CN107441041B - 一种包裹麦角甾苷mPEG-PLA纳米胶束复合物及其合成方法和应用 - Google Patents

一种包裹麦角甾苷mPEG-PLA纳米胶束复合物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包裹麦角甾苷mPEG‑PLA纳米胶束复合物及其合成方法和应用。首先采用开环聚合的方式合成mPEG‑PLA纳米胶束体系，然后在纳米胶束体系中加入天然活性药物麦角甾苷(ACT)，通过胶束反应，ACT被包裹在胶束体系的内部；再在胶束的外层包覆一层壳聚糖，通过静电吸附及光化学反应，将干扰α‑突触核蛋白的质粒DNA(pDNA)与靶向分子‑神经生长因子NGF接枝在纳米胶束的表面，合成得到纳米胶束复合物。该纳米胶束复合物，具有穿透血脑屏障的潜能和良好的生物相容性，对PC12神经细胞毒副作用小，实现细胞靶向运输并神经治疗药物与基因干扰协同作用治疗帕金森症，对帕金森症具有很好的治疗和抑制细胞凋亡的作用，在帕金森症的治疗和药物研发方面具有很好的应用前景。

Description

一种包裹麦角甾苷mPEG-PLA纳米胶束复合物及其合成方法和 应用
技术领域
本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种包裹麦角甾苷(ACT)mPEG-PLA纳米胶束复合物及其合成方法和应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是一种神经系统退行性障碍疾病，主要以中脑黑质纹状体的多巴胺能神经元退化和神经递质多巴胺的减少为主要特征。当多巴胺合成减少时，抑制乙酰胆碱的功能降低，两者失衡结果出现“震颤麻痹”。据统计，对于PD，年龄在45岁以下的发病率较低，75～85岁的发病率为3.1％，85岁以上的发病率达到了4.3％。针对PD主要有三种治疗的方法：1)手术治疗:通过移植多巴胺能神经元细胞，来降低用药量，但是并不能从根本上解决问题。2)药物治疗：左旋多巴胺、儿茶酚转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、酶抑制剂。然而，疾病的恶化是不可避免的，病人很快就会出现运动性障碍，如步伐紊乱、痴呆等。3)基因治疗:RNA干扰特定蛋白的表达，目前研究比较多。因为RNAi通过干扰基因转录为相应的蛋白而沉默特定基因，所以理论上来讲，任何基因都可以通过RNAi靶向沉默，这样就可以为治疗疾病提供一个巨大的前景。
基因治疗有三个主要的类型：1)选择性转染——载体携带着细胞凋亡基因选择性地进入癌细胞，而不会进入正常细胞；2)特异性表达——凋亡基因被转入正常细胞和癌细胞中，在癌细胞中特异性的表达，但是在正常细胞里不表达；3)靶向蛋白的分泌——基因进入细胞以后，能够分泌嵌合体蛋白，靶向癌细胞，从而使癌细胞凋亡。然而，在基因治疗的过程中，携带基因的载体需要克服三个主要的障碍：1)穿过细胞膜；2)保护并成功地释放基因；3)穿过核膜。所有这些障碍中，最关键的是载体携带的基因穿过核膜进入细胞核内进行表达，这是基因转染的限制性步骤。
基因治疗的非病毒载体，按其尺寸大小可以分为三类：纳米载体、微米载体和大尺寸载体。在过去的十几年里，金纳米粒子由于具有生物相容性好、合成简单、分散性好、易功能化、细胞内吞率高、循环半衰期长、易于渗透肿瘤细胞及特殊的化学惰性、表面特性、电子结构和光学特性，使它已经在诊断疾病、化疗、医学成像、热疗、新疫苗的设计、放疗、基因疗法等临床研究中成为一种理想的纳米载体。聚合物胶束是由亲水性外部和疏水核心组成，它的纳米级的尺寸，特定的功能吸引了世界范围内的众多科学研究者去研究这一药物载体。聚合物纳米胶束作为纳米载体，其载体能力相比于纳米颗粒，脂质体和替他纳米载体没有显著的降低。事实上，聚合物纳米胶束最广泛的研究在于作为运输载体在肿瘤及非肿瘤疾病的治疗。聚合物胶束属于类两亲性共聚物的聚合，并组装形成纳米级(1-200nm)尺寸。大多数情况下，胶束外壳主要是亲水性基团如聚乙二醇(PEG)，而内核主要是种类繁多的疏水性物质构成。外壳控制体内药代动力学性质，而内核负责药物滞留、稳定性和药物释放特性等。聚合物胶束的独特性在于，这些共聚物结构可以将表面疏水性药物封装在核心，而外壳表面可以根据需要进行修饰，设计或调整达到期望的功能属性。因此，聚合物胶束在药物输送和靶向方面就可以发挥巨大作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有PD治疗技术和药物的缺陷和不足，利益亲水性外部和疏水核心组成聚合物胶束，并在胶束的内部包裹药物麦角甾甘(ACT)，得到ACT-PLA-mPEG胶束体系；并且在胶束的表面包覆一层壳聚糖，从而能够通过静电吸附作用修饰上SNCA的沉默基因pDNA，去抑制SNCA的过表达，最后运用紫外光接枝技术，接枝上神经靶向分子神经生长因子NGF，最终合成得到一种对帕金森病具有显著疗效的包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物(ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF)，对帕金森模型的神经细胞的凋亡具有明显的抑制作用。本发明通过合成的纳米胶束复合物，在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，将干扰α-突触核蛋白的pDNA转染到细胞内，通过干扰α-突触核蛋白的合成来阻止神经细胞的凋亡，并通过天然药物ACT来对帕金森症进行整体的治疗。
本发明的目的是提供一种包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物及其制备方法。
本发明另一目的是提供所述纳米胶束复合物在帕金森症的治疗和药物研发方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物的制备方法，采用开环聚合的方式合成mPEG-PLA纳米胶束体系，在此基础上，在纳米胶束体系中加入天然活性药物麦角甾苷(ACT)，通过胶束反应，ACT被包裹在胶束体系的内部；并在此基础上，在胶束的外层包覆一层壳聚糖，通过静电吸附及光化学反应，将干扰α-突触核蛋白的质粒DNA(pDNA)与靶向分子-神经生长因子NGF接枝在纳米胶束的表面，合成得到纳米胶束复合物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF。
该纳米胶束胶束复合物，具有穿透血脑屏障的潜能和良好的生物相容性，对PC12神经细胞毒副作用小，对帕金森症具有很好的治疗和抑制细胞凋亡的作用。本发明的方案利用纳米胶束基因输运体系，通过纳米胶束体系与靶向分子NGF的作用将复合物本体系输运到细胞中，并在此基础上将神经治疗药物一起输运到细胞内，与基因干扰进行协同作用治疗帕金森症。
进一步具体地，本发明包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物的制备方法，包括如下步骤：
一种包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物(ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF纳米胶束复合物)的制备方法，采用开环聚合的方式合成mPEG-PLA纳米胶束体系，然后通过胶束反应将药物ACT包裹在胶束体系的内部；然后在胶束的外层包覆一层壳聚糖，通过静电吸附及光化学反应，将干扰α-突触核蛋白的质粒DNA与神经生长因子NGF接枝在纳米胶束的表面，合成得到纳米胶束复合物。
具体地，所述包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1.羧基化mPEG
mPEG与叔丁醇钾溶解在THF中，室温下搅拌反应，然后加入溴代乙酸乙酯继续搅拌反应，再回流反应后，溶液经减压蒸馏干燥，产物溶解在NaOH溶液中水解，得到羧基化的mPEG；
S2.合成ACT-PLA-mPEG纳米胶束
S21.将羧基化的mPEG和丙交酯溶解在甲苯中，加入催化剂进行反应；反应结束后冷却至室温，去除溶剂和未反应的丙交酯；然后萃取出mPEG-PLA共聚物，干燥后置于乙腈和甲醇中结晶，离心去除上清，产物干燥得到mPEG-PLA纳米胶束；
S22.将mPEG-PLA纳米胶束溶解在DMF/NS混合溶液中，并加入麦角甾苷的乙醇溶液，反应后进行透析，产物干燥得到ACT-PLA-mPEG纳米胶束；
S3.合成ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA纳米胶束复合物
S31.将ACT-PLA-mPEG纳米胶束溶解在PBS中得到纳米胶束溶液，将壳聚糖溶解在冰醋酸与四氢呋喃的混合液中得到壳聚糖溶液，两溶液混合后，加入脱水剂进行反应，蒸干溶剂得到ACT-PLA-mPEG-CTS；
S32.将带负电荷的pDNA与ACT-PLA-mPEG-CTS(包覆着壳聚糖的带有正电荷的纳米胶束)通过静电作用结合在一起，孵育获得ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA纳米胶束复合物；
S4.制备ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF纳米胶束复合物
将NGF溶解在PBS/DMF混合液中，在避光下加入叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，搅拌反应后纯化产物，用PBS溶解，然后加入ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA在紫外灯下反应，产物纯化得到终产物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF。
其中，优选地，步骤S1中，mPEG：叔丁醇钾：溴代乙酸乙酯的质量比＝1：30～50：30～35。
优选地，步骤S1中，mPEG：叔丁醇钾：THF：溴代乙酸乙酯：NaOH溶液＝1～3g：70～90mg：10～20ml：60～70mg：100ml。
最优选地，步骤S1中，mPEG：叔丁醇钾：THF：溴代乙酸乙酯：NaOH溶液＝2g：80mg：15ml：67mg：100ml。
优选地，步骤S1所述搅拌反应的时间为0.2～1h。
更优选地，步骤S1所述搅拌反应的时间为0.5h。
优选地，步骤S1所述继续搅拌反应的时间为0.8～2h。
更优选地，步骤S1所述继续搅拌反应的时间为1h。
优选地，步骤S1所述回流反应的时间为2～4h。
更优选地，步骤S1所述回流反应的时间为3h。
优选地，步骤S1所述减压蒸馏干燥的温度为60～80℃。
更优选地，步骤S1所述减压蒸馏干燥的温度为70℃。
优选地，步骤S1所述NaOH溶液的浓度为0.05～0.2M。
更优选地，步骤S1所述NaOH溶液的浓度为0.1M。
优选地，步骤S1所述水解是40～60℃条件下水解3～5h。
更优选地，步骤S1所述水解是50℃条件下水解4h。
优选地，步骤S21所述羧基化的mPEG和丙交酯的质量比为0.2～0.4：1.1～1.8。
最优选地，步骤S21所述羧基化的mPEG和丙交酯的质量比为0.3：1.6。
优选地，步骤S21所述丙交酯需经过真空干燥。
优选地，步骤S21所述催化剂为辛酸亚锡(Sn(Otc)2)或二月桂酸二丁基锡。
优选地，步骤S21所述羧基化的mPEG、丙交酯和催化剂的质量比为0.2～0.4：1.1～1.8：15～30。
最优选地，步骤S21所述羧基化的mPEG、丙交酯和催化剂的质量比为0.3：1.6：20。
优选地，步骤S21所述反应为100～130℃反应10～15h。
更优选地，步骤S21所述反应为120℃反应12h。
优选地，步骤S21中溶剂去除的方法是减压蒸馏抽去溶剂。
优选地，步骤S21中未反应的丙交酯的去除方法是加入冰水，在室温下搅拌，将未反应的丙交酯水解。
优选地，步骤S21中mPEG-PLA共聚物的萃取是用氯仿将mPEG-PLA共聚物萃取出来。
优选地，步骤S21所述离心是4000～8000rpm离心10～20min(最优选5000rpm离心15min)。
优选地，步骤S21中产物干燥的方式是真空干燥。
优选地，步骤S22所述DMF/NS混合溶液中DMF和NS的体积比为3～5：1。
更优选地，步骤S22所述DMF/NS混合溶液中DMF和NS的体积比为4：1。
优选地，步骤S22所述麦角甾苷的乙醇溶液中麦角甾苷的浓度为10～30μg/ml。
更优选地，步骤S22所述麦角甾苷的乙醇溶液中麦角甾苷的浓度为20μg/ml。
优选地，步骤S22中，mPEG-PLA纳米胶束、DMF/NS混合溶液和麦角甾苷的乙醇溶液的比例为0.5～0.6g：4～5ml：0.5～1ml。
优选地，最优选地，步骤S22中，mPEG-PLA纳米胶束、DMF/NS混合溶液和麦角甾苷的乙醇溶液的比例为0.6g：4ml：1ml。
优选地，步骤S22所述反应的时间为10～15h(最优选为12h)。
优选地，步骤S22所述透析是使用透析袋在4℃冰浴中进行透析。
优选地，步骤S22所述透析的时间为20～30h(最优选为24h)
优选地，步骤S22所述干燥是真空冷冻干燥。
优选地，步骤S31中ACT-PLA-mPEG纳米胶束和PBS的质量体积比为0.5～2g：100ml。
优选地，步骤S31中ACT-PLA-mPEG纳米胶束和PBS的质量体积比为1g：100ml。
优选地，步骤S31中冰醋酸与四氢呋喃的体积比为2～3：1(最优选为4：1)。
优选地，步骤S31中壳聚糖和冰醋酸与四氢呋喃的混合液的质量体积比为3～5mg/ml。
更优选地，步骤S31中壳聚糖和冰醋酸与四氢呋喃的混合液的质量体积比为4mg/ml。
优选地，步骤S31中纳米胶束溶液和壳聚糖溶液的体积比为1：4～6。
更优选地，步骤S31中纳米胶束溶液和壳聚糖溶液的体积比为1：5。
优选地，步骤S31所述脱水剂与壳聚糖的质量比为1：30～50(最优选为1：40)。
优选地，步骤S31所述反应的时间为10～15h(最优选为12h)。
优选地，步骤S32所述孵育是0～10℃下孵育20～40min。
更优选地，步骤S32所述孵育是4℃下孵育30min。
优选地，步骤S4所述NGF和PBS/DMF混合液的比例为1.5～2μg/ml。
更优选地，步骤S4所述NGF和PBS/DMF混合液的比例为1.8μg/ml。
优选地，步骤S4所述PBS/DMF混合液中的PBS和DMF的体积比为1：3～5。
更优选地，步骤S4所述PBS/DMF混合液中的PBS和DMF的体积比为1：4。
优选地，步骤S4所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5～6。
更优选地，步骤S4所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5.81。
优选地，步骤S4所述搅拌反应的条件为冰浴中搅拌反应40～55h(最优选48h)。
优选地，步骤S4所述紫外灯下反应的时间为8～15s(最优选为10s)。
优选地，步骤S4中产物纯化是用超滤管对产物进行纯化。
另外，由上述方法制备得到的纳米胶束复合物及其在制备帕金森症的治疗药物方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
综上所述，本发明采用开环聚合的聚合方式，将聚乙二醇(PEG)与真空干燥的丙交酯在甲苯中反应，并以二月桂酸二丁基锡为催化剂，催化聚合反应的发生，以合成mPEG-PLA纳米胶束；经过处理，在合成得到纳米胶束体系的基础上，向胶束体系中加入天然活性物质(ACT)，通过胶束的聚合包裹作用，将药物ACT包裹在胶束体系内部，得到mPEG-PLA包裹的ACT(mPEG-ACT-PLA)；并在此基础上，在胶束的表面通过脱水缩合修饰上一层带正电的壳聚糖，并且通过静电吸附和紫外光接枝的方式将干扰α-突触核蛋白的pDNA和靶向分子NGF接枝在胶束表面，完成纳米胶束复合物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF的合成。然后进行了傅里叶红外光谱、拉曼光谱、透射电镜、扫描电镜、琼脂糖凝胶电泳等系列的表征方式确认了产物的粒子形态及结构；并将该纳米胶束复合物作用于神经细胞，采用DAPI检测，流式细胞术等方法研究复合材料的生物学效应，实验验证显示，该纳米胶束复合物能够显著抑制帕金森模型的PC12神经细胞的凋亡。
在本发明的方案中，麦角甾苷(Acteoside，ACT)，又名毛蕊花糖苷或毛蕊花苷，是一种天然存在的水溶性化合物，广泛分布于植物界是苯乙醇苷类(PHGS)家族的一员。拥有丰富的活性，包括较强的抗氧化，抗炎活性并且调节细胞凋亡，但是其口服生物利用度比较低。有研究表明，麦角甾苷可以直接促进小鼠骨髓来源树突细胞增殖，而且与细胞因子有明显的协同作用。麦角甾苷对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的人骨髓神经母细胞瘤细胞株(SHSY5Y)有保护作用。研究表明帕金森病的发病机制与细胞凋亡有关，毛蕊花苷对MPP+致多巴胺能神经元损伤的保护作用可能具有抗帕金森的潜在功效，这可能为临床治疗神经退行性疾病带来新的希望。而α-synuclein是一个有140个氨基酸的蛋白质，在帕金森病的病理生理学中处于一个重要的地位，它的过表达对帕金森病的体内和体外模型都会产生毒性。最近的研究已经显示，严重的PD病人在中脑黑质纹状体处，α-突触核蛋白的mRNA含量增加。与此同时，早期和晚期的帕金森患者也是通过α-突触核蛋白的过表达程度进行区分的。另外，α-突触核蛋白的过表达在体外实验和体内实验中证明都是有毒的。这些现象说明，α-突触核蛋白的结构突变和表达水平上调导致了多巴胺能神经元细胞的死亡和退化。针对PD患者，通过靶向降低α-突触核蛋白表达的治疗策略，会影响多巴胺能神经元细胞死亡的过程。
本发明利用mPEG-PLA聚合物胶束的输运作用将具有神经元保护作用的麦角甾甘通过胶束包裹输运到神经元处，并通过静电吸附作用，吸附对表达α-syn的基因SNCA有沉默作用的pDNA，然后接枝上神经细胞的靶向受体因子—神经生长因子NGF，从而完成具有良好生物相容性的治疗帕金森症的mPEG-PLA纳米胶束复合物粒子的构建。
本发明具有以下有益效果：
本发明成功合成了一种包裹麦角甾甘的mPEG-PLA纳米胶束胶束复合物，粒径在100nm左右，粒度适中，电位稳定，且经过电镜检测得到空腔形态和链状结构，具有穿透血脑屏障的潜能。
该纳米胶束复合物具有良好的生物相容性，对PC12神经细胞毒副作用小，对帕金森症具有很好的治疗和抑制细胞凋亡的作用，在帕金森症的治疗和药物研发方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物的合成示意图。
图2为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物的粒度分析。
图3为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物的紫外分析。
图4为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物的红外分析。
图5为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束复合物的电位分析。
图6为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束的透射电镜形貌分析。
图7为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束pDNA的接枝率分析。
图8为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束各阶段产物的对细胞活力影响分析。
图9为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束对帕金森体外细胞模型治疗后细胞形态分析。
图10为本发明包裹麦角甾甘的纳米胶束对帕金森体外细胞模型治疗后流式细胞术分析。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例所涉及的材料、试剂与仪器如下：
细胞株：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞系)由暨南大学医学院提供，经本实验室传代培养。
主要试剂：神经生长因子(NGF)，购自广州新特药店；干扰质粒购自上海基凯基因公司；胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。聚乙二醇单甲醚2000；丙交酯；麦角甾甘；溴代乙酸乙酯；二甲基甲酰胺(DMF)；四氢呋喃(THF)；甲苯；乙腈；甲醇；冰醋酸；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；二月桂酸二丁基锡。
仪器：德国LEO公司场发射扫描电镜:LEO 1530VP,Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。
实施例1 ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF纳米胶束复合物的制备
1、合成示意图如附图1所示，本发明将聚乙二醇(PEG)与真空干燥的丙交酯在甲苯中反应，并以二月桂酸二丁基锡为催化剂，催化聚合反应的发生，以合成mPEG-PLA纳米胶束，经过处理，在合成得到纳米胶束体系的基础上，向胶束体系中加入天然活性物质ACT，通过胶束的聚合包裹作用，将药物ACT包裹在胶束体系中，得到mPEG-PLA包裹的ACT(mPEG-ACT-PLA)，在此基础上完成之后，在胶束的表面通过脱水缩合修饰上一层带正电的壳聚糖，并且通过静电吸附和紫外光接枝的方式将干扰α-突触核蛋白的pDNA和靶向分子NGF接枝在胶束表面，完成纳米胶束复合物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF的合成。
2、具体地，所述纳米胶束复合物的制备方法如下：
(1)mPEG的羧基化：
mPEG2000 2g与叔丁醇钾80mg溶解在15ml THF中，室温下搅拌反应0.5h，然后加入67mg溴代乙酸乙酯继续搅拌反应1h，回流3h。溶液在70℃减压蒸馏干燥。将产物溶解在100ml(0.1M)的NaOH中，50℃条件下水解4h，得到羧基化的mPEG2000。
(2)ACT-PLA-mPEG纳米胶束的合成：
1)羧基化的mPEG2000 0.3g和真空干燥的丙交酯1.6g，溶解在15ml甲苯中。然后加入20mg的催化剂辛酸亚锡(Sn(Otc)2)(可替换为二月桂酸二丁基锡)，于120℃反应12h。反应结束，将混合物冷却至室温，减压蒸馏抽去溶剂。加入冰水，在室温下搅拌，将未反应的丙交酯水解。然后用氯仿将mPEG-PLA共聚物萃取出来。干燥后的共聚物置于乙腈和甲醇中结晶，然后5000rpm离心15min，弃去上层清液，得到的颗粒进行真空干燥，得到产物mPEG-PLA纳米胶束。
2)将上述得到的mPEG-PLA纳米胶束产物0.6g溶解在4ml DMF/NS混合溶液(体积比DMF：NS＝4：1)中，并向其中加入20μg/ml浓度的麦角甾苷的乙醇溶液1ml，反应12h。然后用MD＝5000的透析袋在4℃冰浴中进行透析，24h后真空冷冻干燥得到目标产物ACT-PLA-mPEG。
(3)ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA纳米胶束复合物的合成：
1)ACT-PLA-mPEG-CTS的制备：将上述合成得到的产物ACT-PLA-mPEG的冻干粉0.1g在10ml PBS中溶解，将200mg的壳聚糖CTS溶解在50ml冰醋酸与四氢呋喃(体积比4：1)的混合液中，两溶液混合；加入5mg的脱水剂EDC后反应12h，蒸干溶剂，得到产物。
2)带负电荷的shRNA与包覆着壳聚糖的带有正电荷的纳米胶束通过静电作用结合在一起，在4℃下孵育30min，即获得ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA。
(4)ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF纳米胶束复合物的制备：
将9μg的NGF溶解在5ml的PBS/DMF(体积比1：4)混合液中，在避光下加入5.81μg的叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，冰浴中搅拌反应48h；用超滤管对产物进行纯化后，加入2ml的PBS溶解得到NGF-AAH的混合物溶液。
然后将合成的ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA与NGF-AAH的混合物溶液在紫外灯下反应10s，并用超滤管对产物进行纯化，得到终产物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF。
实施例2 ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF纳米胶束复合物的表征
本实施例对实施例1制备的产品进行表征。
1、粒径分析——纳米粒度检测
通过粒径分析仪表征分析：将各步的合成产物mPEG-PLA，ACT-PLA-mPEG和ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA，ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF分别稀释到适当的浓度。然后将以上样品用注射器分别加入到干净的样品池里，塞上塞子，放入马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器中检测。
结果如图2所示。mPEG-PLA的粒径大小范围为60nm～120nm，分布均匀，其中30％的纳米胶束聚集在75nm附近。用该胶束包裹了ACT后，粒径分布显示聚合物大小范围为200nm～300nm，27％的纳米聚合物集中在350nm附近，初步反映包裹了ACT的mPEG-PLA胶束粒径大小适中，分布均匀。在胶束表面通过静电吸附作用接枝了pDNA之后，纳米胶束粒子的粒度范围相比较于未接枝pDNA的纳米胶束粒子增幅不大，均在控制范围之内。而在通过紫外光接枝技术将神经生长因子NGF接枝在表面之后，纳米胶束粒子的粒度具有小幅增大，但还是在可控范围之内。通过整个纳米胶束粒子各个阶段的粒度分析表明，纳米胶束粒子的粒度均在我们的控制之内，具备穿透血脑屏障的潜能。
2、紫外分析——紫外光谱(UV)检测
通过紫外可见分光光度计，在200～900nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。将上述样品干燥，配成相应浓度溶液，然后以分散剂水为参比液，分别取适量的样品于比色皿中，在200～900nm的范围内进行光谱扫描检测。
结果如图3所示。mPEG-PLA的紫外吸收峰值出现在280nm左右，表现为K吸收峰，由含共轭双键的基团产生，是mPEG-PLA中的羰基对紫外光进行吸收引起的。ACT的结构中含有2个苯环，增色基团较多，对紫外吸收量较大，因此吸收峰值出现在336nm附近。对照ACT-PLA-mPEG紫外吸收光谱，可以看到吸收光发生了红移，在ACT最大吸收峰附近及360nm附近均出现了吸收峰，因此ACT已成功与mPEG-PLA胶束结合，其增色基团使分子的紫外吸收发生了整体的红移。
3、红外分析——红外光谱(FTIR)检测
为进一步了解接枝情况，证明各中间产物在反应过程中被成功合成，利用傅立叶转换红外光谱仪(Vector-33，德国Bruker公司)进行表征。
将mPEG-PLA，ACT，ACT-PLA-mPEG和ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。
结果如图4所示。mPEG-PLA谱图在1758.4cm-1以及1114.4cm-1出现吸收峰，分别是C＝O与C-O-C的伸缩变动引起的吸收峰，显示mPEG与PLA在DY-12的催化下开环聚合形成酯；ACT-PLA-mPEG与ACT的谱图吸收峰强度与出现位置相似，ACT-PLA-mPEG谱图在3702.2cm-1，3098.4cm-1，1790.6cm-1，1678.2cm-1出现四个吸收峰，由-OH，C＝C，C＝O，苯环伸缩变动产生，均为ACT的特征基团，显示ACT成功与mPEG在DMF的催化下成功进行脱水缩合，同时在与ACT-PLA-mPEG聚合的过程当中发生聚集，将ACT-PLA-mPEG包裹在内；ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA的谱图比ACT的特征谱区多了一些侧峰，包括1499.4cm-1与1197.6cm-1，分别为-NH-何C-O-C伸缩变动引起，显示壳聚糖通过脱水缩合作用于胶束形成了氨酰基，ACT-PLA-mPEG-CTS成功合成。
4、电位分析——Zeta电位检测
为了进一步证明成功合成了mPEG-PLA、ACT-PLA-mPEG、ACT-PLA-mPEG-CTS、ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA，通过马尔文Zetaszier Nano-ZS仪分别测定了mPEG-PLA、ACT-PLA-mPEG、ACT-PLA-mPEG-CTS、ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA的zeta电位。
将各步的合成产物mPEG-PLA，ACT，ACT-PLA-mPEG和ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA，ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF分别稀释到适当的浓度。然后将以上样品用注射器分别加入到干净的样品池里，塞上塞子，放入马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器中检测。
结果如图5所示，其中ACT-PLA-mPEG的电位为-15mv左右，mPEG-PLA，ACT-PLA-mPEG的电位相差无几，均呈现负电位。因此，ACT与mPEG-PLA反应后发生一定的电子转移，使胶束整体呈现较强的负电位。当CTS包裹在胶束外后，呈现出CTS自身的电位，因而胶束电位强度有所降低，从而证明了ACT与mPEG-PLA发生了脱水反应聚合在一起，另外CTS也成功包裹在聚合物胶束外，并能包埋一定的pDNA。
5、透射电镜形貌分析
为了表征合成的纳米胶束粒子及其复合物的形貌，采用透射电镜对纳米胶束粒子的形貌进行分析。把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像将在放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、以及感光耦合组件)上显示出来。
结果如图6所示，可以很清楚的看到合成的胶束大小在100nm左右，且形成了空腔，胶束整体呈现链状的近球形形态。在经过胶束包裹了药物麦角甾甘之后，可以发现纳米胶束粒子的粒度有所下降，在胶束粒子的中间有麦角甾甘的存在；而后我们在胶束表面接枝了沉默基因pDNA之后，纳米胶束粒子的粒度变化不大，并且呈现很明显的双层壳状结构；纳米胶束粒子在通过紫外光接枝技术接枝了神经生长因子，并进行透析之后，胶束体系的分散度更高。在整个合成过程中，胶束体系整体的粒度范围均在100nm左右，是我们希望得到的结果，这样的结果有利于纳米胶束突破血脑屏障，从而深入治疗帕金森症。
6、接枝率的测定——pDNA包封率的检测
通过紫外分光光度计对接枝前后的pDNA浓度进行测定，取一定体积的pDNA溶液，加MiliQ水稀释3倍后，用紫外分光光度法在波长为260nm下测定吸光度A，按照A＝1时，C＝50μg/ml及稀释倍数来计算出pDNA的浓度，先测定出纳米胶束溶液制备体系中剩余的游离pDNA的含量，然后根据投料量来计算pDNA的接枝率。设定反应前投料的pDNA溶液在260nm处的吸光度为A1，其浓度为W1，而反应后溶液中游离的pDNA浓度测得的在260nm处的吸光度为A2，浓度为W2。
则接枝率为：
结果如图7所示，由测得的数据得：纳米胶束溶液制备体系中剩余的游离pDNA的吸光度为0.58549；投料量的pDNA吸光度为0.69802。根据接枝率公式W1＝50×0.69802×3＝104.70μg/ml，W2＝50×0.58549×3＝87.82μg/ml，所以接枝率的结果为(104.70-87.82)/104.7×100％＝16.13％。
根据公式测得的pDNA在胶束上的接枝率为16.13％，而根据含量计算得知，其在胶束的表面的接枝含量在17μg(可以达到我们所需要的作为沉默α-syn的量)，远大于文献中提到的10μg。这也预示着本发明的方案会有更好的效果。
实施例3细胞实验
1、PC12神经细胞培养
(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
(3)离心，1000rpm，5min；
(4)弃去上清液，用含有10％胎牛血清的1640培养基培养，环境相对湿度为95％、CO2含量为5％，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。
(5)每两天换一次液，继续培养，2-3天传一次代一般一传三。
2、MTT细胞毒性分析
(1)MTT检测细胞活力，方法如下：
①收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至104每孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
②5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入各个合成阶段的药物，在前一天下午铺板，次日上午加药。每孔100μl，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反映真实情况。将最佳时间段药物释放的溶液，经0.22μm的过滤膜过滤除去菌体。
③5％CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。
④每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
⑤终止培养，小心吸去孔内培养液。
⑥每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。
⑦同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
(2)结果
通过对所合成的mPEG-PLA胶束体系复合物在体外环境下，对细胞的作用影响分析，结果如图8所示，mPEG-PLA对于细胞活力具有一定的影响，作用细胞之后，细胞活力只有45％左右。纳米胶束mPEG-PLA本身为电中性，对于细胞生长可能存在着一定的影响。而在纳米胶束内部包裹上药物麦角甾甘，作用细胞之后，细胞活力所受影响更大，其OD值降到了30％以下。而在胶束表面进行沉默基因pDNA的接枝之后，细胞的活力有所改善，但仍然比单纯的mPEG-PLA所得到的细胞OD值要小。在继续通过紫外光接枝技术接枝了神经生长因子NGF，得到的产物ACT-PLA-mPEG-pDNA-NGF作用于细胞后，我们所用的胶束体系复合物对于细胞的活力影响均比较大，均在45％左右。说明胶束体系对于细胞的影响作用整体上呈现出较大的影响，但在各阶段的产物中，接枝了沉默因子pDNA和神经生长因子NGF之后，其对于细胞的毒性影响还是受到了一定的抑制，较之单独的未接枝的情况还是会有一定的改善。这也符合我们的预期要求。
3、DAPI染细胞后形态观察
(1)在使用MPP+对PC12神经细胞建立帕金森症细胞模型的基础上，运用mPEG-PLA的胶束复合物对细胞的帕金森症模型进行治疗修复，治疗前后的PC12神经细胞形态用DAPI荧光染色，并用明场和DAPI荧光显微镜进行拍照。具体方法如下：
将处于对数生长期的PC12神经细胞，以5×104个/孔的细胞密度接种到24孔培养板中。然后分别加入MPP+侵染PC12神经细胞24h，将培养板里的培养基弃去，再加入各阶段合成的胶束复合物对帕金森症细胞进行治疗24h。用PBS洗3次；每孔中加入4％多聚甲醛，室温下固定30min；用PBS洗3次，向每孔中加入0.2％Triton X-100透化30min；再用PBS洗3次；避光向每孔中加入DAPI(20μg/ml)20μL，染核5min，再用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察呈现蓝色的细胞核。
(2)结果如图9所示。在图9中，Control组经过PBS处理后，PC12神经细胞形态未发生明显的变化，细胞核也相对完整；而在MPP+建立的帕金森症模型中，细胞发生碎裂、凋亡，且细胞核也发生破裂和不完整。在经过单纯的mPEG-PLA胶束治疗后，细胞形态未见明显改善，细胞核形态恢复情况可见，但不明显，细胞呈现即将碎裂的状态。在包裹了ACT之后，细胞恢复情况较之单纯的mPEG-PLA胶束的情况类似，但细胞核形态具有明显的改善，这和ACT药物对于神经细胞的治疗作用有关；而在接枝了pDNA之后，细胞状态明显改善，细胞核也变得更加完整，这说明ACT药物和pDNA的双重治疗效果对于帕金森症细胞模型的治疗作用还是明显的。最后经过完整的胶束复合物治疗后，由于神经生长因子NGF的接枝，对于帕金森症细胞模型的治疗效果显著，细胞恢复效果明显，细胞核基本恢复完整性。通过明场下和DAPI染核观察细胞形态之后，证明胶束复合物各阶段的合成产物对于帕金森症体外细胞模型的治疗都有一定的效果，尤其是在接枝了沉默基因pDNA和神经生长因子NGF，治疗效果更加显著，基本达到了对于帕金森症的治疗目的。
4、流式双染色检测细胞凋亡
(1)在MPP+作用PC12神经细胞建立帕金森症细胞模型之后，再用纳米氧化镁复合物对细胞的帕金森症模型进行治疗，具体方法如下：
将处于对数生长期的PC12神经细胞，以5×105个/孔的细胞密度接种到6孔培养板中。然后分别加入MPP+侵染PC12神经细胞24h，将培养板里的培养基弃去，再加入各阶段合成的胶束复合物对帕金森症细胞进行治疗24h。收集细胞，离心去除培养基。向每个样管里面加入200μl的Binding buffer混匀，再加入5μl Annexin V-FITC，室温下避光孵育10min；离心弃去上清，加入200μl的Binding buffer混匀，并加入5μl的PI，直接用细胞流式仪检验细胞的凋亡情况。
(2)得到了初步的治疗结果。结果如图10所示。在图10中，Control组细胞未经任何处理，只在培养基中加入与药物等量的PBS，其细胞凋亡最少。而在模型组中，未经纳米胶束复合物药物处理的细胞组凋亡明显，凋亡率是各组中最高的。PC12神经细胞经过空白胶束mPEG-PLA处理后，与单纯的帕金森模型组相比，PC12细胞的凋亡稍微有所改善，细胞的凋亡得到了初步的抑制。在胶束包裹了神经保护药物麦角甾甘ACT之后，ACT-PLA-mPEG组的帕金森症细胞的凋亡被抑制，凋亡率相比于之前的两组有了降低，早期凋亡部分也见明显的减少。这说明药物ACT对于神经细胞的帕金森症模型具有一定的治疗作用。而在用接枝了pDNA的纳米胶束复合物ACT-PLA-mPEG-pDNA组处理细胞之后，细胞凋亡得到明显的抑制，凋亡率明显的下降且早期凋亡明显下降，药物和pDNA在这一过程起到明显的效果，通过ACT和pDNA的双重作用，将因MPP+导致的帕金森症神经细胞的凋亡进行极大的恢复。在接枝了神经生长因子NGF之后，ACT-PLA-mPEG-pDNA-NGF组的帕金森症细胞凋亡的抑制作用进一步加强，强于单纯接枝pDNA组，细胞凋亡率最低，且明显未见早期凋亡，说明早期帕金森模型的细胞凋亡在治疗过程中都得到了恢复。相较于Control组，凋亡率略高，但仍然具有明显的抑制帕金森症PC12神经细胞凋亡的作用。

Claims (10)

1.一种包裹麦角甾苷的纳米胶束复合物的制备方法，其特征在于，采用开环聚合的方式合成mPEG-PLA纳米胶束体系，然后通过胶束反应将药物麦角甾苷ACT包裹在胶束体系的内部；然后在胶束的外层包覆一层壳聚糖，通过静电吸附及光化学反应，将干扰α-突触核蛋白的质粒DNA与神经生长因子NGF接枝在纳米胶束的表面，合成得到纳米胶束复合物，其中，所述神经生长因子NGF接枝在纳米胶束的表面的反应条件是在紫外灯下反应接枝。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.羧基化mPEG
mPEG与叔丁醇钾溶解在THF中，室温下搅拌反应，然后加入溴代乙酸乙酯继续搅拌反应，再回流反应后，溶液经减压蒸馏干燥，产物溶解在NaOH溶液中水解，得到羧基化的mPEG；
S2.合成ACT-PLA-mPEG纳米胶束
S21.将羧基化的mPEG和丙交酯溶解在甲苯中，加入催化剂进行反应；反应结束后冷却至室温，去除溶剂和未反应的丙交酯；然后萃取出mPEG-PLA共聚物，干燥后置于乙腈和甲醇中结晶，离心去除上清，产物干燥得到mPEG-PLA纳米胶束；
S22.将mPEG-PLA纳米胶束溶解在DMF/NS混合溶液中，并加入麦角甾苷的乙醇溶液，反应后进行透析，产物干燥得到ACT-PLA-mPEG纳米胶束；
S3.合成ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA 纳米胶束复合物
S31.将ACT-PLA-mPEG纳米胶束溶解在PBS中得到纳米胶束溶液，将壳聚糖溶解在冰醋酸与四氢呋喃的混合液中得到壳聚糖溶液，两溶液混合后，加入脱水剂进行反应，蒸干溶剂得到ACT-PLA-mPEG-CTS；
S32.将带负电荷的pDNA与ACT-PLA-mPEG-CTS通过静电作用结合在一起，孵育获得ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA纳米胶束复合物；
S4.制备ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF 纳米胶束复合物
将NGF溶解在PBS/DMF混合液中，在避光下加入叠氮苯胺盐酸盐，搅拌反应后纯化产物，用PBS溶解，然后加入ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA在紫外灯下反应，产物纯化得到终产物ACT-PLA-mPEG-CTS-pDNA-NGF。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，mPEG：叔丁醇钾：溴代乙酸乙酯的质量比=1：30～50：30～35。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S21所述羧基化的mPEG和丙交酯的质量比为0.2～0.4：1.1～1.8。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S22所述DMF/NS混合溶液中DMF和NS的体积比为3～5：1；所述麦角甾苷的乙醇溶液中麦角甾苷的浓度为10～30μg/ml。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S22中，mPEG-PLA纳米胶束、DMF/NS混合溶液和麦角甾苷的乙醇溶液的比例为0.5～0.6g：4～5ml：0.5～1ml。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S31中纳米胶束溶液和壳聚糖溶液的体积比为1：4～6。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述NGF和叠氮苯胺盐酸盐的质量比为9：5～6。
9.根据权利要求1～8任一所述方法制备得到的纳米胶束复合物。
10.权利要求9所述纳米胶束复合物在制备帕金森症的治疗药物方面的应用。
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