CN102614525A - 一种蛋白介导的脑靶向基因递释系统及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,涉及一种蛋白介导的脑靶向基因递释系统及其用途,尤其是在治疗帕金森病药物中的用途。本发明通过亲水性聚合物将乳铁蛋白修饰于阳离子高分子材料上,与质粒DNA通过静电作用复合形成基因递释系统。本发明可有效提高脑毛细血管内皮细胞上基因的转染效率和表达效率,特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释系统的脑靶向性和基因在脑部的表达,与现有技术采用的靶向头基构筑的基因递释系统比较,脑靶向效果显著提高。经动物模型实验,结果证实,该基因递释系统,能显著改善帕金森模型动物的行为障碍,明显增加纹状体和黑质中多巴胺能神经元的数目,同时提高纹状体单胺类递质的水平。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及一种蛋白介导的脑靶向基因递释系统及其用途,尤其是在治疗帕金森病药物中的用途。
背景技术
帕金森病是一种常见于中老年的神经退行性疾病,其主要发病机制是黑质致密部多巴胺能神经元的选择性损伤,从而导致纹状体神经递质多巴胺(dopamine, 简称DA)的缺失。目前帕金森病的治疗主要通过口服左旋多巴(L-DOPA,是DA的前体)来提高纹状体DA水平,缓解帕金森病临床症状,但是不能从根本上改善多巴胺能神经元的病态,不能延缓和阻止神经细胞的衰退进程。随着多巴胺能神经元细胞的不断缺失,疗效降低,且不良反应多。有研究通过外科手术移植胚胎多巴胺能神经元细胞,替代脑内固有的受损神经细胞,补充多巴胺能神经元细胞功能,但是由于无法准确控制移植细胞的生长、存活率以及免疫反应等,可能产生长期的并发症,并且存在操作繁琐、伦理问题而很难成为一种常规的治疗策略。
近年研究表明,一些活性蛋白如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑细胞源性神经营养因子等具有很强的多巴胺能神经元营养、保护作用,可以从根本上减缓或阻止受损多巴胺能神经元细胞的衰退进程,并且保护正常的神经细胞免受损伤。但是由于这些蛋白半衰期短,且无法自主通过血脑屏障,静脉给药后脑内不能达到治疗浓度,因此,目前只能采用脑定位注射、脑内微渗透泵给药等外科手术方法直接运送这些蛋白到病变部位以达到治疗作用。而对于慢性神经退行性疾病的治疗通常需要持续5年、10年甚至更长,脑部外科手术创伤性大,很难维持长期治疗。
基因治疗是神经退行性疾病治疗的有效手段之一。由于GDNF生理活性较强,其基因对于神经退行性疾病也有很好的疗效。但由于血脑屏障的限制,基因无法自主从血液循环进入脑内而发挥疗效。目前大量研究采用携带GDNF基因的病毒载体通过脑内定位注射方法对帕金森病进行治疗,常用有腺病毒、慢病毒、腺相关病毒等。病毒载体的基因转染效率高,持续时间可达数月,但是病毒载体存在潜在的安全性问题,如免疫原性等。同时脑内定位注射的方法伤害性大,很难长期重复给药,无法满足对于如帕金森病等病程长达数年或更长的神经退行性疾病的治疗需要。此外,已知人脑体积约为鼠脑的1000多倍,定位注射后病毒载体的扩散范围十分有限,无法实现脑部治疗基因的广泛表达。以高分子为核心的非病毒基因载体安全性高,但是转染效率较病毒载体低,且表达持续时间较短,脑内的靶向效率不高。
阳离子树状高分子材料是一类纳米级的合成高分子,高度分枝,末端氨基丰富,强正电性,并易于经过适当的修饰连接抗体等生物活性物质以增加载体的靶向性。已有研究使用聚酰胺-胺(polyamidoamine,简称PAMAM)树状高分子有效包载基因进入细胞。但是,单独采用这些荷强正电性的高分子材料具有一定的不足,如较强的溶血性等,因此经过一定的修饰后在基因转运方面有很大的应用潜力。
有文献报道在血脑屏障上存在一些特异性受体,如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白等。转铁蛋白受体因其在毛细血管上的表达仅限于脑毛细血管内皮而备受关注。但是,近期的研究表明,转铁蛋白与其受体的解离常数(Kd)为1μM,而生理状态下循环系统中游离的转铁蛋白浓度很高,约为25μM,此浓度对于转铁蛋白受体而言几乎是饱和的,使得转铁蛋白作为药物转运载体靶向头基的应用受到限制。因此,寻找新的脑靶向头基是克服血脑屏障、提高脑部药物转运的一个有效途径。
乳铁蛋白(lactoferrin,简称Lf)属于转铁蛋白家族,是一种铁离子转运糖蛋白,主要在腺上皮细胞表达和分泌。它是一种多功能蛋白,目前主要用于调节内环境离子稳定、抗微生物感染、调节细胞生长、抑制血小板聚集、增强免疫等。最近,有研究表明,乳铁蛋白的多项生理功能都是通过乳铁蛋白受体介导乳铁蛋白进入细胞来实现的。有学者在不同种属小肠中发现乳铁蛋白受体,并从婴儿体内分离纯化出人小肠乳铁蛋白受体。另有学者用125I标记乳铁蛋白后测定其与脑部脉络丛内皮膜上的乳铁蛋白受体结合的Kd值为0.11μM,说明在脑部有乳铁蛋白受体的表达。虽然乳铁蛋白广泛分布于体液中,但血浆中的浓度仅为5 nM左右,此浓度不会使乳铁蛋白受体饱和,提示可进一步研究乳铁蛋白作为靶向头基的可行性。更为重要的是,文献报道帕金森病患者脑部神经元和微血管上Lf受体表达显著增加,表明Lf可用于构建针对帕金森病的脑靶向基因递释系统。
发明内容
本发明的目的是针对现有脑靶向基因递释系统存在的不足,提供一种新的脑靶向基因递释系统,具体涉及一种蛋白介导的脑靶向基因递释系统及其用途,尤其是在治疗帕金森病药物中的用途。
本发明采用乳铁蛋白作为靶向头基,阳离子高分子材料为基础载体,通过亲水性聚合物连接乳铁蛋白构筑基因递释载体;所获得的基因递释载体与质粒DNA构筑形成80~300 纳米大小的基因递释系统即本发明脑靶向基因递释系统。
具体而言,本发明的蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,由乳铁蛋白修饰的基因递释载体和质粒DNA构成,所述的乳铁蛋白修饰的基因递释载体由阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白组成;所述的乳铁蛋白修饰的基因递释载体中,亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是1~15:1,乳铁蛋白与阳离子高分子材料的分子比为1~6:1,所述的基因为治疗基因。
本发明构筑的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白/DNA基因递释系统,能明显提高治疗基因在脑部的转染效率和表达水平。
本发明构筑的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白/DNA基因递释系统,经尾经脉注射后,能显著改善帕金森模型大鼠的行为障碍,明显增加纹状体和黑质中多巴胺能神经元的数目,同时提高纹状体单胺类递质的水平。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
以阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白为组分,三者以共价方式连接制备乳铁蛋白修饰的高分子基因递释载体。其中,亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是1~15:1,乳铁蛋白与阳离子高分子材料的分子比为1~6:1;
上述基因递释载体按下述方法制备:阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1:1~15的分子比溶于pH值7.8~8.2磷酸盐缓冲液中,室温搅拌反应10~60分钟,两种分子中含有的基团发生特异性反应,生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物,超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8~7.2磷酸盐缓冲液。同时,乳铁蛋白与巯基化试剂反应后引入巯基,以1~6:1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异治疗基团室温搅拌反应12~36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白,分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白。
上述基因递释载体与质粒DNA形成80~300 纳米大小的基因递释系统,其中的阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比是1~15:1。
本发明按下述方法制备基因递释系统:将制备的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白基因递释载体溶于pH值7.3~7.5磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液,将质粒DNA溶于50 mM 硫酸钠溶液中配制成所需浓度的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成基因递释系统。
本发明中,所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或阳离子脂质。
所述亲水性聚合物选自聚乙二醇(polyethyleneglycol, 简称PEG)、聚氧乙烯或聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。
所述质粒DNA选自任何可在真核细胞表达的质粒DNA,所述治疗基因为编码人源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的治疗基因(hGDNF)。
本发明采用核磁共振技术对所制备的基因递释载体及其制备过程的中间产物进行结构鉴定,结果显示,PAMAM与含有双功能基团的PEG(琥珀酰亚胺-PEG3400-马来酰亚胺)反应后在3.5 ppm处出现PEG的特征吸收峰,并在6.7 ppm处出现马来酰亚胺的特征吸收峰,说明PEG已经修饰到PAMAM上,再和乳铁蛋白反应后该马来酰亚胺的特征吸收峰消失,说明PAMAM-PEG-Lf合成成功。
本发明采用0.7%琼脂糖凝胶电泳技术考察所制备的基因递释系统的稳定性,结果显示,经DNase酶处理后,基因递释系统中的DNA未被降解,酶降解反应中止后采用强阴性的十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate,简称SDS)处理,置换出的DNA和对照DNA条带位置一致,说明基因递释系统中的DNA未被DNase酶降解。
本发明所制备的基因递释系统转染脑毛细血管内皮细胞,定性和定量结果均显示,PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统获得最高的表达效率,其中荧光素酶定量结果显示,PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统的基因产物表达量是PAMAM/DNA的3倍左右,是PAMAM-PEG-Tf/DNA的1.5倍左右。
本发明所制备的基因递释系统通过Balb/c小鼠尾静脉注射方式考察体内靶向性和基因表达效果,冰冻切片的定性结果显示,经乳铁蛋白修饰后基因递释系统在小鼠脑部不同区域的表达量均显示提高,荧光素酶定量结果显示,PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统在小鼠脑部的基因表达量是PAMAM/DNA的3.5倍左右,是PAMAM-PEG-Tf/DNA的1.6倍左右。
本发明所制备的基因递释系统在鱼藤酮诱导的慢性帕金森病模型大鼠尾静脉注射考察其抗帕金森病的药效。结果显示,经乳铁蛋白修饰的基因递释系统5次给药后,帕金森病大鼠的行为学显著改善,纹状体和黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, 简称TH)免疫反应阳性细胞明显增加,单胺类递质的含量约是阴性对照组的3~8倍。
本发明的突出优点及特征在于,采用极具临床应用潜力的脑靶向头基——乳铁蛋白修饰阳离子高分子材料,增加了基因在脑毛细血管内皮细胞的转染效率和表达水平,特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释系统的脑靶向性和基因在脑部的表达,与现有技术采用的靶向头基如转铁蛋白构筑的基因递释系统比较,脑靶向作用和外来基因表达效率均显著提高。同时,使用本发明制备的基因递释系统治疗帕金森病模型大鼠,与未经修饰的对照组比较,能显著改善帕金森模型大鼠的行为障碍,明显增加纹状体和黑质中多巴胺能神经元的数目,同时提高纹状体单胺类递质的水平。
本发明的乳铁蛋白修饰的基因递释系统还可用于转染人体来源和动物来源的内皮细胞、上皮细胞、各种组织实质细胞和/或神经细胞。
附图说明
图1 PAMAM-PEG-Lf核磁共振图谱
其中,A:重水的溶剂峰,
B:PEG的特征峰,
C:PAMAM和Lf中各类质子的重叠峰。
图2 琼脂糖凝胶电泳考察不同基因递释系统的稳定性
其中,1:Hind III消化的DNA Marker,
2:单纯质粒DNA,
3:单纯质粒DNA,DNase I处理过,
4:PAMAM/DNA基因递释系统,
5:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统,
6:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,
7:PAMAM/DNA基因递释系统,DNase I处理过,
8:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统,DNase I处理过,
9:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,DNase I处理过,
10:PAMAM/DNA基因递释系统,DNase I处理后采用SDS处理,
11:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统,DNase I处理后采用SDS处理,
12:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,DNase I处理后采用SDS处理。
图3 荧光显微镜下观察脑毛细血管内皮细胞中pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒的表达情况(200×)
其中,A:PAMAM/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (6:1, w/w),
B:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (6:1, w/w),
C:PAMAM-PEG-Tf/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (6:1, w/w),
D:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (6:1, w/w),
E:PAMAM/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (10:1, w/w),
F:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (10:1, w/w),
G:PAMAM-PEG-Tf/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (10:1, w/w),
H:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统的转染结果,PAMAM:DNA (10:1, w/w)。
图4 用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中基因产物荧光素酶的表达量。
图5 冰冻切片考察不同基因递释系统在脑组织的表达情况
其中,A-E:PAMAM/DNA基因递释系统的表达结果,
F-J:PAMAM-PEG/DNA基因递释系统的表达结果,
K-O:PAMAM-PEG-Tf/DNA基因递释系统的表达结果,
P-T:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统的表达结果,
A,F,K和P:大脑皮层冰冻切片图,
B,G,L和Q:海马冰冻切片图,
C,H,M和R:纹状体冰冻切片图,
D,I,N和S:黑质冰冻切片图,
E,J,O和T:第四脑室冰冻切片图。
图6 行为学评价不同基因递释系统抗帕金森病的效果
其中:A为越格次数结果,B为停留时间结果
第一组(Group 1):植物油组,不给予任何治疗,
第二组到第六组为治疗组,45天全程给予鱼藤酮,
第二组(Group 2):阴性对照组,给予鱼藤酮第35天开始尾静脉注射PAMAM-PEG-Lf/GFP纳米粒,5次给药,隔天注射,
第三组(Group 3):在给予鱼藤酮第43天时,尾静脉注射PAMAM-PEG/hGDNF纳米粒,单次给药,
第四组(Group 4):在给予鱼藤酮第43天时,尾静脉注射PAMAM-PEG-Lf/hGDNF纳米粒,单次给药,
第五组(Group 5):给予鱼藤酮第39天开始尾静脉注射PAMAM-PEG-Lf/hGDNF纳米粒,3次给药,隔天注射,
第六组(Group 6):给予鱼藤酮第35天开始尾静脉注射PAMAM-PEG-Lf/hGDNF纳米粒,5次给药,隔天注射。
图7 纹状体TH免疫组织化学评价不同基因递释系统抗帕金森病效果
按照图6所述分组,其中:A为第一组,B为第二组,C为第三组,D为第四组,E为第五组,F为第六组;
大鼠给予鱼藤酮第45天时处死,进行纹状体TH免疫反应性检测。
图8 黑质TH免疫组织化学评价不同基因递释系统抗帕金森病的效果
按照图6所述分组,其中:A为第一组,B为第二组,C为第三组,D为第四组,E为第五组,F为第六组;
大鼠给予鱼藤酮第45天时处死,进行纹状体TH免疫反应性检测。
图9 高效液相色谱法测定纹状体中相关单胺类神经递质含量评价不同基因递释系统抗帕金森病的效果,
按,图6所述分组,大鼠给予鱼藤酮第45天时处死,HPLC法测定纹状体各单胺类神经递质含量,其中:A为多巴胺(dopamine, DA)测定结果,B为二羟苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)测定结果,C为高香草酸(homovanillic acid, HVA)测定结果。
具体实施方式
实施例1.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1:2溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲液(简称PBS)中,室温搅拌反应15分钟,生成PAMAM-PEG,超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时,乳铁蛋白与巯基化试剂N-琥珀酰-S-乙酰硫代乙酸酯(简称SATA)反应后引入巯基基团,纯化后与PAMAM-PEG按照1:1分子比混合,室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf,分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例2.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1:4溶于pH 8.0的PBS中,室温搅拌反应15分钟,生成PAMAM-PEG,超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时,乳铁蛋白与巯基化试剂SATA反应后引入巯基基团,纯化后与PAMAM-PEG按照2:1分子比混合,室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf,分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例3.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1:8溶于pH 8.0的PBS中,室温搅拌反应15分钟,生成PAMAM-PEG,超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时,乳铁蛋白与巯基化试剂SATA反应后引入巯基基团,纯化后与PAMAM-PEG按照4:1分子比混合,室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf,分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例4.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体1.0 mg,溶于0.5 ml重水中,Mercury Plus 400 MHz超导核磁共振波谱仪鉴定基因递释载体的结构,获得理想的核磁共振图谱,说明成功合成PAMAM-PEG-Lf,见附图1。
实施例5.
将实施例3制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体1.0 mg,溶于0.5 ml重水中,Mercury Plus 400 MHz超导核磁共振波谱仪鉴定基因递释载体的结构,获得理想的核磁共振图谱,说明成功合成PAMAM-PEG-Lf。
实施例6.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成600μg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液,将pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA溶于适量的50 mM 硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统。
实施例7.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成1 mg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液,将pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA溶于适量的50 mM 硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统。
实施例8.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成600μg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液,将pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA溶于适量的50 mM 硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统。
实施例9.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成1 mg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液,将pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA溶于适量的50 mM 硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统。
实施例10.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因递释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成1 mg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液,将hGDNF编码人源性胶质细胞源性神经营养因子质粒DNA溶于适量的50 mM 硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液,室温下两者等体积漩涡30 s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统。
实施例11.
将实施例6制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统与DNase I溶液混合,基因递释系统中含有1μg DNA时用100 U DNase I进行切割,和37oC孵育2小时,加入EDTA溶液终止酶反应(终浓度为0.1 M),10% SDS处理(终浓度为2.5%),100 V电压、0.7%琼脂糖凝胶电泳25分钟考察基因递释系统的稳定性,结果显示该复合物可有效保护DNA免受DNase I的降解,见附图2。
实施例12.
使用实施例6中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统和脑毛细血管内皮细胞于37oC、5%CO2培养箱中孵育1小时,采用pH 7.4的PBS溶液润洗细胞,48小时后采用OLYMPUS IX 71显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大),结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达,见附图3D。
实施例13.
使用实施例7中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统和脑毛细血管内皮细胞于37oC、5%CO2培养箱中孵育1小时,采用pH 7.4的PBS溶液润洗细胞,48小时后采用OLYMPUS IX 71显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大),结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达,见附图3H。
实施例14.
使用实施例8中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统和脑毛细血管内皮细胞于37oC、5%CO2培养箱中孵育1小时,48小时后采用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中荧光素酶的表达量,结果显示,细胞中有荧光素酶表达,见附图4。
实施例15.
使用实施例9中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统和脑毛细血管内皮细胞于37oC、5%CO2培养箱中孵育1小时,48小时后采用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中荧光素酶的表达量,结果显示,细胞中有荧光素酶表达,见附图4。
实施例16.
Balb/c小鼠尾静脉注射实施例6中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,剂量为50μg DNA/只小鼠,2天后取全脑, 4oC、4%的多聚甲醛溶液中固定48小时, 4oC、15%的蔗糖溶液中脱水6小时, 4oC、30%的蔗糖溶液中脱水24小时,包埋、冷冻后进行冰冻切片,厚度为20μm,采用荧光试剂DAPI(300 nM)进行核染色,用OLYMPUS IX 71显微镜观察小鼠大脑皮层、海马、纹状体、黑质和第四脑室中绿色荧光蛋白的表达结果并拍照,结果表明,本发明基因递释系统与现有技术基因递释系统比较,脑靶向效果显著提高。
实施例17.
Balb/c小鼠尾静脉注射实施例7中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,剂量为50μg DNA/只小鼠,2天后取全脑, 4oC、4%的多聚甲醛溶液中固定48小时, 4oC、15%的蔗糖溶液中脱水6小时, 4oC、30%的蔗糖溶液中脱水24小时,包埋、冷冻后进行冰冻切片,厚度为20μm,采用荧光试剂DAPI(300 nM)进行核染色,用OLYMPUS IX 71显微镜观察小鼠大脑皮层、海马、纹状体、黑质和第四脑室中绿色荧光蛋白的表达结果并拍照,结果表明,本发明基因递释系统与现有技术基因递释系统比较,脑靶向效果显著提高,见附图5。
实施例18.
大鼠腹腔注射鱼藤酮,每日一次,连续注射45天,制备帕金森病模型大鼠。分别在给予鱼藤酮第35天、39天和43天开始尾静脉注射实施例10中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,隔天注射,分别为5次、3次和单次给药。在给予鱼藤酮第15天、25天、35天和45天时,大鼠进行行为学评价。具体步骤为:大鼠置于80 cm×48 cm×50 cm的开放场(底部分成16 cm×16 cm的方格15格)中,观察时间为5 min,记录以下五个参数:越格次数(3肢进入小方格),后肢直立(前肢脱离地面1 cm以上),修饰次数(整理头部毛发),粪便粒数和停留时间(四肢静止不动),评价大鼠的运动能力。整个行为学测试实验为双盲进行。结果显示,在五个参数中只有越格次数和停留时间这两个参数上显著性差异,经5次给药后大鼠越格次数最多,停留时间最短,治疗帕金森病效果最好,见附图6。
实施例19.
大鼠腹腔注射鱼藤酮,每日一次,连续注射45天,制备帕金森病模型大鼠。分别在给予鱼藤酮第35天、39天和43天开始尾静脉注射实施例10中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,隔天注射,分别为5次、3次和单次给药。在给予鱼藤酮第45天时,进行TH免疫反应性检测。具体步骤为:分别随机取每组大鼠各2只,10%水合氯醛麻醉后,心脏灌注固定。先用生理盐水300 ml进行预灌注,将其体内血液冲出,再用4%多聚甲醛固定液400 ml进行灌注固定,完整剥取脑组织,继续4 oC过夜固定。后浸入30%蔗糖溶液4 oC脱水至下沉,作连续冰冻冠状切片,片厚为30μm,进行TH染色。具体方法为:挑选纹状体位置的切片 → PBS洗涤,5 min×3次 → 0.25% Triton-X100中孵育30 min,增加组织渗透性 → 0.3% H2O2中孵育15 min,灭活过氧化物酶 → PBS洗涤,5 min×3次 → 正常山羊血清中封闭2 h → 与一抗(200倍稀释)4 oC过夜孵育 → PBS洗涤,10 min×3次 → 与生物素化的二抗工作液37 oC孵育1 h → PBS洗涤,10 min×3次 → 与辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液室温孵育1 h → PBS洗涤,10 min×3次 → DAB染色,变色后置蒸馏水中终止染色反应 → 展片 → 风干 → 梯度乙醇脱水(70%,3 min;80%,3 min;90%,3 min;100%,3 min;100%,3 min;70%,3 min) → 二甲苯透化,10 min×2次 → 中性树脂封片 → 显微镜观察并拍照。结果显示,随着给药次数增加,TH免疫反应性改善明显,5次给药组大鼠纹状体中TH阳性细胞和植物油组大鼠已无肉眼可见区别,见附图7。
实施例20.
大鼠腹腔注射鱼藤酮,每日一次,连续注射45天,制备帕金森病模型大鼠。分别在给予鱼藤酮第35天、39天和43天开始尾静脉注射实施例10中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,隔天注射,分别为5次、3次和单次给药。在给予鱼藤酮第45天时,进行TH免疫反应性检测。具体步骤为:分别随机取每组大鼠各2只,10%水合氯醛麻醉后,心脏灌注固定。先用生理盐水300 ml进行预灌注,将其体内血液冲出,再用4%多聚甲醛固定液400 ml进行灌注固定,完整剥取脑组织,继续4 oC过夜固定。后浸入30%蔗糖溶液4 oC脱水至下沉,作连续冰冻冠状切片,片厚为30μm,进行TH染色。具体方法为:挑选黑质位置的切片 → PBS洗涤,5 min×3次 → 0.25% Triton-X100中孵育30 min,增加组织渗透性 → 0.3% H2O2中孵育15 min,灭活过氧化物酶 → PBS洗涤,5 min×3次 → 正常山羊血清中封闭2 h → 与一抗(200倍稀释)4 oC过夜孵育 → PBS洗涤,10 min×3次 → 与生物素化的二抗工作液37 oC孵育1 h → PBS洗涤,10 min×3次 → 与辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液室温孵育1 h → PBS洗涤,10 min×3次 → DAB染色,变色后置蒸馏水中终止染色反应 → 展片 → 风干 → 梯度乙醇脱水(70%,3 min;80%,3 min;90%,3 min;100%,3 min;100%,3 min;70%,3 min) → 二甲苯透化,10 min×2次 → 中性树脂封片 → 显微镜观察并拍照。结果显示,随着给药次数增加,TH免疫反应性改善明显,5次给药组大鼠黑质中TH阳性细胞和植物油组大鼠已无肉眼可见区别,见附图8。
实施例21.
大鼠腹腔注射鱼藤酮,每日一次,连续注射45天,制备帕金森病模型大鼠。分别在给予鱼藤酮第35天、39天和43天开始尾静脉注射实施例10中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因递释系统,隔天注射,分别为5次、3次和单次给药。在给予鱼藤酮第45天时,HPLC法检测纹状体中单胺类递质包括DA、DOPAC和HVA的含量。样品处理步骤为:每组大鼠各6只,即刻处死,解剖取出纹状体,称重并记录,先于液氮中速冻5 min后置-80 oC保存备用。HPLC检测当天,样品按照100 mg加入1000μl样品处理液(0.2 M 高氯酸,0.2 mM 焦亚硫酸钠、0.01% EDTA-2Na),同时含有0.5μM DHBA作为内标,超声粉碎(强度20%,时间30秒),14,000 rpm离心10 min,上清液经0.22μm水相滤膜过滤后用于HPLC检测,以上过程均在4 oC下操作。色谱条件为:色谱柱:Dikma PlatisilTM ODS(5μm, 250 mm×4.6 mm);流动相:16%甲醇水溶液,含40 mM乙酸钠,15 mM柠檬酸,0.25 mM辛烷磺酸钠,0.2 mM EDTA-2Na,未加甲醇前调节PH至4.3;检测器:电化学检测器(ECD);流速:1 ml/min;电压:500 mV;量程:1μA;柱温:25 oC;进样体积:10μl。结果显示,随着给药次数增加,各神经递质含量有所增加,5次给药组中DA、DOPAC和HVA含量分别增加至植物油组的86.5%、93.4%和91.0%,见附图9。
本发明上述实验中采用的pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA购自Clontech公司,pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA购自Promega公司,hGDNF编码人源性胶质细胞源性神经营养因子质粒DNA由芬兰大学惠赠,第五代PAMAM和乳铁蛋白购自Dendritech公司,双功能PEG购自北京健凯公司。
Claims (10)
1.一种蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,由乳铁蛋白修饰的基因递释载体和质粒DNA构成,所述的乳铁蛋白修饰的基因递释载体由阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白组成;所述的乳铁蛋白修饰的基因递释载体中,亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是1~15:1,乳铁蛋白与阳离子高分子材料的分子比为1~6:1,所述的基因为治疗基因。
2.按权利要求1所述的蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的乳铁蛋白修饰的基因递释载体与质粒DNA形成80~300 纳米大小的复合物,其中的阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比是1~15:1。
3.按权利要求1所述的蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺或聚氨基酰胺。
4.按权利要求1所述的蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的亲水性聚合物选自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。
5.按权利要求1所述的蛋白介导的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的质粒DNA是任何可在真核细胞表达的质粒DNA,所述的治疗基因为编码人源性胶质细胞源性神经营养因子的治疗基因。
6.权利要求1的蛋白介导的脑靶向基因递释系统的制备方法,其特征在于,采用乳铁蛋白作为靶向头基,阳离子高分子材料为基础载体,通过亲水性聚合物连接乳铁蛋白构筑基因递释载体;所获得的基因递释载体与质粒DNA构筑形成80~300 纳米大小的基因递释系统。
7.按权利要求6的方法,其特征在于,所述的基因递释载体,其中阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白以共价方式连接。
8.按权利要求6的方法,其特征在于,所述的基因递释载体通过下述步骤制备:
阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1:1~15的分子比溶于pH值7.8~8.2磷酸盐缓冲液,室温搅拌反应10~60分钟,其中含有的基团发生特异性反应,生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物,超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8~7.2磷酸盐缓冲液;同时,乳铁蛋白与巯基化试剂反应后引入巯基,以1~6:1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12~36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白,分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白。
9.权利要求1的蛋白介导的脑靶向基因递释系统在制备治疗帕金森病药物中的用途。
10.按权利要求的用途,其特征在于,所述的蛋白介导的脑靶向基因递释系统改善帕金森模型大鼠的行为障碍,增加纹状体和黑质中多巴胺能神经元的数目,提高纹状体单胺类递质的水平。
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