CN104667297B

CN104667297B - 一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物及其应用

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Publication number: CN104667297B
Application number: CN201510060179.4A
Authority: CN
Inventors: 关燕清; 陈晓辉
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2035-02-05
Also published as: CN104667297A

Abstract

本发明提供了一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物及其应用。该金纳米粒复合物是将巯基化壳聚糖（TCTS）修饰到金纳米粒子（GNP）表面，再静电吸附干扰α‑突触核蛋白合成的pDNA，最后采用光接枝的方法接枝神经生长因子（NGF）后得到。本发明将成功合成的金纳米粒复合物作用于神经细胞，发现该复合物能够明显的抑制该细胞的凋亡，对帕金森病体外细胞模型的凋亡有抑制作用，这将是从继手术治疗和化学药物治疗之后出现的又一个治疗帕金森病的方法和新药物，对于该疾病的治疗和研究有很大的指导意义。

Description

一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物及其应用

技术领域

本发明属于基因治疗药物领域。更具体地，涉及一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物及其应用。

背景技术

帕金森病（Parkinson’s disease，PD），是一种进行性神经系统障碍疾病，主要以中脑黑质纹状体的多巴胺能神经元退化和神经递质多巴胺的减少为主要特征。当多巴胺合成减少时，抑制乙酰胆碱的功能降低，两者失衡结果出现“震颤麻痹”。据统计，对于PD，年龄在45岁以下的发病率较低，75～85岁的发病率为3.1%，85岁以上的发病率达到了4.3%。目前，与帕金森病有关的蛋白在脂质-囊泡动力学（α-synuclein，α-突触核蛋白），泛素-蛋白酶体系统（parkin and UCHL1），促分裂原活化蛋白激酶信号通路（LRRK2），氧化应激和线粒体功能（DJ1, PINK1, parkin）以及微管稳定（tau）中扮演着重要的角色。很明显，由于这些功能都能够导致多巴胺能神经元功能紊乱和死亡，所以这些不同的功能一定存在着部分重叠。但是，这些功能之间并不存在直接的联系，而且它们之间的连接也是非常不明显的。有几条通路可能会说明它们之间的联系：SNCA（编码α-synuclein的基因）发生突变，会导致α-synuclein单体在细胞质内的积累量增加，从而形成对细胞有毒的α-synuclein低聚体，一方面会造成多巴胺能神经元死亡，另一方面会促使路易小体的形成和破坏线粒体的功能，导致神经元细胞死亡。由于α-synuclein的功能发生变化，破坏囊泡的运输，多巴胺释放受阻，产生活性氧，从而导致神经元细胞死亡。

其中，α-突触核蛋白（α-synuclein）在帕金森病的病理生理学中处于一个重要的地位，它的过表达对帕金森病的体内和体外模型都会产生毒性。它是一个有140个氨基酸的蛋白质，研究显示其涉及到帕金森症的发病机制中。有研究表明，编码α-synuclein基因的三个错义突变（A53T, A30P, E46K）导致了帕金森病的常染色体显性遗传形式。聚合的α-synuclein是路易小体和路易神经突触的主要成分，PD病理学指标。尽管α-突触核蛋白精确的功能还不知道，但是越来越多的证据说明，α-突触核蛋白的表达水平在PD的发病机理中是非常重要的。最近的研究已经显示，严重的PD病人在中脑黑质纹状体处，α-突触核蛋白的mRNA含量增加。与此同时，早期和晚期的帕金森患者也是通过α-突触核蛋白的过表达程度进行区分的。另外，α-突触核蛋白的过表达在体外实验和体内实验中证明都是有毒的。这些现象说明，α-突触核蛋白的结构突变和表达水平上调导致了多巴胺能神经元细胞的死亡和退化，针对PD患者，通过靶向降低α-突触核蛋白表达的治疗策略，可能会影响多巴胺能神经元细胞死亡的过程。

帕金森病是一种神经退行性疾病，当前还没根本的治疗方法。针对PD主要有三种治疗的方法：1）手术治疗：通过移植多巴胺能神经元细胞，来降低用药量，但是并不能从根本上解决问题；2）药物治疗：左旋多巴胺、儿茶酚转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、酶抑制剂等药物；然而，疾病的持续恶化是不可避免的，病人很快就会出现运动性障碍，如步伐紊乱、痴呆等；3）基因治疗：RNA干扰特定蛋白的表达；该方法目前研究比较多，因为RNAi可以通过干扰基因转录为相应的蛋白而沉默特定基因，所以理论上来讲，任何基因都可以通过RNAi靶向沉默，这样就可以为治疗疾病提供一个巨大的前景。同时，α-突触核蛋白的表达情况与帕金森病有关联，可以作为疾病治疗的可行靶点，目前已有几种抑制α-突触核蛋白的表达的方法，比如药物、脯氨酰寡肽酶抑制剂、多肽、shRNA和siRNA，但是这些方法没有一个是以纳米医学为基础的。

而针对不同的疾病，纳米基因治疗的实现是研究的重点和难点。目前，基因治疗有三个主要的类型：1）选择性转染：载体携带着细胞凋亡基因选择性地进入癌细胞，而不会进入正常细胞；2）特异性表达：凋亡基因被转入正常细胞和癌细胞中，在癌细胞中特异性的表达，但是在正常细胞里不表达；3）靶向蛋白的分泌：基因进入细胞以后，能够分泌嵌合体蛋白，靶向癌细胞，从而使癌细胞凋亡。

然而，在基因治疗的过程中，携带基因的载体是非常关键的。携带基因的载体需要克服三个主要的障碍：1）穿过细胞膜；2）保护并成功地释放基因；3）穿过核膜。所有这些障碍中，最关键的是载体携带的基因穿过核膜进入细胞核内进行表达，这是基因转染的限制性步骤。基因治疗的常用载体为病毒载体，但是用病毒做基因的载体，在治疗疾病时，可能会产生自身免疫反应和炎症，甚至有基因突变的风险。而对于非病毒载体，按其尺寸大小可以分为三类：纳米载体、微米载体和大尺寸载体。在过去的十几年里，金纳米粒子（AuNPs，也记作GNP）由于具有生物相容性好、合成简单、分散性好、易功能化、细胞内吞率高、循环半衰期长、易于渗透肿瘤细胞及特殊的化学惰性、表面特性、电子结构和光学特性，使它在诊断疾病、化疗、医学成像、热疗、新疫苗的设计、放疗、基因疗法等临床研究中成为一种理想的纳米载体。金纳米粒子可以负载小的药物分子或者大分子（DNA，siRNA）转染到细胞里，通过谷胱甘肽、PH或者额外的电刺激释放到细胞里。所以，金纳米粒子在药物和基因传递系统中得到应用。但是目前还没有用金纳米粒作为载体传递基因用在帕金森病的基因的治疗方面的研究和报道。

金纳米粒子在药物传递系统中的应用主要有三方面：1）金纳米粒子表面巯基化的单分子胶束结构，是内部疏水、表面亲水的，可以包裹疏水的药物，进而有效地通过扩散经由细胞膜进入细胞，而载体不会进入细胞；2）利用金纳米粒的光学特性控释药物，这种方法需要用光去诱导药物分子的释放。通过光敏键将药物接到巯基化的金纳米粒子上，由于EPR效应使该复合物在癌细胞处积累，当曝露在365nm的紫外灯光下时，光敏键断裂，释放药物；3）在细胞内，金纳米粒子与巯基化的药物结合，而谷胱甘肽（GSH）作为药物释放的一个交换体，可以替代金纳米粒子上结合的药物，从而将药物释放。对于金纳米粒子的抗癌治疗中，主要应用在两个方面：光学疗法与基因疗法。光学疗法是用光加热杀死癌细胞。在表面等离子体区域用可见光照射，金纳米粒子能够吸收能量，在极短的时间里以热的形式释放出来。基因疗法是用一个或者几个基因作为药物去补偿某个基因的缺失。金纳米粒子有很强的能力去携带质粒DNA或者RNA进入细胞，所以，金纳米粒子为基因的转染提供了极大的支持。核酸-AuNPs轭合物（即核酸-金纳米粒子轭合物）能够更有效的敲除基因，RNA-AuNPs 有一个更加持续的能力去沉默基因。而AuNPs对于基因的沉默或者表达的研究主要表现在两个方面：1）AuNPs与巯基化的寡核苷酸结合，然后靶向细胞质内的成分；2）AuNPs包裹上带正电的分子，在转染的过程中，通过静电作用吸附DNA/RNA，然后在细胞里面释放。小尺寸（10nm）的AuNPs-DNA通过靶向RNA沉默基因。例如：用特异性的DNA寡核苷酸包裹AuNPs，在mRNA水平上去靶向编码绿色荧光蛋白的序列，其沉默基因的能力达到了75%。AuNPs-RNA也被用于沉默基因，使基因不能编码成相应的mRNA。AuNPs-RNA具有持续性沉默基因的能力，而且不容易被核酸酶降解。1.4～2.0 nm 的带正电的金纳米粒子通过静电作用吸附DNA片段，已经被直接转染进细胞核。而金纳米粒子需要用赖氨酸、PEI、带正电荷的硫醇或者PEG修饰。带正电荷的金纳米粒子，通过硝基-光敏键结合，在紫外灯的照射下传递基因。Mini Thomas等合成PEI-GNP吸附质粒转染COS-7细胞；Yuebin Shan等用含有氨基树枝状化合物修饰Au纳米粒，然后吸附质粒去转染Hela细胞；Cheng Xu等用氧化石墨烯包裹金纳米粒，然后用PEI修饰，吸附DNA转染Hela细胞；Tongyu Xiao等用叶酸作为靶向分子去修饰氨基化的金纳米粒，携带质粒DNA转染Hela细胞。

综上所述，金纳米粒子是一种低毒性的具有高转染效率理想的纳米载体，可以负载小的药物分子或者核酸大分子。在国内，金纳米粒的研究已经在几个领域展开，比如传感器、催化、酶活性检测、医疗成像、抗体检测、免疫测定、抑制病毒传染、分析化学、肿瘤细胞治疗、颈癌的放射性治疗、癌症诊断、抗菌活性、DNA的吸收与释放、蛋白酶的荧光检测、抗血栓、成骨细胞的增值与分化、左旋多巴胺的检测等。在金纳米粒对核酸的传递和转染方面的研究中，目前有用功能化的金纳米粒吸附核酸去转染非洲绿猴肾细胞，HeLa细胞，乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞，抑制病毒传染，皮肤病治疗等，但是还没有发现用功能化的金纳米粒吸附质粒DNA用于抑制神经细胞凋亡或抑制帕金森病细胞模型凋亡方面的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有帕金森病治疗药物的不足，提供一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物，该金纳米粒复合物对帕金森病体外细胞模型的凋亡有抑制作用，这将是从继手术治疗和化学药物治疗之后出现的又一个治疗帕金森病的方法，对于该疾病的治疗研究有很大的指导意义。

本发明另一目的是提供上述金纳米粒复合物的制备方法和应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物，是将巯基化壳聚糖修饰到金纳米粒子表面，再静电吸附干扰α-突触核蛋白合成的pDNA，最后采用光接枝的方法接枝神经生长因子NGF后得到。

具体地，是将巯基化壳聚糖（TCTS）修饰到金纳米粒子（GNP）的表面，得到壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）；再通过静电吸附作用将干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA（pDNA）吸附在壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）上，得到质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA）；最后采用光接枝的方法将神经生长因子（NGF）修饰在质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA）上，得到神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF），即所述的具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物。

本发明还提供了一种上述具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物的制备方法，步骤如下：

S1.制备壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）

S11.按照冰醋酸：巯基化壳聚糖=20～25：1的质量比例，将冰醋酸加到巯基化壳聚糖（TCTS）中，然后加入15～20倍体积的超纯水；

S12.按照巯基化壳聚糖：HAuCl₄·3H₂O（三水氯金酸）=1：2～4的质量比例，将HAuCl₄·3H₂O加入S11得到的混合液中；

S13.再按照HAuCl₄·3H₂O：NaBH₄（硼氢化钠）=1：1～3的摩尔比例，将NaBH₄加入到S12得到的混合液中进行反应，对反应液进行透析（100kDa），得到CTS@GNP水溶液。

S2.制备神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF）

S21.将带负电荷的pDNA与带正电荷的壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）按4～1：1～2质量比混合，然后在4℃或者常温下孵育20～30min，获得CTS@GNP-pDNA；

S22.按照NGF：DMF：AAH=3：20：5～8的体积比，将NGF溶解在二甲基甲酰胺（DMF）PBS溶液中，在避光下加入叠氮苯胺盐酸盐（AAH），冰浴中搅拌反应24～48h；然后用超滤管对反应产物进行纯化后，加入PBS溶解，得到NGF-AAH；

S23.将CTS@GNP-pDNA与NGF-AAH的混合物在紫外灯下反应5～20s，并用超滤管对产物进行纯化，得到神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF），即本发明所述的具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物。

其中，步骤S21所述带负电荷的pDNA为能够干扰α-突触核蛋白合成的pDNA；步骤S22所述二甲基甲酰胺（DMF）PBS溶液中PBS：DMF =1：4。

另外，优选地，步骤S11所述巯基化壳聚糖（TCTS）的制备方法为：

（1）按照4mg/mL的比例，将壳聚糖溶解在冰醋酸与四氢呋喃的混合液中；所述冰醋酸与四氢呋喃的混合液中冰醋酸：四氢呋喃=4：1；

（2）在搅拌的情况下，按照壳聚糖：二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯=1～2：1的比例，将含有二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的四氢呋喃溶液滴加进步骤（1）的混合液中，反应20～48h后，蒸干溶剂，得到产物；所述含有二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的四氢呋喃溶液中二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯：四氢呋喃=10mg：1mL；

（3）将产物悬浮在水中，加入2-巯基乙醇，搅拌2h，过滤，滤液用透析袋（5kDa）透析，得到巯基化壳聚糖（TCTS）；所述的水：2-巯基乙醇=15：1。

优选地，上述制备巯基化壳聚糖（TCTS）所用到的二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯（DTSP）的制备方法为：

（1）在冰浴下，按照3,3’-二硫代二丙酸（DTPA）：N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）：二甲基甲酰胺=2：4：25的摩尔比例，将DTPA和HOSu溶解在二甲基甲酰胺中；

（2）按照2：25的摩尔的比例，将二环己基碳二亚胺溶解在二甲基甲酰胺中，搅拌下，将其滴加到步骤（1）的反应混合物中，冰浴中反应24h后，过滤；然后用乙酸乙酯稀释，加入稀盐酸，除去剩余的二环基脲，然后蒸发除去溶剂，得到固体产物；

（3）用稀盐酸洗3～5次，然后加入乙酸乙酯，除去盐酸水溶液，旋转蒸发除去溶剂得到产物，即为DTSP。

本发明上述具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物在制备抑制神经细胞凋亡的药物中的应用，以及在制备治疗帕金森病的药物中的应用，均在本发明的保护范围之内。

金纳米粒子具有一些重要的特性，比如生物相容性、尺寸可控和简单的功能化，为核酸的传递提供了一个有吸引力和适用的纳米材料；金纳米粒子与核酸的结合形式，对细胞内吞，胞内逃离以及核酸的释放有着重要的影响。基因转染的效率依赖于金纳米粒子上面的修饰等多种因素。针对特定的疾病、特定的药物，能否成功利用金纳米粒子的携载从而实现疾病的治疗，是研究的重点。我们期望首先用巯基化的壳聚糖修饰金纳米粒作为载体，再吸附上与靶向相关mRNA的质粒DNA，然后在表面接上靶向分子NGF，形成金纳米复合物作用于神经细胞，抑制其细胞的凋亡。

我们首先通过脱水缩合反应合成二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯，紧接着通过取代反应得到巯基化的壳聚糖，并将巯基化壳聚糖（TCTS）修饰到金纳米粒子（GNP）的表面，得到壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）；再通过静电吸附作用将干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA（pDNA）吸附在壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）上，得到质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA）；最后采用光接枝的方法将NGF修饰在质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA）上，得到神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF）。

所用到的神经生长因子（NGF）是一种分泌产生的生长因子，对中央及外周神经系统的神经元细胞的生存、生长和维持有重要的作用；还可以与神经元细胞膜上存在的NGF受体（TrkA–NGF）结合。所以，NGF可以作为靶向分子用于医学方面的研究。

我们采用以下表征方法：傅里叶红外光谱（FTIR）、拉曼光谱（Raman）、X射线光电子能谱分析（XPS）、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳。一系列的表征结果说明，我们已经成功的合成了分散性好，尺寸小的金纳米粒复合物（CTS@GNP- pDNA- NGF）。

在成功制备得到具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物后，对于该复合材料的生物学效应，我们将金纳米粒复合物作用于神经细胞，通过DAPI检测、流式细胞术实验验证，发现该复合物能够通过干扰α-突触核蛋白的表达来抑制神经细胞的凋亡，对PC12细胞凋亡的抑制作用显著，所以，合成的金纳米粒复合物有很大的潜力应用于帕金森病的治疗。

本发明合成的金纳米粒复合材料，在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，成功将pDNA转染到细胞内，干扰α-突触核蛋白的合成，来阻止神经细胞的凋亡，进步意义重大。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物，是将巯基化壳聚糖（TCTS）修饰到金纳米粒子（GNP）表面，再静电吸附干扰α-突触核蛋白合成的pDNA，最后采用光接枝的方法接枝神经生长因子（NGF）后得到的。本发明在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，成功将pDNA转染到细胞内，干扰α-突触核蛋白的合成，来阻止神经细胞的凋亡，进步意义重大。

本发明将成功合成的金纳米粒复合物作用于神经细胞，发现该复合物能够明显的抑制该细胞的凋亡，对帕金森病体外细胞模型的凋亡有抑制作用，这将是从继手术治疗和化学药物治疗之后出现的又一个治疗帕金森病的方法和新药物，对于该疾病的治疗和研究有很大的指导意义。

本发明的金纳米粒复合物，与现有的治疗帕金森病的方法和药物相比，在治疗疾病时，可以避免病毒载体产生的危害，比如产生自身免疫反应、炎症以及基因突变的风险；当前的化学药物和手术治疗，都不能从根本上解决神经细胞持续性死亡的问题。而本发明的神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF），具有尺寸小、毒性低、修饰上的壳聚糖容易降解、能够能过血脑屏障特异性靶向神经细胞等优点。

附图说明

图1为合成的金纳米粒复合物的红外光图谱；图中a为二硫代二丙酸（DTPA），b为N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu），c为二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯（DTSP），d为壳聚糖（CTS），e为巯基化的壳聚糖（TCTS），f为金纳米粒（GNP），g为壳聚糖修饰的金纳米粒（CTS@GNP），h为NGF修饰的CTS@GNP即CTS@GNP-GNP）。

图2为3,3'-二硫代二丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和DTSP的拉曼图谱。

图3为GNP和CTS@GNP的紫外图谱。

图4为透射电镜图；图中，a 为CTS@GNP，b为CTS@GNP- pDNA，c为CTS@GNP- NGF-pDNA，d为CTS@GNP -pDNA- NGF。

图5为质粒pDNA的琼脂糖凝胶电泳迁移情况。

图6为PD细胞模型中MPP⁺浓度筛选；注：**P < 0.01 VS.对照组。

图7为金纳米复合物作用于24h体外细胞模型，经DAPI染色后在荧光显微镜下细胞以及细胞核的形态。

图8为金纳米粒复合物作用PC12细胞24h和48h后的凋亡率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例中所用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞系）由暨南大学医学院提供，经本实验室（华南师范大学生命科学学院关燕清教授实验室）传代培养。

神经生长因子（NGF），购自广州新特药店。干扰质粒pDNA购自上海基凯基因公司。胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品。新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。24孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。

所用到的仪器：德国LEO公司场发射扫描电镜LEO 1530 VP，Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85 高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1 制备具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物

1、制备二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯（DTSP）：

在冰浴下，将4.2504g (0.02 mol) 3,3’-二硫代二丙酸（DTPA）和4.6036（0.04mol）N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）溶解在20mL的二甲基甲酰胺；将4.1266 g （0.02mmol）二环己基碳二亚胺溶解在20mL的二甲基甲酰胺中；搅拌下，将其滴加到反应混合物中，冰浴中反应24h后，过滤；然后用乙酸乙酯稀释，加入稀盐酸，除去剩余的二环基脲。然后蒸发除去溶剂，得到固体产物，并用稀盐酸洗三到五次，然后加入乙酸乙酯，除去盐酸水溶液，旋转蒸发除去溶剂得到产物，即为DTSP。

2、制备巯基化壳聚糖（TCTS）：

将 200mg 的壳聚糖溶解在 50mL 冰醋酸与四氢呋喃的混合液（4：1）中；在搅拌的情况下，将溶解在10mL的四氢呋喃中的100mg的二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯滴加进去。反应20h，蒸干溶剂，得到产物。将产物悬浮在15mL水中，加入1mL的2-巯基乙醇，搅拌2h。过滤，滤液用透析袋（5kDa）透析。

3、制备壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP）：

将0.4mL的冰醋酸加到20mg的巯基化壳聚糖（TCTS）中，然后加入8mL的超纯水。将60mg的HAuCl₄·3H₂O加入上述混合液中，然后加入一定量的NaBH₄进行反应（HAuCl₄·3H₂O与NaBH₄的摩尔比为1：2）。接着对反应液进行透析（100kDa），得到CTS@GNP水溶液。

4、制备神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF）：

本研究中将带负电荷的pDNA与带正电荷的CTS@GNP按不同的质量比混合（带负电荷的pDNA与带正电荷的CTS-GNP通过静电作用结合在一起），然后在4℃下孵育30min，获得CTS@GNP-pDNA。

将9 μg的NGF溶解在5mL的PBS/DMF (1:4)中，在避光下加入5.81μg的叠氮苯胺盐酸盐（AAH），冰浴中搅拌反应48h；用超滤管对产物进行纯化后，加入2mL的PBS溶解。

然后将合成的CTS@GNP-pDNA与NGF-AAH的混合物在紫外灯下反应10s，并用超滤管对产物进行纯化，得到神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物（CTS@GNP-pDNA-NGF），即为本发明所述的具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物。

实施例2 红外光谱检测对合成金纳米粒复合物进行表征

1、将DTPA，HOSu，DTSP，CTS，TCTS，GNP，CTS@GNP和CTS@GNP-GNP进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。

2、结果

检测结果如附图1所示。图1是利用傅立叶转换红外光谱仪对相应反应物和产物表征的红外谱图。谱图a在1698cm^-1有一强的吸收峰，是3,3'-二硫代二丙酸羧基上的C=O伸缩振动；谱图b在1651 cm^-1、1705 cm^-1、1780 cm^-1的吸收峰，是N-羟基琥珀酰亚胺中C=O的伸缩振动；对于谱图c在1668 cm^-1、1740 cm^-1、1783 cm^-1、1813 cm^-1的四个吸收峰，是DTSP的C=O伸缩振动。谱图c和谱图b相比，多了一个羰基峰，可以推断出是3,3'-二硫代二丙酸的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺的羟基发生脱水缩合反应生成的羰基。初步的证明了3,3'-二硫代二丙酸和N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂DCC的作用下，发生了脱水缩合反应，生成了DTSP。谱图d和谱图e相比，在2509 cm^-1处多了弱的吸收峰，是巯基化的壳聚糖上S-H的伸缩振动引起的，可以初步的证明壳聚糖上有巯基这个功能团；谱图e在1572 cm^-1处的吸收峰，是仲酰胺的N-H变形振动，在2919 cm^-1处的吸收峰，是-CH₂的C-H伸缩振动，进一步的证明壳聚糖与DTSP发生了取代反应，在壳聚糖上出现了仲酰胺的酰胺键。所以，可以初步的证明巯基化的壳聚糖已经合成。谱图g为金纳米粒修饰上壳聚糖以后的红外图，与谱图f的金纳米粒和谱图d的壳聚糖相比，其特征吸收峰在谱图g中都有呈现。与谱图e相比，谱图f在1303 cm^-1，1419 cm^-1，1457 cm^-1，1541 cm^-1处的吸收峰，是修饰的神经生长因子（NGF）引起的。

实施例3 拉曼光谱检测对合成金纳米粒复合物进行表征

1、将DTPA，HOSu和DTSP进行干燥处理，然后分别取适量的样品于载玻片上，上机检测。

2、结果

检测结果如附图2所示。图2是利用拉曼光谱仪对反应物3,3'-二硫代二丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和生成物DTSP表征的拉曼谱图。谱图A在659 cm^-1处的拉曼峰和500 cm^-1处的拉曼峰，分别是3,3'-二硫代二丙酸中的C-S 链基和S-S链基的伸缩振动引起的，谱图B则没有这样的拉曼峰；而谱图C在665 cm^-1处和507 cm^-1处的拉曼峰，是DTSP中的C-S 链基和S-S链基的伸缩振动引起的，可以证明3,3'-二硫代二丙酸和N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂DCC的作用下，发生脱水缩合反应生成DTSP。

实施例4 紫外可见光谱检测对合成金纳米粒复合物进行表征

1、通过紫外可见分光光度计，在190～900 nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。用HAuCl₄和NaBH₄合成的金纳米粒为样品1，上述合成的CTS–GNP为样品2，然后以分散剂水为参比液，分别取适量的样品于比色皿中，在190～900nm的范围内进行光谱扫描检测。

2、结果

检测结果如附图3所示。图3是利用紫外可见分光光度仪对金纳米粒子（GNP）、壳聚糖修饰的金纳米粒子（CTS@GNP）表征的UV谱图。谱图A中GNP的最大吸收波长是517nm，而CTS@GNP的最大吸收波长是524nm，这是因为壳聚糖被修饰到金纳米粒子上，使该纳米粒子的粒径增大，发生了红移。所以，该谱图也证明了壳聚糖被修饰到了金纳米粒子上。

实施例5 X射线光电子能谱仪检测对合成金纳米粒复合物进行表征

1、X射线光电子能谱仪分析其元素构成及化学键的形成情况。分别取适量3,3’-二硫代二丙酸，N-羟基丁二酰亚胺，DTSP，CTS和TCTS送样，用X射线光电子能谱仪扫描各样品组成成分元素分析。

2、结果

表1是利用X射线光电子能谱仪对二硫代二丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺、DTSP、CTS和TCTS进行表征的原子浓度表。

表1 原子浓度百分数

3，3’- 二硫代二丙酸中氮原子含量为零，硫原子含量为11.27%；N-羟基琥珀酰亚胺中氮原子含量为7.97%，硫原子含量为11.27%。二硫代二丙酸和N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂DCC的作用下，合成的产物中既有氮元素，又有硫元素。所以可以初步的证明，二硫代二丙酸和N-羟基琥珀酰亚胺发生脱水缩合反应生成了DTSP。壳聚糖中硫原子含量为为零，而对壳聚糖进行巯基化修饰的产物中，硫原子的含量为0.67%。所以，此数据证明，壳聚糖上修饰上了巯基这个功能团。

实施例6 透射电子显微镜观察对合成金纳米粒复合物进行表征

1、将金纳米粒悬浮于超纯水中，将溶液滴在透射电镜专用铜网的石蜡膜上，溶剂挥发出去，透射电镜（TEM，JEM-2100HR 显微镜，200keV 电子动能）测定纳米粒形貌。

2、结果

附图4是透射电子显微镜下拍摄CTS@GNP、CTS@GNP-pDNA、CTS@GNP-NGF-pDNA和CTS@GNP-pDNA- NGF的TEM图。从CTS@GNP的TEM图中可以看出，合成的壳聚糖修饰的金纳米粒子分散性好，粒径较小，比表面积较大；而CTS@GNP-pDNA的TEM图中显示，其粒径比CTS-GNP的粒径大，说明CTS-GNP壳聚糖上带正电的氨基和pDNA上带负电的磷酸根，通过静电吸附作用，pDNA被吸附到CTS-GNP上，使其粒径变大。所以，pDNA被成功的吸附在了CTS-GNP上。图c与图a相比，粒径没有发生太大的改变，可能是由于NGF修饰到CTS@GNP上以后，阻止了对pDNA的静电吸附；而对于图d，最终合成的金纳米粒复合物的粒径较CTS@GNP的粒径大，其分散性仍然保持较好。因此，该结果从形态方面说明了金纳米复合物成功的合成。

实施例7琼脂糖凝胶电泳检测对合成金纳米粒复合物进行表征

1、取0.2g琼脂糖加入20mL TAE（1×）缓冲液，微波炉中加热至琼脂糖完全融化（中间取出摇匀，以免沸腾）；冷至50℃左右（不烫手）后，加入1μL染料GV，混匀后倒入胶槽中；待胶完全凝固后（约25～30min），将胶放入电泳槽中，并加入1×TAE缓冲液浸没过胶面；在点样前，需要对如表2所示的6组样品分别加入4 μL 6×上样缓冲液（6×loading buffer）；然后将10 μL的样加入对应的琼脂糖点样孔中。120V的条件下电泳30min。

表2 样品中pDNA与Au的含量情况

2、结果

附图5是琼脂糖凝胶电泳迁移情况。为了验证壳聚糖修饰的金纳米粒子是否吸附pDNA，在琼脂糖凝胶电泳的实验中，通过凝胶中pDNA的迁移率和条带的宽度进行判断。当pDNA与溴化乙锭结合以后，在紫外光下通过观察凝胶中条带的荧光强度，我们可以看出，CTS@GNP与pDNA混合后，能够阻止DNA在凝胶上的迁移率。当CTS@GNP与pDNA的质量比大于1时，pDNA在凝胶电泳中的迁移被完全阻止。所以，可以证明壳聚糖修饰的金纳米粒能够吸附质粒，当CTS@GNP与质粒DNA的质量比大于1时，pDNA被完全吸附在了CTS-GNP上。

实施例8 细胞凋亡实验

1、细胞培养

PC12细胞系由暨南大学医学院提供。细胞在在培养瓶中增殖培养至80%后，以4000/孔的密度接种至96孔板上，培养1，2天，以进行后续实验。其细胞培养条件为：含10%新生牛血清的低糖DMEM培养基，37℃，5.0%CO₂。

2、MPP⁺诱导细胞发生凋亡

（1）分别取不同剂量MPP⁺加入正在培养的PC12细胞中，24 h后测量细胞存活率，设定后续建模MPP⁺ 浓度。

（2）MPP⁺ 诱导 PC12 细胞是公认的 PD 细胞模型，广泛应用于研究多巴胺能神经元的变性机制及药物保护。在PD模型构建的实验中，对PC12细胞用不同浓度的MPP⁺（125μM、250μM、500μM、1000μM）处理24h，检测细胞的活力。PD细胞模型中MPP⁺浓度筛选结果如附图6所示。

从实验结果图6中可以看出，随着MPP⁺药物浓度的增加，对PC12细胞处理24h后，细胞存活率逐渐下降，呈剂量依赖型。与对照组相比，当MPP⁺的浓度为500μM时，细胞的存活率为56%（P < 0.01）。当MPP⁺的浓度低于500μM，细胞存活率较高；而高于500μM细胞又大量的死亡，都不利于构建PD的细胞模型。

3、DAPI染细胞后形态观察

（1）将处于对数生长期的PC12细胞，以5×10⁴个/孔的细胞密度接种到24孔培养板中。然后分别加入PBS、CTS@GNP-pDNA-NGF转染细胞12h，将培养板里的培养基弃去，加入含有MPP⁺（根据24h筛选量）的新鲜DMEM培养基，在37℃继续培养细胞24h。弃去培养基，用PBS洗3次；每孔中加入4%多聚甲醛，室温下固定30min；用PBS洗3次，向每孔中加入0.2% TritonX-100透化30min；再用PBS洗3次；避光向每孔中加入DAPI（5μg/mL），染核1min，再用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察呈现蓝色的细胞核。

（2）金纳米复合物作用于24h体外细胞模型，经DAPI染色后在荧光显微镜下细胞以及细胞核的形态，如附图7所示。

PC12细胞经金纳米粒复合物转染12h后，用PD体外细胞模型对应的MPP⁺的量处理PC12细胞，培养24h；然后用DAPI将细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞以及细胞核的形态结果。2个组的细胞核都被DAPI染成蓝色，加入PBS，经MPP⁺作用后的PC12细胞，由于MPP⁺对细胞的毒性刺激，使PC12细胞发生凋亡，染色质皱缩，高度凝集并且边缘化，出现凋亡小体（如c中箭头所示）； CTS@GNP- pDNA- NGF组，由于质粒干扰了α-突触核蛋白的形成和NGF对神经细胞的营养作用，细胞凋亡被进一步的抑制，细胞核形态趋于正常，凋亡小体较第一组减少，细胞核更趋于正常，凋亡情况更少，说明CTS@GNP- pDNA- NGF对细胞凋亡的抑制效果更好。与同位置明场下细胞的情况，同样可以分析得出细胞形态的变化趋势。

4、流式细胞术检测细胞凋亡

（1）将处于对数生长期的PC12细胞，以5×10⁵个/孔的细胞密度接种到6孔培养板中。然后分别加入PBS和 CTS@GNP-pDNA-NGF转染细胞12h，将培养板里的培养基弃去，加入含有MPP⁺（根据24h筛选量）的新鲜DMEM培养基，在37℃继续培养细胞24h。收集细胞，离心去除培养基。向每个样管里面加入200 μL的溶胶液（Binding buffer）混匀，再加入5μLAnnexin V-FITC，室温下避光孵育10min；离心弃去上清，加入200 μL的溶胶液（Bindingbuffer）混匀，并加入5μL的PI，直接用细胞流式仪检验细胞的凋亡情况。

（2）金纳米粒复合物作用PC12细胞24h和48h后的凋亡率如附图8所示。PC12细胞用金纳米复合物处理12h后，用PD体外细胞模型对应的MPP⁺的量处理PC12细胞，培养24h；然后收集细胞并进行双染，用流式细胞仪测定细胞凋亡。与对照组（PC12细胞凋亡率为39.41%）相比，当用金纳米粒复合物处理以后，PC12细胞的凋亡率变为17.37%，初步说明金纳米复合物对PC12细胞的凋亡有一定的抑制作用。

综上所述，我们用红外光谱，紫外光谱，透射电镜和琼脂糖凝胶电泳对合成金纳米粒复合物进行表征。红外光谱用于分析合成过程中各种化合物的功能团，结果已经证实金纳米粒复合物成功的合成。紫外光谱法的结果说明，壳聚糖修饰的金纳米粒最大吸收峰与单纯的金纳米粒相比，峰值发生了红移，是壳聚糖包裹金纳米粒的尺寸变大的结果。透射电镜的结果显示，合成的壳聚糖修饰的金纳米粒的粒径在5nm左右，而且粒子的分散性好。但是，Choi等合成的壳聚糖修饰的金纳米粒尺寸较大，粒径集中在15～25nm范围。我们合成CTS@GNP粒径较小，比表面积大，可以通过静电作用吸附更多的质粒，用于后续的转染实验中。琼脂糖凝胶电泳的实验结果，说明当CTS@GNP与质粒DNA的质量比大于1时，质粒DNA能够被CTS@GNP通过静电作用完全吸附。但是，在Mirkin 等的研究工作中，需要对寡核苷酸进行巯基化，与金纳米粒共价结合，然后沉默相关基因的表达。我们的质粒DNA是通过静电吸附作用于金纳米粒结合，简化了实验的过程。

金纳米粒复合物对于抑制帕金森病体外细胞模型凋亡的作用情况，通过定性的DAPI实验和定量的流式实验进行了分析，结果表明，金纳米粒复合物对帕金森病体外细胞模型的凋亡有一定的抑制作用。这将从继手术治疗和化学药物治疗之后出现的又一个治疗帕金森病的方法，对于其疾病的治疗研究有很大的指导意义。

Claims

1.一种具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1.制备壳聚糖/金纳米粒复合物

S11.按照冰醋酸：巯基化壳聚糖=20～25：1的质量比例，将冰醋酸加到巯基化壳聚糖中，然后加入15～20倍体积的超纯水；

S12.按照巯基化壳聚糖：HAuCl₄·3H₂O=1：2～4的质量比例，将HAuCl₄·3H₂O加入S11得到的混合液中；

S13.再按照HAuCl₄·3H₂O：NaBH₄=1：1～3的摩尔比例，将NaBH₄加入到S12得到的混合液中进行反应，对反应液进行透析，得到CTS@GNP水溶液；

S2.制备神经生长因子（NGF）/质粒DNA（pDNA）/壳聚糖/金纳米粒复合物

S21.将带负电荷的pDNA与带正电荷的壳聚糖/金纳米粒复合物按4～1：1～2质量比混合，然后在4℃或者常温下孵育20～30min，获得CTS@GNP-pDNA；

S22.按照NGF：二甲基甲酰胺（DMF）：叠氮苯胺盐酸盐（AAH）=3：20：5～8的体积比，将NGF溶解在二甲基甲酰胺PBS溶液中，在避光下加入叠氮苯胺盐酸盐，冰浴中搅拌反应24～48h；然后用超滤管对反应产物进行纯化后，加入PBS溶解，得到NGF-AAH；

S23.将CTS@GNP-pDNA与NGF-AAH的混合物在紫外灯下反应5～20s，并用超滤管对产物进行纯化，得到神经生长因子/质粒DNA/壳聚糖/金纳米粒复合物，即所述的具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物；

步骤S21所述带负电荷的pDNA为能够干扰α-突触核蛋白合成的pDNA。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S22所述二甲基甲酰胺PBS溶液中PBS：DMF =1：4。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S11所述巯基化壳聚糖的制备方法为：

（1）按照4mg/mL的比例，将壳聚糖溶解在冰醋酸与四氢呋喃的混合液中；

（2）在搅拌的情况下，按照壳聚糖：二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯=1～2：1的比例，将含有二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的四氢呋喃溶液滴加进步骤（1）的混合液中，反应20～48h后，蒸干溶剂，得到产物；

（3）将产物悬浮在水中，加入2-巯基乙醇，搅拌2h，过滤，滤液用透析袋透析，得到巯基化壳聚糖。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤（1）所述冰醋酸与四氢呋喃的混合液中冰醋酸：四氢呋喃=4：1；

步骤（2）所述含有二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的四氢呋喃溶液中二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯：四氢呋喃=10mg：1mL；

步骤（3）所述的水：2-巯基乙醇=15：1。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的制备方法为：

（1）在冰浴下，按照3,3’-二硫代二丙酸：N-羟基丁二酰亚胺：二甲基甲酰胺=2：4：25的摩尔比例，将3,3’-二硫代二丙酸和N-羟基丁二酰亚胺溶解在二甲基甲酰胺中；

（2）按照2：25的摩尔比例，将二环己基碳二亚胺溶解在二甲基甲酰胺中，搅拌下，将其滴加到步骤（1）的反应混合物中，冰浴中反应24h后，过滤；然后用乙酸乙酯稀释，加入稀盐酸，除去剩余的二环基脲，然后蒸发除去溶剂，得到固体产物；

（3）用稀盐酸洗3～5次，然后加入乙酸乙酯，除去盐酸水溶液，旋转蒸发除去溶剂得到产物，即为二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯。

6.权利要求1～5任一所述方法制备得到的具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物。

7.权利要求6所述具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物在制备抑制神经细胞凋亡的药物中的应用。

8.权利要求6所述具有抑制神经细胞凋亡作用的金纳米粒复合物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。