JP2003521366A - 過飽和溶液中に取り込まれた化合物を含有するリポソーム - Google Patents

過飽和溶液中に取り込まれた化合物を含有するリポソーム

Info

Publication number
JP2003521366A
JP2003521366A JP2001555645A JP2001555645A JP2003521366A JP 2003521366 A JP2003521366 A JP 2003521366A JP 2001555645 A JP2001555645 A JP 2001555645A JP 2001555645 A JP2001555645 A JP 2001555645A JP 2003521366 A JP2003521366 A JP 2003521366A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
liposome
liposomes
compound
cisplatin
lipid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001555645A
Other languages
English (en)
Inventor
アブラ、ロバート、エム
バレンホルツ、イェケズケル
ラジック、ダニロ、ディー
− シュルマン、タル ペレグ
Original Assignee
アルザ・コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アルザ・コーポレーション filed Critical アルザ・コーポレーション
Publication of JP2003521366A publication Critical patent/JP2003521366A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

(57)【要約】 過飽和された溶液中に取り込まれた化合物を有するリポソーム組成物及びそのような組成物を製造する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、リポソーム組成物に関し、そしてリポソームを製造する方法に関す
る。本発明のリポソームは、高い医薬−対−脂質の比をリポソームに提供する、
過飽和溶液中の医薬をそのリポソームの水性コアに取り込んでいる（ｈａｖｅ
ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）。
【０００２】 （発明の背景） リポソームは水性の容積を取り込んで含有する、完全に閉じられた脂質二重層
である。リポソームは（単一膜二重層を有する）単積層小胞、又は多積層小胞（
各々が水性層によって次の層から分離されている多膜二重層により特徴づけられ
るたまねぎ状構造）であることができる。二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、疎水性
“尾部（テイル）”領域及び親水性“頭部（ヘッド）”領域を有する２つの脂質
単層からなっている。膜二重層のその構造は、脂質単層の疎水性（非極性）“尾
部（テイル）が二重層の中心に向かって配向しており、一方では親水性“頭部（
ヘッド）”が水性相に向かって配向しているような構造である。
【０００３】 リポソームの主な用途は、医薬、化粧品、診断薬、生物活性化合物、等のよう
な種々の物質のための担体として役に立つことである。リポソームに取り込まれ
ている場合の親水性剤は、リポソーム構造物、主として内部中心区画中の水性空
間、そして脂質二重層間の空間と一緒になっている。
【０００４】 リポソーム医薬配合物は、治療効率を改良し、延長された期間の医薬放出及び
治療活性を提供し、治療比を増大させ、そして恐らくは一定の種類の軽い疾患お
よび病気を治療するために必要とされる医薬の全体的量を減少させることができ
る。再検討のために、ニューヨークのＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ発行（１９８８
）のＧ．ＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓによるＬｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ参照。
【０００５】 リポソームを造り、そして治療化合物をリポソームに装入するための多くの方
法が存在する。医薬装入のために最も簡単な方法は、乾燥した脂質フイルムが水
溶性医薬を含有する水溶液で水和されてリポソームを形成する、受動的取り込み
（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）による。他の受動的取り込み方法は、予め形成された
リポソームが医薬の水溶液に加えられ、そしてその混合物が、水和を改良し、し
たがって装入を増大させる、凍結乾燥、蒸発により、あるいは多積層小胞の繰り
返しての凍結及び解凍を包含する、凍結−解凍処理により脱水される、脱水−再
水和を包含する。
【０００６】 しかしながら一般に、受動的取り込みは医薬取り込みの低い効率を生ずる。低
い医薬−対−脂質の比は、リポソーム配合物を用いて有効な治療を達成させるた
めには重大な欠点であり得る。例えば腫瘍組織の治療のために約８０〜１４０ｎ
ｍの寸法を有するリポソームが腫瘍組織中への溢出のために必要とされる。その
小さな寸法は、特に医薬が受動的に取り込まれている場合に、そして（又は）医
薬が限られた溶解度を有し、そして（又は）医薬が脂質に対して低い親和性を有
する場合に、医薬装入に制限を課する。低い医薬−対−脂質の比は、必要とされ
る医薬投与量を達成させるために、大きな脂質投与量の投与を必要とする。
【０００７】 医薬取り込み効率は、高い脂質濃度を用いることにより、又は脂質成分の特定
の組み合わせにより、一部分改良されることができる。例えば、ドキソルビシン
のような両親媒性アミンは、負電荷を含有するリポソーム膜中に一層有効にカプ
セル化されることができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２第４７３４頁〜第４７
３９頁（１９８２））。リポソームとのこの表面静電気医薬の会合は、試験管中
で非常に安定である一方、全身投与の際に、非常に迅速な、殆ど直ちの放出に導
く。
【０００８】 したがって、荷電されていないそして非親油性の医薬、そして特に有効な治療
のために効率的に高い医薬−対−脂質の比で水性層中での低い溶解度を有する医
薬の装入は解決の難しい問題を残している。
【０００９】 （発明の開示）発明の概要 １つの態様において、本発明は高い医薬−対−脂質の比でリポソームに取り込
まれた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）親水性化合物を有するリポソーム含有組成物を提
供する。高い医薬−対−脂質の比は、過飽和状態でリポソーム中に取り込まれて
いる医薬に基づいて達成される。
【００１０】 本発明の他の態様において、過飽和状態でリポソーム中に取り込まれた親水性
化合物を有するリポソーム含有組成物を製造する方法が提供される。
【００１１】 他の態様において、本発明はリポソーム中に過飽和状態で取り込まれた化合物
を有するリポソームを造る方法を包含する。その方法は、（ｉ）選ばれた条件に
応答して少なくとも２倍増大することができる室温水溶解度を有する化合物を選
択し；（ｉｉ）リポソーム中に取り込まれたときの化合物の沈殿を阻止するため
に有効なリポソームの寸法を選択し；そして（ｉｉｉ）該リポソーム中に該化合
物をカプセル化する、ことを包含する。
【００１２】 なお他の態様において、本方法において使用するための化合物は、室温での水
溶解度を増大することができる。水溶解度の増大は、（ｉ）溶媒温度を増大させ
る、（ｉｉ）共同溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）を加える、そして（ｉｉｉ）溶
媒ｐＨを変化させる、ことからなる群から選ばれた条件に応答している。
【００１３】 本発明のリポソームは１つの態様において、直径において約６０〜約１０００
ｎｍである。他の態様において、リポソーム寸法は、約６０〜約１０００ｎｍの
選ばれた寸法間隔で取り込まれた化合物を有するリポソームを造ることにより達
成される。造られたリポソームは、顕微鏡的に、又は別の方法において、分光器
の使用により、もしくは、沈殿した化合物の存在又は不存在について、延長され
たｘ線吸収微細構造のような、光散乱技術を介して分析されることができる。
【００１４】 他の態様において、選ばれた化合物は、医薬溶液を用いて脂質の溶液を水和す
ることによりリポソーム中にカプセル化される。他の態様において、選ばれた化
合物は、濃縮された医薬溶液を用いて、乾燥脂質フイルムを水和することにより
取り込まれる。
【００１５】 追加の態様において、リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のよ
うな、親水性重合体で誘導化された脂質をさらに含むことができる。他の態様に
おいて、脂質二重層を形成するために選ばれた脂質は、硬質（ｒｉｇｉｄ）脂質
二重層を形成するために有効である。
【００１６】 追加の態様において、本発明の方法は、室温溶解度限界以上に医薬を維持する
ために選ばれた条件を、外部リポソーム懸濁媒体から取り出すことを包含する。
【００１７】 他の面において、化合物が過飽和状態でリポソーム中心区画中に取り込まれて
いる、上記方法に従って造られたリポソームを包含する。この面において、リポ
ソーム組成物は、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成性脂質及びリポソームに取り込ま
れた治療化合物を含むリポソームの懸濁液を含有し、しかも１種の化合物はリポ
ソームの中心区画において沈殿医薬の形成を阻止するのに有効なリポソーム寸法
の選択を介して、過飽和状態でリポソーム中に維持される。
【００１８】 リポソーム中に使用するために選ばれた化合物は、１つの態様において、水性
溶解度において少なくとも２倍増大化が可能である。水性溶解度におけるこの増
大は；（ｉ）溶媒温度を増大させること、（ｉｉ）共同溶媒を加えること、そし
て（ｉｉｉ）溶媒ｐＨを変化させること、からなる群から選ばれた条件に応答す
る。
【００１９】 本発明のなお他の態様において、過飽和状態で内部水性区画に取り込まれた化
合物を有するリポソームを造る方法が記載される。その方法は、（ｉ）室温での
水溶液中のその溶解度以上の濃度で化合物がその溶液中に存在するその化合物の
水溶液を造り；（ｉｉ）その濃縮された医薬溶液を用いて脂質フイルム又は脂質
溶液を水和してリポソームを形成し；そして（ｉｉｉ）沈殿化合物の形成を阻止
するようにリポソームを寸法調節し、それにより過飽和溶液に取り込まれた化合
物を維持することを包含する。
【００２０】 他の態様において、選ばれた化合物は、約３７℃の温度で水溶液中でのその溶
解度以上の濃度でその化合物がその水溶液中に存在するように造られる。
【００２１】 本発明のこれらの及び他の態様は、本発明の以下の詳細な記載を考慮して、一
層十分に認識されるだろう。
【００２２】発明の詳細な記載 Ｉ．リポソームの調製 １つの面において、本発明は、過飽和条件でリポソーム中に取り込まれた化合
物を有するリポソーム組成物を造るための方法を包含する。本明細書において用
いられるものとして、“過飽和”とは、同じ条件下で飽和を達成するために通常
必要であるより多くの溶質を溶液が含有する条件を包含する。即ち、その溶液は
、その溶解されていない溶質との平衡を生ずるのに必要とされるより多くの溶解
化された溶質を保っている。
【００２３】 他の面において、リポソームは、取り込まれるべき化合物を選択し、そして室
温での水中の化合物の飽和濃度以上である、化合物の濃度を有する溶液を造るこ
とにより形成される。化合物を含有し、そして室温での水中の飽和濃度以上の濃
度を有する溶液は、多くの方法中の任意の方法により造られることができる。例
えば、その方法は溶媒中の化合物の溶解度を増大させるために溶液を加熱するこ
とにより、水性溶媒に共同溶媒を加えることにより、又は水性溶媒のｐＨを変化
させることによる。
【００２４】 この溶液は本明細書において“濃縮溶液”として称される。濃縮溶液を造るた
めに用いられる方法は、好ましい態様において、室温での水性溶媒中の化合物の
溶解度より約２倍、好ましくは約３倍、さらに好ましくは約４倍に水性溶媒中の
化合物の溶解度を増大させるために有効である。
【００２５】 したがって、本発明の組成物及び方法において使用するために意図される化合
物は、（ｉ）溶媒温度を増大させることにより、（ｉｉ）共同溶媒を加えること
により、又は（ｉｉｉ）溶媒のｐＨを変化させることにより、室温（２０〜２５
℃）での水性溶解度において、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍
、さらに好ましくは少なくとも約４倍増大することができる化合物を包含する。
好ましい化合物は温度における増大と共に、溶解度において実質的に増大を受け
る、室温で水中において限られた溶解度を有する化合物である。本発明をサポー
トするものとして行われた研究において、シスプラチンがモデル化合物として用
いられた。シスプラチンは１〜２ｍｇ／ｍｌの水または塩水中の室温での溶解度
を有する。約６０〜６５℃で、その溶解度は約８〜１０ｍｇ／ｍｌまで増大する
。したがって、リポソームの製造のための医薬の濃縮された溶液を造るための手
段として温度が用いられた。
【００２６】 本発明において使用するための意図された他の化合物は、アシクロビル、ガン
シクロビル、ｔａｘｏｌ（パクリタキセルの商標名）、カルボプラチン、及び他
の白金化合物、そしてドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン及びイダ
ルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）のようなアントラキノン（ａｎｔｈｒａｑｕ
ｉｎｏｎｅｓ）、ならびに貧弱な水溶性の抗生物質、たんぱく質類及びペプチド
類を包含する。
【００２７】 脂質小胞を造るための方法の記載に続けて、別の容器において所望の脂質小胞
組成物を提供するために脂質が選ばれ、そして適当な溶媒中に溶解されることが
できる。脂質小胞の形成のために適当な脂質は当業者に知られている。例えば、
米国特許第５，０１３，５５６号、第９欄、第３４行〜第６２行、及び同第５，
８９１，４６８号、第７欄第５行〜第８欄第４８行参照。リポソームの形成にお
いて用いられる脂質成分は、種々の小胞形成性脂質から選ばれ、そして典型的に
は燐脂質類及びステロール類である。脂質類は比較的に不飽和であり、それによ
り一層硬い二重層よりも、取り込まれた化合物への比較的に高い浸透性を有する
脂質二重層を達成させるアシル鎖を有する脂質の選択により、一層流動性（ｆｌ
ｕｉｄｉｃ）の脂質二重層を達成させるために選ばれることができる。より硬い
脂質二重層は取り込まれた化合物の一層低い浸透性を有する脂質二重層を形成す
るために、高度に飽和された燐脂質を用いて形成される。本発明の他の態様にお
いて、ポリエチレングリコール又は他の重合体のような親水性重合体鎖で誘導化
された脂質を含有するリポソームは、例えば米国特許第５，０１３，５５６号及
び同第５，６３１，０１８号において記載されている。
【００２８】 脂質二重層の組成は、取り込みのために選ばれた医薬に従って選択的に変えら
れる。脂質二重層においてより高い浸透性を有する医薬は、飽和された又は脂質
硬化性成分を用いて脂質二重層を形成することによりリポソーム中に一層良好に
維持される。脂質二重層において脂質成分中に容易に浸透できない医薬は、流動
性脂質成分を用いて形成されたリポソーム中に取り込まれることができる。
【００２９】 上記のとおりにして選ばれた脂質成分は、適当な溶媒中に溶解されることがで
きる。脂質は医薬の濃縮された溶液を用いて水和されてリポソームを形成する。
本明細書での全体にわたって記載された詳細な研究において、シスプラチンの濃
縮された溶液は、脂質のエタノール溶液を水和するために使用された（例１）。
濃縮された医薬溶液はまた、脂質を溶解化している溶媒が除去されて水和のため
の乾燥された脂質フイルムを残す、その乾燥された脂質フイルムを水和するため
に用いられることができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号、第１０
欄、第６０行〜第６５行参照）。水和の後に、脂質−医薬混合物はリポソーム形
成のために十分な時間混合される。
【００３０】 リポソームは、超音波処理、均質化又は押し出しのような当業界において知ら
れている幾つかの方法の１つにより、特定の寸法に寸法調節される。典型的には
、リポソームの寸法は、リポソーム組成物の条件が濃縮された溶液中の医薬の溶
解度を減少させるように変更される場合にリポソームの中心区画中に沈殿の形成
を阻止するように選ばれる。そのような寸法は、異なる寸法を有する幾つかのリ
ポソーム組成物を造り、増大された医薬濃度を維持する条件を変化させ、そして
医薬沈殿物の存在についてリポソームを分析することにより決定される。本明細
書において用いられるものとして、“沈殿物”又は“沈殿”は、結晶形、半固体
形または無定形の医薬のような任意の形の医薬を包含することが意図される。医
薬沈殿物が存在しないような寸法を有するリポソームは本発明の範囲である。
【００３１】 典型的には、約６０〜１，０００ｎｍの寸法を有するリポソームが適当であり
、約７０〜５００ｎｍの寸法が好ましい。医薬沈殿物の存在についてのリポソー
ムの分析は、例えば顕微鏡（電子顕微鏡又は高解像度極低温電子顕微鏡）により
視覚化することにより、又は例えばＩＲ、ラマン、ＮＭＲを包含する種々の分光
学技術により、又は延長化ｘ線吸収微細構造（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｘ−ｒａｙ
ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）（ＥＸＡＦＳ）のよ
うな光散乱技術により行われることができる。
【００３２】 リポソームは典型的には沈殿医薬の形成を阻止するために選ばれた寸法に寸法
調節される。これは、典型的には室温での水中の医薬の溶解度以上の濃度で医薬
を維持する条件がリポソームの懸濁液の外部相で変更されるときに起こる。例え
ばもし温度における増大が濃縮された医薬溶液の製造のための医薬の溶解度を増
大させるために用いられたならば、リポソーム懸濁液の温度は低下される。もし
ｐＨにおける増大又は減少が医薬溶解度を増大させるために用いられたならば、
ｐＨは最終の所望のｐＨに調節される。もし医薬溶解度を増大させるために共同
溶媒が濃縮された医薬溶液に加えられたならば、ダイアフイルトレーション（ｄ
ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、密度勾配遠心分離、透析、蒸留、真空除去、等の
ような選ばれた方法により共同溶媒は外部リポソーム相から除去される。
【００３３】 ＩＩ．リポソームの特徴化 上に記載されたように、本発明は、室温で限られた水溶解度を有する医薬の効
率のよい且つ安定なカプセル化を提供する。そのような化合物は治療のために有
用な医薬−対−脂質の比でリポソーム中に取り込まれることが困難であることが
知られている。本発明をサポートするものとして行われた研究において、抗癌剤
シスプラチンが例示医薬として用いられた。しかしながら、本発明の組成物及び
方法は室温で限られた水溶解度を有する、種々の化合物を用いて使用するために
意図されることが認識されるべきであり、そして他の例示医薬は上に記載されて
いる。
【００３４】 シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ））はｃｉｓ−位置で２
つの塩素原子及び２つのアンモニア分子により囲まれた白金の中心原子を含有す
る重金属錯体である。シスプラチンは、精巣腫瘍、頭頸腫瘍、及び肺腫瘍を包含
する、種々の充実性腫瘍を治療するために広く使用されている。他の癌化学療法
剤と同様に、シスプラチンは高度に毒性の医薬である。シスプラチンの主な欠点
は、主要な投与量限定要因であるその極度の腎毒性、ほんの２、３分の循環半減
期を有する腎臓を経てのその迅速な排出及び血漿たんぱく質への強い親和性であ
る（Ｆｒｅｉｓｅ，Ｊ．等によるＡｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．
，２５８第１８０頁〜第１９２頁（１９８２））。例えば、Ａｂｒａ等による米
国特許第５，９４５，１２２号；Ｇｏｎｄａｌ，Ｊ．Ａ．等によるＥｕｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ（１１）第１５３６頁〜第１５４２頁（１９９３）；Ｓｕ
ｒ，Ｂ．等によるＯｎｃｏｌｏｇｙ，４０第３７２頁〜第３７６頁（１９８３）
；Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｂ．等によるＤｒｕｇｓ ４６（３）第３６０頁〜第３７７
頁（１９９３）において、毒性を克服するための方法としてリポソーム中へのシ
スプラチンのカプセル化が記載されて来た。しかしながら、シスプラチンは、そ
の医薬の水への低い溶解度（室温で約１〜２ｍｇ／ｍｌ）及び低い親油性（この
両方は、低い医薬／脂質の比を与える）の故に、リポソーム中に有効に取り込む
ことは典型的に困難である。
【００３５】 本発明に従えば、過飽和状態でのシスプラチン含有リポソームは、例１におい
て記載されているとおりにして造られた。要するに、医薬の水溶液は、ｐＨ＝７
で、約２０〜２５℃の室温で溶液中のその溶解度限界以上の濃度での医薬を用い
て造られた。この場合において、医薬の溶解度は溶液の温度を加熱することによ
り増大された。上に論じられたとおりの、室温での水溶液中の医薬の溶解度を増
大するための他の方法がまた適当である。造られた溶液は、次に、リポソーム脂
質二重層の形成のために選ばれた脂質を水和するために用いられ、それによりリ
ポソームの中心コア区画中に過飽和医薬溶液を含有するリポソームを形成する。
さらに特定的には、そしてシスプラチンを用いて特定の場合において、リポソー
ムは室温でのシスプラチンの溶解度（１〜２ｍｇ／ｍｌ）以上の約４倍である約
８ｍｇ／ｍｌの濃度で取り込まれたシスプラチンを含有した。リポソームは押し
出されることにより１０６ｎｍの平均粒子直径に寸法調節された。
【００３６】 ８ｍｇ／ｍｌでシスプラチンを含有するリポソームは、今記載されようとして
いるとおりにしてＮＭＲにより及び延長化ｘ線吸収微細構造（ｅｘｔｅｎｄｅｄ
Ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（ＥＸＡ
ＦＳ）により特徴づけられた。
【００３７】 Ａ．ＮＭＲによる特徴づけ 脂質二重層内の分子運動の異方性の性質および膜構造の異方性がＮＭＲの技術
により評価されることができるので、ＮＭＲはリポソーム配合物の評価のために
強力な手段である〔Ｆｅｎｓｋｅ，Ｐ．Ｂ．によるＣｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ
ｉｄｓ ６４：１４３（１９９３）；Ｔｉｌｃｏｃｋ，Ｃ．Ｐ．Ｓ．によるＣｈ
ｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ４０：１０９（１９８６）〕。シスプラチン装
入リポソームについてＮＭＲは、リポソーム燐脂質（物理状態、運動の速度）に
ついて及び白金錯体（酸化状態及び配位球）についての両方の情報を提供する。
ＮＭＲと原子吸収分光測定との組み合わせは、リポソーム配合物中の可溶性白金
の量を定量化するために用いられることができる。
【００３８】 15Ｎ−標識化シスプラチンを含有するリポソームは、例２おいて記載されてい
るとおりにして造られた。医薬装入は、約８ｍｇ／ｍｌまでにシスプラチンの溶
解度を増大させるために６０〜６５℃の温度で行われた。大きな単積層小胞の形
成後に、リポソーム懸濁液の温度を４℃に低下させ、この温度でその医薬の溶解
度は約１〜２ｍｇ／ｍｌである。
【００３９】 １． 195ＰｔＮＭＲによる分析 195ＰｔＮＭＲ分光学は、金属の酸化状態についておよび白金の第１配位球（
ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）における４つの配位子の種類につい
ての情報を提供する。これはＰｔ錯体の化学シフト範囲が数千ｐｐｍにわたる事
実、そして化学シフトがＰｔ（ＩＩ及びＩＶ）の酸化状態に対しておよびＰｔに
結合される原子の種類に対しての両方に感受性である事実に起因する。
【００４０】 例２Ａにおいて記載されたとおりにして造られたｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃ
ｌ2は、195ＰｔＮＭＲ分光学により特徴づけられ、そしてそのスペクトルは図１
Ａ〜図１Ｂに示される。図１Ａにおいて見られるように、広いバンドのデカップ
リングされたスペクトルは、２つの等しい15Ｎ原子のカップリングに起因する予
期された三重項を示す。広いバンドのデカップリングが分かれたとき、３つの19 5 Ｐｔ共鳴の各々は、図１Ｂにおいて見られるように、６個の等しい水素により
七重項に分割された。
【００４１】 シスプラチン含有リポソームの195ＰｔＮＭＲ測定は図２において見られる様
に−２１３９．７ｐｐｍで単一の化学シフト（範囲−１３５０〜−２７００ｐｐ
ｍ）を明らかに示す。このことはシスプラチンが元のままのシスプラチンである
主として（＞９０％）１つの種のＰｔ（ＩＩ）であることを示している。たとえ
大きな分子のＰｔ（ＩＩ）の付加物が195ＰｔＮＭＲにより観察されないとして
も、他の白金種、即ち、白金トリアミン又は白金テトラアミンが形成されなかっ
たことを示す追加の白金ピークは検出されなかった。Ｐｔ（ＩＩ）は特にそれら
が非酸性溶液中で加熱されたときに、２−電子不均化反応を受けて固形Ｐｔ（０
）及び可溶性Ｐｔ（ＩＶ）錯体を与えることができる。黒い沈殿物はサンプル中
に検出されず、Ｐｔ（０）が存在しなかったことを示唆し、そして＋１０００〜
−５００ｐｐｍの領域における195ＰｔＮＭＲにおいてピークは観察されず、Ｐ
ｔ（ＩＶ）錯体が溶液中に存在しなかったことを示している。
【００４２】 ２． 31Ｐ ＮＭＲによる分析 31Ｐ ＮＭＲは脂質小胞における燐脂質の状態を確認するために、ならびに寸
法分布および薄層の数に関してリポソーム製剤の均質性を確認するために用いら
れた。表１に記載されている195ＰｔＮＭＲによりサンプルがまた測定された、
リポソーム配合物の31Ｐ ＮＭＲスペクトルが測定された；それらは燐脂質小胞
の典型的な僅かな非対称ピークを示した。同じサンプルがそれらの白金含有量を
確認するために195ＰｔＮＭＲにより測定された。室温で観察された31Ｐピーク
は非常に広かった。これはマトリックス脂質の液体へのゲルの結晶相転移温度（
Ｔｍ）（水素添加ホスファチジルコリンについてＴｍ＝５２．５℃）以下の飽和
燐脂質及びコレステロールからなる小胞の以前のデータと一致している（ニュー
ヨークのＷｉｌｅｙ発行Ｄ．Ｇｌｉｃｋ監修Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．等に
よる、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ， Ｖｏｌ．２３第３３７頁（１９９８））。図３Ａ〜図３Ｂにおいて見られるよう
に、Ｔｍ以上の６０℃でシャープな31Ｐスペクトルは、白金含有リポソーム（図
３Ａ）及び対照リポソーム（図３Ｂ）の両方について観察された。６０℃で、約
１０の走査は高いシグナル−対−ノイズの比を有する信頼できるデータを生成す
るために十分であった。ピーク分析は燐脂質小胞について予期されるように、両
方について若干の非対称のピーク（垂直に対しての非対称）を示した。高さの半
分での線幅（ｌｉｎｅｗｉｄｔｈｓ）の測定はその配合における燐脂質との白金
の相互作用についての基準として役に立ち得る。高さの半分での線幅（Δν1/2
）は６０℃で測定され、そして対照リポソームについて６．３ｐｐｍの値が得ら
れ、シスプラチン−リポソームについて４．２ｐｐｍの値が得られた。Ｐｔ−含
有リポソームと対照リポソームとの間の比較は、白金と燐脂質との間の小さな相
互作用を示した。両方の小胞は同様な寸法の小胞であるけれども、弱い相互作用
は、Δν1/2Ｐｔ−リポソーム＜Δν1/2対照として起こるだろう。そのデータは
、１００−２００ｎｍ直径ＬＵＶ（即ち、エッグＰＣ／ＤＳＰＧ ８５／１５Δ
ν1/2について〜５ｐｐｍ）の31Ｐ測定と良好に一致している〔Ｔｉｌｏｃｋ，
Ｃ．Ｐ．Ｓ．によるＣｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ４０第１０９頁（１９
８６）〕。線幅はＭＬＶでの主要な汚染がないことを示唆している。したがって
、31Ｐ ＮＭＲは六角形タイプＩＩ状態での燐脂質が存在しないことをピークの
形により示した。
【００４３】
【００４４】 ３．異核単量子干渉（ＨＳＱＣ）による分析 195ＰｔＮＭＲ分光学は、Ｐｔ錯体の酸化状態について及び第１配位球おける
原子の種類について情報を提供するけれども、水配位子、カルボキシ配位子又は
ホスフェート配位子はすべて酸素原子を介して酸素に結合するので、195Ｐｔ
ＮＭＲ分光学は水配位子、カルボキシ配位子又はホスフェート配位子の間で区別
することができない。15Ｎ ＮＭＲ分光学は195ＰｔＮＭＲと一緒に用いられて
欠けている情報を提供した（ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ発行の、
Ｐｉｎｅｄｏ Ｈ．Ｍ．等の監修、Ｂａｒｎｈａｍ，Ｋ．Ｊ．著ＰＬＡＴＩＮＵ
Ｍ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＭＥＴＡＬ ＣＯＯＲＤＩＮＡＴＩＯＮ ＩＮ ＣＡ
ＮＣＥＲ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ ２，第１頁〜第１６頁（１９９６）；Ｂ
ｅｒｎｅｒｓ−Ｐｒｉｃｅ，Ｓ．Ｊ．によるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１ ５ 第８６４９頁（１９９３））。１５Ｎ化学シフト及び15Ｎ−195Ｐｔカップリ
ング定数は15Ｎに対してｔｒａｎｓである配位子に対して感受性である〔Ａｐｐ
ｌｅｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．等によるＩｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４第４６８５頁（１９
８５）〕。14Ｎの欠如は195Ｐｔ共鳴をシャープであるようにさせ、そしてプリ
ング定数（195Ｐｔ−15Ｎ、195Ｐｔ−1Ｈ）が得られることができる。15Ｎ標識
化シスプラチン〔ｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2〕は、例２において記載され
ているとおりにして容易に造られるが、しかしながら、15Ｎ ＮＭＲの低い感受
性は、これらの実験においてそのＰｔ錯体を監視するためのその使用を妨げる。
【００４５】 逆検出実験（ｉｎｖｅｒｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
）は、15Ｎにカップリングされているプロトンを検出し、従ってＰｔの第１配位
球における配位子に依存し且つその酸化状態に依存する15Ｎの化学シフト及びカ
ップリング定数についての情報を提供する。15Ｎ−標識化シスプラチンを使用す
ることの主な利点は異核単量子干渉（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌ
ｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＱＣ）ＮＭＲ技術及び異核多
量子干渉（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ
ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＭＱＣ）ＮＭＲ技術を適用するためのその能力である
。ＨＳＱＣ及びＨＭＱＣは一つの軸上のプロトン化学シフト及び第２の軸上の15 Ｎ化学シフトを有する二−次元逆検出実験である。15Ｎ−標識化Ｐｔ錯体のＨＳ
ＱＣ及びＨＭＱＣは、Ｐｔ錯体のミクロモル濃度を検出するために首尾よく用い
られた。本発明の支持において行われた研究において、ＨＳＱＣはＨＭＱＣより
も狭い線およびより良好な解像度を与えるので、ＨＳＱＣが用いられた。定形的
なＨＳＱＣ実験において、約２０分でミクロモル濃度のシスプラチンが観察され
た。感度における非常に大きな利益に加えてＨＳＱＣは15Ｎにカップリングされ
たプロトンだけを選択的に検出し、（リポソームからの）溶液中の他のプロトン
のすべてを無視し且つデータの解釈を簡単にする。
【００４６】 水中のｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2のＨＳＱＣが図４Ａ〜図４Ｂに描かれ
ている。Ｐｔ（ＩＩ）錯体の特徴である相関ピークは、領域Ｉに配置されている
。Ｐｔ（ＩＶ）ピークが予期される領域ＩＩにはピークが存在しない（ニューヨ
ークの、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ発行、Ｐｉｎｅｄｏ，Ｈ．Ｍ．等監修、Ｂａ
ｒｎｈａｍ，Ｋ．Ｊ．著によるＰＬＡＴＩＮＵＭ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＭＥＴ
ＡＬ ＣＯＯＲＤＩＮＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ
ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ ２，第１頁〜第１６頁（１９９６））。領域Ｉの拡
大が図４Ｂにおいて示され、この図は３つのピーク（Ａ、ＢおよびＣ）が存在し
、そして各々のピークは追加の衛星ピーク（Ａ１’、Ａ１”、Ａ２’及びＡ２”
）を有していることを示している。ピークＡは２つの等しい窒素が単一ピークを
生じさせているｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2に属している。ピークＢ及びＣ
は、ピークＢが水配位子にｔｒａｎｓである窒素に帰因しており、そしてピーク
Ｃが塩素配位子にｔｒａｎｓである窒素に帰因している、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（15Ｎ
Ｈ3）2Ｃｌ（Ｈ2Ｏ）〕+の単一錯体に属している。195Ｐｔ−15Ｎカップリング
定数はＡ１’とＡ１”との間の距離から測定されることができ、そして195Ｐｔ
−1Ｈカップリング定数はＡ１”とＡ２”との間の距離から測定されることがで
きる。水溶液中で起こることが知られているシスプラチンの加水分解反応は、19 5 ＰｔＮＭＲによって容易に観察されないがしかしＨＳＱＣにより容易に観察さ
れる。
【００４７】 〜１００ｎｍ ＬＵＶの水性相中に受動的にカプセル化されたｃｉｓ−Ｐｔ（ 15 ＮＨ3）2Ｃｌ2のＨＳＱＣスペクトルは本来のその医薬のスペクトルとほとん
ど同一であると思われる。しかしながら１つの小さな差がある、即ち衛星ピーク
間の距離は親化合物におけるよりも若干小さい。これは脂質とのｃｉｓ−Ｐｔ（ 15 ＮＨ3）2Ｃｌ2の相互作用に関連しているか、又はリポソーム内の水のかなり
低い“活性”に関連している可能性がある。後者は、本来の医薬のスペクトルに
おいて明瞭に視ることができる、水性種に帰因するピークの欠如により支持され
る。さらに図５において見られるように、シスプラチンカプセル化リポソームの
スペクトルがＰｔ（ＩＶ）領域においてまったくピークを有しておらず、リポソ
ーム中への、ｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2のカプセル化の処理がシスプラチ
ンの不均化反応を起こさなかったことを示している。また、スペクトルにおける 15 ＮＨ4 +ピークの欠如は脱アミノ化（15Ｎ配位子の損失）が起こらなかったこと
を示唆し、そしてすべてのＰｔ（ＩＩ）錯体が、ＨＳＱＣ実験により説明される
ことができることを示唆している。したがって、カプセル化されたリポソーム中
の唯一のＰｔ種はシスプラチン及び若干のｃｉｓ〔Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ（Ｈ2
Ｏ）〕+であると結論することが安全である。（‘Ｘ’としてマークされた）確
認されていないピークがスペクトルにおいて見ることが出来、そしてこれらのサ
ンプルのＨＰＬＣクロマトグラムは非常に少量の不純物（＜５％）（結果は示さ
ず）だけを検出した。
【００４８】 シスプラチンを有する最終配合物はヒスチジン緩衝剤を包含した。1Ｈ−15Ｎ
−ＨＳＱＣ ＮＭＲはサンプル中の最も少ない不純物でさえ検出するのに十分に
感受性である。そのような不純物は、リポソーム製造と同一であるが脂質の不存
在（カプセル化なし）下の処理中にヒスチジン緩衝剤が存在した場合に、又はリ
ポソーム中への白金カプセル化の処理においてヒスチジン緩衝剤が存在した場合
に、観察された。図６において見られるように、測定された1Ｈ−15Ｎ−ＨＳＱ
Ｃスペクトルは、15Ｎ−標識化化合物のピークに追加のピークを示した。検出さ
れたすべてのシスプラチン−ヒスチジン種はリポソーム中にカプセル化の間の水
性シスプラチンに帰因している。アミノ酸ヒスチジンの既知の量を用いての追加
実験は、これらの外部のピークがカプセル化処理中に緩衝剤におけるヒスチジン
への医薬の結合に帰因することができることを示した。これらの会合は不可逆で
あり、したがって、いったん結合したならば、これらの医薬を利用できないよう
にする。生物学的緩衝剤に対する15Ｎ−標識化シスプラチンの反応性はヒスチジ
ンアミノ基の寄与を評価するために、Ｎ−アセチル−ヒスチジンのカルボキシ基
を用いて調べられた。１：１のモル比の15Ｎ−シスプラチンとＮ−アセチルヒス
チジンとの、２４時間インキュベーション後に、図７において見られるように、
恐らくはシスプラチン−ヒスチジン種に属する、種々の新しいピークが現れた。
これらの結果はＨＰＬＣの手段によりさらに確認された；事実、得られたクロマ
トグラムはシスプラチン−ヒスチジン種の存在（検出された白金の約２０〜３０
％）を確認した（結果は示さず）。同様な研究はＮ−ＢＯＣ−メチオニンを用い
て行われた。この研究は、例１において記載されたとおりにして、カプセル化が
、ヒスチジン緩衝剤の不存在下に行われ、そしてカプセル化が終わった後にヒス
チジンが加えられた、シスプラチンカプセル化リポソーム（図５）において、ヒ
スチジン緩衝剤と15Ｎ−シスプラチンとの接触がなく、漏れのない且つ非常に安
定であるリポソームを生ずることを示唆している。この研究は、シスプラチン−
ヒスチジン種に属するピークが観察されなかったので、リポソームからの15Ｎ−
標識化シスプラチンの漏れがなかったことをさらに示した。
【００４９】 ４． 195ＰｔＮＭＲによる白金含有量の定量化 リポソーム中にカプセル化されている白金に関して、決定されるべき他のパラ
メータは、医薬−対−脂質の比を包含し、そしてリポソームの医薬のどのくらい
の多くの量が水溶性シスプラチンのように行動しているかを包含する。シスプラ
チンの場合において、リポソーム内の白金の可溶性部分のみが放出され、そして
細胞ＤＮＡに働くことができることが予期され；すべての白金沈殿物は、利用さ
れることができない医薬として考えられることができる。したがって、Ｋ2Ｐｔ
Ｃｌ4の内部基準を用いて行われた比較研究は、原子吸収分光学と異なって可溶
性シスプラチンだけを選択的に定量化し、したがってリポソーム中に含有される
白金の物理的状態に関して明瞭な表示を得るために195ＰｔＮＭＲを用いること
が可能であった。固体状態において（即ち沈殿物において、又は非常に微細な粒
子の懸濁液においてさえも）のすべての白金は検出されないだろう；そのＴ2は
、非常に短く、それらが基本線中に見えなくなるような程度まで線が広がるだろ
う。
【００５０】 リポソームサンプルは、リポソームにおける白金の溶解度に対する温度上昇の
影響を観察するために、３７℃と６０℃との両方で測定された。温度における上
昇は、観察されたピーク面積を増大させなかった；しかしながら、水性種の非常
に小さなピークが６０℃で検出された。このことは、上記のＨＳＱＣ ＮＭＲ測
定において得られたデータと一致している。
【００５１】 この部分において用いられた４種のリポソームサンプルが、表２において記載
され、そしてサンプルの寸法及び脂質濃度を幾らか変化させているサンプルであ
る。これらのファクターはサンプルの粘度に影響し得、それ故に、ＮＭＲスペク
トルにおけるより広い線幅に寄与している。水中の可溶性シスプラチンのサンプ
ルと、リポソームシスプラチンサンプルとの間の有意義な差は、観察されなかっ
た。６０℃で測定したときに、線は一層広く、これはより短いＴ２ 及び迅速に
消滅するシグナルと一致している。リポソームの寸法とシスプラチンピークの線
幅との間に直接の相関関係が見い出され；リポソームの寸法が増大するにつれて
、シスプラチンのピークの幅も増大した。脂質濃度とシスプラチンピークの幅と
の間に逆相関関係が存在し；脂質濃度が減少するにつれて線幅が増大した。
【００５２】
【００５３】 この研究において使用するためのリポソームは、リポソーム配合の第１段階中
にエタノールの存在下に造られ、そしてシスプラチンの溶解度に対するエタノー
ルの影響を決定するために研究が行われた。したがって、０．９％ＮａＣｌにお
いて及び０．９％ＮａＣｌ中２０％エタノール中において室温で及び６５℃で、
１ｍｇ／ｍｌ及び８ｍｇ／ｍｌのシスプラチンの溶解度が調べられた。１ｍｇ／
ｍｌでシスプラチンはすべての条件下に溶解性である一方、８ｍｇ／ｍｌで室温
においてほとんどのシスプラチンが沈殿し、なお６５℃ではほとんど可溶性であ
った。２０％エタノールの不存在下に及び存在下に、その両方において、温度を
低下させて室温に戻すと、シスプラチンの８ｍｇ／ｍｌのほとんどの沈殿に導い
た。したがって、２０％エタノールの存在はシスプラチンの溶解度を改良しなか
ったことを結論づけることができる。ＮＭＲ測定は、水性相中の遊離のシスプラ
チンの溶解度が〜２ｍｇ／ｍｌに限定され、そして６０℃までに温度を上昇させ
た際に増大されることを示している。ＮＭＲ実験は、集積化が〜２ｍｇ／ｍｌに
比例しているピークの検出を示しているのに対して、不溶性白金沈殿物は事実、
検出されない。リポソームの場合において、原子吸収により明らかにされたほと
んどすべてのシスプラチンは、リポソーム内水性相において可溶性であり、この
ことは、リポソーム内濃度が室温での溶解度である２ｍｇ／ｍｌより高いことを
示唆している。リポソーム製造中シスプラチン濃度が室温（又は４℃）での溶解
度以上であった事実にもかかわらず、リポソーム中のほとんどすべてのシスプラ
チンがリポソーム内水性相において、まるで可溶性であるかのように行動したこ
とが見い出された。溶解度の研究から、エタノールが、予期された医薬−対−脂
質の比よりも一層高いことの原因ではあり得ないことは明らかである。
【００５４】 ＮＭＲ研究は、シスプラチンがリポソームに装入中、元のままの状態にあり、
そしてカプセル化されたシスプラチンが水性中に溶解された親化合物と、小さな
差を有して、親化合物に類似していることを示した。リポソーム中に存在するす
べてのシスプラチンは水溶性医薬のように行動し、そして不溶性医薬らしい様子
がない。リポソーム内の医薬は沈殿しない。この事実は下に記載されたＥＸＡＦ
Ｓ研究によりさらに確認される。
【００５５】 Ｂ．延長されたＸ−線吸収微細構造（ＥＸＡＦＳ）による特徴づけ 延長されたＸ−線吸収微細構造（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｘ−ｒａｙ Ａｂｓｏｒ
ｐｔｉｏｎ Ｆｉｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）（ＥＸＡＦＳ）は、サンプル中
の選ばれた原子の局所構造についての情報を提供する。その方法において、Ｘ−
線光効果の方法において発せられた光電子の散乱は、即時の原子近辺を精査する
ために開発された。散乱から生ずる干渉パターンは、エネルギー又は光電子波数
スケール上にＸ線吸収共同作因の小さな振動として解像される。その効果はゆっ
くりとした光電子についてのみ、即ち任意のＸ線吸収端の直上についてのみ、解
像される。したがって、その方法の選択度は標的原子に関している。データのフ
ーリエ変換により最も容易に引き出された振動の振幅、位相及び期間から近辺原
子の数、種および距離が推定される。追加の分析は、種々の無定形状態だけでな
く、結晶状態での物質が研究できるように、熱及び（又は）構造の不規則の程度
をまた提供できる。
【００５６】 白金について、Ｌ３吸収端は、シンクロトロン放射線についてのモノクロメー
ター（単色光器）の最良の解像が期待されるエネルギー領域に入る。したがって
、サンプルにおけるＰｔ原子の周りの局所構造を調べるために、リポソームカプ
セル化シスプラチンについて、Ｐｔ Ｌ３−端ＥＸＡＦＳスペクトルが測定され
た。そのシステムは、液体状態、凍結状態及び凍結乾燥状態における研究であっ
た。比較のために、固体形及び溶解された形における遊離医薬のＰｔ Ｌ３−端
ＥＸＡＦＳがまた測定された。
【００５７】 結晶及び溶解されたシスプラチンについて、そして例３において記載されたと
おりにして造られた３種のリポソームカプセル化シスプラチンサンプル（液体、
凍結及び凍結乾燥）について、Ｐｔ Ｌ３端での標準のｋ２−加重化ＥＸＡＦＳ
スペクトルχ（ｋ）が図８において示される。
【００５８】 図８〜図１３は、図８において示される各々のサンプルについてｋ間隔３Å-1 〜１２Å-1において計算されたフーリエ変換ｋ2−加重ＥＸＡＦＳスペクトルで
ある。スペクトルにおけるピークは、Ｐｔ電子に近辺の原子の連続シェルに相当
する。構造パラメータはＦＥＦＦ６プログラムコードを用いて近辺原子の一時的
空間分布における光電子の散乱路のセットから、初めから組み立てられた、モデ
ルシグナルと測定シグナルとを比較することにより、これらのスペクトルから定
量的に解像される〔Ｒｅｈｒ，Ｊ．Ｊ．等によるＰｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ． ６９ ：３３９７（１９９２）〕。同じ方法で、近辺の原子種がその特定の散乱位
相シフトにより認められる。
【００５９】 初期の段階において、結晶のシスプラチンサンプルのシグナルが分析される。
それは、カプセル化効果の研究のために直接に関連がないが、その高い品質のシ
グナルは、達成可能な解像の基準として役に立つ。最も重要なことには、結晶学
的データはＰｔ原子の近辺のモデルを造るために用いられることができる（Ｍｉ
ｌｂｕｒｎ，Ｇ．Ｈ．Ｗ．等によるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａ．ＪＣＳＩＡ，第
１６０９頁（１９６６））。事実、２．０５Åでの第１シェルＮ近辺及び２．３
３Åでの第１シェルＣｌ近辺、のシグナルについて完全な一致が見い出される。
両方の種は、２のそれらの占有数（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）と一
緒に、あいまいでなく確認される。
【００６０】 ２．４〜４．０ÅのＦＴスペクトルにおける追加の構造は、結晶学的データ（
Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｇ．Ｈ．Ｗ．等によるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａ．ＪＣＳＩＡ
第１６０９頁（１９６６））により示唆されているように、３．３７Åでの２つ
のＰｔを含む、近辺の第１シェル近辺上の高い程度の散乱の、そして近辺の第２
シェル上の散乱の、助けにより完全に説明されることができる。しかしながら、
結晶学的モデルにより予期されるほぼ同じ距離での追加のＣｌ及びＮ近辺の寄与
は伴なわない。
【００６１】 明らかに、測定及びモデルは異なる結晶変形に言及している。この方法で、シ
スプラチン分子自体の最も近い近辺のＮ及びＣｌ原子及び隣接分子の最も近いＰ
ｔ原子は、それらの予測された位置に見い出され、一方では、結晶内の分子の特
定の積み重ねによりＰｔ原子の周辺にもたらされた追加の近辺には見い出されな
いだろう。このようにして、３Å-1〜１２Å-1のｋ領域及び１．１Å〜４．１Å
のＲ領域におけるデータの最良の適合で作成され且つ純化された近辺についてパ
ラメータが、表３に示される。
【００６２】 ａ：略語：近辺原子のタイプ、Ｎ＝数、Ｒ＝距離、 σ2＝Ｄｅｂｙｅ−Ｗａｌｌｅｒ因子。 ｂ：最後の数字の不確かさがカッコ内に与えられる。 ｃ：適合の良好性の測定としてＦｉｔ ｒ−因子が最後の欄に与えられる （Ｓｔｅｒｎ，Ｅ．Ａ．等によるＰｈｙｓｉｃａ Ｂ ２０８，２０９： １１７（１９９５））
【００６３】 その十分に規定された近辺を有する結晶サンプルはまた他のパラメータ、Ｐｔ
原子についてのＥＸＡＦＳシグナルの振幅減少因子Ｓ0 2を決定するために用いら
れることができる。この数は同様な化学（原子価、配位）状態においての中心原
子との異なるサンプル間で転換可能である。結果（Ｓ0 2＝０．７７±０．０３）
は理論推定値と良好に一致しており〔Ｒｏｙ，Ｍ．等によるＪ．Ｐｈｙｓ． Ｉ
Ｖ Ｆｒａｎｃｅ ７：Ｃ２−１５１〜Ｃ２−１５２（１９９７）〕、そして次
のシスプラチンの分析において用いられる。
【００６４】 図１０において示されたシスプラチンの飽和水溶液のＦＴスペクトルはカプセ
ル化されたサンプルのＰｔ原子近辺の確認のための他の、多分一層近いテンプレ
ートである。結晶シスプラチンとの比較は、３．５Åの距離まですべての細部に
おいて顕著な類似性を示す。したがって、Ｐｔ近辺のモデルは、結晶サンプルに
おけるように分子の２Ｎ原子及び２Ｃｌ原子の最も近いシェルに基づいている。
誤差間隔内で、結晶サンプルのパラメータと同一のモデルパラメータを用いて、
１．１Åから２．５Åまでの間隔について、非常に良好な適合性（表３）が得ら
れる。同じシェルからの高い程度の散乱の寄与は、４Åまでのモデルの有効性ま
でに延び、領域内の小さな二重ピークの説明を提供する。結晶サンプルにおいて
確認されたような一層大きな距離でＰｔ原子近辺の存在は該適合性により完全に
排除される。正反対の発見（結論）は、もし真実ならば、物理化学的データ（浸
透圧、凝固点降下）から確実に知られていたはずである、溶液中のシスプラチン
の凝集に対する点である。基本的な最も近い近辺モデルの想像できる拡大の中に
、データにより支持された唯一のものはＯ原子の大きな拡散シェルである。明ら
かにそれは分子の水和シェルを記載している。強い相互関係に付されるそのパラ
メータは満足できる正確さで決定されることができない。しかしながら、重要な
点は、それが中心Ｐｔ原子の直ぐ近くまで内方に向けて延びないことである。
【００６５】 図１１〜１３（それぞれ、液体、凍結および凍結乾燥）において示されるカプ
セル化シスプラチンの３つのサンプルのスペクトルは、かなり多くのノイズがあ
るけれども、ｋ−空間において、ならびにγ−空間において、シスプラチン溶液
のパラメータと完全に一致している。１．１Åから２．５ÅまでのＲ空間におけ
る定量分析は、この観察を確認している（表３）。第２−シェルＰｔ原子近辺は
また排除され、その結果、カプセル化シスプラチン分子の凝集は示されない。水
和シェルの痕跡的寄与はノイズによって閉ざされている。
【００６６】 Ｐｔ原子の近辺における結晶構造の決定は、凝集状態を決定するための助けと
なるばかりでなく、その化学構造をまた解明し、したがって化学安定性を解明す
ることができる。Ｐｔ原子の第１近辺、直接に結合されたＣｌ及びＮ原子は、す
べてのサンプルにおいて変化していない距離及び配位数で見い出され、このこと
はシスプラチン分子がシステムの物理的状態により認識できる程度に影響されな
いことを示す。
【００６７】 第１配位シェルにおける２つのＮ原子及び２つのＣｌ原子の観察は、カプセル
化されたシスプラチン分子が化学的に安定であり、そして加水分解しない、即ち
１つ又は２つのＣｌ原子が水と交換されないことを示している。このことは、そ
のような錯体および希薄なシステムの他の分析がサンプル製造中に化学的及び物
理的変化に導く可能性があるけれども、それは乱されていないサンプルから直接
に得られることができるので、重要な観察である。
【００６８】 Ｐｔ原子の３．３７ÅでのＰｔ近辺の不存在は、リポソーム内のシスプラチン
の溶液が結晶化しないことを明瞭に示している。さらに特定的であることは、そ
れは、結晶サンプルの変性において結晶化しない〔Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｇ．Ｈ．Ｗ
．等によるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａ．ＪＣＳＩＡ第１６０９頁（１９６６）；
Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｍ．等によるＣｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｏｏｏ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃ
ｉ．２：第１７７頁〜第１８７頁（１９９７）〕。しかしながら、シスプラチン
の他の結晶変性が知られている〔Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｇ．Ｈ．Ｗ．等によるＪ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａ．ＪＣＳＩＡ第１６０９頁（１６６９）〕。それは水和され
たシスプラチンであり、それにおいて、２．０３Åの距離の各々のＰｔ原子に２
つのＯ近辺を与える介在水分子のために、最も近いＰｔ近辺が４Åを超える距離
に移動される〔Ｋｕｒｏｄａ，Ｒ．等によるＩｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２２：第３６２０頁（１９８３）：Ｆａｇｇｉａｎｉ，Ｒ．等によるＣ
ａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０第５２９頁
（１９８２）〕。カプセル化サンプルも、またシスプラチン溶液でさえも、中心
Ｐｔにそのように近いＯ原子を示さない。それ故に水和された結晶構造リポソー
ムの形成がまた排除される。
【００６９】 ＥＸＡＦＳの結果は、シスプラチンがホスファチジルコリン二重層上に吸収さ
れないことを示した脂質二重層への医薬の広範囲にわたる吸収の研究により、支
持されている〔Ｓｐｅｅｌｍａｎｓ，Ｇ．等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ １２８３：第６０頁（１９９６）〕。さらに、同じシステムの １９５ ＰｔＮＭＲ研究は線が広がるのを全く示さなかった、そしてすべてのＰ
ｔシグナルは遊離医薬溶液においてまた特徴づけられる迅速に回転している医薬
の狭い等方性シグナルに起因しているだろう。
【００７０】 凍結、及び凍結乾燥リポソームのサンプルは、液体サンプルに類似している。
表３におけるデータは、凍結も、また凍結乾燥も、医薬結晶化を誘発しないこと
を示している。これは、リポソーム内部に匹敵する寸法の細孔（＜２００ｎｍ）
中の水が、大量の水のように振る舞わない事実と一致している。凍結及び溶融の
ような性質は水分子をカプセル化するために大きな表面積の、容量に対する比に
より影響され、そしてそれは溶質を結晶化することなしに単にガラス状態に凍結
することができる〔Ｈｏｌｌｙ，Ｒ．等によるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０８ ：第４１８３頁（１９９８）〕。
【００７１】 上に示されたデータ及びＮＭＲ観察は、リポソーム内部におけるシスプラチン
が過飽和溶液を形成していることを示唆している。リポソームの寸法に依存して
、典型的には１０００〜３０００の医薬分子が取り込まれる。この研究において
、リポソーム寸法、そして脂質および医薬濃度から、各々のリポソームは平均し
て約３０００のシスプラチン分子を含有していると概算することが理にかなって
いる。各々のシスプラチン分子について、６０Å3の分子容積を想定して、沈殿
の際に形成するこれらの分子の仮定結晶の寸法を計算することができる。もしそ
の分子が固体立方体に会合されたならば、その内部は５５〜６０Åであろう。
【００７２】 何ら特定の理論に縛られることを意図しないけれども、上記観察についての１
つの説明は、区画に分けられた（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）分子の
数が、単に結晶の芽（核）から実際の結晶までのエネルギー障壁を横切ることを
可能にするためにはあまりにも小さいことである（即ち、小さくてエネルギー障
壁を横切ることができない）。そうして、カプセル化されたシスプラチン分子は
絶えず結晶核に会合しつつあり、そして結晶化開始に対する障壁を克服するため
に十分な分子がないので、凝集物は絶えず解離している。これは、分子の区画分
け及びそれらの小さな数、及び（小さな）寸法が、安定な熱力学的平衡に達成さ
せるのをこれらに防止させるので、“失敗化システム（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ
ｓｙｓｔｅｍ）”の例であろう。
【００７３】 リポソーム中の過飽和された化合物の現象は、医薬送り出し以外の分野での用
途を見い出すことが認識されるだろう。例えば、反応速度論のような薬剤の高い
濃度が要求に応じて必要とされる適用は、使用のために用意ができている高い濃
度の化合物を維持するための方法から、利益を受けるだろう。使用の他の領域は
、診断キット、又はたんぱく質及びペプチドのための貯蔵手段を包含する。
【００７４】 （発明を実施するための最良の形態）ＩＩＩ．例 以下の例は、本明細書に記載された本発明を例示し、そして本発明の範囲を限
定することが決して意図されない。
【００７５】例 １： シスプラチンを含有するリポソームの製造 Ａ．工程１：医薬溶液調製 滅菌水を、ＴＥＦＬＯＮ−裏張り加圧容器中で６３〜６７℃に加熱し、そし
て塩化ナトリウム（０．９％）を加えた。シスプラチンを８．５ｍｇ／ｍｌの濃
度で加え、そして溶解するまで約１５〜２５分混合した。
【００７６】 Ｂ．工程２：脂質溶解 ２５７．０ｇのＰＥＧ−ＤＳＰＥ、７１９．４ｇのＨＳＰＣ及び３０８．４ｇ
のコレステロール（５０．６／４４．３／５．１のモル比）を６０〜６５℃で、
脱水エタノールの９００ｍｌに加え、そして溶解するまで約２時間混合した。溶
解した脂質を７６７０ｇの医薬溶液に加えて、約１５０ｍｇ／ｍｌの合計脂質濃
度を得た。
【００７７】 Ｃ．工程３：脂質水和／医薬装入 混合しながら、温かい脂質溶液を温かい（６３〜６７℃）の医薬溶液に迅速に
加えて、不均質な寸法を有するリポソームの懸濁液を形成した。その懸濁液を、
６３〜６７℃で１時間混合した。水和混合物中のシスプラチンの濃度は、７．２
ｍｇ／ｍｌであり、そしてこの段階で、医薬の約３０％がリポソーム中にカプセ
ル化された。合計溶液容量の１０％がエタノールであり、そして合計脂質濃度は
１５０ｍｇ脂質／ｍｌであった。
【００７８】 Ｄ．工程４：押し出し テフロン（登録商標）−裏張りステンレススチール容器に入れられたポリカー
ボネートフイルターカートリッジ中に通過させての制御された押し出しにより、
リポソームは所望の平均粒子直径に寸法調節された。６〜８時間の期間押し出し
処理中ずーっとリポソーム懸濁液を６３〜６５℃に維持した。
【００７９】 Ｅ．工程５：低級濾過 寸法調節後リポソーム懸濁液を室温（２０〜２５℃）に冷却し、そして１．２
μｍの、１４２−ｍｍ Ｇｅｌｍａｎ Ｖｅｒｓａｐｏｒフイルター（ナイロン
６６支持体上のアクリル共重合体）中に通過させ、濾過して、沈殿医薬を除去し
た。この段階で約５０％の医薬がカプセル化された。
【００８０】 Ｆ．工程６：ダイアフイルトレーション 滅菌水中にスクロース（１００ｍｇ／ｍｌ）及び塩化ナトリウム（０．０５８
ｍｇ／ｍｌ）を溶解することによりスクロース／塩化ナトリウム溶液を造った。
２ＮのＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを約５．５に調節した。その溶
液を０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅフイルター中に通過させて濾過した。
【００８１】 該リポソーム懸濁液は、該スクロース／塩化ナトリウム溶液を用いて約１：１
（容量／容量）に希釈され、そしてポリスルホン中空繊維限外濾過器中に通過さ
せてダイアフイルトレーションが行われた（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）。エタ
ノール及びカプセル化されていない医薬を除去するために８回の容量交換がスク
ロース／塩化ナトリウム溶液に対して行われた。処理液体温度を約２０〜３０℃
に維持した。合計のダイアフイルトレーション時間は約４．５時間であった。
【００８２】 次に、リポソーム懸濁液を限外濾過によりシスプラチンの約１．２ｍｇ／ｍｌ
に濃縮した。ダイアフイルトレーション後の処理液をＨＰＬＣによりシスプラチ
ン含有量について分析した。リポソームは０．９％塩化ナトリウム中の８．５ｍ
ｇ／ｍｌのシスプラチンの内部相及びスクロース／塩化ナトリウム溶液の外部相
を有した。
【００８３】 Ｇ．工程７：希釈 スクロース／塩化ナトリウム（１０％スクロース／１ｍＭのＮａＣｌ）溶液中
にヒスチジン（１０ｍＭ）を溶解することにより希釈液を造って、最終混合物中
１．５５ｍｇ／ｍｌの目的ヒスチジン濃度にした。該ヒスチジン希釈液を用いて
該リポソーム懸濁液を希釈し、１．０５ｍｇ／ｍｌの目的シスプラチン濃度にし
た。２ＮのＮａＯＨ又はＨＣｌを用いて懸濁液のｐＨを６．５に調節した。
【００８４】 Ｈ．工程８：滅菌濾過 リポソーム懸濁液を３３〜３８℃に加熱し、そして０．２μｍのＧｅｌｍａｎ
Ｓｕｐｏｒポリエーテルスルホンフイルター中に通過させて濾過した。合計の濾
過時間は約１０分であった。
【００８５】例 ２： ＮＭＲ分析 Ａ． 15Ｎ−標識化シスプラチン〔ｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2〕の調製及び
特徴づけ Ｂｏｒｅｈａｍ等によるＡｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．３４第６５９頁（１９８９
）により記載された方法に従って、ｃｉｓ−15Ｎ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ
）（シスプラチン）が合成された。その生成物は195ＰｔＮＭＲ分光学により及
びチオ尿素試験により、その両方によって特徴づけられた。チオ尿素を15Ｎ−標
識化シスプラチンの水溶液に加え、そしてその溶液を４０〜５０℃に加熱した。
黄色の外観は生成物がｃｉｓ形態にあったことの表示であり、それに対して無色
溶液の外観はｔｒａｎｓ異性体の存在を示した。ｃｉｓ−15Ｎ−ＤＤＰをＤＭＦ
に溶解し、そして195ＰｔＮＭＲにより分析した。
【００８６】 Ｂ．シスプラチン含有リポソームの調製 初期の195ＰｔＮＭＲ測定は2000ＰＥＧ−ＤＳＰＥ〔ポリエチレングリコール
（平均分子量約２０００）誘導化ジステアロイルホスファチジル−エタノールア
ミン〕、コレステロール、大きな単積層リポソーム（１．６４ｍｇ／ｍｌのＰｔ
を含有する９９ｍｇ／ｍｌ合計脂質、７８ｍＭ＝２．４０ｍｇ／ｍｌのＰを有す
る）を用いて行われた。
【００８７】 １．立体的に安定化されたリポソーム中にカプセル化された１５Ｎ−シスプラチ ン の調製 ８．５ｍｇ／ｍｌの15Ｎ−標識化シスプラチンを６５℃で０．９％１ＮａＣｌ
中に溶解し、そして１時間この温度で放置した。脂質（ＨＳＰＣ／コレステロー
ル／2000ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（５１：４４：５））をエタノール中に溶解した。こ
のエタノール溶液中に溶解した。このエタノール溶液を医薬混合物に加えること
により該脂質を水和した。最終の脂質濃度は６５℃で１０％エタノール中１５０
ｍｇ／ｍｌ（１５％）であった。その混合物を６０℃で１時間かき混ぜ続け、次
に、Ｌｉｐｏｆａｓｔシリンジ押し出し器を用いて、１００ｎｍ及び２００ｎｍ
の細孔寸法のポリカーボネートフイルター中に通過させて６５℃で押し出した。
寸法調節されたリポソーム（〜１００ｎｍ）を放置して室温に冷却させた。冷却
中に濃い黄色の沈殿物が形成した。上澄み液を集めそして室温で追加の時間放置
した。さらに沈殿が起こり、そして再び上澄み液を集めた。サンプルを２倍に希
釈し、そして室温でＮａＣｌの１ｍＭを含有する１０％スクロースの１００容量
に対して５回透析した。この条件下、１ｍＭのＮａＣｌを含有する１０％スクロ
ースとの完全な平衡が起こっている筈である。最後に、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ
６．５）を１０ｍＭの最終濃度に加えた。最終リポソーム分散液は半透明の白色
であった。リポソームのアリコート及び両方の沈殿物のアリコートは、３０℃で
異核単量子干渉（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｙｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ
ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＱＣ）により分析された。
【００８８】 ２．ＨＳＱＣ実験のためのサンプル調製 15Ｎ−シスプラチンを６５℃で０．９％ＮａＣｌ中か、又は１０％スクロース
中のいずれかに溶解した（８．５ｍｇ／ｍｌ）。シスプラチンなしの対照のサン
プルを造り、そして同じ方法に従って処理した。冷却後シスチジン緩衝液（１０
ｍＭ、ｐＨ＝６．５）を加えた。処理されたサンプルは４℃で又は（−２０）℃
で貯蔵された。
【００８９】 Ｃ．ＮＭＲ測定 １． 195ＰｔＮＭＲ 195ＰｔＮＭＲ測定は、５ｍｍのコンピュータースイッチ切り換え可能なプロ
ーブを備えた７．０５Ｔ磁石を用いてＶａｒｉａｎ ＶＸＲ−３００Ｓ分光計上
で行われた。白金化学シフトは−１６２４ｐｐｍで設定されたＫ2ＰｔＣｌ4の外
部基準シグナルに対して測定された。１００．０ｋＨｚスペクトル幅、０．０１
０秒の取得時間を用いて、プロトンの広いバンドデカップリングを有し、そして
それを有せずにの、データが集められた。通常、３５０，０００パルス又はそれ
以上が取得され、そして３００Ｈｚの線拡がりが適用された。３７℃及び６０℃
でスピニング（ｓｐｉｎｎｉｎｇ）なしで、サンプルを測定した。既知濃度の内
部基準として２ｍｇ／ｍｌ（４．８２ｘ１０-3Ｍ）のＫ2ＰｔＣｌ4を含有する毛
細管をＮＭＲチューブに加えた。処理および統合のまえに、（Ｈｚでの）自然の
線幅に等しい線拡がりを用いてデータはアポディゼーションが行われた（ａｐｏ
ｄｉｚｅｄ）。
【００９０】 ２． 31Ｐ ＮＭＲ 31Ｐ測定は、５ｍｍコンピュタースイッチ切り換え可能なプローブを用いて室
温で及び６０℃で行われた。31Ｐ化学シフトは０ｐｐｍで設定された燐酸に対し
て測定された。１００００Ｈｚスペクトル幅及び１．６秒の取得時間を用いて、
プロトンの広いバンドデカップリングを有するデータが集められた。通常２５０
パルス又はそれ以上が取得され、そして２０．０Ｈｚの線拡がりが適用された。
プラシーボ（対照）およびシスプラチン装入リポソームを31Ｐ ＮＭＲにより研
究した。リポソームは大きな単積層小胞（ＬＵＶ）を含有しそして５５：４０：
５のモル比で水素添加ホスファチジルコリン（ＨＰＣ）、コレステロール、及び 2000 ＰＥＧ−ＤＳＰＥからなっていた。元のリポソームサンプルの７００μｌを
Ｄ2Ｏの７０μｌと混合することによりサンプルが造られた。
【００９１】 ３．ＨＳＱＣ ＮＭＲ測定 ５ｍｍの多核逆検出プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤＸＲ ４００ＭＨｚ
ＮＭＲ分光計を用いて、すべての〔1Ｈ、15Ｎ〕ＨＳＱＣデータが得られた。そ
の２Ｄデータは、ＩＮＶＩＧＳＴＰ（取得中にデカップリングを有するＴＰＰＩ
を用いて二重ＩＮＥＰＴ転移位相感知を介しての逆検出２Ｄ1Ｈ−Ｘ相関関係）
のＢｒｕｋｅｒシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて記録された。15Ｎスピ
ンは、ＧＡＲＰ−１シーケンスを用いての取得時間中に照射された。15Ｎ化学シ
フトは、１ＭのＨＣｌ中の１．５ＭのＮＨ4Ｃｌに外部的に基準化された：1Ｈ化
学シフトは、ＴＳＰ（Ｍｅ3Ｓｉ（ＣＤ2）2ＣＯ2Ｎａ）に外部的に基準化された
。０．２５１秒の取得時間、ｆ2及びｆ1の両方の次元において２ＫＨｚのスペク
トル幅及びｔ1の２５６増分を用いて２〜８の過度応答（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ
）が取得された。すべてのスペクトルは３００0Ｋ（２７℃）で取得された。約
２０分でスペクトルを集め、そしてＢｒｕｋｅｒソフトウエアを用いてデータを
処理し、線拡がりはなかった。
【００９２】 ４． 195ＰｔＮＭＲにより白金含有量の定量化 Ｋ2ＰｔＣｌ4は、化学シフト（−１６２４ｐｐｍ）がシスプラチンの化学シフ
ト（−２１００ｐｐｍ）に近く、なお重なりを避けるのに十分な距離である安定
な化合物であるので、Ｋ2ＰｔＣｌ4は内部基準として選ばれた。Ｋ2ＰｔＣｌ4（
２ｍｇ／ｍｌ、４．８２ｍＭ）を毛細管に封入し、そしてその加水分解を防止す
るために濃塩酸を加えた。サンプルを含有している５ｍｍＮＭＲチューブ中にそ
の毛細管を挿入し、そして上に記載されているとおりにして195ＰｔＮＭＲスペ
クトルを取得した。
【００９３】 方法の精度を試験するために、濃度を変化させて（１．５４、２．０及び２．
３１ｍｇ／ｍｌ）の３つのシスプラチンのサンプルを３７℃で該毛細管の存在下
に測定した。曲線下の面積は基準ピーク下の面積に関して積分され、そして元素
白金濃度を計算した。計算された数値を確認するために、原子吸収（ＡＡ）測定
が行われた。
【００９４】５．原子吸収分光学 原子吸収測定はＶａｒｉａｎ ＳｐｅｃｔｒＡＡ Ｚｅｅｍａｎ ３００分
光計上で行われた。白金の濃度はＫ2ＰｔＣｌ4原料溶液の既知の濃度（２５０ｎ
ｇ／ｍｌ、６．０２ｘ１０-7Ｍ）の基準曲線に従って計算された。
【００９５】例 ３： ＥＸＡＦＳ分析 Ａ．リポソーム調製 １．材料 カリフォルニア、ＦｕｌｌｅｒｔｏｎのＣｒｏｄａからのコレステロール（Ｃ
Ｈ）；ドイツＬｕｄｗｉｇｓｈｆｅｎのＬｉｐｏｉｄからの水素添加大豆ホスフ
ァチジルコリン（ＨＳＰＣ）；スイス、ＬｉｅｓｔａｌのＳｙｇｅｎａからのＮ
−カルボニル−（メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジアス
テロイル−ｓｎ−グリセロホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＭＰＥＧ−Ｄ
ＳＰＥ）、ドイツ、ＨａｎａｕのＨａｒａｅｕｓ ＧｍｂＨからのシスプラチン
（９８％未満の純度のＵＳＰ級）。
【００９６】 ２．リポソーム調製 多積層小胞が６５℃で医薬溶液中にエタノール性脂質溶液を注入し、次に冷却
且つ透析することにより形成された、例１において記載されたとおりにしてリポ
ソームカプセル化シスプラチンは造られた。リポソームの脂質組成は５１：４４
：５のモル比でＨＳＰＣ／ＣＨ／ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥであった。シスプラチン濃
度は１．１ｍｇ／ｍｌであり、そしてゲル−エクスクルージョン（ｇｅｌ−ｅｘ
ｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフイにより測定されたとき、医薬のカプセル化は
、９８％であった。合計脂質濃度は、１１８ｍＭであり、平均粒子直径は動的レ
ーザー光散乱（フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒのモデルＮ４ＭＢ）により
１０６ｎｍと決定された。カプセル化シスプラチンを０．９％（重量／容量）の
ＮａＣｌ溶液中に溶解し、そしてリポソームを０．９％ＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ
ヒスチジン、ｐＨ６．５）の水性相中に懸濁させた。
【００９７】 プラシーボリポソームをシスプラチンリポソームと全く同じに造ったが、しか
し医薬を含有しなかった。プラシーボリポソームは１０１ｎｍの平均粒子直径お
よび７３ｍＭの合計脂質濃度を有した。
【００９８】 凍結乾燥シスプラチンリポソームは、次のとおりにして造られた。シスプラチ
ン含有リポソームのサンプルは、室温で１２時間にわたって、分子量カットオフ
１４，０００透析チューブ及び１０％（重量／容量）スクロース溶液の４つの１
２容量交換を用いて透析された。次に１０％スクロース溶液中の得られたリポソ
ーム懸濁液をドライアイス／イソプロパノール混合物を用いて迅速に凍結させ、
そして高い真空（１００ｍＴｏｒｒ）で一夜、凍結乾燥させた。
【００９９】 Ｂ．ＥＸＡＦＳ測定 サンプルの白金Ｌ3−端ＥＸＡＦＳスペクトルは、ドイツエレクトロネン−シ
ンクロトロンＤＥＳＹ（ドイツのハンブルグ）でのＨａｍｂｕｒｇｅｒ Ｓｙｎ
ｃｈｒｏｔｒｏｎｓｔｒａｈｌｕｎｇｓｌａｂｏｒ ＨＡＳＹＬＡＢにおいて、
ｘ線ビーム線ＲＯＥＭＯ２（Ｘ１．１）での透過方式において測定された。１２
ｋｅＶで２ｅＶ解像度を有するＳｉ（３１１）固定された口の二重−結晶単色計
が用いられた。安定化フィードバックコントロールを用いて単色計結晶を離調す
ることにより倍振動が有効に排除された。１バールでアルゴンを充たしたイオン
化セルは、サンプルを通過する単色のｘ線ビームの入射し且つ透過したフラック
スを検出するために用いられた。吸収スペクトルは、１秒／照準の集積時間を用
いて、ｘ線光量子エネルギーの関数として記録された。端上の１０００ｅＶ領域
内の標準の階動進行（ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）が採用され
た。
【０１００】 ＫＡＰＴＯＮTM窓を有する変化可能な長さの液体吸収セル中において、液体、
凍結及び凍結乾燥リポソームカプセル化シスプラチンのサンプル、およびシスプ
ラチンの水溶液が造られた。サンプル中のＰｔの非常に低い濃度に起因して、液
体サンプルの５ｍｍ厚さの層及び凍結乾燥サンプルの２ｍｍ層を用いて、最適の
吸収厚さが分かった。得られたＰｔ Ｌ3端ジャンプは、２の合計吸収厚さでリ
ポソームカプセル化サンプルについてほんの０．０４であり、そして水溶液につ
いて０．１であった。シグナルの、ノイズに対する比を改良するために、実験操
作は重ねて行われた。基準スペクトルは空のリポソームの水溶液の５ｍｍ厚さの
層上で取られた。粉末化結晶サンプルは、約１の端ジャンプを有する、接着剤テ
ープの多重層上に造られた。基準スペクトルは空のテープ上で測定された。
【０１０１】 本発明は、特定の態様に関して記載されたけれども、本発明から離れることな
しに、種々の変更及び修正が行われることができることは当業者に明らかであろ
う。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 広いバンドのデカップリングを有するｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2の195Ｐ
ｔＮＭＲスペクトルである。
【図１Ｂ】 広いバンドのデカップリングを有しないｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2の195 ＰｔＮＭＲスペクトルである。
【図２】 リポソームに取り込まれたシスプラチンの195ＰｔＮＭＲスペクトルである。
【図３Ａ】 シスプラチン含有リポソームの、31Ｐ ＮＭＲスペクトルである。
【図３Ｂ】 対照のプラシーボリポソームの、31Ｐ ＮＭＲスペクトルである。
【図４Ａ】 水中のｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2の異核単量子干渉分光学により得られ
たスペクトルである。
【図４Ｂ】 図４Ａの、領域ｌ（ｂ）の拡大である。
【図５】 リポソームにカプセル化後にｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2の異核単量子干
渉分光学により得られたスペクトルである；“ｘ”により示されるピークは確認
されていない。
【図６】 ピーク１〜７がｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃｌ2−ヒスチジン種に起因してい
る、ヒスチジン緩衝剤の存在下に取り込まれた後のｃｉｓ−Ｐｔ（15ＮＨ3）2Ｃ
ｌ2の、異核単量子干渉分光学により得られたスペクトルである。
【図７】 Ｎ−アセチル−ヒスチジンと共にインキュベーション後のシスプラチンの異核
単量子干渉分光学により得られたスペクトルである。
【図８】 結晶シスプラチン、溶解化シスプラチン、及び３種のリポソームカプセル化シ
スプラチンサンプル（液体、凍結及び凍結乾燥）のｋ2−加重ＰｔＬ３−端延長
化ｘ線吸収微細構造（ＥＸＡＦＳ）スペクトルである。そのスペクトルは、透明
に対して垂直に移動され、そして（点線により表される）データの最良が実線に
より表される。
【図９】 実線が実験データを表し、そして最良適合化モデル関数が破線によりて表され
る、結晶シスプラチンのＥＸＡＦＳスペクトルのｋ2−加重フーリェ変換である
。
【図１０】 図９におけると同じ表記法を用いて、水中に溶解されたシスプラチンのＥＸＡ
ＦＳスペクトルのｋ2−加重フーリェ変換である。
【図１１】 図９におけると同じ表記法を用いて、リポソームに取り込まれたシスプラチン
の液体サンプルのＥＸＡＦＳスペクトルのｋ2−加重フーリェ変換である。
【図１２】 図９におけると同じ表記法を用いて、リポソームに取り込まれたシスプラチン
の凍結サンプルのＥＸＡＦＳスペクトルのｋ2−加重フーリェ変換である。
【図１３】 図９におけると同じ表記法を用いて、リポソームに取り込まれたシスプラチン
の凍結乾燥サンプルのＥＸＡＦＳスペクトルのｋ2−加重フーリェ変換である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラジック、ダニロ、ディー アメリカ合衆国 カリフォルニア、ニュー アーク、バークデイル ドライブ 7512 (72)発明者 ペレグ − シュルマン、タル イスラエル国 ギヴァタイム、アクデュッ ト ハヴァダ ストリート １ Ｆターム(参考） 4C076 AA19 CC27 DD37 DD63 DD70 EE23 FF15 FF16 FF43 GG46 4C086 AA10 HA12 HA24 HA26 MA02 MA03 MA05 MA24 NA02 NA05 ZB26 4G005 AA07 AB03 BB20 BB24 DB02X DB12X DB22X DC15W DC18W DD24Y EA03

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 条件に応答して少なくとも２倍増大を示すことができる室温
    水溶性を有する化合物を選択し； リポソーム中に取り込まれたときの該化合物の沈殿を阻止するのに有効な寸法
    のリポソームを選択し；そして 過飽和状態でリポソーム中に該化合物を取り込む； ことからなるリポソームを製造する方法。
  2. 【請求項２】 該化合物を選択することが、（ｉ）溶媒温度を増大させる、
    （ｉｉ）共同溶媒を添加する、そして（ｉｉｉ）溶媒ｐＨを変化させる、ことか
    らなる群から選ばれた条件に応答して周囲の温度で増大した水溶解度を有する化
    合物を選択することを包含する、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 リポソームを選択することが、約６０ｎｍ〜約１０００ｎｍ
    のリポソーム寸法を有するリポソームを選択することを包含する、請求項１の方
    法。
  4. 【請求項４】 リポソームを選択することが、約６０ｎｍ〜約１０００ｎｍ
    のリポソーム寸法間隔で、取り込まれた化合物を有するリポソームを造り、そし
    て沈殿した化合物の存在及び不存在についてリポソームを分析することを包含す
    る、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 リポソームを選択することが、約６０〜約１０００ｎｍのリ
    ポソーム寸法間隔で、取り込まれた化合物を有するリポソームを造り、そして沈
    殿した化合物の存在及び不存在についてリポソームを分析することを包含する、
    請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 取り込みが脂質の溶液を調製することを包含する、請求項１
    の方法。
  7. 【請求項７】 調製が親水性重合体で誘導された脂質を含む脂質の溶液を調
    製することを包含する、請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 調製が硬質脂質二重層を形成するために有効な脂質の溶液を
    調製することを包含する、請求項６の方法。
  9. 【請求項９】 室温溶解度限界以上に医薬を維持するために選ばれた条件を
    、外部リポソーム懸濁液媒体から取り出すことをさらに包含する、請求項１の方
    法。
  10. 【請求項１０】 化合物が過飽和条件でリポソームの中心区画に取り込まれ
    ている、請求項１に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 小胞形成性脂質からなるリポソームの懸濁液、及び リポソーム中に取り込まれた化合物、 を含み、取り込まれる前の該化合物が過飽和状態でリポソーム中に維持されてい
    る、リポソーム組成物。
  12. 【請求項１２】 化合物が、（ｉ）溶媒温度を増大させる、（ｉｉ）共同溶
    媒を加える、及び（ｉｉｉ）溶媒のｐＨを変化させる、ことからなる群から選ば
    れた条件に応答して、水性溶解度において２倍の増大を示す、請求項１１の組成
    物。
  13. 【請求項１３】 リポソームが約６０ｎｍ〜約１０００ｎｍのリポソーム寸
    法を有する、請求項１１の組成物。
  14. 【請求項１４】 リポソームが親水性重合体鎖で誘導化された脂質をさらに
    含む、請求項１の組成物。
  15. 【請求項１５】 リポソームが飽和された小胞形成性燐脂質を含む、請求項
    １の組成物。
  16. 【請求項１６】 リポソーム内部水性区画に取り込むために適した化合物の
    水性濃縮液を造り； 化合物の濃縮された溶液を用いて、脂質フイルム又は脂質溶液をリポソームを
    形成するために水和し；そして 沈殿した化合物の形成を阻止するのに有効な寸法にリポソームを寸法調節し、
    それにより過飽和状態で取り込まれた化合物を維持する、 ことを含むリポソームを調製するための方法。
  17. 【請求項１７】 リポソームの寸法の選択が、内部リポソーム区画に沈殿し
    た医薬の形成を阻止するのに有効なリポソーム寸法を包含する、請求項１１の組
    成物。
  18. 【請求項１８】 親水性重合体鎖がポリエチレングリコールである、請求項
    １４の組成物。
JP2001555645A 2000-01-28 2001-01-26 過飽和溶液中に取り込まれた化合物を含有するリポソーム Pending JP2003521366A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17865000P 2000-01-28 2000-01-28
US60/178,650 2000-01-28
PCT/US2001/003063 WO2001054666A1 (en) 2000-01-28 2001-01-26 Liposomes containing an entrapped compound in supersaturated solution

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003521366A true JP2003521366A (ja) 2003-07-15

Family

ID=22653355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001555645A Pending JP2003521366A (ja) 2000-01-28 2001-01-26 過飽和溶液中に取り込まれた化合物を含有するリポソーム

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20010033861A1 (ja)
EP (1) EP1274399B1 (ja)
JP (1) JP2003521366A (ja)
KR (2) KR20070089761A (ja)
CN (1) CN1236760C (ja)
AT (1) ATE292957T1 (ja)
AU (2) AU2001234670B2 (ja)
CA (1) CA2398514A1 (ja)
DE (1) DE60110057T2 (ja)
DK (1) DK1274399T3 (ja)
ES (1) ES2236181T3 (ja)
HU (1) HUP0400628A3 (ja)
IL (2) IL150483A0 (ja)
MX (1) MXPA02007320A (ja)
NO (1) NO20023139L (ja)
NZ (1) NZ519856A (ja)
PT (1) PT1274399E (ja)
WO (1) WO2001054666A1 (ja)
ZA (1) ZA200205468B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005525375A (ja) * 2002-03-05 2005-08-25 トランセイブ， インク． 生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2306785T3 (es) * 2001-11-02 2008-11-16 The Governors Of The University Of Alberta Composiciones de micelas que contienen fosfolipidos pegilados y un fotosensibilizador.
JP2006513267A (ja) * 2002-12-18 2006-04-20 アルゴルクス ファーマスーティカルズ，インク カプサイシノイドの投与
WO2004056305A2 (en) * 2002-12-18 2004-07-08 Algorx Administration of capsaicinoids
US8980310B2 (en) * 2002-12-31 2015-03-17 Bharat Serums and Vaccines, Ltd. Non-pegylated long-circulating liposomes
KR20060015534A (ko) 2003-04-25 2006-02-17 더 펜 스테이트 리서치 파운데이션 성장 억제, 지질 유래된 생활성 화합물의 전신 전달을 위한방법 및 시스템
EP2090305A4 (en) * 2006-12-08 2012-12-26 Katayama Chemical Ind Co Ltd LIPOSOME ENCAPSULATING HIGH-CONCENTRATION <O> AMINE </ O> COMPLEX, AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
US8158682B2 (en) * 2008-09-12 2012-04-17 Vallinex, Inc. Instillation administration of capsaicinoids for the treatment of pain
JP5983608B2 (ja) * 2011-07-15 2016-09-06 コニカミノルタ株式会社 溶解助剤を利用したリポソーム含有製剤およびその製造方法
US9849087B2 (en) 2011-11-08 2017-12-26 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and compositions for X-ray induced release from pH sensitive liposomes
CN104203216A (zh) * 2012-02-17 2014-12-10 效思因公司 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法
BR112015022415A2 (pt) * 2013-03-13 2017-07-18 Mallinckrodt Llc composições de cisplatina lipossômica para terapia contra câncer
CN106456551A (zh) * 2014-04-08 2017-02-22 阿拉迪姆公司 冻融后形成药物纳米晶体的脂质体
US20160120806A1 (en) * 2014-04-08 2016-05-05 Aradigm Corporation Nanocrystals formed in a microenvironment
EP3129004A4 (en) 2014-04-08 2017-11-15 Aradigm Corporation Liposomal ciprofloxacin formulations with activity against non-tuberculous mycobacteria
PL3137126T3 (pl) 2014-04-30 2020-03-31 Encapson B.V. Urządzenia medyczne z niejednolitą powłoką w celu wzmocnienia echogeniczności
US20190046444A1 (en) * 2015-09-14 2019-02-14 Vgsk Techologies, Inc. A sterically stabilized carrier for subcutaneous, sublingual, and oral therapeutics, compositions and methods for treating a mammal
DE102017210700A1 (de) * 2017-06-26 2018-12-27 Robert Bosch Gmbh Verfahren zum automatisierten Quantifizieren eines Analyten sowie NMR-Messgerät zur Durchführung des Verfahrens
US10925831B2 (en) * 2017-08-28 2021-02-23 Wake Forest University Liposomal formulations of platinum-acridine anticancer agents and methods thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05255070A (ja) * 1992-01-10 1993-10-05 Takeda Chem Ind Ltd リポソーム製剤およびその製造法
WO1998007409A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposomes containing a cisplatin compound

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0177223B1 (en) 1984-09-24 1990-02-28 Michael Mezei Pharmaceutical multi-phase composition
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ATE119034T1 (de) * 1990-04-18 1995-03-15 Takeda Chemical Industries Ltd Liposomenzusammensetzung.
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
DE69622599T2 (de) * 1996-08-21 2003-03-27 Childrens Hosp Medical Center Hautaufhellungszusammensetzungen
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
EP0949906A4 (en) * 1996-10-22 2004-11-24 Hermes Biosciences Inc LIPOSOMES LOADED WITH ACTIVE SUBSTANCE AND THEIR PRODUCTION METHOD
US6348215B1 (en) * 1999-10-06 2002-02-19 The Research Foundation Of State University Of New York Stabilization of taxane-containing dispersed systems
BR0107964A (pt) * 2000-01-31 2002-10-29 Pfizer Prod Inc Derivados de nicotinamida benzofundida com heterociclica úteis como inibidores seletivos de isozimas pde4

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05255070A (ja) * 1992-01-10 1993-10-05 Takeda Chem Ind Ltd リポソーム製剤およびその製造法
WO1998007409A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposomes containing a cisplatin compound
JP2001501173A (ja) * 1996-08-23 2001-01-30 アルザ コーポレイション シスプラチン化合物を含有するリポソーム

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005525375A (ja) * 2002-03-05 2005-08-25 トランセイブ， インク． 生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する方法

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200205468B (en) 2004-09-29
NO20023139L (no) 2002-09-23
CN1396822A (zh) 2003-02-12
HUP0400628A3 (en) 2006-07-28
EP1274399A1 (en) 2003-01-15
US20010033861A1 (en) 2001-10-25
CN1236760C (zh) 2006-01-18
KR20030011767A (ko) 2003-02-11
KR100782891B1 (ko) 2007-12-06
WO2001054666A1 (en) 2001-08-02
NO20023139D0 (no) 2002-06-28
ATE292957T1 (de) 2005-04-15
CA2398514A1 (en) 2001-08-02
DK1274399T3 (da) 2005-08-08
EP1274399B1 (en) 2005-04-13
DE60110057T2 (de) 2005-09-08
KR20070089761A (ko) 2007-08-31
AU3467001A (en) 2001-08-07
AU2001234670B2 (en) 2005-05-19
IL150483A0 (en) 2002-12-01
MXPA02007320A (es) 2004-07-30
PT1274399E (pt) 2005-07-29
US8062662B2 (en) 2011-11-22
IL150483A (en) 2008-07-08
ES2236181T3 (es) 2005-07-16
US20060159739A1 (en) 2006-07-20
DE60110057D1 (de) 2005-05-19
NZ519856A (en) 2004-03-26
HUP0400628A2 (hu) 2004-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8062662B2 (en) Liposomes containing an entrapped compound in supersaturated solution
Li et al. Drug nanocrystallisation within liposomes
CN111956614B (zh) 一种紫杉醇脂质体及其制备方法
Bolotin et al. Ammonium sulfate gradients for efficient and stable remote loading of amphipathic weak bases into liposomes and ligandoliposomes.
Abraham et al. The liposomal formulation of doxorubicin
AU2001234670A1 (en) Liposomes containing an entrapped compound in supersaturated solution
JP2011157376A (ja) 金属イオンをローディングするリポソーム
WO2004054499A2 (en) Platinum aggregates and process for producing the same
BR112012029628B1 (pt) Preparação lipossômica contendo placlitaxel com gradiente de osmolaridade distinto entre as fases aquosas dentro e fora dos lipossomas, seus processos de fabricação, e suspensão lipossômica
Yang et al. The influence of trapping agents on the antitumor efficacy of irinotecan liposomes: Head-to-head comparison of ammonium sulfate, sulfobutylether-β-cyclodextrin and sucrose octasulfate
TWI637754B (zh) 熱塑性奈米粒子及其製法
CN109260155B (zh) 伊立替康脂质体制剂及其制备与应用
US20060030578A1 (en) Pharmaceutically active lipid based formulation of irinotecan
JP2008518925A (ja) リポソーム製剤の製造プロセス
Kirpotin et al. Drug stability and minimized acid-/drug-catalyzed phospholipid degradation in liposomal irinotecan
US20160263030A1 (en) Platinum aggregates and process for producing the same
KR20230011269A (ko) 리포솜 조성물 및 그 제조방법
Ju et al. Preparation and Characterization of Drug Liposomes by Ammonium Sulfate Gradient
Tazina et al. Technology and analysis of temperature-sensitive liposomal preparation of doxorubicin
Cullis et al. By Sheela A. Abraham, Dawn N. Waterhouse, Lawrence D. Mayer

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20031216

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110104

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110329

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110405

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20111007