KR101554564B1

KR101554564B1 - 암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101554564B1
Application number: KR1020130143045A
Authority: KR
Inventors: 최철희; 정규하; 박지호
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2015-09-21
Also published as: KR20150059444A; US20150148428A1; US9393308B2

Abstract

본 발명은 암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암 질환의 진단 또는 치료에 사용 가능한 광감작제를 중합지질인 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성하여 캡슐화함으로써 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광감작제인 하이퍼리신을 중합지질인 분자량 1500 내지 2500의 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성하여 캡슐화함으로써 12 nm 이하의 크기를 가져 혈액-종양 장벽(blood-tumor barrier, BTB)과 조직 내 관류압(interstitial fluid pressure)을 극복하기 용이할 뿐만 아니라, 하이퍼리신 단독으로 사용하였을 경우와 대비하여 약 2.5 배 이상의 광-세포독성 효율을 나타낸다. 또한, 암세포 내 기관 중 미토콘드리아에 대한 상대적 공존 계수가 높으므로 암 질환 특히, 뇌종양에 대한 광역동 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법{Micelle structure of nano preparation for diagnosis or treatment of cancer disease and preparation method thereof}

본 발명은 암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암 질환의 진단 또는 치료에 사용 가능한 광감작제를 중합지질인 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성하여 캡슐화함으로써 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

광역동 치료(photodynamic therapy)는 최근 촉망받는 암 치료방법 중의 하나이다. 광역동 치료는 빛에 예민한 반응을 보이는 물질인 광감작제(photosensitizer)를 체내에 투여하면, 외부에서 특정파장의 빛을 조사하였을 경우 체내의 풍부한 산소와 외부 빛에 의한 화학반응으로 단일항 산소 또는 유리 라디칼(free radical)이 생성되고, 이런 단일항 산소 또는 자유 라디칼이 각종 병변 부위나 암세포의 세포사멸을 유도하여 파괴하는 원리를 이용한 치료법이다.

광역동 치료는 정상 세포를 보존하면서 암 세포만 선택적으로 제거할 수 있는 장점이 있으며, 다른 암 치료방법에서 요구되는 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있고, 간단한 국소 마치만으로 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다. 이러한 장점으로 인해 광역동 치료는 1980년대부터 본격적으로 연구되어 왔으며, 1990년대에 들어와서는 캐나다, 독일, 일본 등에서 임상시술이 승인된 이래 미국의 FDA가 1996년 1월에 식도암 치료 허가, 1997년 9월에는 초기 폐암 치료에 대해 승인을 하는 등 전 세계적으로 광범위하게 사용되고 있다.

광역동 치료에서 이용되는 동일 광감작제는 광역동 진단(photodynamic diagnosis)에도 활발히 이용될 수 있다는 점에서 암의 진단 및 치료제로서의 유용성을 가지고 있다. 광역동 진단은 암을 진단하는 데에 있어 컴퓨터 단층촬영 (computed tomography, CT)나 자기공명영상(magnetic resonance imaging) 등의 고가의 장비의 필요 없이, 광학을 이용한 비교적 간단한 장비를 이용하여 암 진단이 용이하게 가능하다는 장점 이외에도, 수술 중 암의 위치나 정도를 파악하는 데에 있어 시간적 소요를 줄임은 물론 실시간 진단을 별도의 촬영 시간을 요하지 않고 직접적인 시각적 정보를 제공하며 시행할 수 있다는 장점을 갖기에 암의 성공적인 수술적 제거를 돕는 유용한 도구로서 각광을 받고 있다. W. Stummer 등이 2006년 임상 자료를 통해 광감작제의 형광을 이용한 수술적 제거의 유용성을 보고한 바와 같이(비특허문헌 1), 실제 유럽을 기점으로 하여 미주에 이르기까지 2000년 대에 이르러서부터 암 진단 및 수술적 치료에 있어 활발한 임상적 적용이 이루어지고 있다.

한편, 뇌종양의 52%에 해당하는 교모세포종은 뇌종양 전체 중 가장 악성인 종양이다. 교모세포종의 5년 생존율은 5% 이하로, 공격적이고 적극적인 치료를 받았다 하더라도 평균 생존기간이 14-16 개월밖에 되지않는 치명적인 질환이다. 이러한 교모세포종에 대한 최신 표준 치료는 수술적 제거 후에 동시적 항암-방사선 치료를 시행하는 것으로서, 2005년에 발표된 R. Stupp 연구진의 테모졸로마이드(temozolomide)를 이용한 동시적 항암-방사선 치료가 평균 생존기간을 20.7% 연장시킨다는 연구 결과를 토대로 한 표준 치료방법이다(비특허문헌 2). 그러나, 상기 치료방법은 실질적으로 평균 생존기간을 12.1 내지 14.6 개월밖에 연장시킬 수 없다는 문제가 있어, 현재 다양한 치료방법들이 개발 중에 있으며, 실험적ㆍ임상적 시도들이 잇따르고 있다.

뇌종양을 치료하기 위한 다양한 치료방법에 있어서, 약물전달 체계는 뇌에 존재하는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)와 혈액-종양 장벽(blood-tumor barrier, BTB)으로 인한 저농도의 약물투과; 뇌종양 자체 부피 및 성질에 따른 조직 내 압력 증가로 인한 약물전달 능력 감소 등으로 인해 그 효과가 크지 않다는 문제가 있었다. 그러나, 혈중 반감기의 연장, 비표적 기관에 대한 독성 감소, 다양한 표면 변형이 가능함에 따른 표적 기관 또는 약물 물성 변형의 유의성 등을 장점으로 가진 나노입자를 이용한 약물전달 체계의 등장은 약물전달 체계 면에서 획기적인 전환을 가져다 주고 있다.

상기 나노입자를 이용한 약물전달 체계는 나노 약물 자체의 크기, 물성, 나노 약물과 뇌종양 조직 또는 세포와의 상호관계 등의 변수에 의해 그 효과가 결정되는 것으로 알려진 가운데, 최근 미국 국립 보건원의 H. Sarin 연구진과 하버드의 R. Jain 연구진은 뇌종양에 사용되는 나노 약물이 혈액-종양 장벽(blood-tumor barrier, BTB)과 조직 내 관류압(interstitial fluid pressure)을 극복하기 위해서는 12 nm 이하의 크기인 것이 적합하다는 연구결과를 발표한 바 있다(비특허문헌 3 및 4). 이러한 연구결과를 고려하여 볼 때, 현재까지 개발된 뇌종양 치료에 사용되는 나노 약물들은 20 nm 이상이라는 점에서 나노 약물의 크기조절 관련 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 뇌종양에 사용가능한 광역동 진단 또는 치료용 나노 약물을 연구하던 중, 광감작제인 하이퍼리신과 중합지질인 분자량 1500 내지 2500의 DSPE-mPEG를 사용하여 제조되는 나노 제제가 12 nm 이하의 크기를 가질 뿐만 아니라, 하이퍼리신 단독으로 사용하였을 경우와 대비하여 약 2.5배 이상의 광-세포독성 효율을 나타내고, 암세포 내 기관 중 미토콘드리아에 대한 상대적 공존 계수가 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

W. Stummer, M.D., et al., The lancet oncology., 2006, 7(5), 392-401; Roger Stupp, M.D., et al., N. Engl. J. Med., 2005, 352, 987-996; H. Sarin, et al., J. Translational Med., 2008, 6 (1), 80; Rakesh K. Jain, et al., Nature Nanotechnology, 2012, 7 (6): 383-388.

본 발명의 목적은 암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이셀 구조의 나노 제제의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 광감작제 1.0 몰 비율; 및

중합지질인 DSPE-mPEG 5.0 - 15.0 몰 비율;을 포함하는 암 질환의 진단 또는 치료용 마이셀 구조의 나노 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 유기용매에 용해된 광감작제와 중합지질인 DSPE-mPEG를 1.0 : 5.0 - 15.0의 몰 비율로 혼합시켜 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 혼합용액으로부터 유기용매를 제거 및 건조시켜 중합지질 막을 제조하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 제조된 중합지질 막을 상온 내지 100℃ 온도의 물, PBS, HBS 및 HBG로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 용액에서 수화시켜 마이셀 구조의 나노입자를 형성하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 형성된 마이셀 구조의 나노입자를 여과하여 균질화하는 단계(단계 4);를 포함하는 상기 마이셀 구조의 나노 제제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광감작제인 하이퍼리신을 중합지질인 분자량 1500 내지 2500의 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성하여 캡슐화함으로써 12 nm 이하의 크기를 가져 혈액-종양 장벽(blood-tumor barrier, BTB)과 조직 내 관류압(interstitial fluid pressure)을 극복하기 용이할 뿐만 아니라, 하이퍼리신 단독으로 사용하였을 경우와 대비하여 약 2.5 배 이상의 광-세포독성 효율을 나타낸다. 또한, 암세포 내 기관 중 미토콘드리아에 대한 상대적 공존 계수가 높으므로 암 질환 특히, 뇌종양에 대한 광역동 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조방법을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 나노 제제의 최적 조건에 대한 동적 광산란 측정 결과를 도시한 그래프이다(여기서, A는 DSPE-mPEG의 분자량에 따른 나노 제제 크기 변화를 도시한 그래프이고; B는 광감작제인 하이퍼리신과 DSPE-mPEG의 혼합 몰 비율에 따른 나노 제제의 크기, 약물부하, 결합효율 및 제조 비용효율을 도시한 그래프이다).
도 3은 실시예 1-3 및 비교예 1에서 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제에 대한 동적 광산란 측정 결과를 도시한 그래프이다(여기서, A는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 나노 제제 크기 변화를 도시한 그래프이고; B는 실시예 2에 따른 나노 제제 크기 변화를 도시한 그래프이고; C는 실시예 3에 따른 나노 제제 크기 변화를 도시한 그래프이고; D는 실시예 1 내지 3의 나노 제제 크기를 통계적으로 도시한 그래프이다).
도 4는 실시예 1에서 제조된 나노 제제에 대한 투과전자현미경 촬영한 이미지 및 이로부터 도출된 나노 제제의 크기를 도시한 그래프이다(여기서, A는 나노 제제를 소듐 포스포텅스테이트로 염색하여 촬영한 이미지를 도시한 것이고; B는 염색하지 않은 나노 제제를 촬영한 이미지를 도시한 것이다).
도 5는 염색하지 않은 나노 제제를 투과전자현미경 촬영한 도 4B로부터 도출한 나노 제제의 크기를 도시한 그래프이다.
도 6은 인간 악성뇌교종 세포인 U251MG에 대한 실시예 1, 비교예 2 및 3에서 제조된 나노 제제의 세포 독성을 도시한 그래프이다(여기서, A는 광 조사가 이루어지지 않는 경우의 세포 독성을 도시한 그래프이고; B는 광 조사가 이루어진 경우의 암세포에 대한 광-세포독성 효율을 도시한 그래프이다).
도 7은 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 나노 제제를 처리한 암세포의 미토콘드리아를 다중광자 레이져 스캐닝 현미경 이미징 시스템으로 촬영한 이미지이다.
도 8은 다중광자 레이져 스캐닝 현미경 이미징 시스템을 이용하여 촬영된 이미지로부터 도출한 상대적 공존 계수를 도시한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 광감작제 1.0 몰 비율; 및

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제에 있어서, 상기 중합지질인 DSPE-mPEG는 나노 제제의 전체 몰 비율에 있어서 5.0 - 15.0의 비율을 갖는 것이 바람직하다.

상기 DSPE-mPEG의 몰 비율이 5.0 미만인 경우, 나노 제제의 편입효율이 현저히 감소하고, 제조비용이 상승하며, 결론적으로 약물에 대한 캡슐화율이 떨어지는 문제가 있다. 상기 몰 비율이 15.0을 초과하는 경우에는 편입효율의 감소, 약물부하의 현격한 감소, 나노약물 크기의 상승, 제조비용의 현격한 증가 등의 문제로 나노 제제에 포함되는 광감작제가 유효량에 미치지 못하고 효율이 떨어져, 약물의 제조 효율 측면과 아울러 암 질환에 대한 진단 또는 치료를 목적으로 사용하는 데에 있어 효과적이지 않다는 문제가 있다(도 3B 참조).

이때, 본 발명에 따른 상기 광감작제는 하기 화학식 1로 표시되는 하이퍼리신인 것이 바람직하다.

상기 하이퍼리신은 하이페리컴(Hypericum) 속의 식물에서 유래된 천연 색소로서, 에탄올에 용해된 경우, 548 nm 및 591 nm의 두 파장에서 최대 흡광치를 가지고, 594 nm 및 642 nm의 두 파장에서 최대 형광 방출을 보이는 광감각 효과를 갖는다. 또한, 단백질 키나아제 C의 강력한 선택 저해제로 사용 가능하고, 항세균 활성 또는 항바이러스 활성에서부터 항-신생물성 활성(antineoplastic activity) 및 세포자살 유도에 이르는 다양한 약리학적 특징을 가지고 있다. 항-신생물성 활성 및 세포자살 유도와 같은 이러한 효과는 일정 농도 이하의 하이퍼리신만으로는 어떤 종류의 단백질도 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있으며, 빛이 조사되어야만 상기와 같은 단백질 손상 작용이 유발되므로, 다양한 암 질환의 진단 또는 치료에 사용되고 있다(실험예 3 및 4 참조).

본 발명에 따른 중합지질인 상기 DSPE-mPEG는 1500 내지 2500의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 DSPE-mPEG의 분자량이 1500 내지 2500의 범위를 벗어나는 경우, 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제의 크기가 현저히 증가 또는 편입효율과 약물부하와 같은 약물제조효율의 현격한 감소 등으로 인하여, 암 질환, 특히 뇌종양의 진단 또는 치료에 활용하는 데에 있어 어려운 문제가 있다.

본 발명에 따른 상기 나노 제제는 5.0 내지 12.0 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 크기를 평가하기 위하여 동적 광산란 측정 및 투과전자현미경 촬영한 결과, 본 발명에 따른 나노 제제의 크기는 약 5 내지 20 nm에 분포하며, 특히, 그 크기는 9 내지 12 nm 범위에 가장 많이 분포하는 것을 알 수 있다(실험예 1 및 도 3 참조).

또한, 투과전자현미경 촬영 결과로부터, 상기 나노 제제의 크기는 나노 제제를 소듐 포스포텅스테이트로 염색한 경우, 11.1±3.5 nm로 균일한 것을 알 수 있고, 나노 제제를 염색하지 않은 경우, 그 크기는 5.4±1.5 nm로 균일하다(실험예 2, 도 4 및 5 참조).

이로부터, 본 발명에 따른 나노 제제의 크기는 5.4±1.5 nm 내지 11.1±3.5 nm 즉, 5.0 내지 12.0 nm인 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 나노 제제는 세포 내 기관 중 미토콘드리아에 축적된다.

본 발명에 따른 나노 제제의 세포 내 기관간 상대적 공존 계수를 측정하였다. 그 결과, 항암물질인 하이퍼리신을 단독으로 사용하거나, PEG로 캡슐화된 경우와 대비하여 약물이 미토콘드리아에 존재하는 상대적 공존 계수가 1.14 내지 1.17배 높은 것으로 확인되었다(실험예 4 참조).

미토콘드리아는 세포 내에 존재하면서, 섭취된 음식물을 통해 에너지원인 ATP를 합성하는 역할을 하고, 호흡을 관장하는 중심적 구실을 수행한다. 또한, 기능이 상실된 세포를 죽이는 역할을 수행하기도 하는데, 이를 "세포자살" 또는 "아포토시스"라 한다.

상기 "아포토시스"는 세포가 축소되면서 시작된다. 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는 DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화되는 방법으로 세포가 사망한다. 마지막에 세포 전체도 단편화하여 "아포토시스 소체"가 된 후, 가까이 있는 세포에게 먹혀버림으로써 죽음에 이르게 된다. "아포토시스"는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다. 이러한 "아포토시스" 현상은 미토콘드리아의 지령에 의해 일어난다.

따라서, 본 발명에 따른 나노 제제는 세포 내 기관 중에서 미토콘드리아에 높은 비율로 축적됨으로써 암세포의 아포토시스 즉, 세포사멸을 유도하는 효과가 우수하다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 상기 암 질환으로는 예를 들면, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등을 들 수 있다.

이때, 상기 뇌종양로는 예를 들면, 뇌하수체종양, 뇌수막종, 수아세포종, 신경초종, 신경교종, 악성성상세포종, 전이성 뇌종양, 교모세포종 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 유기용매에 용해된 중합지질인 DSPE-mPEG와 광감작제를 1.0 : 5.0 - 15.0의 몰 비율로 혼합시켜 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1);

이하, 상기 마이셀 구조의 나노 제제의 제조방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 단계 1은 상온, 암실 조건 하에서 유기용매에 용해된 광감작제와 중합지질인 DSPE-mPEG를 1.0 : 5.0 - 15.0의 몰 비율로 혼합시켜 혼합용액을 제조하는 단계이다.

이때, 본 발명에 따른 상기 단계 1의 유기용매로는 예를 들면, 클로로포름, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 자일렌, 헥산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 단계 1의 중합지질인 DSPE-mPEG는 1500 내지 2500의 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 상기 DSPE-mPEG의 분자량이 1500 내지 2500의 범위를 벗어나는 경우, 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제의 크기가 현저히 증가하여, 암 질환, 특히 뇌종양의 진단 또는 치료가 어려운 문제가 있다.

나아가, 본 발명에 따른 상기 광감작제는 하기 화학식 1로 표시되는 하이퍼리신인 것이 바람직하다.

[화학식 1]

상기 하이퍼리신은 하이페리컴(Hypericum) 속의 식물에서 유래된 천연 색소로서, 에탄올에 용해된 경우, 548 nm 및 591 nm의 파장에서 최대 흡광치를 가지고, 594 nm 및 642 nm의 파장에서 에서 최대 형광 방출을 보이는 광감각 효과를 갖는다. 또한, 단백질 키나아제 C의 강력한 선택 저해제로 사용 가능하고, 항세균 활성 또는 항바이러스 활성에서부터 항-신생물성 활성(antineoplastic activity) 및 세포자살 유도에 이르는 다양한 약리학적 특징을 가지고 있다. 항-신생물성 활성 및 세포자살 유도와 같은 이러한 효과는 하이퍼리신만으로는 어떤 종류의 단백질도 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있으며, 빛이 조사되어야만 상기와 같은 단백질 손상 작용이 유발되므로, 다양한 암 질환의 진단 또는 치료에 사용되고 있다(실험예 3 및 4 참조).

다음으로, 본 발명에 따른 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 혼합용액으로부터 유기용매를 제거 및 건조시켜 중합지질 막을 제조하는 단계로서, 보다 구체적으로 상온-암실 조건 하에서 완전히 건조시켜 광감작제와 중합지질인 DSPE-mPEG가 혼합된 형태의 막을 제조하는 단계이다.

이때, 상기 막은 당업계에서 통상적으로 사용되고 있는 막 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 중합지질 막을 상온 내지 100℃ 온도의 물, PBS, HBS 및 HBG로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 용액에서 수화시켜 마이셀 구조의 나노입자를 형성하는 단계이다.

이때, 본 발명에 따른 상기 단계 3의 용액은 상기 단계 2에서 제조된 중합지질 막이 수화될 수 있는 PBS(phosphate buffered saline), HBS(HEPES buffered saline) 및 HBG(HEPES buffered glucose)로 이루어지는 군으로부터 1종 이상의 용액을 단독 또는 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 3의 수화는 물에서 수화한 후, PBS, HBS 및 HBG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액에서 숙성하거나, PBS, HBS 및 HBG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액에서 직접 수화할 수 있다. 이때, 상기 수화 또는 숙성의 시간의 시간은 특별한 제한은 없으나, 1시간 내지 밤샘(overnignt)이 바람직하다.

나아가, 본 발명에 따른 상기 단계 3의 수화는 초음파 파쇄기(sonicatior)에 의해서 수행되며, 수화가 수행됨과 동시에 음파 파쇄가 수행될 수 있다. 상기 음파 파쇄는 수화에 의해 생성되는 마이셀의 크기를 보다 균일하게 감소시키는 역할을 한다.

다음으로, 본 발명에 따른 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 형성된 마이셀 구조의 나노입자를 여과하여 균질화하는 단계이다.

이때, 본 발명에 따른 상기 단계 4의 여과는 단계 3에서 형성된 마이셀 구조의 나노입자를 0.05 내지 0.20 μm의 필터로 여과하는 단계(단계 A); 및

상기 단계 A에서 여과된 나노입자를 20 내지 40 K의 원심분리 필터로 재여과하는 단계(단계 B);를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<마이셀 구조의 나노 제제의 제조 조건의 설정>

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제를 제조할 수 있는 최적의 조건을 알아보기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

1. 중합지질의 최적 분자량

광감작제인 하이퍼리신을 캡슐화시키는 중합지질 DSPE-mPEG의 분자량에 따른 나노 제제의 크기 변화를 알아보기 위하여, DSPE-mPEG의 분자량을 각각 350, 2000, 5000인 것을 사용하여 광감각제인 하이퍼리신 및 중합지질인 DSPE-mPEG의 몰 비율이 1 : 10이 되도록 상온에서 혼합하였다. 그 후, 상온-차광상태에서 완전히 건조시켜 중합지질 필름을 형성하고, 형성된 필름을 75℃의 물(1 mL)과 함께 초음파파쇄 기구(sonication equipment)에 투입하고, 5분 동안 초음파 수조에서 수화시켰다. 상기 수화된 용액을 상온으로 냉각시키고, 0.1 μm 크기의 필터로 여과한 다음, 여과액을 원심분리기(3000 MWCO 원심분리기, Millipore, Billerica, MA, USA)의 30 k 원심분리 필터로 추가 필터하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다. 다음으로, 상기 제조된 나노 제제를 물에서 숙성(aging)을 실시 후 25℃에서 평가하였다. 그 후, 상기 나노 제제의 유체역학 크기, 다분산성(PI) 및 제타 포텐셜을 제타사이져 나노 ZS90(zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument Ltds., Worcestershire, UK)로 동적 광산란 측정을 수행하여, 그 결과를 도 2의 A에 나타내었다.

도 2의 A에 나타난 바와 같이, 중합지질 DSPE-mPEG의 분자량이 각각 350, 5000인 경우에는, 측정된 직경이 각각 약 54 내지 63 nm, 및 약 61 내지 66 nm인 것으로 확인된 반면, DSPE-mPEG의 분자량이 2000인 경우에는 직경이 약 48 내지 50 nm로 나노 제제의 크기가 약 11.1 내지 24.2% 감소된 것을 알 수 있다.

따라서, 마이셀 구조의 나노 제제를 제조할 수 있는 중합지질 DSPE-mPEG의 최적 분자량은 1500 내지 2500인 것을 알아내었다.

2. 광감각제 및 중합지질의 최적 몰비율

광감각제인 하이퍼리신 및 중합지질인 DSPE-mPEG의 몰 비율에 따른 나노 제제의 크기 변화를 알아보기 위하여, 하이퍼리신 및 분자량이 2000인 DSPE-mPEG을 각각 1 : 1, 1 : 4, 1 : 10 및 1 : 20의 몰 비율이 되도록 상온에서 혼합하였다. 그 후, 상온-차광상태에서 완전히 건조시켜 중합지질 필름을 형성하고, 형성된 필름을 75℃의 물(1 mL)과 함께 초음파파쇄 기구(sonication equipment)에 투입하고, 5분 동안 초음파 수조에서 수화시켰다. 상기 수화된 용액을 상온으로 냉각시키고, 0.1 μm 크기의 필터로 여과한 다음, 여과액을 원심분리기(3000 MWCO 원심분리기, Millipore, Billerica, MA, USA)의 30 k 원심분리 필터로 추가 필터하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다. 다음으로, 상기 제조된 나노 제제를 물에서 숙성(aging)을 실시 후 25℃에서 평가하였다. 그 후, 상기 나노 제제의 유체역학 크기, 다분산성(PI) 및 제타 포텐셜을 제타사이져 나노 ZS90(zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument Ltds., Worcestershire, UK)로 동적 광산란 측정을 수행하여, 그 결과를 도 2의 B에 나타내었다.

도 2의 B에 나타난 바와 같이, 광감작제인 하이퍼리신과 중합지질 DSPE-mPEG의 혼합 비율에 따른 나노 제제의 성분간 결합력 등의 물성을 살펴보면, 하이퍼리신 1몰에 대하여 DSPE-mPEG의 몰 비율이 1 또는 4인 경우, 광감작제인 하이퍼리신과 DSPE-mPEG의 결합 효율이 감소할 뿐만 아니라, 유효성분으로 사용되는 하이퍼리신의 용량 증가로 인하여 제조비용이 상승되는 것을 알 수 있다. 또한, 하이퍼리신 1몰에 대하여 DSPE-mPEG의 몰 비율이 20인 경우, 편입효율의 감소, 약물부하의 현격한 감소, 나노약물 크기의 상승, 제조비용의 현격한 증가 등의 문제로 나노 제제에 포함되는 광감작제가 유효량에 미치지 못하고 효율이 떨어지는 것을 알 수 있다.

반면, 하이퍼리신 1 몰에 대하여 DSPE-mPEG의 몰 비율이 10인 경우, 하이퍼리신과의 결합 효율이 약 89.9%로 상당히 높을 뿐만 아니라, 제조비용이 현저히 감소되는 것을 알 수 있다.

따라서, 마이셀 구조의 나노 제제를 제조할 수 있는 광감각제 및 중합지질의 최적 몰비율은 1 : 5 내지 15인 것을 알아내었다.

< 실시예 1> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 1

클로로포름에 용해된 하이퍼리신(200 μL, 0.2 mg/mL) 및 DSPE-mPEG (1,2-다이스티로일-sn-글리세로-3-포스포에타노아민-N-[메톡시폴리(에틸렌 글리콜), 분자량 2000], 222 μL, 10 mg/mL)을 1 : 10 몰 비율이 되도록 상온에서 혼합하였다. 그 후, 상온-차광상태에서 완전히 건조시켜 중합지질 필름을 형성하고, 형성된 필름을 초음파파쇄 기구(sonication equipment)에 투입한 후, 75℃의 인산염 완충 식염수(PBS, 1 mL)에서 5분 동안 수화시켰다. 이때, 중합지질 필름은 수화가 진행됨과 동시에 음파 파쇄되었다. 음파 파쇄된 용액을 상온으로 냉각시키고, 0.1 μm 크기의 필터로 여과한 다음, 여과액을 원심분리기(3000 MWCO 원심분리기, Millipore, Billerica, MA, USA)의 30 k 원심분리 필터로 추가 필터하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

상기 인산염 완충 식염수(PBS)는 물; 10 - 20 mM 인산 나트륨; 0.9% 염화 나트륨을 포함한다.

< 실시예 2> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 2

상기 실시예 1에서 사용한 인산염 완충 식염수(PBS, 1 mL)를 대신하여 헤페스 완충 식염수(HBS, 1 mL)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

상기 헤페스 완충 식염수(HBS)는 물; 10- 20 mM의 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산; 135-155 mM 염화나트륨;을 포함한다.

< 실시예 3> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 3

상기 실시예 1에서 사용한 인산염 완충 식염수(PBS, 1 mL)를 대신하여 헤페스 완충 포도당 용액(HBG, 1 mL)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

상기 헤페스 완충 포도당 용액(HBG)은 물; 10- 20 mM의 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산; 5%의 글루코오스;를 포함한다.

< 실시예 4> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 4

클로로포름에 용해된 하이퍼리신(200 μL, 0.2 mg/mL) 및 DSPE-mPEG (1,2-다이스티로일-sn-글리세로-3-포스포에타노아민-N-[메톡시폴리(에틸렌 글리콜), 분자량 2000], 222 μL, 10 mg/mL)을 1 : 10 몰 비율이 되도록 상온에서 혼합하였다.

다음으로, 상온-차광상태에서 완전히 건조시켜 중합지질 필름을 형성하고, 형성된 필름을 초음파 파쇄 기구(sonication equipment)에 투입한 후, 75℃의 물(1 mL)에서 5분 동안 수화시켰다. 이때, 중합지질 필름은 수화가 진행됨과 동시에 음파 파쇄되었다. 음파 파쇄된 용액을 상온으로 냉각시키고, 0.1 μm 크기의 필터로 여과한 다음, 여과액을 원심분리기(3000 MWCO 원심분리기, Millipore, Billerica, MA, USA)의 30 k 원심분리 필터로 추가 필터하였다.

다음으로, 상기 제조된 나노 제제를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 밤샘 숙성(aging)을 실시하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

< 실시예 5> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 5

상기 실시예 4에서 인산염 완충 식염수(PBS)에서 밤샘 숙성(aging)을 실시한 것을 대신하여 헤페스 완충 식염수(HBS)에서 밤샘 숙성을 한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

< 실시예 6> 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 제조 6

상기 실시예 4에서 인산염 완충 식염수(PBS)에서 밤샘 숙성(aging)을 실시한 것을 대신하여 헤페스 완충 포도당 용액(HBG)에서 밤샘 숙성을 한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

< 비교예 1> 물에서 수화 및 숙성시킨 마이셀 구조의 나노 제제의 제조

다음으로, 상온-차광상태에서 완전히 건조시켜 중합지질 필름을 형성하고, 형성된 필름을 초음파파쇄 기구(sonication equipment)에 투입한 후, 75℃의 물(1 mL)에서 5분 동안 수화시켰다. 이때, 중합지질 필름은 수화가 진행됨과 동시에 음파 파쇄되었다. 음파 파쇄된 용액을 상온으로 냉각시키고, 0.1 μm 크기의 필터로 여과한 다음, 여과액을 원심분리기(3000 MWCO 원심분리기, Millipore, Billerica, MA, USA)의 30 k 원심분리 필터로 추가 필터하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

< 비교예 2> 광감작제를 포함하는 나노 제제의 제조

광감작제인 하이퍼리신을 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 16 mg/mL이 되도록 용해시켰다. 그 후, 다이메틸설폭사이드에 완전 용해된 하이퍼리신을 상온-차광상태에서 세포에 처리하기 전 1 부피% 이하의 다이메틸설폭사이드 용량이 되도록 세포 배양액에 혼합하여 세포 처치를 시행하였다.

< 비교예 3> 유기용매에 따른 마이셀 구조의 나노 제제

상기 실시예 1에서 클로로포름에 용해된 하이퍼리신(200 μL, 0.2 mg/mL) 및 DSPE-mPEG (분자량 2000, 222 μL, 10 mg/mL)을 1 : 10 몰 비율이 되도록 상온에서 혼합하는 것 대신에 동일한 부피의 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 각각 용해된 하이퍼리신(62.5 μL, 31.72 mM) 및 DSPE-mPEG (분자량 400, 62.5 μL, 31.72 mM)을 혼합하여 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 마이셀 구조의 나노 제제를 제조하였다.

< 실험예 1> 마이셀 구조의 나노 제제의 크기 및 물성 평가 1

본 발명에 따라 제조되는 마이셀 구조의 나노 제제의 크기를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 인산염 완충 식염수(PBS), 헤페스 완충 식염수(HBS), 헤페스 완충 포도당 용액(HBG)에서 직접 수화시켜 제조한 상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 마이셀 구조의 나노 제제를 미숙성 또는 각각 물, 인산염 완충 식염수(PBS), 헤페스 완충 식염수(HBS), 헤페스 완충 포도당 용액(HBG)에서 밤샘 숙성(aging)을 실시 후 25℃에서 평가하였다. 그 후, 상기 미숙성 또는 숙성된 나노 제제액을 각각 10 내지 20배 희석시키고, 나노 제제의 유체역학 크기, 다분산성(PI) 및 제타 포텐셜을 제타사이져 나노 ZS90(zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument Ltds., Worcestershire, UK)로 동적 광산란 측정을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3에서 제조된 나노 제제에 대한 동적 광산란 측정 결과, 상기 나노 제제의 크기는 약 5 내지 20 nm에 분포하는 것을 알 수 있고, 특히, 약 9 내지 12 nm 범위에 가장 많이 분포하는 것을 알 수 있다(도 2).

이로부터, 본 발명에 따른 광감작제인 하이퍼리신 및 중합지질인 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성하여 제조되는 나노 제제는 약 12 nm 이하의 크기를 가지게 되는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 광감작제인 하이퍼리신 및 분자량의 1500 내지 2500의 중합지질 DSPE-mPEG를 1 : 5.0 - 15.0 비율로 사용하여 캡슐화하고, 물에서 수화시킨 후, 인산염 완충 식염수(PBS), 헤페스 완충 식염수(HBS) 또는 헤페스 완충 포도당 용액(HBG)에서 숙성시키거나, 인산염 완충 식염수(PBS), 헤페스 완충 식염수(HBS) 또는 헤페스 완충 포도당 용액에서 직접 수화시킴으로써, 경제적으로 제조가능하고, 하이퍼리신과 DSPE-mPEG의 높은 결합 효율로 12 nm 이하 마이셀 구조의 나노 제제를 제조할 수 있다. 이에 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등의 암 질환, 특히, 뇌종양의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 마이셀 구조의 나노 제제의 크기 평가 2

상기 실시예 1에서 제조된 나노 제제를 400 메쉬 구리 그리드(grid, Ted Pella Inc., Pedding, Ca, USA)가 지지된 탄소 지지막 상에 한 방울 점적하고, 완전히 건조시켜 막을 형성시켰다. 그 후, 형성된 막을 200 kV에서 투과전자현미경(TEM, JEM-2100F, JEOP Ltd., Tokyo, Japan) 촬영하였으며, 그 결과를 도 4 내지 5에 나타내었다. 상기 촬영은 염색되지 않은 나노 제제 막과 염색된 나노 제제 막에 대하여 수행되었으며, 이때 염색된 나노 제제 막은 형성된 막에 0.1 N의 NaOH로 pH 7.2 내지 7.4가 되도록 조절된 1%의 소듐 포스포텅스테이트(PTA, sodium phophotungstate, 시그마-알드리치) 수용액을 처리한 다음, 페트리 접시에서 15 내지 20분 동안 건조시켜 제조하였다.

도 4 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 3.0 내지 14.5 nm의 크기를 갖는 것을 알 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 실시예 1에서 제조된 나노 제제의 투과전자현미경 촬영 결과를 살펴보면, 나노 제제를 소듐 포스포텅스테이트로 염색한 경우, 나노 제제의 크기는 11.1±3.5 nm로 균일한 것을 알 수 있다(도 4A). 또한, 나노 제제를 염색하지 않은 경우, 그 크기는 5.4±1.5 nm로 균일한 것을 알 수 있다(도 4B 및 5).

따라서, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 5.0 내지 12.0 nm의 크기를 가지므로, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등의 암 질환, 특히, 뇌종양의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 3> 마이셀 구조의 나노 제제의 세포독성 평가

빛이 조사되지 않는 경우, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제의 세포독성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

세포독성을 평가하기 위하여, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 인간 악성뇌교종 세포인 U251MG를 분양받았다. 분양받은 세포를 영양 혼합물 F-12(Nutrient Mixture F-12), 10% 소태아혈청, 항생제(페니실린(100 I.U./mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 0.1mM의 MEM 비필수 아미노산 용액을 포함하는 둘코'스 변형 이글 배양액에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건으로 배양하였다. 배양된 세포를 24-웰 플레이트에 5×10⁴세포/웰 씩 분주하였으며, 각 시료당 4회씩 DMEM/F12 배지(1 mL)를 주입하였다. 배양 24시간 후, 상기 배지를 제거하고, 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 나노 제제를 각각 1.0, 2.5, 5.0 및 10 μM의 농도로 포함하고 있는 배지를 주입하였다. 이때, 주입되는 배지에 있어서, 배지에 포함되는 나노 제제의 부피는 전체 배지 부피의 1.0%를 초과하지 않도록 하였다. 배양 2시간 후, 각 웰을 인산염 완충 용액(PBS)으로 세척하고, 나노 제제를 포함하고 있지 않은 배지로 주입하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, 세포생존 및 세포독성을 평가하기 위하여, 각 웰에 배지에 대하여 10-20 부피%의 WST-1 시약(대일랩 서비스사., 서울, 대한민국)을 처리하고, 1시간 동안 배양한 다음, 흡광도 마이크로플레이트 측정기(absorbance microplate reader)를 이용하여 450 nm 파장에서 배양액을 흡광도를 측정하였다. 이때, 상기 모든 과정은 암실 조건에서 수행되었으며, 측정된 정규화 흡광도로부터 세포의 생존율을 도출하였다. 그 결과를 도 6A에 나타내었다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 세포에 대한 독성이 없는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로, 광감작제인 하이퍼리신만을 포함하는 비교예 2, 하이퍼리신에 mPEG 또는 DSPE-mPEG로 마이셀을 형성시켜 캡슐화한 비교예 3 또는 실시예 1에서 제조된 나노 제제는 광 조사가 되지 않는 암실 조건 하에서 10 μM 이하의 농도에서 세포에 대한 독성이 없는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광조사가 이루어지지 않는 경우, 세포에 대한 독성이 없어 인체에 안전하므로, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등의 암 질환, 특히, 뇌종양의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 4> 광조사에 의한 나노 제제의 광-세포독성 평가

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제에 광조사를 수행하였을 경우의 광-세포독성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

인간 악성뇌교종 세포인 U251MG를 96-웰 플레이트에 1×10⁴cell/웰 씩 분주하였으며, 각 시료당 4회씩 DMEM/F12 배지(0.1 mL)를 주입하였다. 배양 24시간 후, 상기 배지를, 실시예 1, 비교예 2 및 3에서 제조된 나노 제제 각각을 포함하고 있는 배지(시료처리군) 및 나노 제제를 포함하고 있지 않은 배지(무처리군)로 교체하였다. 상기 시료를 2시간 동안 암실 조건에서 배양하고, 인산염완충식염수(PBS)로 세척한 다음, 나노 제제가 배제된 배지로 재교체하였다. 그 후, 각 세포에 전달되는 전체 에너지가 0.1 J/cm²가 되도록 광조사 시스템(light irradiation system, LIS)의 광을 5 mW/cm²의 광력(590-605 nm)으로 조사하여 광역동 진단(photodynamic theraphy)을 수행하였다. 각 세포는 상기 광조사 조건에서 12시간 동안 배양되었다. 배양을 마친 세포는 상기 실험예 3에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 수행하여 광-세포독성을 측정하였다. 측정된 값은 상기 수학식 1 및 2를 이용하여 측정된 값으로부터 광-세포독성 및 광-세포독성 효율을 도출하였다. 그 결과는 도 6B에 나타내었다.

도 6B에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광조사 시, 암세포를 사멸시키는 광-세포독성이 상당히 우수한 것을 알 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노 제제는 인간 악성뇌교종 세포인 U251MG에 처리하였을 경우, 2.65±0.15 % mg/A.U. mL의 광독성을 나타내는 것을 알 수 있다. 반면, 광감작제인 하이퍼리신만을 포함하는 비교예 2의 나노 제제 및 하이퍼리신에 mPEG로 마이셀을 형성시켜 캡슐화한 비교예 3의 나노 제제를 처리하였을 경우, 각각 1.00±0.04 % mg/A.U. mL, 1.0±0.12 % mg/A.U. mL의 광독성을 나타내는 것으로 확인되어, 실시예 1의 나노 제제와 대비하여 광-세포독성이 현저히 낮은 것을 알 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광감작제인 하이퍼리신만을 포함하거나, 또는 mPEG와 같은 중합지질로 마이셀을 형성하여 캡슐화한 나노 제제와 대비하여 2.5배의 현저히 우수한 광-세포독성을 갖는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 광조사 시, 암세포에 대한 광-세포독성이 현저히 우수하므로, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등의 암 질환, 특히, 뇌종양의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 5> 나노 제제의 세포 내 기관의 분포양상 평가

본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제가 세포에 흡수되었을 때의 세포 내 기관의 분포 양상을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

인간 악성뇌교종 세포인 U251MG를 35 mm 배양 접시에 DMEM/F12배지(1 mL)와 3×10⁵cell/웰 씩 분주하였다. 배양 24시간 후, 상기 세포를 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3의 나노 제제(5 μL)로 각각 처리하고, 2시간 동안 배양시켰다. 그 후, 미토 트랙커^® 딥레드 FM(Mito Tracker^®, 200 nM, 처리 후 10분 배양), ER-트랙커^TM 그린(ER-Tracker^TM green, 1 μM, 처리 후 30분 배양) 및 리소 트랙커^® 블루 DND-22(LysoTracker^® Blue DND-22, 75 nM, 처리 후 2시간 배양)를 각각의 시료에 처리하고, 시료와 염료를 인산염완충식염수(PBS)로 세척한 다음, 시료에 약물 배지 및 비약물 배지를 주입하였다. 이때, 상기 과정은 암실 조건에서 수행되었다. 세포의 형광 현미경 촬영 이미지는 다중광자 레이져 스캐닝 현미경 이미징 시스템(multiphoton laser scanning microscopy imaging system, LSM 510; Carl Zeiss)을 사용하여 촬영되었으며, 여기광은 488, 543 및 633 nm 연속파장 레이져 및 800 mm 펨토-초 펄스형 레이져(femto-second pulsed laser)를 사용하였다. 또한, 390-465, 530-550, 560-615 및 650-710 nm의 방출 필터를 사용하였으며, 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 개방 관류 마이크로 배양기(open perfusion micro-incubator, PEMI-2;Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 이미지 및 이미지로부터 도출된 세포 내 기관의 상대적 공존 계수를 도 7 및 8에 나타내었다.

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 세포 내 기관 중 미토콘드리아에 높은 비율로 분포하는 것을 알 수 있으며, 이에 대한 광-세포독성 효율이 우수한 것을 알 수 있다.

보다 구체적으로 촬영된 이미지에서 녹색은 미토콘드리아를; 적색은 하이퍼리신을; 화살표로 표시된 황색은 미토콘드리아에 공존하는 하이퍼리신 의미하도록 의사색채화(pseudocolored) 시킨 도 7을 살펴보면, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노 제제는 미토콘드리아의 전반에 분포하고 있는 반면, 비교예 2 및 3에서 제조된 나노 제제의 경우, 미토콘드리아의 일부에서만 공존하고 있는 것을 알 수 있다.

또한, 촬영된 이미지를 기반으로 세포 내 기관의 상대적 공존 계수를 도시한 도 8을 살펴보면, 하이퍼리신만을 포함하고 있는 비교예 2의 나노 제제와 하이퍼리신을 mPEG로 마이셀을 형성하여 캡슐화한 비교예 3의 나노 제제의 경우, 유사한 상대적 공존계수를 나타내는 반면, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노 제제의 경우, 비교예 2 및 비교예 3의 나노 제제와 대비하여 미토콘드리아의 상대적 공존계수가 높은 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명의 마이셀 구조의 나노 제제는 하이퍼리신의 광-세포독성의 주기전이 미토콘드리아와 관련된다는 점에서 종래의 하이퍼리신을 포함하는 제제와 대비하여 암세포에 대한 광-세포독성 효율이 향상되는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 마이셀 구조의 나노 제제는 세포 내 기관 중 미토콘드리아에 높은 비율로 분포하여 암세포에 대한 광-세포독성을 효과적으로 나타내므로, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 뇌종양 등의 암 질환, 특히, 뇌종양의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

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클로로포름, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 자일렌 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유기용매에 용해된 광감작제와, mPEG의 분자량이 2000인 중합지질 DSPE-mPEG₂₀₀₀을 1.0 : 10.0의 몰 비율로 혼합시켜 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조된 혼합용액으로부터 유기용매를 제거 및 건조시켜 중합지질 막을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조된 중합지질 막을 상온 내지 100℃ 하에 물, PBS, HBS 및 HBG로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 용액에서, 초음파 파쇄기에 의해서 음파 파쇄를 수행하며 수화시켜 마이셀 구조의 나노입자를 형성하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 형성된 마이셀 구조의 나노입자를 여과하여 균질화하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법으로 제조되는, 5.0 내지 12.0 nm의 크기를 갖고, 광감작제의 사용량에 따른 광감작제의 나노 제제화율(%)이 80% 이상인 것을 특징으로 하는 마이셀 구조의 나노 제제.
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제8항에 있어서,
상기 광감작제는 하이퍼리신인 것을 특징으로 하는 나노 제제의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 3의 수화는 물에서 수화한 후, PBS, HBS 및 HBG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액에서 숙성하거나, PBS, HBS 및 HBG으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용액에서 직접 수화하는 것을 특징으로 하는 나노 제제의 제조방법.
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제8항에 있어서,
상기 단계 4의 여과는 단계 3에서 형성된 마이셀 구조의 나노입자를 0.05 내지 0.20 μm의 필터로 여과하는 단계(단계 A); 및
상기 단계 A에서 여과된 나노입자를 20 내지 40 K의 원심분리 필터로 재여과하는 단계(단계 B);를 포함하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 나노 제제의 제조방법.