CN107865970B - 一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其应用 - Google Patents

一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其应用。本发明首先提供了一种新型纳米金刚石多功能靶向给药体系，该体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石以共价方式结合靶向分子形成靶向分子‑纳米金刚石，所述靶向分子‑纳米金刚石以非共价方式负载抗癌药物形成靶向分子‑纳米金刚石‑抗癌药物。本发明还提供了一种上述体系的合成方法，该方法简单，易于操作。进一步本发明提供了一种用于可视化纳米金刚石给药体系与癌细胞作用过程的三维拉曼成像技术，可实现精准定位肿瘤，有效杀伤癌细胞，并可视化细胞内吞过程，对肿瘤的治疗具有重要的意义。

Description

一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其 应用
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域。更具体地，涉及一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系的构建及其应用。
背景技术
随着医学技术进步和材料科学发展，药物传输系统在癌症治疗中的优势逐渐显露。目前，基于脂质体和高分子材料的抗癌载药系统已经有大量临床应用，这些体系在癌症治疗中有优异的表现，而且造价与普通药物也相差无几。在应用广泛的给药体系中，有些为了更好地实现定向给与癌细胞药物，会在体系中同时负载靶向分子和配体，并且这些多功能靶向给药体系的临床表现特别优异。然而，在不断的尝试中，依然面临众多问题，比如给药体系的稳定性、特异性、生物兼容性和潜在副作用等等。因此，开发稳定的，具备良好生物兼容性的靶向给药体系，已成为癌症治疗领域的一个重要研究方向。
顺铂、阿霉素和紫杉醇是被成熟应用于临床的经典化疗药物，可有效抑制肿瘤细胞的增殖，被广泛地用在多种肿瘤的治疗中，如卵巢癌，大肠癌，非小细胞肺癌，子宫癌等。但这些药物单独使用，常易引发耐药而致预后较差，同时正常体细胞对药物的毒性反应也限制其临床应用。因此，需要开发新的药物运输体系，以降低这些药物的非特异性毒性。文献[Ashwin AB,Vyomesh P,Julie G,Zhang G,Alioscka AS,Andrius M,Richard DL,Roberto W,and James FR.Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitrowith EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.ACS Nano.2009,3(2):307-316]中曾报导，将表皮生长因子和顺铂负载于碳纳米管上，用于靶向杀死多种癌细胞，其优越的治疗效果也用活体实验进行验证。但是，碳纳米管的潜在生物毒性和恰当的靶向分子的选择，需要进一步分析和确定。
纳米金刚石作为碳材料家族一员，具备良好的生物兼容性，能有效地通过内吞或者其他机制被细胞摄取；同时，纳米金刚石具备良好的化学稳定性，而且表面性质活泼，易于与化学或生物分子通过共价或非共价键方式结合，DNA、蛋白质、抗原抗体等生物分子可以固定在纳米金刚石的表面，并保持其生物活性；此外，纳米金刚石相对大的比表面积，更便于药物负载，协助一些抗癌药物进入细胞，发挥药效。因此纳米金刚石能够作为抗癌药物有效的转运载体，用于构建靶向给药体系。
在癌症治疗中，靶向给药的靶点选择也至关重要。比如，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)，在许多实体肿瘤中高表达或表达异常，其功能和表达的改变，在多种肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用，因此，EGFR目前被作为肿瘤治疗的主要靶点。而之前的研究发现，EGFR的内源配体EGF,在作为靶向分子时，存在诱发细胞迁移的潜在危险，不完全适合用于抗癌体系。所以，我们必须选取定位EGFR更合适的靶向分子，比如西妥昔单抗。西妥昔不仅是一种定向EGFR的配体，而且本身还是一种美国FDA批准的抗癌药物，这种叠加优势使得关于西妥昔应用的研究不断深入。此外，还有很多靶向癌细胞表面其他位点的分子，如转铁蛋白和叶酸，也被分析讨论。
目前，在癌症治疗中，除了靶向给药体系的治疗效果，实现对靶向给药体系与细胞相互作用过程的可视化监测，也是一大重要议题。通常，大家采用荧光成像技术，用荧光分子修饰给药体系，用于观测给药体系与细胞相互作用，实现对癌症治疗的检测。但是，荧光技术存在很多亟待解决的问题，如稳定性差，光漂白和生物自发荧光干扰等，极大地限制了荧光成像技术的应用。而拉曼成像技术，因具备非侵入性，自发性和高分辨等优势，其在生物体成像中的广阔应用前景，被不断挖掘和开发。但是有关该领域内前人对拉曼成像扫描方式的研究都是基于点扫描叠加，单纯扫描一张完整的细胞图像，需要4-5小时，获得3D图像，可能需要几天的时间。
因此，提供一种能与肿瘤细胞表面特异性结合同时负载抗癌药物的以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系以及利用三维拉曼成像技术，实现对纳米金刚石靶向给药体系与癌细胞间的相互作用过程的可视化对于肿瘤的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新型多功能靶向给药体系，该靶向给药体系可以定向杀伤肿瘤细胞。
本发明的第二个目的在于提供一种上述靶向给药体系的合成方法，该方法简单，易于操作。
本发明的第三个目的在于提供一种上述靶向给药体系的可视化方法，以三维拉曼成像技术为基础，实现对纳米金刚石多功能靶向给药体系与肿瘤细胞相互作用过程的观察。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系，所述靶向给药体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石以共价方式结合靶向分子形成靶向分子-纳米金刚石，所述靶向分子-纳米金刚石以非共价方式负载抗癌药物形成靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物；其中，所述靶向分子为西妥昔单抗、叶酸或转铁蛋白；所述抗癌药物为顺铂、阿霉素或紫杉醇。
本发明进一步提供了上述靶向给药体系的合成方法，包括以下步骤：
1)纳米金刚石均一化
纳米金刚石与混合酸混合反应，其表面多种官能团被羧基化，得到表面均一的羧基化纳米金刚石；
2)共价结合靶向分子
在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液存在的条件下，羧基化的纳米金刚石和靶向分子共价结合形成稳定的复合物靶向分子-纳米金刚石；
3)非共价负载药物
所述靶向分子-纳米金刚石通过非共价方式负载抗癌药物，得以纳米金刚石为载体负载抗癌药物的靶向给药体系，即靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物给药体系。
步骤1)具体通过如下步骤实现：将纳米金刚石粉末加入到混合酸中，于70℃搅拌12-24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入氢氧化钠，于70℃搅拌60min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，测定其pH值，然后用去离子水进行多次清洗，使其pH值呈中性，得到表面均一的羧基化纳米金刚石。
其中，所述混合酸是硫酸和硝酸的混合物；所述硫酸和硝酸的体积比为2-4：1；所述混合酸将纳米金刚石进行羧基化，从而使得其表面均一化。
步骤2)具体通过如下步骤实现：将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10min，得羧基化的纳米金刚石水溶液；向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和靶向分子水溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得靶向分子-纳米金刚石。
其中，所述羧基化的纳米金刚石水溶液的浓度为1-5mg/mL(例如为：1、2、3、4或5mg/mL等)。
所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液的浓度为1-3mg/mL(例如为：1、2或3mg/mL等)；所述N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度为1-3mg/mL(例如为：1、2或3mg/mL等)。
所述靶向分子水溶液的浓度为1-5mg/mL(例如为：1、2、3、4或5mg/mL等)。
步骤3)具体通过如下步骤实现：将靶向分子-纳米金刚石分散于水中，然后加入抗癌药物水溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得以纳米金刚石为载体负载抗癌药物的靶向给药体系，即靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物给药体系。
其中，所述抗癌药物水溶液的浓度为0.5-3mg/mL(例如为：0.5、1、2或3mg/mL等)。
在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液的存在下，靶向分子上的氨基和纳米金刚石上的羧基以酰胺键的方式，共价结合形成稳定的复合物靶向分子-纳米金刚石，然后纳米金刚石通过吸附的方式负载抗癌药物。
本发明对上述靶向给药体系中靶向分子的结合方式和抗癌药物负载量进行了测定(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)：
1)西妥昔单抗与纳米金刚石共价结合的验证
收集西妥昔单抗-纳米金刚石样品，80℃烘干12h，采用傅立叶变换红外光谱仪，验证西妥昔单抗与纳米金刚石间酰胺键的形成，表明其以共价方式结合。
2)抗癌药物负载量的测定
用王水将以纳米金刚石为载体负载抗癌药物的靶向给药体系，即西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系充分溶解，然后用去离子水进行适当的稀释，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对顺铂的负载量进行检测。具体的公式为：顺铂负载量(μg/100μg)＝顺铂的量/反应所用的纳米金刚石的量。经测定顺铂负载率为1.2±0.3μg/100μg纳米金刚石。
本发明还提供了上述多功能靶向给药体系在制备抗肿瘤药物或试剂中的应用。
本发明进一步还提供一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系与肿瘤细胞相互作用的可视化方法，以三维拉曼成像技术为基础，实现对其作用过程的观察，包括以下步骤：
1)用于拉曼观测的细胞样品的制备
首先将纳米金刚石载药体系的溶液，与肝癌细胞作用2-4h，然后用缓冲液清洗三次，得到细胞样品；
2)三维拉曼观测的实现
将细胞样品小皿置于共聚焦拉曼显微镜的60倍水镜上，用532nm激发波长光源，采用线扫描方式，对一个约8微米厚细胞，进行三维拉曼逐层扫描，间隔为2微米，获得多层图像后，用Image J图像软件对其进行叠加处理，获得三维图像。
另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下：
1、本发明以纳米金刚石为载体构建的给药体系，为靶向杀伤肿瘤细胞提供了新的给药体系。
2、本发明的以纳米金刚石为载体构建的给药体系，通过靶向分子上的氨基和纳米金刚石上的羧基共价结合形成稳定的复合物靶向分子-纳米金刚石，然后再通过非共价的方式吸附抗肿瘤药物。
3、本发明的以纳米金刚石为载体构建的给药体系的合成方法简单方便，而且负载的抗癌药物与细胞作用时，释放量可以被细胞内环境pH值变化所调控，具有一定的缓释作用，会降低负载药物的副作用。
4、本发明采用的三维拉曼成像技术，能有效地无损观测以纳米金刚石为载体构建的给药体系与癌细胞作用过程，全面反应新的给药体系对细胞造成的影响。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)的制备流程图。
图2示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)中，西妥昔单抗与纳米金刚石通过酰胺键共价结合的红外光谱图。
图3a示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)的Zeta电位图。
图3b示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)的粒径分布图。
图4示出了三维拉曼成像用于可视化细胞与纳米金刚石作用过程的示意图。
图5示出了三维拉曼成像用于观察以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)与对照组在细胞内吞过程的差异。
图6a示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)对肝癌细胞的杀伤效果。
图6b示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)对肝癌细胞的靶向性。
图7示出了表皮生长因子-纳米金刚石-顺铂给药体系和西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系对肝癌细胞的杀伤效果。
图8示出了以纳米金刚石为载体构建的给药体系(以西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂为例)对子宫颈癌细胞的杀伤效果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1)纳米金刚石均一化
将0.5g纳米金刚石粉末加入到硫酸和硝酸的混合酸(硫酸和硝酸的体积比为3：1)中，于70℃搅拌24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入10mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于70℃搅拌60min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，然后用吸管吸取上层清液并测定其pH值，将所述第二混合物进行多次清洗，使其pH值呈中性，得表面均一的羧基化纳米金刚石。
2)共价结合西妥昔单抗
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10min，得浓度为1mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液；取100μL浓度为1mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液，向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入100μL浓度为2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、100μL浓度为2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和100μL浓度为1mg/mL的西妥昔单抗水溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得西妥昔单抗-纳米金刚石。
3)非共价负载顺铂
将所述西妥昔单抗-纳米金刚石分散于100μL水中，然后加入100μL的浓度为1mg/mL的顺铂水溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系，即西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系(见图1)。
用傅立叶变换红外光谱仪(Excalibur 3100，Varian，America)，验证西妥昔单抗与纳米金刚石间酰胺键(CO-NH)的形成(见图2)，采用Zetasizer3000HS(MalvernInstruments,Malvern,England)仪检测西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系的粒径分布(见图3a)和zeta电位(见图3b)。采用电感耦合等离子体发射光谱仪(710-ES，Varian，America)对负载的顺铂量进行检测，顺铂负载率为1.2±0.3μg/100μg纳米金刚石。
4)三维拉曼观测的实现
首先将纳米金刚石载药体系的溶液，与肝癌细胞(HepG2细胞)作用2h，然后用缓冲液清洗三次，然后直接将细胞样品小皿置于共聚焦拉曼显微镜的水镜上。三维拉曼扫描时，用532nm激发波长光源，然后采用线扫描方式，实验结果见图4和图5。从图4中可以看出，对一个约8微米厚细胞，进行逐层扫描，间隔为2微米。获得图4C中多层图像后，用Image J图像软件对其进行叠加处理，获得图4D中所示三维拉曼图像。从图4C中可以观察到，经过两个小时的作用，纳米金刚石载药体系会通过靶向分子与受体的识别过程，结合到肝癌细胞表面上。金刚石信号呈现绿色环状围绕在细胞周围。这样可以明确纳米金刚石与细胞的相对位置，从而实现对载药体系的定位和可视化观察。从图4D可以从不同角度观察金刚石载药体系与癌细胞的相对位置，为进一步实现对纳米金刚石载药体系在细胞内分布的可视化观察提供便利。
图5给出三维拉曼成像技术用于验证靶向分子对金刚石载药体系治疗效果提升的重要作用。其中，从图5A2中可以看出金刚石表面不负载任何靶向分子的细胞内吞效果，而图5B2中可以看出金刚石表面负载西妥昔靶向分子的细胞内吞效果。明显可以观察到，图5B2中有更多的金刚石信号分布在癌细胞内，而图5A2中仅有少量金刚石信号分布在细胞表面，这说明，西妥昔能显著提升金刚石载药体系的靶向效果，从而促进细胞对抗癌药物的内吞，以获得更好的爱细胞杀伤效果。
实施例2
1)纳米金刚石均一化
将0.5g纳米金刚石粉末加入到硫酸和硝酸的混合酸(硫酸和硝酸的体积比为2：1)中，于70℃搅拌12h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入10mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于70℃搅拌60min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，然后用吸管吸取上层清液并测定其pH值，将所述第二混合物进行多次清洗，使其pH值呈中性，得表面均一的羧基化纳米金刚石。
2)共价结合叶酸
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10min，得浓度为5mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液；取100μL浓度为5mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液，向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入100μL浓度为3mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、100μL浓度为3mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和100μL浓度为5mg/mL的叶酸水溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得叶酸-纳米金刚石。
3)非共价负载阿霉素
将所述叶酸-纳米金刚石分散于100μL水中，然后加入100μL的浓度为3mg/mL的阿霉素水溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得以纳米金刚石为载体负载阿霉素的靶向给药体系，即叶酸-纳米金刚石-阿霉素给药体系。
实施例3
1)纳米金刚石均一化
将0.5g纳米金刚石粉末加入到硫酸和硝酸的混合酸(硫酸和硝酸的体积比为4：1)中，于70℃搅拌18h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入10mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于70℃搅拌60min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，然后用吸管吸取上层清液并测定其pH值，将所述第二混合物进行多次清洗，使其pH值呈中性，得表面均一的羧基化纳米金刚石。
2)共价结合转铁蛋白
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10min，得浓度为3mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液；取100μL浓度为3mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液，向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入100μL浓度为2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、100μL浓度为2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和浓度为3mg/mL的转铁蛋白溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得转铁蛋白-纳米金刚石。
3)非共价负载紫杉醇
将所述转铁蛋白-纳米金刚石分散于100μL水中，然后加入100μL的浓度为0.5mg/mL的紫杉醇溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得以纳米金刚石为载体负载紫杉醇的靶向给药体系，即转铁蛋白-纳米金刚石-紫杉醇给药体系。
实验例1对肝癌细胞的杀伤效果检测
实验组1：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、实施例1合成的西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、与给药体系顺铂量一致的含顺铂(浓度为1.2μg/mL)的无血清培养基培养4h；分别吸去含纳米金刚石的培养基、含西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基和含顺铂的培养基，然后用PBS溶液分别将培养好的三组细胞冲洗3遍，再将每组冲洗后的细胞分别用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用细胞计数试剂盒-8(CCK8试剂盒)分别检测三组细胞的存活率。
实验组2：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为两组，然后分别用含EGFR抗体(浓度为5ug/mL)的无血清培养基、单一的无血清培养基培养2h；然后分别吸去含DMEM溶液的无血清培养基，用PBS溶液分别将培养好的两组细胞冲洗3遍，再将冲洗后的两组细胞分别用实施例1合成的西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的培养基培养4h；然后吸去西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基并用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒分别检测两组细胞的存活率。
对照组：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞用含DMEM溶液的无血清培养基培养4h，然后吸去含DMEM溶液的无血清培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒检测细胞的存活率。
结合图6a比较实验组1和对照组，在培养基中加入纳米金刚石，细胞存活率为99.14±8.40％，表明纳米金刚石本身在此浓度下对HepG2细胞没有毒性，验证纳米金刚石良好的生物兼容性；在培养基中加入西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率为57.99±12.22％，表明西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下可以有效地杀死HepG2细胞；在培养基中加入与给药体系顺铂量一致的顺铂，细胞的存活率为82.33±16.86％，表明与给药体系顺铂量一致的顺铂在给药浓度下对HepG2细胞杀伤效果很差，进一步验证西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂靶向给药体系可以将药物顺铂集中作用于肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。
结合图6b比较实验组2和对照组，在培养基中加入EGFR抗体后再加入西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂靶向给药体系，细胞存活率为93.34±1.29％，表明在HepG2细胞表面的EGFR被封闭后，西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系丧失靶向杀伤肿瘤细胞的能力。进一步证明了西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系靶向杀死HepG2细胞的特异性。
实验例2与其他靶向给药体系相比对肝癌细胞杀伤效果提升的检测
实验组：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞中加入实施例1中合成的西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基4h，然后吸去含西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用细胞计数试剂盒-8(CCK8试剂盒)分别检测细胞的存活率。
对照组：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞中加入按照实施例1流程制备的表皮生长因子-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基4h。然后吸去含表皮生长因子-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用细胞计数试剂盒-8(CCK8试剂盒)分别检测细胞的存活率。
结合图7，比较对照组和实验组，相对于表皮生长因子-纳米金刚石-顺铂给药体系，在培养基中加入西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率降为60.8±1.32％，表明西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下，比表皮生长因子-纳米金刚石-顺铂给药体系，可以更有效地杀死HepG2细胞，这说明相对于表皮生长因子这种内源配体，西妥昔单抗有更好的抗癌作用效果。这个实验结果进一步验证西妥昔单抗作为靶向分子的给药体系可以更有效地将药物顺铂集中作用于肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。
实验例3对子宫颈癌细胞的杀伤效果检测
实验组：选用子宫颈细胞(HeLa细胞)为肿瘤细胞，将HeLa细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、实施例1合成的西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、与给药体系顺铂量一致的含顺铂(浓度为1.2μg/mL)的无血清培养基培养4h；分别吸去含纳米金刚石的培养基、含西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基和含顺铂的培养基，然后用PBS溶液分别将培养好的三组细胞冲洗3遍，再将每组冲洗后的细胞分别用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒分别检测三组细胞的存活率。
对照组：选用子宫颈癌细胞(HeLa细胞)为肿瘤细胞，将HeLa细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×103个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基中的DMEM溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞用含DMEM溶液的无血清培养基培养4h，然后吸去含DMEM溶液的无血清培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒检测细胞的存活率。
结合图8比较实验组和对照组，在培养基中加入纳米金刚石，细胞存活率为113.08±2.26％，表明纳米金刚石在给药浓度下对HeLa细胞没有毒性，进一步验证纳米金刚石良好的生物兼容性；在培养基中加入西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率为61.49±4.60％，表明西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下可以有效地杀死HeLa细胞；在培养基中加入与给药体系顺铂量一致的顺铂，细胞的存活率为91.22±3.52％，表明给药体系顺铂量一致的顺铂在给药浓度下对HeLa细胞杀伤性较差，进一步验证西妥昔单抗-纳米金刚石-顺铂给药体系可以将药物集中作用肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系，其特征在于，所述靶向给药体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石以共价方式结合靶向分子形成靶向分子-纳米金刚石，所述靶向分子-纳米金刚石以非共价方式负载抗癌药物形成靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物；其中，所述靶向分子为西妥昔单抗；所述抗癌药物为顺铂、阿霉素或紫杉醇。
2.如权利要求1所述的多功能靶向给药体系的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)纳米金刚石均一化：纳米金刚石与混合酸混合反应，得到表面均一的羧基化纳米金刚石；
2)共价结合靶向分子：在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液存在的条件下，羧基化的纳米金刚石和靶向分子共价结合形成稳定的复合物靶向分子-纳米金刚石；
3)非共价负载药物：所述靶向分子-纳米金刚石通过非共价方式负载抗癌药物，得到以纳米金刚石为载体的多功能靶向给药体系，即靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物给药体系。
3.按照权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤1)中所述纳米金刚石均一化是将纳米金刚石粉末加入到混合酸中，于70℃搅拌12-24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入氢氧化钠，于70℃搅拌60min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，测定其pH值，然后用去离子水进行多次清洗，使其pH值呈中性，得到表面均一的羧基化纳米金刚石。
4.按照权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，所述混合酸为体积比为(2-4)：1的硫酸和硝酸的混合物。
5.按照权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤2)中所述共价结合靶向分子是将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10min，得羧基化的纳米金刚石水溶液；向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液和靶向分子水溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得靶向分子-纳米金刚石。
6.按照权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述羧基化的纳米金刚石水溶液的浓度为1-5mg/mL；所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液的浓度为1-3mg/mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度为1-3mg/mL；所述靶向分子水溶液的浓度为1-5mg/mL。
7.按照权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述非共价负载药物是将所述靶向分子-纳米金刚石分散于水中，然后加入抗癌药物水溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为1200rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得以纳米金刚石为载体负载抗癌药物的靶向给药体系，即靶向分子-纳米金刚石-抗癌药物给药体系。
8.按照权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述抗癌药物水溶液的浓度为0.5-3mg/mL。
9.权利要求1所述多功能靶向给药体系在制备抗肿瘤药物或试剂中的应用。
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