CN110066395A - 基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用，包括聚合物、接枝二氢卟吩的透明质酸和PD‑L1单克隆抗体，所述聚合物的结构式为该聚合物的数均分子量为2000～6000，m与n比为1:8～15。本公开提供的纳米组装体能够实现加强抗原呈递阶段、淋巴细胞活化增殖分化阶段和肿瘤清除一体化联合治疗。

Description

基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用
技术领域
本公开涉及医药技术领域，具体涉及基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
据报道，在癌症相关死亡病例中，约90％的癌症患者死于恶性肿瘤转移。恶性黑素瘤是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤，常见于皮肤，亦见于黏膜、眼脉络膜等部位。黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，非常容易出现远处转移。目前，经典的癌症治疗方法，如手术切除、化疗和放疗，对晚期黑色素瘤转移的疗效都非常有限。随着对肿瘤免疫学研究的深入，免疫疗法逐渐成为一种极具潜力的抗肿瘤疗法。肿瘤免疫治疗通过激活或重新激活免疫系统，让免疫细胞识别杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生存。从理论上讲，每一种临床上可检测到及临床相关肿瘤均可通过免疫系统消除。然而，免疫治疗的实际效果差强人意，这主要是因为免疫应答是一个复杂的多环节连续的过程，包括抗原呈递阶段，淋巴细胞活化增殖分化阶段和肿瘤清除阶段。因此，免疫应答的任何环节出现问题，其抗癌活性将会大打折扣。以PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法为例说明：PD-1(T细胞表面程序性死亡受体1)和PD-L1(肿瘤细胞表面程序性死亡配体1)是两个与免疫逃逸相关的免疫检查点，PD-1与PD-L1结合后会向T细胞传导抑制性信号，抑制T细胞活性。通过相应的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1通路，可以消除这一免疫抑制，使T细胞恢复活性，从而提高抗肿瘤免疫效力。然而，据本公开发明人所知，目前的临床应用中，针对PD-1/PD-L1通路的单抗仍存在许多局限性，其中最大的障碍即为治疗响应率低(仅20％)。
发明内容
经本公开发明人研究发现，导致PD-1/PD-L1通路单抗局限性的主要原因是利用单抗药物阻断PD-1/PD-L1通路从而防止肿瘤细胞逃逸免疫细胞查杀这一机制的成功实现需要依赖抗原的识别与提呈过程以及淋巴细胞的活化增殖分化过程。如果免疫系统对肿瘤细胞的抗原呈递过程出现差错，或者T淋巴细胞无法正常增殖分化，那么即使充分阻断了PD-1/PD-L1通路，也无法对肿瘤进行充分的查杀。因此研究如何更为有效的激活免疫系统是如今肿瘤免疫领域的重点研究对象。就意味着只有加强免疫应答全过程才能对完成对癌症的绝杀。然而，在一个纳米平台中实现这些目标是非常具有挑战性的。这是因为在不同阶段起作用的免疫药物具有不同的靶位点：能够增强抗原呈递的肿瘤疫苗靶向树突细胞，能够增强T细胞增殖的免疫小分子抑制剂，如吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)通路抑制剂1-甲基-D-色氨酸(1-mt)作用靶点位于肿瘤细胞基质，但是，在效应期起作用的抗PD-L1mAb(aPD-L1)的靶标位于肿瘤细胞膜上。因此，同时递送靶向不同类型细胞或甚至细胞不同部位的免疫治疗药物并且使其各司其职互不干扰地是非常困难的。所以需要建立一种同时加强抗原呈递阶段、淋巴细胞活化增殖分化阶段和肿瘤清除这三部分的一体化联合治疗纳米平台。此外，大多数现有的肿瘤免疫制剂均采用瘤内注射，其临床可行性差、依从性低、伤口面积大并且生理疼痛严重。
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用，该纳米组装体能够实现加强抗原呈递阶段、淋巴细胞活化增殖分化阶段和肿瘤清除一体化联合治疗。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物，其结构式如下：
该聚合物的数均分子量为2000～6000，m与n比为1:8～15。该聚合物记为PLL-1-mt。
另一方面，一种上述聚合物的制备方法，采用叔丁氧羰基将1-甲基-D-色氨酸的氨基进行保护获得Boc-1-mt，Boc-1-mt的羧基与聚赖氨酸的部分伯胺基团进行缩合反应获得Boc-1-mt-PLL，将Boc-1-mt-PLL中的叔丁氧羰基脱除，获得聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物。
第三方面，基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体，包括上述聚合物、接枝二氢卟吩的透明质酸(HA-Ce6)和PD-L1单克隆抗体(aPD-L1)。
第四方面，上述纳米组装体的制备方法，将上述聚合物的水溶液加入至接枝二氢卟吩透明质酸的水溶液中，混合均匀后获得聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的纳米复合物HC/PM，将PD-L1单克隆抗体的溶液滴加至搅拌的HC/PM的溶液中，获得纳米组装体，即为aPD-L1@HC/PM纳米复合物。
第五方面，一种上述纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本公开的有益效果为：
(1)本公开首次合成聚赖氨酸共价连接1-甲基-D-色氨酸(PLL-1-mt)，该分子了解决了1-mt极性大，膜通透性差，在体内易被代谢失活等缺点。
(2)本公开制得的纳米静脉制剂为aPD-L1@HC/PM纳米球，无需添加BSA稳定剂，载药量高，可稳定存在20天以上，无形态改变。
(3)本公开的aPD-L1@HC/PM纳米组装体在光照后对肿瘤细胞显示较强的细胞毒性，且HA和PLL作为载体材料生物相容性好，毒性低，表现为没有近红外光照射时，细胞毒性较低为增强体内抗肿瘤选择性提供可能。
(4)本公开的aPD-L1@HC/PM纳米组装体利用免疫治疗和光疗联合治疗，加强了免疫应答的三个步骤，解除了肿瘤免疫抑制的环境，提高了体内抗肿瘤效力。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例2的核磁图谱；
图2为本公开实施例4的aPD-L1@HC/PM分别于1天、5天、10天和20天外观形态照片；
图3为本公开实施例4表征的aPD-L1@HC/PM形态的透射电镜照片；
图4为本公开实施例5的aPD-L1@HC/PM体外细胞毒性实验表征图；
图5为本公开实施例6的aPD-L1@HC/PM体内抗肿瘤活性实验表征图，左图为肿瘤体积曲线，右图为肿瘤重量柱状图和肿瘤抑制率表征图，1为生理盐水作为对照组，2为1-mt治疗组，3为aPD-L1治疗组，4为Ce6治疗组，5为HC/PM治疗组，6为HC/PM+aPD-L1治疗组，7为PD-L1@HC/PM治疗组。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于同时递送靶向不同类型细胞或甚至细胞不同部位的免疫治疗药物并且使其各司其职互不干扰非常困难，为了解决如上的技术问题，本公开提出了基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体及其制备方法与应用。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物，其结构式如下：
该聚合物的数均分子量为2000～6000，m与n比为1:8～15。该聚合物记为PLL-1-mt。
本公开的另一种实施方式，提供一种上述聚合物的制备方法，采用叔丁氧羰基将1-甲基-D-色氨酸的氨基进行保护获得Boc-1-mt，Boc-1-mt的羧基与聚赖氨酸的部分伯胺基团进行缩合反应获得Boc-1-mt-PLL，将Boc-1-mt-PLL中的叔丁氧羰基脱除，获得聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物。
该实施方式的一种或多种实施例中，对氨基进行保护的步骤为：将1-甲基-D-色氨酸、NaHCO3和二碳酸二叔丁酯溶解后，将溶液冷却至-1～0℃，然后升温至室温进行反应，反应后获得Boc-1-mt。
本公开中所述的室温是指室内的温度，为15～30℃。
该系列实施例中，溶解采用的溶剂为水与四氢呋喃的混合物。当水与四氢呋喃的体积比为1:0.9～1.1时，对1-甲基-D-色氨酸、NaHCO3和二碳酸二叔丁酯的溶解效果最好。
该系列实施例中，溶液冷却至-1～0℃，并保温9～11min。
该系列实施例中，升温至室温，在室温下进行反应的时间为22～26h。
为了获得更为纯净的Boc-1-mt，该系列实施例中，反应结束后，去除溶剂获得含有产品的水溶液，向水溶液中添加盐酸至pH为1.0～1.1，采用乙酸乙酯进行萃取，去除水层获得乙酸乙酯层，将乙酸乙酯去除后获得Boc-1-mt。
该实施方式的一种或多种实施例中，进行缩合反应的步骤包括：
将N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和Boc-1-mt进行反应获得活性中间酯；
将聚赖氨酸溶液的pH调节至10，然后加入所述活性中间酯，再调节pH至10，进行反应获得Boc-1-mt-PLL。
该系列实施例中，获得活性中间酯的过程为：将N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解与无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入Boc-1-mt，室温下反应3.5～4.5h，获得Boc-1-mt。Boc-1-mt可以不经过纯化，直接使用。
该系列实施例中，聚赖氨酸与Boc-1-mt的质量比为1:0.6～1.2。聚赖氨酸与Boc-1-mt的质量比1:0.9时，效果更好。
该系列实施例中，聚赖氨酸溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和水的混合物。为简化实验过程，采用N,N-二甲基甲酰胺和水的体积比为1:1的混合物作为溶剂。
该系列实施例中，获得Boc-1-mt-PLL的反应时间为40～50h。
为了获得更为纯净的Boc-1-mt-PLL，将反应后的含有Boc-1-mt-PLL的物料依次用等体积比的N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液和去离子水进行透析，透析液通过0.45mm膜过滤，然后冻干得目标产物Boc-1-mt-PLL。
该实施方式的一种或多种实施例中，脱除叔丁氧羰基的步骤为：Boc-1-mt-PLL在室温下溶解在三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，室温反应，用去离子水水透析后通过冷冻干燥。
该系列实施例中，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:5～12。当三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:9时，透析效果更好。
本公开的第三种实施方式，提供了基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体，包括上述聚合物、接枝二氢卟吩的透明质酸(HA-Ce6)和PD-L1单克隆抗体(aPD-L1)。
本公开的第四种实施方式，提供了上述纳米组装体的制备方法，将上述聚合物的水溶液加入至接枝二氢卟吩透明质酸的水溶液中，混合均匀后获得聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的纳米复合物HC/PM，将PD-L1单克隆抗体的溶液滴加至搅拌的HC/PM的溶液中，获得纳米组装体，即为aPD-L1@HC/PM纳米复合物。
该实施方式的一种或多种实施例中，混合均匀的方式采用超声。
该实施方式的一种或多种实施例中，聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的质量比为1:3.5～5。当聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的质量比为1:4时，效果更好，纳米混悬液保20天后，形态保持原有状态。
本公开的第五种实施方式，提供了一种上述纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本公开所述的肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤(癌症)，癌症包括但不限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌等。
本公开所述的抗肿瘤方式包括化疗法、光疗法、免疫疗法的一种或多种。
本公开所述的抗肿瘤药物还包括但不限于烷化剂、生物碱类药物、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类药物。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1：PLL-1-mt分子合成。
1)1-甲基-D-色氨酸氨基的Boc保护(Boc-1-mt)：用分析天平精密称取1-甲基-D-色氨酸，NaHCO3和二(叔丁基)二碳酸酯溶于体积比为1:1的水四氢呋喃混合溶液中，并将混合物在0℃搅拌10分钟，然后在室温下保持24小时。反应结束后，旋干THF，水层用1M HCl酸化至pH1.0，然后用乙酸乙酯萃取。蒸发乙酸乙酯，得到乳白色固体即为目标产物Boc-1-mt。
(2)合成Boc-1-mt活性中间酯(Boc-1-mt-NHS ester1)：将一定量N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解到无水DMF中，加入Boc-1-mt。将反应混合物在室温下搅拌4小时，其可不经进一步纯化而使用。
(3)合成Boc保护的1-甲基-D-色氨酸大分子前药(Boc-1-mt-PLL)：将一定量聚赖氨酸溶解在等体积的N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中。使用1M氢氧化钠溶液将聚赖氨酸溶液的pH调节至10。将上述(2)混合溶液缓慢滴加到聚赖氨酸溶液中，再次将反应混合物的pH调节至10。将反应混合物在室温下搅拌48小时。反应结束后，依次用等体积比的N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液和去离子水进行透析，透析液通过0.45mm膜过滤，然后冻干得目标产物Boc-1-mt-PLL。
(4)脱保护得(PLL-1-mt):将一定量Boc-1-mt-PLL在室温下溶解在10％三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，室温反应1小时，用去离子水水透析后通过冷冻干燥获得产物。反应得到PLL-1-mt，为乳白色固体。
实施例2：核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定PLL-1-mt分子化学结构。
分别称取PLL-1-mt前药约5mg，重水(D2O)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱测定其核磁共振氢谱图，以四甲基硅烷为内标物，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中同时出现PLL和1-mt的特征峰。通过1H-NMR谱图可以证实PLL-1-mt分子的成功合成。通过对PLL的核磁分析，得出m+n为44，通过紫外光谱分析，得出m为4，n为40。
实施例3：aPD-L1@HC/PM纳米静脉制剂的制备。
精密称取HA-Ce6分子2mg，溶解在1.5mL水中，同时精密称取PLL-1-mt分子0.5mg，溶解在0.5mL水中。在超声条件下，将PLL-1-mt水溶液滴加到HA-Ce6水溶液中，反应30分钟后，静置三十分钟后形成HA-Ce6与PLL-1-mt的纳米复合物(HC/PM)，再进行aPD-L1单抗的后吸附。将aPD-L1分散在10μLPBS中，然后在冰浴下使用搅拌器缓慢滴入HC/PM纳米复合物溶液中，再静置10分钟获得aPD-L1@HC/PM纳米复合物。其中，HA-Ce6参考文献W.J.Li,C.F.Zheng,Z.Y.Pan,C.Chen,D.H.Hu,G.H.Gao,S.D.Kang,H.D.Cui,P.Gong,L.T.Cai,Smarthyaluronidase-activedtheranostic micelles for dual-modal imaging guidedphotodynamic therapy.Biomaterials 2016,10,10-19.进行制备。
实施例4：aPD-L1@HC/PM纳米聚集体形态和稳定性实验。
为更直观的观察与比较，将实施例3制备得到的aPD-L1@HC/PM制剂于4℃冰箱保存0天、5天、10天和20天后观察其外观。在图2中，aPD-L1@HC/PM外观均一，无分层且无絮凝产生；持续观察20天，aPD-L1@HC/PM制剂外观依然无明显改变。从直观分析得到，aPD-L1@HC/PM制剂可以稳定存在20天以上，稳定性好。吸取20μL纳米聚集体混悬液滴于碳膜铜网上，滤纸吸去多余液体，室温下干燥后置于透射电镜下观察aPD-L1@HC/PM纳米聚集体形态。电镜照片如图3，结果显示aPD-L1@HC/PM可在水中聚集成大小均匀的纳米球结构说明DA-Ara聚集体形态均匀，稳定性良好，聚集体尺度适用于静脉注射。
实施例5：aPD-L1@HC/PM体外细胞毒性实验。
1.细胞的培养
选取鼠源黑色素瘤细胞株B16F10作为研究对象。取冻存细胞，用培养基于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。
2.细胞毒性实验
B16F10细胞用于评估不同浓度1-mt，Ce6，HC/PM和aPD-L1@HC/PM的暗毒性和光毒性。用培养基将待测目标化合物Ce6和aPD-L1@HC/PM各按照Ce6的量稀释至0.5、1、2、4、8、16μg mL-1。收集对数生长期的B16F10细胞，细胞以8×103个/孔的浓度加入96孔板中，孵育过夜后，加入不同浓度的目标化合物溶液200μL，设3个复孔。将细胞在37℃下培养6小时，然后洗涤，换新鲜培养基，其中，光毒组接受100mW/cm2的激光照射5分钟，波长为660nm。进一步温育20小时后，孵育后，每孔加入0.5％的MTT溶液10μL，继续孵育6h，然后弃去孔内液体，每孔加100μLDMSO溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度，用下式计算细胞抑制率：
两种样品在不同浓度下的细胞抑制率实验结果如图4。由图4可以看出，Ce6和aPD-L1@HC/PM展现出浓度依赖性。激光照射条件下，aPD-L1@HC/PM对B16F10细胞的抑制作用明显强于Ce6，同时，从非光照组结果可以看出，aPD-L1@HC/PM具有良好的生物相容性。
由此，得出结论，aPD-L1@HC/PM纳米复合体静脉制剂对黑色素瘤细胞株B16F10细胞有理想的抑制作用，起效快，杀伤力强。
实施例6aPD-L1@HC/PM体内抑瘤研究
1.动物模型建立
6至8周雌性C57BL/6小鼠用于建立体内抗肿瘤模型。B16F10细胞悬液(每只小鼠1×106个细胞)皮下接种到8-6周C57BL/6雌性小鼠的右胁腹区来建立肿瘤。
2.动物体内抑瘤实验
接种后8天，肿瘤达到～80mm3，此时，称重小鼠，随机分成7组：生理盐水作为对照，1-mt、aPD-L1、Ce6、HC/PM、HC/PM+aPD-L1、PD-L1@HC/PM后六组作为实验组，其中，Ce6、HC/PM、PD-L1@HC/PM三组在静脉给药6h后，对肿瘤进行激光照射，光源波长为660nm，功率为100W/cm2，照射时长为10分钟。每三天给予一次治疗，共治疗五次。每两天测量肿瘤体积，并根据以下等式计算肿瘤体积：
L表示最大直径(mm)，而W表示最小直径(mm)。
在各种治疗20天后，处死小鼠以取出肿瘤称重。并根据以下公式计算每组小鼠肿瘤的抑制率：
Wc表示生理盐水组的平均肿瘤重量，而Wt表示其他组的最终肿瘤重量。
本公开首次合成1-甲基-D-色氨酸大分子衍生物PLL-1-mt，这种前药分子解决了1-mt极性大，透膜性差，在体内易被代谢失活等缺点。同时，PLL-1-mt与HA-Ce6静电组装后吸附aPD-L1形成aPD-L1@HC/PM纳米复合体，可在水中自组装形成结构均一的纳米球。制备得到的aPD-L1@HC/PM静脉纳米聚集体制剂，不仅稳定性好，而且保存时间长，易于储存与运输，为工业生产提供可能。细胞实验表明aPD-L1@HC/PM静脉纳米聚集体制剂对黑色素瘤细胞的杀伤力强，选择性好。同时，体内实验证明aPD-L1@HC/PM制剂具有良好的肿瘤抑制作用。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物，其特征是，结构式如下：
该聚合物的数均分子量为2000～6000，m与n比为1:8～15。
2.一种权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征是，采用叔丁氧羰基将1-甲基-D-色氨酸的氨基进行保护获得Boc-1-mt，Boc-1-mt的羧基与聚赖氨酸的部分伯胺基团进行缩合反应获得Boc-1-mt-PLL，将Boc-1-mt-PLL中的叔丁氧羰基脱除，获得聚赖氨酸骨架接枝1-甲基-D-色氨酸的聚合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，对氨基进行保护的步骤为：将1-甲基-D-色氨酸、NaHCO3和二碳酸二叔丁酯溶解后，将溶液冷却至-1～0℃，然后升温至室温进行反应，反应后获得Boc-1-mt；
优选的，溶解采用的溶剂为水与四氢呋喃的混合物；进一步优选的，水与四氢呋喃的体积比为1:0.9～1.1；
优选的，溶液冷却至-1～0℃，并保温9～11min；
优选的，升温至室温，在室温下进行反应的时间为22～26h；
优选的，反应结束后，去除溶剂获得含有产品的水溶液，向水溶液中添加盐酸至pH为1.0～1.1，采用乙酸乙酯进行萃取，去除水层获得乙酸乙酯层，将乙酸乙酯去除后获得Boc-1-mt。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，进行缩合反应的步骤包括：
将N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和Boc-1-mt进行反应获得活性中间酯；
将聚赖氨酸溶液的pH调节至10，然后加入所述活性中间酯，再调节pH至10，进行反应获得Boc-1-mt-PLL；
优选的，获得活性中间酯的过程为：将N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解与无水N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入Boc-1-mt，室温下反应3.5～4.5h，获得Boc-1-mt；
优选的，聚赖氨酸与Boc-1-mt的质量比为1:0.6～1.2；进一步优选的，聚赖氨酸与Boc-1-mt的质量比1:0.9；
优选的，聚赖氨酸溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和水的混合物；进一步优选的，N,N-二甲基甲酰胺和水的体积比为1:1；
优选的，获得Boc-1-mt-PLL的反应时间为40～50h。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，将反应后的含有Boc-1-mt-PLL的物料依次用等体积比的N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液和去离子水进行透析，透析液通过0.45mm膜过滤，然后冻干得目标产物Boc-1-mt-PLL。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，脱除叔丁氧羰基的步骤为：Boc-1-mt-PLL在室温下溶解在三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，室温反应，用去离子水水透析后通过冷冻干燥；
优选的，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:5～12；进一步优选的，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:9。
7.基于免疫检查点抑制剂的纳米组装体，其特征是，包括权利要求1所述的聚合物、接枝二氢卟吩的透明质酸和PD-L1单克隆抗体。
8.权利与其7所述的纳米组装体的制备方法，其特征是，将权利要求1所述的聚合物的水溶液加入至接枝二氢卟吩透明质酸的水溶液中，混合均匀后获得聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的纳米复合物HC/PM，将PD-L1单克隆抗体的溶液滴加至搅拌的HC/PM的溶液中，获得纳米组装体，即为aPD-L1@HC/PM纳米复合物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是，混合均匀的方式采用超声；
或，聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的质量比为1:3.5～5；优选的，聚合物与接枝二氢卟吩透明质酸的质量比为1:4。
10.一种权利要求7所述的纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用；
优选的，肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤，癌症包括但不限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌；
优选的，抗肿瘤方式包括化疗法、光疗法、免疫疗法的一种或多种；
优选的，抗肿瘤药物还包括但不限于烷化剂、生物碱类药物、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类药物。
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