CN111821419A - 一种自组装多肽纳米载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自组装多肽纳米载体及其制备方法和应用，所述的自组装多肽纳米载体具有由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，所述的亲水外链为水溶性聚合物；所述的疏水内核包括自组装多肽和与自组装多肽连接的CD47分子阻断剂；亲水外链与疏水内核通过偶氮苯‑4，4‑二羧酸连接。本发明所述的自组装多肽纳米载体具有低氧响应性和CD47分子靶向性，能够顺利地到达相应的靶点发挥作用，免于其在血液循环中被免疫系统识别和降解，同时又保持了自组装纳米纤维在抑肿瘤方面的疗效，具有优异的抑制肿瘤细胞的生长和转移的效果。

Description

一种自组装多肽纳米载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米载体的制备领域，具体涉及一种自组装多肽纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
生物大分子自组装成纤维状纳米结构是原核和真核细胞的基本过程。蛋白质是维持细胞正常功能的重要组成部分，多肽作为其二级结构发挥着重要的作用。
研究表明多肽的纳米级装配体能够执行许多关键的生物学功能，如维持细胞外基质和细胞正常功能等方面。通常温度、pH值或酶等外界条件的变化可触发多肽分子作为自组装构件，通过非共价相互作用(主要是π效应)聚集形成各种纳米级结构，包括纳米管、原纤维纳米囊泡、凝胶和纳米笼。基于这种特性，自组装多肽在抗肿瘤治疗领域通常作为释药载体来改善药物的药学性质，例如提高药物的生物利用度，降低药物的毒性，从而使药物满足临床需求。
公开号为CN107281161A的中国发明专利申请公开了一种药物纳米制剂及其制备方法，纳米载体进入肿瘤组织后，细胞外发生低氧响应性断裂后，脱去表面PEG，暴露内部小尺寸的正电荷粒子，从而促进肿瘤组织穿透。
但是，作为释药载体而言，自组装多肽在研究与应用方面仍面临很多的挑战，自组装结构难以准确预测和控制，缺乏靶向性，可能造成药物滞留。过去研究报道自组装多肽(FF二肽、FFY三肽或FFKY四肽)可在特定条件下自组装形成蜂窝状纤维，从而阻止细胞之间的物质交换和肌动蛋白以及微管的形成，导致程序性细胞死亡的形成，抑制细胞增殖和迁移。多肽自组装技术将在靶向分子治疗和免疫治疗中显现出巨大潜力。
在过去的十年中，使用针对抑制性免疫检查点的抑制剂一直是抗癌治疗领域最重要的进展之一，这些药物发挥作用的前提一般是免疫细胞功能被抑制，而缓解这种免疫抑制作用可提高抗肿瘤活性。针对T细胞上表达的抑制性受体的抗体(如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白CTLA-4和程序性死亡PD-1)或其配体(如PD-L1)，已显示出广泛的抗癌疗效，但是，这些药物的临床疗效具有个体差异性，且有些患者会出现包括严重自身免疫在内的明显副作用。因此，研究者开始重新寻找新的用于提高肿瘤患者免疫系统的相关靶点。
作为近年来被广泛研究的新型免疫检查点分子，CD47也被称为整合素相关蛋白，是免疫球蛋白超家族中的重要成员，在不同组织细胞均广泛表达，CD47分子在固有免疫和适应性免疫中都发挥重要作用，与巨噬细胞、T细胞等介导的免疫反应息息相关。
SIRPα是SIRP家族中的一个典型的抑制性免疫受体，其可以选择性地表达与髓系细胞和神经细胞膜表面，SIRPα可与其配体CD47结合，产生“别吃我”信号，阻止巨噬细胞吞噬健康细胞。然而这一机制被癌细胞所利用，欺骗免疫系统。
研究证实使用阻断性抗CD47抗体干扰SIRPα-CD47相互作用不仅能够显著增加体外巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，还能通过DC-T细胞途径激活特异性免疫应答从而促进细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的清除。
因此，亟需研发一种能够使CD47分子阻断剂顺利地到达靶点发挥作用，免于其在血液循环中被免疫系统识别和降解的纳米制剂。
发明内容
本发明提供了一种自组装多肽纳米载体及其制备方法和应用。所述的自组装多肽纳米载体利用低氧响应性连接分子偶氮苯-4，4-二羧酸(AZO)连接疏水内核(4N1K-FY4片段)和聚乙二醇(PEG)片段，合成壳核式纳米载体。
利用PEG片段在体内长循环的特点和纳米粒的高渗透长滞留效应(EPR效应)聚集到肿瘤组织，自组装多肽纳米载体进入肿瘤组织后；在细胞外，肿瘤低氧还原微环境下发生响应性解离，游离出的4N1K-FY4片段能够在细胞外自发组装形成纤维，与CD47分子相互识别锚定在细胞表面，封闭肿瘤细胞表面的CD47分子，阻断SIRPα-CD47通路，发挥免疫哨卡阻断剂的作用；从而增强巨噬细胞吞噬功能，增强免疫疗法的疗效，同时有效改善肿瘤微环境，减少肿瘤组织新生血管的生成，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种自组装多肽纳米载体，具有由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，其特征在于，所述的亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述的疏水内核包括自组装多肽和与其连接的CD47分子阻断剂；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯-4，4-二羧酸连接。
在能够形成纳米纤维的自组装多肽的末端接入亲水性基团，可阻止自组装多肽的自组装过程。自组装多肽纳米载体利用亲水性外壳在体内长循环并通过EPR效应聚集于肿瘤部位后，在肿瘤低氧还原的微环境下，偶氮苯-4，4-二羧酸的偶氮双键断裂，游离出疏水内核(4N1K-FY4片段)能够自发组装形成纤维。
疏水内核(4N1K-FY4片段)携带CD47分子的相应配体(4N1K)，与CD47分子相互识别锚定在细胞表面，封闭肿瘤细胞表面的CD47分子，从而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，增强免疫疗法的疗效，同时有效改善肿瘤微环境，减少肿瘤组织新生血管的生成，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。
所述的水溶性聚合物为聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)；所述的水溶性多糖为透明质酸、肝素、葡聚糖或海藻酸钠。
作为优选，所述的水溶性聚合物为聚乙二醇类衍生物，进一步优选为甲氧基聚乙二醇胺。甲氧基聚乙二醇胺生物相容性好，能减小纳米制剂的毒性，同时可有效增加纳米载体体内循环时间，提高纳米载体的肿瘤靶向性。
所述亲水外链的分子量为800～1000000Da，优选为为1800-2200Da。
若选用的亲水外链的分子量较大，最终形成的纳米载体的粒径会增加，因此要选用适合的分子量，以控制纳米载体的粒径。
所述亲水外链优选分子量为2000Da的甲氧基聚乙二醇胺，此时纳米粒的粒径在100～200nm，利于纳米粒蓄积在肿瘤部位。
所述自组装多肽为Nap-FFKY、FFK(AIE)Y、FFKY或FF或者其它能够向二级结构转变或者具有两亲性的多肽分子。
作为优选，所述多肽分子为具有苯环结构的FFKY多肽，可通过π-π键堆积以及分子间氢键相互作用形成片层结构，自组装形成纳米纤维，影响细胞内各项生理活动。疏水性的多肽与水溶性PEG连接后，不再具有自组装能力，自发形成核壳结构的纳米载体。
所述的自组装多肽的结构如式(II)所示：
Figure BDA0002613241160000031
所述的CD47分子阻断剂为4N1K或CV1。
所述的4N1K的结构如式(III)所示：
Figure BDA0002613241160000041
所述的自组装多肽和CD47分子阻断剂通过式(IV)所示分子连接在一起：
Figure BDA0002613241160000042
其中，a为3～6的整数；b为3～6的整数。
所述的自组装多肽和CD47分子阻断剂通过式(V)所示分子连接在一起：
Figure BDA0002613241160000043
所述的疏水内核的结构如式(VI)所示：
Figure BDA0002613241160000044
CD47广泛表达于多种肿瘤细胞，肿瘤细胞可通过CD47-SIRPα信号通路逃逸巨噬细胞的免疫监视，因此通过CD47抗体或受体阻断CD47与SIRPα的结合可以激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，以及DC细胞的递呈抗原作用，同时可以与其他肿瘤杀伤途径联合治疗，如免疫治疗、小分子靶向药物、化疗和放疗等。
所述的自组装多肽纳米载体的分子式如式(I)所示：
Figure BDA0002613241160000051
其中，n为30～90。
所述的n优选为40～55，进一步优选为40～50。
本发明还提供了一种本发明所述的自组装多肽纳米载体和抗肿瘤化疗药物的联用方法。
本发明所述的自组装多肽纳米载体联合少量抗肿瘤化疗药物可达到多次化疗所产生的抗肿瘤效果，同时减少治疗中化疗药物的使用剂量，从而减轻化疗药剂量依赖所导致的毒副作用。
所述的抗肿瘤化疗药物为疏水性药物，包括但不限于多柔比星、柔红霉素、阿柔比星、表柔比星、表柔比星、伊达比星、阿霉素、博来霉素、平阳霉素、丝裂霉素、羟基喜树碱、紫杉醇或多西他赛。
本发明还提供了所述自组装多肽纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤(a)、偶氮苯-4，4-二羧酸用吡啶溶解后，加入羧基活化剂羧基得到羧基活化的偶氮苯-4，4-二羧酸；
步骤(b)、在缚酸剂的作用下，羧基活化的偶氮苯-4，4-二羧酸与水溶性聚合物进行缩合反应，除去溶剂，加水复溶，离心后取上层清液，上层清液冻干得到水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸；
步骤(c)、向水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸中加入羧基活化剂得到羧基活化的水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸；
步骤(d)、羧基活化的水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸与疏水内核进行酰胺缩合反应，先后用分子量截留值3500Da、8000～14000Da的透析袋透析纯化，透析后的溶液冻干后得到所述的自组装多肽纳米载体。
所述偶氮苯-4，4-二羧酸和水溶性聚合物的摩尔比为1∶0.6～1.2。
所述的水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸与疏水内核的的摩尔比为1∶0.08～0.12。
所述的缚酸剂为三乙胺。
本发明还提供了所述的自组装多肽纳米载体在制备肿瘤免疫药物中的应用。
所述的肿瘤为血液瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和黑色素瘤等实体瘤。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
(1)本发明首次采用偶氮苯-4，4-二羧酸(AZO)连接甲氧基聚乙二醇胺与4N1K-FY4多肽片段制备了一种低氧响应性的自组装多肽纳米载体。多肽纳米载体不仅具有在肿瘤低氧微环境刺激下自发组装形成纤维，封闭肿瘤细胞表面的CD47分子，增强免疫疗法的疗效；而且制剂工艺简单，与传统抗肿瘤纳米制剂相比，该载体还能调节或阻断肿瘤细胞间或与外界的物质交换和信号交流，改变肿瘤细胞生长的微环境，减少肿瘤细胞的活动抑制转移。
(2)本发明制备的自组装多肽纳米载体携载CD47分子阻断剂4N1K可有效与CD47分子相互识别锚定在细胞表面，封闭肿瘤细胞表面的CD47分子，从而增强巨噬细胞吞噬功能，增强免疫疗法的疗效。
(3)本发明制备的自组装多肽纳米载体可进一步联合少量抗肿瘤化疗药物(阿霉素)可达到多次化疗所产生的抑制黑色素瘤生长的效果，同时减少治疗中化疗药物的使用剂量，从而减轻化疗药剂量依赖所导致的毒副作用。
附图说明
图1为实施例1制备PAP纳米载体的合成路径示意图。
图2为原料mPEG-NH2和制备的PEG-AZO的核磁共振图。
图3为实施例1制备的PAP纳米载体的核磁共振图。
图4为实施例1制备的PAP纳米载体的粒径分布图及TEM图；其中，A为粒径分布图，B为TEM图。
图5为PAP纳米载体低氧响应性评价结果图；其中，A为PAP纳米载体经100mMNa2S2O4处理前后的紫外吸收光谱及其溶液颜色的变化以及紫外400～500nm波长吸收情况图，PAP NPs(H)表示100mM Na2S2O4处理组，PAP NPs表示空白对照；B溶剂挥发法制备的4N1K-FY4多肽的TEM图；C为PAP纳米载体经100mM Na2S2O4处理后的TEM图。
图6为细胞水平上PAP纳米载体低氧响应性评价结果图；其中，A未经PAP纳米载体水溶液处理的B16F10细胞TEM图；B为B16F10细胞经PAP纳米载体水溶液处理12h后的TEM图。
图7为细胞水平上PAP纳米载体低氧响应性评价结果图；其中，A为未经PAP纳米载体制剂处理的B16F10细胞SEM图；B为B16F10细胞经PAP纳米载体制剂处理12h后的SEM图；C为溶剂挥发法制备的4N1K-FY4自组装纤维的SEM图。
图8为不同制剂封闭肿瘤细胞表面CD47的研究结果；其中，A为B16F10细胞经不同制剂处理12h后共聚焦显微镜下观察细胞表面CD47荧光量及其分布图，B为B16F10细胞经不同制剂处理12h后，流式细胞术检测细胞表面CD47荧光量；PAP NPs为PAP纳米载体组，Control为对照组，anti-CD47 Ab为CD47阻断性抗体组。
图9为共聚焦显微镜观察封闭肿瘤细胞表面CD47分子对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响；Control为对照组，anti-CD47 Ab为CD47阻断性抗体组；DIC代表光镜下的视野；DAPI代表细胞核；APC代表巨噬细胞；CFSE代表肿瘤细胞；Merge代表APC阳性的巨噬细胞与CFSE阳性的肿瘤细胞的叠加图。
图10为其中，A为流式细胞术检测封闭肿瘤细胞表面CD47分子对巨噬细胞/DC；B为吞噬肿瘤细胞功能的影响；C为流式细胞术计算巨噬细胞/DC吞噬率的方法，吞噬率＝Q2/(Q1+Q2)×100％。
图11为细胞划痕实验研究PAP NPs纳米制剂预处理肿瘤细胞后对其迁移能力的影响。
图12为体内药效学实验研究PAP NPs纳米制剂联合少量化疗药物抑制B16F10肿瘤的生长。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例、测试例中采用的药物、试剂、细胞株和动物具体如下：
4N1K-FY4多肽(上海楚肽生物技术有限公司，中国)；偶氮苯-4，4-二羧酸(梯希爱化成工业发展有限公司，中国)；吡啶(Pyridine，阿拉丁试剂有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，Sigma-Aldrich，美国)；4-二甲氨基吡啶(DMAP，上海阿拉丁生化科技股份，中国)；1-羟基苯并三唑(HOBT，阿拉丁试剂有限公司，上海)；O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU，阿拉丁试剂有限公司，上海)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS，Sigma-Aldrich，美国)；N-二异丙基乙胺(DIEA，阿拉丁试剂有限公司，上海)。
实施例1制备PAP纳米载体
Figure BDA0002613241160000081
本实施例制备PAP纳米载体的合成路径示意图如图1所示。
(1)取25mg AZO(0.137mmol)、21.85mg EDC·HCl(0.112mmol)、12.8mg NHS(0.111mmol)和1.15mg DMAP(0.010mmol)，溶于15mL的吡啶中，用1mM HCl溶液调节上述溶液的pH至5.0，边滴加HCl溶液边超声至溶液澄清透明；室温搅拌2小时，使AZO的羧基活化。
(2)逐滴滴加185mg mPEG-NH2(上海阿拉丁生化科技有限公司，MW2000)的吡啶溶液(5mL)至步骤(1)得到的活化后的AZO溶液中，同时滴加5μl三乙胺；室温搅拌过夜。
(3)75℃真空旋转蒸发除去吡啶溶液，得橙黄色薄膜产物，加入适量纯水复溶，离心(3000rpm，5min)除去游离的AZO沉淀，上清液为mPEG-AZO水溶液，冻干得橙黄色产物PEG-AZO，称量后于4℃保存。
Figure BDA0002613241160000082
4N1K-FY4多肽的结构式如下所示：
Figure BDA0002613241160000091
(4)称取PEG-AZO 250mg以及适量HOBT、TBTU、DIEA溶解于5mLDMF中，室温活化2小时，反应投料摩尔比为PEG-AZO∶HOBT∶TBTU∶DIEA∶4N1K-FY4为1∶1.2∶1.2∶2∶0.1。
(5)缓慢加入4N1K-FY4多肽的DMF溶液，室温搅拌，反应过夜；反应液经分子量3500Da的透析袋透析24h后，使用分子量8000～14000 Da的透析袋继续透析24h每隔4h换水。
(6)透析后的溶液经离心(3000rmp，5min)后取上清液冻干得产物PAP纳米载体，称重后于4℃保存。
实施例2表征与性能分析
对上述实施例1的自组装多肽纳米载体进行形态、核磁共振分析、低氧响应性、封闭CD47性能、促吞噬能力、抑转移能力进行分析：
测试例1对PAP纳米载体进行核磁共振分析
取纯化处理后的原料mPEG-NH2、中间体PEG-AZO及终产物PAP纳米载体溶解于适当的氘代溶剂中，进行1H-NMR分析。原料mPEG-NH2和PEG-AZO的核磁参见图2，PAP纳米载体的核磁参见图3。
结论：图3中，在化学位移为7ppm左右出现4N1K-FY4多肽中各氨基酸上苯环上C-H的特征峰，相对于PEG-AZO的1H NMR，PAP纳米载体的核磁氢谱图中出现了多肽酰胺键连接之间C-H的特征峰，其化学位移位于4～5ppm之间，综合以上核磁共振结果，表明具有低氧响应性的PAP纳米载体的成功合成。
测试例2粒径测定与形态观察
取PAP纳米载体，分散于水中，浓度约为5mg/mL，采用Malvem Zetasizer NanoZS90系列激光粒径分析仪，测定制剂的粒径大小，并对结果进行记录和分析。具体操作过程为：去离子水分散PAP纳米载体水溶液(5mg/mL)，样品悬滴于铜网上，滤纸吸取多余的水分，干燥，透射电子显微镜(TEM)观察其外观形态，结果参见图4。
结论：通过对PPAP纳米载体粒径和形态的考察，纳米制剂粒径在200nm以下，且分散均匀在溶液状态下有较好的稳定性符合纳米制剂的制备要求，有利于纳米制剂在体内的长期循环。
测试例3低氧响应性考察
测试例3.1 Na2S2O4断裂低氧响应性基团
Na2S2O4作为常用的硫酸盐类还原剂可迅速消耗水溶液中的氧气，被用于模拟低氧还原环境。
配制PAP纳米载体水溶液(2.4mM)两份，加入现配制的Na2S2O4水溶液混匀，使Na2S2O4终浓度为100mM，于37℃放置5min；另一份不做处理作为空白对照。拍照记录Na2S2O4处理前后样品颜色变化，通过紫外可见分光光度法(UV/VIS)，测试结果参见图5A，PAPNPs(H)表示100mM Na2S2O4处理组，PAP NPs表示空白对照；分析PAP纳米载体在445nm波长处AZO氮氮双键的断裂情况。图5A中可以看出经Na2S2O4水溶液处理后的PAP纳米载体中低氧基团AZO在445nm波长处的紫外特征吸收峰消失，溶液颜色变成无色。
将购买的4N1K-FY4多肽和PAP NPs(H)组溶剂挥干，TEM观察载体断裂后形态及粒径大小的变化，测试结果参见图5B和5C。对比图5C和图4B，可以发现不同于图4B中的球形纳米粒，经低氧条件，纳米粒解体出现网状纤维，说明低氧断裂游离出的4N1K-FY4多肽片段可自组装形成纤维。
结论：PAP纳米载体中AZO在Na2S2O4条件下易被还原，氮氮双键断裂生成苯胺，4N1K-FY4多肽表面修饰的mPEG断裂，游离出的4N1K-FY4片段能够自发组装形成纤维。纳米制剂PAP在Na2S2O4条件下具有良好的低氧响应性。
测试例3.2细胞水平上PAP纳米载体低氧响应性考察
取对数生长期B16F10细胞以(5×105个细胞/孔)接种于48孔板中，在37℃，5％CO2、1％O2条件下培养12小时后，弃去培养液，给予PAP纳米载体水溶液使之终浓度为250μM，12h后胰酶消化离心，离心后的细胞团块经2.5％的戊二醛4℃固定过夜后制样，TEM观察细胞形态及其细胞间质的变化；参见图6B，未经PAP纳米载体制剂处理的B16F10细胞TEM图如图6A所示。
取对数生长期B16F10细胞以10×104个细胞/孔接种于48孔板中，并在板底放置适当大小的盖玻片。37℃、5％CO2、1％O2条件下培养12小时后给予PAP纳米载体水溶液使之终浓度为250μM，12h后经2.5％的戊二醛4℃固定过夜后制样，SEM观察细胞形态变化及其表面是否形成多肽纤维，参见图7B，未经PAP纳米载体制剂处理的B16F10细胞SEM图如图A所示；图7C为溶剂挥发法制备的4N1K-FY4多肽的SEM图。
结论：细胞水平上，AZO能够在低氧条件下响应性断裂。
测试例4封闭肿瘤细胞表面CD47的研究
测试例4.1 PAP纳米载体封闭肿瘤细胞表面CD47的实验
取对数生长期状态良好的B16F10细胞以15×104个细胞/孔接种于共聚焦皿中，在37℃、5％CO2、1％O2条件下培养4h后，转移到低氧条件下孵育过夜。而后分别经CD47阻断性抗体anti-CD47 Ab(miap 301，10μg)，PAP纳米载体(PAP NPs，浓度为250μM)低氧处理12h，未经制剂处理的肿瘤细胞作为实验对照组(Control)。
吸出旧培养液，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗涤2遍，0.25％Triton X-10透化20min，PBS洗涤2遍，山羊血清(每皿0.5mL)封闭30min，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗2遍；加入3％BSA稀释后的CD47一抗溶液(稀释比例为1∶30)，37℃孵育1h后PBS洗2遍；加入荧光二抗Cy5.0(稀释比例为1：80)，37℃避光孵育1h后PBS洗2遍；而后加入DAPI染色液(每皿0.5mL)，室温染色10min，PBS清洗2遍后共聚焦显微镜下观察不同组别的荧光强度，结果参见图8A。
测试例4.2流式细胞术检测PAP纳米载体封闭CD47分子的能力
肿瘤细胞B16F10细胞的处理与分组同上；处理后的肿瘤细胞经CD47-APC标记，冰上避光放置，孵育30min；胰酶消化，离心，PBS洗涤，流式细胞术统计分析不同制剂处理后的样品细胞表面CD47的表达量。参见图8B。
结论：PAP纳米载体制剂能够显著封闭肿瘤细胞表面的CD47分子。
测试例5促吞噬研究
测试例5.1巨噬细胞吞噬实验
取对数生长期B16F10细胞以50×104个细胞/孔接种于6孔板中，常氧下充分贴壁后，分别经CD47阻断性抗体anti-CD47 Ab(miap 301，10μg)，PAP纳米载体水溶液(250μM)低氧处理12h后，CFSE染料室温染色20min，其CFSE终浓度为10μM；胰酶消化，离心，用完全培养基制成单细胞悬液备用。未经制剂处理的B16F10细胞作为实验对照组。
取得的小鼠原代骨髓细胞经完全培养基重悬后接种于共聚焦皿中，刺激分化5-7天后替换不含药的完全培养基备用；实验前将刺激好的巨噬细胞/DC在无血清培养基中饥饿2h后，加入CFSE染料标记后的肿瘤细胞，37℃共孵育2h；PBS洗去未被吞噬的肿瘤细胞后，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗涤；0.25％Triton X-10透化20min，PBS洗涤；山羊血清适量封闭30min后加入3％BSA稀释后的F4/80一抗稀释液(稀释比例为1∶30)，室温孵育1h后，PBS洗涤；二抗稀释液室温孵育1h(稀释比例为1∶200)，PBS洗涤；即用型DAPI适量室温标记10min后，洗涤，通过共聚焦显微镜观察各组巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬情况。参见图9。
结果表明：巨噬细胞对经PAP纳米载体水溶液预处理后的肿瘤细胞吞噬能力明显增强，肿瘤细胞被吞噬数量增加接近50％。综合比较共聚焦结果以后，可以直观地观察到肿瘤细胞经PAP纳米载体水溶液处理后能够增强巨噬细胞对其吞噬作用。
测试例5.2流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬能力
取对数生长期B16F10细胞以50×104个细胞/孔接种于6孔板中，常氧下充分贴壁后，分别经CD47阻断性抗体anti-CD47 Ab(miap 301，10μg)，PAP纳米载体水溶液(250μM)低氧处理12h后，CFSE染料室温染色20min，其CFSE终浓度为10μM；胰酶消化，离心，用完全培养基制成单细胞悬液备用。未经制剂处理的B16F10细胞作为实验对照组。
取得的小鼠原代骨髓细胞经完全培养基重悬后接种6孔板中，刺激分化5-7天后替换不含药的完全培养基备用；实验前将刺激好的巨噬细胞/DC在无血清培养基中饥饿2h以后，加入CFSE标记的肿瘤细胞，37℃共孵育2h后，F4/80-APC标记巨噬细胞，冰上避光放置，孵育30min；胰酶消化，离心，PBS洗涤，流式细胞术进一步统计分析巨噬细胞中GFP阳性的细胞比例，考察PAP纳米载体处理肿瘤细胞后对巨噬细胞/DC吞噬功能的影响。参见图10。
结果表明：PAP纳米载体主要是通过封闭肿瘤细胞表面CD47分子从而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力而发挥作用的。
测试例6划痕实验
取对数生长期B16F10细胞以25×104个细胞/孔接种于6孔板中，孵育过夜，细胞附着后，用200μL枪头尖端在每孔底部划一条直线(一般选中间细胞较密处，划痕尽量平整，可以划“十”字形)，PBS冲洗细胞2-3次，加入2mL培养液，分别加入不同药物处理：CD47阻断性抗体anti-CD47 Ab(miap 301，10μg)和PAP纳米载体制剂(PBS，250μM)为实验组(PAP NPs)，每组设置3个复孔，未经处理的肿瘤细胞作为实验对照组(Control)。分别于孵育0h、24h后，显微镜观察肿瘤细胞侵袭情况并拍照记录，参见图11。
结果表明：PAP纳米载体制剂相比于CD47阻断性抗体anti-CD47 Ab miap 301能够更有效地抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
测试例7体内药效学实验
取6周龄C57BL/6J鼠，于皮下接种B16F10细胞(5×105细胞/0.1mL)，建立荷黑色素瘤小鼠模型。
构建方法如下：将对数生长期的B16F10细胞用胰酶消化并重悬于冷PBS中冰浴放置，调节细胞悬液浓度为1×106细胞/0.1mL，每只皮下注射0.1mL，接种6天后，肿瘤长至50-100mm3，选取肿瘤大小均一的造模鼠进行后续体内实验。
选取大小均一的造模鼠随机分为四组，每组六只。对照组给予生理盐水处理，实验组分别给予制剂PAP NPs(500mg/kg)、阿霉素(free DOX 5.0mg/kg)、free DOX+PAP NPs处理，每隔2天尾静脉给药一次，连续给药15天(注：free DOX+PAP NPs治疗方案，即给予两次freeDOX治疗后，再给予三次PAP NPs治疗)。隔天测量各组肿瘤的长径和短径以及裸鼠体重，绘制肿瘤体积和动物体重变化曲线。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5×L×W2(L为肿瘤的长径，W为肿瘤的短径)。参见图12。
结果表明：PAP纳米载体联合少量化疗在达到多次化疗所产生的抗肿瘤效果的同时，可减少治疗中化疗药物的使用剂量，从而减轻DOX剂量依赖所导致的毒副作用。

Claims (10)

1.一种自组装多肽纳米载体，具有由亲水外链和疏水内核组成的核壳结构，其特征在于，所述的亲水外链为水溶性聚合物或水溶性多糖；所述的疏水内核包括自组装多肽和与其连接的CD47分子阻断剂；所述亲水外链与疏水内核通过偶氮苯-4，4-二羧酸连接。
2.根据权利要求1所述的自组装多肽纳米载体，其特征在于，所述的水溶性聚合物为聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇胺；所述的水溶性多糖为透明质酸、肝素、葡聚糖或海藻酸钠。
3.据权利要求1或2所述的自组装多肽纳米载体，其特征在于，所述亲水外链的分子量为1800Da～2200Da。
4.据权利要求1所述的自组装多肽纳米载体，其特征在于，所述自组装多肽为Nap-FFKY、FFK(AIE)Y、FFKY或FF。
5.如权利要求1所述的多肽纳米载体，其特征在于，所述CD47分子阻断剂为4N1K或CV1。
6.根据权利要求1所述的自组装多肽纳米载体，其特征在于，所述的自组装多肽纳米载体的分子式如式(I)所示：
Figure FDA0002613241150000011
其中，n为40～50。
7.一种根据权利要求1～6任意一项所述自组装多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、在缚酸剂的作用下，羧基活化的偶氮苯-4，4-二羧酸与水溶性聚合物进行缩合反应，除去溶剂，加水复溶，离心后取上层清液，上层清液冻干得到水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸；
步骤2、羧基活化的水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸与疏水内核进行酰胺缩合反应，纯化，冻干后得到所述的自组装多肽纳米载体。
8.根据权利要求7所述的自组装多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，所述偶氮苯-4，4-二羧酸和水溶性聚合物的摩尔比为1∶0.6～1.2。
9.根据权利要求7所述的自组装多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，所述的水溶性聚合物-偶氮苯-4，4-二羧酸与疏水内核的的摩尔比为1∶0.08～0.12。
10.一种根据1～6任意一项所述自组装多肽纳米载体在制备肿瘤免疫药物中的应用。
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