CN107569451B - 一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的合成及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的合成及其应用。本发明以纳米氧化镁为载体，吸附能够沉默表达α‑syn的基因SNCA的pDNA，并用天然蛋白胶束进行包裹，最后在胶束的表面修饰上靶向分子mRNA和神经生长因子NGF，构建得到能够治疗帕金森症的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。该纳米氧化镁胶束复合物能够靶向作用SNCA并显著抑制PC12神经细胞的凋亡，对PC12神经细胞的帕金森症模型具有很好的治疗效果；且其粒度适中，近球形和结晶结构，电位稳定，热稳定性好，具有穿透血脑屏障的潜能；对细胞的毒副作用小，具有良好的生物相容性；因而在治疗帕金森症药物的研究和开发方面具有很好的应用前景。

Description

一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的合成及 其应用

技术领域

本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的合成及其应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是一种神经系统退行性障碍疾病，主要以中脑黑质纹状体的多巴胺能神经元退化和神经递质多巴胺的减少为主要特征。当多巴胺合成减少时，抑制乙酰胆碱的功能降低，两者失衡结果出现“震颤麻痹”。据统计，对于PD，年龄在45岁以下的发病率较低，75～85岁的发病率为3.1％，85岁以上的发病率达到了4.3％。针对PD主要有三种治疗的方法：1)手术治疗：通过移植多巴胺能神经元细胞，来降低用药量，但是并不能从根本上解决问题。2)药物治疗：左旋多巴胺、儿茶酚转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、酶抑制剂。然而，疾病的恶化是不可避免的，病人很快就会出现运动性障碍，如步伐紊乱、痴呆等。3)基因治疗:RNA干扰特定蛋白的表达，目前研究比较多。因为RNAi通过干扰基因转录为相应的蛋白而沉默特定基因，所以理论上来讲，任何基因都可以通过RNAi靶向沉默，这样就可以为治疗疾病提供一个巨大的前景。

帕金森病如众多脑部以及神经系统的重大疾病(如脑肿瘤、中枢神经系统感染和神经退行性疾病等)一样，发病率和死亡率逐年呈上升趋势，但由于血脑屏障(Blood-BrainBarrier, BBB)的存在，98％以上的小分子药物和100％的大分子药物难以入脑，使得脑部疾病的治疗成为急需人类攻克的重大难题。并且药物在病灶部位的蓄积能力差，药物随血液循环全身分布，不仅造成病灶部位难以达到治疗浓度发挥药效，而且因药物在其他器官的蓄积而造成严重的毒副作用；并且会产生一定的耐药性，无论是造成感染的病原体还是引发肿瘤的肿瘤细胞，在进行连续多次给药后，易产生耐药性而使治疗无效。于是如何提高给药效率，直接靶向的将药物输送到目的病灶是今后研究的重点。因此现在各种靶向分子mRNA正在被越来越多的研究者所关注，它可以靶向定位到病灶，将药物直接定向输送到靶向部位，减少治疗药物在输运过程中的损失。

α-synuclein是一个有140个氨基酸的蛋白质，在帕金森病的病理生理学中处于一个重要的地位，它的过表达对帕金森病的体内和体外模型都会产生毒性。最近的研究已经显示，严重的PD病人在中脑黑质纹状体处，α-突触核蛋白的mRNA含量增加。与此同时，早期和晚期的帕金森患者也是通过α-突触核蛋白的过表达程度进行区分的。另外，α-突触核蛋白的过表达在体外实验和体内实验中证明都是有毒的。这些现象说明，α-突触核蛋白的结构突变和表达水平上调导致了多巴胺能神经元细胞的死亡和退化。针对PD患者，通过靶向降低α- 突触核蛋白表达的治疗策略，会影响多巴胺能神经元细胞死亡的过程。

有研究表明，通过在载体上修饰靶向分子之后，能够将药物直接递送到病灶部位，并提高药物治疗效果。这一策略被更多的应用于肿瘤的靶向治疗，将靶向分子定位于基因水平的帕金森症的治疗则鲜有报道。帕金森症是由于编码α-突触核蛋白的基因SNCA的突变引起的，导致α-突触核蛋白单体在细胞质内的积累量增加，从而形成对细胞有毒的α-突触核蛋白低聚体，造成多巴胺能神经元的死亡，和线粒体功能的破坏。而根据张韬等人的研究，编码α-突触核蛋白的基因SNCA对α-突触核蛋白的聚集起决定性作用的是NAC区(aa 61-95)的aa 71～82(VTGVTAVAQKTV)，其包括12个氨基酸残基，缺失这一区段的α-突触核蛋白的聚集趋势明显下降。利用这一基因靶点，构建特异性识别的靶向分子mRNA，从而可实现对突变基因的定点控制，达到对帕金森症的特异性治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有PD治疗技术和药物的缺陷和不足，利用纳米氧化镁作为载体，吸附能够沉默表达α-syn的基因SNCA的pDNA，并用天然蛋白胶束进行包裹，防止粒子在输运途中pDNA的损失，最后在胶束的表面修饰上靶向分子mRNA和神经生长因子NGF，构建了能够治疗帕金森症的纳米氧化镁胶束复合粒子。

本发明的目的是提供一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的及其制备方法。

本发明另一目的是提供所述纳米氧化镁金属胶束复合物在帕金森症的治疗和药物研发方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的制备方法，是以纳米氧化镁为载体，吸附能够沉默表达α-syn的基因SNCA的pDNA，并用天然蛋白胶束进行包裹，防止粒子在输运途中pDNA的损失，最后在胶束的表面修饰上靶向分子mRNA和神经生长因子NGF，构建得到能够治疗帕金森症的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。

经过验证，本发明纳米氧化镁胶束复合物的合成是成功的，并且其总合成粒径在120nm左右，粒度适中，近球形和结晶结构，电位稳定，热稳定性好，具有穿透血脑屏障的潜能。而且，该纳米氧化镁胶束复合物对细胞的毒副作用小，具有良好的生物相容性。更重要的是，该纳米氧化镁胶束复合物能够靶向作用SNCA并显著抑制PC12神经细胞的凋亡，对PC12神经细胞的帕金森症模型具有很好的治疗效果，而M^g2+的存在可能对于MPP⁺引起的线粒体的扰动也有一定的平衡作用，保护多巴胺神经元。因而纳米氧化镁胶束复合物可作为治疗帕金森症药物进一步研究和开发。

具体地，上述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的制备方法，是首先利用表面活性剂月桂酸钠的表面改性功能，对纳米氧化镁的表面进行正电改性，得到改性后表面带正电荷的纳米氧化镁；在此基础上，利用静电吸附，在带正电的纳米氧化镁的表面接枝上干扰α-突触核蛋白的pDNA；再在此基础上，利用胰岛素与多糖的亲疏水性差异进行自组装，得到天然蛋白的纳米胶束，并将前述吸附pDNA后的纳米氧化镁复合物包裹在胶束中间，避免纳米药物在运输过程中pDNA的脱落损失；然后在胶束的表面利用酯化取代反应，修饰上α-突触核蛋白的表达基因SNCA的靶向分子mRNA，并利用紫外光接枝技术将神经细胞的靶向受体神经生长因子NGF与mRNA结合从而接枝在胶束表面，合成得到所述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。

更具体优选地，上述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的制备方法，包括如下步骤：

S1.纳米氧化镁的表面改性

将纳米氧化镁粉体加入去离子水中，分散打浆，使氧化镁颗粒分散均匀，并调节pH至 5.5～6.5；然后加入改性剂月桂酸钠/十二烷基苯磺酸钠，搅拌反应充分；然后过滤、洗涤、干燥，得到改性后的纳米氧化镁；

S2.改性后的纳米氧化镁对质粒DNA的吸附

将带负电荷的shRNA通过静电作用与改性后的纳米氧化镁结合在一起，孵育得到MgO- pDNA复合粒子；

S3.蛋白胶束的合成

选用血影蛋白、胰岛素蛋白或藻蓝蛋白，利用蛋白质上的氨基与普鲁兰多糖上的半缩醛羟基发生取代反应，形成蛋白质与普鲁兰多糖的天然胶束；然后将MgO-pDNA复合粒子加入到胶束中，通过胶束两端亲、疏水性的不同，自组装将MgO-pDNA复合粒子包裹在胶束中； S4.靶向分子mRNA在蛋白胶束上的接枝

利用蛋白胶束的多羧基结构与靶向分子mRNA上的氨基的缩合反应，将基因SNCA的特异性靶点接枝在蛋白胶束上；所述靶向分子mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

S5.神经生长因子NGF的接枝

将NGF溶解在PBS/DMF混合液中，避光下加入叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，冰浴搅拌反应，产物纯化后用PBS溶解，得到NGF-AAH的混合物；然后将步骤S4的产物与NGF- AAH的混合物在紫外灯下反应，得到的产物纯化即为所述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。

其中，优选地，步骤S1所述纳米氧化镁粉体和去离子水的质量体积比为0.5～1g：15～25ml。

优选地，步骤S1所述调节pH是使用HCl和NaOH进行调节。

优选地，步骤S1所述改性剂月桂酸钠/十二烷基苯磺酸钠的质量分数为15％～20％。

优选地，步骤S1所述搅拌反应是38～45℃条件下900～1200r/min彻底搅拌，使之充分反应。

更优选地，步骤S1所述搅拌反应是40℃条件下1000r/min彻底搅拌1～2h，使之充分反应。

步骤S1所述洗涤是用去离子水洗涤。

步骤S2所述孵育是4℃孵育30～60min。

优选地，步骤S3所述MgO-pDNA复合粒子和胶束的质量比为1：2～3。

优选地，步骤S5所述NGF和PBS/DMF混合液的质量体积比为6～10μg：5ml。

更优选地，步骤S5所述NGF和PBS/DMF混合液的质量体积比为9μg：5ml。

优选地，步骤S5所述PBS/DMF混合液中PBS和DMF的体积比为1：3～5。

更优选地，步骤S5所述PBS/DMF混合液中PBS和DMF的体积比为1：4。

优选地，步骤S5所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5～6。

更优选地，步骤S5所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5.81。

优选地，步骤S5所述冰浴搅拌反应的时间为40～55h(最优选为48h)。

优选地，步骤S5所述紫外灯下反应的时间为5～15s(最优选为10s)。

优选地，步骤S5所述步骤S4的产物与NGF-AAH的混合物的质量比为100～500： 1。

另外，由上述方法制备得到的纳米氧化镁金属胶束复合物，以及其在制备帕金森症的治疗药物方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

本发明首先对纳米氧化镁进行表面改性，得到改性后表面带正电荷的纳米氧化镁。在此基础上，利用静电吸附，接枝上干扰α-突触核蛋白的质粒DNA(pDNA)。与此同时，利用胰岛素与多糖的亲疏水性差异，进行自组装，得到天然蛋白的纳米胶束，并将前述吸附pDNA后的纳米氧化镁复合物包裹在胶束中间，避免纳米药物在运输过程中pDNA的脱落。天然蛋白纳米胶束包裹纳米氧化镁结束后，在胶束的表面利用酯化取代反应，修饰上α-突触核蛋白的表达基因SNCA的靶向分子mRNA，并利用紫外光接枝技术将神经细胞的靶向受体神经生长因子NGF与mRNA结合，完成基因靶向的纳米氧化镁金属胶束复合物的合成。最后将该合成的纳米氧化镁胶束复合物作用于PC12神经细胞帕金森模型，发现该复合物能够靶向作用SNCA并显著抑制PC12神经细胞的凋亡。本发明研究目的是利用纳米氧化镁的可降解性，将纳米氧化镁金属作为基因载体，通过修饰质粒DNA并运用天然蛋白胶束的保护，以及靶向分子mRNA等合成纳米氧化镁金属的胶束复合物，并将其运送到细胞中，通过基因干扰作用靶向治疗帕金森症。本发明的纳米氧化镁金属胶束复合物，利用纳米纳米氧化镁作为载体，携带质粒DNA以及靶向分子mRNA和神经生长因子NGF对帕金森症的体内外模型进行有效的治疗，取得了很好的治疗效果。

本发明具有以下有益效果：

本发明成功合成一种纳米氧化镁金属胶束复合物对帕金森模型的PC12神经细胞的凋亡具有明显的抑制作用，对PC12神经细胞的帕金森症模型具有很好的治疗效果。该复合物粒径在 120nm左右，粒度适中，近球形和结晶结构，电位稳定，热稳定性好，具有穿透血脑屏障的潜能。而且，纳米氧化镁胶束复合物对细胞的毒副作用小，具有良好的生物相容性。

本发明的纳米氧化镁金属胶束复合物，在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，维持Mg²⁺平衡，恢复线粒体功能，并利用细胞靶向受体到达神经细胞，并运用靶向分子mRNA，使材料与基因SNCA特异性结合，并将干扰α-突触核蛋白的pDNA转染到 PC12神经细胞内，定向干扰α-突触核蛋白的合成来阻止神经细胞的凋亡，从而达到从根本上治疗帕金森症的目的。

附图说明

图1为纳米氧化镁金属胶束复合物的合成示意图。

图2为纳米氧化镁金属胶束复合物的粒度分析。

图3为纳米氧化镁金属胶束复合物的电位分析。

图4为纳米氧化镁金属胶束复合物的红外光谱分析。

图5为纳米氧化镁金属胶束复合物的粒子形貌透射电镜分析。

图6为纳米氧化镁金属胶束复合物中pDNA的接枝率。

图7为纳米氧化镁金属胶束复合物中pDNA的包封率。

图8为纳米氧化镁金属胶束复合物的热稳定性分析。

图9为纳米氧化镁金属胶束复合物的PC12神经细胞活力影响分析。

图10为DAPI染色分析纳米氧化镁金属胶束复合物对帕金森症模型的PC12神经细胞形态影响。

图11为流式细胞术检测纳米氧化镁金属胶束复合物对帕金森症模型的PC12神经细胞凋亡作用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所涉及的材料、试剂与仪器如下：

细胞株：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞系)由暨南大学医学院提供，经本实验室传代培养。

主要试剂：神经生长因子(NGF)，购自广州新特药店；干扰质粒购自上海基凯基因公司；胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。纳米氧化镁(20～50nm)，月桂酸钠，胰岛素，普鲁兰多糖，叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，盐酸等。

仪器：德国LEO公司场发射扫描电镜:LEO 1530VP,Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1纳米氧化镁金属胶束复合物的合成

1、合成示意图如附图1所示，本发明利用表面活性剂月桂酸钠的表面改性功能，对纳米氧化镁的表面进行正电改性，使其带上正电荷，得到MgO-OH₂ ⁺。之后通过静电吸附作用，在带正电的纳米氧化镁的表面吸附上干扰α-突触核蛋白的质粒DNA(pDNA)。在此基础上，利用胰岛素蛋白和普鲁兰多糖的亲疏水性的不同，合成天然蛋白纳米胶束，并将吸附上pDNA的纳米氧化镁包裹在胶束中间，防止质粒DNA在运输过程中的损失。完成之后，在胶束的表面通过酯化取代反应，修饰上靶向分子mRNA，并运用紫外光接枝的方式将神经细胞的受体靶向分子NGF接枝在胶束表面，完成纳米氧化镁金属胶束复合物的合成。

2、具体地，所述纳米氧化镁金属胶束复合物的制备方法如下：

(1)纳米氧化镁的表面改性

称取0.5g～1g纳米氧化镁粉体，加入15～25ml去离子水，分散打浆，使氧化镁颗粒分散均匀。用HCl和NaOH调节浆液的pH＝5.5～6.5之间。之后加入改性剂月桂酸钠/十二烷基苯磺酸钠(15％～20％，质量分数)，在40℃条件下，高速1000r/min彻底搅拌1～2h，使之充分反应。然后过滤，用去离子水洗涤，干燥，得到改性后的纳米氧化镁。

经过此步骤在弱酸性条件下改性后的纳米氧化镁，MgO转变为MgO-OH₂ ⁺，此时，纳米氧化镁的表面携带大量的正电荷。

(2)改性后的纳米氧化镁对质粒DNA的吸附

在步骤(1)的基础上，将带负电荷的shRNA通过静电作用与改性后的纳米氧化镁结合在一起，在4℃条件下孵育30～60min，得到MgO-pDNA复合粒子。

(3)蛋白胶束的合成

选用血影蛋白、胰岛素蛋白或藻蓝蛋白等，利用蛋白质上的氨基与普鲁兰多糖上的半缩醛羟基发生取代反应，形成蛋白质与普鲁兰多糖的天然胶束。得到胶束之后，按照1：2～3的质量比，将MgO-pDNA复合粒子加入到胶束中，通过胶束两端亲、疏水性的不同，自组装将 MgO-pDNA复合粒子包裹在胶束中，可以避免粒子在运输的过程中，被体内各种环境所降解。

(4)靶向分子mRNA在蛋白胶束上的接枝

构建α-突触核蛋白对应的基因SNCA的特异性靶点，即靶向分子mRNA，其序列如SEQID NO.1所示(gttgaggagccatgttcctcacctcatcttatggct)；然后采用蛋白胶束的多羧基结构与靶向分子mRNA上的氨基的缩合反应，将基因SNCA的特异性靶点接枝在蛋白胶束上。

(5)神经生长因子NGF的接枝

将9μg的NGF溶解在5ml的PBS/DMF(体积比1:4)混合液中，在避光下加入5.81μg的叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，冰浴中搅拌反应48h；用超滤管对产物进行纯化后，加入2ml的PBS溶解，得到NGF-AAH的混合物。然后将步骤(4)的产物(即合成的复合物)与NGF- AAH的混合物(两者的质量比是100～500：1)在紫外灯下反应10s，并用超滤管对产物进行纯化，得到产物。

实施例2纳米氧化镁金属胶束复合物的表征

本实施例对实施例1制备的产品进行表征。

1、纳米粒度检测分析

将各步的合成产物如改性后的纳米氧化镁，天然蛋白多糖胶束和接枝了pDNA后的纳米氧化镁，包裹了纳米氧化镁复合物后的蛋白胶束分别稀释到适当的浓度。然后将以上样品用注射器分别加入到干净的样品池里，塞上塞子，放入马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器中检测。

根据纳米粒度分析结果(如图2)所示，在经过表面活性剂月桂酸钠的表面改性及对质粒pDNA进行吸附之后，纳米氧化镁复合物的粒度大小在60～80nm之间，相比较于纳米氧化镁本体的粒度(50nm)增加的趋势不是很明显。经过检测，胰岛素和普鲁兰多糖进行自组装形成的蛋白多糖胶束的粒度大小为100nm左右，比吸附pDNA之后的纳米氧化镁复合物的粒度要大，但使用蛋白多糖胶束对纳米氧化镁复合物进行包裹之后，其粒度是在两个单体基础上的简单相加，达到主要的粒度范围在160nm左右。值得一提的是，在蛋白多糖胶束包裹的基础上，再接枝上靶向分子mRNA及神经生长因子NGF之后，其粒度范围并没有增大，主要的粒度范围较之单纯蛋白多糖胶束包裹的纳米氧化镁复合物还要小大约40个纳米范围。另外，从各个阶段粒子粒度的分布看，粒子的分布均匀，纳米尺度范围适中，符合我们的需要。

2、Zeta电位检测分析

Zeta电位一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性，一般情况下，Zeta电位的绝对值越高，其粒子间的静电斥力也就越大，物理稳定性也就越好。为了进一步检测纳米粒子的合成效果，通过马尔文电位分析检测了各合成阶段粒子的Zeta电位。

将各步的合成产物如改性后的纳米氧化镁，天然蛋白多糖胶束和接枝了pDNA后的纳米氧化镁，包裹了纳米氧化镁复合物后的蛋白胶束分别稀释到适当的浓度。然后将以上样品用注射器分别加入到干净的样品池里，塞上塞子，放入马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器中检测。

结果如图3所示。根据结果显示，在经过月桂酸钠改性修饰之后得到的带正电的纳米氧化镁的Zeta电位值在100mv左右，属于高电位。一方面，高的Zeta电位显示了纳米氧化镁粒子具有良好的稳定性；另一方面，在正的高的Zeta电位下也说明了纳米氧化镁粒子对于细胞及组织也存在着一定的毒性。而单独的pDNA的Zeta电位检测表现出负电性，在完成pDNA对改性后纳米氧化镁粒子的接枝之后，纳米氧化镁粒子的Zeta电位值变成负值，显示了纳米氧化镁粒子对于质粒pDNA的接枝是成功的，且接枝效果良好。在经过胰岛素和普鲁兰多糖自组装形成的胶束对纳米氧化镁粒子包裹之后，复合物的Zeta电位依然显示为负电性，但其绝对值变得更小。

3、红外光谱(FTIR)检测

进一步了解纳米氧化镁复合物的合成过程中的结构变化，通过红外光谱检测了合成各阶段产物的官能团变化。

将纳米氧化镁、改性后的纳米氧化镁、天然蛋白多糖胶束和接枝了pDNA后的纳米氧化镁以及包裹了纳米氧化镁复合物后的蛋白胶束进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。结果如图4所示。

图4的a图中，3699.4cm^-1处的强吸收峰，来自于体系中改性剂的游离的羟基的吸收；3286.6cm^-1的宽吸收带是粒子表面的羟基之间形成分子间氢键缔合的吸收峰；2920.1cm^-1和2850.7cm^-1的吸收峰来自于-CH-的伸缩振动；而1577.7cm^-1的吸收峰则是归于C＝O的吸收；1463.9cm^-1处的吸收峰则可能是-CH的弯曲振动，也可能是Mg(OH)₂的分子振动； 1114.8cm^-1的振动吸收可能来自于C-O-C的吸收峰；442.6cm^-1则可能代表的是Mg-O的振动吸收带；而其他的在1000cm^-1及以下的吸收带则可能是改性剂月桂酸钠与MgO-OH形成的化学键的吸收，这说明了纳米氧化镁表面包覆了改性剂月桂酸钠。

图4的b图中，3583.6cm^-1处的吸收峰为多糖蛋白胶束的羟基缔合形成的宽峰；2067.6cm^-1的弱吸收峰，是取代苯的吸收峰；1644.2cm^-1处的强吸收峰则是羰基C＝O的吸收；734.9cm^-1则是-NH-的变形振动吸收峰。

图4的c图中，红外吸收峰保持了改性后的氧化镁本体的峰型，并且在3410.9cm^-1的位置出现更强的羟基缔合峰，这是蛋白多糖胶束的羟基与改性后的纳米氧化镁表面的羟基之间形成的分子间氢键，而且更强；其他的峰型则和纳米氧化镁本体保持一致，且其C-O-C的吸收峰也变的更强，原因可能是蛋白多糖胶束的加入，带入了更多比例的C-O-C的结构。

图4的d图中，在纳米粒子的表面接枝了靶向分子mRNA后，由于mRNA的两端是连接了两个-OH的结构，所以，在3698.4cm^-1和3426.4cm^-1出现极强的-OH缔合峰，一方面是体系中游离的羟基的吸收峰；一方面是纳米粒子表面羟基和靶向分子mRNA的端羟基的缔合峰；而在2910.2cm^-1和2850.7cm^-1处的吸收峰则是-CH-的伸缩振动；1637.5cm^-1则依然是羰基C＝O的特征吸收峰；在1426.3cm^-1处的吸收峰为C-H的弯曲振动吸收峰，在 1000cm^-1以下的吸收域内则还保留了一定的蛋白多糖胶束的峰型。

4、透射电镜观察检测

为了观察合成的纳米氧化镁复合粒子及胶束粒子的形貌，采用透射电镜对纳米粒子进行分析。

把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像将在放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、以及感光耦合组件)上显示出来。

结果如图5所示，纳米氧化镁在吸附质粒pDNA之后，整体呈现近球形形态和结晶结构，并且在经过胶束包裹之后，粒子整体均在100nm以下，与之前粒径结果相符。

5、复合物中pDNA接枝率及包封率的检测

(1)通过紫外分光光度计对接枝前后的pDNA浓度进行测定，取一定体积的pDNA溶液，加MiliQ水稀释3倍后，用紫外分光光度法在波长为260nm下测定吸光度A，按照A＝1 时，C＝50μg/ml及稀释倍数来计算出pDNA的浓度，先测定出纳米粒溶液体系中剩余的 pDNA的含量，然后根据投料量来计算接枝率。设定反应前投料的pDNA溶液在260nm处的吸光度为A1，其浓度为W1，而反应后溶液中游离的pDNA浓度测得的在260nm处的吸光度为A1，浓度为W2。则接枝率为：

同理，将经过蛋白多糖胶束包裹后，纳米体系中游离的pDNA浓度设为W3，则包封率Qw 就可以根据公式求得为：

(2)结果如图6和图7，其在改性后的纳米氧化镁的表面的接枝率接近41％，充分说明了对纳米氧化镁的表面正电改性使成功的，且成功的通过静电吸附作用将带负电的pDNA吸附在纳米粒子的表面，达到很好的吸附效果。在此基础上，为了防止在运输过程中pDNA的损失，我们又通过蛋白多糖胶束对吸附了pDNA的纳米氧化镁粒子进行包裹，结果显示，包封率达到了44％左右，即成功的将pDNA包裹在胶束内部，防止其丢失。而根据含量来计算，在此种情况下，纳米氧化镁粒子的表面吸附的pDNA含量就有 104.70×40.47％×43.53％＝18.45μg，显示了纳米氧化镁粒子可以携带足够的pDNA含量来沉默α-syn，也证明在合成过程中，pDNA的吸附以及包裹都是成功的。

6、热稳定性分析

物体在温度的影响下的形变能力，形变越小，稳定性越高。将试样和参比物分别放入各自的样品容器中，并使之与样品容器有良好的热接触(对于液体试样，最好加入试样重量20％的惰性材料，如氧化铝等)。将装有试样和参比物的样品容器一起放入仪器的加热装置内，并使之与热传感元件紧密接触。接通气源，并将气体流量控制在10～50mL/min的范围内进行检测。

结果如图8所示。根据结果我们可以发现，经过月桂酸钠改性后的纳米氧化镁材料的含量在200℃以内均能保持在80％以上；而在改性后纳米氧化镁表面接枝了pDNA之后，纳米氧化镁复合物的热稳定性有所下降，在200℃以内含量保持在70％左右，说明在接枝了沉默因子pDNA之后，在一定程度上影响了纳米氧化镁复合物的稳定性，但考虑到温度在 200℃，这种影响作用对于纳米颗粒来说不是那么的明显。之后，在将纳米氧化镁复合物用蛋白多糖胶束进行包裹之后，其稳定性大大增强，甚至在200℃的情况下，仍能保持在95％左右，说明在经过胶束的包裹之后，纳米颗粒体系的稳定性得到极大的提升，也可以从侧面说明，纳米颗粒在输运过程中，能够保持稳定，减少损失。而在经过对靶向分子mRNA和神经生长因子NGF的接枝后，其稳定性有所下降，在升温到200℃的情况下，保持在65％左右，但在100℃也有将近90％的含量，说明在高温下，纳米氧化镁表面接枝的靶向分子和神经生长因子才有所损失，说明在常温下，纳米颗粒均能保持一定的稳定性，保证在输运过程中减少损失。这也符合我们在研究中的需求，得到稳定性更好的理想材料。

实施例3细胞实验

1、PC12神经细胞培养

(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

(3)离心，1000rpm，5min；

(4)弃去上清液，用含有10％胎牛血清的1640培养基培养，在相对湿度为95％，CO₂含量为5％，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

(5)每两天换一次液，继续培养，每2-3天传一次代一般一传三。

2、MTT细胞毒性分析

(1)在体外环境下，分析所合成的纳米氧化镁复合物对PC12神经细胞活力的影响：

①收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至10⁴每孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

②5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入各阶段合成的药物，在前一天下午铺板，次日上午加药。每孔100μl，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反映真实情况。将最佳时间段药物释放的溶液，经0.22μm的过滤膜过滤除去菌体。

③5％CO₂，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。

④每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

⑤终止培养，小心吸去孔内培养液。

⑥每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。

⑦同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

(2)结果如图9所示，经过月桂酸钠改性后的纳米氧化镁对于PC12神经细胞活力的影响比较大，只有30％左右，显示出改性后的纳米氧化镁的正电性比较强，对于PC12神经细胞存在着一定的毒性。而在对改性后的纳米氧化镁进行沉默基因pDNA的接枝之后， PC12神经细胞的活力有所改善，说明pDNA对于改性后的纳米氧化镁对于PC12神经毒性有一定的抑制作用。我们所用的包裹的胶束是胰岛素和普罗兰多糖自组装形成的，经过胶束包裹的产物MgO-INS-Plu对于PC12神经细胞活力的影响较接枝pDNA后的纳米氧化镁低。最主要的是，在我们对纳米氧化镁粒子进行靶向分子mRNA的接枝，以及神经生长因子 NGF的接枝之后，得到的产物MgO-INS-Plu-mRNA-NGF作用于PC12神经细胞后，与前几种产物相比，PC12神经细胞活力大大增加，达到了我们想要的在纳米颗粒的基础上促进细胞生长的目的。

3、DAPI染细胞核后形态观察

在使用MPP⁺对PC12神经细胞建立帕金森症细胞模型的基础上，运用纳米氧化镁复合物对细胞的帕金森症模型进行治疗修复，治疗前后的PC12神经细胞形态用DAPI荧光染色，并用明场和DAPI荧光显微镜进行拍照。具体是：将处于对数生长期的PC12大鼠心肌细胞，以5×10⁴个/孔的细胞密度接种到24孔培养板中。然后分别加入MPP⁺侵染PC12神经细胞24h，将培养板里的培养基弃去，再加入各阶段合成的纳米氧化镁复合物对帕金森症细胞进行治疗24h用PBS洗3次；每孔中加入4％多聚甲醛，室温下固定30min；用PBS洗3次，向每孔中加入0.2％Triton X-100透化30min；再用PBS洗3次；避光向每孔中加入DAPI (20μg/ml)20μL，染核5min，再用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察呈现蓝色的细胞核。

结果如图10所示。在图10中，Control组经过PBS处理后，PC12神经细胞形态未发生明显的变化，细胞核也相对完整；而在MPP+建立的帕金森症模型中，细胞发生碎裂、凋亡，且细胞核也发生破裂和不完整。在经过改性后的纳米氧化镁治疗后，细胞形态有所改善，细胞核形态也有所恢复，但不明显，细胞呈现即将碎裂的状态，这和MTT的结果相吻合。而在接枝了pDNA之后，细胞状态明显改善，细胞核也变得更加完整，较之帕金森症的细胞恢复效果更加显著。在经过蛋白多糖胶束包裹之后的纳米氧化镁治疗后，细胞状态和经过改性后的氧化镁治疗后的状态相似，但仍有较大的恢复，细胞核形态也有明显的改善。最后经过完整的纳米氧化镁复合物治疗后，由于又接枝了靶向分子mRNA和神经生长因子 NGF，对于帕金森症细胞模型的治疗效果显著，细胞恢复效果明显，细胞核基本恢复完整性。

4、流式双染色检测细胞凋亡

在MPP+作用PC12神经细胞得到帕金森症细胞模型之后，再用纳米氧化镁复合物对细胞的帕金森症模型进行治疗。纳米氧化镁复合物对帕金森症模型的PC12神经细胞作用的流式细胞术凋亡检测方法：将处于对数生长期的PC12细胞，以5×10⁵个/孔的细胞密度接种到6孔培养板中。然后分别加入MPP⁺侵染PC12神经细胞24h，将培养板里的培养基弃去，再加入各阶段合成的纳米氧化镁复合物对帕金森症细胞进行治疗24h，收集细胞，离心去除培养基。向每个样管里面加入200μl的Binding buffer混匀，再加入5μl Annexin V-FITC，室温下避光孵育10min；离心弃去上清，加入200μl的Binding buffer混匀，并加入5μl的PI，直接用细胞流式仪检验细胞的凋亡情况。

结果如图11所示。在图11中，Control组细胞未经任何处理，只在培养基中加入与药物等量的PBS，其细胞凋亡最少。而在模型组中，未经纳米氧化镁复合物药物处理的细胞组凋亡明显，凋亡率是各组中最高的。PC12神经细胞经过改性后纳米氧化镁MgO-OH₂ ⁺处理后，与单纯的帕金森模型组相比，细胞的凋亡稍微有了好转，凋亡率有所下降。在用接枝了pDNA的纳米氧化镁复合物MgO-pDNA组处理细胞之后，细胞凋亡得到明显的抑制，凋亡率明显的下降，pDNA在这一过程起到明显的效果。胶束包裹之后的纳米氧化镁复合物 MgO-pDNA-INS-Plu组在细胞凋亡的抑制作用上比单纯接枝了pDNA组有所减弱，细胞凋亡率有一定的上升。而在使用完全接枝了靶向分子mRNA和神经生长因子NGF之后，帕金森症细胞凋亡的抑制作用进一步加强，强于单纯接枝pDNA组，细胞凋亡率最低。相较于 Control组，凋亡率略高，但仍然具有明显的抑制PC12神经细胞凋亡的作用。

综上结果说明，本发明成功合成了纳米氧化镁的胶束复合物，并在体外细胞实验中，得到了纳米镁胶束复合物对PC12神经细胞帕金森症模型具有很好的治疗和抑制作用。

Claims (9)

1.一种基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物的制备方法，其特征在于，首先利用表面活性剂月桂酸钠的表面改性功能，对纳米氧化镁的表面进行正电改性，得到改性后表面带正电荷的纳米氧化镁；在此基础上，利用静电吸附，在带正电的纳米氧化镁的表面接枝上干扰α-突触核蛋白的pDNA；再在此基础上，利用胰岛素与普鲁兰多糖的亲疏水性差异进行自组装，得到天然蛋白的纳米胶束，并将前述吸附pDNA后的纳米氧化镁复合物包裹在胶束中间；然后在胶束的表面利用酯化取代反应，修饰上α-突触核蛋白的表达基因SNCA的靶向分子mRNA，并利用紫外光接枝技术将神经细胞的靶向受体神经生长因子NGF与mRNA结合从而接枝在胶束表面，合成得到所述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.纳米氧化镁的表面改性

将纳米氧化镁粉体加入去离子水中，分散打浆，使氧化镁颗粒分散均匀，并调节pH至5.5～6.5；然后加入改性剂月桂酸钠/十二烷基苯磺酸钠，搅拌反应充分；然后过滤、洗涤、干燥，得到改性后的纳米氧化镁；

S2.改性后的纳米氧化镁对质粒DNA的吸附

将带负电荷的shRNA通过静电作用与改性后的纳米氧化镁结合在一起，孵育得到MgO-pDNA复合粒子；

S3.蛋白胶束的合成

选用胰岛素蛋白，利用蛋白质上的氨基与普鲁兰多糖上的半缩醛羟基发生取代反应，形成蛋白质与普鲁兰多糖的天然胶束；然后将MgO-pDNA复合粒子加入到胶束中，通过胶束两端亲、疏水性的不同，自组装将MgO-pDNA复合粒子包裹在胶束中；

S4.靶向分子mRNA在蛋白胶束上的接枝

利用蛋白胶束的多羧基结构与靶向分子mRNA上的氨基的缩合反应，将基因SNCA的特异性靶点接枝在蛋白胶束上；所述靶向分子mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

S5.神经生长因子NGF的接枝

将NGF溶解在PBS/DMF混合液中，避光下加入叠氮苯胺盐酸盐，冰浴搅拌反应，产物纯化后用PBS溶解，得到NGF-AAH的混合物；然后将步骤S4的产物与NGF-AAH的混合物在紫外灯下反应，得到的产物纯化即为所述基因靶向的可降解纳米氧化镁金属胶束复合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述纳米氧化镁粉体和去离子水的质量体积比为0.5～1g：15～25ml。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述搅拌反应是38～45℃条件下900～1200r/min彻底搅拌，使之充分反应。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述孵育是4℃孵育30～60min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述NGF和PBS/DMF混合液的质量体积比为6～10μg：5ml；所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5～6。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述冰浴搅拌反应的时间为40～55h，所述紫外灯下反应的时间为5～15s。

8.根据权利要求1～7任一所述方法制备得到的纳米氧化镁金属胶束复合物。

9.权利要求 8 所述纳米氧化镁金属胶束复合物在制备帕金森症的治疗药物方面的应用。