ES2306785T3 - Composiciones de micelas que contienen fosfolipidos pegilados y un fotosensibilizador. - Google Patents

Abstract

Composición que contiene micelas que comprende a) uno o más fotosensibilizadores, y b) uno o más fosfolípidos que contienen PEG, los cuales forman micelas.

Description

Composiciones de micelas que contienen fosfolípidos pegilados y un fotosensibilizador.

La invención se refiere de forma general al uso d moléculas anfipáticas que contienen polietilenglicol (PEG) y fosfolípidos en micelas, y a su uso en el suministro de agentes química y biológicamente activos. Las micelas de la invención son particularmente útiles para la liberación rápida de tales agentes. Un ejemplo de un agente que podría suministrarse mediante las micelas de la invención es un fotosensibilizador útil en aplicaciones farmacéuticas, agrícolas o industriales. La invención también se refiere a los procesos para la producción de, y aplicación de, dichas micelas como un sistema de suministro para uno o más agentes activos.

Antecedentes de la invención

Mientras que muchos agentes activos son hidrofóbicos o insolubles en agua, a menudo se necesitan en entornos basados en agua o acuosos. En consecuencia, se han desarrollado múltiples sistemas como vehículos de suministro para tales agentes. Estos incluyen el uso de solventes orgánicos, mezclas acuosas/detergente, mezclas acuosas/solvente orgánico (tales como cosolventes), emulsiones, liposomas, y micelas. Por ejemplo, Parikh et al., patente estadounidense número 5.922.355, describen micropartículas que comprenden sustancias insolubles.

También se han mejorado los sistemas de liposomas. Por ejemplo, los sistemas de liposomas se han modificado para potenciar su estabilidad y tiempo de circulación (consultar, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.837.028 y 4.920.016), así como su capacidad para apuntar a células o tejidos concretos (consultar, por ejemplo, las patentes estadounidenses número 5.527.528 y 5.620.689).

Las micelas se han usado para suministrar medicamentos a pacientes (Brodin et al., Acta Pharm. Suec., 19:267-284 (1982)) y las micelas se han usado como portadores de fármacos y para el suministro dirigido de fármacos (Supersaxo et al., Pharm. Res., 8:1286-1291 (1991)), incluyendo medicamentos para el cáncer (Fung et al., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs, 16:439 y siguientes (1988); y Yokoyama et al., Cancer Res., 51:3229-3236 (1991)). Lasic (Nature, volumen 355, pp. 379-380, (1992)) describe el uso de micelas mezcladas que comprenden un agente farmacológicoo y lípidos biológicos.

Las moléculas anfipáticas que comprenden lípidos y partes hidrofílicas (tales como el polietilenglicol (PEG)) son tensioactivos que tienen tendencia a formar espontáneamente agregados coloidales y solución acuosa, conocidos como micelas, cuando el contenido de monómero está por encima de cierta concentración micelar crítica (CMC). Consultar, por ejemplo, Kwun et al., "Polymeric micelles as new drug carriers", Adv. Drug Del. Rev., 21:107-116 (1996); y Bedu-Addo, et al., "Effects of polyethyleneglycol chain length and phospholipid acyl chain composition on the interaction of polyethyleneglycol-phospholipid conjugates with phospholipid: implications in liposomal drug delivery", Pharm Res., 13:710-717 (1996).

Las micelas han tenido gran interés como vehículos de suministro de fármacos con liberación lenta y circulación prolongada. Consultar, por ejemplo, Yokoyama et al., "Toxicity and antitumor activity against solid tumors of micelle-forming polymeric anticancer drug and its extremely long circulation in blood", Cancer Res., 51:3229-3236 (1991); y Trubetskoy et al., "Use of polyethylene-lipid conjugate as long circulating carriers for delivery of therapeutic and diagnostic agents", Adv. Drug Del. Rev., 16:311-320 (1995).

No obstante, hay situaciones en las que se prefiere una liberación más rápida de un agente hidrofóbico. Un ejemplo es la terapia fotodinámica (PDT) convencional, la cual generalmente implica la administración de un fármaco o compuesto fotosensibilizador a un receptor, bien local o sistémicamente, seguido por la irradiación con luz, la cual es capaz de ser absorbida por el fotosensibilizador en el tejido u órgano a ser tratado. Mientras que algunos fotosensibilizadores, tales como el Photofrin® (Axcan Pharmaceuticals, Canadá) pueden suministrarse como parte de una solución acuosa simple, otros fotosensibilizadores hidrofóbicos tienen una tendencia a agregarse en soluciones acuosas a causa del apilamiento molecular, lo que puede reducir gravemente los procesos de fotosensibilización subsiguientes (Siggel et al., J. Phys. Chem., 100(12):2070-2075 (1996)).

Los fotosensibilizadores hidrofóbicos de gran interés incluyen los macrocíclicos polipirrólicos basados en compuestos, y, en particular, las porfirinas verdes tales como la BPD-MA (Anillo A monoácido derivado de benzoporfirina). Desde hace cierto tiempo se sabe que estos compuestos son útiles, cuando se combinan con la luz, para el tratamiento y diagnóstico de una variedad de patologías, incluyendo los tumores, la angiogénesis y la neovasculatura, la reestenosis y las placas ateroescleróticas, y la artritis reumatoide. Las porfirinas tienen una tendencia natural a "localizarse" en tejido canceroso o en proliferación, en donde absorben luz a ciertas longitudes de onda cuando se irradian. La luz absorbida puede resultar en un efecto citotóxico en las células, en las células vecinas, en las cuales se han ubicado las porfirinas. (Consultar, por ejemplo, Diamond et al., Lancet, 2:1175-77 (1972); Dougherty et al., "The Science of Photo Medicine", 625-38 (editores Regan et al., 1982); y Dougherty et al., "Cancer: Principles and Practice of Oncology", 1836-44 (editores DeVita Jr. et al., 1982)). Se ha propuesto que el efecto citotóxico de las porfirinas se debe a la formación de un oxígeno singlete cuando se exponen a la luz (Weishaupt et al., Cancer Research, 36:2326-29 (1976)).

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Es particularmente interesante un grupo de porfirinas modificadas, conocido como "porfirinas verdes" (Gp), que tienen uno o más máximos de absorción de luz entre aproximadamente 670-780 nm. Se ha observado que estos compuestos de Gp, usados conjuntamente con la luz, confieren citotoxicidad contra células diana a concentraciones inferiores a las requeridas para la hematoporfirina o HPD. Los compuestos de Gp pueden obtenerse usando reacciones Diels-Alder de la protoporfirina con varios derivados acetilénicos en las condiciones apropiadas. Las formas preferidas de Gp son los derivados hidromonobenzoporfirina ("BPD"), así como los BPD-MA (incluyendo el compuesto conocido con el nombre genérico Verteporfina), en concreto el EA6 (incluyendo el compuesto conocido como QLT 0074) y el B3. La preparación y el uso de los compuestos de Gp y BPD se describe en las patentes estadounidenses números 4.920.143, 4.883.790 y 5.095.030, incorporadas aquí por referencia en la descripción de la presente solicitud. La preparación y los usos del EA6 y B3 se describen respectivamente en las patentes estadounidenses números 6.153.639 y 5.990.149, también incorporadas en la presente invención por referencia.

Muchos fotosensibilizadores de hidromonobenzoporfirina deseables, tales como el BPD-MA, no sólo son insolubles en agua a pH fisiológicos, sino que también son insolubles sistemas acuosos/cosolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables. Por tanto, se han usado las formulaciones liposomales de BPD-MA (Verteporfina) y ftalocianina de zinc (CIBA-Geigy Ltd., Basilea, Suiza). En el caso de los BDP-MA, los liposomas actúan como un agente de suministro pasivo, transfiriendo el fotosensibilizador a las lipoproteínas plasmáticas, tales como las lipoproteínas de baja densidad (LDL), inmediatamente después de su inyección en el torrente sanguíneo. La mayor expresión de los receptores de las LDL sobre la superficie de tejidos que están proliferando rápidamente, permite un nivel de selectividad para la localización de los fármacos hidrofóbicos asociados con LDL, en los sitios diana para la PDT.

De forma similar, la hematoporfirina (HP) y los dimetilésteres de hematoporfirina se han formulado en vesículas unilamelares de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y liposomas de dimiristoil- (DMPC) y diestearoilfosfatidilcolina (DSPC). Zhou et al., ver más arriba; Ricchelli, New Directions in Photodynamic Therapy, 847:101-106 (1987); Milanesi, Int. J. Radiat. Biol., 55:59-69 (1989). La HP, el porfímero sódico, y las tetrabenzoporfirinas se han formulado en liposomas compuestos por fosfatidilcolina de huevo (EPC). Johnson et al., Proc. Photodynamic Therapy: Mechanisms II, Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 1203:266-80 (1990).

Además, se han preparado formulaciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden un fotosensibilizador de porfirina, un disacárido o polisacárido, y uno o más fosfolípidos (tales como el EPG y el DMPC). Estas formulaciones forman liposomas que contienen una cantidad efectiva de fotosensibilizador de porfirina a partir de su reconstitución con un vehículo acuoso apropiado, y se describen en Desai et al., patente estadounidense número 6.074.666, la cual se incorpora por referencia. Los procedimientos para la producción a gran escala de liposomas de DPMC/EPG que contienen fotosensibilizador se describen en la patente estadounidense número 5.707.608, la cual se incorpora por referencia como si se detallara completamente.

En la PDT, a menudo se prefiere una liberación rápida del fotosensibilizador (PS) desde el sistema de suministro para permitir la administración de una dosis efectiva de luz activadora durante un período de tiempo breve oportuno después de la administración del PS. La liberación rápida también permite que el PS inicie su eliminación del sujeto para minimizar la activación espuria por parte de la luz ambiental después de la administración de la luz activadora.

Adicionalmente, un sistema de suministro de PS para la PDT es preferiblemente sencillo, no tóxico (biodegradable o fácilmente excretado), químicamente inerte, económico, y usado fácilmente mientras se mantiene el fármaco en un forma relativamente no agregada con una prolongada vida útil (preferiblemente como una formulación en estado sólido). El vehículo de suministro real debería ser efectivo en el suministro del fotosensibilizador, fácil de reconstituir para su uso, y apropiado para su esterilización mediante filtración en el caso de que el autoclavado o la radiación gamma no sean apropiados.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona composiciones de micelas que comprenden polietilenglicol (PEG) conjugado covalentemente a fosfolípidos, así como procedimientos para su preparación y uso. Mientras que las composiciones pueden servir como vehículos para contener o suministrar cualquier agente química o biológicamente activo, se prefieren como vehículos para fotosensibilizadores. En contraste con ciertos sistemas de micelas de PEG descritos en la técnica anterior, se ha descubierto que las composiciones de micelas de la invención son capaces de liberar un agente activo in vivo de forma relativamente rápida, dependiendo del fotosensibilizador escogido, y, por tanto, tienen el potencial de afrontar muchas necesidades y requisitos de formulaciones de sistemas de suministro de fotosensibilizadores. Se ha descubierto que las composiciones de la invención mantienen los agentes hidrofóbicos en una forma no agregada y en una concentración relativamente elevada, a la vez que con una baja proporción (total) de lípido respecto agente activo. Los lípidos de las micelas pueden, por supuesto, incluir otros lípidos o fosfolípidos, además de los fosfolípidos que contienen PEG.

La invención proporciona además procedimientos para preparar las susodichas composiciones. Estos procedimientos comprenden combinar un agente activo, tal como un fotosensibilizador (PS), y uno o más fosfolípidos que contienen PEG, los cuales son capaces de formar micelas, seguido por la conversión a una forma sólida, si se desea. Las composiciones en forma sólida, que contienen el agente activo (tal como el PS) y los fosfolípidos que contienen PEG, pueden permanecer como un sólido, o hidratarse con una solución acuosa sin pérdida de las propiedades físicas de las micelas, para su almacenamiento o aplicación. Las composiciones en forma sólida puede formularse para comprender uno o más compuestos potenciadores de la hidratación, los cuales hacen más sencilla, rápida, y/o más eficiente la hidratación de las micelas. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática de las micelas de la invención.

Las composiciones, bien antes o después de la hidratación, pueden combinarse adicionalmente con otros agentes farmacéuticamente aceptables. La forma sólida o hidratada de la composición puede separarse en dosis apropiadas para administrar una cantidad efectiva del fotosensibilizador a un sujeto.

La presente invención también proporciona procedimientos para la administración de las micelas a sujetos que precisan de agentes activos concretos. En el caso de los fotosensibilizadores, las micelas se administran a sujetos sometidos a terapia fotodinámica.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de la interacción reversible de un fármaco hidrofóbico con micelas de conjugado de polietilenglicol-lípido.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la medición de la concentración micelar crítica (CMC) de la P2K-DSPE antes y después de la incorporación de QLT0069.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Antes de detallar la invención, puede ser útil, para una comprensión de la misma, establecer primero las definiciones de ciertos términos que se usarán a partir de ahora.

"Anfipático" o "molécula anfipática" se refiere a la presencia de ambas, una parte hidrofóbica y una hidrofílica, en una única molécula. La parte hidrofóbica puede ser lipofílica, y la parte hidrofílica puede ser polar y/o cargada. Hidrofóbica se refiere a cualquier sustancia o parte de la misma que es más soluble en un solvente no polar que en un solvente polar. Hidrofílico se refiere a cualquier sustancia o parte de la misma que es más soluble en un solvente polar que en un solvente no polar. Las moléculas anfipática preferidas de la invención son aquéllas que son capaces de autoensamblarse en micelas. Un fragmento hidrofílico preferido para la práctica de la invención incluye el polietilenglicol (PEG).

"Micela" se refiere a un agregado coloidal formado a partir de moléculas anfipáticas a un concentración superior a una concentración micelar crítica (CMC). Las micelas se distinguen de los liposomas en que los liposomas comprenden una o más bicapas lipídicas, mientras que las micelas no. Más aún, la parte "cola" hidrofóbica (lipofílica) de los fosfolípidos generalmente está orientada hacia el interior de la micela. Preferiblemente, las micelas tienen la parte "cola" generalmente orientada hacia el centro de la micela. Las micelas no tienen estructura de bicapa y por tanto no se consideran vesículas o liposomas. Las micelas pueden formarse también en una orientación invertida, en donde las partes hidrofóbicas de las moléculas anfipáticas se encaran hacia el exterior de la micela, mientras que las partes hidrofílicas de las moléculas se encaran hacia el interior de las micelas. Las micelas de la invención son preferiblemente pequeñas (menos de 200 nanómetros (nm)) y contienen concentraciones elevadas del agente activo, tales como cercanas o aproximadamente 2 mg/mL, en una proporción (molar) baja de lípido:agente activo. Las más preferidas son las micelas con diámetros medios de menos de aproximadamente 30 nm. Aún más preferiblemente, tienen diámetros medios de menos de aproximadamente 20 nm. Las micelas de la invención preferiblemente contienen concentraciones de un fotosensibilizador como el QLT 0069 de aproximadamente 2 mg/mL.

"Lípido" se refiere a una sustancia hidrofóbica. Preferiblemente, son ácidos grasos que contienen al menos 10 átomos de carbono, más preferiblemente aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 16, aproximadamente 18, aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 24 átomos de carbono. Pueden usarse las cadenas de ácido graso de más de 24 átomos de carbono, así como otras sustancias hidrofóbicas, tales como, pero no limitados a, el colesterol. Las cadenas de ácido graso puede estar completa o parcialmente saturadas. Determinadas cadenas de ácido graso tienen nombres (seguidos por el número de átomos de carbono que poseen), tales laurato (12C), miristato (14C), palmitato o palmitoleato(16C), estearato u oleato o linoleato o linolenato (18C), araquidato o araquidonato (20C), o behenato (22C), y lignocerato (24C).

"Fosfolípido" se refiere a las moléculas anfipáticas que comprenden una parte lipídica y una parte hidrofílica que contiene fósforo. En las moléculas que comprenden glicerol, la parte hidrofílica es preferiblemente la fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, o fosfatidilinositol. En realizaciones particularmente preferidas de la invención, el fosfolípido es una diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE).

Tal como se usa en la presente invención, polietilenglicol o PEG, se refiere a dichos compuestos que tienen entre aproximadamente 100 a 10.000 dalton, dependiendo del número de unidades de óxido de etileno en la cadena polimérica. Los pesos moleculares preferidos (PM) van desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 10.000, aproximadamente 1000 hasta 10.000 (o aproximadamente 22 hasta 220 unidades de óxido de etileno), aproximadamente 2000 hasta 10.000, y aproximadamente 3000 o 4000 hasta 10.000. Son realizaciones particularmente preferidas los PEG que tienen un peso molecular aproximado de 2000, aunque también podrían usarse pesos moleculares de aproximadamente 5000, aproximadamente 6000, aproximadamente 7000, y aproximadamente 8000 en la práctica de la invención. En realizaciones particularmente preferidas de la invención, se usa el PEG de PM 2000 con DSPE.

"Porfirina verde" se refiere a derivados de la porfirina obtenidos haciendo reaccionar núcleos de porfirina con un álcali en una reacción del tipo Diels-Alder para obtener una monohidrobenzoporfirina.

Ademas de las micelas y de las composiciones que contienen micelas de la invención, la presente invención proporciona procedimientos para formular dichas micelas. En una realización, tales procedimientos implican disolver la molécula anfipática, tales como el PEG_{2000}-DSPE, y uno o más agentes activos en un solvente apropiado, tal como el diclorometano, seguido por la eliminación del solvente para formar una película delgada. La película delgada puede hidratarse con un solvente acuoso para formar una solución que comprende micelas para su administración o aplicación, o para su esterilización mediante un filtro de 0,22 \mum. La película también puede dividirse en porciones antes de hidratarlas de forma individual. Alternativamente, las micelas pueden formarse mediante la adición de un solvente volátil miscible, que contiene un PS y un PEG-lípido, a una fase acuosa, de tal forma que se elimina la fase orgánica (por ejemplo, calentando la mezcla), dejando en solución acuosa las micelas que contienen el PS. Pueden usarse varias cantidades de agente activo dentro de los rangos apropiados de la proporción (molar) de lípido:agente activo. Las proporciones preferidas van desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 10 o aproximadamente 20. También pueden usarse las proporciones de aproximadamente 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, y aproximadamente 9, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 19. Las proporciones preferidas para la práctica de la invención van desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6, o desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 10. Adicionalmente, se hallan dentro del ámbito de la invención las proporciones intermedias dentro del rango, tales como desde aproximadamente 4,1:1 hasta 4,9:1, aproximadamente 5,1:1 hasta 5,9:1, aproximadamente 6,1:1 hasta 6,9:1, aproximadamente 7,1:1 hasta 7,9:1, y aproximadamente 8,1:1 1 hasta 8,9:1.

La hidratación puede ser con cualquier solución acuosa apropiada, incluyendo las soluciones tamponadas o no tamponadas (tales como el agua destilada, o el agua para inyecciones). Cuando se usan soluciones tamponadas, preferiblemente están tamponadas a un pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, más preferiblemente a un pH de aproximadamente 5,5, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, y aproximadamente 8,5. Los ejemplos de soluciones tamponadas incluyen, pero no se limitan a, las soluciones tamponadas con fosfato 2 o 20 mM.

Las composiciones y procedimientos de la presente invencion incluyen además la administración de micelas que contienen agente activo, como vehículos de suministro, a un sujeto que precisa del agente. Preferiblemente, el agente activo no es una molécula de polipéptido o no es un polipéptido que comprende más de aproximadamente 15 o aproximadamente 25 aminoácidos. En cambio, el agente activo es preferiblemente una molécula orgánica pequeña, con un peso molecular superior a 600 dalton. Por ejemplo, las micelas de la invención pueden usarse para suministrar compuestos fotosensibilizadores a receptores sometidos a tratamiento de PDT.

Fotosensibilizadores

La invención podría practicarse con una variedad de fotosensibilizadores sintéticos y naturales basados en el pirrol, incluyendo los profármacos tales como el ácido 5-aminolevulínico, las porfirinas y los derivados de la porfirina, por ejemplo, las clorinas, bacterioclorinas, isobacterioclorinas, ftalocianina y naftalocianinas, y otros compuestos tetra- y policíclicos, y compuestos relacionados (por ejemplo, las pirofeoforbidas, las safirinas y texafirinas) y los complejos metálicos (tales como, pero no limitados por, el estaño, aluminio, zinc y lutecio). Las tetrahidroclorinas, las purpurinas, los porficenos, y los fenotiazinios también se hallan dentro del ámbito de la invención.

Los fotosensibilizadores particularmente preferidos incluyen las porfirinas verdes tales como la BPD-MA, EA6 y B3. Generalmente, puede usarse en la invención cualquier compuesto fotosensible macrocíclico, polipirrólico o tetrapirrólico, que sea hidrofóbico. Los ejemplos de estos y otros fotosensibilizadores para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las angelicinas, algunas macromoléculas biológicas tales como la lipofuscina; los centros de reacción del fotosistema II; y los centros de reacción D1-D2-cit b-559 del fotosistema II, los colorantes de chalcogenapirilio, las clorinas, las clorofilas, las coumarinas, las cianinas, ciertos ADN y los compuestos relacionados, ciertos fármacos tales como la adriamicina; la aflocualona; la amodiaquina; la daunomicina; la daunomicinona, ciertas flavinas riboflavinas, los fullerenos, las metaloporfirinas, las metaloftalocianinas, los derivados del azul de metileno, las naftalimidas, las naftalocianinas, ciertos compuestos naturales tales como las quinureninas, las inureninas; la sanguinarina; la berberina; el carmano; y el 5,7,9(11),22-ergostatetraen-3-\beta-ol, los derivados del azul del nilo, los NSAID (fármacos antiinflamatorios no esteroídicos), la perilenequinonas, los fenoles, las feoforbidas, las feofitinas, los dímeros y conjugados de fotosensibilizador, las ftalocianinas, los porficenos, las porfirinas, los psoralenos, las purpurinas, las quinonas, los retinoides, las rodaminas, los tiofenos, las verdinas, las vitaminas y los colorantes de xanteno (Redmond y Gamlin, Photochem. Photobiol., 70(4):391-475 (1999)).

Las angelicinas ilustrativas incluyen las modificadas mediante grupos aceto o metilo en las posiciones 3, 4', 4, 5', y/o 6.

Los colorantes de chalcogenapirilio ilustrativos incluyen los percloratos de pirilio, selenopirilio, tiopirilio y teluropirilio.

Los colorantes de clorina ilustrativos incluyen el derivado éster dimetílico de la 5-azaclorina; la 5,10,15,20-tetraquis-(m-hidroxifenil)bacterioclorina; anillo A monoácido derivado de benzoporfirina; ácido porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-dimetil-amino)-2-oxoetil]-8-etiliden-7,8-dihidro-3,7,12,17-tetrametil, dimetilester; ácido porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-dimetil-amino)-2-oxoetil]-8-etiliden-8-etil-7,8-dihidro-3,7,12,17-tetrametil, dimetilester Z; ácido porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-dimetil-amino)-2-oxoetil]-8-etiliden-8-etil-7,8-dihidro-3,7,12,17-tetrametil, dimetilester ZECHL; ácido porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-dimetil-amino)-2-oxoetil]-8-etiliden-8-n-heptil-7,8-dihidro-
3,7,12,17-tetrametil, dimetilester Z; tin ácido (II) porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-(dimetilamino-2-oxoetil]-8-etiliden-8-n-heptil-7,8-dihidro-3,7,12,17-tetrametil, dimetilester Z; clorina e_{6}; clorina e_{6} dimetil ester; clorina e_{6} k3; clorina e_{6} monometil ester; clorina e_{6} Na3; clorina p6; clorina p6-trimetilester; derivado de clorina del ácido zinc (II) porfina-2,18-dipropanoico, 7-[2-(dimetilamino)-2-oxoetil]-8-etiliden-8-n-heptil-7,8-dihidro-3,7,12,17-tetrametil, dimetiléster Z; 131-desoxi-20-formil-vic-dihidroxi-bacterioclorina di-tert-butil aspartato; 13'-desoxi-20-formil-4-ceto-bacterioclorina di-tert-butil aspartato; di-L-aspartil clorina e_{6}; mesoclorina; 5,10,15,20-tetraquis-(m-hidroxifenil) clorina; meta-(tetrahidroxifenil)clorina; metil-131-desoxi-20-formil-4-ceto-bacterioclorina; mono-L-aspartil clorina e_{6}; dimetiléster de fotoprotoporfirina IX; ficocianobilina; protoclorofilina a; clorina e_{6} de estaño (IV); clorina e_{6} estaño; tin L-aspartil clorina e_{6}; octaetil-benzoclorina de estaño; clorina de estaño (IV); clorina e_{6} de zinc; y L-aspartil clorina e_{6} de zinc.

Los colorantes de clorofilas ilustrativos incluyen las clorofilas a y b; las bacterioclorofilas, a b c, o d; las protoclorofilas; y los derivados anfifílicos de las mismas.

Las coumarinas ilustrativas incluyen las metoxicoumarinas; las tenoilcoumarinas; la quelina; el RG 708; el RG277; y la visnagina.

Las cianinas ilustrativas incluyen el colorante de benzoselenazola; el colorante de benzoxazola; las oxacarbocianinas; las tiacarbocianinas; las selenacarbocianinas; las critocianinas; los derivados de la benzoxazola; los derivados de la quinolina; y las merocianinas.

Los fullerenos ilustrativos incluyen el C60; C70; C76; los dihidrofullerenos; los buckminsterfullerenos; y los tetrahidrofullerenos.

Las metaloporfirinas ilustrativas incluyen los nitratos de clorotexafirina; las porfirinas de cadmio o cobalto o cobre o europio o galio o lutecio o magnesio o manganeso o níquel o paladio o platino o samario o plata o estaño o zinc, las tetrabenzoporfirinas, las porfinas, las texafirinas, las hematoporfirinas, las tetrabenzoporfirinas, las tetrafenilporfirinas, las clorotexafirinas, las porfirazinas; la protoporfirina de zinc; y la protoporfirina IX de zinc.

Las metaloftalocianinas ilustrativas incluyen las ftalocianinas (opcionalmente sulfonatos, disulfonatos, trisulfonatos, y tetrasulfonatos).

Los derivados azules de las naftalimidas ilustrativos incluyen la N,N'-bis-(hidroperoxi-2-metoxietil)-1,4,5,8-naftaldiimida; N-(hidroperoxi-2-metoxietil)-1,8-naftalimida; 1,8-naftalimida; N,N'-bis(2,2-dimetoxietil)-1,4,5,8-naftaldiimida; y N,N'-bis(2,2-dimetilpropil)-1,4,5,8-naftaldiimida.

Las naftalocianinas ilustrativas incluyen las naftalocianinas de aluminio o sílice o zinc, cloronaftalocianinas, t-butilnaftalocianinas, amidonaftalocianinas, tetraaminonaftalocianinas, tetrabenzamidonaftalocianinas, tetrahexilamidonaftalocianinas, tetrarnetoxi-benzarnidonaftalocianinas, tetrametoxinaftalocianinas, los tetrasulfonatos de naftalocianina y las tetradodecilamidonaftalocianinas.

Los derivados ilustrativos del azul de nilo incluyen los benzo[a]fenotiazinios.

Las perilenequinonas ilustrativas incluyen las hipericinas, la calfostina C, las cercosporinas, los elsinocromos, los fleicromos y la rubelina A.

Los fenoles ilustrativos incluyen el 2-bencilfenol; el 2,2'-dihidroxibifenilo; 2,5-dihidroxibifenilo; 2-hidroxibifenilo; 2-metoxibifenilo; y 4-hidroxibifenilo.

Los feofórbidos ilustrativos incluyen el feofórbido a; el metil 131-deoxi-20-formil-7,8-vic-dihidro-bacterio-meso-feofórbido a; el metil-2-(1-dodeciloxietil)-2-devinil-pirofeofórbido a; el metil-2-(1-heptil-oxietil)-2-devinil-feofórbido a; el metil-2-(1-hexil-oxietil)-2-devinil-pirofeofórbido a; el metil-2-(1-metoxi-etil)-2-devinil-pirofeofórbido a; el metil-2-(1-pentil-oxietil)-2-devinil-pirofeofórbido a; el metil bacteriofeofórbido d magnésico; el metil-bacteriofeofórbido d; y el feofórbido.

Las feofitinas ilustrativas incluyen la bacteriofeofitina a; la bacteriofeofitina b; la bacteriofeofitina c; la bacteriofeofitina d; la 10-hidroxifeofitina a; la feofitina; la feofitina a; y la protofeofitina.

Las porfirinas ilustrativas incluyen la 5-azaprotoporfirina dimetilester; la bis-porfirina; la coproporfirina III; el tetrametiléster de coproporfirina III; la deuteroporfirina; el dimetiléster de deuteroporfirina IX; el dimetiléster de diformildeuteroporfirina IX; la dodecafenilporfirina; la hematoporfirina; la hematoporfirina IX; el monómero de hematoporfirina; el dímero de hematoporfirina; los derivados de la hematoporfirina; el dihidrocloruro de hematoporfirina IX; el dimetiléster de hematoporfirina IX; el dimetiléster de mesoporfirina; el dimetiléster de monoformil-monovinil-deuteroporfirina IX; la monohidroxietilvinil deuteroporfirina; la 5,10,15,20-tetra(o-m-hidroxifenil)porfirina; la 5,10,15,20-tetra(m-hidroxifenil)porfirina; la 5,10,15,20-tetraquis-(m-hidroxifenil)porfirina; la 5,10,15,20-tetra(p-m-hidroxifenil)porfirina; la 5,10,15,20- tetraquis (3-metoxifenil)porfirina; la 5,10,15,20- tetraquis (3,4-dimetoxifenil)porfirina; la 5,10,15,20- tetraquis (3,5-dimetoxifenil) porfirina; la 5,10,15,20- tetraquis (3,4,5-trimetoxifenil)porfirina; la 2,3,7,8,12,13,17,18-octaetil-5,10,15,20-tetrafenilporfirina; la Photofrin®; la Photofrin® II; la porfirina c; la protoporfirina; la protoporfirina IX; el dimetiléster de protoporfirina; el dimetiléster de protoporfirina IX; el yoduro de protoporfirina propilaminoetilformamida; la protoporfirina N,N-dimetilaminopropilformamida; el yoduro de protoporfirina propilaminopropilformamida; la protoporfirina butilformamida; la protoporfirina N,N-dimetilamino-formamida; la protoporfirina formamida; las sapirinas; las porfinas; la tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina; la meso-tetra(4-N-trimetilanilinio)-porfina; la uroporfirina; la uroporfirina IX; and uroporfirina I.

Los psoralenos ilustrativos incluyen los metoxipsoralenos dimetoxipsoralenos; los carbetoxipsoralenos; los pseudopsoralenos; los hidroxipsoralenos; los trimetilpsoralenos; los alopsoralenos; el isopseudopsoraleno; los acetoisopseudopsoralenos; los pseudoisopsoralenos; y los acetopseudoisopsoralenos.

Las purpurinas ilustrativas incluyen la octaetilpurpurina; la octaetilpurpurina de zinc; la octaetilpurpurina oxidada; la octaetilpurpurina reducida; la octaetilpurpurina de estaño; la purpurina 18; la purpurina-18; la purpurina-18-metilester; la purpurina; la etil etiopurpurina I de estaño; el etiléster de la Zn(II) etiopurpurina; y la etiopurpurina de zinc.

Las quinonas ilustrativas incluyen las antraquinonas; las benzoquinonas; las hidroquinonas; las clorohidroquinonas; el resorcinol; y el 4-clororesorcinol.

Los retinoides ilustrativos incluyen el retinal todo-trans; el aldehído en C17; el aldehído en C22; el 11-cis retinal; el 13-cis retinal; el retinal; y el retinal palmitato.

Los tiofenos ilustrativos incluyen los tertiofenos, los bitiofenos, el difeniltiofeno; los quatertiofenos; el \alpha-quatertienilo; el \alpha-tetratiofeno; el \alpha-pentatiofeno; el \alpha-hexatiofeno; y el \alpha-heptatiofeno.

Las verdinas ilustrativas incluyen el trimetilester de copro (II) verdina; el metilester de deuteroverdina; el metilester de la mesoverdina; y la metilpiroverdina de zinc.

Las vitaminas ilustrativas incluyen el ergosterol (provitamina D2); el hexametil-Co a Co b-diciano-7-de(carboximetil)-7,8-didehidro-cobirinato (Pirocobester); pirocobester; y la vitamin D3.

Los colorantes xantenos ilustrativos incluyen las eosinas y los derivados de la eosina, las eritrosinas, las fluoresceínas, las floxinas, y el rosa de bengala.

En una realización, los compuestos preferidos para formular son los compuestos de anillos A y B tetrapirrólicos hidrofóbicos, tales como el BPD-DA, -DB, -MA, y -MB. Los más preferidos son los compuestos del anillo B, BPD-MB, B-EA6, B-B3; los compuestos del anillo A, BPD-MA, A-EA6 y A-B3; y las dihidroxiclorinas.

Estos compuestos son derivados de la porfirina obtenidos haciendo reaccionar un núcleo de porfirina con un alquino en una reacción del tipo Diels-Alder, para obtener una monohidrobenzoporfirina, y se describen en detalle en la patente estadounidense concedido número 5.171.749, la cual se incorpora en la presente invención en su totalidad por referencia. Por supuesto, también pueden usarse combinaciones de fotosensibilizadores. Se prefiere que el espectro de absorción del fotosensibilizador esté en el rango visible, típicamente entre 350 nm y 1200 nm, más preferiblemente entre 400-900 nm, y aún más preferiblemente entre 600-900 nm.

El BPD-MA se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses con números 5.171.749 y 5.095.030; EA6 y B3 se describen en las patentes estadounidenses con números 5.929.105 y 5.880.145, respectivamente, todas las cuales se incorporan en la presente invención por referencia. Las porfirinas verdes preferidas tienen la estructura básica:

1

2

en donde R^{4} es un vinilo o 1-hidroxietilo, y R^{1}, R^{2}, y R^{3} son H o un alquilo o un alquilo sustituido, y n es un entero entre 0 y 6, preferiblemente 2.

El BPD-MA (Verteporfina) tiene la estructura mostrada en la Fórmula 1, en donde R^{1} y R^{2} son metilos, R^{4} es un vinilo, y uno de R^{3} es H y el otro es un metilo, y n=2. B-EA6 es de la Fórmula 2, en donde R^{1} y R^{2} son metilos, y ambos R^{3} son 2-hidroxietilos (es decir, los ésteres de etilenglicol). B3 es de la Fórmula 2, en donde R^{1} es un metilo, R^{2} es H, y ambos R^{3} son metilos, y n=2. En ambos, EA6 y B3, R^{4} es también un vinilo.

Las representaciones de BPD-MAC y BPD-MAD, los cuales son los componentes enantioméricos de la Verteporfina, así como las ilustraciones de las formas de anillo A y B del EA6 y B3 (en donde n=2), son como sigue:

3

4

5

Los compuestos relacionados de las Fórmulas 3 y 4 son útiles también; en general, R^{4} será un vinilo o un 1-hidroxietilo, y R^{1}, R^{2}, y R^{3} son H o un alquilo o un alquilo sustituido.

Los ejemplos adicionales de compuestos BPD hidrofóbicos del anillo B que son difíciles de formular, y que son especialmente apropiados para su uso en la invención se muestran más abajo. El compuesto QLT0069 se usa en varios de los ejemplos en la presente invención.

6

7

Las formas diméricas de la porfirina verde y las formas dimérica y multimérica de las combinaciones porfirina verde/porfirina pueden usarse también. Los dímeros y compuestos oligoméricos de la invención pueden prepararse usando reacciones análogas a aquéllas para la dimerización y oligomerización de la porfirina per se. Los enlaces entre porfirinas verdes o porfirina verde/porfirina pueden hacerse directamente, o las porfirinas pueden acoplarse, seguidas por una reacción de Diels-Alder de una o ambas porfirinas terminales para convertirlas en las correspondientes porfirinas verdes.

Otros ejemplos no limitantes de fotosensibilizadores que pueden ser útiles en la invención, son los derivados Diels-Alder fotosensibles de la porfirina, descritos en las patente estadounidense número 5.308.608; los compuestos similares a la porfirina, descritos en las patentes estadounidenses números 5.405.957, 5.512.675, y 5.726.304; los derivados de la bacterioclorofila-A descritos en las patentes estadounidenses números 5.171.741 y 5.173.504; las clorinas, los isobacterioclorinas, y las bacterioclorinas, tal como se describen en la patente estadounidense número 5.831.088; el tripirrano meso-mono-sustituido y meso-sustituido, descrito en la patente estadounidense número 5.831.088; los macrociclos polipirrólicos procedentes de los compuestos tripirrano meso-sustituidos, descritos en la patentes estadounidenses números 5.703.230, 5.883.246, y 5.919.923; y los ésteres de etilenglicol, descritos en la patente estadounidense número 5.929.105. Todas las patentes citadas en este parágrafo se incorporan aquí por referencia, como si se detallaran completamente. Generalmente, cualquier fotosensibilizador hidrofóbico, que absorbe en los rangos espectroscópicos ultravioleta, visible e infrarrojo, será útil para practicar esta invención.

Actualmente, un cierto número de fármacos fotosensibilizadores de interés son hidrofóbicos, con una estructura basada en el tetrapirrol. Estos fármacos tienen una tendencia inherente a agregarse, lo que puede reducir gravemente los procesos de fotosensibilización (Siggel et al., J. Phys. Chem., 100(12):2070-2075 (1996)). Por ejemplo, la vía sintética para BPD rinde intermedios del anillo A y B en cantidades aproximadamente equimolares, los cuales pueden derivarse adicionalmente. Se halló que los derivados del anillo A, tales como el BPD-MA (Verteporfina), pueden formularse para su suministro usando medios tradicionales tales como los liposomas, mientras que los compuestos del anillo B se mostraron más difíciles de formular, debido a su tendencia a experimentar autoasociación. Esta autoasociación de los BPD derivados del anillo en dímeros se describen en D. Delmarre et al, Can J. Chem., 79: 1069-1074 (2001), la cual se incorpora por referencia como si se detallara completamente. Mientras que los BPD del anillo B monoméricos exhiben una banda de absorción principal a 692 nm, el dímero absorbe a 724 nm. Por tanto, la tendencia de los BPD de anillo B a experimentar autoasociación en una formulación determinada pueden verificarse mediante el cociente A_{692}/A_{720}. El desplazamiento al rojo observado en los espectros de absorción los más probable es que sea consecuencia de la formación del dímero consistente en dos moléculas del BPD del anillo B apiladas cabeza-con-cola.

En un aspecto adicional de la invención, los fotosensibilizadores de la invención pueden conjugarse con varios ligandos para facilitar el apuntamiento a tejidos y células antes de que los fotosensibilizadores se formulen con moléculas anfipáticas. Estos ligandos incluyen aquéllos que son específicos para receptor, así como las inmunoglobulinas y los fragmentos de las mismas. Los ligandos preferidos incluyen los anticuerpos en general y los anticuerpos monoclonales, así como los fragmentos inmunológicamente reactivos de los mismos.

Micelas

Las micelas de la invención contienen uno o más fosfolípidos conjugados a PEG. Los fosfolípidos conjugados a PEG son reactivos disponibles comercialmente (Avanti Polar Lipids, Genzyme Pharmaceuticals, Lipoid), o pueden prepararse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Estos conjugados PEG-lípido y su síntesis se han descrito detalladamente en Allen, T.M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C. y Yau-Young, A. 1991. Los liposomas que contiene derivados lipídicos sintético del polietilenglicol presentan vidas medias en circulación in vivo prolongadas. Biochim. Biophys. Acta, 1066, 29-36, la cual se incorpora por referencia en su totalidad como si se detallara completamente. Los fosfolípidos apropiados para su uso en la invención pueden ser cualquier fosfolípido que ocurra de forma natural o sintético, sea saturado o insaturado en la parte lipídica de la molécula. Incluyen, pero no se limitan los siguientes: DSPE, dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, lisofosfolípidos, fosfolípido de huevo o soja o combinación de los mismos. Los fosfolípidos hallarse en cualquier forma, incluyendo con sales o desalados, hidrogenados o parcialmente hidrogenados, o naturales, semisintéticos (modificados) o sintéticos.

Los más preferidos son los fosfatidilgliceroles saturados, las fosfatidiletanolaminas o las fosfatidilcolinas.

Sin estar restringidos por la teoría, y en relación a la característica de liberación rápida de las micelas de la invención, se cree que la combinación de agentes activos hidrofóbicos con fosfolípidos que contienen PEG resulta en la transferencia del agente activo hidrofóbico lejos de las moléculas anfipáticas cuando la formulación se diluye por debajo de la concentración micelar crítica (CMC) de la mezcla. Por tanto, a partir de su inyección intravenosa, la formulación experimenta un dilución en la sangre que debería ser inferior a la CMC de la formulación para garantizar la liberación del fármaco.

Los fosfatidilgliceroles (PG) también pueden estar presentes en las micelas de la invención. Los ejemplos de tales PG incluyen el dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), DLPG y similares. Otros tipos apropiados de fosfolípidos que pueden incluirse son las fosfatidiletanolaminas (PE), los ácidos fosfatídicos (PA), las fosfatidilserinas, y los fosfatidilinositoles.

Antioxidantes

En las realización que comprenden el uso de fosfolípidos insaturados, la invención puede incluir el uso de antioxidantes para impedir la oxidación de los fosfolípidos. La autooxidación de las cadenas aciladas insaturadas puede ser un problema para el almacenamiento a largo plazo de las formulaciones de liposomas. El fracaso para impedir la alteración oxidativa de los fosfolípidos insaturados resulta en subcomponentes tales como los liso-lípidos y ácidos grasos, los cuales pueden ser no deseable en algunas composiciones micelares. Como tales, los antioxidantes apropiados para su inclusión en micelas que contienen fosfolípidos, para mejorar su almacenamiento a largo plazo, son conocidos en el estado de la técnica. Los ejemplos de tales antioxidantes incluyen el hidroxitolueno butilado (BHT), el alfa-tocoferol, y el ascorbilpalmitato (AP), así como los agentes tamponantes del pH tales como los fosfatos y la glicina. Preferiblemente, el BHT está presente en aproximadamente 0,01-0,02% en peso, y el AP a aproximadamente 0,1-0,2% en peso.

El BHT es hidrofóbico y se esperara que permanezca en los entornos lipofílicos de las micelas de la invención. El BHT tiene la capacidad de impedir la propagación en cadena durante la autoxidación, mediante la aceptación de radicales formados durante la rotura oxidativa de los lípidos. El ácido ascórbico tiene la capacidad de actuar como un antioxidante, y de actuar con otros antioxidantes tales como el alfa-tocoferol. Se ha observado que el sistema BHT/ácido ascórbico permite la regeneración del BHT, a continuación de su conversión en un radical fenoxilo, después del secuestro de los radicales libres procedentes de lípidos oxidados, resultando de ese modo en la aparición de radicales ascorbilo. Este último factor justifica la proporción de peso relativo de AP respecto HBT descrita más arriba. AP se usó en lugar del ácido ascórbico porque la naturaleza hidrofóbica del primero se esperaría que concentrara el antioxidante dentro de los entornos lipofílicos.

Otra consideración antioxidante es el relleno de los espacios en cabecera del contenedor con agente nitrógeno y el sellado de tales contenedores. Adicionalmente, y puesto que los iones metálicos pueden catalizar procesos oxidativos, se prefiere el uso de fármacos, excipientes, y contenedores de elevada calidad, la limpieza juiciosa del equipo de fabricación, y el uso apropiado de quelantes de iones. metálicos,

Agentes crioprotectores y agentes isotónicos

En una realización preferida de la invención, las micelas pueden estabilizarse adicionalmente mediante liofilización. Las micelas de la invención pueden contener un crioprotector para su estabilización durante la liofilización. Alternativamente, las estructuras físicas de las micelas pueden conservarse mediante la presencia de suficiente agua durante la liofilización. Esto puede conseguirse mediante un control apropiado del grado de liofilización.

Puede usarse en la invención reivindicada cualquier agente crioprotector que se sepa que es útil en la técnica de preparar formulaciones liofilizada, tales como los di- o polisacáridos u otros agentes de carga tales como la lisina. Además, pueden usarse agentes isotónicos típicamente añadidos para mantener la isomolaridad con los fluidos corporales. En realizaciones preferidas, se usa un disacárido o polisacárido y funciona tanto como agente crioprotector como agente isotónico. En una realización especialmente preferida, el disacárido o polisacárido se selecciona de entre el grupo consistente en lactosa, trehalosa, maltosa, maltotriosa, palatinosa, lactulosa o sacarosa, prefiriéndose la lactosa o la trehalosa. Los azúcares efectivos tales como la trehalosa y la lactosa son capaces de formar puentes de hidrógeno, con el grupo de la cabeza del fosfolípido, en sustitución del agua.

La adición de un disacárido o polisacárido puede hacerse durante la fabricación de la película fina o, alternativamente, puede añadirse después de la formación de la película seca, como parte de la solución acuosa usada para hidratar las micelas.

Para este propósito se prefieren los disacáridos o polisacáridos a los monosacáridos. Para mantener la presión osmótica de las composiciones micelares de la invención similar a la de la sangre, no debería añadirse más del 4-5% de polisacáridos. Por contra, puede usarse aproximadamente un 9-10% de un disacárido sin generar una presión osmótica inaceptable. También, cuando está presente, el disacárido o polisacárido se formula en una proporción en peso preferida de aproximadamente 10-20 de sacárido respecto a 0,5-6,0 de fosfolípidos totales, respectivamente, aún más preferiblemente en una proporción de desde aproximadamente 10 respecto 1,5-4,0. En una realización, una formulación preferida pero no limitante es lactosa o trehalosa y fosfolípidos totales en una proporción de aproximadamente 10 a 0,94-1,88 hasta aproximadamente 0,65-1,30, respectivamente.

Liofilización

Una vez formuladas, las micelas de la invención, si se desea, pueden secarse congeladas o liofilizarse para su almacenamiento a largo plazo. Por ejemplo, el BPD-MA, un fotosensibilizador de hidromonobenzoporfirina, ha mantenido su potencia en una composición crío-desecada durante un periodo de al menos nueve meses a temperatura ambiente, y se ha estimado una vida en almacenamiento de al menos dos años. Si la composición está liofilizada, puede empaquetarse en viales para su subsiguiente reconstitución, justo antes de usarse, con una solución acuosa apropiadas, tal como agua estéril o agua estéril conteniendo un sacárido y/o otros excipientes apropiados. Por ejemplo, la reconstitución puede efectuarse simplemente añadiendo agua para inyecciones justo antes de su administración.

En el estado de la técnica se conocen varias técnicas de liofilización. Por ejemplo, los viales conteniendo micelas de la invención pueden congelarse primero a -45ºC, y a continuación mantenerse ahí durante un período de hasta 90 minutos. Este paso puede seguirse por un ciclo de secado primario con vacío elevado, en donde la temperatura se incrementa lentamente hasta aproximadamente 10ºC durante un período usualmente del orden de 50 horas. Este paso puede seguirse por un ciclo de secado secundario a 20ºC de hasta aproximadamente 24 horas. Una vez la presión del liofilizador se estabiliza a aproximadamente 55-65 mTorr (73-87 microbares), el ciclo ha finalizado. A continuación, los viales pueden sellarse después de rellenarlos con gas nitrógeno. Una regla general para el liofilizado es que, para una rehidratación exitosa se prefiere una pastilla sólida, frágil, no colapsada, y homogénea.

Adicionalmente, el uso de la liofilización puede impedir la hidrólisis de los agentes hidrofóbicos susceptibles de tales reacciones. Por ejemplo, el fotosensibilizador BPD-MA puede hidrolizarse a BPD-DA.

Administración y uso

El uso de los agentes hidrofóbicos incorporados en las micelas de la invención puede ser para cualquier aplicación farmacéutica, agrícola o industrial apropiada. Con los fotosensibilizadores incorporados, las micelas pueden usarse para cualquier enfermedad o en cualquier procedimiento para el cual los fotosensibilizadores son apropiados en combinación con exposición a la luz u otra radiación electromagnética. Estos incluyen, pero no se limitan a, el diagnóstico o tratamiento del cáncer, la reducción de los niveles de leucocitos activados, el tratamiento de trastornos oculares, el tratamiento y la prevención de la neovasculatura y de la angiogénesis, la destrucción de virus y células infectadas por ellos, el tratamiento de las placas ateroescleróticas, el tratamiento de la reestenosis, y otros. Además, muchos fotosensibilizadores pueden fotoactivarse mediante longitudes de onda de excitación apropiadas para dar respuesta fluorescente de forma visible. Esta fluorescencia puede usarse para localizar un tumor u otro tejido diana. Mediante la incorporación de agentes hidrofóbicos en las micelas de la invención, puede obtenerse un empaquetado, suministro y, por tanto administración, más eficientes del los agentes.

En términos generales, las micelas de la invención pueden aplicarse de cualquier manera idéntica o análoga a la administración de micelas y liposomas. La concentración del agente hidrofóbico en las micelas de la invención depende de la naturaleza del agente, así como de la naturaleza de la administración deseada.

Las composiciones y formulaciones de micelas de la invención pueden administrarse parenteralmente o mediante inyección. La inyección puede ser intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal, intratumoral, o incluso intraperitoneal. Sin embargo, las micelas también pueden administrarse mediante aerosol de forma intranasal o intrapulmonar, o de forma tópica. Las formulaciones diseñadas para una liberación regulada se hallan también dentro del ámbito de la invención.

La cantidad de formulación de micela de agente hidrofóbico a administrarse depende de la elección de los agentes activos, las enfermedades a tratarse, el modo de administración, el sujeto individual, así como de la aptitud, experiencias y juicio del médico practicante. No obstante, en términos generales, pueden ser apropiadas las dosis en el rango de 0,05-10 mg/kg. El rango precedente es, por supuesto, meramente una sugerencia, puesto que el número de variables en relación a un régimen de tratamiento individual es elevado. Por tanto, se esperan diferencias considerables a partir de estos valores recomendados. La cantidad de formulación de micela de agente fotosensible a administrar in vivo puede determinarse fácilmente mediante estudios sencillos de calibración de la dosis, que son bien conocidos en el estado de la técnica.

Por ejemplo, y con el uso de los fotosensibilizadores como un diagnóstico en la localización de tejido tumoral o en la localización de placas ateroescleróticas, las composiciones de micelas de la invención se administran sistemáticamente de la misma forma general que se conoce en relación a la terapia fotodinámica. El período de espera para permitir que los fármacos se eliminen de los tejidos en los que no se acumulan es aproximadamente el mismo, por ejemplo, desde aproximadamente 30 minutos hasta 10 horas. Una vez que se ha permitido que las composiciones de la invención se han confinado a un sitio, la ubicación del tejido diana se determina detectando la presencia del fotosensibilizador.

El diagnosis, los fotosensibilizadores incorporados en micelas pueden usarse junto con, o pueden marcarse con, un radioisótopo u otros medios de detección. Si tal es el caso, los medios de detección dependen de la naturaleza de la marca. Las marcas centelleográficas tales como el tecnecio o indio pueden detectarse usando escáneres ex vivo. También pueden usarse marcas fluorescentes pero, al igual que la detección basada en la fluorescencia de los propios fotosensibilizadores, estas marcas requieren una irradiación previa.

Para la activación de los fotosensibilizadores aplicados mediante las micelas de la invención, puede usarse cualquier longitud de onda de absorción apropiada. Esta puede proporcionarse usando los diversos procedimientos conocidos en la técnica para mediar la citotoxicidad o emisión fluorescente, tales como la radiación visible, incluyendo las fuentes de luz incandescente o fluorescente, o los fotodiodos, tales como los diodos emisores de luz. La luz láser también puede usarse para el suministro in situ de luz a un fotosensibilizador confinado a un sitio. En un protocolo típico, por ejemplo, desde unos pocos minutos hasta varias horas antes de la irradiación, se inyectan por vía intravenosa aproximadamente 0,5-1,5 mg/kg de micelas que contienen fotosensibilizador de porfirina verde, y a continuación se excitan mediante luz de la longitud de onda apropiadas, es decir, luz que contiene una longitud de onda que es absorbida por el fotosensibilizador.

Preferiblemente, la radiación electromagnética, tal como luz desde el ultravioleta al visible e infrarrojo, se suministra después de la administración de las composiciones y formulaciones de la invención. Generalmente, ha tres variables significativas: la concentración del fármaco fotosensibilizador, la intensidad de la radiación empleada, y el tiempo de exposición a la luz, que determinan la cantidad total de energía que en última instancia se suministrará al tejido diana. Generalmente, un incremento en uno de estos factores permite una disminución en los
otros.

Por ejemplo, si se desea irradiar sólo durante un breve período de tiempo, la energía de la irradiación o la concentración del fármaco pueden incrementarse. De forma opuesta, si están permitidos períodos de tiempo de irradiación más largos, son deseables intensidades de irradiación más bajas y concentraciones de fármaco inferiores. En algunos casos, la combinación de 0,15 mg/kg de peso corporal de BPD-MA como una dosis de fármaco, y aproximadamente 1-25 J/cm^{2} de irradiación total desde una fuente de irradiación apropiada, proporcionan resultados exitosos cuando una dosis baja de PDT es suficiente para producir el efecto terapéutico deseado. La PDT a dosis bajas es útil para indicaciones tales como el tratamiento de enfermedades autoinmunes, y la prevención de la inflamación. El uso de la PDT a dosis bajas ofrece una ventaja adicional en forma de reducción de la probabilidad de efectos secundarios de la PDT, tales como la lesión de tejidos no previstos. Las dosis elevadas de PDT se usan generalmente para la destrucción de tejidos tales como las células tumorales, tal como se demuestra en el Ejemplo 4.

Se entiende que la manipulación de estos parámetros variará de acuerdo con la naturaleza del tejido que se está tratando y la naturaleza del fotosensibilizador (PS) empleado. No obstante, en general, la PDT de dosis bajas emplea combinaciones de la concentración de fármaco, intensidad de la radiación, y valores de energía total que son varias veces inferiores a los usados convencionalmente para destruir tejidos diana tales como tumores y la neovascularización no deseada. Una medida puede ser el producto de la concentración de PS (por ejemplo, en ng/ml) \times intensidad (por ejemplo, en mW/cm^{2}) \times tiempo (por ejemplo, en segundos). Sin embargo, es difícil establecer valores absolutos para este producto, puesto que existen restricciones sobre cada uno de los parámetros individualmente. Por ejemplo, si la intensidad es muy baja, el PS no se activará de forma consistente; si la intensidad de demasiado elevada, pueden ocurrir efectos hipertérmicos y otros efecto dañinos. Adicionalmente, en ciertos casos, la luz ambiental o medioambiente disponible, en la célula o tejido diana sometidos a la PDT, puede ser suficiente en ausencia de irradiación deliberada adicional.

De forma similar, las concentraciones de PS no pueden variar a lo largo de cualquier rango arbitrario. También puede haber restricciones sobre el tiempo durante el cual puede administrarse la irradiación. En consecuencia, el producto de la ecuación precedente es sólo una medida aproximada. No obstante, este enfoque puede proporcionar un índice apropiado que puede ajustarse de acuerdo con la potencia relativa del PS empleado, y, en general, un incremento en la intensidad permitirá una disminución del tiempo de irradiación, y así sucesivamente.

Habiendo ahora descrito de forma general la invención, la misma se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, los cuales se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitantes de la presente invención, a menos que se especifique.

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Ejemplo 1

Preparación de películas delgadas e hidratación

Para preparar una formulación de 2 mg/mL de fármaco activo, se disolvió conjugado de PEG_{2000}-DSPE (obtenido de Avanti Polar Lipids, 1-20 mg/mL) en 15 mL de diclorometano en un frasco de fondo redondo de 100 mL. La proporción molar de lípido respecto a fármaco varío desde 0,5:1 hasta 6:1. El PEG_{2000}-DSPE se disolvió muy rápidamente hasta una solución incolora, transparente, cuando se agitó a mano durante unos pocos minutos. A continuación se añadieron cinco mg de QLT 0069 o Verteporfina al frasco de fondo redondo, seguidos por 10-25 mL de diclorometano. Se agitó el frasco a mano durante al menos 5 minutos hasta que no había particulas sin disolver visibles a simple vista. Se generó una película delgada mediante evaporación del diclorometano usando un rotavapor.

Para generar la película delgada se usaron los siguientes parámetros:

Temperatura del baño de agua:

35ºC

Rotación del frasco:

35 rpm

Vacío inicial:

600 mbar

En general, el vacío se incrementó en incrementos de aproximadamente 25 mbar. Hacia los 300 mbar, la mayoría del diclorometano se había evaporado y se había formado la película delgada.

Una vez se formaron las películas delgadas, todos los frascos que contenían películas delgadas se mantuvieron con vacío elevado (10 mbar) durante 1 hora. Dependiendo del pKa del PS, las películas delgadas se hidrataron con varias soluciones acuosas tales como 2,5 mL de tampón fosfato 20 mM a pH 8,5 o 2,5 mL de lactosa al 9,2% (p/v) tal como se muestra en las Tablas 1, 2, 3 y 4. Los frascos se colocaron en un agitador orbital y, en promedio, se agitaron a 200 r.p.m. durante 40 minutos.

Alternativamente, la solución puede repartirse en alícuotas seguidas por su liofilización. Antes de la hidratación, el material sólido puede calentarse hasta temperatura ambiente mientras se protege de la luz.

Las micelas hidratadas pueden esterilizarse haciéndolas pasar a través de un filtro de 0,22 \mum o menor.

Los resultados de las muestras se muestran en las Tablas 1, 2, 3, y 4. El cociente A_{692}/A_{720} se usó para determinar la cantidad relativa de QLT 0069 en forma de monómero (A_{692}) respecto el dímero agregado (A_{720}) (Tablas 1 y 2). La tendencia de los BPD de anillo B a autoasociarse en dímeros se describe en D. Delmarre et al, Can J. Chem., 79:1069-1074 (2001).

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Muestras seleccionadas procedentes de la Tabla 2 se ensayaron por su estabilidad a partir del almacenamiento a temperatura ambiente durante 24 ó 48 horas, o a 4ºC durante 24 ó 48 horas, o durante 1 ó 4 semanas. Las muestras se consideraron estables por la ausencia de sedimento o precipitado retenido por la filtración de 0,22 \mum.

Opcionalmente, la lactosa, u otro azúcar, puede incluirse en la solución hidratante o en la combinación de moléculas anfipática y agentes(s) activos(s) para reducir el tiempo de hidratación.

La Tabla 3 muestra los resultados antes y después de la filtración con micelas que contenían Verteporfina, después de su hidratación en tampón fosfato 20 mM a pH 8,5 (en donde "5DW" se refiere a dextrosa al 5% en agua). Las micelas se solubilizaron completamente, tal como se demostró por su filtrabilidad a través de los filtros de 0,22 \mum.

La Tabla 4 muestra los resultados antes y después de la filtración, con micelas que contenían Verteporfina, despues de la hidratación en una solución que contenía lactosa al 9,2%.

Debe notarse que, generalmente, para el QLT 0069 y otras BDP de anillo B, se necesita una proporción aproximadamente 6:1 (molar) de lípido:fotosensibilizador para obtener una concentración de aproximadamente 2 mg/mL del fotosensibilizador, mientras que sólo se necesita aproximadamente 2:1 para BPD de anillo A tales como la Verteporfina.

Estos resultados muestran que ambos, los derivados de la benzoporfirina de anillo A y anillo B, pueden atraparse fácilmente en micelas de PEG_{2000}-DSPE a concentraciones de fármaco tan elevadas como 1-2 mg/ml. La eficiencia de incorporación del derivado de benzoporfirina de anillo B, QLT 0069, dependió tanto de la proporción molar lípido:fármaco como del pH del medio de hidratación usado en la preparación. Debe notarse que las micelas de BPD de anillo B permanecieron solubles (según se determinó mediante su filtrabilidad a través de un filtro de 0,22 micrómetros) después de ser rehidratadas en medio acuoso a lo largo de un rango de pH de 5,5 a 8,5. Sin embargo, había una tendencia del fármaco a autoagregarse si el pH del medio de rehidratación no se mantenía por encima del pKa del grupo carboxilo en la molécula.

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Ejemplo 2

Concentración micelar crítica (CMC) de la micelas de PEG-fosfolípido con y sin QLT 0069

El incremento de la concentración de tensioactivo en la solución acuosa causa una disminución de la tensión superficial de la solución hasta una cierta concentración, a partir de la cual pasa a ser esencialmente constante con la concentración creciente. El cambio ocurre a la CMC. La explicación más razonable de estos efectos es que la molécula del tensioactivo se autoasocia para formar agregados solubles conocidos como micelas. Durante el proceso de formación de la micela, los grupos hidrofóbicos forma el núcleo de la micelar y se apantallan del agua para conseguir un estado de mínima energía. Las micelas están en equilibrio dinámico con las moléculas libres (monómeros) en solución; es decir, las micelas están continuamente rompiéndose y formándose de nuevo. Varias propiedades físicas cambian con una concentración creciente de tensioactivo por encima de la CMC, por ejemplo, la tensión superficial, la intensidad de dispersión de la luz, la presión osmótica, la conductividad equivalente, la solubilidad de un soluto insoluble en agua. Todas estas propiedades pueden usarse para determinar la CMC de un tensioactivo. En la presente invención, hemos usado la dispersión de la luz para determinar la CMC de P2K-DSPE (PEG_{2000}-DSPE) tanto en agua destilada como en tampón fosfato.

La P2K-DSPE se disolvió inicialmente en agua destilada a concentraciones entre 4-80 \muM. La absorción a 211 nm se leyó usando un espectrómetro de visible-UV (Ultrospec® 3000, Pharmacia Biotech), y se representó como una función de la concentración de P2K-DSPE. La concentración a la cual cambia la pendiente está relacionada con la CMC. Los resultados muestran que la absorción de la P2K-DSPE incrementó a una concentración de 24-32 \muM (Figura 2). Estos datos son muy próximos a la CMC descrita (20 \muM) de los estudios previos en nuestro laboratorio. La Figura 2 también muestra el incremento abrupto en la absorción de las micelas de P2K-DSPE que contienen QLT0069. Por tanto, la incorporación del QLT0069 en P2K-DSPE no parece tener un efecto apreciable sobre la
CMC.

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Ejemplo 3

Efecto de variar la longitud de cadena y saturación del diacilo; y el peso molecular del PEG

Se llevaron a cabo estudios para evaluar la incorporación de QLT0069, una BPD de anillo B, en micelas compuestas por diferentes conjugados de PEG-lípido. Estos incluían:

\bullet Poli(etilenglicol)2000-dioleoilfosfatidiletanolamina (P2K-DOPE) (18:1) (Cat.880130) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)2000-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (P2K-DPPE) (16:0) (Cat. 880160) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)5000-dimiristoilfosfatidiletanolamina (P5K-DMPE) (14:0) (Cat. 880210) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)5000-dioleoilfosfatidiletanolamina (P5K-DOPE) (18:1) (Cat.880230) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)5000-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (P5K-DPPE) (16:0) (Cat. 880200) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)5000-diestearoilfosfatidiletanolamina (P5K-DSPE) (18:0) (Cat. 880220) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)750-diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG750-DSPE) (18:0) (Cat. 880620) obtenida de Avanti Polar Lipids, Inc.

\bullet Poli(etilenglicol)1750-ácido estérico (PEG1750-Ácido Estérico).

Las micelas se prepararon siguiendo el procedimiento esbozado en el Ejemplo 1, excepto que en algunas de las muestras, otros varios conjugados PEG-lípido sustituyeron la P2K-DSPE. Las concentraciones de fármaco variaron desde 0,02 hasta 0,2 mg/ml. Todas las muestras de película delgadas se hidrataron en una solución acuosa a pH y osmolaridad fisiológicos usando MOPS 20 mM, dextrosa USP al 5%, pH 7,0. La eficacia de las diversas formulaciones micelares para prevenir la autoagregación del PS BPD-MB (medida como A_{692}/A_{720}) se muestra en la Tabla 5. La presencia de formas diméricas (A_{720}) o monoméricas (A_{692}) de la BPD-MB en micelas se relacionó con la longitud de cadena y el grado de saturación de la cadena del ácido graso. Por ejemplo, a una proporción molar lípido:fármaco de 5:1, el fármaco incorporado en micelas de P5K-DSPE o P5K-DPPE estaba presente como monómero, mientras que había dímeros de fármaco presentes en las micelas formadas a partir de P5K-DMPE o P5K-DOPE. El fármaco formulado en micelas de PEG1750-ácido estérico se hidrataba muy rápidamente, aunque el fármaco estaba presente principalmente como dímero.

Cuando se cargó QLT0069 en micelas de PEG-lípido, la formulación más homogénea que contenía monómero se obtuvo cuando para el núcleo hidrofóbico de la micela se usaban cadenas acílicas largas, saturadas. PEG-DSPE, con pesos moleculares de PEG de 2000 ó 5000, formó micelas con igual eficiencia. Puesto que la P2K-DSPE ya ha sido aprobada como un excipiente en formulaciones liposomales (Doxil®, Alza Corporation), es una buena candidata para micelas destinadas a un uso clínico.

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Ejemplo 4

Uso in vivo de las micelas

La capacidad de PDT con formulaciones de fotosensibilizador en PEG_{2000}-DSPE para controlar el crecimiento tumoral se ensayó en ratones DBA 2 usando un modelo tumoral de M1. Se implantaron ratones machos con 2 \times 10^{4} células tumorales M1 en un volumen de 50 \mul, y se mantuvieron hasta que el tumor había crecido hasta 4-6 mm en diámetro. A los ratones DBA se les administró, o una única dosis intravenosa de 1,4 \mumol/kg, o una única inyección intratumoral de 0,09 mg de PS (ingrediente activo). Después período de espera que oscilada de 15 a 60 minutos, se administraron 50 J/cm^{2} de luz a 690 nm al sitio del tumor, a una velocidad de fluencia de 90 mW/cm^{2}. Los resultados se muestran en la Tabla 6. QLT0069-PEG 2000-DSPE fue tan efectivo en el control del tumor como la BDP de anillo A, QLT0074, formulada liposomalmente cuando se administró intratumoralmente. Verteporfina-PEG_{2000}-DSPE era altamente efectiva en el control del tumor cuando se administraba intravenosamente.

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Ejemplo 5

Realizaciones particularmente preferidas

Una realización particularmente preferida de la invención es una composición que contiene micelas, que comprende uno o más fotosensibilizadores, y uno o más de un fosfolípido que contiene PEG, los cuales forman micelas. Tales composiciones preferiblemente comprenden un fotosensibilizador de porfirina verde, el cual es preferiblemente el QLT0069. Las composiciones particularmente preferidas también pueden comprender PEG-2000, al menos diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) es dicho uno o más de un fosfolípidos, o PEG_{2000}-DSPE como dicho uno o más de un fosfolípidos.

Las composiciones particularmente preferidas comprenden una proporción molar de lípido:fotosensibilizador de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10. Más preferiblemente, la composición comprende QLT 0069 y PEG_{2000}-DSPE, en donde la proporción molar de lípido:fotosensibilizador oscila entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10. También se prefiere una composición que comprende Verteporfin y PEG_{2000}-DSPE, en donde la proporción molar de lípido:fotosensibilizador oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6. En cualquier composición particularmente preferida, la concentración de fotosensibilizador es aproximadamente 1-2 mg/ml y/o está liofilizada.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante sólo es para provecho del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.

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Claims (13)

1. Composición que contiene micelas que comprende a) uno o más fotosensibilizadores, y b) uno o más fosfolípidos que contienen PEG, los cuales forman micelas.

2. La composición de la reivindicación 1, en la cual dicho fotosensibilizador es una porfirina verde.

3. La composición de la reivindicación 2, en la cual la porfirina verde es la Verteporfina.

4. La composición de la reivindicación 2, en la cual la porfirina verde es la QLT 0069.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, la cual comprende PEG_{2000}-.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que además comprende un fosfolípido que es la diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE).

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la cual un fosfolípido que contiene PEG es la PEG_{2000}-DSPE.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la cual la proporción molar de lípido:fotosensibi-
lizador está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10.

9. Composición que contiene micelas que comprende un fotosensibilizador de porfirina verde, y uno o más fosfolípidos que contienen PEG que forman micelas.

10. Composición que contiene micelas que comprende un fotosensibilizador QLT 0069 y PEG_{2000}-DSPE, en donde la proporción molar de lípido:fotosensibilizador oscila entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10.

11. Composición que contiene micelas que comprende un fotosensibilizador Veteporfina y PEG_{2000}-DSPE, en donde la proporción molar de lípido:fotosensibilizador oscila entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6.

12. La composición de la reivindicación 10 ó reivindicación 11 en la cual la concentración de fotosensibilizador es aproximadamente 2 mg/ml.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en una forma liofilizada.