CN1236760C - 含有存在于过饱和溶液中的包载化合物的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了含有包载在过饱和溶液中的化合物的脂质体组合物以及该组合物的制备方法。

Description

含有存在于过饱和溶液中的包载化合物的脂质体
发明领域
本发明涉及脂质体组合物和制备脂质体的方法。过饱和溶液中的本发明脂质体在其水性内核中包载药物，提供了高药脂比的脂质体。
发明背景
脂质体是一种包载有水性体积的完全闭合的类脂双层膜。脂质体可以是单室囊泡(具有单层双层膜)或多室囊泡(洋葱状结构，其特征是由水性层隔开的多层双层膜)。其中双层由两层具有疏水性“尾基”区域和亲水性“头基”区域的类脂单层所构成。在这样的双层膜结构中，类脂单层的疏水性(非极性)“尾基”朝向双层中心，而其亲水性“头基”朝向水相。
脂质体的一个主要用途是用作许多物质的载体，例如药物、化妆品、诊断剂、生物活性化合物等。脂质体所包载的亲水性试剂结合于脂质体结构中的水性空间内(主要是内部中央隔室以及类脂双层间的空间内)。亲脂性药物则典型地结合于类脂双层中。
脂质体药物制剂可提高治疗效果，使药物释放和治疗活性延长，提高治疗率并有可能降低治疗某种疾病或病症所需的总施用量。有关综述，可参见G.Gregoriadis作为药物载体的脂质体，Wiley&Sons出版社，纽约(1988)。
制备脂质体和用脂质体负载治疗化合物的方法很多。负载药物的最简单方法是被动包载，其中用包含水溶性药物的水溶液水合干燥类脂膜，即可形成脂质体。其他被动包载方法包括脱水—再水化法，即将预先形成的脂质体加到包含药物的水溶液中，然后将混合物冻干、蒸发或冻融而脱水，其中可对多室囊泡重复冻融，以促进其水合作用并提高负载率。
然而，被动包载的药物包载效率一般较低。低药脂比是导致脂质体制剂不能达到预期有效治疗效果的一个主要缺陷。例如，对于肿瘤组织的治疗来说，外渗进入肿瘤组织要求脂质体的大小约为80-140nm。尺寸太小对药物负载有一定的限制，这在药物被动包载和/或药物的溶解度有限和/或药物对类脂的亲合力较低时尤为明显。低药脂比就需要施用较大的类脂剂量，才能达到所需的药物剂量。
采用高浓度的类脂或者不同类脂组分的特定组合，可能部分地提高药物负载率。例如，可将两亲性胺例如阿霉素更有效地包裹于包含负电荷的脂质体膜中(Cancer Res. 42：4734-4739(1982))。这种表面静电性药物与脂质体的结合，虽然在试管中非常稳定，但经全身给药时会非常快地(几乎是立即)释放药物。
因此，如何以足够高的药脂比负载那些无荷电和非亲脂性药物或在水相中溶解度较低的特定药物以达到有效的治疗效果，是我们面临的一项挑战。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供一种脂质体组合物，其中的亲水性化合物以高药脂比负载于脂质体中。所述药物以过饱和状态负载于脂质体中，因此达到了较高的药脂比。
在本发明另一个实施方案中，本发明提供制备脂质体组合物的方法，其中的亲水性化合物以过饱和状态负载于脂质体中。
在另一个实施方案中，本发明包括制备脂质体的方法，所述化合物以过饱和状态包载于脂质体中。该方法包括：(i)选择处于某种条件下时其室温水溶解度可增加至少2倍的化合物；(ii)对脂质体大小加以选择，所述脂质体大小可有效地抑制脂质体中包载的化合物析出；和(iii)将化合物包裹于脂质体中。
在另一实施方案中，所述方法中采用的化合物是可增加其室温水溶解度的化合物。所述可引起化合物水溶解度增加的条件选自(i)提高溶剂温度，(ii)加入共溶剂和(iii)调节溶剂pH。
在本发明的一个实施方案中，本发明脂质体的直径为约60至1000nm。在另一个实施方案中，以约60至1000nm的大小间隔制备含有包载化合物的脂质体，从而达到上述脂质体大小。通过显微镜分析、或者采用其他光谱或散射技术，例如广延(extended)X射线吸收精细结构法，可分析制得的脂质体中是否存有化合物沉淀。
在另一个实施方案中，用药物溶液水合类脂溶液，从而将选定化合物包裹于脂质体中。在另一个实施方案中，用浓缩的药物溶液水合干燥类脂膜，而将选定的药物包载于脂质体中。
在其他实施方案中，脂质体还包括经亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)衍生的类脂。在另一个实施方案中，选择形成类脂双层的类脂能有效地形成刚性类脂双层。
在另一个实施方案中，本发明方法包括从脂质体混悬液外部介质中除去用以保持药物高于其室温溶解度极限的条件。
另一方面，本发明包括根据上述方法制备的脂质体，其中化合物以过饱和状态包载于脂质体的中央隔室中。在这一方面，脂质体组合物包括含有成囊类脂和包载于脂质体中的治疗性化合物的脂质体混悬液，通过对脂质体大小加以选择，有效地抑制了脂质体中央隔室中的药物形成沉淀，从而使所述化合物以过饱和状态保持在脂质体中。
在一个实施方案中，脂质体中所用化合物的水溶解度可增加至少2倍。所述可引起化合物水溶解度增加的条件选自(i)提高溶剂温度，(ii)加入共溶剂和(iii)调节溶剂pH。
在本发明的另一实施方案中，描述了制备脂质体的方法，其中化合物以过饱和状态包载于所述脂质体的内部水性隔室中。该方法包括：(i)配制化合物的水溶液，其中化合物以高于其室温溶解度的浓度存在于所述溶液中；(ii)用浓缩的药物溶液水合类脂膜或类脂溶液，形成脂质体；和(iii)调节脂质体大小以抑制化合物析出，从而将包载的化合物保持在过饱和溶液中。
在另一个实施方案中，配制选定化合物的水溶液，其中化合物以高于在37℃时溶解度的浓度存在于所述溶液中。
通过下面的发明详述可更加充分地领会本发明的上述和其他实施方案。
附图简述
图1A-1B为顺式-Pt(15NH3)2Cl2的宽带去偶(图1A)和未宽带去偶(图1B)195PtNMR光谱；
图2为包裹于脂质体中的顺铂的195PtNMR光谱；
图3A-3B为包含顺铂的脂质体(图3A)和对照，空白对照脂质体(图3B)的31PNMR光谱；
图4A-4B为水中顺式-Pt(15NH3)2Cl2的异核单量子相干光谱(图4A)和区域I的放大图(b((图4B)；
图5为顺式-Pt(15NH3)2Cl2包裹于脂质体中以后的异核单量子相干光谱；未归属的峰标记为“X”；
图6是在组氨酸缓冲液存在下，顺式-Pt(15NH3)2Cl2包裹于脂质体中以后的异核单量子相干光谱，其中峰1-7归属于顺式-Pt(15NH3)2Cl2-组氨酸；
图7为顺铂与N-乙酰基组氨酸保温后的异核单量子相干光谱；
图8为晶状顺铂、溶解的顺铂和三种脂质体包载的顺铂样品(液体、冷冻和冻干)的k2-加权Pt L3-吸收边广延X射线吸收精细结构(EXAFS)光谱。为了清晰起见，将光谱垂直移动，其中实线代表数据(圆点表示)的最佳部分；
图9为晶状顺铂的k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱，其中实线代表实验数据，破折线代表最佳拟合(fit)模型函数；
图10为溶于水的顺铂的k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱；其中符号同图9；
图11为脂质体包载的顺铂液态样品的k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱；其中符号同图9；
图12为脂质体包载的顺铂冷冻样品的k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱；其中符号同图9；和
图13为脂质体包载的顺铂冻干样品的k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱；其中符号同图9。
发明详述
I.制备脂质体
一方面，本发明包括制备脂质体组合物的方法，其中化合物以过饱和状态包载于脂质体中。在此所用的“过饱和”，包括使溶液中所含溶质的浓度高于同样条件下达到饱和时所需溶质浓度的条件。即该溶液中所含的溶解溶质高于其与未溶解溶质达到平衡时所需的浓度。
另一方面，通过对包载化合物加以选择，并配制化合物的浓度高于其室温水中饱和浓度的化合物溶液，从而制得所述脂质体。可采用多种方法，配制化合物浓度高于其室温水中饱和浓度的化合物溶液。例如，加热溶液以增加化合物在溶剂中的溶解度，向水性溶剂中加入共溶剂，或者调节水性溶剂的pH。此处该溶液是指“浓溶液”。在一个优选实施方案中，使用的配制浓溶液的方法，可以使化合物在水性溶剂中的溶解度比其室温下水性溶剂中的溶解度增加约2倍，优选约3倍，更优选约4倍。
因此，期望用于本发明组合物和方法中的化合物，包括处于以下条件下时其室温(20-25℃)水溶解度可增加至少2倍、优选至少约3倍和更优选至少约4倍的化合物，所述可引起化合物水溶解度增加的条件包括：(i)提高溶剂温度，(ii)加入共溶剂，或(iii)调节溶剂pH。优选化合物室温下在水中具有有限的溶解度，但其溶解度可随着温度的增加而明显提高。在支持本发明的研究中，选用顺铂为模型化合物。室温时，顺铂在水或盐水中的溶解度为1-2mg/mL。在约60-65℃时，顺铂的溶解度增加到约8-10mg/mL。由此可见，通过控制温度，即可配制用于制备脂质体的浓缩药物溶液。
期望用于本发明的其他化合物包括治疗药物，例如阿昔洛韦、更昔洛韦、taxol、卡铂和其他铂化合物和蒽醌，例如阿霉素、表柔比星、柔红霉素和伊达比星，以及那些水溶性差的抗生素、蛋白质和肽。
接下来描述的是在独立容器中制备类脂囊泡的方法，选择可形成预期类脂囊泡组合物的类脂，并将其溶于适宜溶剂中。适于形成类脂囊泡的类脂是所属领域技术人员已知的。例如，可参见US5,013,556的9栏34-62行，和US5,891,468的7栏5行至8栏48行。用于形成脂质体的类脂组分选自许多成囊类脂，典型地为磷脂和甾醇。选择具有酰基链的相对不饱和类脂，可形成更具流动性的类脂双层，从而使类脂双层对包载化合物的渗透性高于更为刚性的双层。采用高度饱和的磷脂可形成更为刚性的类脂双层，这种类脂双层对包载化合物具有较低的渗透性。在本发明的另一个实施方案中，脂质体包含经亲水性聚合物链如聚乙二醇或其他聚合物衍生的类脂，在例如US5,013,556和5,631,018中加以描述的。
根据包载药物的不同，可对类脂双层组合物加以选择。对于在类脂双层中渗透性较高的药物，可通过用饱和或刚化类脂组分形成类脂双层，以使药物更好地保留在脂质体中。对于那些不易渗透类脂双层中类脂组分的药物，可将其包载于流动性类脂组分形成的脂质体中。
将上述选定的类脂组分溶于适宜溶剂中。用浓缩的药物溶液水合类脂，即可形成脂质体。在整个说明书描述的详细研究中，是采用顺铂浓溶液水合类脂的乙醇溶液(实施例1)。所属领域技术人员可以理解，该浓缩的药物溶液也可用于水合干燥类脂膜，其中除去用于溶解类脂的溶剂即可得到上述用于水合的干燥类脂膜(例如参见，US5,013,556的10栏60-65行)。水合之后，将类脂-药物的混合物进行混合，直至形成脂质体。
采用本领域已知方法，例如超声、匀化或挤压法，可将脂质体调节成特定大小。典型地，应对脂质体的大小加以选择，这样当脂质体组合物所处的条件改变而使浓溶液中药物的溶解度降低时，选定的脂质体大小即可抑制脂质体中央隔室中的沉淀形成。通过制备不同粒径的脂质体组合物，改变用来保持增加的药物浓度的条件和分析脂质体中是否存在药物沉淀，从而确定适宜的脂质体大小。在此所用的“沉淀”或“析出”包括任何形式的药物，例如晶体形式、半固体形式或无定形形式的药物。这种具有使无药物沉淀形成尺寸的脂质体属于本发明范畴。
典型地，脂质体的适宜大小约为60-1000nm，优选约为70-500nm。对脂质体加以分析，以确定是否存在药物沉淀。例如，可采用显微镜法(电子显微镜或高分辨率的低温电子显微镜)目测，或者采用各种光谱技术，例如包括IR、Raman、NMR或散射技术例如广延X射线吸收精细结构(EXAFS)。
典型地，将脂质体调节大小成能抑制药物形成沉淀。当脂质体混悬液外部相所处的用以保持药物高于其室温水中溶解度的条件变化时，就典型地需要脂质体具有抑制药物形成沉淀的作用。例如，如果采用升高温度的方法来增加药物的溶解度以制备药物浓溶液，则脂质体混悬液的温度降低时，就会有药物析出。如果采用升高或降低pH值的方法增加药物溶解度，则pH调至最终所需的pH时，也可能有药物析出。如果向浓溶液加入共溶剂以增加药物的溶解度，则在采用例如膜渗滤(diafiltration)、密度梯度离心、渗析、蒸馏以及真空去除等方法从脂质体外部相除去共溶剂时，也可能导致药物析出。
II.脂质体的特征分析
如上所述，本发明可对室温下具有有限水溶解度的药物提供有效和稳定的包裹。已知此类化合物难于以有效治疗的药脂比包载于脂质体中。在支持本发明的研究中，所述抗癌剂顺铂仅为示例药物。应当理解的是，本发明的组合物和方法还期望用于室温下具有有限水溶解度的多种化合物以及其他上述示例药物。
顺铂(顺式-二氯·二氨合铂(lI))是一种重金属络合物，其中的中心铂原子被两个氯原子和两个氨分子以顺位环绕。顺铂广泛用于治疗多种实体瘤，包括睾丸、头颈和肺部肿瘤。同其他抗癌症化学治疗剂一样，顺铂是一种高毒性药物。顺铂的主要缺点是可导致严重的中毒性肾损害(是其主要的剂量限制因素)、经肾快速排泄(循环半衰期仅为几分钟)以及强的血浆蛋白质亲合力(Freise，J.等，Arch.Iht.Pharmacodyn.， 258：180-192(1982))。将顺铂包裹于脂质体中，作为克服其毒性的方法，已经在例如US5,945,122(Abra等)；Gondal，J.A.等，Eur.J.Cancer， 29A(11)：1536-1542(1993)；Sur，B.等，Oncology，40：372-376(1983)；Weiss，R.B.等，Drugs， 46(3)：360-377(1993)中加以描述。然而，由于其较低的水溶解度(室温下约1-2mg/mL)和较低的亲脂性，二者都会导致低的药脂比，顺铂很难有效地包载于脂质体中。
按实施例1方法，可制备过饱和状态下包含于脂质体的顺铂。简单地说，以高于药物在室温下溶液中的溶解度极限(约20-25℃，pH＝7)的浓度，配制水性药物溶液。在这种情况下，可通过加热溶液来提高药物的溶解度。也可采用其他如上所述的方法来增加所述药物在室温水溶液中的溶解度。然后用配制的溶液水合用于形成脂质体类脂双层的类脂，从而形成了在中央内核隔室中包含有过饱和药物溶液的脂质体。更具体地说，尤其是采用顺铂的情况下，脂质体中包含的顺铂浓度约为8mg/ml，该浓度约为其室温溶解度(1-2mg/mL)的4倍。脂质体经挤压法调节大小成平均粒径为106nm。
按下面的描述，采用NMR和广延X射线吸收精细结构法(EXAFS)，对包含8mg/ml顺铂的脂质体进行特征分析。
A.NMR特征分析
NMR是评价脂质体制剂的一种有力工具，因为采用这种技术可以评价类脂双层中分子运动的各向异性以及膜结构的各向异性[Fenske，P.B.，Chem.Phys.Lipids  64：143(1993)；Tilcock，C.P.S.，Chem.Phys.Lipids  40：109(1986)]。对于负载了顺铂的脂质体，NMR可提供有关脂质体磷脂(物理状态，运动速度)和铂络合物(氧化态和配位层)的信息。联用NMR和原子吸收光谱法可对脂质体制剂中的可溶性铂进行定量分析。
按实施例2方法，制备包含15N-标记的顺铂脂质体。于60-65℃下负载药物，可将顺铂的溶解度增至约8mg/mL。形成大单室囊泡后，将脂质体混悬液的温度降至4℃，此时药物溶解度约为1-2mg/mL。
1. 195 PtNMR分析
195PtNMR波谱法可提供有关金属的氧化态信息以及铂的第一配位层中4个配位体性质的信息。这是由于Pt络合物的化学位移跨度可达几千ppm，并且化学位移对Pt(II和IV)的氧化态以及与Pt结合的原子的性质均灵敏。
按实施例2A制备顺式-Pt(15NH3)2Cl2，然后用195PtNMR波谱法进行特征分析，其光谱见图1A-1B。如图1A所示，宽带去偶光谱出现预期的三重峰(与2个等位的15N原子偶合)。当停止宽带去偶时，3个195Pt共振峰均被6个等位的H裂分成七重峰，如图1B所示。
如图2所示，对包含顺铂的脂质体进行的15PtNMR测量结果清楚地表明，在-2139.7ppm处出现了一个化学位移(范围从-1350至-2700ppm)。这表明顺铂主要为(＞90％)Pt(II)，即完整的顺铂。未检测到另外的铂峰，这表明未形成其他种类的铂(即铂叔胺或铂季胺)，尽管195PtNMR未能检测到Pt(II)与大分子的加合物。经2-电子歧化反应，Pt(II)可形成固体Pt(0)和可溶性Pt(IV)络合物(尤其是在非酸性溶液中加热时)。样品中未检测到黑色沉淀，表明不存在Pt(0)，并且195PtNMR在+1000ppm至-500ppm的范围未出现峰，表明溶液中不存在Pt(IV)络合物。
2. 31 PNMR分析
31PNMR用于确定磷脂在类脂囊泡中的状态，并可用来确定脂质体制剂大小分布和层数的均匀性。表1列出了脂质体制剂(已经195PtNMR测量)的31PNMR光谱；31PNMR光谱显示了磷脂囊泡的典型轻微不对称峰。195PtNMR用于测定同样样品中铂量。室温下，可观察到31P峰非常宽。这与在低于基质类脂的凝胶-液晶相转变温度(TM)下测定的囊泡的数据一致，所述囊泡含有饱和磷脂以及胆固醇(氢化磷脂酰胆碱的Tm＝52.5℃)，参见Lichtenberg D.等，生物化学分析方法，D.Glick编辑，23卷，Wiley，纽约，337页(1998)。如图3A-3B所示，在60℃(高于其Tm)时，包含铂的脂质体(图3A)和对照脂质体(图3B)均出现了明显的31P光谱。在60℃时，约扫描10次即可得到具有高信躁比的可靠数据。对峰的分析显示，稍微不对称的峰(向右偏)可归属于磷脂囊泡。在半峰高处测定的谱线宽度可用作铂与制剂中磷脂相互作用的判据。于60℃，测定半峰高处的谱宽(Δv1/2)，对照脂质体和顺铂脂质体的结果分别为6.3ppm和4.2ppm。比较包含Pt的脂质体和对照脂质体，表明铂与磷脂间存在较弱的相互作用。Δv1/2 Pt脂质体小于Δv1/2对照脂质体(两种囊泡的粒径相同)，即表明出现了较弱的相互作用。这些数据与100-200nm直径LUV的31P测量结果一致(即蛋黄PC/DSPG 85/15的Δv1/2约为5ppm)[Tilcock，C.P.S.，Chem.Phys.Lipida  40：109(1986)]。谱线宽度暗示其中未混杂。因此，31PNMR的峰形表明不含呈六角形II态的磷脂。
表1供31P和195Pt波谱法测试的脂质体制剂
     制剂      P(mg/mL)  磷脂(mM)  总  类  脂(mg/mL)     Pt(mg/mL)  粒径(nm)
空白对照脂质体   2.65   86     109      -   104
顺铂脂质体   9.75   315     403     1.8   116
3.异核单量子相干(HSQC)分析
尽管195PtNMR波谱法可提供有关Pt络合物氧化态以及第一配位层中原子性质的信息，但是它不能识别水配位体、羧基配位体或磷酸盐配位体(因为它们均通过氧原子与Pt结合)之间的差异。15N NMR波谱法与195PtNMR波谱法联用，可提供一些失去的信息(Barnham，K.J.，铂和其他金属配位化合物在癌症化学治疗中的应用2，Pinedo，H.M.等编辑，Plenum出版社，纽约，1-16页(1996)；Berners-Price，S.J.，J.Am.Chem.Soc. 115：8649(1993))。15N化学位移和15N-195Pt偶合常数对与15N顺位结合的配位体灵敏[Appleton，T.G.等，Inorg.Chem. 24：4685(1985)]。缺少14N会导致195Pt共振峰变尖锐，可得到偶合常数(195Pt-15N，195Pt-1H)。按实施例2，可很容易地制备15N-标记的顺铂[顺式-Pt(15NH3)2Cl2]，但是由于15NNMR的灵敏度较低，而不能在这些实验中用于检测Pt络合物。
反转(inverse)检测实验用来检测与15N偶合的质子，因此可提供有关15N化学位移和偶合常数的信息，这种信息取决于Pt第一配位层中配位体及其氧化态。采用15N-标记的顺铂的主要优点是可进行异核单量子相干或异核多量子相干(分别为HSQC或HMQC)NMR技术。HSQC和HMQC是二维反转检测实验，可检测到轴上的质子化学位移和另一轴上的15N化学位移。15N-标记的Pt络合物HSQC和HMQC已成功地用于微摩尔浓度Pt络合物的检测。在支持本发明的研究中采用了HSQC，这是由于其峰比HMQC狭窄且其分辨率好于HMQC。在典型的HSQC实验中，约20分钟即可检测到微摩尔浓度的顺铂。除了其非常高的灵敏度增益以外，HSQC还可仅选择性地检测与15N偶合的质子，而忽略溶液来自于脂质体中的所有其他质子，从而使数据的分析简单化。
水中的顺式-Pt(15NH3)2Cl2的HSQC如图4A-4B所示。表征Pt(II)络合物的相关峰位于区域I。预计出现Pt(IV)峰的区域II(Barnham，K.J.，铂和其他金属配位化合物在癌症化学治疗中的应用2，Pinedo H.M.等编辑，Plenum出版社，纽约，1-16页(1996))中并未出现峰。区域I的放大图如图4B所示，其中出现3个峰(A，B，和C)，并且每一峰均有附属峰(A1′、A1″，A2′与A2″)。峰A归属于顺式-Pt(15NH3)2Cl2，其中2个等位的N产生单峰。峰B和C归属于顺式-[Pt(15NH3)2Cl(H2O)]+单一络合物，其中峰B归属于与水配位体反式的N，而峰C归属于与氯化物配位体反式的N。由A1′与A1″之间的距离可测量出195Pt-15N偶合常数，由A1″与A2″间的距离可测量出95Pt-1H偶合常数。195PtNMR不能很容易地检测到顺铂的水解反应(已知可在水溶液中发生)，但是HSQC可很容易地检测到。
被动包裹于LUV(约100nm)水相中的顺式-Pt(15NH3)2Cl2的HSQC光谱，与天然药物的光谱几乎相同。但是两者之间也有一定的差异：附属峰的间距略小于它们在母体化合物中的间距。这可能与顺式-Pt(15NH3)2Cl2和类脂间的相互作用有关，或者是与脂质体内部“活性”较低的水有关。未观察到可归属于水层的峰支持后一种推测，因为在天然药物的光谱中可清楚地观察到该峰。另外，如图5所示，包裹顺铂的脂质体的光谱在Pt(IV)区域未出现任何峰，这表明在将顺式-Pt(15NH3)2Cl2包裹于脂质体中的过程中未引起顺铂的歧化反应。另外，光谱中未出现15NH4 +峰则表明：未发生脱氨基作用(脱去15N配位体)，并且所有Pt(II)络合物可采用HSQC实验解释。因此，可以推断出脂质体中所包裹的Pt仅为顺铂和一些顺式-[Pt(15NH3)2Cl(H2O)]+。光谱中可观察到未经确认的峰(标记为′X′)，这些样品经HPLC色谱检测表明仅有非常少的杂质(＜5％)(结果未给出)。
含有顺铂的最终制剂包含组氨酸缓冲液。1H-15N-HSQC NMR的灵敏度足以检测出样品中最轻微量的杂质。当制备脂质体(不含类脂，未包裹)的过程中使用了组氨酸缓冲液，或者在将铂包裹于脂质体中的过程中使用组氨酸缓冲液时，即可观察到这种杂质峰。如图6所示，1H-15N-HSQC光谱测量表明15N-标记的化合物存在附加峰。检测到的任何顺铂-组氨酸归属于脂质体包裹过程中的水性顺铂。其他已知量的氨基酸组氨酸的实验表明，这些杂质峰可归属于包裹过程中缓冲液中药物与组氨酸的结合。这些结合是不可逆的，因此一旦药物与之结合即不能再利用了。利用N-乙酰基-组氨酸上的羧基，可检测到15N-标记的顺铂对生物缓冲液的活性，从而评估组氨酸氨基的影响。将15N-顺铂和N-乙酰基组氨酸(1∶1摩尔比)保温24小时后，会出现各种可能归属于顺铂组氨酸的新峰(如图7所示)。这些结果可通过HPLC进一步确认；所得色谱图证实存在顺铂-组氨酸(检测出约20-30％的铂，结果未给出)。对N-BOC-蛋氨酸也进行了类似的研究。该研究表明，在不含组氨酸缓冲液的情况下进行脂质体包裹，以及在包裹之后加入组氨酸(按实施例1方法)，则组氨酸缓冲液与15N-顺铂之间没有接触(图5)，这使脂质体不易渗漏且非常稳定。研究进一步证实，没有15N-标记的顺铂从脂质体渗漏(未观察到归属于顺铂-组氨酸的峰)。
4. 用 195 PtNMR定量铂含量
对包裹于脂质体中的铂进行了其他参数的测定，这包括药脂比以及具体有多少经脂质体药物呈水溶性顺铂样行为。对于顺铂来说，仅希望脂质体中的可溶性铂释放出来并作用于细胞DNA；任何铂沉淀都将被认为是无效的药物。以K2PtCl4为内标所进行的比较研究表明，195PtNMR与原子吸收波谱法不同，它能仅选择性地定量可溶性顺铂，这样就可清楚地获得脂质体中铂的物理状态。该法无法检测到任何固态的铂(即沉淀或呈超细粒形式的混悬液体)；其T2非常短，谱线增宽使这些峰消逝在基线中。
在37℃和60℃下对脂质体样品进行测量，以研究升高温度对脂质体中铂溶解度的影响。升高温度并未使观测到的峰面积增加；然而，在60℃时检测到非常小的含水峰。这与上述HSQC NMR测量到的数据相吻合。
在这部分研究中，对四份脂质体样品进行了研究，样品的大小和类脂浓度均不同(如表2所示)。这些因素可能对样品的粘度有影响，并可能由此而引起NMR光谱的谱线宽度增宽。未观察到水中可溶性顺铂样品与脂质体顺铂样品之间存在明显的差异。谱线在60℃测量时变宽，这与其较短的T2和快速衰减信号吻合。研究发现，脂质体大小与顺铂峰的谱线宽度之间存在直接相关性：顺铂峰会随着脂质体大小的增加而增宽；类脂浓度与顺铂峰的谱线宽度之间存在反相关性：谱线宽度会随着类脂浓度的降低而增宽。
表2用于[1H，15N]HSQC NMR波谱分析的脂质体制剂
    参数   样品1   样品2   样品3   样品4
   大小(nm)   112   125   100   107
   顺铂(mg/mL)   1.0   1.0   0.9   0.9
   类脂(mM)   104   89   110   110
外部相   10％蔗糖1mM NaCl10mM组氨酸pH 6.5 0.9NaCl10mM组氨酸pH 6.5   3％蔗糖3.3％NaCl10mM组氨酸pH 6.5   3％蔗糖3.3％NaCl10mM组氨酸pH 6.5
   备注   未冷冻   冻融
在制备脂质体制剂的第一阶段，在乙醇存在下制备供上述研究的脂质体，并研究了乙醇对顺铂溶解度的影响。顺铂在室温下0.9％NaCl中和在0.9％NaCl中的20％乙醇中的溶解度为1mg/ml，而在65℃时的溶解度为8mg/ml。顺铂可以1mg/ml的浓度在所有条件状态下溶解，当浓度为8mg/ml时，室温下大部分顺铂会沉淀，而65℃下大部分顺铂会溶解。在存在或不存在20％乙醇的情况下，温度降至室温均可使8mg/ml浓度的顺铂大部分析出。因此，可以断定20％乙醇的存在并不能改善顺铂的溶解度。NMR测量显示，游离顺铂在水相中的溶解度极限约为2mg/ml，温度升高到60℃时其溶解度会增加。NMR检测显示有一个峰的积分约相当于2mg/ml，而事实上未检测到不溶性铂沉淀。对于脂质体而言，顺铂的原子吸收几乎全部由脂质体内水相中的可溶性顺铂所贡献，这暗示顺铂在脂质体内的浓度高于2mg/ml(即室温溶解度)。业已发现，尽管脂质体制备过程中顺铂的浓度高于其室温(或4℃)溶解度，但是脂质体中几乎所有顺铂的行为均与脂质体内水相中的可溶性顺铂相似。对溶解度的研究表明，乙醇对于提高预期药脂比并没有帮助。
NMR研究表明，顺铂在负载到脂质体中的过程中保持完整，并且包裹的顺铂与溶于水相的母体化合物类似(仅有较小的差异)。脂质体中所有顺铂的行为与水溶性药物类似，没有迹象表明存在着不溶性药物。脂质体中的药物未析出。这一事实在下面的EXAFS研究得到了进一步的证实。
B.广延X射线吸收精细结构法(EXAFS)特征分析
EXAFS可提供有关样品中选定原子局部结构的信息。在该方法中，用x-射线光电效应过程发射的光电子散射扫描接近的原子邻域。由散射得到的干涉图样，造成了x-射线吸收系数对能量或光电子波数标度的小幅度振荡。这种效应仅作用于慢光电子(即x-射线吸收边附近高能一侧)。因此，该方法的选择性与目标原子有关。从振动的幅度、相位和周期(对数据进行傅里叶变换可很容易得到)，可以推断出邻原子的数目、种类和距离。进一步分析还可提供热量和/或结构无序(disorder)的程度，从而可以研究晶体以及各种无定形状态物质。
铂的L3吸收边(L3-edge)属于同步辐射单色器处于最佳分辨率的能量区域。因此，对脂质体包裹的顺铂进行Pt L3-吸收边EXAFS光谱测量，可确定样品中Pt原子周围的局部结构。可对液体、冷冻和冻干状态进行系统研究。对固体和溶解形式的游离药物也进行了Pt L3-吸收边测量，以供比较。
图8为晶状和溶解的顺铂以及3种脂质体包裹的顺铂样品(按实施例3制备的液体、冷冻和冻干)的标准k2-加权Pt L3-吸收边EXAFS光谱χ(k)。
图8-13为k2-加权EXAFS傅里叶变换光谱，每个样品按3-1-12-1的k间隔计算(如图8所示)。光谱中的峰与邻近Pt原子的原子连续层相对应。将测量信号与模型信号比较，可由光谱对结构参数进行定量(采用FEFF6程序代码，由光电子在邻原子的试验性空间分布中的散射程ab initio算出)[Rehr，J.J.等，Phys.Rev.Lett.69：3397(1992)]。采用同样方法，可由特定的散射相移确定邻原子的种类。
第一步骤是分析晶状顺铂样品的信号。虽然它与包裹效应的研究并无直接相关性，但是其高质量信号可用作可达分辨率的基准。最重要的是，结晶学数据可用于构建Pt原子的邻域模型(Milburn，G.H.W.等，J.Chem.Soc.A.JCSIA，1609页(1966))。已分别在2.05和2.33得到第一层N和Cl邻原子的信号。可以明确地确定两者的种类以及它们的配位(occupation)数为2。
如同结晶学数据(Milburn，G.H.W.等J.Chem.Soc.A.JCSIA，1609页(1966))所显示的一样，第一层邻原子的高级(order)散射贡献，以及第二层邻原子的散射贡献(包括在3.37的2个Pt)，可以完全解释FT光谱(2.4-4.0)中的其他结构。然而，对于那些处于大致相同距离的其他Cl和N邻原子的贡献，其结晶学模型预测并不能解释上述光谱。
很明显，测量和模型涉及各种晶体变形。在这方面，可在预期位置发现最靠近的邻原子(即顺铂分子本身的N和Cl原子)和邻位分子的最近邻Pt原子，但是不能发现晶体中通过分子特定堆叠而进入Pt原子邻域的其他邻原子。对于邻域，其在k区域(3-1-12-1)和R区域(1.1-4.1)的数据经最佳拟合所得的精细结构参数如表3所示。
表3晶状顺铂、饱和顺铂水溶液以及脂质体包裹的顺铂样品(液体、冷冻和冻干)中Pt周围最近邻配位层的参数
  Pt邻原子a  Na           R(X)a            σ2(χ2)a    拟合r-因子c
                           晶状顺铂N           2.0(2)b      2.052(4)          0.0022(9)          0.007Cl          2.0(2)        2.330(1)          0.0025(3)Pt          2.0(5)        3.37(2)           0.016(3)
                        溶于水的顺铂N           2.3(4)        2.02(1)           0.002(1)           0.006Cl          1.9(2)        2.29(1)           0.003(1)
                     脂质体包裹的顺铂：液体N           2.2(4)        2.01(1)           0.002(1)           0.017Cl          2.3(3)        2.29(1)           0.003(1)
                     脂质体包裹的顺铂：冷冻N           2.4(4)        2.00(1)           0.002(1)           0.022Cl          2.2(3)        2.29(1)           0.003(1)
                     脂质体包裹的顺铂：冻干N           1.9(3)        2.03(1)           0.002(1)           0.005Cl          2.2(3)        2.32(1)           0.003(1)
a缩写：邻原子类型，N＝数目，R＝距离，σ2＝德拜-沃勒因子
b圆括号中的最后一位数字不确定。
c表示拟合优度的量度的拟合r-因子列在最后一列(Stern，E.A.等，
Physica B  208，209：117，(1995))。
晶状样品及其定义明确的最近邻原子也可用来确定另一个参数，例如Pt原子EXAFS信号的振幅减缩因数S0 2。该数据可在具有相似化学(化合价，配位)状态中心原子的不同样品之间相互转换。结果(S0 2＝0.77±0.03)与理论值吻合良好[Roy，M.等，J.Phvs.IV France 7：C2-151-C2-152(1997)]，并可用于后续顺铂样品的分析。
顺铂饱和水溶液的FT光谱如图10所示，它可能是另一种用来鉴定包裹样品中Pt原子邻域的模板(template)。与晶状顺铂的比较显示，3.5距离的所有数据在细节均非常相似。同晶状样品一样，Pt邻域模型以分子中2个N和2个Cl原子的最接近邻层为基础。由1.1-2.5的间隔可获得非常好的拟合(表3)，其模型参数与那些误差间隔内的晶状样品相一致。相同层的高级有序散射贡献将模型的有效性扩展至4，可用来解释区域内小的双峰。经拟合，完全排除了在较大距离处还存在Pt原子邻域(例如在晶状样品中业已证实的)的可能性。相反的发现是指溶液中顺铂分子的聚集，如果存在这种现象，由已知物理化学数据(渗透压，冰点降低)即可确定。在基本最近邻模型的所有可能想象到的扩展中，唯一得到数据支持的是O原子存在较大的扩散层。它很显然描述的是分子水合层信息。那些具有较强组间关联性的参数的测量精度并不能令人满意。然而，重要的一点是其不能向中心Pt原子最接近的区域内扩展。
3种包裹的顺铂样品(分别为液体、冷冻和冻干)的光谱如图11-13所示，尽管其中的噪音较大，但是与顺铂溶液的k-和r-空间光谱完全一致。R间隔为1.1-2.5的定量分析证实了这一观测结果(表3)。同时，排除了存在第二层Pt原子邻域的可能，因此没有迹象表明包裹后的顺铂分子产生了聚集。水合层的残留贡献被噪音淹没。
对Pt原子周围晶体结构的测定，不仅有助于确定聚集状态，而且还可提供有关其化学结构以及化学稳定性的信息。研究表明，所有样品中Pt原子的第一邻原子(即直接结合的Cl和N原子)的距离和配位数目在所有样品中均无变化，这表明顺铂分子不会明显地受系统的物理状态所影响。
对第一配位层中2个N和2个Cl原子的研究证实，包裹的顺铂分子是化学稳定的，并且没有发生水解(即与水交换1个或2个Cl原子)。这种研究方法很重要，因为它可直接从无扰样品中获得结果，而用于这种络合物和精细系统的其他分析方法可能会在样品制备过程中引起化学和物理变化。
在Pt原子的3.37处未出现Pt邻域，这清楚地表明脂质体内部的顺铂溶液未结晶。更具体地说，在晶状样品的变形中未形成结晶[Milburn，G.H.W.等，J.Chem.Soc.A.JCSIA，1609页(1966)；Moeller，M.等，Curr.Op.Cooo.Interf.Sci. 2：177-187(1997)]。然而，已知顺铂存在其他晶体变形[Milburn，G.H.W.等，J.Chem.Soc.A.JCSIA，1609页(1966)]。为了插入水分子(在2.03距离向每一Pt原子提供2个O邻原子)，水合顺铂中的最近邻Pt邻域被移至4以外的距离[Kuroda，R.等，Inorganic Chemisty  22：3620(1983)；Faggiani，R.等，CanadianJournalof Chemistry  60：529(1982)]。包裹的样品和普通溶液均显示O原子并未如此靠近中心Pt。因此，也排除了形成水合晶体结构脂质体的可能。
对药物-类脂双层的广延吸收研究支持EXAFS结果，即顺铂不会被吸收到磷脂酰胆碱双层中[Speelmans，G.等，Biochim.Biophys.Acta1283：60(1996)]。另外，对相同系统进行的195PtNMR研究显示：并未出现任何谱线增宽，并且所有Pt信号可归属于快速旋转药物的狭窄各向同性信号(与游离药物溶液的表征类似)。
冷冻和冻干脂质体样品与液体样品相似。表3数据显示，冷冻或冻干均未引起药物结晶化。这与水在等于脂质体内部大小的孔(＜200nm)中的行为不同于本体水的事实相一致。较大的包裹水分子表面/体积比对冰冻和融化的性质有影响，有可能冻结成不含溶质晶体的玻璃态[Holly，R.等，J.Chem.Phys  108：4183(1998)]。
上述数据以及NMR研究表明，脂质体内部的顺铂呈过饱和溶液形式。典型地，1000-3000个药物分子包载于脂质体中，这取决于脂质体的大小。在该研究中，由脂质体大小以及类脂与药物的浓度，可以估计出每一脂质体平均约包含3000个顺铂分子。假定每一顺铂分子的分子体积约为603，可以计算出这些分子析出所形成的理想晶体的大小。如果分子呈固体立方晶形式，其大小约为55-60。
期望不受任何特定理论所限，对上述研究的一种解释是：隔室化(compartmentalized)分子的数量太小而不能跨越由晶核形成实际晶体的能垒。这样，包裹的顺铂分子通常会缔合到晶核中，但是由于没有足够的分子可以克服开始结晶化的能垒，因此聚集体通常会分离。一个例子就是分子的隔室化(少量)以及其(小)尺寸阻止其达到稳定的热力学平衡而形成的受抑系统”。
可以理解的是，在非药物传递领域所用的脂质体中也存在这种过饱和化合物的现象。例如，在某种需要高浓度试剂(例如出于反应动力学的要求)的应用中，上述方法即利于以高浓度保持待用化合物。其他应用领域包括诊断试剂盒或者蛋白质和肽的贮存方法。
III. 实施例
以下实施例将对在此所述的本发明作进一步说明，但并不对本发明的范畴作任何限制。
实施例1
制备包含顺铂的脂质体
A.步骤1：配制药物溶液
将无菌水置于特氟龙涂层的(TEFLON-lined)压力容器中，加热至63-67℃，并加入氯化钠(0.9％)。以8.5mg/ml浓度加入顺铂并混合至溶解，用时约15-25分钟。
B.步骤2：溶解类脂
将257.0g PEG-DSPE、719.4g HSPC和308.4g胆固醇(摩尔比为50.6/44.3/5.1)加到900ml脱水乙醇(60-65℃)，混合约2小时至溶解。将溶解的类脂加到7670g药物溶液中，总类脂浓度约为150mg/ml。
C.步骤3：水合类脂/负载药物
将热的类脂溶液快速加到热的药物溶液(63-67℃)中，并混合而形成具有不均匀尺寸的脂质体混悬液。63-67℃下将混悬液混合1小时。水合混合物中顺铂的浓度为7.2mg/ml，约有30％的药物在该阶段包裹到脂质体中。乙醇占总溶液体积的10％，总类脂浓度为150mg类脂/ml。
D.步骤4：挤压
将脂质体控制挤压通过置于特氟龙涂层的不锈钢容器中的聚碳酸酯滤筒，将其调节大小成所需的平均粒径。挤压期间保持脂质体混悬液的温度为63-65℃，用时6-8小时。
E.步骤5：初级过滤
将调节大小后的脂质体混悬液冷却至室温(20-25℃)，并经1.2μm的142-mm Gelman Versapor过滤器(Nylon66支撑物上的丙烯酸共聚物)过滤，除去析出的药物。在该阶段可包裹约50％的药物。
F.步骤6：膜渗滤
用无菌水溶解蔗糖(100mg/ml)和氯化钠(0.058mg/ml)，制得蔗糖/氯化钠溶液。用2N的HCl或NaOH将溶液pH调至约5.5。将溶液经过0.22μm的Durapore过滤器过滤。
用蔗糖/氯化钠溶液以约1∶1(v/v)的比例稀释脂质体混悬液，并用聚砜空心纤维超过滤器进行膜渗滤。交换8体积的蔗糖/氯化钠溶液，除去乙醇和未包裹的药物。保持工作流的温度约为20-30℃。总膜渗滤时间约为4.5小时。
然后，经超滤将脂质体混悬液浓缩至约1.2mg顺铂/ml。将膜渗滤后的工作流进行HPLC分析，测定顺铂含量。脂质体在0.9％氯化钠中含有8.5mg/ml顺铂的内部相，其外部相为蔗糖/氯化钠溶液。
G.步骤7：稀释
将组氨酸(10mM)溶于蔗糖/氯化钠溶液(10％蔗糖/1mM NaCl)中，制得一稀释剂，最终混合物中的目标组氨酸浓度为1.55mg/ml。用组氨酸稀释剂稀释脂质体混悬液，使其中的目标顺铂浓度为1.05mg/ml。用2N的NaOH或HCl将混悬液pH调至6.5。
H.步骤8：无菌过滤
将脂质体混悬液加热至33-38℃，并经0.2μm的Gelman Supor聚醚砜过滤器过滤。总过滤时间约为10分钟。
实施例2
NMR分析
A. 15 N-标记的顺铂[顺式-Pt(15NH3)2Cl2]的制备和特征分析
根据Boreham等在Aust.J.Chem. 34：659(1981)描述的方法，合成顺式-15N-二氯·二氨合铂(II)(顺铂)。采用195PtNMR波谱法和硫脲试验对产物进行特征分析。将硫脲加到15N-标记的顺铂水溶液中，并将溶液加热至40-50℃。溶液外观呈黄色表明产品为顺式构型，而外观呈无色则表明存在反式异构体。将顺式-15N-DDP溶于DMF中，并用195PtNMR分析。
B.制备包含顺铂的脂质体
对包含2000PEG-DSPE[聚乙二醇(MW约为2000)-衍生的二硬脂酰磷脂酰基-乙醇胺]、胆固醇的大单室脂质体进行195PtNMR测量，其总类脂为99mg/ml，78mM＝2.40mg/ml P，包含1.64mg/ml Pt。
1.制备包裹于空间稳定脂质体中的 15 N-顺铂
65℃下，将8.5mg/ml 15N-标记的顺铂溶于0.9％ NaCl中，并在该温度下放置1小时。将类脂(HSPC/胆固醇/2000PEG-DSPE 51∶44∶5)溶于乙醇中。将该乙醇溶液加到药物混合物中，使类脂水合。65℃下，10％乙醇中类脂的最终浓度为150mg/ml(15％)。将混合物于60℃下搅拌1小时，然后用Lipofast注射挤压器将混合物挤压通过100nm和200nm孔径的聚碳酸酯过滤器(65℃)。将调节大小后的脂质体(约100nm)冷却至室温。在冷却期间，会形成深黄色沉淀。收集上清液并于室温放置。待出现更多沉淀时，收集上清液。样品稀释2倍，并于室温下渗析5次(共交换100体积包含1mM NaCl的10％蔗糖)。在上述条件下，与包含1mM NaCl的10％蔗糖达到完全平衡。最终，加入组氨酸缓冲液(pH6.5)，使其最终浓度为10mM。最终的脂质体分散体呈白色半透明状。取等分脂质体和沉淀供异核单量子相干(HSQC)分析(30℃)。
2.制备供HSOC实验的样品
65℃下，将15N-顺铂溶于0.9％NaCl或10％蔗糖(8.5mg/ml)中。按同样操作，配制不含顺铂的对照样品，冷却后加入组氨酸缓冲液(10mM，pH＝6.5)。将处理过的样品置于4℃或-20℃下贮藏。
C.NMR测量
1.  195 PtNMR
195PtNMR测量采用Varian VXR-300S波谱仪(7.05T磁体，配有5mm可转接计算机的探头)。相对于外标K2PtCl4信号(-1624ppm)测量铂的化学位移。采用和不采用质子宽带去偶收集数据，谱宽为100.0KHz，收集时间为0.010秒。通常，收集350,000次脉冲或更高脉冲，谱线增宽一般为300Hz。于37℃和60℃，测量样品(没有自旋)。将包含2mg/ml(4.82×10-3M)K2PtCl4的毛细管加到NMR样品管中，作为已知浓度的内标。在进一步处理和积分之前，数据用等于天然线宽(Hz)的谱线增宽变迹(apodized)
2. 31 PNMR
采用5mm可转接计算机的探头，于室温和60℃下进行31P测量。相对磷酸的0ppm，测量31P化学位移。采用质子宽带去偶收集数据，谱宽为10000Hz，收集时间为1.6秒。收集250次脉冲或更高脉冲，谱线增宽一般为20.0Hz。采用31PNMR对空白对照脂质体和负载顺铂的脂质体进行研究。脂质体包含大单室囊泡(LUV)，其组成为氢化磷脂酰胆碱(HPC)、胆固醇和2000PEG-DSPE(摩尔比为55∶40∶5)。混合700μl最初的脂质体和70μl D2O，制得样品。
3.HSOC NMR测量
采用Bruker DXR 400 MHz NMR谱仪(配有5mm多核反转检测探头)，测量所有[1H，15N]HSQC数据。采用Bruker INVIGSTP序列(经双INEPT转换器反转检测2D1H-X相关，TPPI相敏方式取样，采用去偶)，记录二维(2D)数据。在采集期间用GARP-1序列照射15N自旋。15N化学位移以1M HCl中的1.5M NH4Cl为外标；1H化学位移以TSP(Me3Si(CD2)2CO2Na)为外标。采集2-8瞬态值，用时0.251秒。f2和f1维的谱宽均为2KHz，t1增量为256。在300K(27℃)下采集所有光谱，用时约20分钟，并用Bruker软件处理数据，没有谱线增宽。
4.  195 PTNMR定量铂含量
以K2PtCl4为内标，这是因为其很稳定，其化学位移(-1624ppm)与顺铂(-2100ppm)非常接近，并且它们之间有足够的距离以避免重叠。将K2PtCl4(2mg/mL，4.82mM)密封于毛细管，并加入浓盐酸以防止其水解。将毛细管插入包含样品的5mmNMR样品管中，按上述方法收集195PtNMR光谱。
为了测试该方法的准确度，取3份不同浓度的顺铂样品(1.54、2.0和2.31mg/ml)，37℃在毛细管存在下进行测量。对曲面下面积积分(相对于参比峰下面积)，并计算元素铂的浓度。可进行原子吸收(AA)测量，以进一步确认计算值。
5.原子吸收波谱法
用Varian SpectrAA Zeemam 300波谱仪进行原子吸收测量。由已知浓度K2PtCl4贮备液(250ng/ml，6.02×10-7M)的校准曲线计算铂浓度。
实施例3
EXAFS分析
A.脂质体制备
1.材料
胆固醇(CH)，来自Croda，Fullerton，CA；氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)，来自Lipoid，Ludwigshafen，德国；N-羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油磷酰乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)，来自Sygena，Liestal，瑞士；顺铂(USP级，纯度不低于98％)，来自HeraeusGmbH，Hanau，德国。
2.制备脂质体
按实施例1方法，制备脂质体包裹的顺铂，于65℃下将类脂的乙醇溶液注入药物溶液制得多室囊泡，然后冷却并渗析。形成脂质体的类脂组合物HSPC/CH/MPEG-DSPE的摩尔比为51∶44∶5。顺铂浓度为1.1mg/ml，经凝胶排阻色谱法测定包裹了98％的药物。总类脂浓度为118mM，动态激光散射(N4MB型Coulter，Miami，FI)测得其平均粒径为106nm。其中包裹的顺铂溶于0.9％(w/v)NaCl溶液中，脂质体混悬于0.9％NaCl溶液、10mM组氨酸的水相中(pH6.5)。
按制备顺铂脂质体的方法，制备空白对照脂质体(其中不含药物)。该空白对照脂质体的平均粒径为101nm和总类脂浓度为73mM。
如下制备冻干顺铂脂质体：室温下，采用分子量截留值为14,000的渗析管对包含顺铂的脂质体进行透析，共交换4、20体积的10％(w/v)蔗糖溶液，用时12小时。然后将所得脂质体混悬液于10％蔗糖溶液中用干冰/异丙醇混合物进行快速冷冻，并在高真空下(100mTorr)冻干过夜。
B.EXAFS测量
在德国汉堡Deutschen Elektronen-Synchrotron DESY的Hamburger Synchotronstrahlungslabor HASYLAB中，采用x-射线光束线ROEMO2(X1.1)，以透射法测量样品的铂L3-吸收边EXAFS光谱。采用Si(311)固定开口(fixed-exit)双晶单色器，它在12keV的分辨率为2eV。采用稳定反馈控制，使单色器晶体经去谐而有效地消除了谐波。充有1巴的氩气的电离室用于检测单色x-射线光束穿过样品的入射和出射通量。以吸收光谱为x-射线光子能的函数(积分时间为1秒/点)，记录吸收光谱。在高于吸收边的1000eV范围内采用标准步进。
在可变长度的液体吸收池中(带有KAPTONTM窗口)，配制液态的、冷冻的和冻干的脂质体包裹的顺铂样品和顺铂水溶液。由于样品中Pt的浓度非常低，液态样品和冻干样品的最佳吸收厚度分别为5mm和2mm。总吸收厚度为2时，脂质体包裹的样品和水溶液样品的Pt L3吸收边分别跃迁0.04和0.1将10次试验结果叠加(superimpose)以改善信躁比。以空白脂质体的水溶液为参比光谱(5mm厚层)。在多层粘胶带中配制粉状的结晶样品，其吸收边跃迁约为1。在空白带中测量参比光谱。
尽管通过上述特定实施方案对本发明作了描述，但是那些针对本发明所进行的并不偏离本发明范畴的变化和改进，对于本领域技术人员是显而易见的。

Claims (9)

1.一种制备脂质体的方法，所述脂质体含有过饱和溶液形式的包载化合物，该方法包括：
选择处于某种条件时其室温水溶解度可增加至少2倍的化合物；
由化合物的过饱和水溶液制备不同大小间隔的脂质体；
改变维持化合物增加的水溶性的条件；
分析所述脂质体存在或不存在析出的包载化合物；和
基于所述分析，对脂质体大小加以选择，所述脂质体大小相应于不具有析出的包载化合物的脂质体。
2.权利要求1的方法，其中化合物的选择包括选择处于某种条件时其环境温度下水溶解度可增加的化合物，所述可引起化合物水溶解度增加的条件选自：(i)提高溶剂温度，(ii)加入共溶剂和(iii)调节溶剂pH。
3.权利要求1的方法，其中脂质体的选择包括选择大小为60至1000nm的脂质体。
4.权利要求1的方法，其中脂质体的制备包括以60至1000nm的脂质体大小间隔制备含有包载化合物的脂质体。
5.权利要求1的方法，其中脂质体的制备包括以70至500nm的脂质体大小间隔制备含有包载化合物的脂质体。
6.权利要求1的方法，其中包载包括配制类脂溶液。
7.权利要求6的方法，所述配制包括配制包含经亲水性聚合物衍生的类脂溶液。
8.权利要求6的方法，所述配制包括配制能有效形成刚性类脂双层的类脂溶液。
9.权利要求1的方法，其中所述改变包括改变保持药物在外部脂质体混悬液介质中高于其室温溶解度极限的条件。
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