CN1931372A - 一种脑靶向基因传释系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一种脑靶向基因传释系统及其制备方法，本发明通过亲水性聚合物将乳铁蛋白修饰于阳离子高分子材料上，与质粒DNA通过静电作用复合形成基因传释系统。本发明可有效提高脑毛细血管内皮细胞上基因的转染效率和表达效率，特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因传释系统的脑靶向性和基因在脑部的表达，与现有技术采用的靶向头基构筑的基因传释系统比较，脑靶向效果显著提高。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种脑靶向基因传释系统及其制备方法。
背景技术
许多脑部顽疾如帕金森病、老年痴呆病等发病率很高，长时间困扰着人类，严重影响人们的生活质量。基因治疗是极具潜力的治疗手段，DNA药物已经成为近年来引人注目的大分子药物之一。但是由于血脑屏障的存在，治疗基因无法自主进入脑内病灶治疗中枢神经系统疾病。目前临床上普遍采用的脑内插管、脑室注射等神经外科学方法，伤害性大，易造成颅内感染，不利于长期用药，因此需要建立一个经血管内给药、有效跨越血脑屏障、运送目的基因产物到达脑内作用部位的方法。脑基因靶向技术可以通过静脉注射的方式将外源基因递送到中枢神经系统进而广泛表达，是中枢神经系统疾病治疗的一种无创伤性方法，有很好的应用前景。
阳离子高分子材料聚酰胺—胺树状分枝物(polyamidoamine，简称PAMAM)是近年来出现的一类新型纳米级的合成高分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，强正电性，并易于经过适当的修饰连接抗体等生物活性物质以增加载体的靶向性，同时内部具有大量的空腔，已有报道表明特定代数的PAMAM可以有效包载基因进入细胞。但是，单独采用PAMAM具有一定的不足，如较强的溶血性等，因此经过一定的修饰后在基因转运方面有很大的应用潜力。
目前已知的存在于血脑屏障上的特异性受体有转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、表皮生长因子受体等，被证实在体内有转运作用的是转铁蛋白受体和胰岛素受体。转铁蛋白受体因其在毛细血管上的表达仅限于脑毛细血管内皮而备受关注。但是，近期的研究表明，转铁蛋白与其受体的解离常数(Kd)为1μM，而生理状态下循环系统中游离的转铁蛋白浓度很高，约为25μM，此浓度对于转铁蛋白受体而言几乎是饱和的，使得转铁蛋白作为药物转运载体靶向头基的应用受到限制。因此，寻找新的脑靶向头基是克服血脑屏障、提高脑部药物转运的一个有效途径。
乳铁蛋白(lactoferrin，简称Lf)属于转铁蛋白家族，是一种铁离子转运糖蛋白，主要在腺上皮细胞表达和分泌。它是一种多功能蛋白，目前主要用于调节内环境离子稳定、抗微生物感染、调节细胞生长、抑制血小板聚集、增强免疫等。最近，有研究表明，乳铁蛋白的多项生理功能都是通过乳铁蛋白受体介导乳铁蛋白进入细胞来实现的。有学者在不同种属小肠中发现乳铁蛋白受体，并从婴儿体内分离纯化出人小肠乳铁蛋白受体。另有学者用125I标记乳铁蛋白后测定其与脑部脉络丛内皮膜上的乳铁蛋白受体结合的Kd值为0.11μM，说明在脑部有乳铁蛋白受体的表达。虽然乳铁蛋白广泛分布于体液中，但血浆中的浓度仅为5nM左右，此浓度不会使乳铁蛋白受体饱和，提示，可进一步研究乳铁蛋白作为靶向头基的可行性。
发明内容
本发明的目的是针对现有脑靶向基因传释系统存在的不足，提供一种新的脑靶向基因传释系统。
本发明采用乳铁蛋白作为靶向头基，阳离子高分子材料为基础载体，通过亲水性聚合物连接乳铁蛋白构筑基因传释载体；所获得的基因传释载体与质粒DNA构筑形成纳米级基因传释系统即本发明脑靶向基因传释系统。
本发明构筑的阳离子高分子材料—亲水性聚合物—乳铁蛋白/DNA基因传释系统，能明显提高治疗基因在脑部的转染效率和表达水平。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
通过对脑内的乳铁蛋白特异性受体进行表征，结果表明：乳铁蛋白在脑毛细血管内皮细胞和脑组织上均具有高结合位点和低结合位点两类结合位点，在脑毛细血管内皮细胞上高低结合位点的Kd值分别为6.77nM和4.82μM，在脑组织上高低结合位点的Kd值分别为10.61nM和2.23μM，均高于血浆中的乳铁蛋白浓度(约5nM)，表明乳铁蛋白为一种有效的脑靶向头基；
以阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白为组分，三者以共价方式连接制备乳铁蛋白修饰的高分子基因传释载体。其中，亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是1～20∶1，乳铁蛋白与阳离子高分子材料的分子比为1～10∶1；
上述基因传释载体按下述方法制备：阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1∶1～20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应10～60分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液。同时，乳铁蛋白与巯基化试剂反应后引入巯基，以1～10∶1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白，分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白。
上述基因传释载体与质粒DNA形成纳米级基因传释系统，其中的阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比是1～20∶1。
本发明按下述方法制备基因传释系统：将制备的阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白基因传释载体溶于pH值7.3～7.5磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液，将质粒DNA溶于50mM硫酸钠溶液中配制成所需浓度的溶液，室温下两者等体积漩涡30s混匀制成基因传释系统。
本发明所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或阳离子脂质。
所述亲水性聚合物选自聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)、聚氧乙烯或聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。
所述质粒DNA选自任何可在真核细胞表达的质粒DNA。
本发明采用核磁共振技术对所制备的基因传释载体及其制备过程的中间产物进行结构鉴定，结果显示，PAMAM与含有双功能基团的PEG(琥珀酰亚胺-PEG3400-马来酰亚胺)反应后在3.5ppm处出现PEG的特征吸收峰，并在6.7ppm处出现马来酰亚胺的特征吸收峰，说明PEG已经修饰到PAMAM上，再和乳铁蛋白反应后该马来酰亚胺的特征吸收峰消失，说明PAMAM-PEG-Lf合成成功。
本发明采用0.7％琼脂糖凝胶电泳技术考察所制备的基因传释系统的稳定性，结果显示，经DNase酶处理后，基因传释系统中的DNA未被降解，酶降解反应中止后采用强阴性的十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate，简称SDS)处理，置换出的DNA和对照DNA条带位置一致，说明基因传释系统中的DNA未被DNase酶降解。
本发明所制备的基因传释系统转染脑毛细血管内皮细胞，定性和定量结果均显示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统获得最高的表达效率，其中荧光素酶定量结果显示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统的基因产物表达量是PAMAM/DNA的3倍左右，是PAMAM-PEG-Tf/DNA的1.5倍左右。
本发明所制备的基因传释系统通过Balb/c小鼠尾静脉注射方式考察体内靶向性和基因表达效果，冰冻切片的定性结果显示，经乳铁蛋白修饰后基因传释系统在小鼠脑部不同区域的表达量均显示提高，荧光素酶定量结果显示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统在小鼠脑部的基因表达量是PAMAM/DNA的3.5倍左右，是PAMAM-PEG-Tf/DNA的1.6倍左右。
本发明的突出优点及特征在于，采用极具临床应用潜力的脑靶向头基—乳铁蛋白修饰阳离子高分子材料，增加了基因在脑毛细血管内皮细胞的转染效率和表达水平，特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因传释系统的脑靶向性和基因在脑部的表达，与现有技术采用的靶向头基如转铁蛋白构筑的基因传释系统比较，脑靶向作用和外来基因表达效率均显著提高。另外，本发明选用近年来出现的新型阳离子高分子材料PAMAM为基础载体，利用该树型高分子材料自身的一些优势如单分散性、无免疫原性、模拟体内分子特性等，使该基因传释系统的转染效率较高且相对安全。
本发明的乳铁蛋白修饰的基因传释系统还可用于转染人体来源和动物来源的内皮细胞、上皮细胞、各种组织实质细胞和/或神经细胞。
附图说明
图1PAMAM-PEG-Lf核磁共振图谱
其中，A：重水的溶剂峰，
B：PEG的特征峰，
C：PAMAM和Lf中各类质子的重叠峰。
图2琼脂糖凝胶电泳考察不同基因传释系统的稳定性
其中，1：Hind III消化的DNA Marker，
2：单纯质粒DNA，
3：单纯质粒DNA，DNase I处理过，
4：PAMAM/DNA基因传释系统，
5：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统，
6：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统，
7：PAMAM/DNA基因传释系统，DNase I处理过，
8：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统，DNase I处理过，
9：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统，DNase I处理过，
10：PAMAM/DNA基因传释系统，DNase I处理后采用SDS处理，
11：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统，DNase I处理后采用SDS处理，
12：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统，DNase I处理后采用SDS处理。
图3荧光显微镜下观察脑毛细血管内皮细胞中pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒的表达情况(200×)
其中，A：PAMAM/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(6∶1，w/w)，
B：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(6∶1，w/w)，
C：PAMAM-PEG-Tf/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(6∶1，w/w)，
D：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(6∶1，w/w)，
E：PAMAM/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(10∶1，w/w)，
F：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(10∶1，w/w)，
G：PAMAM-PEG-Tf/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(10∶1，w/w)，
H：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统的转染结果，PAMAM∶DNA(10∶1，w/w)。
图4用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中基因产物荧光素酶的表达量。
图5冰冻切片考察不同基因传释系统在脑组织的表达情况
其中，A-E：PAMAM/DNA基因传释系统的表达结果，
F-J：PAMAM-PEG/DNA基因传释系统的表达结果，
K-O：PAMAM-PEG-Tf/DNA基因传释系统的表达结果，
P-T：PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统的表达结果，
A，F，K和P：大脑皮层冰冻切片图，
B，G，L和Q：海马冰冻切片图，
C，H，M和R：纹状体冰冻切片图，
D，I，N和S：黑质冰冻切片图，
E，J，O和T：第四脑室冰冻切片图。
具体实施方式
实施例1.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1∶2溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲液(简称PBS)中，室温搅拌反应15分钟，生成PAMAM-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，乳铁蛋白与巯基化试剂N-琥珀酰-S-乙酰硫代乙酸酯(简称SATA)反应后引入巯基基团，纯化后与PAMAM-PEG按照1∶1分子比混合，室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf，分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例2.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1∶4溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应15分钟，生成PAMAM-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，乳铁蛋白与巯基化试剂SATA反应后引入巯基基团，纯化后与PAMAM-PEG按照2∶1分子比混合，室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf，分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例3.
PAMAM和含有双功能基团的PEG按照分子比1∶8溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应15分钟，生成PAMAM-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，乳铁蛋白与巯基化试剂SATA反应后引入巯基基团，纯化后与PAMAM-PEG按照4∶1分子比混合，室温搅拌反应12小时后生成PAMAM-PEG-Lf，分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。
实施例4.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体1.0mg，溶于0.5ml重水中，Mercury Plus 400MHz超导核磁共振波谱仪鉴定基因传释载体的结构，获得理想的核磁共振图谱，说明成功合成PAMAM-PEG-Lf，见附图1。
实施例5.
将实施例3制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体1.0mg，溶于0.5ml重水中，Mercury Plus 400MHz超导核磁共振波谱仪鉴定基因传释载体的结构，获得理想的核磁共振图谱，说明成功合成PAMAM-PEG-Lf。
实施例6.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成600μg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液，将pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA溶于适量的50mM硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统。
实施例7.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成1mg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液，将pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA溶于适量的50mM硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统。
实施例8.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成600μg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液，将pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA溶于适量的50mM硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统。
实施例9.
将实施例1制备的PAMAM-PEG-Lf基因传释载体溶于适量pH 7.4的PBS中配成1mg/ml(以PAMAM的质量计算)的溶液，将pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA溶于适量的50mM硫酸钠溶液中配制成100μg/ml的溶液，室温下两者等体积漩涡30s混匀制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统。
实施例10.
将实施例6制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统与DNase I溶液混合，基因载体系统中含有1μg DNA时用100U DNase I进行切割，和37℃孵育2小时，加入EDTA溶液终止酶反应(终浓度为0.1M)，10％SDS处理(终浓度为2.5％)，100V电压、0.7％琼脂糖凝胶电泳25分钟考察基因传释系统的稳定性，结果显示该系统可有效保护DNA免受DNase I的降解，见附图2。
实施例11.
使用实施例6中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统和脑毛细血管内皮细胞于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时，采用pH 7.4的PBS溶液润洗细胞，48小时后采用OLYMPUS IX 71显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大)，结果显示，细胞中有绿色荧光蛋白表达，见附图3D。
实施例12.
使用实施例7中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统和脑毛细血管内皮细胞于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时，采用pH 7.4的PBS溶液润洗细胞，48小时后采用OLYMPUS IX 71显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大)，结果显示，细胞中有绿色荧光蛋白表达，见附图3H。
实施例13.
使用实施例8中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统和脑毛细血管内皮细胞于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时，48小时后采用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中荧光素酶的表达量，结果显示，细胞中有荧光素酶表达，见附图4。
实施例14.
使用实施例9中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统和脑毛细血管内皮细胞于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时，48小时后采用荧光素酶分析系统分析脑毛细血管内皮细胞中荧光素酶的表达量，结果显示，细胞中有荧光素酶表达，见附图4。
实施例15.
Balb/c小鼠尾静脉注射实施例6中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统，剂量为50μg DNA/只小鼠，2天后取全脑，4℃、4％的多聚甲醛溶液中固定48小时，4℃、15％的蔗糖溶液中脱水6小时，4℃、30％的蔗糖溶液中脱水24小时，包埋、冷冻后进行冰冻切片，厚度为20μm，采用荧光试剂DAPI(300nM)进行核染色，用OLYMPUS IX 71显微镜观察小鼠大脑皮层、海马、纹状体、黑质和第四脑室中绿色荧光蛋白的表达结果并拍照，结果表明，本发明基因传释系统与现有技术基因传释系统比较，脑靶向效果显著提高。
实施例16.
Balb/c小鼠尾静脉注射实施例7中制备的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因传释系统，剂量为50μg DNA/只小鼠，2天后取全脑，4℃、4％的多聚甲醛溶液中固定48小时，4℃、15％的蔗糖溶液中脱水6小时，4℃、30％的蔗糖溶液中脱水24小时，包埋、冷冻后进行冰冻切片，厚度为20μm，采用荧光试剂DAPI(300nM)进行核染色，用OLYMPUS IX 71显微镜观察小鼠大脑皮层、海马、纹状体、黑质和第四脑室中绿色荧光蛋白的表达结果并拍照，结果表明，本发明基因传释系统与现有技术基因传释系统比较，脑靶向效果显著提高，见附图5。
本发明上述实验中采用的pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒DNA购自Clontech公司，pGL2-Control Vector荧光素酶质粒DNA购自Promega公司，第五代PAMAM和乳铁蛋白购自Sigma公司，双功能PEG购自Nektar公司。
Claims (9)
1.一种脑靶向基因传释系统，其特征在于由乳铁蛋白修饰的基因传释载体和质粒DNA构成，所述的乳铁蛋白修饰的基因传释载体由阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白组成。
2、按权利要求1所述的脑靶向基因传释系统，其特征在于所述的乳铁蛋白修饰的基因传释载体，其中亲水性聚合物与阳离子高分子材料的分子比是1～20∶1，乳铁蛋白与阳离子高分子材料的分子比为1～10∶1。
3、按权利要求1所述的脑靶向基因传释系统，其特征在于所述的乳铁蛋白修饰的基因传释载体与质粒DNA形成纳米级的复合物系统，其中的阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比是1～20∶1。
4、按权利要求1所述的脑靶向基因传释系统，其特征在于所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺或聚氨基酰胺。
5、按权利要求1所述的脑靶向基因传释系统，其特征在于所述的亲水性聚合物选自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙稀酰胺。
6、按权利要求1所述的脑靶向基因传释系统，其特征在于所述的质粒DNA是任何可在真核细胞表达的质粒DNA。
7、权利要求1所述的脑靶向基因传释系统的制备方法，其特征是采用乳铁蛋白作为靶向头基，阳离子高分子材料为基础载体，通过亲水性聚合物连接乳铁蛋白构筑基因传释载体；所获得的基因传释载体与质粒DNA构筑形成纳米级基因传释系统。
8、按权利要求7所述的脑靶向基因传释系统的制备方法，其特征在于所述的基因传释载体，其中阳离子高分子材料、亲水性聚合物和乳铁蛋白以共价方式连接。
9、按权利要求7所述的脑靶向基因传释系统的制备方法，其特征在于所述的基因传释载体通过下述步骤制备：
阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1∶1～20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液，室温搅拌反应10～60分钟，其中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液；同时，乳铁蛋白与巯基化试剂反应后引入巯基，以1～10∶1的分子比与阳离子高分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子高分子材料-亲水性聚合物-乳铁蛋白，分子排阻色谱法除去未反应的乳铁蛋白。
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