CN102397256A - 同载亲水和疏水药物的靶向复合纳米药物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用高分子材料、纳米生物技术与药剂学领域，涉及靶向性碳纳米管药物载体及其制备方法，涉及同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂及其制备方法。本发明由聚乙二醇化的高纯度碳纳米管作为载体，连接HER-2特异性单克隆抗体Fab片段作为靶向分子，该靶向性的碳纳米管药物载体上负载亲水性的阿霉素和疏水性的紫杉醇两种抗癌药。通过HER-2特异性单克隆抗体的Fab片段的靶向导引作用，能实现阿霉素和紫杉醇两种不同作用机制的抗癌药物在HER-2表达阳性的乳腺癌组织内富集，发挥互补的肿瘤细胞的杀伤力，提高疗效，减少药物用量及毒副作用，并且可以延缓耐药性的产生。

Description

同载亲水和疏水药物的靶向复合纳米药物制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料、纳米生物技术与药剂学领域，涉及靶向性碳纳米管药物载体及其制备方法，具体涉及同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂及其制备方法，尤其涉及疏水性与亲水性两种抗癌药物共同负载于特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管载体上的复合纳米抗癌药物制剂及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前人们尚不能有效控制的疾病之一，其严重危害人类健康。化疗是恶性肿瘤治疗中不可缺少的重要方法之一，由于目前临床用于肿瘤治疗的传统剂型的化疗药物缺乏靶向性，进入机体后不仅分布于肿瘤组织也分布在正常组织，在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了人体正常组织细胞，导致疗效低、毒副作用强。因此，增强化疗药物的抗肿瘤效果并减少其毒副作用成为临床目前亟待解决的问题，研发新型抗癌药剂迫在眉睫。纳米生物技术的兴起为其开辟了一条崭新的途径。近年来，国内外研究人员利用碳纳米管的独特的结构和优异的物理化学性能开始研发以碳纳米管为载体负载抗癌药及靶向分子的新型抗癌药。所述纳米抗癌药剂具有纳米级物质所特有的超小粒径与性质及高靶向、高效、低毒、缓释等特点。

临床研究表明，单一药物化疗对实体瘤疗效不佳，而且肿瘤的缓解期短。因为，肿瘤内部的细胞并非均质一致，而且往往处于细胞周期的不同阶段，对于某一种药物的敏感程度不同，而且在治疗过程中还会出现耐药性的问题。另外，由于单药效果不显著，导致增加药物用量或延长用药时间，于是增加了药物的毒性。因此，近半个世纪来，联合用药一直是肿瘤化疗中的主流，单一用药已仅在少数情况下偶尔为之。选择不同作用机制的抗癌药物同时使用，可以分别作用于细胞代谢或增生过程中的不同环节，对肿瘤细胞的打击面增宽，可杀伤多种不同的肿瘤细胞，提高疗效，并且可以延缓耐药性的产生。联合用药时，一般是选用毒性互相不产生重叠的药物，因而毒性小于单一用药。现有技术公开了阿霉素(Adriamycin,ADM))属亲水性的抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成。紫杉醇(Paclitaxel,Taxol)属疏水性的促进细胞微管聚合的抗癌药物，细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累能干扰细胞的各项功能，阻断细胞的正常分裂。有临床研究将阿霉素和紫杉醇的联合应用作为乳腺癌化疗的首选方案，但存在确定药物用量等不确定因素的影响。    迄今为止，国内外尚未见采用靶向性碳纳米管同时运载阿霉素（亲水）和紫杉醇（疏水）两种抗癌药物的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供新的靶向性碳纳米管药物载体及其制备方法，尤其涉及同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂及其制备方法，本发明特别涉及疏水性与亲水性两种抗癌药物共同负载于特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管载体上的复合纳米抗癌药物制剂及其制备方法。该靶向性碳纳米管负载两种抗癌药的药物体系可用于恶性肿瘤的的靶向性联合化疗。

本发明中，亲水性药物选自阿霉素(Adriamycin,ADM))，疏水性药物选自紫杉醇(Paclitaxel,Taxol)。

现有研究发现，部分乳腺癌细胞表面的HER -2蛋白水平较周围正常乳腺上皮细胞高出数十倍乃至数百倍； HER -2过表达的乳腺癌预后不佳；抗HER-2单克隆抗体分子量较大，很难通过毛细血管内皮层到达实体瘤深部，本发明以人表皮生长因子受体- 2（HER-2）为靶点，用酶切法获得到抗体的Fab片段，用Fab片段与碳纳米管连接，使碳纳米管具有HER-2靶向性，且较易穿透细胞外间隙到达深部肿瘤细胞，然后将亲水性的抗癌药-阿霉素和疏水性抗癌药-紫杉醇同时连接在同一个带靶向的碳纳米管载药体系，制备碳纳米管-阿霉素-紫杉醇复合物（PEG-CNTs-ADM-Taxol ）。

本发明中，采用聚乙二醇（PEG）化的高纯度碳纳米管（PEG-CNTs）连接HER-2特异性单克隆抗体的Fab片段制成纳米药物载体。该载体具有良好的亲水性基团PEG，能连接亲水性抗癌药阿霉素，同时还保留碳纳米管CNTs疏水性的部分，能用于连接疏水性抗癌药紫杉醇，制成PEG-CNTs-ADM-Taxol 复合物。

本发明中，所述的碳纳米管长度为约50-200nm。

本发明中，所述的HER-2特异性单克隆抗体Fab片段其分子量约40KD。

本发明中，阿霉素抑制核酸的合成，紫杉醇促进细胞微管聚合，PEG-CNTs-ADM-Taxol 复合物能将ADM和Taxol两种作用机理不同的药物同时送入肿瘤组织内，发挥药物协同作用，抑制肿瘤细胞，并克服单药易出现的耐药和毒性，达到最好的治疗效果和最低的副作用。本发明的一个实施例中通过HER-2特异性单克隆抗体的Fab片段的靶向导引作用，实现抗乳腺癌药物在HER-2表达阳性的乳腺癌组织的主动靶向，降低药物用量和毒副作用，提高治疗效率。

本发明的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂通过下述方法制备，

用强酸氧化多壁碳纳米管（MWCNTs），制得表面有羧基修饰的长度在50-200nm的高纯度多壁碳纳米管，在1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的催化作用下，将聚乙二醇（PEG2000）通过其末端的氨基接枝到制得的多壁碳纳米管的表面羧基上，制得表面有聚乙二醇修饰的多壁碳纳米管；再在催化剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的催化作用下将HER-2特异性单克隆抗体的酶切Fab片段连接至多壁碳纳米管表面的PEG另一端的氨基上，制得HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性多壁碳纳米管（CNT- PEG -AntiHER2 Fab）作为药物载体；制得的靶向性碳纳米管药物载体通过疏水相互作用、π-π相互作用先后与疏水性抗癌药紫杉醇和亲水性抗癌药阿霉素连接，制成同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂。本发明的一个实施例中，制成HER-2靶向性碳纳米管载亲水性药物阿霉素(Adriamycin,ADM))和疏水性药物紫杉醇(Paclitaxel,Taxol)两种抗癌药的药物制剂（CNT- PEG -AntiHER2 Fab-ADM-Taxol）。

本发明中，负载在靶向碳纳米管上的两种抗癌药，紫杉醇和阿霉素各自具有不同的杀伤肿瘤细胞机制，可以分别作用于细胞代谢或增殖过程中的不同环节，对肿瘤细胞的打击面增宽，疗效提高，并且可以延缓耐药性的产生。联合用药时，阿霉素和紫杉醇的毒性互相不产生重叠，与单药相比毒性降低。

本发明的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂的优点有：

（1）由于碳纳米管具有疏水性表面，可以连接紫杉醇及各种不同的疏水药物，因此，扩大了以碳纳米管为载体的载药体系的应用范围。

（2）碳纳米管强酸氧化后，管壁带有很多羧基基团，既增加了碳管在水溶液中的溶解性和稳定性，也增加了亲水性药物的连接，经处理的碳管载体可以连接阿霉素及各种不同的亲水药物，因此，扩大了纳米载药体系的应用范围。

（3）本发明的纳米药物载体表面具有很多PEG长链，其质量占到总载体质量的30%左右， 既增加了碳管的水溶解性，也能减少机体网状内皮系统对纳米药物的吞噬，有利于药效的发挥；PEG所带的氨基又可以与HER2单克隆抗体及其他多种抗体结合，可以使载药系统按照实际所需带有不同的靶向。

（4）本发明的纳米复合药物装载了靶向分子HER-2特异性单克隆抗体的Fab片段，能实现抗乳腺癌药物的主动靶向传递，提高药物的生物利用度，降低药物用量，并明显减少对正常组织、器官的伤害；

（5）本发明装载的紫杉醇和阿霉素两种抗癌药，具有不同的肿瘤杀伤机制，对肿瘤细胞的打击面增宽，可杀伤多种不同的肿瘤细胞，提高疗效，并且可以延缓耐药性的产生，同时也大大降低抗癌药的毒副作用。

（6）本发明方法可制备多种靶向性亲水和疏水药物同载碳纳米管的复合纳米药物制剂。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

 

附图说明

图1 是载亲水和疏水抗癌药的HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性多壁碳纳米管（CNT- PEG -AntiHER2 Fab-ADM-Taxol）。

 图2是Skbr-3细胞活力结果，

其中1：PEG-CNTs-Anti HER-2Fab -Taxol ；

2：PEG-CNTs- Anti HER-2Fab –ADM；

3：PEG-CNTs- Anti HER-2Fab -ADM-Taxol ；

*P >0.05vs PEG-CNTs- Anti HER-2Fab -ADM-Taxol  n=6 。

具体实施方式

实施例1

1）50 mgMWCNTs加入150 ml浓硫酸和浓硝酸（H₂SO₄:HNO₃=3:1）混合物中于100 ℃氧化反应4 h得到截短的CNTs，后者经6000 rpm离心后，沉淀于超声波水槽中用丙酮反复清洗5遍以去除杂质，再于40 ℃真空干燥16 h，得到的黑色粉末状物质即为截短的多壁碳纳米管（CNTs）。制得的CNTs 具有高度亲水性的表面，可溶于水溶液中，因为强酸氧化不仅截短了CNTs，而且改变了其表面的化学性质，即其表面高度羧基化。将50 mg CNTs溶于50 ml去离子水中，加入3个当量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）于室温下活化2 h，然后加入3个当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和一定量的聚乙二醇（H₂N-PEG-NH₂ (Mw=2000)），45 ℃搅拌过夜。于50 ℃在对比压力下去除溶剂以浓缩混合物，然后将其溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，将其逐滴加入二甲基甲酰胺/乙基醋酸（体积比为30:70），过滤，沉淀物用二甲基甲酰胺/乙基醋酸（体积比为30:70）反复清洗5遍后，于40 ℃真空干燥过夜。得到的PEG-CNTs溶于去离子水中，超声波处理使其分散于水溶液中，调整浓度为1 mg/ml。通过上述的制备步骤，制得特定长度且表面修饰有聚乙二醇支链的功能性碳纳米管；

2）将含有15mg HER-2特异性单克隆抗体的300μl herceptin溶液稀释至浓度为2mg/ml，按照IgG：papain为50:1的比例加入60μl的浓度为5mg/ml的papain溶液，在上述混合液中加入EDTA和DTT，使两者的中浓度分别为2mM和1mM，置于37℃水浴箱孵育2h后，加入碘乙酰胺，使其终浓度为0.5mM，终止反应；

3）用PBS反复清洗Protein A 过滤柱5遍后，将上述酶切的HER-2特异性单克隆抗体混合物过柱，液体收集于EP管中，每管收集1ml。再用PBS反复清洗Protein A 过滤柱3遍后，再用Gly·HCl (pH=2.7)洗脱 Protein A 过滤柱3遍，洗脱液收集于EP管中，每管收集1ml，每管加入60μl的Tris·HCl (pH=9.0)；

4）取0.195g 2-吗啉乙磺酸（MES）和0.2925g NaCl 溶于10ml 双蒸水中充分溶解，调节pH值为6.0，制得MES缓冲液，取出1ml备用，加入EDC和NHS，使两者终浓度分别为0.4M和0.1M，充分混匀后加入浓度为50ml/ml的HER-2特异性单克隆抗体溶液50ul，将上述混合液于室温下震荡15min，再加入前述制得的浓度为1mg/ml的PEG-MWCNTs500ul，充分混匀后，室温下搅拌反应2h后，以20000rpm的转速于4℃离心10min，弃上清，用1ml PBS重悬，反复离心4次，去除游离杂质，得到的沉淀物用双蒸水重悬，即得到HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管药物载体；

   5）将上述PEG-CNTs- HER-2Fab水溶液 1mg/ml 4ml (碳管的含量为4mg)加入到4g 紫杉醇的无水乙醇溶液中（紫杉醇的浓度为10mg/g）。在磁力搅拌下，将4ml去离子水缓慢加入体系中，再将2ml 4mg/ml阿霉素水溶液也加入到此载药体系中，此过程耗时2h。在室温下继续搅拌20h。6000rpm离心5min，取上层液体，将液体12,000rpm 离心60min。将其沉淀真空冷冻干燥，即可得到本发明制备的PEG-CNTs-Anti HER-2Fab -ADM-Taxol复合物。HPLC检测，ADM和Taxol的载药量均大于10%。

 

实施例2  乳腺癌细胞体外实验，

采用HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3，将SKBR-3细胞与阿霉素(ADM)) HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管药物PEG-CNTs- AntiHER2 Fab -ADM、紫杉醇（Taxol ）HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管药物PEG-CNTs- AntiHER2 Fab -Taxol及HER-2靶向性碳纳米管载亲水性药物阿霉素和疏水性药物紫杉醇两种抗癌药的药物制剂（PEG-CNTs- AntiHER2 Fab -ADM-Taxol）共培养48h，MTT检测细胞活性，结果显示，本发明ADM-Taxol双药组对细胞的抑制作用明显大于ADM和Taxol单药组 (p<0.05,n=6)。 

Claims (9)

1.同载亲水和疏水药物的靶向复合纳米药物制剂，其特征在于，由聚乙二醇化的高纯度碳纳米管作为载体， HER-2作为靶向分子，碳纳米管药物载体上连接有HER-2特异性单克隆抗体的Fab片段，其上连接亲水性和疏水性抗癌药物。

2.按权利要求1所述的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂，其特征在于，所述的亲水性抗癌药物为阿霉素，所述的疏水性抗癌药物为紫杉醇。

3.按权利要求1所述的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂，其特征在于，所述的碳纳米管长度为约50-200nm。

4.按权利要求1所述的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂，其特征在于，所述的HER-2特异性单克隆抗体Fab片段其分子量约40KD。

5.权利要求1所述的同载亲水和疏水药的靶向复合纳米药物制剂的制备方法，其特征在于， 其包括步骤：

用强酸氧化碳纳米管，制得表面有羧基修饰的高纯度碳纳米管，在1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的催化作用下，将聚乙二醇通过其末端的氨基接枝到制得的碳纳米管的表面羧基上，制得表面有聚乙二醇修饰的高纯度多壁碳纳米管；

再在催化剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的催化作用下将HER-2特异性单克隆抗体的酶切Fab片段连接至碳纳米管表面的PEG另一端的氨基上，制得HER-2特异性单克隆抗体Fab片段靶向性碳纳米管；

制得的Fab片段靶向性碳纳米管PEG-CNTs-Fab先加入到疏水性抗癌药物无水乙醇溶液中，在此体系中滴加去离子水，使多余药物析出，之后再滴加亲水性药物水溶液，制得同载亲水和疏水药物的靶向复合纳米药物制剂。

6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表面有羧基修饰的高纯度多壁碳纳米管长度为50-200nm。

7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇为聚乙二醇2000。

8.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的制得表面有聚乙二醇修饰的高纯度多壁碳纳米管的长度为50-200nm。

9.按权利要求5所述的的方法，其特征在于，所述的亲水性抗癌药物为阿霉素，所述的疏水性抗癌药物为紫杉醇，该两药物共同连接在同一碳纳米管药物载体上。

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