반감기"는 비-변형 형태와 비교할 때 치료 유효량의 변형 생물학적 활성 분자의 반감기에서의 양의 또는 음의 변화를 의미한다. 예를 들면, 변형 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 성질 및/또는 치료 효과를 측정함으로써 측정한다. 증가된 치료 반감기는 유리한 특정 투여 섭생법 또는 유리한 특정 총 투여량을 허용할 수 있게 하거나, 원치않는 효과를 피할 수 있게 한다. 예를 들면, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 변형 분자와 그의 표적의 증가된 또는 감소된 결합, 비-변형 분자의 또 다른 매개변수 또는 작용 기작의 증가 또는 감소, 예를 들어, 단백질분해효소와 같은 효소에 의한 분자의 증가된 또는 감소된 분해로부터 비롯될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "나노입자"는 입자 크기가 약 500 nm 내지 약 1 nm인 입자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "거의-화학양론적인"은 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비가 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방향족 아민 측쇄 상의 수소의 수에 비해 약 0.75 내지 약 1.5인 것을 지칭한다. 예를 들면, 1차 방향족 아민은 2개의 수소를 가지는 반면, 2차 아민은 1개의 수소를 가진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비-진핵생물"은 비-진핵 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비-진핵생물 유기체는 진정세균(Eubacteria)[에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 써머스 써모필러스(thermus thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 포함하나 이로 한정되지 않음] 계통발생적 도메인, 또는 고세균(Archaea)[메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 아키오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 또는 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들면 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC -1을 포함하나 이로 한정되지 않음] 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.
"비-천연 아미노산"은 20종의 공통된 아미노산 중 하나, 피로라이신(pyrrolysine) 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이 아닌 아미노산을 말한다. 용어 "비-천연 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연적으로 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비-천연 발생 아미노산" 및 하이픈으로 연결된 이들의 다양한 버젼 및 하이픈으로 연결되지 않은 이들의 다양한 버젼이다. 용어 "비-천연 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 공통된 아미노산 또는 피로라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)의 변형에 의해 천연적으로 발생되지만 그 자체가 번역 복합체(translation complex)에 의해 성장 폴리펩티드 쇄 내로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연-발생 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코즈아미닐-L-세린, N-아세틸글루코즈아미닐-L-쓰레오닌 및 O-포스포티로신이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 용어 "비-천연 아미노산"에는 천연적으로 발생되지 않고 합성에 의해 수득될 수 있거나 비-천연 아미노산의 변형에 의해 수득될 수 있는 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 핵산 및 핵산 중합체로는 (i) 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체; (ii) 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)인 PNA(펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체; (iii) 그의 보존적 변형 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 상보적 서열, 및 명시적으로 표시된 서열이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선별된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "산화제"는 산화될 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 예를 들면, 산화제로는 산화된 글루타치온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오쓰레이톨, 산화된 에리쓰레이톨 및 산소가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광친화성 표지"는 광에의 노출 시 표지가 친화성을 갖는 분자와 결합을 형성하는 기를 가진 표지를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 결합은 공유결합 또는 비-공유결합일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광케이징된 부분"은 일정한 파장에서의 조광 시 다른 이온 또는 분자와 공유결합하거나 비-공유결합하는 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광절단성 기"는 광에의 노출 시 절단되는 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광가교연결제"는 광에의 노출 시 반응성을 나타내어 2개 이상의 단량체성 또는 중합체성 분자와 공유결합 또는 비-공유결합을 형성하는 2개 이상의 작용기를 포함하는 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광이성질체화성 잔기"는 광으로의 조명 시 한 이성질체 형태로부터 또 다른 이성질체 형태로 변화하는 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 또는 분지형 중합체성 폴리에테르 폴리올을 지칭한다. 이러한 폴리알킬렌 글리콜로는 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이들의 유도체가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 다른 예시적 실시양태는 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카달로그("Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001))와 같은 시판 공급자의 카달로그에 기재되어 있다. 예를 들어, 이러한 중합체성 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 예를 들어, 이러한 중합체성 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이나, 이들로 한정되지 않는다. 상기 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 0 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중합체"는 반복된 하위단위체(subunit)로 구성된 분자를 지칭한다. 이러한 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리사카라이드, 또는 폴리알킬렌 글리콜이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들로 구성된 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 대한 설명은 펩티드의 설명에 동일하게 적용되고, 펩티드에 대한 설명은 폴리펩티드에 동일하게 적용된다. 상기 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연 아미노산인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 또한, 이러한 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하며, 이때 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 연결에 의해 연결되어 있다.
용어 "번역 후 변형"은 천연 또는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄에 번역에 의해 도입된 후 일어나는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이러한 변형으로는 생체내에서 번역과 동시에 일어나는 변형, 시험관내에서 번역과 동시에 일어나는 변형(예컨대, 세포-무함유 번역 시스템 내에서의 변형), 생체내에서의 번역 후 변형 및 시험관내에서의 번역 후 변형이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로드러그"는 생체내 또는 시험관내에서 모 약물로 전환되는 물질을 지칭한다. 이러한 프로드러그의 이점으로는 (i) 모 약물에 비해 투여가 용이하다는 점; (ii) 모 약물은 경구 투여될 수 없는 반면 프로드러그는 경구 투여될 수 있다는 점; 및 (iii) 프로드러그가 모 약물에 비해 약학 조성물에서 개선된 가용성을 가질 수 있다는 점이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 프로드러그는 활성 약물의 약리학적 불활성 또는 감소된-활성의 유도체를 포함한다. 프로드러그는 약물의 성질 예컨대, 물리화학적 성질, 생체약학적 성질 또는 약동학적 성질의 개질을 통해 원하는 작용 부위에 도달하는 약물 또는 생물학적 활성 분자의 양을 조절하기 위해 디자인될 수 있다. 프로드러그는 효소적 또는 비-효소적 반응을 통해 체내에서 활성 약물로 전환된다. 프로드러그는 개선된 물리화학적 성질 예컨대, 우수한 가용성, 증강된 전달 특성, 예컨대, 특정한 세포, 조직, 기관 또는 리간드를 특이적으로 표적화하는 특성, 및 약물의 개선된 치료 값을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방 유효량"은 하나 이상의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 환자에게 예방 목적으로 투여된 경우 치료할 질환, 증상 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시킬 상기 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 예방을 위한 사용에 있어서, 이러한 양은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 당업자라면 이러한 예방 유효량을 투여량 증가 임상 시험을 포함하나 이로 한정되지 않는 관용적인 실험으로 결정할 수 있다는 것은 당업계의 기술 내에 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호될 화학적 반응성 기의 종류에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, (i) 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; (ii) 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있고; (iii) 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다.
예를 들어, 차단기/보호기는 하기 기들로부터 선택될 수 있다:
Figure 112013073088060-pat00001
추가로, 보호기는 Nvoc 및 MeNvoc와 같은 광불안정성 기 및 당업계에 공지된 다른 보호기를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 보호기는 본 명세서에 완전히 참고로 도입되는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "방사성 부분"은 핵이 핵 방사선, 예컨대, 알파, 베타 또는 감마 입자를 자발적으로 방출하는 기를 지칭하는데, 이때 알파 입자는 헬륨 핵이고, 베타 입자는 전자이고, 감마 입자는 고 에너지 광자이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "반응성 화합물"은 적절한 조건 하에 또 다른 원자, 분자 또는 화합물에 대해 반응성을 나타내는 화합물을 지칭한다.
"숙주 세포"로도 지칭되는 용어 "재조합 숙주 세포"는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭하며, 이때 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 삽입시키는 데 사용되는 방법으로는 직접 섭취(uptake), 형질도입, f-교배(mating), 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 플라스미드를 포함하나 이로 한정되지 않는 비-삽입(nonintegrated) 벡터일 수 있거나, 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "산화환원-활성제"는 또 다른 분자를 산화시키거나 환원시키는 분자를 지칭하고, 이로써 산화환원 활성제는 환원되거나 산화된다. 산화환원 활성제의 예로는 페로센, 퀴논, Ru2 +/3+ 착물, Co2 +/3+ 착물 및 Os2 +/3+ 착물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "환원제"는 환원될 화합물에 전자를 부가할 수 있는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 환원제로는 디티오쓰레이톨(DTT), 2-머캡토에탄올, 디티오에리쓰리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타치온이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 환원제는 예를 들면, 환원된 상태에서 설프히드릴 기를 유지하고 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 환원시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리폴딩"은 부적절하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 천연 또는 적절하게 폴딩된 구조로 변환되는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 지칭한다. 예를 들면, 리폴딩은 이황화 결합 함유 폴리펩티드를 이황화 결합에 대하여 부적절하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 천연 또는 적절하게 폴딩된 구조로 변환시킨다. 이러한 이황화 결합 함유 폴리펩티드는 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수지"는 고분자량의 불용성 중합체 비드를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 비드는 고체 상 펩티드 합성을 위한 지지체로서 사용될 수 있거나, 정제 전 분자의 부착을 위한 부위로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "사카라이드"는 당, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 일련의 탄수화물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 어구 "에 선별적으로 혼성화한다" 또는 "특이적으로 혼성화한다"는 서열이 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않는 복합 혼합물 중에 존재하는 경우 분자가 엄격한 혼성화 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에 결합하거나, 특정 뉴클레오티드 서열과 함께 이중가닥을 형성하거나 또는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "스핀 표지"는 전자 스핀 공명 분광법에 의해 검출될 수 있고 또 다른 분자에 부착될 수 있는 페어링되지 않은 전자 스핀(즉, 안정한 상자성 기)을 나타내는 원자 또는 일군의 원자를 함유하는 분자를 지칭한다. 이러한 스핀-표지 분자로는 니트릴 라디칼 및 니트록사이드가 있으나, 이들로 한정되지 않고, 단일 스핀-표지 또는 이중 스핀-표지일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "화학양론적인"은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방향족 아민 측쇄 상의 수소의 수에 대한 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비가 약 0.9 내지 약 1.1인 것을 지칭한다. 예를 들면, 1차 방향족 아민은 2개의 수소를 갖는 반면, 2차 아민은 1개의 수소를 가진다.
본 명세서에서 사용된 용어 "화학양론적-유사"는 반응 조건 또는 첨가제의 존재 하에서의 변화에 따라 화학양론적이거나 거의-화학양론적인 상태가 되는 화학 반응을 지칭한다. 반응 조건에서의 이러한 변화로는 온도의 증가 또는 pH의 변화가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 상기 첨가제로는 촉진제가 있으나, 이로 한정되지 않는다.
어구 "엄격한 혼성화 조건"은 낮은 이온 강도 및 고온 조건 하에서의 DNA, RNA, PNA 또는 다른 핵산 모사체 또는 이들의 조합물의 서열의 혼성화를 지칭한다. 예를 들면, 엄격한 조건 하에서 프로브는 핵산의 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 중의 그의 표적 하위서열에 혼성화하지만, 상기 복합 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 수 있다. 예를 들면, 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 엄격한 조건은 (i) 지정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮은 융점; (ii) 염 농도가 약 pH 7.0 내지 약 8.3에서 약 0.01 내지 약 1.0 M이고, 짧은 프로브(10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 60℃ 이상인 조건; (iii) 포름아미드를 포함하나 이로 한정되지 않는 탈안정화제의 첨가; 및 (iv) 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리, 및 약 5분 내지 약 120분 동안 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS를 사용한 세척. 예를 들면, 선별적 또는 특이적 혼성화의 검출은 배경(background) 신호의 2배 이상인 양(positive)의 신호를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen, Techzques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피험체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 예를 들면, 피험체는 인간을 포함하나 이로 한정되지 않는 포유동물일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 정제하기 전에 원하는 성분을 정상적으로 동반하거나 원하는 성분과 상호작용하는 다른 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 갖지 않는 원하는 성분을 지칭한다. 예를 들면, 원하는 성분은 원하는 성분 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 성분들을 함유하는 경우 "실질적으로 정제된 것"일 수 있다. 따라서, "실질적으로 정제된" 원하는 성분의 순도는 약 70% 이상, 약 75% 이상, 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연 세포로부터 정제될 수 있거나, 재조합적으로 제조된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 경우 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 제제는 상기 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 물질을 함유하는 경우 "실질적으로 정제된 것"일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 5 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 750 mg/ℓ, 약 500 mg/ℓ, 약 250 mg/ℓ, 약 100 mg/ℓ, 약 50 mg/ℓ, 약 10 mg/ℓ 또는 약 1 mg/ℓ 미만으로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 SDS-PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 적절한 방법에 의한 측정 시 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 이보다 높을 수 있다.
"비-간섭 치환기"로도 지칭되는 용어 "치환기"는 분자 상의 또 다른 기를 치환시키는 데 사용될 수 있는 기를 지칭한다. 이러한 기로는 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C5-C12 아르알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C5-C12 알콕시아릴, C5-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬설피닐, C1-C10 알킬설포닐, -(CH2)m-O-(C1-C10 알킬)(이때, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환 아릴, 치환 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-C10 알킬), -C(O)-(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬 티오알킬, -C(O)O-(C1-C10 알킬), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR2, 카르보닐, -C(O)-(C1-C10 알킬)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR2, -(C1-C10 아릴)-S-(C6-C10 아릴), -C(O)-(C6-C10 아릴), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10 알킬)(이때, m은 각각 1 내지 8임), -C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, -NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2, 이들의 염 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이 목록에서 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환 알킬, 아릴 또는 치환 아릴, 또는 알크아릴이다. 치환기가 좌측부터 우측으로 기재되는 그들의 보편적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 우측부터 좌측으로 기재함으로써 비롯되는 화학적으로 동일한 치환기도 포함하는데, 예를 들면, -CH2O-는 -OCH2-와 동등하다.
예를 들어, 알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기로는 -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -0C(0)NR2, -NRC(0)R, -NR-C(0)NR2, -NRC(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN 및 -NO2가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 티오알콕시 기, 또는 아르알킬 기가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 2개의 R 기가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-원, 6-원 또는 7-원의 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR2는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
예를 들어, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기로는 0 내지 방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총수 범위 내의 수의 -OR, -O, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NR-C(0)NR2, -NRC(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, -R, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬이 있으나 이들로 한정되지 않으며; 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 하나 이상의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 질환, 증상 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 투여된 경우 치료할 질환, 증상 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키거나 경감시키기에 충분한 상기 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 조성물의 효과는 질환, 장애 또는 증상의 심도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 조건에 달려 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 투여량 증가 임상 시험을 포함하나 이로 한정되지 않는 관용적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "티오알콕시"는 산소 원자를 통해 분자에 연결된 황을 함유하는 알킬 기를 지칭한다.
용어 "융점" 또는 Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 (지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "독성 부분"은 유해할 수 있거나 사망을 초래할 수 있는 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 증상의 증상을 완화시키거나, 감소시키거나 개선시키는 것, 추가 증상을 예방하는 것, 증상의 대사적 기초 원인을 개선시키거나 예방하는 것, 질환 또는 증상을 억제하는 것, 예를 들어, 질환 또는 증상의 발달을 정지시키는 것, 질환 또는 증상을 경감시키는 것, 질환 또는 증상의 퇴행을 일으키는 것, 질환 또는 증상에 의해 야기되는 증상을 경감시키는 것, 및 질환 또는 증상의 증상을 정지시키는 것을 포함한다. 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 용해될 수 있는 임의의 중합체를 지칭한다. 이러한 수용성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C1-C10 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본원에 참고로 도입되는 미국특허 제5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴릴비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체(덱스트란 설페이트를 포함함), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체(메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 전분, 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜과 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체와 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 폴리펩티드의 결합은 증가한 또는 조절된 혈청 반감기, 비-변형 형태에 비해 증가한 또는 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 응집 및 다량체 형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는 조절된 물리적 결합 특성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너와의 변경된 결합, 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 또한, 이러한 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다.
달리 명시하지 않은 한, 당업계의 기술 내에 있는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학적 기법, 생화학적 기법, 재조합 DNA 기법 및 약학적 기법과 같은 통상적인 기법이 사용된다.
본 명세서에서 제시된 화합물(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물을 제조하기 위한 시약을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)은 하나 이상의 원자가 천연 상태에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 질량수와 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된다는 점을 제외하고 본 명세서에 제공된 다양한 화학식 및 구조식에서 표시된 화합물들과 동일한 동위원소-표지 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물 내로 도입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 170, 35S, 18F, 36Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소를 포함한다. 본 명세서에 기재된 몇몇 동위원소-표지 화합물, 예컨대, 3H 및 14C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에서 유용할 수 있다. 또한, 중수소, 즉 2H와 같은 동위원소를 사용한 치환은 보다 큰 대사적 안정성 예를 들면, 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량 요구로부터 비롯된 치료적 이점을 제공할 수 있다. 본원 화합물들 중 일부(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물의 제조를 위한 시약을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)는 비대칭 탄소 원자를 가지므로 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 공지된 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 및/또는 분획 결정화에 의한 그들의 물리적 화학적 차이점에 기초하여 그들의 개별 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는 적절한 광학적 활성 화합물(예를 들면, 알코올)을 사용한 반응으로 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환시키고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개개의 부분입체이성질체를 상응하는 순수한 거울상이성질체로 전환(예를 들어, 가수분해)시킴으로써 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 이들의 혼합물을 포함하는 이러한 모든 이성질체는 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.
추가 또는 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 화합물(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 프로드러그의 형태로 사용된다. 추가 또는 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 화합물(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 이를 필요로 하는 유기체에게 투여된 때에 대사되어 대사물질을 생성하고, 이 대사물질은 원하는 치료 효과를 비롯한 원하는 효과를 얻는 데 사용된다. 추가 또는 또 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산, 및 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사물질이 제공된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 제제는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 N-산화물, 결정 형태(다형체로도 공지되어 있음) 또는 약학적으로 허용가능한 염의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 호변이성질체로서 존재할 수 있다. 모든 호변이성질체가 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 범위 내에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 물, 에탄올 등과 같은 약학적으로 허용가능한 용매와의 용매화 형태뿐만 아니라 비-용매화 형태로 존재할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화 형태도 본 명세서에 개시된 것으로 간주된다.
본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 여러 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 모든 호변이성질체 형태는 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다. 또한, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 화합물들(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 모든 에놀-케토 형태도 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.
본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 산성을 띠며, 약학적으로 허용가능한 양이온과의 염을 형성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 염기성을 띨 수 있으므로 약학적으로 허용가능한 음이온과의 염을 형성할 수 있다. 이-염(di-salt)을 비롯한 모든 이러한 염들이 본 명세서에 기재된 조성물의 범위 내에 있고, 이들은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 수성, 비-수성 또는 부분 수성 매질 중에서 산성 물질과 염기성 물질을 접촉시킴으로써 제조할 수 있다. 염은 여과, 비-용매를 사용한 침전 후 여과, 용매의 증발, 및 수용액의 경우 동결건조 중 하나 이상의 기법을 이용하여 회수한다.
염으로는 예를 들어, (1) 염산, 수소화브롬산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산을 사용하여 형성하거나, 아세트산, 프로피온산, 헥사노산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-1-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등을 사용하여 형성한 산 부가 염; (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양자가 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리성 토류 이온 또는 알루미늄 이온으로 치환된 경우 형성된 염; 또는 유기 염기와의 배위체가 있다. 허용가능한 유기 염기로는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등이 있다. 허용가능한 무기 염기로는 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등이 있다.
염에 대한 언급은 그의 용매 부가 형태 또는 결정 형태, 특히 용매화물 또는 다형체를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 용매화물은 화학양론적 또는 비-화학양론적 양의 용매를 함유하며, 종종 결정화 과정 동안 형성된다. 수화물은 용매가 물일 때 형성되고, 알코올레이트는 용매가 알코올일 때 형성된다. 다형체는 화합물의 동일한 기본 조성을 가진 상이한 결정 팩킹 배열체를 포함한다. 다형체는 통상적으로 다양한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형태, 광학적 및 전기적 성질, 안정성 및 가용성을 가진다. 재결정화 용매, 결정화 속도 및 저장 온도와 같은 다양한 인자로 인해 단일 결정 형태가 우세해질 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 특징 및 장점은 본 방법, 조성물, 고안품 및 장치의 원리가 이용되는 예시적 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 수반된 도면을 참고함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 기법을 이용하여 변형시킬 폴리펩티드를 선별하고 디자인하기 위한 방법의 비-제한적 측면을 설명한다.
도 2는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 3은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다. 도 3의 경우에만, X는 할로겐을 나타낸다.
도 4는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 5는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 6은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다. 도 6의 경우에만, X는 할로겐을 나타낸다.
도 7은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 8은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 9는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다. 도 9의 경우에만, X는 할로겐을 나타낸다.
도 10은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 11은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 12는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 13은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 종류의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 14는 차폐되지 않고/않거나 탈보호된 아민 부분으로 전환될 수 있는 차폐된 및/또는 보호된 아민 부분을 함유하는, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 15는 알데히드-함유 시약을 사용한 환원성 아민화를 위한 차폐된 및/또는 보호된 아민 측쇄를 함유하는, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 16은 알데히드-함유 시약을 사용한 환원성 알킬화에 의한, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 가진 폴리펩티드의 형성의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 17은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 함유하는 방향족 보호 알데히드의 예시적 비-제한적 예를 보여준다. 이러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에서 사용될 수 있거나 도입될 수 있다.
도 18은 보호된/차폐된 전구체의 번역 후 탈보호/비차폐 후 방향족 아민-함유 시약을 사용한 환원성 아민화에 의한, 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 가진 폴리펩티드 형성의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 19는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 선별적 환원성 알킬화 및 환원성 아민화의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 20은 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 환원된 유로텐션(urotension)-II(UT-H-SH)의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 21은 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 환원된 유로텐션(urotension)-II(UT-II)의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 22는 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 XT-8의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 23은 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 SXT-9의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 24는 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 HXT-9의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 25는 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II) 및 이소부트알데히드(III)를 사용한 펩티드 WXT-9의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 26은 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 펩티드 NXT-9의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 27은 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 펩티드 RXT-10의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 28은 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 29는 다양한 알데히드(I-III)를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 30은 다양한 알데히드(IV-VII)를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 31은 알데히드 및 1,3-디케톤(I-III)을 사용한 펩티드 AXT-11의 경쟁적 반응 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 32는 알데히드 및 1,3-디케톤(I-III)을 사용한 펩티드 NXT-9의 경쟁적 반응 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 33은 다양한 알데히드 및 케톤(I-V)을 사용한 펩티드 MXT-9의 경쟁적 반응 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 34는 펩티드 MXT-9-N3 내지 MXT-9NH2(I)의 환원 후 프로피온알데히드(II) 및 벤즈알데히드(III)을 사용한 환원성 알킬화 및 상응하는 HPLC 크로마토그램의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 35는 본 명세서에 기재된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산의 N-말단 PEG화와 PEG화에 의한 펩티드 PEG화의 예시적 비-제한적 예 및 비교를 보여준다.
도 36은 펩티드 내로 도입된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 PEG화하는 데 사용된 PEG 알데히드 시약의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 37은 N-말단 환원성 알킬화에 의한 MT-9의 PEG화의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 38은 MXT-9 내로 도입된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산의 환원성 알킬화에 의한 MXT-9의 PEG화의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 39는 hGH 및 IFNα 내로 도입된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산의 환원성 알킬화에 의한 hGH 및 IFNα의 PEG화의 예시적 비-제한적 예를 보여준다.
도 40은 다양한 hGH PEG화의 전기영동 겔의 예시적 비-제한적 이미지를 보여준다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
최근에, 단백질 과학에서 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 한계의 대부분을 해결할 것으로 기대되는 완전히 새로운 기술이 보고된 바 있다. 구체적으로, 생체내에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는, 원핵생물 이. 콜라이[예를 들어, 문헌(L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500)] 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지애(에스. 세레비지애(S. cerevisiae))[예를 들어, 문헌(J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)]의 단백질 생합성 기구(machinery)에 새로운 성분들을 첨가한다. 광친화성 표지 및 광이성질체화성 아미노산, 광가교 아미노산[예를 들어, 문헌(J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; and J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027) 참조], 중원자 함유 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화된 아미노산을 비롯하여 신규 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 가진 다수의 신규 아미노산이 이 방법에 의해 앰버(amber) 코돈인 TAG에 반응하여 이. 콜라이 및 효모에서 높은 신뢰도로 효율적으로 단백질 내로 도입되었다. 예를 들어, 본원에 완전히 참고로 도입되는 문헌[J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1: 1-11]을 참조한다. 이 연구들은, 단백질에서 발견되지 않으며 유전적으로 코딩된 20종의 공통된 아미노산에서 발견된 모든 작용기에 대해 화학적 불활성을 나타내고 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기를 선별적 및 관용적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.
II . 개요
도 1은 본 명세서에 기재된 조성물, 방법 및 기법의 개요를 보여준다. 한 측면에서, 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민을 가진 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하고 사용하기 위한 수단(방법, 조성물, 기법)이 본 명세서에 기재된다. 헤테로방향족 기로는 푸란, 피롤, 티오펜, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 이미다졸, 티아졸, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 벤조티아졸, 티아졸로피리딘, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 옥사졸로피리딘, 티아졸로피리미딘, 옥사졸로피리미딘, 벤즈옥사진 및 벤조티아진이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 비-천연 아미노산은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 추가 작용기를 함유할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 한 측면에서 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 기법을 사용하여 변형시킬 폴리펩티드를 선별하고 디자인하기 위한 방법이 제공된다. 신규 폴리펩티드는 새롭게(de novo) 디자인될 수 있는데, 예를 들어, (다수의 폴리펩티드가 디자인되거나 합성되거나 그 특징이 규명되고/되거나 시험될 수 있는) 고-처리 검색 방법의 일부로서 또는 연구자들의 연구 대상에 기초하여 디자인될 수 있다. 신규 폴리펩티드는 공지된 또는 부분적으로 그 특징이 규명된 폴리펩티드의 구조에 기초하여 디자인될 수도 있다. 예를 들면, 성장 호르몬 유전자 수퍼패밀리(superfamily)(하기 참조)는 과학계에 의한 집중적인 연구 대상이고; 신규 폴리펩티드는 이 유전자 수퍼패밀리의 한 구성원 또는 구성원들의 구조에 기초하여 디자인될 수 있다. 치환시키고/시키거나 변형시킬 아미노산을 선별하기 위한 원리는 본 명세서에 별도로 기재되어 있다. 사용될 변형의 선택도 본 명세서에 기재되어 있고, 실험자 또는 최종 사용자의 요구를 충족시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 요구는 폴리펩티드의 치료 효과의 개선, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질의 조절 예컨대, 수용성 및 생체이용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이러한 변형은 예를 들어, 추가 작용기를 폴리펩티드에 제공하는 것, 태그, 표지 또는 검출가능한 신호를 폴리펩티드 내로 도입하는 것, 폴리펩티드의 단리 성질을 개선시키는 것, 및 전술한 변형의 임의의 조합을 포함한다.
방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민을 함유하도록 변형되거나 변형될 수 있는 비-천연 아미노산도 본 명세서에 기재된다. 헤테로방향족 기로는 푸란, 피롤, 티오펜, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 이미다졸, 티아졸, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 벤조티아졸, 티아졸로피리딘, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 옥사졸로피리딘, 티아졸로피리미딘, 옥사졸로피리미딘, 벤즈옥사진 및 벤조티아진이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이 측면은 이러한 비-천연 아미노산을 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법을 포함한다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 이러한 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하기 위한 방법, 수단 및 기법이 본 명세서에 기재된다. 또한, 이 측면은 하나 이상의 이러한 비-천연 아미노산을 함유하는 이러한 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법도 포함한다. 또한, 이 측면은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하는 데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA를 포함함)를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 또한, 이 측면은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하는 데 사용될 수 있는 이러한 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 세포를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
따라서, 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민을 가진 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 본 명세서에 제공되고 기재된다. 헤테로방향족 기로는 푸란, 피롤, 티오펜, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 이미다졸, 티아졸, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 벤조티아졸, 티아졸로피리딘, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 옥사졸로피리딘, 티아졸로피리미딘, 옥사졸로피리미딘, 벤즈옥사진 및 벤조티아진이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민을 가진 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 변형 비-천연 아미노산을 가진 폴리펩티드는 그 폴리펩티드 상의 일부 위치에서의 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 헤테로시클 변형 비-천연 아미노산은 푸란, 피롤, 티오펜, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 이미다졸, 티아졸, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 벤조티아졸, 티아졸로피리딘, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 옥사졸로피리딘, 티아졸로피리미딘, 옥사졸로피리미딘, 벤즈옥사진 및 벤조티아진을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 많은 경우 세포 기구(예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-연결 변형 등)를 통해 일어나고, 이러한 세포 기구-기재 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 천연 발생 아미노산 부위에서 일어나지만, 일부 실시양태에서, 세포 기구-기재 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 비-천연 아미노산 부위(들)에서 일어난다.
다른 실시양태에서, 번역 후 변형은 세포 기구를 이용하지 않는 대신에, 환원성 알킬화 방법을 이용하여 제1 반응성 기(방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민 작용기를 함유하는 비-천연 아미노산을 포함하는 이로 한정되지 않음)를 포함하는 하나 이상의 비-천연 아미노산에 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 부착시킴으로써 작용기를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 반응성 기는 알데히드 및 케톤을 포함하나 이들로 한정되지 않는 카르보닐 함유 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 진핵세포 또는 비-진핵세포 내에서 생체내 만들어진다. 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 시험관내에서 만들어진다. 이 측면은 하나 이상의 이러한 번역 후 변형 비-천연 아미노산을 함유하는 이러한 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법을 포함한다.
폴리펩티드의 일부인 비-천연 아미노산(방향족 아민 기, 헤테로방향족 아민 기 또는 이들의 보호된 형태를 함유함)과 반응하여 전술한 번역 후 변형 중 임의의 변형을 생성할 수 있는 시약도 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 범위 내에 포함된다. 일반적으로, 생성된 번역 후 변형 비-천연 아미노산은 추가 변형 반응을 받을 수 있는 하나 이상의 환원적으로 아민화된 알데히드 또는 케톤을 함유할 것이다. 이 측면은 이러한 비-천연 아미노산(들)의 임의의 이러한 번역 후 변형을 생성할 수 있는 이러한 시약들을 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법도 포함한다.
특정 실시양태에서, 단백질은 한 숙주 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는데, 이때 상기 번역 후 변형은 또 다른 종류의 숙주 세포에 의해 정상적으로 만들어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 단백질은 진핵 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는데, 이때 상기 번역 후 변형은 비-진핵세포에 의해 정상적으로 만들어지지 않는다. 이러한 번역 후 변형의 예로는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-연결 변형 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 연결에 의해 올리고사카라이드를 아스파라진에 부착시킨 단계를 포함한다(올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하나 이들로 한정되지 않음). 또 다른 실시양태에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 연결트레오닌 연결사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시킨 단계를 포함한다. 분비 신호 서열의 예로는 원핵 분비 신호 서열, 진핵 분비 신호 서열, 박테리아 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 분비 신호 서열, 새로운 분비 신호 서열, 펙테이트 라이아제(pectate lyase) 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 예로는 STII(원핵), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존으로부터 유도된 신호 서열 bla가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그(tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 이 측면은 하나 이상의 이러한 번역 후 변형을 함유하는 이러한 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 그 특징을 규명하고 사용하는 방법도 포함한다. 다른 실시양태에서, 글리코실화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-글리코실화된 형태로 제조된다. 이러한 글리코실화된 비-천연 아미노산의 비-글리코실화된 형태는 단리된, 실질적으로 정제된 또는 정제되지 않은 글리코실화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 올리고사카라이드 기를 화학적 또는 효소적으로 제거하는 방법; 이러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 글리코실화하지 못하는 숙주(상기 폴리펩티드를 글리코실화하지 못하도록 개조되거나 돌연변이된 원핵생물 또는 진핵생물을 포함하는 숙주)에서 비-천연 아미노산을 제조하는 방법; 글리코실화 억제제를 세포 배양 배지 내로 도입하는 방법(이때, 이러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 정상적으로 글리코실화할 수 있는 진핵생물에 의해 제조됨); 및 임의의 이러한 방법들의 조합을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 정상적으로 글리코실화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이러한 비-글리코실화된 형태도 본 명세서에 기재된다("정상적으로 글리코실화된"이라 함은 천연 발생 폴리펩티드가 글리코실화되는 조건 하에 제조된 경우 폴리펩티드가 글리코실화될 것임을 의미함). 물론, 정상적으로 글리코실화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이러한 비-글리코실화된 형태는 미정제된 형태, 실질적으로 정제된 형태 또는 단리된 형태일 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질은 시험관내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는데, 이때 번역 후 변형은 화학양론적, 화학양론적-유사 또는 거의-화학양론적인 반응이다. 이러한 번역 후 변형의 예로는 환원제를 사용하여 방향족 아민 기 또는 헤테로방향족 아민 기를 카르보닐 함유 시약으로 환원성 알킬화시키는 것을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 번역 후 변형으로는 환원제를 사용하여 방향족 아민 기 또는 헤테로방향족 아민 기를 알데히드 함유 시약으로 환원성 알킬화시키는 것을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 번역 후 변형은 소듐 시아노보로하이드라이드 환원제를 사용하여 방향족 아민 기 또는 헤테로방향족 아민 기를 알데히드 함유 시약으로 환원성 알킬화시키는 것을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
비-천연 아미노산 함유 폴리펩티드는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비-천연 아미노산 함유 방향족 아민, 헤테로방향족 아민 또는 이의 보호된 형태를 함유할 수 있다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질의 천연 발생 형태에 존재하는 1개 이상의 (그러나, 전체 아미노산보다 적은 수의) 특정 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 방향족 아민, 헤테로방향족 아민 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 비-천연 아미노산이 아닌 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 수도 있다.
본 명세서에 제공되고 기재된 방법 및 조성물은 방향족 아민, 헤테로방향족 아민 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 이러한 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 도입됨으로써 20종의 공통된 천연 발생 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비-천연 아미노산과의 특이적 화학 반응을 수반하는 화학적 접합 기법의 적용이 가능하나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 도입된 아미노산 측쇄를 수반하는 이러한 특이적 화학 반응으로는 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 환원성 알킬화 화학적 기법이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 일단 도입되면, 아미노산 측쇄는 천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 화학적 기법을 이용함으로써 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 가진 물질과 다른 물질(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)의 접합체를 제공한다.
본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단의 또 다른 측면에서, 전술한 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드를 연구하거나 사용하는 방법이 제공된다. 이 측면에는 예를 들어, 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드로부터의 이점이 될 수 있는 치료 용도, 진단 용도, 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도가 포함된다.
III . 폴리펩티드 내의 비-천연 아미노산의 위치
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 것을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 하나 이상의 특정 위치에 도입될 수 있다. 이것은 소수성 아미노산을 비-천연 또는 천연 소수성 아미노산으로, 용적이 큰(bulky) 아미노산을 용적이 큰 비-천연 또는 천연 아미노산으로, 친수성 아미노산을 비-천연 또는 천연 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행하고/하거나 비-천연 아미노산을 활성에 필요하지 않은 위치에 삽입시킴으로써 달성될 수 있다.
다양한 생화학적 및 구조적 방법을 이용하여, 비-천연 아미노산으로 치환시키고자 하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위를 선별할 수 있다. 폴리펩티드 쇄 내의 임의의 위치가 비-천연 아미노산을 도입하기 위한 선별에 적합하고, 선별은 합리적 디자인을 기초로 하여 행해질 수 있거나 임의의 또는 불특정한 소정의 목적을 위한 무작위 선별에 의해 행해질 수 있다. 원하는 부위의 선별은 작용제, 수퍼-작용제(super-agonist), 역 작용제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합 파트너와의 결합 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 입체구조 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 원하는 성질 또는 활성을 갖는 비-천연 아미노산 폴리펩티드(추가로 변형될 수 있거나 비-변형된 상태로 남아 있을 수 있음)를 생성하기 위한 것, 천연 분자에 비해 활성 또는 성질을 변화시키지 않기 위한 것, 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들면 가용성, 응집, 또는 안정성을 개질시키기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 요구되는 폴리펩티드 내의 위치는 당업계에 공지된 점 돌연변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 상동체 스캐닝 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이유발에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 잔기들 이외의 잔기는 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 우수한 후보일 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 우수한 후보일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 쇄 상의 각각의 위치에서 비-천연 아미노산으로 단순히 연속적으로 치환시키고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 비-천연 아미노산을 임의의 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 위치를 선별하기 위한 임의의 수단, 기법 또는 방법이 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물에서 사용하기에 적합하다.
또한, 결실을 포함하는 폴리펩티드의 천연 발생 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 허용하기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 허용하지 않을 것 같은 잔기를 일단 제거하면, 각각의 잔여 위치에서 제시된 치환의 영향이 관련 폴리펩티드, 및 임의의 결합 리간드 또는 결합 단백질의 3차원 구조로부터 조사될 수 있다. 많은 폴리펩티드의 X-선 결정학적 구조 및 NMR 구조는 큰 단백질 및 핵산 분자의 3차원 구조 데이터를 보유하는 중앙집중형 데이터베이스(centralized database)인 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)(PDB, www.rcsb.org)에서 이용가능하다. 또한, 3차원 구조 데이타를 이용할 수 없는 경우, 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 조사하기 위한 모델을 만들 수 있다. 따라서, 당업자는 비-천연 아미노산으로 치환시킬 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.
비-천연 아미노산의 도입의 예시적인 부위는 잠재적 수용체 결합 영역 또는 결합 단백질 또는 리간드와의 결합을 위한 영역으로부터 배제된 부위, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있는 부위, 인접 잔기와의 최소한의 수소 결합 상호작용을 갖거나 수소결합 상호작용을 전혀 갖지 않는 부위, 인접 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있는 부위, 특정 폴리펩티드와 그의 결합 수용체, 리간드 또는 결합 단백질의 3차원 결정 구조에 의해 예측될 때 높은 유연성을 갖는 영역에 존재할 수 있는 부위를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
매우 다양한 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내의 소정의 위치에서 치환될 수 있거나 소정의 위치 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입될 특정 비-천연 아미노산은 폴리펩티드와 그의 결합 리간드, 수용체 및/또는 결합 단백질의 3차원 결정 구조의 조사, 보존적 치환에 대한 선호성(즉, Phe, Tyr 또는 Trp이 아릴-기재 비-천연 아미노산, 예를 들면, p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파길티로신으로 치환되는 것), 및 폴리펩티드 단백질 내로 도입하고자 하는 특정한 접합 화학물질을 기초로 하여 선별된다.
한 실시양태에서, 본 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입시키는 단계; 및 상기 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 반응성 기는 방향족 아민 상의 아민 부분이며, 제2 반응성 기는 알데히드이고, 이때 상기 아민 기는 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드의 존재 하에 알데히드와 접촉할 때 환원적으로 알킬화된다. 다른 실시양태에서, 제1 반응성 기는 헤테로방향족 아민 상의 아민 부분이며, 제2 반응성 기는 알데히드이고, 이때 상기 아민 기는 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드의 존재 하에 알데히드와 접촉할 때 환원적으로 알킬화된다.
일부 경우, 비-천연 아미노산 치환 또는 도입은 폴리펩티드 내의 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합되어 다른 생물학적 특징에 영향을 줄 것이다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(단백질분해에 대한 내성을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 증가시키거나 그의 적절한 수용체, 리간드 및/또는 결합 단백질에 대한 폴리펩티드의 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 가용성(이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 목적으로 비-천연 아미노산을 도입하기 위한 또 다른 부위 이외에 천연적으로 코딩된 또는 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 부위가 선별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 결합된 리간드, 결합 단백질 및/또는 수용체에 대한 친화성을 조절하는, 수용체 이량체화를 조절하는(증가시키거나 감소시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화시키는, 순환 반감기를 조절하는, 방출 또는 생체이용성을 조절하는, 정제를 용이하게 하는, 또는 특정한 투여 경로를 개선시키거나 변경시키는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, 폴리펩티드는 검출(GFP를 포함하나 이로 한정되지 않음), 정제, 조직 또는 세포 막을 통한 수송, 프로드러그 방출 또는 활성화, 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특징을 개선시키는 단백질분해효소 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이로 한정되지 않음), 또는 다른 친화성-기재 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 연결된 분자(바이오틴을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
IV . 예로서의 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산을 포함하도록 디자인되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅(exfoliating) 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그(hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린(neurturin), 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자(oncogene) 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀(pleiotropin), 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신(relaxin), 레닌(renin), SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다.
따라서, 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 하기 설명은 설명 및 예시를 위한 목적으로 제공된 것이지 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 또한, 본원에서 GH 폴리펩티드에 대한 언급은 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원의 예로서 포괄적인 용어를 사용하기 위한 것이다. 따라서, GH 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 기재된 변형 및 화학적 기법은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것들을 비롯한 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원에 동일하게 적용될 수 있음을 이해해야 한다.
하기 단백질들은 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 단백질들을 포함한다(문헌[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)] 참조): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리쓰로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀-1(CT-1)("GH 수퍼유전자 패밀리"). 향후, 유전자 클로닝 및 시퀀싱을 통해 이 유전자 패밀리의 추가 구성원이 확인될 것으로 기대된다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 갖는다는 사실에도 불구하고 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징은 상기 유전자 패밀리의 신규 구성원이 용이하게 확인될 수 있게 하고, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에 유사하게 적용된다.
G-CSF(문헌[Zink et al., FEBS Lett. 314: 435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33: 8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167 (1993)] 참조), GM-CSF(문헌[Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224: 1075-1085 (1992)] 참조), IL-2(문헌[Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412(1992)] 참조), IL-4(문헌[Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035(1991); Powers et al., Science 256: 1673-1677 (1992)] 참조), 및 IL-5(문헌[Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)] 참조)를 비롯한 다수의 사이토카인의 구조가 X선 회절 및 NMR 연구에 의해 결정되었으며, 상당한 1차 서열 상동성이 결여되어 있음에도 불구하고 GH 구조에서의 현저한 보존성을 보인다. IFN은 모델링 및 다른 연구에 기초할 때 이 패밀리의 구성원인 것으로 간주되고 있다(문헌[Lee et al., J. Growth hormone Cytokine Res. 15: 341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17: 62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274: 661 (1997)] 참조). 알파, 베타, 오메가, 타우, 엡실론 및 감마 인터페론과 같은 IFN뿐만 아니라 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 트롬보포이에틴(TPO), 온코스타틴 M, 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)를 포함하는 상당수의 추가 사이토카인 및 성장 인자들이 이 패밀리에 속한다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and IhIe (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS] 검토). 현재 상기 사이토카인 및 성장 인자들 모두가 하나의 큰 유전자 패밀리를 구성하는 것으로 간주된다.
이 패밀리의 구성원은 유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 외에도, 세포 표면 수용체를 반드시 올리고머화시켜 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시키는 성질을 공유한다. GH 및 EPO를 포함하나 이들로 한정되지 않는 일부 GH 패밀리 구성원은 단일 유형의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 동종이량체를 형성하게 한다. IL-2, IL-4 및 IL-6을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 패밀리 구성원은 하나 이상의 유형의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 이종이량체 또는 보다 높은 차수의 응집물을 형성하게 한다(문헌[Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)] 참조). 돌연변이유발 연구는 GH와 마찬가지로 다른 사이토카인 및 성장 인자들도 다수의 수용체 결합 부위, 전형적으로 2개의 수용체 결합 부위를 함유하고, 그들의 동족(cognate)수용체에 순차적으로 결합한다는 것을 밝혀냈다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476] 참조). GH와 마찬가지로, 이러한 다른 패밀리 구성원에 대한 1차 수용체 결합 부위는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에서 발생한다. 수용체 결합에 참여하는 나선 다발 내의 특정 아미노산은 상기 패밀리 구성원 사이에 서로 상이하다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 관련되어 있고, 제2의 큰 다중-유전자 패밀리를 포함한다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제6,608,183호를 참조할 수 있다.
GH 수퍼유전자 패밀리의 다양한 구성원의 돌연변이 연구로부터 얻은 일반적인 결론은, 일반적으로 알파 나선을 연결시키는 루프는 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 점이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 전부는 아니더라도 대부분의 패밀리 구성원에서 수용체 결합에 대해 필수적이지 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, B-C 루프는 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에서 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, A-B 루프, C-D 루프(및 GH 수퍼패밀리의 인터페론/IL-10 유사 구성원의 D-E 루프)도 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, 나선 A에 근접해 있으며, 최종 나선에 멀리 떨어져 있는 아미노산도 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 또한 비-천연 아미노산을 도입하기 위한 부위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 루프 구조 내의 임의의 위치에서 치환된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산 내에서 치환된다.
EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12, p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하나 이들로 한정되지 않는 GH 패밀리의 특정 구성원은 N-연결 및/또는 O-연결 당을 함유한다. 단백질 내의 글리코실화 부위는 거의 루프 영역에서만 발생하고 알파 나선 다발에서는 발생하지 않는다. 일반적으로, 루프 영역은 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유결합에 대한 부위이기 때문에, 이들은 비-천연 아미노산 치환을 단백질 내로 도입하기에 유용한 부위일 수 있다. 단백질에서 N-연결 글리코실화 부위 및 O-연결 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산은 표면에 노출되기 때문에 비-천연 아미노산 치환을 위한 부위일 수 있다. 따라서, 천연 단백질은 이들 부위에서 단백질에 부착되는 용적이 큰(bulky) 당 기를 허용할 수 있고, 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위로부터 떨어져 위치하는 경향이 있을 수 있다.
향후, 추가 GH 수퍼유전자 패밀리의 추가 구성원이 발견될 가능성이 크다. 예측되는 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석 및 특정 표적에 결합하는 분자를 확인하도록 디자인된 선별 기법에 의해 GH 수퍼유전자 패밀리의 신규 구성원이 확인될 수 있다. 전형적으로, GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 비-나선 아미노산(루프 영역)에 의해 연결된 4개의 또는 5개의 양친매성 나선을 갖는다. 단백질은 그들의 N-말단에서 소수성 신호 서열을 함유하여 세포로부터의 분비가 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 추후 발견될 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물 내에 포함된다.
V. 비-천연 아미노산
하기 4종의 성질 중 하나 이상의 성질을 갖는 한 매우 다양한 비-천연 아미노산이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합하다: (1) 비-천연 아미노산의 측쇄 상의 하나 이상의 작용기가 20종의 공통된 유전적으로 코딩된 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학적 반응성에 대해 오르토고날하거나 또는 적어도 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 존재하는 천연 발생 아미노산의 화학적 반응성에 오르토고날한 1종 이상의 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 가짐; (2) 도입된 비-천연 아미노산이 20종의 공통된 유전적으로 코딩된 아미노산에 대한 실질적인 화학적 불활성을 나타냄; (3) 바람직하게는 천연 발생 아미노산과 동등한 정도로 안정적으로 또는 전형적인 생리학적 조건 하에서 비-천연 아미노산을 안정하게 도입할 수 있고, 더 바람직하게는 이러한 도입은 생체내 시스템을 통해 일어날 수 있음; 및 (4) 비-천연 아미노이 바람직하게는, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 성질을 파괴하지 않는 조건 하에서 (물론 이러한 파괴가 변형/변환을 목적으로 하지 않는 경우) 시약과 반응시킴으로써 방향족 아민, 헤테로방향족 아민, 또는 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민으로 전환될 수 있는 작용기를 포함하고, 이때 변환이 약 4 내지 약 10의 pH에서 수성 조건 하에 일어날 수 있거나, 비-천연 아미노산 상의 반응성 부위가 친핵성 부위임. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 비-천연 아미노산에 대한 이들 4종의 성질을 만족시키는 아미노산의 예시적 비-제한적 예는 도면 및 본 명세서 전체에 제공되어 있다. 임의의 수의 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 비-천연 아미노산은 보호된 또는 차폐된 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민을 포함할 수 있고, 이로써 탈보호 또는 비-차폐 시 보호된 또는 차폐된 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민은 방향족 아민 또는 헤테로방향족 아민으로 변환될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합할 수 있는 다른 비-천연 아미노산으로는 광활성화성 가교-링커를 포함하는 아미노산, 스핀-표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 신규 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이징성 및/또는 광이성질체화성 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면 당 치환된 세린, 다른 탄수화물에 의해 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단될 수 있고/있거나 광절단될 수 있는 아미노산, 약 5개 이상 또는 약 10개 이상의 탄소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결 당 함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라진 및 O-만노사미닐-L-세린이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 아미노산과 사카라이드 사이의 천연 발생 N-연결 또는 0-연결이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 상태에서 통상적으로 발견되지 않는 공유결합에 의해 교체되어 있는 예시적 아미노산들이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 천연 발생 단백질에서는 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예를 들면 2-데옥시-글루코즈, 2-데옥시갈락토즈 등이 있다.
비천연 아미노산을 통해 단백질 내로 도입될 수 있는 화학적 부분은 다양한 이점 및 단백질의 개조를 제공한다. 예를 들면, 중원자 비-천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는 데 유용할 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자의 위치를 선별하는 데 있어서 선별성 및 유연성을 제공한다. 예를 들면, 광반응성 비-천연 아미노산(벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나 이로 한정되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않음)은 단백질의 효율적인 생체내 및 시험관내 광가교연결을 가능하게 한다. 광반응성 비-천연 아미노산의 예로는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 그 다음, 광반응성 기-제공 일시적 조절(temporal control)의 흥분에 의해 광반응성 비-천연 아미노산을 갖는 단백질을 마음대로 가교 결합시킬 수 있다. 일례로, 비-천연 아미노의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광법의 사용을 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 국소 구조적 및 역학적 프로브인 동위원소로 표지된 메틸 기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 기로 치환될 수 있다.
A. 비-천연 아미노산의 구조 및 합성: 알킬화 방향족 아민 기
친핵성 반응 기 예컨대, 방향족 아민 기(2차 및 3차 아민 기를 포함함), 차폐된 방향족 아민 기(방향족 아민 기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 방향족 아민 기(탈보호 시 방향족 아민 기와 유사한 반응성을 나타냄)를 가진 비-천연 아미노산은 알데히드 함유 시약을 사용한 환원성 알킬화 반응을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 반응을 통해 분자를 연결할 수 있게 한다. 이러한 방향족 아민 함유 비-천연 아미노산은 하기 화학식 A로 표시되는 아미노산을 포함한다:
[화학식 A]
Figure 112013073088060-pat00002
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00003
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
(본 명세서의 예에서 제시된 바와 같이) 화학식
Figure 112013073088060-pat00004
은 "A", "B", "NH-M" 및 "Ra"의 상대적 배향을 제공하지 않고, 오히려 이 화학식의 이들 4개의 특징적 치환기는 본 명세서의 예에 의해 예시된 바와 같이 (이 화학식의 다른 특징적 치환기와 함께) 임의의 화학적으로 안정한 방식으로 배향될 수 있다.
화학식 A의 구조를 가진 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식 I의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 II의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 III의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 IV의 비-천연 아미노산 및 하기 화학식 V의 비-천연 아미노산이 있다:
Figure 112013073088060-pat00005
상기 식에서,
A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00006
로부터 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00007
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
화학식 A로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 비-제한적 예로는 하기 화학식 VI의 비-천연 아미노산 및 하기 화학식 VII의 비-천연 아미노산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00008
상기 식에서,
G는 아민 보호기 하기 화학식의 기이다:
Figure 112013073088060-pat00009
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure 112013073088060-pat00010
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분(moiety)은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다. 또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다.
화학식 A로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 다른 비-제한적 예는 도 2 내지 10에 나타나 있다. 또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다.
화학식 A의 화합물의 합성의 비-제한적 예는 도 11 내지 13에 나타나 있다. 이러한 예는 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 합성을 보여주는데, 이때 생성된 아민 부분은 1차 또는 2차 아민이다. 또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
화학식 A로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 비-제한적 형성은 도 14에 나타나 있는데, 이때 예를 들어 화학식 A의 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산의 방향족 부분 상의 보호된 또는 차폐된 아민 부분의 환원에 의해 형성될 수 있다. 보호된 또는 차폐된 아민 부분으로는 이민, 히드라진, 니트로 또는 아지드 치환기가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 보호된 또는 차폐된 아민 부분을 환원시키는 데 사용되는 환원제로는 TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, NaBH4 또는 NaBCNH3이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 보호된 또는 차폐된 아민 부분을 함유하는 이러한 비-천연 아미노산은 하기 화학식 B로 표시된다:
화학식 B]
Figure 112013073088060-pat00011
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00012
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Y는 -NH-NH2, -NH-NHR', -CR'=NR', -NO2 또는 -N3이고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다.
(본 명세서의 예에서 제시된 바와 같이) 화학식
Figure 112013073088060-pat00013
은 "A", "B", "Y" 및 "Ra"의 상대적 배향을 제공하지 않고, 오히려 이 화학식의 이들 4개의 특징적 치환기는 본 명세서의 예에 의해 예시된 바와 같이 (이 화학식의 다른 특징적 치환기와 함께) 임의의 화학적으로 안정한 방식으로 배향될 수 있다.
화학식 B로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식 VIII의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 IX의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 X의 비-천연 아미노산 및 하기 화학식 XI의 비-천연 아미노산이 있다:
Figure 112013073088060-pat00014
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 이러한 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산 번역 도중에 폴리펩티드 내로 도입된 후 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 일부로서 화학식 A의 비-천연 아미노산을 형성하도록 환원에 의해 번역 후 변형될 수도 있다. 또한, 화학식 B의 비-천연 아미노산은 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 내로 도입된 후, 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드의 일부로서 화학식 A의 비-천연 아미노산을 형성하도록 환원될 수도 있다. 그 후, 화학식 A의 이러한 도입된 비-천연 아미노산은 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
보호된 또는 차폐된 아민 부분을 함유하는 이러한 비-천연 아미노산의 다른 비-제한적 예는 도 15에 나타나 있다.
B. 비-천연 아미노산의 구조 및 합성: 알킬화 방향족 아민 기
친핵성 반응 기 예컨대, 방향족 아민 기(2차 및 3차 아민 기를 포함함), 차폐된 방향족 아민 기(방향족 아민 기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 방향족 아민 기(탈보호 시 방향족 아민 기와 유사한 반응성을 나타냄)를 가진 비-천연 아미노산은 알데히드 함유 시약을 사용한 환원성 알킬화 반응을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 반응을 통해 분자를 연결할 수 있게 한다. 이러한 알킬화 비-천연 아미노산은 하기 화학식 C의 아미노산을 포함한다:
[화학식 C]
Figure 112013073088060-pat00015
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00016
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
(본 명세서의 예에서 제시된 바와 같이) 화학식
Figure 112013073088060-pat00017
은 "A", "B", "N(M)CH2R5" 및 "Ra"의 상대적 배향을 제공하지 않고, 오히려 이 화학식의 이들 4개의 특징적 치환기는 본 명세서의 예에 의해 예시된 바와 같이 (이 화학식의 다른 특징적 치환기와 함께) 임의의 화학적으로 안정한 방식으로 배향될 수 있다.
화학식 C로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식 XII의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 XIII의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 XIV의 비-천연 아미노산, 하기 화학식 XV의 비-천연 아미노산 및 하기 화학식 XVI의 비-천연 아미노산이 있다:
Figure 112013073088060-pat00018
상기 식에서,
A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00019
로부터 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00020
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
화학식 C로 표시되는, 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 다른 비-제한적 예는 도 8 내지 10에 나타나 있다. 또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
화학식 C의 화합물은 케톤, 에스테르, 티오에스테르 및 알데히드와 같은 카르보닐 함유 시약을 사용한 화학식 A의 화합물의 환원성 알킬화에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 알데히드 함유 시약은 하기 화학식에 상응하는 구조를 가질 수 있다:
Figure 112013073088060-pat00021
상기 식에서,
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나; 또는
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
화학식 B의 하기 다른 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-제한적 예이다:
Figure 112013073088060-pat00022
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-(이때, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
화학식 C의 하기 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 알킬화 비-천연 아미노산의 비-제한적 예이다:
Figure 112013073088060-pat00023
Figure 112013073088060-pat00024
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고, 경우에 따라 환원적으로 알킬화된다.
화학식 C의 아미노산을 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-제한적 예시적 합성은 도 15에 나타나 있고, 이때 폴리펩티드 내에 함유된 화학식 B의 비-천연 아미노산의 차폐된 아민 부분이 먼저 환원되어 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입된 방향족 아민 부분을 함유하는 화학식 A의 비-천연 아미노산을 제공한다. 그 다음, 이러한 방향족 아민 부분은 전술한 카르보닐 함유 시약에 의해 환원적으로 알킬화되어 화학식 C의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 반응은 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 또한, 이러한 반응은 도입되지 않은 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 차폐된 아민 부분을 환원시키는 데 사용된 환원제로는 TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6 및 NaBH4가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 환원성 알킬화는 pH가 약 4 내지 약 7인 수성 완충제 중에서 약한 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드(NaBCNH3)를 사용하여 수행할 수 있다. TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6, B2H6 및 NaBH4를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 환원제도 환원성 알킬화에 사용될 수 있다.
화학식 A의 비-천연 아미노산에 함유된 2차 방향족 아민 부분을 전술한 카르보닐-함유 시약을 사용하여 환원성 알킬화시킴에 의한 화학식 C의 아미노산 함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-제한적 예시적 합성이 도 16에 나타나 있다. 이러한 환원성 알킬화는 3차 방향족 아민 부분을 가진 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 반응은 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 또한, 이러한 반응은 도입되지 않은 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 환원성 알킬화는 pH가 약 4 내지 약 7인 수성 완충제 중에서 약한 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드(NaBCNH3)를 사용하여 수행할 수 있다. TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6, 및 NaBH4를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 환원제도 환원성 알킬화에 사용될 수 있다.
화학식 C의 화합물은 디케톤, 케토알데히드 및 디알데히드를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 2개 이상의 카르보닐 부분을 함유하는 시약을 사용한 화학식 A의 화합물의 환원적 알킬화에 의해 형성될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 시약은 하기 화학식에 상응하는 구조를 가질 수 있다:
Figure 112013073088060-pat00025
또는
Figure 112013073088060-pat00026
상기 식에서,
R1 각각은 H, 경우에 따라 치환된 알킬, 경우에 따라 치환된 알켄, 경우에 따라 치환된 알킨, 경우에 따라 치환된 시클로알킬, 경우에 따라 치환된 헤테로시클, 경우에 따라 치환된 아릴 및 경우에 따라 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환 헤테로시클로알킬렌, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")-, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")-, 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR"-이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-(이때, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
n은 1, 2 또는 3이다.
C. 비-천연 아미노산의 합성 및 구조: 아민화 아미노산
친전자성 반응 기 예컨대, 알데히드 기, 차폐된 알데히드 기(알데히드 기로 용이하게 전환될 수 있는 작용기임), 또는 보호된 방향족 아민 기(탈보호 시 방향족 아민 기와 유사한 반응성을 나타냄)를 가진 비-천연 아미노산은 방향족 아민 함유 시약을 사용한 환원성 아민화 반응을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 반응을 통해 분자를 연결할 수 있게 한다. 이러한 아민화 비-천연 아미노산은 하기 화학식 D의 아미노산을 포함한다:
[화학식 D]
Figure 112013073088060-pat00027
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R")-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R")S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R")=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
Figure 112013073088060-pat00028
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이다.
(본 명세서의 예에서 제시된 바와 같이) 화학식
Figure 112013073088060-pat00029
은 "A", "B", "Ra" 및 선과 구불구불한 곡선으로 표시된 나머지 치환기의 상대적 배향을 제공하지 않고, 오히려 상기 화학식의 이들 4개의 특징적 치환기는 본 명세서의 예에 의해 예시된 바와 같이 (이 화학식의 다른 특징적 치환기와 함께) 임의의 화학적으로 안정한 방식으로 배향될 수 있다.
보호된 알데히드 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 한 실시양태는 하기 화학식 E로 표시된다:
[화학식 E]
Figure 112013073088060-pat00030
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R")-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-으로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
R6은 알데히드, 보호된 알데히드 또는 차폐된 알데히드이고, 이때 보호기로는
Figure 112013073088060-pat00031
이 있으나, 이들로 한정되지 않고, 이때 X1 각각은 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 이때 R' 및 R 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 이러한 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입된 후 탈보호되어 "동일 반응계"에서 알데히드 기를 형성한 다음, 방향족 아민 함유 시약을 사용한 상기 알데히드의 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형됨으로써 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 일부로서 화학식 D의 비-천연 아미노산을 형성할 수도 있다. 또한, 화학식 E의 비-천연 아미노산은 중합체 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고 탈보호되어 "동일 반응계"에서 알데히드 기를 형성한 후, 방향족 아민 함유 시약을 사용한 상기 알데히드의 환원성 아민화에 의해 상기 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 화학식 D의 비-천연 아미노산을 형성할 수도 있다.
보호된 알데히드 부분을 함유하는 이러한 비-천연 아미노산의 비-제한적 예는 도 17에 나타나 있다.
화학식 D의 화합물은 화학식 E의 화합물의 알데히드 기의 탈보호 후 방향족 아민 함유 시약을 사용한 화학식 D의 화합물의 환원성 아민화에 의해 형성될 수 있다. 이러한 방향족 아민 함유 시약은 하기 화학식에 상응하는 구조를 가진다:
Figure 112013073088060-pat00032
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00033
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
M은 H 또는 -CH2R5이며;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬이다.
화학식 D의 아미노산을 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-제한적 예시적 합성은 도 18에 나타나 있고, 이때 폴리펩티드 내에 함유된 화학식 E의 비-천연 아미노산의 보호된 알데히드 부분이 먼저 탈보호되어 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입된 알데히드 부분을 함유하는 비-천연 아미노산을 제공한다. 그 다음, 이러한 알데히드 부분을 전술한 방향족 아민 함유 시약으로 환원적으로 아민화시켜 화학식 D의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 반응은 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 또한, 이러한 반응은 도입되지 않은 비-천연 아미노산에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 보호된 알데히드는 산 촉매에 의해 촉진되는 탈보호에 의해 탈보호된다. 예를 들어, 환원성 아민화는 pH가 약 4 내지 약 7인 수성 완충제 중에서 약한 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드(NaBCNH3)를 사용하여 수행할 수 있다. TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6 및 NaBH4를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 환원제도 환원성 알킬화에 사용될 수 있다.
화학식 A의 비-천연 아미노산의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화에 의한 화학식 C의 비-천연 아미노산의 형성의 비-제한적인 대표적 예, 및 화학식 E의 비-천연 아미노산 상의 탈보호된 알데히드 부분의 환원성 아민화에 의한 화학식 D의 비-천연 아미노산의 형성의 비-제한적인 대표적 예가 도 19에 나타나 있다. 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성이 도 19에 나타나 있고, 이때 화학식 A의 비-천연 아미노산의 방향족 아민 부분만이 환원적으로 알킬화되는 반면, 다른 아민 부분, 티올 및 이황화 결합은 사용된 반응 조건 하에서 환원되지 않거나 반응하지 않는다. 또한, 환원성 아민화 반응의 특이성 및 선별성이 도 19에 나타나 있고, 이때 화학식 E의 비-천연 아미노산의 탈보호된 알데히드 부분만이 환원적으로 아민화되는 반면, 다른 카르복실레이트 부분, 티올 및 이황화 결합은 사용된 반응 조건 하에서 환원되지 않거나 반응하지 않는다. 이러한 선별적 부위 특이적 유도화, 환원성 알킬화 또는 환원성 아민화 반응은 작용제 및/또는 길항제, 폴리펩티드/단백질의 부위 특이적 PEG화, 폴리펩티드/단백질의 부위 특이적 접합, 프로드러그 디자인, 폴리펩티드/단백질 글리코실화, 폴리펩티드/단백질 이량체화, 폴리펩티드/단백질의 소분자 약물 접합체, 및 항체의 소분자 약물 접합체를 디자인하기 위한 폴리펩티드/단백질의 변형을 가능하게 할 수 있다.
환원성 알킬화 또는 환원성 아민화 반응을 사용한 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 변형은 하기 장점들 중 임의의 또는 모든 장점을 가진다. 첫째, 약 4 내지 약 10의 pH 범위(일부 실시양태에서, 약 4 내지 약 7의 pH 범위)에서 알데히드 및 케톤을 비롯한 카르보닐-함유 화합물로 방향족 아민을 환원적으로 알킬화시켜 2차 및 3차 아민을 비롯한 치환 아민 연결을 생성할 수 있다. 둘째, 이 반응 조건 하에서 화학 반응은 천연 발생 아미노산의 측쇄가 반응성을 나타내지 않기 때문에 비-천연 아미노산에 대한 선별성을 나타낸다. 이것은 방향족 아민 부분 또는 보호된 알데히드 부분을 함유하는 비-천연 아미노산이 도입된 폴리펩티드(예를 들어, 재조합 단백질을 포함함)의 부위 특이적 유도화를 허용한다. 이로써, 이러한 유도화 폴리펩티드 및 단백질은 소정의 균질한 생성물로서 제조될 수 있다. 셋째, 폴리펩티드 내로 도입된 아미노산 상의 방향족 아민 부분과 알데히드 함유 시약의 반응에 영향을 미치기 위해 필요한 온화한 조건은 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외됨). 유사하게, 폴리펩티드 내로 도입된 아미노산 상의 알데히드 부분과 방향족 아민 함유 시약의 반응에 영향을 미치기 위해 필요한 온화한 조건은 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외됨). 넷째, 반응이 실온에서 신속히 일어나기 때문에, 보다 높은 온도에서 불안정한 많은 종류의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나기 때문에, 비-수용액과 함께 (임의의 정도까지) 상용될 수 없는 폴리펩티드 및 시약을 사용할 수 있다. 여섯째, 시약에 대한 폴리펩티드 또는 아미노산의 비가 화학양론적, 화학양론적-유사 또는 거의-화학양론적인 경우에도 반응이 용이하게 일어나기 때문에, 유용한 양의 반응 생성물을 얻기 위해 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가할 필요가 없다. 일곱째, 생성된 아민이 반응물의 아민 및 카르보닐 부분의 디자인에 따라 위치선별적 및/또는 위치특이적으로 생성될 수 있다. 마지막으로, 알데히드 함유 시약을 사용한 방향족 아민의 환원성 알킬화, 및 방향족 아민 함유 시약을 사용한 알데히드의 환원성 아민화는 생물학적 조건 하에서 안정한 2차 및 3차 아민을 비롯한 아민 연결을 생성한다.
시스테인 잔기에 인접한 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화의 특이성 및 선별성의 비-제한적 예가 도 20에 나타나 있다. 프로피온알데히드(I) 또는 벤즈알데히드(II)를 사용한 환원된 유로텐신-II(UT-II-SH)의 환원성 알킬화는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 자유 티올 기가 반응하지 않는다는 것을 보여준다. 약 2시간인 반응 속도, 환원된 유로텐신-II(UT-II-SH)와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계가 도 20에 나타나 있다. 또한, UT-II-SH, I 및 II에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
시스테인 잔기에 인접한 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화의 특이성 및 선별성의 비-제한적 예가 도 21에 나타나 있다. 프로피온알데히드(I) 또는 벤즈알데히드(II)를 사용한 환원된 유로텐신-II(UT-II-SH)의 환원성 알킬화는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 약 2시간인 반응 속도, 환원된 유로텐신-II(UT-II-SH)와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계가 도 21에 나타나 있다. 또한, UT-II-SH, I 및 II에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
말단 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성의 추가 비-제한적 예가 도 22에 나타나 있고, 이때 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 XT-8의 환원성 알킬화는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 약 2시간인 반응 속도, XT-8과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계가 도 22에 나타나 있다. 또한, XT-8, I, II, III 및 IV에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
다양한 N-말단 아미노산에 인접한 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성의 추가 비-제한적 예가 도 23 내지 27에 나타나 있다. 도 23에서, 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 SXT-9(N-말단 세린)의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, SXT-9와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 23은 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-Ser 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, SXT-9, I, II, III 및 IV에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
도 24에서, 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 HXT-9(N-말단 히스티딘)의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, HXT-9와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 24는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-His 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, HXT-9, I, II, III 및 IV에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
도 25에서, 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 WXT-9(N-말단 트립토판)의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, WXT-9와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 25는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-Trp 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, WXT-9, I, II 및 III에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
도 26에서, 프로피온알데히드(I), 벤즈알데히드(II), 이소부트알데히드(III) 및 피발알데히드(IV)를 사용한 펩티드 NXT-9(N-말단 아스파라진)의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, NXT-9와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 26은 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-Asn 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, NXT-9, I 및 II에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
도 27에서, 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 펩티드 RXT-10(N-말단 아르기닌)의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, RXT-10과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 27은 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-Arg 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, RXT-10, I 및 II에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성의 추가 비-제한적 예가 도 28에 나타나 있고, 이때 프로피온알데히드(I) 및 벤즈알데히드(II)를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, AXT-11과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 28은 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않으며, N-Ala 잔기가 선별성에 대한 최소한의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, AXT-11, I 및 II에 대한 MS 데이타가 제시되어 있다.
다양한 알데히드 함유 시약을 사용한 펩티드 내의 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성의 추가 비-제한적 예가 도 29 및 30에 나타나 있다. 도 29에서, 다양한 알데히드 함유 시약을 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화는 약 5시간인 반응 속도, AXT-11과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 29는 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않는다는 것을 보여준다. AXT-11, I, II 및 III에 대한 MS 데이타도 제시되어 있다. 도 30에서, 다양한 헤테로 방향족 알데히드 함유 시약을 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화는 약 5시간인 반응 속도, AXT-11과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 30은 하나의 생성물이 각각의 반응으로부터 우세하게 형성되고, 이황화 결합이 반응하지 않는다는 것을 보여준다. AXT-11, IV, V 및 VI에 대한 MS 데이타도 제시되어 있다.
도 31 내지 33은 펩티드 내의 아미노산 잔기 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화 반응의 특이성 및 선별성의 추가 비-제한적 예를 보여주고, 이때 방향족 아민 부분은 알데히드 함유 시약, 케톤 함유 시약 또는 이들의 혼합물과 반응한다. 도 31에서, 알데히드 함유 시약, 케톤 함유 시약 또는 이들의 혼합물을 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, AXT-11과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 31은 이용된 반응 조건 하에서 알데히드 함유 시약만이 방향족 아민 부분과 반응하고 하나의 생성물만이 우세하게 형성된다는 것을 보여준다. 또한, 이황화 결합은 반응하지 않았다. 도 32에서, 알데히드 함유 시약, 케톤 함유 시약 또는 이들의 혼합물을 사용한 펩티드 NXT-9의 환원성 알킬화는 약 2시간인 반응 속도, NXT-10과 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여준다. 또한, 도 32는 이용된 반응 조건 하에서 알데히드 함유 시약만이 방향족 아민 부분과 반응하고 하나의 생성물만이 우세하게 형성된다는 것을 보여준다. 또한, 이황화 결합은 반응하지 않았다. 도 33에서, 알데히드 함유 시약, 케톤 함유 시약 또는 이들의 혼합물을 사용한 펩티드 MXT-9의 환원성 알킬화는 이용된 반응 조건 하에서 알데히드 함유 시약만이 방향족 아민 부분과 반응하고 하나의 생성물만이 우세하게 형성된다는 것을 보여준다. 또한, 이황화 결합은 반응하지 않았다.
펩티드 내의 아미노산 상의 보호된 (또는 차폐된) 방향족 아민 부분의 탈보호(또는 비-차폐) 후, 다양한 알데히드 함유 시약을 사용한 생성된 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화의 비-제한적 예는 도 34에 나타나 있다. TCEP를 사용한 펩티드 MXT-9-N3 상의 아지드의 환원은 펩티드 MXT-9NH2(I) 상의 1차 방향족 아민 부분을 제공한다. 그 다음, 프로피온알데히드(II) 또는 벤즈알데히드(III)를 사용한 MXT-9NH2(I)의 후속 환원성 알킬화는 상응하는 알킬화 펩티드를 제공한다. 도 34는 보호된 또는 차폐된 아민 기의 도입 후 방향족 아민 부분을 형성하는 능력을 보여준다. 약 1시간인 반응 속도, MXT-9NH2(I)와 각각의 알데히드 함유 시약 사이의 화학양론적 또는 거의-화학양론적인 관계를 보여주고, 하나의 생성물만이 우세하게 형성되었으며, 티올 기는 반응하지 않았다.
D. 비-천연 아미노산의 세포 흡수
세포에 의한 비-천연 아미노산 흡수는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 목적을 포함하나 이로 한정되지 않는 목적을 위해 비-천연 아미노산을 디자인하고 선별하는 경우 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포를 투과하지 못할 수 있음을 암시한다. 천연 아미노산은 단백질-기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵세포 내로 흡수된다. 존재한다면 어떤 비-천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 검색을 수행할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 완전히 참고로 도입되는 미국특허 공보 제2004/198637호(발명의 명칭: "단백질 어레이"); 및 문헌[Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에서의 독성 분석을 참조할 수 있다. 흡수는 다양한 분석을 이용하여 용이하게 분석되지만, 세포 흡수 경로를 따라 흡수될 수 있는 비-천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생체내에서 아미노산을 생성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
E. 비-천연 아미노산의 생합성
아미노산 및 다른 화합물을 생성하는 많은 생합성 경로들이 세포에 이미 존재한다. 특정 비-천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는 자연계에 존재할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비-천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 경우에 따라 신규 효소를 첨가하거나 존재하는 숙주 세포 경로를 변경함으로써 숙주 세포에서 생성된다. 새로운 추가 효소로는 경우에 따라 천연 발생 효소 또는 인공적으로 유도된 효소가 있다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성(국제특허공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입")의 실시예에서 제공됨)은 다른 유기체로부터의 공지된 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 이 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 원하는 화합물을 합성하는 효소적 경로를 제공한다. 경우에 따라 첨가되는 효소 종류의 예는 하기 실시예에서 제공된다. 추가 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크(Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 유도된 효소는 경우에 따라 동일한 방식에 의해 세포 내로 첨가된다. 이 방식으로, 세포 기구 및 세포 자원을 개조하여 비-천연 아미노산을 생성한다.
신규 효소를 제조하기 위한 다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용 또는 현존하는 경로의 진화를 위해 이용가능하다. 경우에 따라, 예를 들면, 멕시겐, 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 maxygen.com에서 입수가능)에 의해 개발된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 신규 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 유사하게, 제넨코르(Genencor)(월드 와이드 웹 genencor.com에서 입수가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)TM는 경우에 따라 세포 내에서 0-메틸-L-티로신을 생성하는 경로를 조작하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기법은 기능 유전체학 및 분자의 진화 및 디자인을 통해 확인된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 신규 유전자의 조합물을 사용하여 숙주 유기체 내에서 기존 경로를 재구성한다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 상의 diversa.com에서 입수가능)도 새로운 경로를 찾기 위한 목적을 포함하나 이로 한정되지 않는 목적을 위한 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리의 신속한 검색 기법을 제공한다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 유전공학적으로 개조된 생합성 경로를 사용하여 생성된 비-천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시키는 정도는 아니지만 천연 세포 내에서의 양을 포함하나 이로 한정되지 않는 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생성된다. 이 방식으로 생체내에서 생성되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로에 바람직한 효소를 생성하는 데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고, 비-천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라, 생체내 선별을 이용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 생장 둘 다에 대해 비-천연 아미노산의 생성을 더 최적화시킨다.
F. 추가 합성 방법
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산은 당업계에 공지된 방법을 이용하거나, 본 명세서에 기재된 기법을 이용하거나, 이들을 병용함으로써 합성할 수 있다. 보조적으로, 하기 표는 원하는 작용기를 생성하도록 조합될 수 있는 다양한 출발 친전자체 및 친핵체를 제공한다. 제공된 정보는 설명을 위한 것이지 본 명세서에 기재된 합성 기법을 한정하고자 하는 것이 아니다.
표: 공유결합 및 이들의 전구체의 예
Figure 112013073088060-pat00034
일반적으로, 탄소 친전자체는 탄소 친핵체를 비롯한 상보적 친핵체에 의해 공격받기 쉬운데, 이때 공격 친핵체는 친핵체와 탄소 친전자체 사이의 새로운 결합을 형성하도록 탄소 친전자체에 전자 1쌍을 제공한다. 적절한 탄소 친핵체로는 알킬, 알케닐, 아릴 및 알키닐 그리그나드, 유기리튬, 유기아연, 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-주석 시약(유기스타난), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-보란 시약(유기보란 및 유기보로네이트)이 있으나, 이들로 한정되지 않으며; 이들 탄소 친핵체들은 물 또는 극성 유기 용매 중에서 동역학적으로 안정하다는 장점을 가진다. 다른 탄소 친핵체로는 인 일리드, 에놀 및 에놀레이트 시약이 있고; 이들 탄소 친핵체들은 합성 유기 화학 분야에서 숙련된 자에게 잘 공지된 전구체들로부터 비교적 용이하게 생성된다는 장점을 가진다. 탄소 친핵체는 탄소 친전자체와 함께 사용된 경우 탄소 친핵체와 탄소 친전자체 사이의 새로운 탄소-탄소 결합을 발생시킨다.
탄소 친전자체에의 커플링에 적합한 비-탄소 친핵체로는 1차 및 2차 아민, 티올, 티올레이트 및 티오에테르, 알코올, 알콕시드, 아지드, 세미카르바지드 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이들 비-탄소 친핵체들은 탄소 친전자체들과 함께 사용된 경우 전형적으로 헤테로원자 연결(C-X-C)을 발생시키고, 이때 X는 헤테로원자, 예를 들어, 산소 또는 질소이다.
VI . 비-천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입시킨다. 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 임의의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한 폴리펩티드 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조의 파괴가 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 목적 중 하나인 경우가 아니라면 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는다. 또한, 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입함으로써 활성(예를 들어, 폴리펩티드의 치료 효과의 개질, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질의 조절(예컨대, 수용성 및 생체이용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 태그, 표지 또는 검출가능한 신호의 폴리펩티드 내로의 도입, 폴리펩티드의 단리 성질의 개선, 및 전술한 변형의 임의의 조합) 및/또는 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 3차 구조를 어느 정도까지 개질시키면서 상기 활성 및/또는 3차 구조를 완전히 파괴하지 않을 수 있다. 활성 및/또는 3차 구조의 이러한 변형은 종종 이러한 도입을 수행하는 목적 중 하나이지만, 물론 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입한 것이 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조에 거의 영향을 미치지 않을 수도 있다. 따라서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 제조 방법, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 정제, 단리 및 특징규명 방법, 및 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 인정된다. 또한, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드(예를 들어, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연-발생 아미노산 폴리펩티드를 포함함)에 연결될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 또는 비-생합성적으로 제조될 수 있다. "생합성적으로"라 함은 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보좀 중 하나 이상을 사용하는 임의의 방법을 의미한다. "비-생합성적"이라 함은 번역 시스템을 사용하지 않는 임의의 방법을 의미하고, 이 방법은 고체 상태 펩티드 합성 방법, 고체상 펩티드 합성 방법, 하나 이상의 효소를 사용하는 방법, 및 하나 이상의 효소를 사용하지 않는 방법으로 더 분류될 수 있고; 또한, 이 하위-분류들 중 임의의 분류는 중첩될 수 있고, 많은 방법들이 이들 하위-분류들을 이용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 성장 호르몬 수퍼유전자의 임의의 폴리펩티드 구성원과의 상동성을 나타낼 수도 있다. 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산을 도입할 수 있는 펩티드/단백질의 비-제한적 예는 도 20 내지 34에 나타나 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 추가 변형될 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 추가 변형 없이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 내로의 비-천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능 변화의 조정(tailoring), 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 단백질분해효소 표적 부위의 접근용이성의 변화, 부분에 대한 표적화(단백질 어레이의 경우를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 변화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증강되거나 또는 심지어 완전히 새로운 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 경우에 따라 비-천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 성질들을 변화시킨다: 독성, 생체분포(biodistribution), 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나 이로 한정되지 않음), 공유결합 또는 비-공유결합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구 등에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.
또한, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분(들)의 측쇄는 매우 광범위한 폴리펩티드에 추가 작용기를 제공할 수 있는데, 예를 들어, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 부위의 측쇄는 하기 작용기들 중 임의의 작용기를 포함할 수 있다: 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물.
한 측면에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 내에 존재하는 1개 이상(그러나, 전체 아미노산보다 적은 수)의 특정 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들면, 상기 단백질은 2개 이상의 상이한 종류의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 2개의 동일한 비-천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개를 초과하는 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 실시양태가 고체상 (예를 들어, 고체 수지) 펩티드 합성법, 용액상 펩티드 합성법 및/또는 효소의 비-사용 의해 화학적으로 합성될 수 있다 하더라도, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 실시양태는 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 시스템을 통한 합성 또는 생체내 시스템을 통한 합성, 즉 원핵세포 또는 진핵세포의 세포 기구를 사용한 합성을 가능하게 한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 핵심 특징들 중 하나는 이들을 리보좀을 사용하여 합성할 수 있다는 점이다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 고체 수지의 조합, 효소의 비-사용, 리보좀의 사용, 시험관내 시스템, 생체내 시스템 또는 이들의 조합을 통해 합성될 수 있다.
리보좀 및/또는 생체내 시스템을 통한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 합성은 고체 수지 상에서 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 효소를 사용하지 않으면서 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 상이한 장점 및 특징을 가진다. 이 장점 또는 특징은 상이한 불순물 프로파일을 포함하는데, 즉 리보좀을 사용한 시스템 및/또는 생체내 시스템은 숙주 세포 단백질, 막의 일부 및 지질을 비롯한, 사용된 생물학적 시스템으로부터 유래한 불순물을 가지는 반면, 고체 수지를 사용한 시스템 및/또는 효소를 사용하지 않는 시스템으로부터의 불순물 프로파일은 유기 용매, 보호기, 수지 물질, 커플링제 및 합성 과정에서 사용된 다른 화학물질을 포함할 것이다. 또한, 리보좀의 사용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방사성 패턴은 세포에서 사용되는 공급원료의 방사성 패턴과 유사한 반면, 고체 수지 상에서 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방사성 패턴은 합성에 사용된 아미노산의 방사성 패턴과 유사할 것이다. 또한, 리보좀의 사용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비-천연 아미노산은 아미노산의 D-이성질체를 실질적으로 갖지 않을 것이고/것이거나, 내부 시스테인 아미노산을 폴리펩티드의 구조 내로 용이하게 도입할 수 있을 것이고/것이거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 거의 제공하지 않을 것이다. 다른 한편으로, 고체 수지 상에서 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 보다 높은 함량의 아미노산의 D-이성질체 및/또는 보다 높은 비율의 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 가질 것이다. 더욱이, 당업자는 리보좀의 사용 및/또는 생체내 시스템의 사용에 의해 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 고체 수지 및/또는 효소의 비-사용을 통해 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 구별할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 하기 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 화합물 또는 이의 염의 제조 방법으로서, 하나 이상의 알데히드 부분을 포함하는 하나 이상의 반응물을 사용하여 하나 이상의 비-천연 아미노산 상의 방향족 아미노 부분을 환원적으로 알킬화시켜 상기 화합물을 형성하는 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00035
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있으며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 R1 및 R2가 각각 H 및 OH인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 Ra가 할로겐인 화합물의 제조 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 R1 및 R2가 폴리펩티드인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 X가 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 미셀로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 활성제인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 X가 항생제, 살진균제, 항-바이러스, 소염제, 항종양제, 심혈관제, 항-불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드제로 구성된 군으로부터 선택된 약물인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 X가 호스라디쉬 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 및 글루코즈 옥시다제로 구성된 군으로부터 선택된 효소인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산의 X가 형광성 부분, 인광성 부분, 화학발광성 부분, 킬레이팅 부분, 전자 밀집 부분, 자성 부분, 인터칼레이팅 부분, 방사성 부분, 발색성 부분 및 에너지 전달 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 표지인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 X가 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬을 포함하는 중합체인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 중합체가 폴리알킬렌 옥사이드 또는 치환 폴리알킬렌 옥사이드인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 중합체가 -[(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환 알킬)]x를 포함하고, 이때 x가 20 내지 10,000인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 중합체가 약 2 내지 약 40 KDa의 분자량을 가진 m-PEG인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다.
추가 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 하기 비-천연 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00036
상기 식에서, X는 할로겐이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 하기 비-천연 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00037
추가 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 하기 비-천연 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00038
상기 식에서, X는 할로겐이다.
다른 실시양태에서, 하기 비-천연 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 화합물 또는 이의 염의 제조 방법으로서, 하나 이상의 알데히드 부분을 포함하는 하나 이상의 반응물을 사용하여 하나 이상의 비-천연 아미노산 상의 방향족 아미노 부분을 환원적으로 알킬화시켜 상기 화합물을 형성하는 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00039
또는
Figure 112013073088060-pat00040
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 -CH2R5이며;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR" 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하되;
단, R1이 H인 경우, R2는 OH가 아니거나, 또는 R2가 OH인 경우, R1은 H가 아니며;
G는 아민 보호기이다.
일부 실시양태에서, 아민 보호기가 하기 기들로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00041
다른 실시양태에서, R1 및 R2 둘 다가 폴리펩티드인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 알데히드 부분이 하기 화학식에 상응하는 구조를 가진 것인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00042
상기 식에서,
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이다.
다른 실시양태에서, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00043
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-으로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
R6은 보호된 알데히드 또는 차폐된 알데히드이고, 이때 보호기로는
Figure 112013073088060-pat00044
이 있으나, 이들로 한정되지 않고, 이때 X1 각각은 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 이때 R' 및 R 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
다른 실시양태에서, X1이 O인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2가 폴리펩티드인 화합물 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다.
VII . 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법
A. 본원에서 사용할 일반적인 재조합 핵산 방법
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 많은 실시양태에서, 원하는 폴리펩티드(예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함함)를 코딩하는 핵산은 단리하고 클로닝하고, 종종 재조합 방법을 이용하여 변경시킨다. 이러한 실시양태는 단백질 발현을 위해, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트(cassette), 또는 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열을 생성하는 동안에 이용되나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 세포도 본 명세서에 기재되고, 이때 상기 폴리펩티드 상의 하나 이상의 비-천연 아미노산은 방향족 아민 부분 또는 차폐되거나 보호된 알데히드 부분을 갖는 측쇄를 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생합성하는 세포는 본 명세서에 기재된 기법, 방법, 조성물 및 수단 또는 이들의 변형 기법을 이용하여 발생시킬 수 있다.
비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성한 후, 관련 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 삽입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)에 영향을 주기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 생성된다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위-지정 돌연변이유발에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택하여 디자인한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰(ligation) 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되어 조립될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991)], 및 미국특허 제6,521,427호를 참조할 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 재조합 유전학 분야에서의 관용적인 기법을 이용한다. 본 발명에 이용되는 일반적 방법을 개시하는 교재는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.
분자 생물학적 기법을 설명하는 일반 교재는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 교재들은 비-천연 아미노산, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 합성효소 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생성하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자의 생성을 포함하나 이로 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이유발, 벡터의 사용, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기술하고 있다.
신규 합성효소 또는 tRNA의 생성, tRNA 분자의 돌연변이유발, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈의 생성, 원하는 단백질 또는 폴리펩티드에서 비-천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈의 삽입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 다양한 종류의 돌연변이유발기법을 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에서 사용한다. 이들은 부위-지정, 랜덤 점 돌연변이유발, 상동 재조합, DNA 셔플링(shuffling) 또는 다른 반복적(recursive) 돌연변이유발 방법, 키메라 구축, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 갭을 가진(gapped) 이중체 DNA를 사용한 돌연변이유발 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적절한 방법은 점 미스매치 복구(point mismatch repair), 복구능-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중 가닥 절단 복구(double-strand break repair) 등을 포함한다. 키메라 구축물을 사용하는 돌연변이유발기법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발기법도 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에 포함된다. 한 실시양태에서, 돌연변이유발기법은 서열, 서열 비교, 물성, 결정 구조 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 발생 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이된 천연 발생 분자의 공지된 정보에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 교재 및 예에는 이러한 절차가 개시되어 있다. 하기 문헌 및 그에 인용된 참고문헌에서 추가 정보를 발견할 수 있다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 또한, 많은 상기 방법에 대한 더 상세한 설명은 다양한 돌연변이유발 방법을 이용한 과제 해결에 대한 유용한 조절을 기술하는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾을 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비-천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵 숙주 세포, 비-진핵 숙주 세포 및 유기체의 사용에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 구축물을 사용하여 유전공학적으로 개조시킨다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나 이로 한정되지 않음). 예를 들어, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 tRNA 합성효소 및 유도화될 단백질에 대한 코딩 영역들을 원하는 숙주 세포에서 작용하는 유전자 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결한다. 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 네이키드(naked) 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(electroporation)(문헌[Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 가진 소립자에 의한 고속 탄두 침투(ballistic penetration)(문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조)를 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.
개조된 숙주 세포는 예를 들면, 검색 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체(transformant)의 선별과 같은 단계에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 경우에 따라 형질전환 유기체 내에서 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참고문헌은 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기서 인용된 참고문헌[Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.
표적 핵산을 세포 내로 도입하는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이들 방법은 수용 세포와, DNA를 함유하는 박테리아 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염(이하에서 추가로 논의됨) 등을 포함한다. 박테리아 세포는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 DNA 구축물을 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 대수기(log phase)까지 생장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법(예를 들면, 문헌[Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 박테리아으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 다수의 키트가 시판되고 있다(예를 들면, 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)로부터 시판되는 이지프렙(EasyPrep)TM 및 플렉시프렙(FlexiPrep)TM; 스트라타진(Stratagene)으로부터 시판되는 스트라타클린(StrataClean)TM; 및 퀴아젠(Qiagen)으로부터 시판되는 퀴아프렙(QIAprep)TM). 그 다음, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 개조하여, 세포를 형질감염시키는 데 사용되거나 유기체를 감염시키는 다른 관련 벡터 내로 도입되는 다른 플라스미드를 생성한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결서열(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 경우에 따라 하나 이상의 독립된 종결서열, 진핵생물, 원핵생물 또는 이들 둘 다(셔틀(shuttle) 벡터를 포함하나 이로 한정되지 않음)에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에 대한 선별 마커(marker)를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는, 바람직하게는, 이들 둘 다에서 복제 및 도입에 적합하다. 문헌[Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1): 10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지(bacteriophage)의 카달로그는 예를 들면, ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC에 의해 공개된 카달로그[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)]가 있다. 또한, 시퀀싱, 클로닝 및 분자 생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 절차 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌[Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾을 수 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산(및, 표준이든 비표준이든 사실상 임의의 모든 표지 핵산)을 다양한 시판 공급원 중 임의의 공급원, 예를 들면, 밀란드 써티파이드 리젼트 캄파니(Midland Certified Reagent Company)(텍사스 미들랜드 소재, 월드 와이드 웹(World Wide Web) mcrc.com에서 이용가능함), 더 크레이트 아메리칸 진 캄파니(The Great American Gene Company)(캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 genco.com에서 이용가능함), 익스프레스젠 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 expressgen.com에서 이용가능함), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급원으로부터 특별 주문하거나 일반 주문하여 공급받을 수 있다.
B. 셀렉터 코돈
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격(framework)을 확장시킨다. 예를 들면, 셀렉터 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 넌센스(nonsense) 코돈, 예를 들면 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈, 비-천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 광범위한 범위 내의 수의 셀렉터 코돈을 원하는 유전자 내로 도입할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 비-천연 아미노산을 진핵세포의 생체 내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 포함한다. 예를 들면, UAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하며 원하는 비-천연 아미노산을 가진 O-RS에 의해 아미노아실화된 O-tRNA가 생성된다. 이 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되지 않는다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 원하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위에, TAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonuclease if a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]을 참조할 수 있다. O-RS, O-tRNA, 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비-천연 아미노산은 UAG 코돈에 반응하여 도입되어 특정 위치에서 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.
비-천연 아미노산은 희귀 코돈에 의해 코딩될 수도 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소되는 경우, 희귀 아르기닌 코돈, 즉 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 입증된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Ma et al., Biochemistry. 32:7939 (1993)]을 참조한다. 이 경우, 합성 tRNA는 이. 콜라이에서 소수의 종으로서 존재하는 천연 발생 tRNAArg와 경쟁한다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 배정받지 않은 코돈인 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물 중에서의 아미노산의 삽입에 사용된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res.. 25:4685 (1997)]을 참조한다. 본 발명의 성분들은 생체내에서 이 희귀 코돈들을 사용하도록 생성될 수 있다.
생체내 비-천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주 세포에 유의한 영향을 주지 않으면서 수행할 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 엠버 억제자 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵 방출 인자(eRF를 포함하나 이로 한정되지 않음)(이는 정지 코돈에 결합하여, 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 달려 있기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 억제자 tRNA의 발현 수준 증가를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 조절될 수 있다.
또한, 셀렉터 코돈은 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4개, 5개 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 5개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 특징은 프레임쉬프트(frameshift) 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 하나 또는 다수의 비-천연 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아미노산을 동일한 단백질 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 안티코돈(anticodon) 루프, 예를 들면 8 내지 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 안티코돈 루프를 갖는 특수 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이된 O-tRNA의 존재 하에서, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 단일 아미노산으로 판독된다. 다른 실시양태에서, 안티코돈 루프는 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 5개 이상의 염기로 구성된 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 코돈을 해독(decoding)할 수 있다. 256개의 가능한 4 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비-천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 구성된 코돈의 사용에 의해 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조할 수 있다.
예를 들면, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 이용하여 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 데 사용된다. 예를 들면, 문헌[Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 라이신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘(streptavidin) 내로 도입하는 데 사용되었다. 예를 들면, 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194]을 참조할 수 있다. 생체내 연구에서, 무어(Moore) 등은 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임(frame)으로 거의 해독되지 않으면서 13 내지 26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 한 연장된 코돈이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있으며, 이는 다른 원치 않는 부위에서의 미스센스 리드쓰루(missense readthrough) 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.
또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 3개의 천연 염기로 구성된 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이때 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않음). 예를 들면, 이는 3개의 천연 염기로 구성된 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.
셀렉터 코돈은 경우에 따라 비-천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비-천연 염기쌍은 현존하는 유전자 알파벳을 더 연장시킨다. 여분의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질은 안정한 선택적 염기 페어링(base paring), 높은 신뢰도에서의 중합효소에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기(nascent) 비-천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 비-천연 염기쌍에 대한 설명은 예를 들면, 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182]을 참조한다. 다른 관련 문헌은 하기에 나열된다.
생체내에서 사용하는 경우, 비-천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 갖고, 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너(Benner) 및 다른 사람들에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 와슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌[Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 이 염기들은 어는 정도 천연 염기와 미스페어링(mispairing)하고, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨(Kool) 및 그의 동료들은 염기들 사이의 소수성 팩킹(packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825]을 참조할 수 있다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비-천연 염기쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 그의 동료들은 일련의 비-천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍(self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 밝혀졌고, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선별성을 가진 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803]을 참조할 수 있다. 그러나, 양쪽 염기 둘 다 추가 복제를 위한 사슬 종결제로 작용한다. 최근, 돌연변이 DNA 중합효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439]을 참조할 수 있다. 또한, 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었으며, 상기 염기쌍은 Cu(II) 결합 시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비-천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르토고날하기 때문에, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법은 이 성질을 이용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.
또한, 번역 우회(translational bypassing) 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비-천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열은 유전자 내로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보좀이 서열 상에서 호핑하여(hopping), 삽입 부위의 다운스트림(downstream)의 번역을 재개하는 신호(cue)로서 작용하는 구조를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및/또는 조성물에서 원하는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들면, 비-천연 아미노산의 도입을 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들면, 원하는 단백질에 대한 핵산은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 도입시키는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 예를 들면, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는, 임의의 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 변이체를 포함한다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 상응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비-천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.
예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함하는 원하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 원하는 단백질 내로 도입하는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법 예컨대, 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제6,608,183호에 기재된 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 표준 돌연변이유발 기법을 포함한다.
VIII . 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 생성
천연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 부가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 생체내에서 생성할 수 있다.
천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법은 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제7,045,337호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입") 및 미국특허 제7,083,970호(발명의 명칭: "오르토고날 tRNA-아미노아실 tRNA 합성효소 쌍의 생성을 위한 방법 및 조성물")에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성을 갖는 합성효소 및 tRNA와 독립적으로 작용하는(따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭됨) 번역 기구의 생성을 포함한다. 한 실시양태에서, 번역 시스템은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드는 상응하는 DNA로부터 전사된 mRNA일 수 있거나, RNA 바이러스 벡터로부터 발생된 mRNA일 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드는 비-천연 아미노산의 도입을 위한 소정의 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 추가로 포함한다. 번역 시스템은 비-천연 아미노산을 포함하며 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 추가로 포함하고, 추가 실시양태에서, 상기 비-천연 아미노산은 아미노아실화된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 번역 시스템은 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함하고, 다른 또는 추가 실시양태에서, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함하며, 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 번역 시스템은 (전형적으로 DNA의 형태로) 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, (전형적으로 DNA의 형태로) 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA, 및 전술한 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 (추가 실시양태에서, 삽입은 안정한 삽입임) 게놈 DNA 중 하나 이상을 포함한다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비-천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 실시양태에서, tRNA는 억제자 tRNA이다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 리보좀에 의해 합성된다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키고, O-tRNA는 이 시스템에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 상기 시스템에서 생성된 단백질 내에 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 내의 특정 위치에서 아미노산을 "치환"시킨다.
특정한 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 매우 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 일반적으로 적합하다. 예를 들면, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 문헌[Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100; 56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본원에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자도 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제7,045,337호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입") 및 미국특허 제7,083,970호(발명의 명칭: "오르토고날 tRNA-아미노아실 tRNA 합성효소 쌍의 생성을 위한 방법 및 조성물")에 기재되어 있다. 또한, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Mehl et al. in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939 and Santoro et al. Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048]에는 검색 방법, 및 p-아미노페닐알라닌을 폴리펩티드 내로 도입하기 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 및 tRNA 분자가 논의되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열은 본원에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열번호 1 내지 3을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정한 비-천연 아미노산에 특이적인 한 쌍의 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 다른 예는 본원에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 에스. 세레비지애에서 케토-함유 아미노산 및 아지드-함유 아미노산 둘 다를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기재되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비-천연 아미노산을 코딩하는 특정한 코돈의 선택을 포함한다. 임의의 코돈을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예를 들면 정지 코돈(엠버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 및 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.
특정한 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이유발 방법(부위 특이적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 이용하여 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.
비-천연 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면 O-RS, O-tRNA, 및 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌[Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비-천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본원에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법은 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제7,045,337호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입") 및 미국특허 제7,083,970호(발명의 명칭: "오르토고날 tRNA-아미노아실 tRNA 합성효소 쌍의 생성을 위한 방법 및 조성물")에 기재되어 있다. 또한, 본원에 완전히 참고로 도입되는 PCT 공보 제WO 04/035743호(발명의 명칭: "단백질 내로의 케토 아미노산의 부위 특이적 도입")에는 케토 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. 본원에 완전히 참고로 도입되는 PCT 공보 제WO 04/094593호(발명의 명칭: "진핵 유전 코드의 확장")에는 진핵 숙주 세포에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS와 tRNA 쌍이 기재되어 있다.
하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 (a) 원핵생물 유기체, 예를 들면, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 이. 콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등, 또는 진핵생물 유기체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 제1 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리 중에서 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 구성원을 선별 (및/또는 검색)함으로써, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계, 및/또는 (c) 비-천연 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 대한 풀을 (경우에 따라, 음성 선별을 통해) 선별함으로써 비-천연 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다. 예를 들면, 비활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않음)으로 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다.
돌연변이체 RS의 라이브러리는 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적(rational) 디자인을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 이용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이유발을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위적 돌연변이, 다양성(diversity) 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구축물, 합리적 디자인, 및 본 명세서에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 단계를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 활성을 가진 구성원을 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리로부터 선별(및/또는 검색)하는 단계는, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 양성 선별 또는 검색 마커(이때, 양성 선별 및/또는 검색 마커는 엠버, 오커, 및 오팔 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 선별제의 존재 하에 다수의 세포를 생장시키는 단계; 및 양성 선별 또는 검색 마커의 존재 하에 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하여 선별제 및/또는 검색제의 존재 하에 생존하는 (또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성(경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포로 구성된 하위세트를 제공하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 선별제 및/또는 검색제 농도는 변할 수 있다.
한 측면에서, 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 경우에 따라, 양성 선별 마커는 β-락타마제(lactamase) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 검색 마커는 형광 또는 발광 검색 마커 또는 친화성-기초 검색 마커(세포 표면 마커를 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함한다.
한 실시양태에서, 비-천연 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(경우에 따라, 돌연변이체)에 대한 풀을 음성적으로 선별하거나 검색하는 과정은, 양성 선별 또는 검색으로부터의 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 사용하여 음성 선별 또는 검색 마커(이때, 음성 선별 또는 검색 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함)를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비-천연 아미노산 및 검색제 또는 선별제로 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적 검색 반응을 나타내지만 비-천연 아미노산 및 선별제 또는 검색제로 보충되지 않는 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 생존하는 세포 또는 검색된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들면, CAT 확인 프로토콜은 경우에 따라 적합한 O-RS 재조합체의 결정에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 검색으로서 작용한다. 예를 들면, 클론의 풀은 경우에 따라 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖거나 갖지 않는 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 함유하는 생장 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비-천연 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 생장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 한 측면에서, 선별제(및/또는 검색제)의 농도는 변할 수 있다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 경우에 따라 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 이. 콜라이, 진균류, 효모, 원시세균(archaebacterium), 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시양태에서, 검색 마커는 형광 또는 발광 검색 마커 또는 친화성-기초 검색 마커를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대한 풀을 검색하거나 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하는 과정은 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리하는 단계; 음성 선별 또는 검색 마커(이때, 음성 선별 또는 검색 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제(ribonuclease barnase) 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함), 및 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비-천연 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서는 생존하거나 특이적 검색 반응을 나타내지만, 비-천연 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 검색 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비-천연 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 생존하거나 검색된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 이러한 실시양태는 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 경우(이때, 각각의 유기체는 경우에 따라, 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 이. 콜라이, 진균류, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 검색 마커가 경우에 따라 형광 또는 발광 검색 마커 또는 친화성-기초 검색 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시양태에서, 검색 및/또는 선별은 경우에 따라 검색 및/또는 선별 엄격도(stringency)의 변경을 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(경우에 따라, 돌연변이됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라, 단계 (d) 내지 (f)를 약 2회 이상 반복한다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이된 O-RS의 제2 세트는 무작위적 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.
전술한 방법들에서 양성 선별/검색 단계 (b), 음성 선별/검색 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/검색 단계 (b) 및 (c) 둘 다를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별/검색 단계의 엄격도는 경우에 따라 선별/검색 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양성 선별/검색 단계 (b), 음성 선별/검색 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/검색 단계 (b) 및 (c) 둘 다는 리포터(reporter)의 사용을 포함하며, 이때 리포터는 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 경우에 따라, 리포터는 세포 표면 상, 파지 디스플레이(phage display) 상 등에서 나타나고, 비-천연 아미노산 또는 유사체를 수반하는 친화성 또는 촉매 활성에 기초하여 선별된다. 한 실시양태에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면 상, 파지 디스플레이 상 등에서 나타난다.
재조합 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 생성하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터 억제자 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 또는 검색하여 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 선별하거나 검색함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 tRNA는 억제자 tRNA이고/이거나 천연 및/또는 비-천연 염기로 된 독특한 3 염기 코돈을 포함하거나, 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비-천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 정지 코돈이다. 한 실시양태에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르토고날성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경우에 따라 O-tRNA를 변형시킬 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체 내로 도입할 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하고 경우에 따라 원핵생물(메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 이. 콜라이, 할로박테리움 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진핵생물, 포유동물, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 또한, 재조합 tRNA는 경우에 따라 비-천연 아미노산에 의해 아미노아실화되며, 이때 비-천연 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내에서 생합성된다. 경우에 따라, 비-천연 아미노산을 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 생장 배지에 첨가한다.
한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 검색하는 단계(단계 (b))는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자(이때, 독성 마커 유전자, 또는 독성 또는 세포증식 저해 물질을 생성하는 유전자 또는 유기체에 필수적인 유전자) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 라이브러리를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 함유하는 생존 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 이용함으로써 선별할 수 있다.
또 다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 이때 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 검색하는 단계는, 양성 선별 또는 검색 마커 유전자(이때, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들면 하나 이상의 엠버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음), 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 물질의 해독화를 이끌어내는 유전자), 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별제 또는 검색제의 존재 하에 생장하는 생존 세포 또는 검색된 세포를 확인함으로써 하나 이상의 재조합 tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 반응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물 내에 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선별제 및/또는 검색제의 농도는 변화한다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 라이브러리를 음성적으로 선별하거나 검색함으로써 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 검색함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 구성원에 대해 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별하거나 검색하여 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비-천연 아미노산의 부재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 검색함으로써, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(이때, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법에 의해 생성된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들면, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제 3 유기체가 동일한 (메타노코커스 잔나스키이를 포함하나 이로 한정되지 않음) 경우를 포함한다.
또한, 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법도 본 명세서에 기재된 방법에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA, 및 제1 유기체로부터 단리되거나 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체로부터의 세포로 구성된 제1 세트 내로 도입하는 단계; 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복(duplicate) 세포 세트 내로 도입하는 단계; 및 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하지만 제1 세트에서는 생존하는 세포를 선별하거나 중복 세포 세트에서는 제공하지 못하는 특이적 검색 반응을 나타내는 세포에 대해 검색하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제1 세트 및 중복 세포 세트는 선별제 또는 검색제의 존재 하에 생장하고, 상기 생존 세포 또는 검색된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 한 실시양태에서, 비교 및 선별 또는 검색은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선별제 또는 검색제의 농도는 변할 수 있다.
본 명세서에 기재된 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 유기체는 경우에 따라 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 이. 콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 유기체는 경우에 따라 식물(복합 식물, 예를 들면 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함하나 이로 한정되지 않음), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 동물(포유동물, 곤충, 절지 동물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 진핵생물 유기체 등을 포함한다.
A. 비-진핵세포 및 진핵세포 내에서의 발현
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-진핵세포 및 진핵세포에서의 발현에 적용될 수 있다.
클로닝된 폴리뉴클레오티드의 고도 발현을 얻기 위해서는, 전형적으로 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결서열, 및 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위(단백질을 코딩하는 핵산의 경우)를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloning)한다. 적합한 박테리아 프로모터는 예를 들면, 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.
폴리펩티드 발현용 박테리아 발현 시스템은 이. 콜라이, 바실러스 종(Bacillus sp .), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 균주에서 이용가능하다(문헌[Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템도 상업적으로 입수가능하다. 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(본 명세서에 기재됨)를 사용하여 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그의 능력을 기초로 선별된다. 예시적인 숙주 세포로는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아(비. 브레비스(B. brevis), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 및 그람-음성 박테리아(이. 콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 슈도모나스 푸티다) 뿐만 아니라, 효모 및 다른 진핵세포가 있다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포는 비-천연 아미노산을 많은 유용한 양으로 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 경우에 따라 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 100 ㎎ 또는 1 그램 이상의 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드, 또는 생체내 단백질 생성 방법(재조합 단백질 생성 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공되어 있음)을 이용하여 얻어질 수 있는 양의 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 경우에 따라 세포 용해물, 완충제, 약학적 완충제 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나 이들로 한정되지 않는 액체(약 1 nl 내지 약 100 ℓ의 임의의 부피를 포함하나 이로 한정되지 않는 부피를 가짐) 중의 1 ℓ 당 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상 또는 10 ㎎ 이상의 폴리펩티드 농도를 포함하나 이로 한정되지 않는 농도로 조성물 중에 존재한다. 진핵세포에서 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량 (전형적으로, 시험관내 번역을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 방법을 이용하여 얻을 수 있는 양보다 많은 양을 포함하나 이로 한정되지 않음) 제조하는 것은 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물의 한 특징이다.
본 명세서에 기재된 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포는 비-천연 아미노산을 포함하는 많은 유용한 양의 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질은 예를 들어, 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 또는 완충제 중의 10 ㎍/ℓ 이상, 50 ㎍/ℓ 이상, 75 ㎍/ℓ 이상, 100 ㎍/ℓ 이상, 200 ㎍/ℓ 이상, 250 ㎍/ℓ 이상, 또는 500 ㎍/ℓ 이상, 1 mg/ℓ 이상, 2 mg/ℓ 이상, 3 mg/ℓ 이상, 4 mg/ℓ 이상, 5 mg/ℓ 이상, 6 mg/ℓ 이상, 7 mg/ℓ, 8 mg/ℓ 이상, 9 mg/ℓ 이상, 10 mg/ℓ 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ℓ, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 이상의 단백질 농도를 포함하나 이들로 한정되지 않는 농도로 생성될 수 있다.
1. 발현 시스템, 배양 및 단리
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 발현 시스템, 배양 및 단리에 적용될 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아를 비롯한 임의의 다수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 예시적인 발현 시스템에 대한 설명은 본 명세서에 제공되어 있다.
효모
본 명세서에 사용된 용어 "효모"는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 과(family), 즉 스퍼모프토라세애(Spermophthoraceae)와 사카로마이세타세애(Saccharomycetaceae)로 나뉜다. 사카로마이세타세애는 4개의 하위과(subfamily), 스키조사카로마이코이데애(Schizosaccharomycoideae)(예를 들면, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데애(Nadsonioideae), 리포마이코이데애(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데애(Saccharomycoideae)(예를 들면, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세애(Sporobolomycetaceae)(예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세애(Cryptococcaceae)(예를 들면, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.
특정 실시양태에서, 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 귈러리몬디이(P. guillerimondii), 에스. 세레비지애(cerevisiae), 에스. 칼스버겐시스(carlsbergensis), 에스. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), 에스. 더글라시이(S. douglasii), 에스. 클루이베리(S. kluyveri), 에스. 노르벤시스(S. norbensis), 에스. 오비포르미스(S. oviformis), 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis), 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 말토사(C. maltosa) 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물에서 사용된다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 발현에 적합한 효모의 선택은 당업자의 기술 내에 속한다. 발현용 효모 숙주의 선택 시, 적합한 숙주는 예를 들면, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성, 우수한 가용성 단백질 생성 및 전체적인 강인성(robustness)을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학(University of California)(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics) 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; "ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.
용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 효모를 포함한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 원(original) 효모 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
염색체외 레플리콘(extrachromosomal replicon) 또는 도입 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주 내로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, 에스. 세레비지애(문헌[Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1978) 75: 1929] 참조); 씨. 알비칸스(문헌[Kurtz et al., Mol. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조); 씨. 말토사(문헌[Kunze et al., J. BASIC MOL. MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 에이치. 폴리모르파(문헌[Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202: 302] 참조); 케이. 프라길리스(문헌[Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조): 케이. 락티스(문헌[De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (1990) 8: 135] 참조); 피. 귈러리몬디이(문헌[Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 피. 파스토리스(미국특허 제5,324,639호, 제4,929,555호 및 제4,837,148호; 문헌[Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조); 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌[Beach and Nurse, NATURE (1981) 300: 706] 참조); 및 와이. 리폴리티카(lipolytica)(Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1986) 10:49); 에이. 니둘란스(A. nidulans)(문헌[Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221; and Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1984) 81: 1470-74] 참조); 에이. 니게르(A. niger)(문헌[Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479] 참조); 티. 레시아(T. reesia)(유럽 특허 제0 244 234호); 및 섬사상 진균류, 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(국제특허공보 제WO 91/00357호)(상기 각각의 문헌은 본원에 참고로 도입됨)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.
효모 벡터에 대한 조절 서열은 알코올 데히드로게나제(ADH)(유럽 특허 제0 284 044호); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프럭토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(유럽 특허 제0 329 203호)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌[Myanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1983) 80: 1] 참조). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 해당 효소, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코즈 이소머라제(문헌[Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7: 149] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다(문헌[Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 2073] 참조). 전사가 생장 조건에 의해 조절된다는 추가 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2; 이소사이토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인(metallothionein); 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제; 질소 대사와 관련된 분해성 효소; 및 말토스 및 갈락토즈 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제0 073 657호에 추가로 기재되어 있다.
또한, 효모 인핸서(enhancer)를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 업스트림 활성화 서열(UAS)이 또 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 연결되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호를 참조할 수 있다. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 원하는 효소 유전자, 예를 들면 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 영역과 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. 유럽 특허 제0 164 556호를 참조할 수 있다. 나아가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하는 능력 및 전사를 개시하는 능력을 갖는 비-효모로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터 유래된 종결서열을 포함한다(문헌[Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2 μ의 플라스미드로부터 유래된 복제기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자이다. 문헌[Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 생장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에게 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
외인성 DNA를 효모 숙주 내로 도입하는 방법은 전형적으로 스페로플라스트(spheroplast)의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1979) 76: 3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 세포에 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입, 전기천공법 또는 원형질체 융합도 일반적으로 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 그 다음, 효모 숙주 세포를 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 배양할 수 있다.
효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 미국특허출원 공개 제20020055169호, 미국특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국특허 제RE37,343호 및 제RE35,749호; 국제특허공보 제WO 99/078621호; 제WO 98/37208호; 및 제WO 98/26080호; 유럽 특허출원 제0 946 736호; 제0 732 403호; 제0 480 480호; 제0 460 071호; 제0 340 986호; 제0 329 203호; 제0 324 274호; 및 제0 164 556호를 참조할 수 있다. 또한, 각각 본원에 참고로 도입되는 문헌[Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2): 79-93; Romanes et al., YEAST (1992) 8 (6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.
효모 숙주 균주는 표준 공급 회분식 발효 방법을 이용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 생장시킬 수 있다. 발효 방법은 특정한 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 고려하여 적절하게 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코즈 공급물, 복합 질소 공급원(예를 들면, 카세인 가수분해물) 및 다양한 비타민 보충을 필요로 할 수 있는 반면, 메틸오트로픽(methylotrophic) 효모인 피. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 생장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제5,324,639호, 문헌[Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌[Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다.
그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 관계없는 일부 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 생장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증식기 동안 발효기에 첨가하여 최대 생장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인, 및 다른 소수의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아에서 사용하기에 적합한 발효 배지의 예는 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기재되어 있다.
바큘로바이러스 ( Baculovirus )-감염 곤충 세포
용어 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 곤충 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 애데스 애깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 몇몇 곤충 종은 당 업계에 잘 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 곤충은 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.
일반적으로, 바큘로바이러스-감염 곤충 발현 시스템의 구성성분들은 전이 벡터, 통상 바큘로바이러스 게놈의 단편 및 발현될 이종 유전자 삽입에 편리한 제한 부위 둘 다를 함유하는 박테리아 플라스미드; 전이 벡터 내의 바큘로바이러스-특이적 단편과 서열 상동성을 나타내는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 게놈 내에서의 이종 유전자의 상동 재조합을 가능하게 함); 및 적합한 곤충 숙주 세포 및 생장 배지를 포함한다. 벡터의 구축, 세포의 형질감염, 플라크(plaque)의 픽킹(picking), 배양물 중에서의 세포의 생장 등에 사용되는 물질, 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 기법들이 기재된 메뉴얼도 이용가능하다.
이종 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주 세포 내로 형질감염시키는데, 이때 벡터와 바이러스 게놈은 재조합된다. 팩키징된 재조합 바이러스를 발현시키고, 재조합 플라크를 확인하고 정제한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질 및 방법은 예를 들면, 인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corp.)(캘리포니아주 칼스버드 소재)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 이러한 기법들은 본원에 참고로 도입되는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 충분히 기재되어 있다. 또한, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16. 9-16. 11 (1994); KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 다양한 이종 단백질의 제조는 하기 참고문헌들에 기재되어 있고, 이러한 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하는 데 적용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; 국제특허공보 제WO 02/06305호, 제WO 01/90390호, 제WO 01/27301호, 제WO 01/05956호, 제WO 00/55345호, 제WO 00/20032 제WO 99/51721호, 제WO 99/45130호, 제WO 99/31257호, 제WO 99/10515호, 제WO 99/09193호, 제WO 97/26332호, 제WO 96/29400호, 제WO 96/25496호, 제WO 96/06161호, 제WO 95/20672호, 제WO 93/03173호, 제WO 92/16619호, 제WO 92/03628호, 제WO 92/01801호, 제WO 90/14428호, 제WO 90/10078호, 제WO 90/02566호, 제WO 90/02186호, 제WO 90/01556호, 제WO 89/01038호, 제WO 89/01037호 및 제WO 88/07082호를 참조할 수 있다.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 헬퍼(helper)-독립적 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 통상, 이 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 강한 바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌[O' Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.
외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입시키기 전에, 프로모터, 리더(leader)(필요에 따라), 원하는 코딩 서열 및 전사 종결서열을 포함하는 전술한 성분들을 전형적으로 중간체 전위 구축물(intermediate transplacement construct)(전이 벡터)로 조립한다. 종종, 중간체 전위 구축물은 숙주, 예를 들면 박테리아에서 안정하게 유지될 수 있는 레플리콘, 예를 들면 염색체 외부 요소(예를 들면, 플라스미드)에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 갖기 때문에, 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주에서 유지될 수 있다. 더욱 구체적으로, 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(문헌[Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조), 및 이. 콜라이 중에서의 선별 및 증식을 위한 원핵 앰피실린-내성(amp) 유전자 및 복제기점을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 AcNPV 내로 도입하는 데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT로부터 32개 염기쌍만큼 떨어진 다운스트림 위치 내로 BamHI 클로닝 부위를 도입하는 pVL985를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌[Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]을 참조할 수 있다. 다른 시판되는 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; 및 pBlueBac4.5(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.
이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주 내로 동시에 형질감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위로 도입하는 예시적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들면, 상동 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면 폴리헤드린 유전자 내에 삽입될 수 있고, 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 도입된 제한 효소 부위 내에 삽입될 수 있다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91]을 참조할 수 있다.
형질감염은 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]에 기재된 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키기 위해 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1): 36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45; TILICNS et al., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al., GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37): 22376; Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39): 23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2): 766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조할 수 있다. 시판되는 리포좀은 예를 들면, 셀펙틴(Cellfectin)® 및 리포펙틴(Lipofectin)®(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 이용할 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19): 5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.
통상, 바큘로바이러스 발현 벡터는 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는, 바큘로바이러스 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는, 통상 구조 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서(존재하는 경우)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 더욱이, 발현은 조절가능한 발현 또는 기본구성적 발현일 수 있다.
감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로는 바이러스 폴리헤드린 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; 유럽 특허 제0 127 839호 및 제0 155 476호 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열이 있다.
새로이 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터를 감염성 재조합 바큘로바이러스로 팩키징한 후, 성장한 플라크를 예컨대, 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 기재된 기법으로 정제할 수 있다.
몇몇 곤충 세포의 감염을 위한 재조합 바큘로바이러스 발현 벡터가 개발되었다. 예를 들면, 특히, 애데스 애깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대한 재조합 바큘로바이러스가 개발되었다. 문헌[Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 보다 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 통상적으로 Sf9(스포돕테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포돕테라 프루기페르다)(인비트로겐 코퍼레이션, 카달로그 번호 11497-013(캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368(트리초풀시아 니(Trichopulsia ni)) 및 하이-파이브(High-Five)TM BTI-TN-5B1-4(트리초풀시아 니)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
바큘로바이러스/발현에서의 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 둘 다를 위한 세포 및 배양 배지는 상업적으로 입수가능하다.
이. 콜라이 , 슈도모나스 종, 및 다른 원핵세포
박테리아 발현 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 박테리아 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들이 이용가능하다. 벡터는 단일 카피 벡터이거나 낮은 또는 높은 다중카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터에 관한 풍부한 문헌, 많은 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 이의 제한 맵(map) 및 특징이 기재된 메뉴얼이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 벡터는 일반적으로 선별을 가능하게 하는 마커를 포함하며, 이때 마커는 세포독성제 내성, 야생성(prototrophy) 또는 면역성을 제공할 수 있다. 종종, 다양한 특징을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.
박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 박테리아 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 오퍼레이터(operator)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 리프레서(repressor) 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특정 유전자의 전사를 억제할 수 있기 때문에 오퍼레이터는 음성 조절(유도성) 전사를 허용한다. 기본구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면 오퍼레이터의 부재 하에 일어날 수 있다. 또한, 양성 조절은 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접한 (5') 유전자 활성화제 단백질 결합 서열(존재하는 경우)에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성화제 단백질의 일례는 에스케리치아 콜라이(이. 콜라이)에서 lac 오페론(operon)의 초기 전사를 돕는 이화생성물 활성화제 단백질(CAP)이다(문헌[Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성 조절이므로 전사를 증가시키거나 감소시킨다.
대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로는 당 대사 효소, 예를 들면 갈락토즈, 락토스(lac)(문헌[Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열이 있다. 추가 예로는 생합성 효소, 예를 들면 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열이 있다(본 명세서에 참고문헌으로 도입되는 문헌[Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731]; 미국특허 제4,738,921호; 유럽 특허 제036 776호 및 제121 775호 참조). 또한, β-갈락토시다아제(bla) 프로모터 시스템(본원에 참고로 도입되는 문헌[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 람다 PL(본원에 참고로 도입되는 문헌[Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5(본원에 참고로 도입되는 미국특허 제4,689,406호 참조) 프로모터 시스템도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본원에 포함되는 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면 T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 폴리펩티드 생성을 유도한다. 이러한 벡터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 노바겐(Novagen)으로부터 시판되는 pET29 계열, 및 본원에 참고로 도입되는 국제특허공보 제WO 99/05297호에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 생존 능력 또는 생장 매개변수에 악영향을 주지 않으면서 숙주에서 폴리펩티드를 높은 수준으로 생성한다.
또한, 자연계에서 발견되지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 기능한다. 예를 들면, 한 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합하여 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다(본원에 참고로 도입되는 미국특허 제4,551,433호 참조). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터, 및 lac 리프레서에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 둘 다를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌[Amaml et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80; 21] 참조). 나아가, 박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는, 비-박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비-박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 상용가능한 RNA 중합효소와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌[Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 하이브리드 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 이. 콜라이 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다(유럽 특허 제267 851호 참조).
기능성 프로모터 서열 외에도, 효율적인 리보좀 결합 부위도 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. 이. 콜라이에서, 리보좀 결합 부위는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈으로부터 3 내지 11개 뉴클레오티드만큼 업스트림 부위에 위치한 3 내지 9개의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함한다(문헌[Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 상기 SD 서열은 이. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 페어링에 의해 mRNA와 리보좀의 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다(문헌[Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌[Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.
용어 "박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되는 박테리아를 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 박테리아 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질 예를 들면, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 박테리아의 선택은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 발현을 위한 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 봉입체(inclusion body) 형성 능력, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 박테리아 숙주는 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 박테리얼 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 일반적으로, 산업적/약학적 발효는 K 균주(예를 들면, W3110)로부터 유도된 박테리아 또는 B 균주(예를 들면, BL21)로부터 유도된 박테리아를 사용한다. 이러한 균주들은 이들의 생장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강인하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 병원성을 나타내지 않으며, 안전성 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 본 명세서에 기재되어 있으며 본원에 포함되는 방법의 한 실시양태에서, 이. 콜라이 숙주는 BL21, DH10B 또는 이들의 유도체 균주이다. 본원에 기재되어 있으며 본원에 포함되는 방법의 또 다른 실시양태에서, 이. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-을 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질분해효소 결핍 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 박테리아 숙주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 및 슈도모나스 푸티다와 같은 슈도모나스 종일 수 있다. 슈도모나스 균주의 일례는 피. 를루오레센스 비오바르 1, 균주 MB101((Dow Chemical)이다.
일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구축물이 숙주 세포 내로 도입되었고, 적합한 발현 구축물을 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 폴리펩티드의 제조에 적합한 조건 하에 배양한다. 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구축물의 성질 및 숙주 세포의 종류에 달려 있다. 재조합 숙주 균주는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 통상적으로 배양한다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한(assimilatable) 공급원, 및 경우에 따라, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 경우에 따라, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 생장을 방지하는 항생제 또는 항진균제, 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.
재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(폴리펩티드가 세포내에 축적되는 경우) 또는 배양 상청액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 재조합 시스템에서 발현시킨 후 정제한다. 상기 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 통상적으로, 박테리아 숙주 세포에서 생성된 많은 폴리펩티드가 낮은 가용성 또는 불용성(봉입체의 형태의 경우)을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합적으로 제조된 단백질의 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선별된 아미노산 치환을 폴리펩티드 내로 용이하게 도입할 수 있다. 불용성 폴리펩티드의 경우, 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과 후 세포의 균질화에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수거될 수 있다. 가용성이 낮은 폴리펩티드의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 용해가능한 폴리펩티드의 침전을 유도할 수 있다. 그 다음, 침전된 단백질을 원심분리 또는 여과에 의해 편리하게 수거할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 파괴하거나 균질화하여, 당업자에게 잘 공지되어 있는 다양한 방법을 이용하여 세포내로부터 봉입체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 파괴 또는 균질화는 효소적 세포 파괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 파괴를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 본 명세서에 기재되고 본원에 포함되는 방법의 한 실시양태에서, 고압 방출 기술을 이용하여 이. 콜라이 숙주 세포를 파괴하여 폴리펩티드의 봉입체를 방출시킬 수 있다. 폴리펩티드의 봉입체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질분해와 같은 요인으로 인한 손실 없이 봉입체의 수율을 최대화시키기 위해 반복 수행 시 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다.
그 다음, 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 폴리펩티드를 가용화할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드로 가용화할 수 있다. 편리하게 취급할 수 있는 회분 크기를 이용하여 큰 회분을 생산할 수 있기 위해, 가용화된 폴리펩티드의 부피를 최소화해야 한다. 이 요인은 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 회분에서 생장할 수 있는 대규모 상업적 셋팅에서 중요할 수 있다. 또한, 특히 인간의 약학적 용도를 위해 대규모 상업적 셋팅에서 폴리펩티드를 제조하는 경우, 기구 및 용기, 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 독한 화학물질은 가능하면 피해야 한다. 보다 독한 변성화제인 구아니딘 히드로클로라이드 대신에 더욱 순한 변성화제인 우레아를 사용하여 폴리펩티드 봉입체를 가용화할 수 있다는 점이 본 명세서에 기재되고 본원에 포함되는 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 폴리펩티드 봉입체를 효율적으로 가용화하면서 폴리펩티드의 제조 및 정제 공정에서 사용되는 스테인레스 강철 장치에 대한 손상 위험을 유의하게 감소시킨다.
가용성 폴리펩티드의 경우, 펩티드는 세포주위질 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 펩티드는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 전에 가용성 펩티드를 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 명세서에 기재된 기법을 포함하나 이로 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 펩티드를 농축시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 기법을 포함하나 이로 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 숙주 세포를 파괴하고 숙주 세포의 세포질 또는 세포질주위 공간으로부터 가용성 펩티드를 방출시킬 수 있다.
폴리펩티드가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 절단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 조건 하에 달성될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 종류에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정될 것이다. 화학적 절단은 시아노겐 브로마이드, TEV 단백질분해효소 및 다른 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않는 시약을 사용하여 달성할 수 있다. 절단된 폴리펩티드는 경우에 따라 잘 공지되어 있는 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제된다. 이러한 방법은 융합 서열 및 폴리펩티드의 본질(identity) 및 성질에 의해 결정될 것이다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또한, 폴리펩티드는 경우에 따라 DNA를 제거하기 위해 단백질 용액으로부터 정제된다. DNA는 예를 들면 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제거될 수 있다. 한 실시양태에서, DNA 예를 들면, 프로타민(protamine) 설페이트와 같은 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거된다. 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 폴리펩티드가 인간을 치료하는 데 사용되는 셋팅에서 중요한 인자이며, 본 명세서에 기재된 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.
또한, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기(bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 공급-회분식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 인간 형태는 일반적으로 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 여과하여 세포 데브리스(debris)를 제거할 수 있다. 상청액을 원하는 부피로 눙축시키거나 희석시키거나, 추가 정제를 위해 제제를 컨디셔닝하는 데 적합한 완충제로 투석여과할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 추가 정제는 상응하는 온전한 형태로부터 폴리펩티드 변이체인 탈아미드화 형태 및 절단된 형태를 분리하는 단계를 포함한다.
하기 예시적인 절차 중 임의의 절차를 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제에 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피; 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피(displacement chromatography); 전기영동 절차(분취형 등전위 포커싱(isoelectric focusing)을 포함하나 이로 한정되지 않음); 상이한 가용성(differential solubility) 이용법(황산암모늄 침전을 포함하나 이로 한정되지 않음); SDS-PAGE 또는 추출.
비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물 내에 포함되는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 정도까지 정제될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 렉틴(lectin) 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다수의 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 정확하게 폴딩된 성숙 단백질을 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 고순도가 바람직한 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비-천연 아미노산(또는 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드)에 대해 생성된 항체는 하나 이상의 비-천연 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드의 친화성-기초 정제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정제를 위한 정제 시약으로서 사용된다. 일단 폴리펩티드가 부분적으로 또는 균질한 정도로 정제되면, 필요한 경우, 경우에 따라 분석 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 제조용 면역원을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 용도로 사용된다.
본 명세서에 언급된 다른 참고문헌 외에도, 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications. Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에서 인용된 참고문헌에 기재된 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다.
진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포에서 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 제조의 장점은 전형적으로 폴리펩티드가 그의 천연 구조로 폴딩된다는 점이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 특정 실시양태에서, 합성, 발현 및/또는 정제 후, 폴리펩티드는 관련 폴리펩티드의 원하는 입체구조와는 상이한 입체구조를 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 측면에서, 발현된 단백질을 경우에 따라 변성된 후 복원된다. 이는 샤페로닌(chaperonin)을 원하는 폴리펩티드에 첨가하는 방법, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예를 들면 구아니딘 HCl 중에서 가용화하는 방법, 단백질 디설피드 이소머라제를 사용하는 방법 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성한다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 입체구조로 리폴딩시키는 것이 종종 바람직하다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 원하는 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(상기 참고문헌들 및 문헌[Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참조). 예를 들면, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 봉입체 단백질의 변성 및 환원을 개시한다. 단백질은 산화된 글루타치온 및 L-아르기닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는 물질을 함유하는 산화환원 완충제 중에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 유동하거나 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있고, 반대로 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물이 유동하거나 이동하여 리폴딩 시약과 접촉할 수 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드를 원핵생물에서 제조하는 경우, 제조된 폴리펩티드는 미스폴딩되어 생물학적 활성을 갖지 않거나 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 한 실시양태에서, 미스폴딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들면, 우레아 및/또는 구아니딘), 및 디설피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들면, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화하고(이때, 폴리펩티드도 불용성을 가짐), 언폴딩하고, 환원시킴으로써 리폴딩한다. 그 다음, 중간 정도의 무질서 상태에서, 디설피드 결합을 재형성시키는 산화제(예를 들면, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 언폴딩된 또는 미스폴딩된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들면 본원에 참고로 도입되는 미국특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법을 이용하여 리폴딩할 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩 후, 폴리펩티드는 더 정제될 수 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제는 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않은 다양한 기법을 이용하여 달성할 수 있다. 추가 정제는 정제된 단백질의 건조 또는 침전 단계를 포함할 수도 있다.
정제 후, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상이한 완충제 내로 교환될 수 있고/있거나, 정용여과 및 투석을 포함하나 이들로 한정되지 않은 당업자에게 공지된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 농축될 수 있다. 단일 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집시키고 침전시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 (역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-PAGE에 의한 측정 시) 90% 이상일 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도의 정확한 수치적 값과 관계없이, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 약학 제품으로서 사용하기거나 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합을 포함하나 이로 한정되지 않은 추가 공정에 사용하기에 충분하다.
특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 (부형제, 담체 및 안정화제, 혈청 알부민 등 외에) 다른 활성 성분 또는 단백질의 부재 하에서 치료제로서 사용될 수 있고, 특정 실시양태에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 착물을 형성할 수 있다.
2. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제
일반적 정제 방법
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 일반적 정제에 적용될 수 있다. 다양한 단리 단계들 중 어느 하나를 세포 용해물 추출물, 배양 배지, 봉입체, 숙주 세포의 세포질주위 공간, 숙주 세포의 세포질, 또는 원하는 폴리펩티드를 포함하는 다른 물질에 대해 수행할 수 있거나, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 확장된 층(expanded bed) 흡착, 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 임의의 적합한 순서로의 이들 방법의 반복을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 발생된 임의의 폴리펩티드 혼합물에 대해 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 기법을 수행하는 데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 입수가능하다. 펌프, 분획 수집기(fraction collector), 모니터(monitor), 기록기(recorder) 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 라보라토리즈, 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(캘피로니아주 허큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 이러한 회사들로부터 입수가능하다.
본 명세서에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법에서의 평형화 및 다른 단계, 예를 들어, 세척 및 용출은 특수 장치, 예를 들면 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행할 수 있다. 시판되는 펌프는 하이로드(HILOAD)® 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
분획 수집기의 예는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기인 FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 슈퍼프랙(SUPERFRAC)® 분획 수집기(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기도 입수가능하다. 시판되는 혼합기는 그라디안트 믹서(Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기(In-Line Mixer)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.
임의의 시판되는 모니터를 사용하여 크로마토그래피 방법을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는 데 사용될 수 있다. 검출기의 예는 모니터(Monitor) UV-1, 유니코드(UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전체 시스템이 상업적으로 입수가능하다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 실시양태에서, 예를 들면, 폴리펩티드는 먼저 생성된 정제된 폴리펩티드를 우레아 중에서 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제(예를 들면, DTT)를 함유하는 TRIS 완충제로 희석시킴에 의해 환원되고 변성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드를 약 2 M 내지 약 9 M의 농도의 우레아 중에서 변성시킨 후, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 TRIS 완충제 중에서 희석시킨다. 그 다음, 이 실시양태의 리폴딩 혼합물을 항온처리할 수 있다. 한 실시양태에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 항온처리한다. 그 다음, 환원되고 변성된 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리할 수 있거나 정제할 수 있다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 폴리펩티드 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 농축시킬 수 있다. 나아가, 당업자에게 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용출 완충제를 다음 단리 단계에 적합한 완충제로 교환할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이온 교환 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택적 추가 단계로서 이온 교환 크로마토그래피를 제1 폴리펩티드 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](카달로그 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 시판되는 이온 교환 컬럼은 하이트랩(HITRAP)®, 하이프랩(HIPREP)® 및 하이로드® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면 Q 세파로스® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면 SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스® 패스트 플로우 및 SP 세파로스® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면 DEAE 세파로스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면 CM 세파로스® 패스트 플로우(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 과정 중 임의의 단계에서 폴리펩티드에 대해 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유질, 다공성, 비-다공성, 미세구형(microgranular), 비드형 또는 가교-결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질로는 셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 이들의 임의의 복합체가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 폴리펩티드를 양이온 교환 매트릭스에 흡착시킨 후, 폴리펩티드를 매트릭스로부터 탈착시키기에 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 가진 완충제와 상기 매트릭스를 접촉시킴으로써 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 높은 pH 용출에서 사용하기에 적합한 완충제로는 농도가 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이하인 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
역상 크로마토그래피
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 역상 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 적합한 프로토콜에 따라 RP-HPLC를 수행하여 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 폴리펩티드에 대해 수행하여 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 이와 관련하여, 약 C3 이상 내지 약 C30 이상, 약 C3 이상 내지 약 C20 이상, 또는 약 C3 이상 내지 약 C18 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 길이를 갖는 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도화 수지를 사용할 수 있다. 별법으로, 중합체 수지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 나아가, RP-HPLC 컬럼을 용매, 예를 들면 에탄올로 세척할 수 있다. 이온 페어링 시약(ion pairing agent) 및 유기 개질제, 예를 들면, 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용출 완충제를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온 페어링 시약은 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 하나 이상의 구배 또는 등용매 조건을 이용하여 용출을 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간 및 피크 폭을 감소시키기에 바람직한 구배 조건이다. 또 다른 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2종의 구배를 이용하는 것을 포함한다. 본원에서 사용하기에 적합한 용출 완충제의 예는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 폴리펩티드에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 본원에 참고로 도입되는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))]을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 매트릭스는 아가로오스, 가교-결합된 아가로오스, 세파로스, 셀룰로오스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬-치환 매트릭스 또는 아릴-치환 매트릭스, 예를 들면 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스; 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸-치환 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 혼합된 형태의 수지를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 대한 시판되는 공급원은 하이트랩®, 하이프랩® 및 하이로드® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 요약하면, 로딩(loading) 전, HIC 컬럼을 당업자에게 공지된 표준 완충제, 예를 들면 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 헤페스를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 그 다음, 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 완충제를 사용하여 세척하고, 폴리펩티드를 HIC 컬럼 상에서 보유하면서 원치 않는 물질을 제거하도록 컨디셔닝할 수 있다. 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 완충제, 예를 들면 EDTA, 및 평형 완충제보다 낮은 농도의 황산암모늄을 함유하는 헤페스 완충제, 또는 아세트산/염화나트륨 완충제 등을 사용하여 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 이용하는, 감소하는 선형 염 구배를 이용하여 폴리펩티드 분자를 용출할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 여과, 예를 들면 투석여과 또는 한외여과에 의해 용출물을 농축할 수 있다. 투석여과를 이용하여 폴리펩티드를 용출하는 데 사용되는 염을 제거할 수 있다.
다른 정제 기법
본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 정제 기법에 적용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 겔 여과(본원에 참고로 도입되는 문헌[GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS], 카달로그 번호 18-1022-18, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(적절한 매트릭스는 HA-울크로겔, 고해상(칼바이오켐), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(바이오라드), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(바이오라드)), HPLC, 확장된 층 흡착, 한외여과, 투석여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물에 대해 수행함으로써, 임의의 과량의 염을 제거하고, 완충제를 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약품의 제형화에 적합한 완충제로 교체할 수 있다. 본 명세서에 기재된 각 단계에서 당업자에게 공지되어 있는 기법을 사용하여, 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 기법은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 수율을 평가하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 수율은 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 뿐만 아니라 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 임의의 여러 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC 등을 사용하여 모니터링할 수 있다.
특정 실시양태에서, 각 정제 단계 후의 폴리펩티드의 수율은 각 정제 단계 후 출발 물질 중의 폴리펩티드의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9% 이상 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.
순도는 표준 기법, 예를 들면 SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블롯(Western blot) 및 ELISA 분석을 이용하여 폴리펩티드를 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 다클론 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.
RP-HPLC 물질 비다크(Vydac) C4(비다크)는 그 표면이 C4-알킬 쇄를 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 폴리펩티드의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출을 수행한다. 스테인레스 강철 컬럼(2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전됨)을 사용하여 분취형 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 히드록시아파타이트 울트로겔 용출액을 산성화시키고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충제로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 폴리펩티드 분획을 풀링한다.
DEAE 세파로스(파마시아) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유결합된 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. DEAE 기와 폴리펩티드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 보유되지 않으면서 컬럼을 통과한다. 이들 물질들을 세척한 후, 낮은 pH에서 아세테이트 완충제로 컬럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 그 다음, 컬럼을 중성 포스페이트 완충제로 세척하고, 폴리펩티드를 증가된 이온 강도를 갖는 완충제로 용출한다. 컬럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 팩킹한다. 컬럼 부피는 겔 1 ㎖ 당 3 내지 10 mg의 폴리펩티드 범위 내의 폴리펩티드 로딩이 이루어지도록 조정한다. 컬럼을 물 및 평형화 완충제(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용출액의 풀링된 분획을 로딩하고, 컬럼을 평형화 완충제로 세척한다. 그 다음, 컬럼을 세척 완충제(아세트산나트륨 완충제)로 세척한 후, 평형화 완충제로 세척한다. 그 후, 용출 완충제(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 폴리펩티드를 컬럼으로부터 용출하고, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용출액은 특정한 전도성을 갖도록 조정한다. 생성된 약물을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70 ℃에서 저장한다.
추가 방법은 내독소를 제거하는 단계를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 내독소는 그람-음성 숙주 세포 예컨대, 이. 콜라이의 외막 상에 위치된 리포폴리-사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 사용한 정제 기법, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이 방법들의 조합 방법 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드로부터 오염물질 예컨대, 동시-이동하는 단백질을 제거하기 위한 변형 방법 또는 추가 방법이 필요할 수 있다. 내독소 수준의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고 리뮬러스 아메보사이트 용해물(LAL) 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
추가 방법 및 절차로는 단백질 염색 방법과 커플링된 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광계(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전위 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광 분석(circular dichroism)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내로 생합성적으로 도입됨으로써 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 아미노산은 폴리펩티드 내의 특정 부위에 도입된다. 다른 실시양태에서, 이러한 아미노산은 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드 내로 도입한다. 다른 실시양태에서, 이러한 번역 시스템은 (i) 상기 아미노산의 도입을 위한 예정된 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하며 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 상기 아미노산을 포함하며 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 시스템에서 생성된 mRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 파지를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 내로 안정하게 도입된다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비-천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, tRNA는 억제자 tRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 상기 아미노산으로 아미노아실화된 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 상기 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 리보좀에 의해 합성되고, 추가 실시양태에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진핵세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 생체내 번역 시스템이다. 다른 실시양태에서, 세포는 이. 콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종으로부터의 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시양태에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 또는 진핵세포로부터의 세포 추출물을 포함하는 시험관내 번역 시스템이다. 다른 실시양태에서, 세포 추출물은 이. 콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종으로부터의 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포로부터 유래된 것이다. 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드의 적어도 일부는 고체상 펩티드 합성 또는 용액상 펩티드 합성 또는 이들의 조합 기법에 의해 합성되지만, 다른 실시양태는 상기 폴리펩티드를 또 다른 폴리펩티드에 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내로 생합성적으로 도입될 수 있고, 이때 상기 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타내는 단백질이다.
B. 생체내 번역 후 변형
진핵세포에서 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 제조함으로써 이러한 폴리펩티드는 진핵세포에서의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 하나 이상의 비-천연 아미노산, 및 진핵세포에 의해 생체내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 번역 후 변형은 원핵세포에 의해서는 만들어지지 않는다. 예를 들어, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-연결 변형, 글리코실화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 연결에 의해 올리고사카라이드((GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc를 포함하는 이로 한정되지 않음)를 아스파라진에 부착시킨 단계를 포함한다. 진핵세포 단백질의 N-연결 올리고사카라이드의 일부 예가 나열된 하기 표 1을 참조한다(기재되지 않은 추가 잔기도 존재할 수 있음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 연결, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 연결로 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시킨 단계를 포함한다.
[표 1]
Figure 112013073088060-pat00045
또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구인슐린(preproinsulin), 전구인슐린(proinsulin), 전전구-오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 단백질분해 처리, 다중서브유닛(multisubunit) 단백질 또는 거대분자 조립체(assembly)로의 조립, 세포 내의 또 다른 부위로의 이동(소기관, 예를 들면 소포체, 골기체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로의 이동 또는 분비성 경로를 통한 이동을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.
비-천연 아미노산의 한 이점은 추가 분자를 부가시키는 데 사용될 수 있는 추가 화학적 부분을 제공한다는 점이다. 이러한 변형은 진핵세포 또는 비-진핵세포의 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 비-천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선별적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나 이들로 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유결합 형성을 포함한다. 이러한 경우, 선별성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근용이성에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 제조한 폴리펩티드에서, 시험관내 및 생체내에서의 비-천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 포함하나 이로 한정되지 않는 다른 더 많은 선별적 반응들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7]을 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교연결제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약 호스트(host)를 사용하여 사실상 임의의 단백질을 선별적으로 표지할 수 있게 한다. 또한, 본원에 참고로 도입되는, 2003년 1월 16일 출원된 미국특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "당단백질 합성")를 참조한다. 또한, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 번역 후 변형은 스타우딩거 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용한 결합을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조한다.
IX . 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 대체 시스템
비-재조합 숙주 세포, 돌연변이된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 몇몇 방법들이 사용되었다. 본 단락에 개시된 대체 시스템은 비-천연 아미노산의 제조에 적용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 측쇄, 예를 들면 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도화는 라이신을 N2-아세틸-라이신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비-천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 효소에 의한 펩티드 단편의 연결 및 펩티드 단편의 천연 화학적 연결이 최근에 개발되었기 때문에, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 화학적 펩티드 결찰 및 천연 화학적 결찰은 본 명세서에 완전히 참고로 도입되는 미국특허 제6,184,344호, 미국특허 공보 제2004/0138412호, 미국특허 공보 제2003/0208046호, 및 국제특허공보 제WO 02/098902호 및 제WO 03/042235호에 기재되어 있다. 원하는 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제자 tRNA를, 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반적인 시험관내 생합성 방법을 이용하여 100개 초과의 비-천연 아미노산을 사실상 임의의 크기의 다양한 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하였다. 예를 들면, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34; 621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989); and, J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 전달도입의 연구를 위해 매우 다양한 작용기가 단백질 내로 도입되었다.
선별적 압력 도입으로 지칭되는 생체내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 실시하였다. 예를 들면, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 세포에 특정한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 생장하지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 생장기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 고갈되고, 비-천연 아미노산 유사체로 교체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비-천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 방법에 의해, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질 내로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더(shoulder)를 나타내며(예를 들면, 문헌[C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29 (2000)] 참조), 19F NMR을 이용하여 키토올리고사카라이드 리간드와 메티오닌의 상호작용을 연구하기 위해 박테리오파지 T4 리소자임(lysozyme)에서 메티오닌을 트리플루오로메티오닌으로 치환하는 데 사용되었고(예를 들면, 문헌[H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry. 36: 3404 (1997)] 참조), 트리플루오로류신을 류신 대신에 도입하여, 류신-지퍼(zipper) 단백질의 열적 안정성 및 화학적 안정성을 증가시켰다. 예를 들면, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40: 1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 나아가, 셀레노메티오닌(selenomethionine) 및 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질 내로 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌[W. A. Hendrickson, J.R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1: 283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230: 788 (1995); and, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270; 616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의한 단백질의 추가 변형을 가능하게 하였다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122: 1282 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487 (2000)]; 미국특허 제6,586,207호; 및 미국특허출원 공개 제2002/0042097호를 참조할 수 있다.
이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비-천연 아미노산 유사체의 인식에 달려 있고, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선별성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되었다. 예를 들면, 이. 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala294의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 일으킨다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33: 7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이 돌연변이체 PheRS를 보유하는 이. 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입한다. 예를 들면, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364: 272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467: 37 (2000)]을 참조할 수 있다. 유사하게, 이. 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 티로신보다 아자티로신을 더 효율적으로 도입하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275: 40324 (2000)]을 참조할 수 있다.
비-천연 아미노산을 생체내에서 단백질 내로 도입하는 또 다른 방법은 교정(proofreading) 기전을 갖는 합성효소를 개질시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이 오류는 분리된 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된(mischarged) 아미노산을 탈아실화시켜 단백질 번역의 신뢰도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 작용하지 못하는 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing) 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이 방법은 발릴-tRNA 합성효소(VaIRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292: 501 (2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아미노아실화시킬 수 있고, 이러한 비-동족 아미노산들은 추후 교정 도메인에 의해 가수분해된다. 이. 콜라이 염색체의 무작위적 돌연변이유발 후, ValRS의 교정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 이. 콜라이 균주를 선별하였다. 이러한 교정-결핍 ValRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에, Cys의 -SH 기는 Abu의 -CH3로 치환되고 돌연변이체 ValRS도 이 돌연변이체 이. 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에 생장하는 경우 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분광 분석은 천연 단백질 내의 각각의 발린 위치에서 발린의 약 24%가 Abu로 치환된다는 것을 보여준다.
또한, 고체-상 합성 및 반합성 방법도 새로운 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다: 문헌[Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of prazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am. Chem., 88 (24): 5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256 (5054): 221-225 (1992); Chaiken, I. M. Seniisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev. Biochem., 11 (3): 255-301 (1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means, Protein Eng., 1 (3): 151-157 (1987); and, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183): 243 (1994)].
화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비-천연 측쇄를 시험관내에서 단백질 내로 도입하는 데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌[Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev. Biochem., 54: 565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226 (4674): 505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J Am. Chem. Soc., 3153-3154 (1966); and, Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881): 1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.
별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법을 사용하여 몇몇 생물리적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질 내로 도입하였다. 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev. Biochem., 62: 483-514 (1993); and, Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (22): 8604- 8608 (1986)].
종래, 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비-천연 아미노산을 시험관내에서 부위 특이적으로 도입할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법들을 이용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성을 갖는 균주를 사용하여 다수의 20종의 공통된 아미노산을 유사한 구조의 상동체로 치환시킬 수 있고, 예를 들면, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J Am. Chem. Soc., 111: 8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13: 41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.
예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 제조하였다. 보편적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 정지 코돈 TAG를 단백질 유전자 내의 원하는 부위에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16 (3): 791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제자 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정한 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 비-천연 아미노산이 도입되었다. [3H]-Phe을 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정한 위치에서만 도입되고, 이 아미노산이 단백질 내의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 문헌[Noren, et al, supra: Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6): 425-432; and, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041): 197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.
또한, 미세주사(microinjection) 기법을 사용하여 비-천연 아미노산을 단백질에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J.R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268: 439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 645 (2000)]을 참조할 수 있다. 시험관내에서 제조된 2개의 RNA 종(원하는 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비-천연 아미노산으로 아미노아실화된 엠버 억제자 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 주사하였다. 그 다음, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에서 비-천연 아미노산을 삽입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템에서 생성되지 않는 일체형(integral) 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 태치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체 내로 도입하여 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들면, 문헌[G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271: 19991 (1996)] 참조); 이온 채널에서 표면-노출된 잔기를 확인하기 위해 바이오티닐화 아미노산을 도입하는 것(예를 들면, 문헌[J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4: 739 (1997)] 참조); 실시간으로 이온 채널의 구조적 변화를 모니터링하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용하는 것(예를 들면, 문헌[J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998)] 참조), 및 관문(gating) 기전을 프로빙(probing)하기 위해 알파 히드록시 아미노산을 사용하여 이온 채널 골격을 변화시키는 것을 포함한다(예를 들면, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96: 89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4: 239 (2001)] 참조).
생체내에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포, 또는, 가능한 경우, 살아있는 유기체에서의 돌연변이체 단백질의 연구 가능성, 및 치유적 치료에 있어서의 이러한 돌연변이체 단백질의 사용이라는 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 성질을 갖는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력은 단백질 기능을 프로빙하고 새로운 성질을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생성하기 위해 단백질의 구조를 합리적 및 체계적으로 개조하는 능력을 크게 확장시킬 수 있다.
파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하려는 한 시도에서, 효모 앰버 억제자 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 이. 콜라이 균주에서 사용하였다. 예를 들면, 문헌[R. Furter, Protein Sci. 7: 419 (1998)]을 참조할 수 있다.
무세포(시험관내) 번역 시스템을 사용하여 원하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻을 수도 있다. 번역 시스템은 세포 또는 무세포 시스템일 수 있고, 원핵 또는 진핵 시스템일 수 있다. 세포 번역 시스템으로는 투과가능한 세포 또는 세포 배양물과 같은 전체 세포 제제(preparation)가 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 이때 원하는 핵산 서열은 mRNA로 전사될 수 있고, mRNA는 번역될 수 있다. 무세포 번역 시스템은 시판되고 있으며, 많은 다양한 종류 및 시스템이 잘 공지되어 있다. 무세포 시스템의 예에는 원핵세포 용해물 예컨대, 이. 콜라이 용해물, 진핵 세포 용해물 예컨대, 밀 생식세포 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상적혈구 용해물, 토끼 난자 용해물 및 인간 세포 용해물이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 진핵세포 추출물 또는 용해물은 생성된 단백질이 글리코실화되거나, 인산화되거나, 또는 달리 변형될 때 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 많은 변형이 진핵세포 시스템에서만 가능하기 때문이다. 이 추출물 및 용해물 중 일부는 시판되고 있다(Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N. Y.). 분비 단백질을 번역하는 데 유용한 막 추출물 예컨대, 마이크로좀 막을 함유하는 개 췌장 추출물 또한 사용될 수 있다. 주형(시험관 내 번역)으로서의 mRNA 또는 주형(시험관 내 전사와 번역이 조합됨)으로서의 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관 내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Kim, D. M. and J.R. Swartz, Biotechraology and Bioengineering, 74: 309-316 (2001); Kim, D. M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechnology 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허출원 공개 제2002/0081660호; 및 국제특허출원 공개 제WO 00/55353호 및 제WO 90/05785호를 참조할 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 방법은 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들면, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이 방법에서, 퓨로마이신(puromycin)에 결합된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비-천연 아미노산 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관 내 분석에서 흥미로운 성질을 갖는 것으로 발견된 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 보다 최근에, 정제된 성분을 사용한 시험관 내 리보좀 번역이 비-천연 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌[A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100: 6353 (2003)]을 참조할 수 있다.
재구성된 번역 시스템을 사용할 수도 있다. 또한, 정제된 번역 인자들의 혼합물뿐만 아니라 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3, 연장 인자 T(EF-Tu) 또는 종결 인자와 같은 정제된 번역 인자들로 보충된 용해물 또는 용해물의 조합물도 mRNA를 단백질로 성공적으로 번역하는 데 사용되고 있다. 또한, 무세포 시스템은 커플링된 전사/번역 시스템일 수 있으며, 이때 DNA는 시스템에 도입되어 mRNA로 전사되고, 이 mRNA는 참고로 본 명세서에 구체적으로 도입되는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993)]에 기재된 바와 같이 번역된다. 진핵세포 번역 시스템 내에서 전사된 RNA는 일부 번역 시스템에서 이점이 될 수 있는, 이종핵(heteronuclear) RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 테일 보유 성숙 mRNA의 형태일 수 있다. 예를 들면, 캡핑된 mRNA는 망상적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.
tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나 이들로 한정되지 않은 임의의 방법 또는 기법에 의해 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.
아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해 또는 리보자임을 포함하나 이로 한정되지 않는 다른 효소적 분자에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매 RNA"와 상호교환적으로 사용된다. 문헌[Cech, 1987, Science, 236: 1532- 1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64: 221-226)]은 촉매(리보자임)로서 작용할 수 있는 천연 발생 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이 천연 RNA 촉매가 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에 대해 작용하는 것으로만 밝혀져 있다 하더라도, 최근 리보자임의 인위적 진화의 개발은 다양한 화학 반응에 대한 촉매활성의 레파토리(repertoire)를 확장시켰다. 연구에 의해, 그 자신의 (2')3'-말단 상의 아미노아실-RNA 결합을 촉매작용에 의해 촉진할 수 있는 RNA 분자(Illangakekare et al., 1995 Science 267: 643-647), 및 아미노산을 한 RNA 분자로부터 또 다른 분자에 전달할 수 있는 RNA 분자(Lohse et al., 1996, Nature 381: 442-444)가 확인되었다.
본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0228593호에는 리보자임을 구축하는 방법, 및 천연적으로 코딩된 아미노산 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서 리보자임의 용도가 기재되어 있다. 리보자임을 포함하나 이로 한정되지 않는, tRNA를 아미노아실화시킬 수 있는 효소적 분자의 지지체-고정 형태는 아미노아실화된 생성물의 효율적인 친화 정제를 가능하게 할 수 있다. 적절한 지지체의 예로는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드가 있다. 아미노아실화에 대한 리보자임의 지지체-고정 형태의 제조 및 용도는 문헌[Chemistry and Biology 2003, 10: 1077-1084], 및 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0228593호에 기재되어 있다.
아미노아실화에 있어서 합성효소의 사용을 피하기 위한 화학적 아미노아실화 방법은 본원에 참고로 도입되는 문헌[Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) and by Schultz, Chamberlin, Dougherty and others (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621 ; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34]에 기재된 것들을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 방법 또는 다른 화학적 아미노아실화 방법을 이용하여 tRNA 분자를 아미노아실화시킬 수 있다.
촉매 RNA의 제조 방법은 무작위화된 리보자임 서열의 분리된 풀을 발생시키는 단계, 상기 풀에 대한 지시된 진화를 수행하는 단계, 원하는 아미노아실화 활성에 대해 상기 풀을 검색하는 단계, 및 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
리보자임은 GGU 모티프 및 U-풍부 영역과 같은, 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, U-풍부 영역은 아미노산 기질의 인식을 촉진할 수 있고, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기쌍을 형성할 수 있다고 보고되어 있다. 추가로, GGU-모티프와 U-풍부 영역은 아미노산 및 tRNA의 동시 인식을 촉진하여 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화를 촉진한다.
리보자임은 tRNAAsnCCCG와 접합된 부분적으로 무작위화된 r24mini를 사용한 시험관 내 선별 후 활성 클론에서 발견된 컨센서스 서열의 전체적 조작에 의해 생성될 수 있다. 이 방법에 의해 수득되는 예시적 리보자임은 "Fx3 리보자임"으로서 지칭되며, 본원에 완전히 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0228593호에는 동족 비-천연 아미노산으로 충전된 다양한 아미노아실-tRNA의 합성에 있어서 다용도 촉매로서 작용하는 것으로서 기재되어 있다.
지지체 상의 고정화를 이용하여 아미노아실화된 tRNA를 효율적으로 친화 정제할 수 있다. 적절한 지지체의 예로는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용하여 수지 상에 고정시킬 수 있으며, 예를 들어, RNA의 리보스 상의 3'-시스-디올을 페리오데이트로 산화시켜 상응하는 디알데히드를 생성함으로써 수지 상의 RNA의 고정화를 촉진할 수 있다. 저렴한 히드라지드 수지를 비롯한 다양한 유형의 수지를 사용할 수 있으며, 이때 환원성 아민화는 수지와 리보자임 사이의 상호작용을 비가역적 결합으로 만든다. 아미노아실-tRNA의 합성은 이 컬럼 상의 아미노아실화 기법에 의해 상당히 촉진될 수 있다. 문헌[Kourouklis et al. Methods 2005; 36: 239-4]에는 컬럼-기재 아미노아실화 시스템이 기재되어 있다.
아미노아실화된 tRNA의 단리는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 한 가지 적당한 방법은 10 mM EDTA를 포함하는 아세트산나트륨 용액, 50 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl 및 10 mM EDTA을 함유하는 완충제(pH 7.0), 또는 단순히 EDTA에 의해 완충된 물(pH 7.0)과 같은 완충제를 사용하여 컬럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 회수하는 것이다.
아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가함으로써, 상기 tRNA에 의해 아미노아실화된 아미노산을 번역 반응에 의해 만들어지는 폴리펩티드 내의 선별된 위치에 도입할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예로는 세포 용해물이 있으나 이로 한정되지 않는다. 세포 용해물은 투입 mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관 내에서 번역하기 위해 필요한 반응 성분들을 제공한다. 이러한 반응 성분들의 예에는 리보좀 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 연장 인자, 및 번역과 관련된 다른 인자들이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 번역 시스템은 회분식 번역 또는 구획화된 번역일 수 있다. 회분식 번역 시스템은 단일 구획에서 반응 성분들을 조합시키는 반면, 구획화된 번역 시스템은 번역 효율을 억제할 수 있는 반응 생성물들로부터 번역 반응 성분들을 분리한다. 이러한 번역 시스템은 시판되고 있다.
또한, 커플링된 전사/번역 시스템을 사용할 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 투입 DNA가 상응하는 mRNA로 전사되게 하고, 상기 mRNA가 반응 성분들에 의해 번역되게 한다. 시판되는 커플링된 전사/번역의 예는 빠른 번역 시스템(RTS, Roche Inc.)이다. 이 시스템은 리보좀 및 번역 인자들과 같은 번역 성분들을 제공하기 위해 이. 콜라이 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 추가로, RNA 중합효소는 투입 DNA를 번역에 사용될 mRNA 주형으로 전사시키기 위해 포함된다. RTS는 공급/소비 구획 및 전사/번역 구획을 비롯한 반응 구획 사이에 삽입된 막에 의한 반응 성분들의 구획화를 이용할 수 있다.
tRNA의 아미노아실화는 트랜스퍼라제, 중합효소, 촉매 항체, 다기능 단백질 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 물질에 의해 수행될 수 있다.
문헌[Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33]에는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입하는 추가 방법이 기재되어 있다. 문헌[Lu et al. in Mol. Cell. 2001 Oct; 8(4): 759-69]에는 비-천연 아미노산을 함유하는 합성 펩티드에 단백질을 화학적으로 결찰시키는 방법(발현된 단백질 결찰)이 기재되어 있다.
X. 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분의 번역 후 변형
단백질의 생체내 번역 과정 동안에 비-천연 아미노산을 부위 특이적으로 도입하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단이 개발되었다. 이 기술은 천연 발생 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날한 측쇄를 가진 비-천연 아미노산을 도입함으로써 재조합 단백질의 부위 특이적 유도화를 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단의 주요 이점은 유도화된 단백질이 소정의 균질한 생성물로서 제조될 수 있다는 점이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 생체내 번역 기법에 의해 형성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 한정되지 않고, 예를 들어, 시험관내 기법, 발현된 단백질 결찰, 화학적 합성, 리보자임-기재 기법(예컨대, 본원의 "대체 시스템에서의 발현" 단락 참조)을 비롯한 임의의 기법에 의해 형성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다.
비-천연 아미노산을 재조합 단백질 내로 도입하는 능력은 번역 후 유도화를 위해 실시될 수 있는 화학적 기법을 넓게 확장시키는데, 이때 이러한 유도화는 생체내 또는 시험관내에서 일어난다. 보다 구체적으로, 카르보닐 함유 화합물 예컨대, 알데히드와 방향족 아민 사이의 환원성 알킬화 또는 환원성 아민화 반응을 이용하여 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 알킬화 아민 연결을 형성하는 단백질 유도화는 여러 이점을 제공한다. 첫째, (a) 천연 발생 아미노산이 카르보닐 기와 반응하여 알킬화 방향족 아민을 형성할 수 있는 방향족 아민 기를 함유하지 않고, (b) 방향족 아민 기가 카르보닐 함유 기와 반응하여 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 알킬화 아민을 형성하므로 이러한 알킬화 아민을 형성하기 위해 디자인된 시약이 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분과 부위 특이적으로 반응할 것이다(물론 비천연 아미노산 및 상응하는 시약은 알킬화 아민 및 상응하는 아민 연결을 형성하도록 디자인되었다고 가정함). 이러한 부위 특이적 유도화는 도 19 내지 34에 나타나 있는데, 이때 방향족 아민을 함유하는 측쇄는 양자를 갖는 아민 또는 이미디졸 부분을 함유하는 측쇄에 비해 우세하게 환원적으로 알킬화된다. 둘째, 이러한 알킬화 방향족 아민은 생물학적 조건 하에 안정한 아민 연결을 가지는데, 이는 이러한 연결에 의해 유도화된 단백질이 치료에 사용하기에 유효한 후보물질임을 시사한다. 셋째, 이러한 아민 연결의 안정성은 상기 연결이 형성된 비-천연 아미노산의 본질(즉, 작용기 및/또는 구조)에 기초하여 개조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 2차 아민 또는 3차 아민 연결을 포함하는 알킬화 아민은 1시간 미만의 분해 반감기, 다른 실시양태에서는 1일 미만의 분해 반감기, 다른 실시양태에서는 2일 미만의 분해 반감기, 다른 실시양태에서는 1주일 미만의 분해 반감기, 다른 실시양태에서는 1주일 초과의 분해 반감기를 가진다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 4주 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 3주 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 2주 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 1주 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 6일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 5일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 4일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 3일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 2일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 1일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 24시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 12시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 6시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 3시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 2시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 생물학적 조건 하에서 1시간 이하 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 약산성 조건 하에서 2주 이상 동안 안정하고, 다른 실시양태에서, 2차 아민 또는 3차 아민을 비롯한 생성된 알킬화 아민은 약산성 조건 하에서 5일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약 2 내지 약 8의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 2 내지 약 6의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 2 내지 약 4의 pH에서 1일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약 6 내지 약 10의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 4 내지 약 8의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 4 내지 약 10의 pH에서 1일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약 2 내지 약 5의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 3 내지 약 7의 pH에서, 다른 실시양태에서는 약 3 내지 약 10의 pH에서 1일 이상 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 수단, 방법, 조성물 및 기법을 이용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 2차 아민 또는 3차 아민 연결을 포함하는 알킬화 아민의 합성을 변경하여 분해 반감기를 (예컨대, 지속 방출과 같은 치료 용도, 진단 용도, 상업적 제품, 또는 산업적 용도 또는 군사적 용도) 요구되는 수준까지 바꿀 수 있다.
전술한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구 등에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다. 전술한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 용도에는 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도가 포함된다. 전술한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치료 효과의 개질, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질의 조절(예컨대, 수용성 및 생체이용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 폴리펩티드 내로의 태그, 표지 또는 검출가능한 신호의 도입, 폴리펩티드의 단리 성질의 개선 및 전술한 변형의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 한정되지 않는 새로운 또는 개선된 기능을 도입하기 위한 추가 변형을 받을 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다.
이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소, 활성화된 착물 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 백터, 거대분자, 미모토프, 수용체, 리버스 미셀 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상에 추가 작용기를 도입하는 것을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 하기 화학식 A 내지 E의 아미노산 중 어느 하나를 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 더 변형시킬 수 있다:
(a) 화학식 A
Figure 112013073088060-pat00046
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00047
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
이러한 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식의 아미노산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00048
상기 식에서,
A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00049
로부터 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00050
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식의 아미노산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00051
상기 식에서,
G는 하기 기들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아민 보호기이다:
Figure 112013073088060-pat00052
(b) 화학식 B
Figure 112013073088060-pat00053
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00054
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Y는 -NH-NH2, -NH-NHR', -CR'=NR', -NO2 또는 -N3이고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산에는 하기 구조를 갖는 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00055
(c) 화학식 C
Figure 112013073088060-pat00056
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00057
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
이러한 비-천연 아미노산에는 하기 화학식의 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00058
상기 식에서,
A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00059
로부터 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00060
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
(d) 화학식 E
Figure 112013073088060-pat00061
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R")-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-으로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
R6은 알데히드, 보호된 알데히드 또는 차폐된 알데히드이고, 이때 보호기로는
Figure 112013073088060-pat00062
이 있으나, 이들로 한정되지 않고, 이때 X1 각각은 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 이때 R' 및 R 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
(e) 화학식 D
Figure 112013073088060-pat00063
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R")-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R")S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R")=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
Figure 112013073088060-pat00064
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 측면에서, 번역 후 변형된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 번역 후 변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 상이한 번역 후 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드 내에 존재하는 1개 이상(그러나, 전체 아미노산보다 적은 수)의 특정 아미노산이 번역 후 변형된 비-천연 아미노산으로 치환되어 있는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 번역 후 변형된 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드의 경우, 번역 후 변형된 비-천연 아미노산은 동일할 수 있거나, 상이할 수 있거나, 동일한 종류의 다수의 번역 후 변형된 비-천연 아미노산과 하나 이상의 상이한 번역 후 변형된 비-천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
A. 단일 번역 후 변형 단계를 이용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 방향족 아민 함유 비 -천연 아미노산과 카르보닐-함유 시약의 환원성 알킬화 반응
천연 발생 아미노산의 측쇄는 매우 높은 친핵성을 나타내는 부위를 갖지 않는다. 그러므로, 예를 들어, 방향족 아민 기 또는 치환 방향족 아민 기를 함유하는 아미노산을 포함하는 친핵체-함유 측기를 갖는 비-천연 아미노산의 도입은 알데히드-함유 시약을 비롯한 카르보닐 함유 시약에의 친핵체 부가를 통한 이 측기의 부위 특이적 알킬화 후 환원 반응을 가능하게 한다. 이러한 환원성 알킬화 반응은 2차 아민 및 3차 아민을 비롯한 아민 연결을 발생시킨다.
유도화하고/하거나 더 변형시키는 방법은 환원성 알킬화 단계 전에 또는 환원성 알킬화 단계 후에 정제된 천연 발생 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 유도화하고/하거나 더 변형시키는 방법은 이러한 변형 전에 또는 후에 정제된 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다.
알데히드-함유 시약을 사용한 방향족 아민-함유 폴리펩티드의 환원성 알킬화에 기초한 폴리펩티드의 번역 후 변형은 상이한 이점을 가진다. 첫째, 약 4 내지 약 10의 pH 범위(추가 실시양태에서, 약 4 내지 약 7의 pH 범위)에서 환원제 예컨대, NaBCNH3를 사용하여 알데히드 및 케톤을 비롯한 카르보닐-함유 화합물로 방향족 아민을 환원적으로 알킬화시켜 2차 및 3차 아민 연결을 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 환원제로는 TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6 및 NaBH4가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 둘째, 이 반응 조건 하에서 화학 반응은 천연 발생 아미노산의 측쇄가 반응성을 나타내지 않기 때문에 비-천연 아미노산에 대한 선별성을 나타낸다. 이것은 방향족 아민 부분 또는 보호된 알데히드 부분을 함유하는 비-천연 아미노산이 도입된 폴리펩티드(예를 들어, 재조합 단백질을 포함함)의 부위 특이적 유도화를 허용한다. 이로써, 이러한 유도화 폴리펩티드 및 단백질은 소정의 균질한 생성물로서 제조될 수 있다. 셋째, 폴리펩티드 내로 도입된 아미노산 상의 방향족 아민 부분과 알데히드 함유 시약의 반응에 영향을 미치기 위해 필요한 온화한 조건은 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외됨). 유사하게, 폴리펩티드 내로 도입된 아미노산 상의 알데히드 부분과 방향족 아민 함유 시약의 반응에 영향을 미치기 위해 필요한 온화한 조건은 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(물론, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외됨). 넷째, 반응이 실온에서 신속히 일어나기 때문에, 보다 높은 온도에서 불안정한 많은 종류의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나기 때문에, 비-수용액과 함께 (임의의 정도까지) 상용될 수 없는 폴리펩티드 및 시약을 사용할 수 있다. 여섯째, 시약에 대한 폴리펩티드 또는 아미노산의 비가 화학양론적, 화학양론적-유사 또는 거의-화학양론적인 경우에도 반응이 용이하게 일어나기 때문에, 유용한 양의 반응 생성물을 얻기 위해 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가할 필요가 없다. 일곱째, 생성된 아민이 반응물의 아민 및 카르보닐 부분의 디자인에 따라 위치선별적 및/또는 위치특이적으로 생성될 수 있다. 마지막으로, 알데히드 함유 시약을 사용한 방향족 아민의 환원성 알킬화, 및 방향족 아민 함유 시약을 사용한 알데히드의 환원성 아민화는 생물학적 조건 하에서 안정한 2차 및 3차 아민을 비롯한 아민 연결을 생성한다.
예를 들어, 하기 화학식 A 및 C의 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 알데히드-함유 시약으로 환원적으로 알킬화될 수 있다:
(a) 화학식 A
Figure 112013073088060-pat00065
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00066
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
이러한 비-천연 아미노산으로는 하기 구조를 갖는 아미노산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00067
상기 식에서, A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00068
로부터 각각 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00069
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산으로는 하기 화학식의 아미노산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00070
상기 식에서,
G는 하기 기들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아민 보호기이다:
Figure 112013073088060-pat00071
(b) 화학식 C
Figure 112013073088060-pat00072
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00073
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임);
2개의 R5 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
이러한 비-천연 아미노산에는 하기 화학식의 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00074
상기 식에서,
A' 각각은 CRa, N 및
Figure 112013073088060-pat00075
로부터 각각 독립적으로 선택되고, 2개 이하의 A'는
Figure 112013073088060-pat00076
일 수 있고, 남은 A'는 CRa 및 N으로부터 선택된다.
이러한 환원성 알킬화 반응은 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 일-알킬화 또는 이-알킬화 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 번역 후 변형시킨다.
알데히드-함유 시약이 방향족 아민 기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 생성된 변형 비-천연 아미노산을 생성하지 않도록(물론, 이러한 파괴가 반응의 목적인 경우는 제외됨), 방향족 아민-함유 비-천연-아미노산이 상기 폴리펩티드 상에 위치하는 한, 상기 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 종류는 사실상 한정되지 않는다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산과 반응하며 방향족-아민 함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는 데 사용될 수도 있는 카르보닐-함유 시약으로는 하기 화학식으로 표시되는 알데히드-함유 화합물이 있다:
Figure 112013073088060-pat00077
상기 식에서,
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나; 또는
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산과 반응하며 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는 데 사용될 수 있는 카르보닐-함유 시약은 디케톤, 케토알데히드 및 디알데히드를 비롯한 하기 화학식 중 하나로 표시되는 디카르보닐-함유 화합물이다:
Figure 112013073088060-pat00078
또는
Figure 112013073088060-pat00079
상기 식에서,
R1 각각은 H, 경우에 따라 치환된 알킬, 경우에 따라 치환된 알켄, 경우에 따라 치환된 알킨, 경우에 따라 치환된 시클로알킬, 경우에 따라 치환된 헤테로시클, 경우에 따라 치환된 아릴 및 경우에 따라 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환 헤테로시클로알킬렌, -C(O)R"-, -C(O)OR"-, -C(O)N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")-, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")-, 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR"-이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
n은 1, 2 또는 3이다.
카르보닐-함유 시약이 방향족 아민 기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 생성된 변형 비-천연 아미노산을 생성하지 않도록(물론, 이러한 파괴가 반응의 목적인 경우는 제외됨), 방향족 아민-함유 비-천연-아미노산이 상기 폴리펩티드 상에 위치하는 한, 상기 방향족-함유 비-천연 아미노산과 반응하는 카르보닐-함유 시약의 종류는 사실상 한정되지 않는다. 이러한 카르보닐-함유 시약으로는 1개 이상의 알데히드 부분을 함유하는 시약 및 2개 이상의 알데히드 부분을 함유하는 시약이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
알데히드 부분과 방향족 아민 부분 사이의 반응은 용이하며, 이러한 환원성 알킬화 반응은 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 가진다: (i) 약 4 내지 약 7의 pH 범위 내에서 일어남, (ii) 생물학적 조건 하에서 안정한 아민 연결을 생성함; (iii) 부위 특이적임; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않음; (v) 실온에서 신속히 일어남; (vi) 수성 조건 하에서 용이하게 일어남; (vii) 알데히드-함유 반응물에 대한 방향족 아민 부분을 포함하는 비-천연 아미노산의 비가 화학양론적, 화학양론적-유사 또는 거의 화학양론적임; 및 (viii) 위치선별적 및/또는 위치특이적임. 환원성 알킬화 반응의 오르토고날 성질은 위치선별성 및/또는 위치특이성을 발생시킴으로써, 비-천연 아미노산(들)을 함유하는 폴리펩티드 중의 다른 아미노산에 영향을 주지 않으면서 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 번역 후 변형을 허용한다.
폴리펩티드 내의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 환원적으로 알킬화시키는 방법의 예시적 실시양태는 도 20 내지 34에 나타나 있다. 특정 실시양태는 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 알데히드-함유 시약을 비롯한 카르보닐-함유 시약으로 1회 환원적으로 알킬화하여 2차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함하는 반면, 다른 실시양태는 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 알데히드-함유 시약을 비롯한 카르보닐-함유 시약으로 2회 환원적으로 알킬화하여 3차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함한다. 또한, 일부 실시양태는 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 2개 이상의 카르보닐 기를 함유하는 시약으로 1회 환원적으로 알킬화하여 2차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함한다. 다른 실시양태는 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 2개 이상의 카르보닐 기를 함유하는 시약으로 2회 환원적으로 알킬화하여 3차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함한다. 이 예시적 실시양태에서, 알데히드-함유 시약은 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 환원제 예컨대, 소듐 시아노보로히드라이드를 함유하는 완충 용액(약 4 내지 약 7의 pH)에 첨가된다. 이 반응은 주위 온도에서 진행되고, 생성된 알킬화 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다른 실시양태에서, 다수의 링커 화학물질은 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 하나 이상의 링커 말단 상에 알데히드 작용기를 비롯한 카르보닐 작용기를 함유하는 링커(일-작용성, 이-작용성 또는 다작용성)를 사용한다. 알데히드-유도화 링커를 사용한 방향족 아민-함유 폴리펩티드의 환원성 알킬화는 안정한 아민 연결을 발생시킨다. 이종작용성 링커(예컨대, 하나 이상의 다른 링커 화학물질을 갖는 알데히드를 비롯한 카르보닐)로도 공지되어 있는 이-작용성 및/또는 다작용성 링커는 상이한 분자(예컨대, 다른 폴리펩티드, 폴리핵산, 중합체 또는 소분자)가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부위 특이적으로 연결될 수 있게 하지만, 동종작용성 링커(모든 말단 상에서 알데히드 치환을 비롯한 카르보닐-치환을 가짐)로도 공지되어 있는 일-작용성 링커는 방향족 아민 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 용이하게 한다. 이 링커 방법과 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기법을 병용함으로써, 화학적으로 정교하게 만들어진 단백질의 3차원적 구조를 특정할 수 있게 된다.
B. 2개의 번역 후 변형 단계를 사용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 방향족 아민- 함유 비 -천연 아미노산의 형성 후, 카르보닐-함유 시약을 사용한 방향족 아민- 함유 비 -천연 아미노산의 환원적 알킬화
방향족 아민-함유 아미노산은 알데히드-함유 시약을 비롯한 카르보닐-함유 시약을 사용한 환원성 알킬화 전에 번역에 의해 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 별법으로, 방향족 아민-함유 아미노산 예컨대, 치환된 방향족 부분을 함유하는 아미노산의 전구체는 번역에 의해 폴리펩티드 내로 도입된 후, 카르보닐-함유 시약을 사용한 환원성 알킬화 전에 방향족 아민-함유 아미노산으로 변환될 수 있다. 후자 방법은 2개의 번역 후 변형을 포함하는 반면, 전자 방법은 1개의 번역 후 변형만을 포함한다. 유도화하고/하거나 추가로 변형시키는 방법은 이 변형 방법들 전에 또는 후에 정제될 수 있는 천연 발생 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 유도화하고/하거나 추가로 변형시키는 방법은 이 변형 방법들 전에 또는 후에 정제될 수 있는 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 하기 화학식 B의 비-천연 아미노산을 환원시켜 방향족 아민-함유 아미노산을 생성할 수 있다:
화학식 B
Figure 112013073088060-pat00080
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00081
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Y는 -NH-NH2, -NH-NHR', -CR'=NR', -NO2 또는 -N3이고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산에는 하기 화학식의 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다:
Figure 112013073088060-pat00082
천연 폴리펩티드, 합성 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 환원적으로 발생시키는 것에 대한 예시적 실시양태는 도 14 및 15에 나타나 있다. 일부 실시양태는 이민 치환기의 방향족 1차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원, 이미 치환기의 방향족 2차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원, 히드라진 아민 치환기의 방향족 1차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원, 히드라진 아민 치환기의 방향족 2차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원, 니트로-치환기의 방향족 1차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원, 및 아지도-치환기의 방향족 1차 아민-함유 비-천연 아미노산으로의 환원을 포함한다. 이들 예시적 실시양태들에서, 치환된 방향족 부분은 완충 용액(약 4 내지 약 7의 pH) 중에서 환원되고, 사용되는 환원제로는 TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6, NaBH4 또는 NaBCNH3가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 반응은 주위 온도에서 진행되고, 생성된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 천연 폴리펩티드, 합성 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
치환된 방향족 부분-함유 아미노산의 환원으로부터 발생된 이러한 방향족 아민-함유 아미노산의 환원성 알킬화는 단락 A(단일 번역 후 변형 단계를 이용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 방향족 아민 함유 비-천연 아미노산과 카르보닐-함유 시약의 환원성 알킬화 반응)에 기재된 바와 같다. 보호된 (또는 차폐된) 아민의 환원에 의해 발생된 방향족 아민-함유 아미노산의 환원성 알킬화의 예시적 실시양태는 도 15 및 34에 나타나 있다. 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 환원적으로 발생시키는 제1 번역 후 단계에 이어서 환원적 알킬화 단계를 수행한다. 환원적 알킬화는 알킬화 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 사용하여 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 변형시키는 제2 번역 후 반응이다. 이러한 번역 후 변형 또는 도입 후 변형은 합성 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 내로 도입된 방향족 아민 함유 아미노산에 적용될 수도 있다.
알데히드-함유 시약을 비롯한 카르보닐-함유 시약이 방향족 아민 기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 생성된 변형 비-천연 아미노산을 생성하지 않도록(물론, 이러한 파괴가 반응의 목적인 경우는 제외됨), 방향족 아민-함유 비-천연-아미노산이 상기 폴리펩티드 상에 위치하는 한, 상기 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 종류는 사실상 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산과 반응하며 방향족-아민 함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는 데 사용될 수도 있는 알데히드-함유 시약은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure 112013073088060-pat00083
상기 식에서,
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나; 또는
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산과 반응하며 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는 데 사용될 수 있는 카르보닐-함유 시약은 디케톤, 케토알데히드 및 디알데히드를 비롯한 하기 화학식 중 하나로 표시되는 디카르보닐-함유 화합물이다:
Figure 112013073088060-pat00084
또는
Figure 112013073088060-pat00085
상기 식에서,
R1 각각은 H, 경우에 따라 치환된 알킬, 경우에 따라 치환된 알켄, 경우에 따라 치환된 알킨, 경우에 따라 치환된 시클로알킬, 경우에 따라 치환된 헤테로시클, 경우에 따라 치환된 아릴 및 경우에 따라 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬렌, 치환 시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환 헤테로시클로알킬렌, -C(O)R"-, -C(O)OR"-, -C(O)N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")-, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")-, 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR"-이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, 알키닐렌, 치환 알키닐렌, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
n은 1, 2 또는 3이다.
카르보닐-함유 시약이 방향족 아민 기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 최종 변형 비-천연 아미노산을 생성하지 않도록(물론, 이러한 파괴가 반응의 목적인 경우는 제외됨), 방향족 아민-함유 비-천연-아미노산이 상기 폴리펩티드 상에 위치하는 한, 상기 방향족-함유 비-천연 아미노산과 반응하는 카르보닐-함유 시약의 종류는 사실상 한정되지 않는다. 이러한 카르보닐-함유 시약으로는 1개 이상의 알데히드 부분을 함유하는 시약 및 2개 이상의 알데히드 부분을 함유하는 시약이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
알데히드 부분과 방향족 아민 부분 사이의 반응은 용이하며, 이러한 환원성 알킬화 반응은 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 가진다: (i) 약 4 내지 약 7의 pH 범위 내에서 일어남, (ii) 생물학적 조건 하에서 안정한 아민 연결을 생성함; (iii) 부위 특이적임; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않음; (v) 실온에서 신속히 일어남; (vi) 수성 조건 하에서 용이하게 일어남; (vii) 알데히드-함유 반응물에 대한 방향족 아민 부분을 포함하는 비-천연 아미노산의 비가 화학양론적, 화학양론적-유사 또는 거의 화학양론적임; 및 (viii) 위치선별적 및/또는 위치특이적임. 환원성 알킬화 반응의 오르토고날 성질은 위치선별성 및/또는 위치특이성을 발생시킴으로써, 비-천연 아미노산(들)을 함유하는 폴리펩티드 중의 다른 아미노산에 영향을 주지 않으면서 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 번역 후 변형을 허용한다.
특정 실시양태는 방향족 아민 부분을 카르보닐-함유 시약으로 1회 환원적으로 알킬화하여 2차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함하는 반면, 다른 실시양태는 방향족 아민 부분을 2종의 카르보닐-함유 시약으로 2회 환원적으로 알킬화하여 3차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함한다. 이 실시양태에서 카르보닐-함유 시약은 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 일부 실시양태는 방향족 아민 부분을 2개 이상의 카르보닐 기를 함유하는 시약으로 1회 환원적으로 알킬화하여 2차 아민 부분을 생성하는 방법을 포함한다. 다른 실시양태는 방향족 아민 부분을 2개 이상의 카르보닐 기를 함유하는 시약으로 2회 환원적으로 알킬화하여 환형 3차 아민 부분을 생성하는 방법으로도 지칭되는 이중 환원성 알킬화를 포함한다. 이 예시적 실시양태에서, 카르보닐-함유 시약은 천연 폴리펩티드, 합성 중합체, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 상의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산, 및 환원제 예컨대, NaBCNH3, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6 또는 NaBH4를 함유하는 완충 용액(약 4 내지 약 7의 pH)에 첨가된다. 이 반응은 주위 온도에서 진행되고, 생성된 알킬화 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다른 실시양태에서, 다수의 링커 화학물질은 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 하나 이상의 링커 말단 상에 알데히드 작용기를 비롯한 카르보닐 작용기를 함유하는 링커(일-작용성, 이-작용성 또는 다작용성)를 사용한다. 카르보닐-유도화 링커를 사용한 방향족 아민-함유 폴리펩티드의 환원성 알킬화는 안정한 아민 연결을 발생시킨다. 이종작용성 링커(예컨대, 하나 이상의 다른 링커 화학물질을 갖는 알데히드)로도 공지되어 있는 이-작용성 및/또는 다작용성 링커는 상이한 분자(예컨대, 다른 폴리펩티드, 폴리핵산, 중합체 또는 소분자)가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부위 특이적으로 연결될 수 있게 하지만, 동종작용성 링커(모든 말단 상에서 알데히드 치환을 가짐)로도 공지되어 있는 일-작용성 링커는 방향족 아민 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 용이하게 한다. 이 링커 방법과 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기법을 병용함으로써, 화학적으로 정교하게 만들어진 폴리펩티드의 3차원적 구조를 특정할 수 있게 된다.
C. 2 단계 번역 후 변형을 이용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 보호된 알데히드- 함유 비 -천연 아미노산의 탈보호 후 방향족 아민-함유 시약을 사용한 알데히드- 함유 비 -천연 아미노산의 환원성 아민화
차폐된 또는 보호된 친전자체-함유 측쇄를 가진 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 것은 상기 측쇄의 부위 특이적 환원성 아민화를 허용한다. 이러한 비-천연 아미노산으로는 차폐된 또는 보호된 카르보닐 기 예컨대, 차폐된 알데히드 기 또는 보호된 알데히드를 함유하는 아미노산이 있고, 이때 부위 특이적 환원성 아민화는 상기 알데히드의 비-차폐 시 이용가능한 알데히드-함유 측쇄에의 방향족 아민의 친핵성 부가를 통해 달성된다. 이 환원성 아민화 반응은 2차 아민 및 3차 아민을 비롯한 아민 연결을 생성한다. 유도화하고/하거나 추가로 변형시키는 방법은 환원성 아민화 단계 전에 또는 환원성 아민화 단계 후에 정제된 천연 발생 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 유도화하고/하거나 추가로 변형시키는 방법은 이 변형 방법들 전에 또는 후에 정제될 수 있는 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 하기 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내로 도입한 후 환원적으로 아민화하기 전에 이용가능한 알데히드 함유 측쇄를 비-차폐/탈보호하여 아민 연결을 생성할 수 있는 차폐된/보호된 알데히드 부분-함유 아미노산의 일종이다:
화학식 E
Figure 112013073088060-pat00086
상기 식에서,
L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환 아르알킬렌이고;
Q는 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- , -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R")-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-으로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4 또는 2개의 R3 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
R6은 알데히드, 보호된 알데히드 또는 차폐된 알데히드이고, 이때 보호기로는
Figure 112013073088060-pat00087
이 있으나, 이들로 한정되지 않고, 이때 X1 각각은 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 이때 R' 및 R 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이다.
또한, 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 이러한 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입된 후 탈보호되어 "동일 반응계"에서 알데히드 기를 형성한 다음, 방향족 아민 함유 시약을 사용한 상기 알데히드의 환원성 아민화에 의해 번역 후 변형될 수 있다. 또한, 화학식 E의 비-천연 아미노산은 중합체 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있고 탈보호되어 "동일 반응계"에서 알데히드 기를 형성한 후, 상기 알데히드를 방향족 아민 함유 시약을 사용하여 환원적으로 아민화시킬 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 비-차폐된/탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산과 반응하는 방향족 아민-함유 시약은 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다:
Figure 112013073088060-pat00088
상기 식에서,
Figure 112013073088060-pat00089
은 일환 아릴 고리, 이환 아릴 고리, 다환 아릴 고리, 일환 헤테로아릴 고리, 이환 헤테로아릴 고리 및 다환 헤테로아릴 고리로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 독립적으로 CRa 또는 N이고;
B는 독립적으로 CRa, N, O 또는 S이며;
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
M은 H 또는 -CH2R5이며;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고, R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬 또는 치환 알킬이다.
이러한 시약은 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 포함한다:
Figure 112013073088060-pat00090
이 화합물들은 (천연 또는 화학적으로 합성된) 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 더 변형시키는 데 사용될 수도 있다.
이 환원성 아민화 반응은 비-차폐된/탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 번역 후 변형시킨다. 방향족 아민-함유 시약이 이용가능한 알데히드 기와 반응할 수 있고 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 최종 변형 비-천연 아미노산을 생성하지 않도록(물론, 이러한 파괴가 반응의 목적인 경우는 제외됨), 비-차폐된/탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산이 상기 폴리펩티드 상에 위치하는 한, 상기 방향족-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 종류는 사실상 한정되지 않는다.
알데히드 부분과 방향족 아민 부분 사이의 반응은 용이하며, 이러한 환원성 아민화 반응은 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 가진다: (i) 약 4 내지 약 7의 pH 범위 내에서 일어남, (ii) 생물학적 조건 하에서 안정한 아민 연결을 생성함; (iii) 부위 특이적임; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않음; (v) 실온에서 신속히 일어남; (vi) 수성 조건 하에서 용이하게 일어남; (vii) 방향족 아민-함유 반응물에 대한 알데히드 부분을 포함하는 비-천연 아미노산의 비가 화학양론적 비, 화학양론적 비와 유사한 비 또는 거의 화학양론적인 비임; 및 (viii) 위치선별적 및/또는 위치특이적임. 환원성 아민화 반응의 오르토고날 성질은 위치선별성 및/또는 위치특이성을 발생시킴으로써, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내의 다른 아미노산에 영향을 주지 않으면서 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 번역 후 변형을 허용한다.
폴리펩티드 상의 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 환원적으로 아민화시키는 예시적 실시양태는 도 18에 나타나 있다. 또한, 특정 실시양태는 방향족 아민-함유 시약을 사용하여 폴리펩티드 상의 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 1회 환원적으로 아민화시켜 2차 아민 부분을 생성하는 것을 포함한다. 또한, 일부 실시양태는 폴리펩티드 상의 카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 방향족 아민-함유 시약으로 환원적으로 아민화시켜 환형 3차 아민 부분을 생성하는 것을 포함하는데, 이때 상기 카르보닐 부분은 2개 이상의 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드 기를 함유한다. 다른 실시양태는 2개 이상의 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 상의 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 2개의 동일한 또는 2개의 상이한 방향족 아민-함유 시약으로 2회 환원적으로 아민화시켜 2개의 2차 아민 부분을 생성하는 것을 포함한다. 이들 예시적 실시양태들에서, 방향족 아민-함유 시약은 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 환원제 예컨대, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6, NaBH4 또는 NaBCNH3를 포함하는 완충 용액(약 4 내지 약 7의 pH)에 첨가된다. 반응은 주위 온도에서 진행되고, 생성된 아민화 알데히드-함유 비-천연 아미노산 천연 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다른 실시양태에서, 다수의 링커 화학물질은 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 하나 이상의 링커 말단 상에 방향족 아민 작용기를 함유하는 링커(일-작용성, 이-작용성 또는 다작용성)를 사용한다. 방향족 아민-유도화 링커를 사용한 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 폴리펩티드의 환원성 아민화는 안정한 아민 연결을 발생시킨다. 이종작용성 링커(예컨대, 하나 이상의 다른 링커 화학물질을 갖는 방향족 아민)로도 공지되어 있는 이-작용성 및/또는 다작용성 링커는 상이한 분자(예컨대, 다른 폴리펩티드, 폴리핵산, 중합체 또는 소분자)가 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부위 특이적으로 연결될 수 있게 하지만, 동종작용성 링커(모든 말단 상에서 방향족 아민 치환을 가짐)로도 공지되어 있는 일-작용성 링커는 비-차폐된 또는 탈보호된 알데히드-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 용이하게 한다. 이 링커 방법과 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기법을 병용함으로써, 화학적으로 정교하게 만들어진 단백질의 3차원적 구조를 특정할 수 있게 된다.
D. 작용기 부가의 예: 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형은 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소, 활성화된 착물 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 백터, 거대분자, 미모토프, 수용체, 리버스 미셀 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상에 추가 작용기를 도입하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단의 예시적 비-제한적 예로서, 하기 설명은 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단이 전술한 작용기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 작용기를 부가하는 것에도 적용될 수 있다(필요하다면 당업자는 본원의 개시내용을 이용하여 적절히 변형시킬 수 있음)는 것을 이해하면서 거대분자 중합체를 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부가하는 것에 초점을 맞출 것이다.
매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결시켜 비-천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 성질을 조절하고/하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 새로운 생물학적 성질을 제공할 수 있다. 이 거대분자 중합체는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산의 임의의 작용 치환기, 또는 비-천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
수용성 중합체는 폴리펩티드(천연 또는 합성), 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체 내로 도입된 비-천연 아미노산에 커플링될 수 있다. 수용성 중합체는 폴리펩티드 내로 도입된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비-천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 커플링될 수 있다. 일부 경우, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 비-천연 아미노산(들), 및 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 친수성 중합체와 생물학적 활성 분자의 공유결합은 (예컨대, 생리학적 환경 하에서의) 수용성을 증가시키거나, 생체이용성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나, 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 한 방법이다. 이러한 친수성 중합체의 중요한 추가 특징은 생체적합성, 독성의 결핍 및 면역원성의 결핍을 포함할 수 있다. 최종 생성물 제제의 치료적 용도를 위해, 약학적으로 허용가능한 중합체가 사용될 수 있다.
친수성 중합체의 예로는 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예를 들면, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 이의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리에틸렌글리콜 또는 PEG로도 공지되어 있는 폴리옥시에틸렌 글리콜); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들면, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 상동체; 친수성 펩티드 서열; 폴리사카라이드 및 이의 유도체(덱스트란 및 덱스트란 유도체 예컨대, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란을 포함함); 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 석시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체 예컨대, 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알코올; 이의 공중합체; 이의 3원중합체; 이의 혼합물; 및 이들의 유도체가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 수용성 중합체는 선형, 갈래형(forked) 또는 분지형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 2개 내지 약 300개의 말단을 가진 수용성 중합체 골격이 특히 유용하다. 다작용성 중합체 유도체로는 2개의 말단을 가진 선형 중합체가 있으나, 이로 한정되지 않고, 상기 말단은 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 각각 결합되어 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 당업자는 실질적으로 수용성을 나타내는 골격에 대한 상기 목록이 결코 전부가 아니며 단지 예시적인 것이고, 전술된 질을 가진 모든 중합체 물질이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되기에 적합한 것으로 고려된다는 것을 인식할 것이다.
전술한 바와 같이, 친수성 중합체의 일례는 약학 분야, 및 인공 이식재(implant), 및 생체적합성, 독성의 결핍 및 면역원성의 결핍이 중요한 다른 분야에서 광범위하게 사용되는, PEG로 약칭되는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 명세서에 기재된 중합체:폴리펩티드 실시양태는 예시적 친수성 중합체로서 PEG를 사용할 것이지만, 이때 다른 친수성 중합체가 이러한 실시양태에서 유사하게 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
PEG는 상업적으로 입수가능하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환(ring-opening) 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다(문헌[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조). 전형적으로, PEG는 투명하고, 무색 무취이고, 수용성, 열에 대한 안정성 및 많은 화학적 약제에 대한 불활성을 나타내며, 가수분해되거나 약화되지 않으며, 일반적으로 무독성을 띤다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성 물질로서 간주된다. 즉, PEG는 손상을 초래하지 않으면서 생명체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성을 가진다. 즉, PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 나타낸다. PEG가 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면 생물학적 활성 물질에 부착된 경우, PEG는 상기 물질을 차폐하는 경향을 나타내며 유기체가 상기 물질의 존재에 대한 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 응고 또는 다른 원하지 않는 효과를 일으키는 경향을 나타내지 않는다.
용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결되어 있는 것으로 표시될 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
상기 식 중,
n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나 C1 -4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하나 이로 한정되지 않는 말단 변형이다. 용어 PEG는 이작용성 PEG, 멀티아암형(multiarmed) PEG, 유도화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG(각 쇄의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 약 1 kDa 내지 약 50 kDa 또는 약 1 kDa 내지 약 20 kDa임), 현수 PEG(즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 그 안에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, n이 약 20 내지 약 2000인 PEG가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 매우 광범위한 PEG 분자가 본원에 참고로 도입되는 문헌(Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog)을 포함하나 이로 한정되지 않는 문헌에 기재되어 있다.
문헌에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-석신이미딜 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,281,698호 및 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들면, 문헌[Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 히드라지드(예를 들면, 문헌[Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)] 참조), 석신이미딜 프로피오네이트 및 석신이미딜 부타노에이트(예를 들면, 문헌[Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D. C., 1997]; 및, 미국 특허 제5,672,662호 참조), 석신이미딜 숙시네이트(예를 들면, 문헌[Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) and Joppich et al. Macromol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 석신이미딜 에스테르(예를 들면, 미국 특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들면, 문헌[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들면, 문헌[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들면, 문헌[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들면, 문헌[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984)], 미국 특허 제5,824,784호 및 미국 특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들면, 문헌[Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984), and Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-디설피드(예를 들면, 문헌[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들면, 문헌[Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들면, 미국 특허 제5,900,461호 참조)을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참고로 도입된다.
일부 경우, PEG는 히드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH3임)를 갖는 한 말단 상에서 종결된다("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응성 기로 종결되어 이작용 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 20종의 공통된 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 통상적으로 사용되는 반응성 기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시석신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 뿐만 아니라, 20종의 공통된 아미노산에 대해 불활성을 나타내지만 비-천연 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(방향족 아민 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다.
상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 말단이 비-천연 아미노산을 통해 (합성 또는 천연) 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체에 직·간접적으로 부착될 것임을 인식해야 한다. Y가 알데히드 기인 경우, 알데히드-함유 PEG 시약은 폴리펩티드 내의 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산과 반응함으로써 아민 연결을 통해 폴리펩티드에 연결된 PEG 기를 형성할 수 있다. 적절한 반응 조건, 정제 방법 및 시약의 예는 본 명세서 전체 및 첨부된 도면에 기재되어 있다. 도 35는 N-말단 PEG화와, 펩티드 내로 도입된 아미노산 상의 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화에 기초한 PEG화 사이의 비교를 개략적으로 보여준다. 상기 도면은 천연 펩티드의 PEG화에 사용된 반응 조건 하에서만 PEG화가 말단 아민에서 용이하게 달성되는 반면, 방향족 부분을 함유하는 도입된 비-천연 아미노산을 갖는 비-천연 펩티드의 PEG에 사용된 반응 조건 하에서 PEG화는 비-천연 아미노산이 서열 내로 도입되는 부위에서 달성될 수 있고 양자를 갖는 말단 아민에서는 어떠한 반응도 일어나지 않는다는 것을 보여준다. PEG화 부위는 방향족 아민 부분을 함유하는 비-천연 아미노산의 도입 부위에 달려 있다. 이러한 부위는 말단 부위일 수 있거나, 펩티드 서열 내의 임의의 부위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단에서 사용될 수 있는 PEG 시약의 종류 또는 부류를 한정하고자 하는 것이 아니라 단지 예시하기 위해, 도 36은 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응하여 아민 연결을 통해 PEG 기에 연결된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있는 알데히드-함유 PEG 시약의 예를 제공한다. 또한, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응하여 PEG 기에 연결된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있는 분지형 알데히드-함유 PEG 시약의 예가 도 36에 제공되어 있다.
이종이작용성 유도체도 PEG 중합체의 각 말단에 상이한 분자를 부착시키는 것이 바람직한 경우 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, PEG의 한 말단은 비-천연 아미노산에 존재하는 방향족 아민 기와 반응하여 PEG와 펩티드 사이의 아민 연결을 형성할 수 있는 알데히드 부분을 함유하지만, PEG의 다른 말단은 적절한 물질을 사용한 처리에 의해 추가 반응을 받을 수 있는 다른 작용기를 함유한다. 예를 들어, 이러한 작용기는 카르보닐 함유 시약을 비롯한 다양한 친전자체 상의 친핵체로서 작용할 수 있는 아민 기일 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 비-천연 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 20종의 천연적으로 도입된 아미노산에서 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 비-천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선별적으로 도입한 후, 이러한 아미노산을 적절한 반응성 PEG 유도체를 사용하여 변형시키는 단계를 포함하는, PEG 유도체를 사용한 단백질의 선별적 변형에 매우 효율적인 방법을 제공한다. 수용성 중합체를 단백질 내로 도입하기 위한 매우 다양한 공지된 화학적 기법들이 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에서 사용되기에 적합하다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분, 및 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. PEG는 다양한 폴리올, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예를 들면 라이신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반적으로 화학식 R(-PEG-OH)m(이때, R은 코어 부분, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨로부터 유도되고, m은 아암의 수를 나타냄)로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예를 들면 본원에 완전히 참고로 도입되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호, 제5,229,490호 및 제4,289,872호; 미국 특허출원 공개 제2003/0143596호; 국제특허공보 제WO 96/21469호; 및 제WO 93/21259호에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 분지형 PEG는 PEG(-YCHZ2)n(이때, Y는 링커 기이고, Z는 정해진 길이의 원자로 된 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단 기임)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 또 다른 분지 형태인 현수 PEG는 PEG 쇄의 말단에서가 아니라 PEG 골격을 따라 반응성 기, 예를 들면 카르복실 기를 갖는다. 도 36은 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 분지형 알데히드-함유 PEG 시약의 비-제한적 예를 보여준다.
또한, 이러한 PEG 형태 이외에, 골격 내에 약한 또는 분해가능한 연결을 갖는 PEG 중합체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 내의 에스테르 연결을 갖는 PEG를 제조할 수 있다. 하기에 표시되는 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단시킨다:
-PEG-CO2-PEG- + H2O → PEG-CO2H + HO-PEG-
당업자는 용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본 명세서에 개시된 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점을 이해할 것이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.
PEG의 원하는 성질을 최대화하기 위해, 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체 또는 중합체들의 분자량 및 수화 상태는 모 분자의 생체활성에 악영향을 주지 않으면서 PEG 중합체 부착과 전형적으로 관련되어 있는 유리한 특성 예컨대, 증가된 수용성 및 순환 반감기를 부여하기에 충분히 높아야 한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 중합체:단백질 접합체로 이루어진 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 균질한"은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질의 절반을 초과하는 정도의 수준으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본 명세서에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 폴리펩티드 제제는 균질한 제제의 이점, 예를 들면, 로트 대 로트(lot to lot) 약동학적 특성을 예측할 수 있다는 점에서 임상적 적용의 용이성을 나타내기에 충분히 균질한 제제이다.
또한, 당업자는 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택할 수 있으며, 이때 제공되는 이점은 혼합물 중에 포함되는 단일-중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 당업자는 필요에 따라, 다양한 수의 부착된 중합체 잔기(즉, 2-, 3-, 4- 등)를 갖는 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 조합할 수 있고, 소정의 비율의 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 수득할 수 있다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그들의 농도처럼 변하게 된다. 일반적으로, (최소한의 잔류 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 점에서 반응 효율에 비추어) 최적 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기에 의해 결정될 수 있다. 분자량의 경우, 전형적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 친수성 중합체:폴리펩티드/단백질 접합체를 고려하는 경우 용어 "치료 유효량"은 환자에게 유리한 효과를 나타내는 양을 지칭한다. 이 양은 개체마다 다르고, 환자의 전체적인 신체 조건 및 치료될 증상의 병인을 비롯한 다수의 인자에 달려 있다. 당업자는 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 이용하여 본 조성물의 치료 유효량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변경된 (증가 또는 감소를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특성, 예를 들면, 변경된 생체내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 반감기는 비-변형 폴리펩티드에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상, 또는 약 2배, 5배, 10배, 50배 또는 약 100배 이상 증가된다.
한 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 연결된 말단 알데히드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 알데히드 부분을 함유하는 분지쇄 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이때 분지쇄 PEG의 각 쇄의 MW는 약 10 내지 40 kDa, 다른 실시양태에서는 약 5 내지 20 kDa이다.
일부 실시양태에서, 알데히드-말단 PEG 유도체는 하기 화학식으로 표시된다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-CH2-NH-CH2-C(O)H
상기 식 중,
R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.
또 다른 실시양태에서, 방향족 아민 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 알데히드 부분을 함유하는 분지쇄 PEG 유도체에 의해 변형되어 아민 연결을 형성하며, 이때 분지쇄 PEG의 각 쇄의 MW는 약 10 내지 40 kDa, 다른 실시양태에서는 약 5 내지 20 kDa이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.
PEG의 작용화 및 접합에 대한 몇몇 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들면, 문헌[Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.
또한, 중합체의 활성화 방법은 국제특허공보 제WO 94/17039호, 미국 특허 제5,324,844호, 국제특허공보 제WO 94/18247호 및 제WO 94/04193호, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, 국제특허공보 제WO 90/13540호, 미국 특허 제5,281,698호, 및 국제특허공보 제WO 93/15189호에서 찾을 수 있고, 응고인자 VIII(국제특허공보 제WO 94/15625호 참조), 헤모글로빈(국제특허공보 제WO 94/09027호 참조), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제(ribonuclease) 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase)(문헌[Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)] 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 효소와 활성화된 중합체의 접합 방법도 공지되어 있고, 이들 문헌들은 본원에 완전히 참고로 도입된다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 본 명세서에 기재된 PEG화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 방법(분취형 등전위 포커싱을 포함하나 이로 한정되지 않음), 차등 용해도 이용법(황산암모늄 침전을 포함하나 이로 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 공정으로 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 기준물과 비교함에 의해 GPC에 의해 추정될 수 있다(문헌[PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). 비-천연 아미노산 폴리펩티드:PEG 접합체의 순도는 단백질분해성 분해(트립신 분해를 포함하나 이로 한정되지 않음) 후 질량 분광측정 분석에 의해 평가될 수 있다. 문헌[Pepinsky B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다.
말단 아민 부분의 환원성 알킬화에 의한 천연 폴리펩티드의 PEG화는 비-천연 아미노산 상의 방향족 아민 부분의 PEG화에 필요한 것보다 더 많은 시간을 필요로 한다. 또한, 비-천연 아미노산 상의 방향족 아민 부분의 PEG화 방법은 부위 특이적이고 비-천연 아미노산이 도입된 폴리펩티드 내의 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 도 37은 pH 5에서 화학양론적 또는 거의 화학양론적인 비를 사용한 펩티드 MT-9의 말단 아민의 PEG화의 약 50%가 일어나기 위해 12시간 이상이 필요하다는 것을 보여준다. 대조적으로, 도 38은 pAF2(p-아미노-페닐알라닌)를 포함하나 이로 한정되지 않는 방향족 아민 부분을 함유하는 아미노산을 함유하는 펩티드의 PEG화의 비-제한적 예를 보여준다. 도 38에서, 펩티드 MT-9는 약 1시간 동안 반응한 후 pH 4에서 화학양론적 또는 거의 화학양론적인 비로 20k PEG 알데히드 또는 40k PEG 알데히드에 의해 거의 완전히 PEG화된다.
이는 방향족 아민 부분을 함유하는 아미노산의 환원성 알킬화를 사용한 PEG화의 유리한 특성 예컨대, 선별성(방향족 아민 함유 아미노산에서의 PEG화만); 빠른 반응 시간(약 1 시간 대 12 시간); 과량의 PEG 알데히드 시약보다 오히려 화학양론적 또는 거의 화학양론적인 비(이로써 시약을 덜 사용함); 및 특이성(N-말단 PEG화와 반대로, 방향족 아민 부분을 함유하는 아미노산의 환원성 알킬화를 통한 PEG화는 펩티드 서열 내의 임의의 곳에서 일어남)을 입증한다.
hGH("인간 성장 호르몬")의 PEG화의 비-제한적 예가 도 39에 나타나 있는데, 이때 hGH 단백질의 위치 35에 있는 티로신 잔기는 pAF2(p-아미노-페닐알라닌)를 포함하나 이로 한정되지 않는 방향족 아민 부분을 함유하는 아미노산으로 번역 도중에 치환된 후, 알데히드 부분을 함유하는 PEG에 의해 환원적으로 알킬화된다. IFNα의 PEG화의 비-제한적 예도 도 39에 나타나 있는데, 이때 pAF2를 포함하나 이로 한정되지 않은 방향족 아민 부분은 IFNα 서열 내로 도입된 후 알데히드 부분을 함유하는 분지쇄 PEG에 의해 환원적으로 알킬화된다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 비-천연 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 제한 없이 더 유도화될 수 있거나 치환될 수 있다.
E. 부위 특이적 유도화를 사용한 변형의 추가 예
폴리펩티드/단백질의 선별적 부위 특이적 유도화의 비-제한적 예가 도 20 내지 34에 나타나 있는데, 이때 pAF2(p-아미노-페닐알라닌)를 포함하나 이로 한정되지 않는 방향족 아민 부분의 환원성 알킬화는 예를 들어, 라이신과 같은 다른 측쇄 기 또는 임의의 말단 기 유도화보다 우세하게 일어난다. 이러한 선별적 부위 특이적 유도화는 작용제 및/또는 길항제를 디자인하기 위한 폴리펩티드/단백질의 변형, 폴리펩티드/단백질의 부위 특이적 PEG화, 약물 디자인, 폴리펩티드/단백질의 글리코실화, 폴리펩티드/단백질 이량체화, 폴리펩티드/단백질의 소분자 약물 접합체 및 항체의 소분자 약물 접합체를 허용할 수 있다.
F. 혈청 알부민에 대한 친화성 증강
또한, 다양한 분자를 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중에서의 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자를 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결시키거나 융합시켜 동물 내에서의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 증강시킨다.
예를 들면, 일부 경우, 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예를 들면, 문헌[Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534-542 (1996) and Sjolander et al., J. Immunol. Methods 201: 115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면 문헌[Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 (2002)]에 기재된 펩티드들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 일부 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312; 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 직접 융합된다. 당업자는 매우 다양한 다른 분자들도 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 연결되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
G. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연 사카라이드 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비-천연 사카라이드 잔기(3-플루오로갈락토즈를 포함하나 이로 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-연결 또는 O-연결 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토즈-L-세린을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비-천연 연결(옥심 또는 상응하는 C-연결 또는 S-연결 글리코시드를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 의해 비-천연 아미노산에 연결될 수 있다.
사카라이드(글리코실을 포함하나 이로 한정되지 않음) 부분은 생체내 또는 시험관내에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를, 알데히드 기로 유도화된 사카라이드를 사용하여 변형시켜 아민 연결을 통해 연결된 상응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 다른 실시양태에서, 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를, 탈보호 시 방향족 아민 기로 유도화된 사카라이드로 변형시켜 아민 연결을 통해 연결된 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 생성한다. 일단 사카라이드가 비-천연 아미노산에 부착되면, 글리코실트랜스퍼라제, 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 있는 다른 효소를 사용하여 처리함으로써 사카라이드를 더 정교하게 만들 수 있다. 예를 들면, 문헌[H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.
H. 폴리펩티드 이량체 및 다량체를 포함하는 링커 기의 사용 및 응용
비-천연 아미노산 폴리펩티드에 작용기를 직접 부가하는 것 외에, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 부위는 다작용성 (예컨대, 2-, 3-, 4-) 링커 분자에 의해 먼저 변형된 후, 상기 링커 분자가 더 변형될 수 있다. 즉, 다작용성 링커 분자의 하나 이상의 말단은 폴리펩티드 내의 하나 이상의 비-천연 아미노산과 반응하고, 다작용성 링커의 다른 하나 이상의 말단은 추가 작용기화를 위해 사용될 수 있다. 다작용성 링커의 모든 말단이 동일하면, (화학양론적 조건에 따라) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 동종다량체가 형성될 수 있다. 다작용성 링커의 말단이 상이한 화학적 반응성을 가지면, 다작용성 링커 기의 하나 이상의 말단이 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합될 것이고, 그 후 다른 말단은 예를 들어, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기인광성 기광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 상이한 작용기와 반응할 수 있다.
다작용성 링커 기는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure 112013073088060-pat00091
상기 식에서,
X 각각은 알데히드 또는 방향족 아민이고,
L 각각은 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐린, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며, 이때 k는 1, 2, 또는 3이고, R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이고;
L1은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-이며, 이때 p는 0, 1 또는 2이고;
W는 알데히드 또는 방향족 아민이며;
n은 1 내지 3이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 폴리펩티드의 조합물 예컨대, 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등) 또한 제공한다. 예를 들어, 하기 설명은 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원들에 초점을 맞추고 있으나, 본 단락에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 하기 폴리펩티드를 포함하는, 이량체 및 다량체 형태로 이점을 제공할 수 있는 사실상 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 또 다른 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체, 또는 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체인 임의의 다른 폴리펩티드의 폴리펩티드 골격에 직접 결합되거나 링커를 통해 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드도 포함한다. GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 그의 분자량으로 인해, 단량체 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 비해 상이한 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 성질, 조절된 치료적 반감기 또는 조절된 혈장 반감기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 새로운 또는 바람직한 성질을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체의 이량체화를 조절할 것이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체 길항제, 작용제 또는 조절제로서 작용할 것이다.
일부 실시양태에서, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 연결 또는 Cys-Cys 디설피드 연결을 포함하나 이들로 한정되지 않는 연결을 통해 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 알데히드-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 제2 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드에 접합된 방향족 아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 제1 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 연결된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 이량체화를 촉진하기 위한 상이한 비-천연 아미노산을 포함할 것이고, 상기 폴리펩티드들은 환원성 알킬화를 통해 반응하고, 이로써 이들 사이에 아민 연결이 형성될 것이다.
별법으로, 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 링커를 통해 연결된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커는 동일하거나 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 연결시키는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 연결시키는 데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하기와 같은 아령 구조를 갖는 수용성 이작용성 링커를 제공한다: a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 알데히드-함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들면, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하기 구조를 갖는 활성화된 수용성 중합체와의 반응에 의해 형성된 하나 이상의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원을 포함하는 다량체를 제공한다:
R-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m-X
상기 식 중,
n은 약 5 내지 약 3,000이고, m은 2 내지 10이고, X는 (알데히드를 비롯한) 카르보닐-함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑 기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들면, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시석신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시석신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택된 작용기일 수 있다.
I. 기능성 부가의 예: 폴리펩티드의 단리 성질의 개선
천연 발생 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특성을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 이유로 샘플로부터 단리하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 치료적 용도로 폴리펩티드를 제조하는 경우, 이러한 폴리펩티드는 그 폴리펩티드를 과다생성하도록 개조된 재조합 시스템으로부터 단리될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특성으로 인해, 원하는 순도를 달성하는 것이 종종 어려운 것으로 입증되었다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다.
당업자는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단을 사용하여 원하는 폴리펩티드와의 상동성을 나타내는 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는데, 이때 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 단리 특성을 가진다. 한 실시양태에서, 상동성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 제조된다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 구조 중 한 구조 내로 도입될 수 있다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.
한 실시양태에서, 생합성적으로 제조된 생성된 비-천연 아미노산은 이미 원하는 개선된 단리 특성을 가진다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 개선된 단리 특성을 가진 기와의 아민 연결을 포함한다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 더 변형되어 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데, 이 변형은 개선된 단리 특성을 제공하는 기와의 아민 연결을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 기는 비-천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 실시양태에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비-천연 아미노산에 연결된다. 특정 실시양태에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비-천연 아미노산에 연결되고, 다른 실시양태에서, 일련의 화학 반응이 이러한 기를 비-천연 아미노산에 연결시키는 데 필요하다. 바람직하게는, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비-천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건 하에서 천연 발생 아미노산에 연결되지 않는다.
다른 또는 추가 실시양태에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과의 상동성을 나타내지만, 본 단락에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 개선된 단리 특성이라는 이점을 가질 수 있는, 예컨대, 하기 폴리펩티드를 포함하는 사실상 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
다른 또는 추가 실시양태에서, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용성을 개선시키고, 다른 실시양태에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합성을 개선시키고, 다른 실시양태에서, 상기 기는 폴리펩티드에 새로운 결합성을 제공한다(예컨대, 바이오틴 기 또는 바이오틴-결합 기를 포함함). 기가 폴리펩티드의 수용성을 개선시키는 실시양태에서, 상기 기는 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 PEG 중합체 기 중 임의의 기를 포함하는) 본 명세서에 기재된 수용성 중합체로부터 선택된다.
J. 기능성 부가의 예: 폴리펩티드의 존재 검출
천연 발생 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드에 용이하게 결합할 수 있는 시약 또는 표지의 결핍을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 이유로 샘플(생체내 샘플 및 시험관내 샘플을 포함함) 중에서 검출되기 어려울 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다.
당업자는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단을 사용하여 원하는 폴리펩티드와의 상동성을 나타내는 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는데, 이때 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생체내 샘플 및 시험관내 샘플 중에서의 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 상동성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 제조된다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 구조 중 한 구조 내로 도입될 수 있다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.
한 실시양태에서, 생합성적으로 제조된 생성된 비-천연 아미노산은 이미 원하는 개선된 검출 특성을 가진다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 개선된 검출 특성을 가진 기와의 아민 연결을 포함한다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 더 변형되어 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데, 이 변형은 개선된 검출 특성을 제공하는 기와의 아민 연결을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 기는 비-천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 실시양태에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비-천연 아미노산에 연결된다. 특정 실시양태에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비-천연 아미노산에 연결되고, 다른 실시양태에서, 일련의 화학 반응이 이러한 기를 비-천연 아미노산에 연결시키는 데 필요하다. 바람직하게는, 개선된 검출 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비-천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건 하에서 천연 발생 아미노산에 연결되지 않는다.
다른 또는 추가 실시양태에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과의 상동성을 나타내지만, 본 단락에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 개선된 생체내 샘플 또는 시험관내 샘플 중에서 검출될 필요가 있는, 예컨대, 하기 폴리펩티드를 포함하는 사실상 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
다른 또는 추가 실시양태에서, 개선된 검출 특성을 부여하는 기는 표지; 염료; 친화성 표지; 광친화성 표지; 스핀 표지; 형광단; 방사성 부분; 중원자를 도입하는 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 발색단; 에너지 전달제; 검출가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
K. 기능성 부가의 예: 폴리펩티드의 치료적 성질의 개선
천연 발생 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 장애, 질환 또는 증상을 앓는 환자에게 특정한 치료적 이점을 제공할 수 있을 것이다. 이러한 치료적 이점은 예컨대, 폴리펩티드의 안전성 프로파일, 및 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질(예컨대, 수용성, 생체이용성, 혈청 반감기, 치료 반감기, 면역원성, 생물학적 활성 또는 순환 시간)을 비롯한 다수의 인자에 달려 있을 것이다. 또한, 폴리펩티드에 추가 작용기 예컨대, 부착된 세포독성 화합물 또는 약물을 제공하는 것이 유리할 수 있거나, 추가 폴리펩티드를 부착시켜 본 명세서에 기재된 동종이량체 및 이종이량체를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 변형은 바람직하게는 모 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이 문제에 대한 해결책을 제공한다.
당업자는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단을 사용하여 원하는 폴리펩티드와의 상동성을 나타내는 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는데, 이때 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 치료적 특성을 가진다. 한 실시양태에서, 상동성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 제조된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 구조 중 한 구조 내로 도입될 수 있다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.
한 실시양태에서, 생합성적으로 제조된 비-천연 아미노산은 이미 원하는 개선된 치료적 특성을 가진다. 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 개선된 치료적 특성을 가진 기와의 아민 연결을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 더 변형되어 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데, 이 변형은 개선된 치료적 특성을 제공하는 기와의 아민 연결을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 기는 비-천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 실시양태에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비-천연 아미노산에 연결된다. 특정 실시양태에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비-천연 아미노산에 연결되고, 다른 실시양태에서, 일련의 화학 반응이 이러한 기를 비-천연 아미노산에 연결시키는 데 필요하다. 바람직하게는, 개선된 치료적 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비-천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건 하에서 천연 발생 아미노산에 연결되지 않는다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과의 상동성을 나타내지만, 본 단락에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 개선된 치료적 특성이라는 이점을 가질 수 있는, 예컨대, 하기 폴리펩티드를 포함하는 사실상 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
다른 또는 추가 실시양태에서, 개선된 치료적 특성을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용성을 개선시키고, 다른 실시양태에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합성을 개선시키고, 다른 실시양태에서, 상기 기는 폴리펩티드에 새로운 결합성을 제공한다(예컨대, 바이오틴 기 또는 바이오틴-결합 기를 포함함). 기가 폴리펩티드의 수용성을 개선시키는 실시양태에서, 상기 기는 예컨대, PEG 중합체를 비롯한, 본 명세서에 기재된 수용성 중합체로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 기는 세포독성 화합물인 반면, 다른 실시양태에서, 기는 약물이다. 추가 실시양태에서, 연결된 약물 또는 세포독성 화합물은 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 절단되어 상기 약물 또는 세포독성 화합물을 원하는 치료 위치에 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, 기는 예컨대, 제1 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 동일한 아미노산 구조를 가진 폴리펩티드를 비롯한 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 비롯한 제2 폴리펩티드이다.
또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 변형된 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 수용성을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 치료 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 순환 시간을 연장시킨다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절한다. 또 다른 또는 추가 실시양태에서, 알킬화 아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 면역원성을 조절한다.
XI . 변형된 폴리펩티드의 치료적 용도
편의를 위해, 본 단락에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 일반적으로 기재되고/되거나 특정 예로 기재된다. 그러나, 본 단락에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 폴리펩티드는 본 단락에 제공된 일반적 설명 또는 특정 예로만 한정되지 않고, 오히려 본 단락에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 폴리펩티드는 본원의 명세서, 청구의 범위 및 도면에 기재된 화학식 A 내지 E 및 I 내지 XVI의 범위 내에 포함되는 임의의 하위-화학식 또는 특정 화합물을 비롯한, 화학식 A 내지 E 및 I 내지 XVI의 범위 내에 속하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 모든 "변형 또는 비-변형" 비-천연 폴리펩티드에도 동등하게 적용된다.
그의 동종다량체 및 이종다량체를 포함하는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치료 용도, 진단 용도, 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도를 포함하는 다수의 용도로 사용된다. 비-제한적 예로서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 하기 치료적 용도가 제공된다.
본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 매우 다양한 장애, 증상 또는 질환의 치료에 유용하다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 투여는 인간에서 시판되는 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 활성들 중 임의의 활성을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균 양은 변할 수 있고, 특히 일정한 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료될 증상의 정확한 유형, 치료될 환자의 상태, 및 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자들에 달려 있다. 당업자는 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용한 요법을 기초로 하여 소정의 양을 용이하게 결정할 수 있다.
A. 투여 및 약학 조성물
그의 동종다량체 및 이종다량체를 포함하는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치료 용도, 진단 용도, 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도를 포함하는 다수의 용도로 사용된다. 비-제한적 예로서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 하기 치료적 용도가 제공된다.
본 명세서에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 매우 다양한 장애의 치료에 유용하다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 투여는 인간에서 시판되는 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 활성들 중 임의의 활성을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균 양은 변할 수 있고, 특히 일정한 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료될 증상의 정확한 유형, 치료될 환자의 상태, 및 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자들에 달려 있다. 당업자는 "변형 또는 비-변형" 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 요법을 기초로 하여 소정의 양을 용이하게 결정할 수 있다.
경우에 따라, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드(하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 합성효소, 단백질 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 예컨대, 적절한 약학적 담체와 함께 치료적 용도로 사용된다. 예를 들면, 이러한 조성물은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 만들어진다. 일반적으로, 단백질을 투여하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.
경우에 따라, 효능 및 조직 기전을 확인하고 투여량을 평가하기 위해, 1종 이상의 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 치료용 조성물은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 1종 이상의 적합한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 시험한다. 특히, 투여량은 즉, 관련 분석에서 천연 아미노산 상동체에 대한 비-천연 아미노산 상동체의 활성, 안정성 또는 다른 적절한 측정치(하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하도록 변형된 폴리펩티드와 천연 아미노산 폴리펩티드의 비교를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 의해 초기에 결정될 수 있다.
투여는 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는 데 통상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 임의의 적절한 방식에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용가능하고, 비록 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 종종, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 보다 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 구체적인 조성물뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 이용되는 구체적인 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물로 된 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물은 비경구 경로 예컨대, 피하 또는 정맥 주사 또는 임의의 다른 형태의 주사 또는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 주사를 포함하나 이로 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 적합한 임의의 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 약학 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 리포좀을 통해서도 투여될 수 있다. 이러한 투여 경로 및 적합한 제형은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로 사용될 수 있거나 약학적 담체를 포함하나 이로 한정되지 않는 다른 적절한 성분과 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드를, 단독으로 또는 다른 적절한 성분과 함께 흡입 투여용 에어로졸 제형(즉, 이들은 "분사"될 수 있음)으로 만들 수 있다. 에어로졸 제형은 가압된 허용가능한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 내에 배치될 수 있다.
예를 들면, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제, 및 해당 수용자의 혈액과 등장성을 나타내는 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포장된 핵산 제형은 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여는 투여의 바람직한 방법이다. 특히, 현재 사용되는 제형과 함께, 천연 아미노산 상동체 치료제에 대해 이미 이용되고 있는 투여 경로(EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, 인터루킨, 항체 및/또는 임의의 다른 약학적으로 전달되는 단백질에 대해 전형적으로 이용되는 투여 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간에 따라 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분하다. 투여량은 구체적인 제형의 효능, 및 사용된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 치료될 환자의 상태 뿐만 아니라, 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량은 구체적인 환자에서 구체적인 제형 등의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정된다.
질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 제형의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수치, 제형의 독성, 질환의 진행, 및/또는, 관련되는 경우, 항-비-천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.
전형적으로, 예를 들면, 70 킬로그램 환자에게 투여되는 투여량은 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대해 조정된, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위 내에 있다. 본 명세서에 기재된 제형은 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 변경제 등의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 상태를 보충할 수 있다.
투여에 있어서, 본 명세서에 기재된 제형은 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 다양한 농도에서의 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 부작용의 관찰, 예컨대, 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태에 의해 결정된 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 달성될 수 있다.
제형을 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 일으키는 경우, 적합한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 제형을 주입하기 30분 전, 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜히드라민을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약물을 주입에 대한 반응, 예를 들면 고열, 근육통 및 오한을 보이는 환자에게 미리 처방한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심각도에 따라 세포 주입을 늦추거나 또는 중단한다.
본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 포유동물 피험체에게 직접 투여할 수 있다. 투여는 폴리펩티드를 피험체 내로 통상적으로 도입하는 데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 어떠한 경우에도, 가장 적합한 경로는 치료될 증상의 특성 및 심각도에 달려 있지만, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통한 흡입을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 협측(설하를 포함하나 이로 한정되지 않음), 질, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막내, 복막내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 양쪽 모두) 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 제형은 단회 투여량 또는 다회 투여량 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량의 주사가능한 형태(용액, 현탁액 또는 에멀션을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 연속 관주(미니펌프, 예를 들면, 삼투압 펌프를 사용하는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 단일 볼러스(bolus) 또는 지연 방출 데포 제형에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적합한 제형은 제형을 등장성 제형으로 만들 수 있는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수용액, 비-수용액 및 등장성 멸균 용액 뿐만 아니라, 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 종래 공지된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
동결-건조는 원하는 단백질 제제로부터 물을 제거하는 데 기여하는 단백질을 제공하기 위해 통상적으로 이용되는 기법이다. 냉동-건조 또는 동결-건조는 건조될 물질을 먼저 동결시킨 후 진공 환경 하의 승화로 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 방법이다. 동결-건조 과정 동안 안정성을 증강시키고 저장 시 동결-건조된 생성물의 안정성을 개선하기 위해 부형제를 동결-건조 전에 미리 제형에 포함시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991)].
약제의 분무 건조 역시 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm., 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조한다. 소분자 약제 이외에, 다양한 생물학적 물질이 분무 건조되어 왔고 이들로는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효소가 있다. 분무 건조는 1-단계 과정으로 액상 약학 제제를 미세한, 먼지 없는 또는 응집된 분말로 전환할 수 있기 때문에 유용한 기법이다. 기본적인 기법은 하기 4개 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 스프레이 내로 분사하는 단계; b) 스프레이-공기를 접촉시키는 단계; c) 스프레이를 건조하는 단계; 및 d) 건조된 생성물을 건조 공기로부터 분리하는 단계. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,235,710호 및 제6,001,800호에는 스프레이 건조에 의한 재조합 에리쓰로포이에틴 제조가 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 아미노산 폴리펩티드에 대한 약학 조성물(경우에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함)로 이루어진 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다(예를 들면, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)] 참조). 적절한 담체로는 석시네이트, 포스페이트, 보레이트, 헤페스, 시트레이트, 히스티딘, 이미다졸, 아세테이트, 중탄산염 및 다른 유기산을 함유하는 완충제; 아스코르브산을 포함하나 이로 한정되지 않는 항산화제; 저 분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 가진 폴리펩티드가 포함되나, 이로 한정되지 않음); 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린을 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이로 한정되지 않는 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 라이신을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물(트레할로스, 수크로스, 글루코즈, 만노스 또는 덱스트린을 포함하나 이들로 한정되지 않음); EDTA 및 에덴테이트 디소듐을 포함하나 이들로 한정되지 않는 킬레이팅제; 아연, 코발트, 또는 구리를 포함하나 이들로 한정되지 않는 2가 금속 이온; 만니톨 및 소르비톨을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당 알코올; 나트륨 및 염화나트륨을 포함하나 이들로 한정되지 않는 염 형성 반대 이온; 및/또는 트윈TM(트윈 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20)을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 플루로닉스(Pluronics)TM 및 다른 플루론산(플루론산 F68(폴록사머 188) 또는 PEG를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 비이온성 계면활성제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 적합한 계면활성제로는 예를 들면, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드), 즉 (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 즉 (PPO-PEO-PPO)에 기초한 폴리에테르 또는 이들의 조합물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 플루로닉스™, R-플루로닉스™, 테트로닉스™ 및 R-테트로닉스™(BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) 하에 시판되며, 본 명세서에 그 전문이 참고로 도입되는 미국 특허 제4,820,352호에 더 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체가 적절한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 이들의 조합물을 사용하여, 교반으로부터 생기는 스트레스를 포함하나 이로 한정되지 않는 1종 이상의 스트레스로부터 PEG화된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있다. 상기 물질들 중 일부 물질은 증량제(bulking agent)로서 지칭될 수 있다. 또한, 일부 물질은 "강직성 개질제"로서 지칭될 수 있다. 항균 보존제도 제품 안정성 및 항균 효능을 위해 사용될 수 있고; 적합한 보존제로는 벤질 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드, 메타크레졸, 메틸/프로필 파라벤, 크레졸 및 페놀, 및 이들의 조합물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 비롯한 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 서방형 시스템 또는 이의 일부에 의해 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐(microcapsule)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예를 들면 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981): Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌[Langer et al., supra] 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 제133,988호), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허 제58,481호), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물(polyanhydride), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌[U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)] 참조), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포좀으로 포획되는 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다: 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호 및 제143,949호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 제4,619,794호, 제5,201,234호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호.
리포좀에 의해 포획되는 폴리펩티드는 예를 들면, 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82; 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호 및 제143,949호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 제4,619,794호, 제5,021,234호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 실험적으로 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예는 예를 들면, 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 조성물, 제형 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에게 유리한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 1회 투여 당 비경구로 투여되는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비-변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 환자 체중 1 kg 당 약 0.01 ㎍/일 내지 약 100 ㎍/일, 또는 약 0.05 mg/일 내지 약 1 mg/일 범위이다. 또한, 투여 빈도 역시 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 인간에게 사용할 수 있는 것으로 승인된 시판되는 생성물의 투여 빈도보다 더 적거나 더 많을 수 있다. 일반적으로, 예컨대, 본 명세서에 기재된 PEG화된 폴리펩티드를 비롯한 중합체:폴리펩티드 접합체는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식의 비-천연 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 치료 유효량의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00092
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이되;
단, R1이 H인 경우 R2는 OH가 아니고, 또는 R2가 OH인 경우 R1은 H가 아니다.
다른 실시양태에서, 치료 유효량의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 추가 실시양태에서, R1 및 R2 둘 다가 폴리펩티드인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, X가 수용성 중합체인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, X가 폴리에틸렌 글리콜의 유도체인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 추가 실시양태에서, X가 세포독성 화합물인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, X가 약물인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, X가 제2 폴리펩티드인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 제2 폴리펩티드가 펩티드 함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 하기 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타내는 단백질인 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내의 특정 부위에 도입되는, 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 리보좀에 의해 합성되는, 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 1개월 이상 동안 수용액 중에서 안정한, 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 2주 이상 동안 수용액 중에서 안정한, 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 5일 이상 동안 수용액 중에서 안정한, 장애, 증상 또는 질환의 치료 방법이 제공된다.
추가 실시양태에서, 하기 아미노산들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 유효량의 상동성 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다:
Figure 112013073088060-pat00093
상기 식에서,
Ra 각각은 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고;
M은 H 또는 -CH2R5이거나; 또는 M-N-C(R5) 부분은 4원 내지 7원의 고리 구조를 형성할 수 있고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 알콕시, 치환 알콕시, 알킬알콕시, 치환 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환 폴리알킬렌 옥사이드, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-N(R")2, -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알케닐렌 또는 치환 알케닐렌)-(아릴 또는 치환 아릴), -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)SR", 또는 -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환 아릴)이고, 이때 R" 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알콕시, 치환 알콕시, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클, 치환 헤테로시클, 알크아릴, 치환 알크아릴, 아르알킬, 치환 아르알킬 또는 -C(O)OR'이거나;
R5는 L-X이고, 이때 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교연결제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 저해성 리보핵산; 방사성뉴클레오티드; 중성자-포획제; 바이오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 치환기이고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환 알킬렌, 알케닐렌, 치환 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)N(R'), -OC(O)N(R')-, -OC(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-OC(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -NR'C(O)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-NR'C(O)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -S(O)k-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택된 링커이거나(이때, k는 1, 2 또는 3임); 또는
R5와 임의의 Ra는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R' 각각은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환 알킬이되;
단, R1이 H인 경우 R2는 OH가 아니고, 또는 R2가 OH인 경우 R1은 H가 아니다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 특정 부위에 도입되어 있는 폴리펩티드의 존재를 환자에서 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산이 번역 시스템의 사용에 의해 도입되어 있는 폴리펩티드의 존재를 환자에서 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산이 번역 시스템 및 번역 후 변형 시스템의 사용에 의해 도입되어 있는 폴리펩티드의 존재를 환자에서 검출하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 1개월 이상 동안 수용액 중에서 안정한 것인, 환자에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 2주 이상 동안 수용액 중에서 안정한 것인, 환자에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 5일 이상 동안 수용액 중에서 안정한 것인, 환자에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 하기 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타내는 단백질인, 환자에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
실시예
하기 실시예에는 방향족 아민 함유 아미노산의 합성 방법이 기재된다.
실시예 1a: 3- 클로로 -4-아미노-페닐알라닌의 합성
3-클로로-4-아미노-페닐알라닌을 도 11에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
실시예 1b: 3- 요오도 -4-아미노-페닐알라닌의 합성
3-요오도-4-아미노-페닐알라닌을 도 11에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
실시예 1c: 3- 메톡시 -4-아미노-페닐알라닌의 합성
3-메톡시-4-아미노-페닐알라닌을 도 12에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
실시예 1d: 3- 플루오로 -4-아미노-페닐알라닌의 합성
3-플루오로-4-아미노-페닐알라닌을 도 12에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
실시예 1e: N- 메틸 -p-아미노-페닐알라닌의 합성
N-메틸-p-아미노-페닐알라닌을 도 13에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
실시예 1f: N-에틸-p-아미노-페닐알라닌의 합성
N-에틸-p-아미노-페닐알라닌을 도 13에 나타낸 방법에 따라 합성하였다.
하기 실시예에는 변형된 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시킨 후 번역 후 변형시키는 방법이 기재된다.
실시예 2: hGH 의 PEG 화
본 실시예는 이. 콜라이에서 변형 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 설명하기 위한 것이다. 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(0-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 발현시켰다. O-RS는 우선적으로 O-tRNA를 비-천연 아미노산으로 아미노아실화시켰다. 이어서, 번역 시스템이 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입시켰다. 변형 유전자 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비-천연 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드를 사용한 이. 콜라이의 형질전환을 통해 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 부위 특이적으로 도입하였다. 0.01 내지 100 mM의 특정한 비-천연 아미노산을 함유하는 37℃의 배지 중에서 생장한 형질전환된 이. 콜라이는 높은 신뢰도 및 효율로 변형 폴리펩티드를 발현시켰다. 비-천연 아미노산을 함유하는 His-태그 폴리펩티드가 이. 콜라이 숙주 세포에 의해 봉입체 또는 응집물로서 생성되었다. 응집물을 가용화시키고, 변성 조건 하에서 6 M 구아니딘 HCl 중에서 친화적으로 정제하였다. 4℃에서 50 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 μM CuSO4 및 2%(w/v) 사르코실 중에서 밤새 투석하여 재폴딩을 수행하였다. 그 다음, 이 물질을 20 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2에 대해 투석한 후, His-태그를 제거하였다. 문헌[Boissel et al., (1993) 268: 15983-93]을 참조할 수 있다. 폴리펩티드의 정제 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전자분무-이온화 이온 트랩(ion trap) 질량 분광법 등으로 확인하였다.
예를 들어, 위치 35에서 티로신이 p-아미노페닐알라닌으로 치환된 hGH 폴리펩티드(H6-hGH Y35pAF2)를, hGH, 및 비-천연 아미노산에 대한 오르토고날 tRNA 합성효소-오르토고날 tRNA 쌍을 코딩하는 구축물을 사용하여 이. 콜라이에서 발생시켰다. 발현된 단백질은 IMAC 및 IEX 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 상기 단백질은 10 mM 인산나트륨, 20 g/ℓ 글리신 및 5 g/ℓ 만니톨 (pH 7.0) 내로 투석한 후, 350 μM로 농축시켰다. 샘플의 pH는 10% 아세트산을 사용하여 pH 4.0으로 조절하였다.
H6-hGH Y35pAF2의 번역 후 변형은 다양한 PEG-알데히드를 사용한 p-아미노페닐알라닌의 환원성 알킬화에 의한 H6-hGH Y35pAF2의 PEG화에 의해 입증되었다. 이러한 PEG화에 대한 비-제한적 과정의 개요는 도 39에 나타나 있으며 하기와 같이 본원에 기재된다: 2OK, 3OK 및 4OK PEG 알데히드를 사용하여 100 ㎕ PEG화 반응액을 준비하였다. PEG 알데히드는 pH 4.0의 20 mM 아세테이트 완충제 중에 함유되어 있다. 각 반응물의 단백질에 대한 PEG의 몰 비는 1:1이었고, DMF 중에 가용화된 NaCNBH3:단백질의 몰 비는 5:1이었다. 반응액을 4℃ 또는 실온에서 항온처리하고 3, 4, 6 및 16시간 후 SDS-PAGE로 분석하였다. 생성된 펩티드의 겔 전기영동은 도 40에 나타나 있다.
하기 실시예에는 도 20 내지 34에 나타낸 번역 후 변형에 의한 폴리펩티드의 변형 방법이 기재되는데, 이때 X는 p-아미노페닐알라닌이다.
실시예 3a: 프로피온알데히드 및 벤즈알데히드를 사용한 환원된 유로텐신 -II(UT-II-SH)의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드)와 0.25 mM의 환원된 유로텐신의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 0 내지 50% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드(Zorbax Extend) C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3b: 프로피온알데히드 및 벤즈알데히드를 사용한 유로텐신 - II ( UT - II )의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드)와 0.25 mM의 유로텐신의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3c: 프로피온알데히드 , 벤즈알데히드 , 이소부트알데히드 및 피발알데히드를 사용한 펩티드 XT-8의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드 또는 0.25 mM의 이소부트알데히드 또는 0.25 mM의 피발알데히드)와 0.25 mM의 XT-8의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3d: 프로피온알데히드 , 벤즈알데히드 , 이소부트알데히드 및 피발알데히드를 사용한 펩티드 SXT-9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드 또는 0.25 mM의 이소부트알데히드 또는 0.25 mM의 피발알데히드)와 0.25 mM의 SXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3e: 프로피온알데히드 , 벤즈알데히드 , 이소부트알데히드 및 피발알데히드를 사용한 펩티드 HXT-9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드 또는 0.25 mM의 이소부트알데히드 또는 0.25 mM의 피발알데히드)와 0.25 mM의 HXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3f: 프로피온알데히드 , 벤즈알데히드 및 이소부트알데히드를 사용한 펩티드 WXT-9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드 또는 0.25 mM의 이소부트알데히드)와 0.25 mM의 WXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3g: 프로피온알데히드 및 벤즈알데히드를 사용한 펩티드 NXT -9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드)와 0.25 mM의 NXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3h: 프로피온알데히드 또는 벤즈알데히드를 사용한 펩티드 RXT -10의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드)와 0.25 mM의 RXT-10의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3i: 프로피온알데히드 또는 벤즈알데히드를 사용한 펩티드 AXT -11의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 프로피온알데히드(또는 0.25 mM의 벤즈알데히드)와 0.25 mM의 AXT-11의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3j: 3- 페닐프로판알 , 2- 페닐아세트알데히드 또는 신남알데히드를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 3-페닐프로판알(또는 0.25 mM의 2-페닐아세트알데히드 또는 0.25 mM의 신남알데히드)와 0.25 mM의 AXT-11의 혼합물에 첨가하고 5시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3k: 1H- 이미다졸 -5- 카르브알데히드 , 티오펜-2- 카르브알데히드 , 피콜린알데히드 또는 퀴놀린-4-카르브알데히드를 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.25 mM의 1H-이미다졸-5-카르브알데히드(또는 0.25 mM의 티오펜-2-카르브알데히드 또는 0.25 mM의 피콜린알데히드 또는 0.25 mM의 퀴놀린-4-카르브알데히드)와 0.25 mM의 AXT-11의 혼합물에 첨가하고 5시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3l: 벤즈알데히드 , 1- 페닐부탄 -1,3- 디온 , 또는 벤즈알데히드와 1- 페닐부탄-1,3-디온의 혼합물을 사용한 펩티드 AXT-11의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.20 mM의 벤즈알데히드(또는 0.20 mM의 1-페닐부탄-1,3-디온, 또는 0.20 mM의 벤즈알데히드와 0.20 mM의 1-페닐부탄-1,3-디온의 혼합물)와 0.20 mM의 AXT-11의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3m: 벤즈알데히드 , 1- 페닐프로판 -1,2- 디온 , 또는 벤즈알데히드와 1-페닐프로판-1,2-디온의 혼합물을 사용한 펩티드 NXT-9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.20 mM의 벤즈알데히드(또는 0.20 mM의 1-페닐프로판-1,2-디온, 또는 0.20 mM의 벤즈알데히드와 0.20 mM의 1-페닐프로판-1,2-디온의 혼합물)와 0.20 mM의 NXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3n: 벤즈알데히드 , 아세토페논, 벤즈알데히드와 아세토페논의 혼합물, 벤즈알데히드와 프로피온알데히드의 혼합물, 또는 벤즈알데히드와 부탄-2-온의 혼합물을 사용한 펩티드 MXT-9의 환원성 알킬화
3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.20 mM의 벤즈알데히드(또는 0.20 mM의 아세토페논, 또는 0.20 mM의 벤즈알데히드와 0.20 mM의 아세토페논의 혼합물, 또는 0.20 mM의 벤즈알데히드와 0.20 mM의 프로피온알데히드의 혼합물, 또는 0.20 mM의 벤즈알데히드와 0.20 mM의 부탄-2-온의 혼합물)와 0.20 mM의 MXT-9의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
실시예 3o: 펩티드 MXT -9- N 3 의 환원 후 프로피온알데히드 또는 벤즈알데히드를 사용한 펩티드 MXT-9-NH2의 환원성 알킬화
MXT-9-N3의 혼합물을 TCEP로 환원시켜 펩티드 MXT-9-NH2를 수득하였다. 3 당량의 NaBCNH3의 혼합물(pH 4)을 0.20 mM의 프로피온알데히드(또는 0.20 mM의 벤즈알데히드)와 0.20 mM의 MXT-9-NH2의 혼합물에 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 생성물 혼합물을 하기 조건을 사용하여 HPLC로 분석하였다: 5 내지 60% B(A, 물 중의 0.05% TFA; B, 물 중의 60% 아세토니트릴 및 0.05% TFA), 유속: 1.5 ㎖/분; 컬럼: 조박스 익스텐드 C18, 3.5 m, 4.6 x 50 mm.
하기 실시예에는 변형된 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성 및 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성을 측정하여 이들을 비교하는 방법이 기재된다.
실시예 4: 비-천연 아미노산 폴리펩티드 활성 및 친화성의 측정
본 실시예에는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 활성, 및 이들의 수용체, 결합 파트너 또는 리간드에 대한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성의 측정이 상술된다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드 수용체, 결합 파트너 또는 리간드에 대한 단백질을 당업자에게 공지된 방법에 따라 발현하고 단리하였다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 수용체에 대한 상기 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 결합을 분석하기 위해 비아코어(Biacore)™ 시스템을 사용하였다. 유사하게, 결합 파트너 또는 리간드를 이 분석에 사용하였다.
제조자에 의해 권장되는 바와 같이 표준 아민-커플링 절차를 사용하여 약 600 내지 800 RU의 가용성 수용체를 비아코어™ CM5 칩 상에 고정시켰다. HBS-EP 완충제(Biacore™, Pharmacia) 중의 다양한 농도의 야생형 또는 (변형) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 표면 상에서 40 ㎕/분의 유속으로 4 내지 5분 동안 주입하고 주입 후 15분 동안 모니터링하였다. 상기 표면은 4.5M MgCl2의 15초 펄스에 의해 재생되었다. 결합 친화성의 최소한의 손실(1 내지 5%)만이 적어도 100 재생 주기 후에 관찰되었다. 고정된 수용체를 갖지 않는 기준 셀을 사용하여 임의의 완충제 용적 효과 및 비-특이적 결합을 차감하였다.
(변형) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 적정 실험으로부터 얻은 속도론적 결합 데이타를 비아에발루션(BiaEvaluation) 4.1 소프트웨어(BIACORE™)로 처리하였다. 평형 해리 상수(Kd)를 개개의 속도 상수(koff/kon)의 비로서 산출하였다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 수용체, 결합 파트너 또는 리간드를 발현하는 안정한 세포주를 확립하였다. 수용체, 결합 파트너 또는 리간드 cDNA를 함유하는 구축물을 전기천공으로 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 클로닝 전에 48시간 동안 회수하였다. 수용체, 결합 파트너 또는 리간드 발현 형질감염체를 수용체에 대한 항체로 표면 염색하여 확인하고 FACS 어레이(BD Biosciences, San Diego, CA) 상에서 분석하였다. 안정하게 형질감염된 세포 클론은 원하는 형질감염체의 반복된 서브클로닝의 추가 라운드 시 확립되었다. 이러한 세포를 세포 결합 분석에 사용하였다.
세포(3 x 106)를 다양한 농도(부피 10 ㎕)의 비-표지 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 음성 대조군 폴리펩티드의 부재 또는 존재 하에, 그리고 125I-(변형) 비-천연 아미노산 폴리펩티드(약 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재 하에 0℃에서 90분 동안 PBS/1% BSA(100 ㎕) 중에서 중복적으로 항온처리하였다(총 부피: 120 ㎕). 그 후, 세포를 재현탁시키고 350 ㎕ 플라스틱 원심분리 튜브 내의 200 ㎕ 빙냉 FCS 상에 놓고 원심분리하였다(1000 g; 1분). 상기 튜브의 말단을 절단하여 펠릿을 회수하고 펠릿 및 상청액을 감마 카운터(Packard) 내에서 별도로 카운팅하였다.
특이적 결합(cpm)을 비-특이적 결합을 제외한 경쟁자의 부재 하에서의 총 결합(중복 실험의 평균)으로서 측정하였다. 비-특이적 결합은 사용된 세포 종류 각각에 대해 측정하였다. 실험은 동일한 125I-(변형) 비-천연 아미노산 폴리펩티드 제제를 사용하여 다른 날짜에 수행하였고 내적 일관성을 나타내어야 한다. 125I-(변형) 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체, 결합 단백질 또는 리간드-생성 세포에의 결합을 입증한다. 결합은 음성 대조군 폴리펩티드에 의해서가 아니라 비표지 천연 아미노산 폴리펩티드에 의해 투여량 의존적 방식으로 억제된다.
실시예 5: 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생체내 연구
변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드 및 완충제 용액을 마우스 또는 래트에게 투여하였다. 결과는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 우수한 활성 및 연장된 반감기를 보여준다.
실시예 6: 접합된 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 접합되지 않은 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 및 이들의 변이체의 생체내 반감기의 측정
모든 동물 실험을 AAALAC 공인 시설 내에서 세인트 루이스 유니버시티(St. Louis University)의 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행하였다. 래트를 실험실 내의 우리 내에서 12-시간 명/암 주기를 제공하면서 개별적으로 사육하였다. 동물은 공인된(Purina) 푸리나 설치류 먹이 및 물에 임의로 접근할 수 있게 하였다.
실시예 7: 약동학적 연구
동물 실험에 들어가기 전에 각각의 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 질을 3가지 분석법으로 평가하였다. 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 비-환원 조건 하에서 MES SDS 런닝 완충제를 사용하여 4 내지 12% 아크릴아미드 NuPAGE 비스-트리스 겔 상에서 런닝시킴으로써 조사하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA). 겔을 코마시에 블루로 염색하였다. 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 밴드는 밀도측정 스캔을 기준으로 95%보다 더 높은 순도를 나타내었다. 각각의 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드에서의 내독소 수준은 찰스 리버 레보레이토리스(Charles River Laboratories; Wilmington, MA)로부터 구입된 KTA2 키트를 사용한 속도론적 LAL 분석으로 시험하였고 투여량 당 5 EU 미만이었다. 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성은 이 폴리펩티드의 생체활성의 특징을 규명하는 세포 분석으로 평가하였다.
변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 화합물의 약동학적 성질을 찰스 리버 레보레이토리스로부터 입수된 수컷 스프라그-다울리 래트(261 내지 425 g)에서 서로 비교하고 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드와 비교하였다. 채혈을 위해 수술을 통해 카테터를 경동맥 내에 설치하였다. 성공적인 카테터 설치 후, 투약 전에 동물을 처리군(군 당 3 내지 6 마리)으로 나누었다. 0.41 내지 0.55 ㎖/kg의 투약 부피로 화합물 1 mg/kg을 동물에게 피하 투여하였다. 내재된 카테터를 통해 혈액 샘플을 다양한 시점에서 EDTA-피복 마이크로 튜브 내로 채취하였다. 원심분리 후 혈장을 모아 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 바이오소스 인터내셔날(Camarillo, CA) 또는 다이아그노스틱 시스템스 레이보레이토리스(Diagnostic Systems Laboratories; Webster, TX)로부터 구입한 항체 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 화합물 농도를 측정하였다. 투여된 유사체에 상응하는 표준을 이용하여 농도를 산출하였다. 모델링 프로그램 윈놀린(WinNonlin)(Pharsight, version 4.1)을 사용하여 약동학적 파라미터를 추정하였다. 선형-상승/대수-하강 사다리꼴 적분을 사용한 비구획 분석을 사용하여 농도 데이타에 균일하게 가중치를 주었다. 그 다음, 데이타를 작도하여 Cmax(최대 농도), 말기 t1 /2(말기 반감기), AUCO →∞inf(무한대까지 외삽법에 의해 추정된 농도-시간 곡선 하의 면적), MRT(평균 체류 시간), Cl/f(겉보기 총 혈장 제거율), 및 Vz/f(말기 동안의 겉보기 부피 분포)를 수득하였다.
실시예 8: 약력학적 연구
수컷 스프라그-다울리 래트를 찰스 리버 레보레이토리스로부터 입수하였다. 동물을 3주 동안 순화시키고, 이 기간 동안 천연 아미노산 폴리펩티드와 관련된 생물학적 특성을 모니터링하였다. 이들 생물학적 특성에서의 허용가능한 수준의 변화를 가진 동물을 처리군으로 무작위적으로 나누었다. 래트에게 변형 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 볼루스 투여량 또는 1일 투여량을 피하로 투여하였다. 연구 기간 내내 래트를 매일 순차적으로 마취시키고, 채혈하고 (적용가능한 경우) 투약하고, 상관관계를 가진 생물학적 특성을 측정하였다. 헤파린으로 처리된 모세관 튜브를 사용하여 안화누(orbital sinus)로부터 채혈하여 EDTA 피복 마이크로퓨즈 튜브 내에 넣었다. 원심분리하여 혈장을 모으고 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 래트에서의 단회 피하 투여 후 혈장 농도를 수득하였다.
실시예 9: 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 및/또는 효능에 대한 인간 임상 시험
목적
피하 투여된 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 및 약동학적 성질을 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 및 약동학적 성질과 비교하기 위한 것이다.
환자
연령이 20 내지 40세이고 체중이 60 내지 900 kg인 18명의 건강한 지원자들을 이 연구에 등록시킨다. 이 피험체들은 혈액학 또는 혈청 화학, 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험 값을 갖지 않는다. 이들은 하기 경우 중 어떠한 경우에도 해당하지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 1차 혈액학적 질환의 병력; 심각한 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 박테리아 또는 포유동물 유도 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 공지된 감수성; 카페인을 함유하는 음료에 대해 심각한 중독; 연구 시작 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 혈액을 수혈받거나 또는 수혈한 경험; 연구 시작 전 3개월 이내에 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 노출된 경험; 연구 시작 전 7일 이내에 질환을 앓은 경험; 및 연구 시작 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가 시 유의한 이상 증세가 있는 경우. 모든 피험체는 안전성에 대해 평가될 수 있고, 약동학적 분석을 위한 모두 채혈을 예정대로 수행한다. 모든 연구는 윤리 위원회의 승인 및 환자의 동의하에 수행된다.
연구 디자인
이는 건강한 남성 지원자들을 대상으로 한 임상 I 단계 단일-센터 공개 무작위 2-기 교차 연구이다. 18 명의 피험체를 두 치료 순서 군 중 하나(군 당 9 명의 피험체)에 무작위로 배정하였다. 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 등가 투여량의 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하여 대퇴부에서 볼러스 피하 주사로서 분리된 두 투여 기간에 걸쳐 투여하였다. 시판되는 제품의 투여량 및 투여 빈도는 팩키지 표지에 지시된 대로 따랐다. 추가 군의 피험체를 포함시킴으로써, 시판되는 제품을 사용한 추가 투여량, 투여 빈도 또는, 필요에 따라, 다른 매개변수를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간은 14일간의 워시아웃(washout) 기간에 의해 분리된다. 피험체는 투여 기간 사이가 아닌, 각각의 두 투여 기간 동안 투여 전 12시간 이상부터 투여 후 72시간까지 연구 센터에만 있었다. 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대해서도 시험될 추가 투여량, 투여 빈도 또는 다른 매개변수가 존재하는 경우 추가 군의 피험체를 연구에 포함시킬 수 있다.
혈액 샘플링
변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 투여 전 및 후에 직접적인 정맥 천자를 통해 연속적으로 채혈하였다. 혈청 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드 농도의 측정을 위해 정맥혈 샘플(5 ㎖)을 투여(3 개의 기준 샘플) 전 약 30, 20 및 10 분에서 얻고, 투여 후 대략 하기 시간에서 얻었다: 30분 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간. 각각의 혈청 샘플을 2 개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20 ℃에서 저장하였다. 혈청 샘플을 드라이 아이스 상에 두었다. 금식 임상 실험실 시험(혈액학, 혈청 화학 및 뇨검사)을 제1일에 첫 투여 직전, 제4일 아침, 제16일 투여 직전 및 제19일 아침에 수행하였다.
생체분석 방법
혈청 농도를 측정하는 데 ELISA 키트 절차(BioSource International(Camarillo, CA))를 사용하였다.
안전성 측정
활력 징후를 각각의 투여 직전(제1일 및 제16일), 및 각각의 투여 후 6, 24, 48 및 72시간에서 기록하였다. 안전성을 발병률 및 불리한 이벤트의 종류 및 임상 실험실 시험에서의 기준과의 차이를 기초로 하여 측정하였다. 또한, 혈압을 비롯한 활력 징후 측정 및 신체 검사 결과에 있어서 연구 전과의 차이를 평가하였다.
데이터 분석
투여 전 30분, 20분 및 10분에서 수집된 3개의 샘플로부터의 농도를 평균내어 결정한 평균 기준 농도를 투여 후 값들 각각으로부터 차감함으로써 투여 후 혈청 농도 값을 투여 전 기준 농도에 대해 보정하였다. 투여 전 혈청 농도가 분석의 정량화 수준 미만인 경우, 이 농도는 평균 값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 매개변수는 기준 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 측정되었다. 약동학적 매개변수는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 VAX 8600 컴퓨터 시스템(Digital Equipment Corporation)에서 모델 독립적 방법에 의해 산출되었다. 하기 약동학적 매개변수가 결정되었다: 피크 혈청 농도(Cmax); 피크 혈청 농도에 대한 시간(tmax); 선형 사다리꼴 법칙을 이용하여 계산한 0 내지 마지막 채혈 시간(AUC0 -72)에서의 농도-시간 곡선 하의 면적(AUC); 및 제거율 상수로부터 산정된 최종 제거 반감기(t1 /2). 제거율 상수는 로그-선형 농도-시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속적인 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정되었다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 매개변수의 평균, 표준 편차(SD) 및 변이 계수(CV)를 산출하였다. 매개변수 평균의 비(보존된 제형/보존되지 않은 제형)를 산출하였다.
안전성 결과
불리한 사건 발생률은 처리군에 걸쳐 동일하게 분포하였다. 기준 또는 연구 전 임상 실험실 시험 또는 혈압과의 임상적으로 유의한 차이는 없고, 연구 전 신체 검사 결과 및 활력 징후 측정에 있어서도 연구 전과의 뚜렷한 차이가 없었다. 두 처리군에 대한 안전성 프로파일은 유사한 것으로 보여야 한다.
약동학적 결과
단회 투여량의 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여받은 후, 모든 18명의 피험체에서 평균 혈청 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드 농도-시간 프로파일(기준 농도에 대해 보정되지 않음)을 측정되는 각각의 시점에서 비교하였다. 모든 피험체들은 정상적인 생리학적 범위 내의 투여 전 기준 농도를 가져야 한다. 약동학적 매개변수는 투여 전 평균 기준 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정되고, Cmax 및 tmax가 결정된다. 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 평균 tmax는 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 tmax보다 상당히 짧다. 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 최종 반감기 값은 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 최종 반감기에 비해 상당히 더 짧다.
비록 본 발명의 연구가 건강한 남성 피험체에서 수행되었지만, 유사한 흡수 특징 및 안전성 프로파일이 다른 환자 집단, 예를 들면 암 또는 만성 신부전을 앓는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전 환자, 자가조직 예치(autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 대기 수술이 예정된 환자에서도 기대될 것이다.
결론적으로, 피하 투여된 단회 투여량의 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 건강한 남성 피험체에게 안전하고, 이러한 피험체들이 잘 받아들일 수 있다. 불리한 사건의 유사한 발생률, 임상 실험실 값, 활력 징후 및 신체 검사 결과를 기초로 할 때, 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 프로파일은 동등할 것이다. 변형 치료 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 잠재적으로 환자 및 건강 관리 제품의 공급자들에게 임상적으로 매우 유용하다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태는 설명을 위해 제공되는 것이며, 이들의 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 시사될 것이고, 이는 본원의 기술적 사상 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 완전히 본 명세서에 참고로 도입된다.
서열목록
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Figure 112013073088060-pat00095
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Claims (3)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112014031808032-pat00097

    상기 식에서,
    Q는 결합, -C(O)-, 또는 C1-C8 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R1은 H, 아미노 보호기 또는 하나 이상의 아미노산이며;
    R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 하나 이상의 아미노산이고;
    R3 및 R4 각각은 독립적으로 H, 할로겐, C1-C8 알킬, 또는 치환된 C1-C8 알킬이거나, 또는
    R3과 R4 기 또는 2개의 R3 기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
    각각의 Ra는 H, 할로겐, 알킬, -NO2, -CN, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR', 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 k는 1, 2 또는 3이고; R 및 R' 각각은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 -C(O)-알킬이며; Q가 결합인 경우, (i) R가 H일 때, R'는 C3-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알킬 또는 -C(O)-C3-C6 알킬이거나, 또는 (ii) R'가 H일 때, R은 C3-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알킬 또는 -C(O)-C3-C6 알킬이거나, 또는 (iii) R 및 R'는 각각 치환된 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2 둘다가 각각 하나 이상의 아미노산인 화합물.
  3. 하기 화학식의 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 폴리펩티드:
    Figure 112013073088060-pat00098
    ,
    Figure 112013073088060-pat00099
    ,
    Figure 112013073088060-pat00100
    ,
    Figure 112013073088060-pat00101
    , 및

    Figure 112013073088060-pat00102
    .
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