CN106456551A - 冻融后形成药物纳米晶体的脂质体 - Google Patents

Abstract

一种用于配制脂质体的方法，所述脂质体包含表面活性剂和冷冻保护剂，其可被冷冻而具有长期稳定性，并且在融化后提供立即和持续的释放递送概况。公开了包含抗感染剂的特定脂质体制剂及其用于治疗呼吸道感染和其它身体状况的递送，以及与之联用的装置和制剂。

Description

冻融后形成药物纳米晶体的脂质体

发明领域

本发明涉及，例如，用于治疗由多种微生物或胞内病原体所致的呼吸道感染的药物组合物。具体而言，本发明涉及在冻融后具有改性的释放概况的制剂，其提供药物(例如抗感染剂)的即刻释放或持续释放。它们可通过多种方法递送。例如，这些制剂可通过吸入来递送，以治疗囊性纤维化(CF)、非CF支气管扩张、COPD，和胞内肺部感染，包括非结核分枝杆菌(NTM)，并且预防和治疗生物恐怖主义感染，尤其是通过吸入来传播的那些，例如炭疽、兔热病、肺炎性鼠疫、类鼻疽和Q热病。

发明背景

感染可由多种微生物所致。对于卫生保健团体而言，顽固的感染会产生大量后果，包括增加的治疗负担和成本，而对于患者而言则为更具侵袭性的治疗模式，以及严重疾病甚至死亡的可能性。如果存在一种改善的治疗模式，其能够提供预防性治疗来预防易感患者患上感染，并且提高已被微生物感染的患者中的根除速率或有效性，那么将会是有益的。

具体而言，囊性纤维化(CF)是患者常患的顽固或固执呼吸道感染疾病的一个示例，包括绿脓假单胞菌(PA)。与复发的PA肺部感染相关的另一种疾病是非CF支气管扩张。COPD患者的一个亚组也遭受PA肺部感染，并且许多患有支气管扩张。

高定殖速率和控制囊性纤维化(CF)患者中PA感染所遇到的难题需要寻求安全且有效的抗生素。当前，吸入型妥布霉素、粘菌素，或氨曲南是CF的标准治疗。目前尚未批准任何制剂用于治疗NTM感染患者或非CF支气管扩张患者。

尽管阿奇霉素具有抗金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的活性，其对于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)，或其它革兰氏阴性非发酵菌而言没有直接抵抗活性(Lode H等，1996)。妥布霉素具有抵抗绿脓假单胞菌的活性；然而，在3个月后，对连续治疗的抗药分离株的患者数量从约10％增加至80％(Smith AL等，1989)，这已导致给药28天随后停歇28天的疗法的间歇给药方案。以连续方式递送抗感染性治疗，同时仍抑制抗药分离株出现的治疗方案的开发，可提供一种改进的治疗模式。值得注意的是，长期PA气道感染仍是CF患者发病率和死亡率的要因。当患者经历肺部恶化时，全身性抗铜绿假单胞菌治疗(通常由β-内酰胺和氨基糖苷类组成)的应用可能会导致临床上的改善和细菌负载的减少。然而感染的根除是极为罕见的。

在CF气道中，PA初始时具有非粘液性表型，但最终产生粘液表多糖，并组织成生物膜，这表明气道感染已从急性进展到慢性。生物膜中的细菌生长极其缓慢，这归因于厌氧环境，并且固有地对抗微生物剂具有抗性，因为固着细胞的易感性比浮游生长的细胞低得多。已报道，生物膜细胞对抗细菌剂的抗性要高至少500倍(Costerton JW等，1995)。因此，向粘液表型的转换和生物膜的生成，通过保护细菌以使其免受宿主防御并且妨碍抗生素向细菌细胞的递送，使PA持久存在于具有长期感染的CF患者中。尽管已做出大量工作来改善对于患有CF的个体的护理与治疗，并且已经延长了平均寿命，但患有CF的人类的中值存活年龄仅延长至近40岁(CF基金会网站，2006)。

众所周知，非结核分枝杆菌(NTM)的肺部感染也难以治疗。它们以多种形式存在于肺中，包括巨噬细胞内和生物膜内。抗生素特别难以触及这些位置。此外，NTM还可以处于静止(称为固着)或复制期，从而，有效的抗生素治疗将要靶向这两个时期。

鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)候米瑟氏(hominissuis)亚种(后文称作鸟分枝杆菌(M.avium))和脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)的肺部感染是严重的医疗卫生问题，并且在目前的疗法中存在很大的限制。由非TB分枝杆菌(NTM)造成的肺部感染的发生率正在增长(Adjemian等，2012；Prevots等，2010)，尤其是因鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌所致(Inderlied等，1993)。美国有约80％的NTM与鸟分枝杆菌相关联(Adjemian等，2012；Prevots等，2010)。脓肿分枝杆菌，其在最具毒力的类型之中发病率排列第二(Prevots等，2010)。由这两种分枝杆菌所致的疾病在具有慢性肺部病症，例如，肺气肿、囊性纤维化和支气管扩张的患者中常见(Yeager和Raleigh，1973)。它们还可引起严重呼吸疾病，例如，支气管扩张(Fowler等，2006)。所述感染来自环境来源，并且对肺造成渐进性损害。

现有治疗通常在功效上不理想，或与显著的副作用相关联。鸟分枝杆菌感染通常采用大环内酯(克拉霉素)或氮杂红霉素(阿奇霉素)联合乙胺丁醇和阿米卡星的全身疗法来治疗。口服或静脉(IV)喹诺酮，例如环丙沙星和莫西沙星，可与其它化合物联用(Yeager和Raleigh，1973)，但需要较高的胞内药物水平来实现最大功效。口服环丙沙星仅在与大环内酯或氨基糖苷联合给予时具有针对鸟分枝杆菌的临床功效(Shafran等1996；de Lalla等，1992；Chiu等，1990)。体外和小鼠内研究表明，仅口服环丙沙星的受限活性与环丙沙星无法在感染位置处达到杀细菌浓度相关(Inderlied等，1989)；5μg/ml的最小抑制浓度(MIC)对比4μg/ml的临床血清C_最大解释了实验模型和人类中有限的功效(Inderlied等，1989)。脓肿分枝杆菌常对克拉霉素具有抗性。需要施用静脉氨基糖甙类或亚胺培南，其通常是唯一可用的治疗可选方式，并且这些携载着严重副作用的可能，以及与静脉给予相关联的创伤和成本。有时也规定氯法齐明、利奈唑胺和头孢西丁，但用于静脉给予的毒性和/或需求限制了这些化合物的应用。因此，可用的疗法具有显著的缺陷，从而需要改良的方案。

近期研究也显示，鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌感染均与显著的生物膜形成相关联(Bermudez等，2008；Carter等，2003)：在实验动物模型中，鸟分枝杆菌中与生物膜相关联的基因的删除对于细菌形成生物膜和造成肺部感染的能力具有影响(Yamazaki等，2006)。

刻意释放雾或气溶胶形式的微生物剂造成了严重的生物恐怖主义威胁。希望能够获得更有效的方法来预防和治疗生物恐怖主义感染，尤其是可通过吸入传播的那些，例如炭疽、兔热病、肺炎性鼠疫、类鼻疽和Q热病。它们以可经融化以形成具有所需性质的药物的冷冻制剂形式储备将非常有吸引力。

因此，对于抗感染剂的改良制剂，尤其是用于通过吸入给予的那些，存在持续的需求。本发明解决该需求。

环丙沙星是氟喹诺酮抗生素，其经指示用于归因于PA的治疗下呼吸道感染，这在囊性纤维化患者中是常见的。环丙沙星是广谱的，并且，除了PA以外，它对于数种其它类型的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌也具有抵抗活性。其通过抑制拓扑异构酶II(DNA旋转酶)和拓扑异构酶IV来发挥最用，上述酶是细菌的复制、转录、修复和重组所需的酶。该作用机理与青霉素、头孢菌素、氨基糖甙类、大环内酯类和四环素不同，因此，对于这些类别的药物具有抗性的细菌可能对环丙沙星易感。因此，已对氨基糖苷类妥布霉素发展出抗药性的CF患者仍可能采用环丙沙星治疗。尚不知晓环丙沙星与其它类型的抗微生物剂之间存在交叉抗性。

尽管其吸引人的抗微生物性质，环丙沙星确实会产生麻烦的副作用，例如胃肠道(GIT)不耐症(呕吐、腹泻、腹部不适)，以及头晕、失眠、应激和增加的焦虑水平。明确需要可长期使用而不会导致这些使人衰弱的副作用的改良的治疗方案。

以吸入型气溶胶形式递送环丙沙星，通过划分所述药物在呼吸道(感染的主要位置)中的递送和作用，而具有解决这些担忧的潜力。

目前，还没有经监督管理批准用于人类应用的能够将抗生素直接靶向递送至呼吸道中的主要感染区域的气溶胶化形式的环丙沙星。这部分是因为该药物的较差稳定性和苦味抑制了对适于吸入的制剂的开发(Barker等，2000)。此外，环丙沙星的组织分布极为快速，致使肺中的药物停留时间过短，以无法提供口服或静脉途径给予药物以外的附加治疗益处(Bergogne-Bérézin E，1993)。

通过纳入脂质体，许多药物的治疗性质得到了改善。作为药物递送系统，在1965年重新发现磷脂载剂作为“脂质体”(Bangham等，1965)。通用术语“脂质体”涵盖了多种结构，但其均由一种或多种脂质双层组成，封闭出一水性空间，其中可包封亲水性药物，例如环丙沙星。脂质体包封通过多种机理改善了生物药学特性，包括改变的药物药代动力学和生物分布、从该运载体的持续药物释放、对于疾病位置增强的递送，和，保护活性药物物质不被降解。如下物质的脂质体制剂：抗癌剂阿霉素道诺霉素抗真菌剂两性霉素B和苯并卟啉是在过去20年引入美国、欧洲和日本市场的成功产品的示例。近期，长春新碱的脂质体制剂经批准用于肿瘤学指示。基于脂质的运载体的已证安全性和功效使其成为用于药学制剂的吸引人的候选物。

脂质体制剂通过吸入的递送能够提供许多吸引人的特征，限制条件是该脂质体制剂对气溶胶化过程稳定(Niven和Schreier，1990；Cipolla等，2013)。因此，相比现有的环丙沙星制剂，脂质体环丙沙星气溶胶制剂应具有如下数项益处：1)较高的药物浓度，2)通过感染位置处的持续释放实现的延长的药物停留时间，3)减少的副作用，4)增加的适口性，5)进入细菌的较好透过性，和6)进入被细菌感染的细胞的较好透过性。先前已显示，脂质体包封的氟喹诺酮抗生素的吸入可有效治疗肺部感染。在土拉弗朗西斯菌小鼠模型中，通过升高的存活率，显示脂质体包封的氟喹诺酮抗生素优于游离的或未包封的氟喹诺酮(CA2,215,716、CA2,174,803，和CA2,101,241)。

美国专利号8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915描述了由吸入的液滴或颗粒组成的气溶胶。所述液滴或颗粒包含游离药物(例如，抗感染化合物)，其中药物不被包封，并且所述药物可以是环丙沙星。所述颗粒还包含脂质体，其包封药物，例如，抗感染化合物，所述药物也可以是环丙沙星。游离药物和脂质体包封的药物被包括在药学上可接受的赋形剂中，其经配制用于气溶胶化递送。所述颗粒还可包括其它治疗剂，其可以是游离的和/或处于脂质体中，并且，其可以是不同于第一药物的任何药学活性药物。这些专利中的脂质体是单层囊泡(平均粒径75-120nm)。环丙沙星以约10小时的半衰期在肺中从所述脂质体缓慢释放(Bruinenberg等，2010b)，这允许一天一次的给药。

此外，采用多种脂质体组合物在体外和鼠类感染模型中的研究显示，脂质体环丙沙星有效抵抗数种胞内病原体，包括鸟分枝杆菌。吸入型脂质体环丙沙星还有效治疗患者中的绿脓假单胞菌(PA)肺部感染(Bilton等，2009a，b，2010，2011；Bruinenberg等，2008，2009，2010a，b，c，d，2011；Serisier等，2013)。相比批准的口服和静脉环丙沙星剂量，通过吸入进入气道递送的脂质体环丙沙星制剂达到了呼吸道粘膜中和巨噬细胞中的高得多的浓度，并伴随获得如下临床功效的改善：在患者中，吸入所述脂质体环丙沙星的治疗剂量之后2小时，痰液中的环丙沙星浓度超过200μg/ml，并且，甚至在20小时后(下一次给药之前2小时)，其浓度>20μg/ml，远高于上述抗性分枝杆菌的最小抑制浓度(约4μg/ml的断点(Bruinenberg 2010b))。因为包含环丙沙星的脂质体被巨噬细胞竭力吞噬，使得环丙沙星得以紧密靠近胞内病原体，所以进一步增加了抗分枝杆菌浓度，因此该吸入型脂质体制剂相对于环丙沙星的其它制剂而言应能获得改善的功效。因此，我们认为，采用所述吸入型脂质体环丙沙星甚至能抑制高抗性NTM。这极具意义，因为在这些患者长期应用全身抗生素，已常见鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌对于抗生素的抗性。采用绿脓假单胞菌(绿脓假单胞菌(PA))的临床实践也显示，在吸入型脂质体环丙沙星治疗之后，没有明显的抗性产生：事实上，甚至在初始时已经具有抗性菌株的那些患者均对治疗有良好响应。这可能归因于持续的压倒性浓度的环丙沙星的存在。此外，在囊性纤维化中采用其它抗假单胞菌性药物妥布霉素和多粘菌素的实践显示，甚至具有PA抗性菌株的患者也对所述吸入形式的药物临床响应良好(Fiel，2008)。

少数几项体外研究已显示，脂质体环丙沙星有效抵抗胞内病原体：鸟分枝杆菌感染：1)在人类外周血单核细胞/巨噬细胞中，测试的浓度为0.1-5μg/ml的脂质体环丙沙星，相比相同浓度的游离药物，造成了胞内鸟分枝杆菌-细胞内分枝杆菌复合群(MAC)集落形成单位(CFU)的浓度相关减少(Majumdar等，1992)；2)在鼠类巨噬细胞样细胞系J774中，脂质体环丙沙星使细胞相关的鸟分枝杆菌的水平减少高达43倍，并且这些减少大于游离环丙沙星的结果(Oh等，1995)。

一旦鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌感染单核细胞/巨噬细胞，该感染可随后扩散至肺、肝、脾、淋巴结、骨髓和血液。对于脂质体环丙沙星抵抗动物模型中鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌的功效还没有公开的研究。

数项体内研究已显示，脂质体环丙沙星有效抵抗胞内病原体土拉弗朗西斯菌：采用低达单一剂量的脂质体环丙沙星，证明了通过吸入或鼻内滴注递送至肺的脂质体环丙沙星抵抗小鼠中吸入性兔热病(土拉弗朗西斯菌LVS和SCHU S4)的功效，其提供100％的接触后保护，并且甚至对于已经具有显著的全身感染的动物提供有效的接触后治疗(Blanchard等，2006；Di Ninno等，1993；Conley等，1997；Hamblin等，2011；Hamblin等，1996；Wong等，2003)。所述研究还发现，吸入型脂质体环丙沙星优于吸入和口服的未包封的环丙沙星。

不同的是，a)在分枝杆菌感染的巨噬细胞模型中，游离环丙沙星不如脂质体环丙沙星(Majumdar等，1992；Oh等，1995)；b)在土拉弗朗西斯菌感染的鼠模型中测试时，递送至肺的单独的游离环丙沙星的功效不如游离环丙沙星(Conley等，1997；Wong等，1996)，因为其被迅速吸收进入血流。由游离环丙沙星和脂质体环丙沙星两者制成的制剂结合了游离环丙沙星的初始瞬时高浓度的潜在优势，以增加肺中的C_最大，随后是环丙沙星从脂质体组分的缓释，如在BE中得到证实(Cipolla等，2011；Serisier等，2013)。游离环丙沙星组分还具有希望的免疫调节作用(美国专利号8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915)。

此外，胃肠外注射的脂质体环丙沙星活化巨噬细胞，甚至在低于抑制水平的浓度下也能导致增加的吞噬作用、一氧化氮产量，和胞内微生物杀灭作用，这可能是通过免疫刺激作用所致(Wong等，2000)。载有环丙沙星的巨噬细胞可从肺迁移进入淋巴，以治疗肝、脾和骨髓中的感染–由肺部-递送的CFI在兔热病中的全身作用所表明(Di Ninno等，1993；Conley等，1997；Hamblin等，2011；Hamblin等，1996；Wong等，2003)。已知脂质体-包封的抗生素能够较好地透过肺中的细菌膜(Meers等，2008)。因此，递送至肺的新制剂的抗分枝杆菌和免疫调节作用，可为感染有鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌的患者提供相比现有治疗而言更好的替代疗法，或提供用于渐进式改进的辅助方法。

一项关于脂质体环丙沙星的药代动力学研究证实了动物中通过肺泡巨噬细胞的高摄取，这大概也是小鼠中吸入性兔热病的高度有效的接触后预防和治疗的原因。尽管在呼吸道给予所述脂质体环丙沙星之后，环丙沙星的血浆水平较低，观察到肝、脾、气管支气管淋巴结以及肺中的兔热病感染的减少，表明载有脂质体环丙沙星的肺泡巨噬细胞通过淋巴从肺迁移进入肝、脾和淋巴结(Conley等，1997)。

延长脂质体包封的抗生素的保存期限的能力是有价值的。然而，众所周知，所述制剂，例如脂质体环丙沙星制剂，对冻融敏感。例如，在上述脂质体环丙沙星制剂冻融后，会观察到脂质聚集物，表明许多脂质体经历冻融应激之后未能维持其完整性。由于物理聚集物，这些融化的制剂肯定无法例如，以气溶胶化的形式有效使用。

希望鉴定出一种脂质体制剂，其在冻融后能够维持其稳定性和完整性。冷冻制剂的保存期限通常比冷藏或室温制剂要长，这归因于水和其它成分的移动性降低，导致降解过程(例如，脂质水解)的速率降低。已有大量文献描述了冷冻脂质体并在冻融之后保持脂质体完整性时所遇到的困难。已显示，冷冻保护剂，例如二甲亚砜、甘油、季胺和碳水化合物具有前景(Wolkers等，2004)。此外，公认的是，糖能使磷脂囊泡在冷冻过程中稳化，并且，该稳化需要糖和磷脂头基之间的直接相互作用(Strauss等，1986；Crowe等，1988；Izutsu等，2011；Stark等，2010，Siow等，2007；Siow等，2008)。添加糖(例如多元醇)至内部脂质体流体和脂质体外流体，能够提高脂质体对冻融的稳健性，并有助于保持脂质体完整性。然而，并非全部脂质体制剂均能被糖完全保护，并且，在许多情况中，将会存在一部分完全丧失了完整性的囊泡，以及，聚结在一起导致囊泡大小增大的其它囊泡。这些事件也与包封药物的丢失相关联(Strauss等，1986；Crowe等，1988；Izutsu等，2011；Stark等，2010，Siow等，2007；Siow等，2008)。

尚未预期对冻融后的脂质体制剂的性质进行有益改性的能力。无疑，冻融之后，脂质体最有可能降解，从而破坏了脂质体的完整性。然而，尚未见在冻融之后保留脂质体完整性，同时以有益方式改性药物包封和药物释放性质的报道。

此外，冻融之后包含药物纳米晶体的脂质体的实例也未见报道。在脂质体中以纳米晶体形式存在的药物将有可能改变该药物的释放性质，因为目前存在影响释放速率的两种因素或限制；即，脂质体膜是一道屏障，并且，要求药物在运输通过脂质双层之前从所述晶体溶解是第二个限制。对脂质体中的晶体的尺寸和形状进行改性将会允许对于释放速率的进一步调节。所述晶体的尺寸和形状可通过如下方式进行调节：改变制剂中的赋形剂的比例，即，增加或减少药物、脂质体脂质、冷冻保护剂和表面活性剂的浓度。药物纳米晶体在所述脂质体中的存在有可能会改善所述制剂的其它性质，包括其稳定性特点。这些改性总体上可能会改善所述脂质体制剂的疗效，或允许具有更高便利度的给药概况；例如，给药频率的降低。该改善的给药概况可导致更高的患者依从性，并由此提高功效。采用溶解缓慢的药物晶体，因为较慢溶解和释放而缺乏药物浓度峰值，这也能降低或消除不希望的副作用。

另一个做法是产生即释型概况，并使其与持续释放概况相组合。融化该制剂之后，可能会有一部分药物从脂质体释放，并由此在吸入之后变得立即可用。可通过调节制剂中赋形剂的比例，即，增大或减小冷冻保护剂和/或表面活性剂的浓度，将这部分“游离药物”调节至1～60％，或10～50％，或20～40％。冷冻保护剂可包括，多元醇、糖，包括蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖等。表面活性剂可包括非离子型表面活性剂，包括聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20(也称作吐温20)。冷冻保护剂可存在于所述脂质体内侧(脂质体内部)，所述脂质体外侧(脂质体外部)，或两处。

已有在脂质体内包含沉淀的、凝胶或结晶形式的药物的多种脂质体制剂，但所有这些药物沉淀物在初始载药过程中产生。例如，有关于离子/pH梯度加载之后(Drummond等，2008)脂质体中结晶化的阿霉素(Lasic等，1992；Lasic等，1995；Li等，1998)、拓扑替康(Abraham等，2004)和长春瑞滨(Zhigaltsev等，2006)的报道。尚没有报道含有包封药物的脂质体，其中所述药物的一些在冻融后形成药物晶体。

发明内容

公开了一种制剂，其包含脂质体，所述脂质体包含脂质双层，所述脂质双层围绕药学活性药物，所述药物包含纳米晶体，对于所述晶体的一个或多个维度而言，所述纳米晶体的尺寸是200纳米或更小、100纳米或更小、50纳米或更小、10纳米或更小。所述双层可包含冷冻保护剂，其可以是多元醇，例如海藻糖或蔗糖，并且还包含表面活性剂，其可以是非离子型去污剂，例如聚山梨醇酯20或BRIJ 30。所述药物可以是抗感染剂，例如环丙沙星。

本发明还包括通过特定方法生成的本发明的制剂，由此，所述药物，例如环丙沙星，以10mg/mL或更多，25mg/mL或更多，50mg/mL或更多，100mg/mL或更多，200mg/mL或更多的范围内的浓度溶解于水性溶液中，并且包封进入脂质体的脂质双层。然后，可将所述脂质体纳入溶液中，该溶液可包括抗感染剂，该抗感染剂可与包封在该脂质体内的抗感染化合物(且例如可以是环丙沙星)相同或不同。该制剂经冷冻，例如，在-20℃～-80℃范围内的极低温度下被冷冻。该冷冻制剂可长期维持冷冻状态以供储存，例如一周或更久，一个月或更久，一年或更久，或者可以立即再融化以供使用。脂质体内的药物再融化之后形成纳米晶体。在给予之后，溶解于脂质体周围的溶剂运载体中的药物提供药物即释，随后，当脂质体溶解于肺中时，药物被释放，随后，当纳米晶体溶解时，药物进一步被释放。该制剂提供抗感染药物(例如环丙沙星)在肺中的长时间控释，由此使其能够有效地根除以生物膜形式出现的感染。

本发明的一个方面是一种制剂，该制剂具有特定的释放概况，其中，在冻融后的所述释放概况经改性。该制剂可以多种方式给予。例如，其可后续经气溶胶化，以生成具有改性的和/或预定的释放概况的可吸入的液滴或颗粒。所述液滴或颗粒包含游离药物(例如，抗感染化合物)，其中药物不被包封，并且所述药物可以是环丙沙星。所述颗粒还包含脂质体，所述脂质体包封药物，例如抗感染性化合物，其也可以是环丙沙星，并且，所述包封的药物的一部分以纳米晶体形式存在于脂质体中。所述脂质体中的纳米晶体的形状和长度可通过以选定浓度纳入特定的冷冻保护剂以及其它表面活性剂来选择，这在实施例中有详尽说明。游离药物和脂质体包封的药物被包括在药学上可接受的赋形剂中，其经配制用于气溶胶化递送。所述颗粒还可包括第二治疗剂，其可以是游离的和/或处于脂质体中，并且，其可以是不同于第一药物的任何药学活性药物。

冷冻可以各种冷冻速率和冷冻温度进行。例如，所述样品可用液氮快速冷冻，然后贮存在冰箱-20℃，或-50℃，或-80℃或低于0℃的其它温度。也可将待冷冻的样品直接放入冰箱，例如，-20℃或-50℃，或-80℃冰箱，并且允许以慢或快的冷冻速率冷冻，这取决于冰箱的设计。冷冻速率也可取决于待冷冻的样品的体积，及其储存容器的导热性质，并且，本发明预期50μL至多至50或100L或更多的范围内的体积。更优选地，所述体积将在1mL～10mL。容器材料也可具有从玻璃到塑料，到金属，或其组合的不同组成。

当所述制剂经气溶胶化时产生的制剂和所得颗粒包含药学上可接受的运载体、冷冻保护剂、游离药物，和以药物纳米晶体的形式包封在脂质体中的药物。在一些情况中，可完全排除药学上可接受的运载体，例如在游离药物处于液态时。然而，一般需要所述运载体为游离药物提供溶剂，并且，所述溶剂可以是水、乙醇、水和乙醇的组合或对于人类和动物无害的其它有用溶剂。制剂中的溶剂百分比可以是从0重量％到90重量％，1重量％到50重量％，2重量％到25重量％不等，但通常保持在足够高以保持所述药物在该制剂的pH下处于溶液中的水平。该水平将在药物与药物之间不同，并且随pH变化而变化。所述运载体可以10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％等或更多或其间任何增加量的量存在于所述制剂中。

所述制剂包括两种不同形式的药物。首先，所述药物是游离形式，其是液体或溶解于溶剂。其次，所述药物被包封在脂质体中。游离药物与包封在脂质体中的药物的比例可变。一般而言，游离药物占所述制剂的0％、5％、10％、20％、30％等，至多至80％，以重量计。所述脂质体中存在的药物占所述制剂中存在的药物的剩余百分比。因此，所述脂质体中存在的药物可以所述制剂中存在的总药物的20％至多至100％的重量存在。所述脂质体中存在的药物的部分是药物纳米晶体形式。

所述制剂可具有6.0±20％的pH。在本发明的一些方面中，所述制剂可在相对低的pH，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或5.5下配制。

所述制剂包括脂质体，其具有包封的药学活性药物，所述脂质体经设计用于提供受控的药物释放。本发明该方面的受控释放指的是，药物可在1-24小时时程内以约0.1％-100％/小时释放，或在1-12小时时程内以0.5％-20％/小时释放，或者，在约1-6小时的时程内以约2％-10％/小时释放。本发明意在涵盖上文提供的范围之间的半个百分点的量和半小时的量的药物百分比和小时数方面的增量，以及其它增量。

本发明的一个方面是一种制剂，其包含通过气溶胶递送至人类患者的肺的脂质体，所述脂质体包含游离和包封的环丙沙星或其它抗感染剂。所述脂质体可以是单层或多层的，并且可以是生物粘附性的，包含分子例如透明质酸。除了所述游离和脂质体包封的抗感染性以外的至少一种治疗剂也可包括在该组合物中。该治疗剂可以是游离药物或包封的药物，伴随可用于直接吸入人的肺的药学上可接受的运载体存在。

所述其它药物可包括，酶，以减小粘液的粘弹力，例如DNA酶或其它粘痰溶解剂；上调氯离子通道或增加跨细胞离子流的化学品，包括羊毛硫氨酸抗生素(lantibiotics)，例如耐久霉素，促进水合作用或粘液纤毛清除的物质，包括上皮钠通道(ENaC)抑制剂或P2Y2激动剂，例如地纽福索，弹性蛋白酶抑制剂包括α-1抗胰蛋白酶(AAT)、支气管扩张剂、类固醇、N-乙酰半胱氨酸、干扰素γ、干扰素α；增强抗生素对抗生物膜细菌的活性的物质，例如水杨酸钠(Polonio RE等，2001)，或本领域技术人员已知的抗生素。气道炎症和收缩也与囊胞性纤维症及其治疗相关联。因此，支气管扩张剂，例如β₂-肾上腺素受体激动剂和抗毒蕈碱剂，以及抗炎剂，包括吸入型皮质类固醇、非甾族抗炎剂、白三烯受体拮抗剂，或合成抑制剂等，也可与抗感染剂组合。

本发明的另一方面是用于治疗患者中的囊性纤维化的方法，所述方法包括：给予所述患者包含所述抗感染剂(例如，包封在脂质体中的环丙沙星)的制剂。所述制剂优选通过吸入给予患者。

本发明的另一个方面是治疗胞内肺部感染(具体是NTM感染)的方法。冻融后，脂质体中药物纳米晶体的存在与延迟释放概况相关联。该延迟释放概况提供另一益处，其为感染的细胞(具体为肺泡巨噬细胞)提供更多时间供于摄取所述脂质体，因此增加递送至胞内感染的活性药物的量。另一个益处是，一旦感染细胞摄取了包含药物纳米晶体的脂质体，细胞内的药物释放速率将在时程上持久，因此改善疗效。

根据本发明的另一方面，同时包含游离和包封的抗感染剂的制剂于初始时在肺中提供高治疗水平的抗感染剂以根除仅对高浓度的药物易感的细菌，同时维持抗感染剂随时间的持续释放，以针对对于长时间接触而非短暂高峰易感性更高的细菌。脂质体包封也有助于透过生物膜，并且，拖延的接触也可能更有效地对抗静止或缓慢复制的细菌。尽管对于生物膜抗药性的一些方面了解有限，但认为主要机理与如下方面有关：(i)改性的营养环境与生物膜中生长速率的遏制；(ii)外聚合物基质与其成分和抗微生物剂之间的直接相互作用，影响了扩散和可及性；和(iii)生物膜/附着特定表型的发展(Gilbert P等，1997)。因此，即释型抗感染剂(例如，环丙沙星)的目的是使肺中的难以根除的细菌周围的抗生素浓度快速增加至治疗水平。这些高峰，联合脂质体向生物膜中的较好穿透性，也解决了未包封的抗生素向生物膜和在生物膜内的较低扩散速率的问题。持续释放抗感染剂(例如，环丙沙星)的作用是，在肺部保持治疗水平的抗生素，由此提供较长时间范围内的持续的治疗，增加功效、降低给药频率，并降低形成耐药集落的可能性。

抗感染剂的持续释放可确保该抗感染剂从不减少到低于抑制水平(sub-inhibitory)的浓度之下，从而减小形成针对该抗感染剂的抗性的可能性。

本发明的另一个方面涉及治疗(具体是肺中的)胞内感染的方法。已知一些脂质体制剂被巨噬细胞(例如肺泡巨噬细胞)摄取，其是胞内感染的位点。因此，采用某种脂质体制剂的递送将提高将包封的药物靶向至包含胞内感染的巨噬细胞的能力。然而，显著量的包封的药物可在雾化过程中或在气道中沉积之后从脂质体释放，然后被巨噬细胞摄取。通过产生对雾化稳定并且在脂质体中保留较长时间段的脂质体制剂，能够增强将包封的药物靶向至巨噬细胞，或具有胞内感染的其它细胞的能力。包含由可溶性相对较差的药物形式组成的纳米晶体形式的药物的脂质体将具有降低的从脂质体释放的速率，这是因为要求结晶药物在运输通过脂质体双层之前溶解。因此，期望这也导致体内释放速率的降低，由此进一步提高本发明的制剂靶向肺中胞内感染的能力。

尽管环丙沙星是具体用于本发明的抗感染剂，并不希望将本发明限制于环丙沙星。可采用其它抗生素或抗感染剂，例如，选自下组的那些：氨基糖苷、四环素、磺胺、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹诺酮、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、青霉素、头孢菌素、皮质类固醇、前列腺素、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明、萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬、肽抗生素，或其任意组合。

本发明的一个方面是一种制剂，其包含：

脂质体，其中所述脂质体包含：

脂质双层；和

冷冻保护剂；

药学活性药物的纳米晶体，其被所述脂质双层围绕，其中，所述纳米晶体的尺寸是200nm或更小。

本发明的另一个方面是所述制剂，其包含表面活性剂，例如非离子型去污剂，与冷冻保护剂相联合，所述冷冻保护剂是多元醇例如海藻糖和蔗糖。

本发明的另一个方面，所述制剂包括药学上可接受的运载体，并且，所述运载体可替代性地是液体形式的药学活性药物或其中溶解有药物的水性运载体。

在本发明的另一个方面中，所述药学活性药物是抗感染药物，其可以选自下组：喹诺酮、磺胺、氨基糖苷、四环素、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明，萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬及其组合。

本发明的另一方面是所述制剂，其中，所述双层包含选自下组的脂质：脂肪酸；溶血脂质；鞘脂类；鞘磷脂；糖脂(glycolipid)；糖脂(glucolipid)；鞘糖脂；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；载有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；具有醚和酯联脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、心磷脂、磷脂、具有不对称酰基链的合成的磷脂；和，具有共价结合的聚合物的脂质。

本发明的另一方面是所述制剂，其中，所述脂质体包含选自下组的磷脂：磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸，及其混合物；其中，所述磷脂以与改性剂的共混物形式提供，所述改性剂选自下组：胆固醇、十八胺、硬脂酸、生育酚，及其混合物；并且其中，所述脂质体是单层的或多层的。

本发明的另一个方面包括如下制剂，其中，所述纳米晶体的尺寸是10纳米或更小，所述冷冻保护剂是蔗糖或海藻糖，所述表面活性剂是聚山梨醇酯表面活性剂，例如聚山梨醇酯20和BRIJ 30，并且其中，所述药物优选是环丙沙星。

在本发明的另一个方面，所述制剂是气溶胶化的，并且，该气溶胶化的颗粒的气动直径是1微米-12微米，并且在气溶胶化时，90％或更多，95％或更多，98％或更多的脂质体保持其结构完整性。

在本发明的另一个方面，所述制剂通过将温度降至-20℃～-80℃的范围来冷冻，在融化之前贮存一周或更久，所述融化在5℃～30℃的温度范围内进行，这之后，90％或更多的脂质体保持其结构完整性，或95％或更多，或98％或更多的脂质体保持其结构完整性。

本发明的另一个方面采用其中具有药物的本文所述的任何制剂，并且采用该制剂以通过调节表面活性剂的量来调节所述制剂的药物释放概况，从而获得所需的释放速率。

本发明的另一个方面是治疗患者中的感染的方法，其包括：

使制剂气溶胶化，所述制剂包含游离的第一药学活性药物和以纳米晶体形式包封在脂质体中的第二药学活性的药物，所述纳米晶体在冻融之后形成；和

将该气溶胶吸入所述患者的肺，其中，所述游离药物包含所述制剂中游离药物与包封的药物两者总计的1％～50％。

另一个方面是上述方法，其中，所述感染是选自下组的微生物的感染：分枝杆菌、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)。

本发明的另一个方面是一种方法，其中：

90％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后提供0.5％-10％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明的另一个方面是一种方法，其中：

其中，95％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后，提供1％-8％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明的另一个方面是一种方法，其中：

所述脂质体以29.4比70.6的比例包含胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)，并且是单层的，并且其中，98％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且提供2％-6％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明的另一个方面是一种方法，其中：

所述脂质体还包含0.1-0.3％的聚山梨醇酯20，和200-400mg/mL的蔗糖。

本发明的一个方面是调节药物释放概况的方法，其包括：

向如权利要求1和21中任一项所请求保护的制剂添加表面活性剂，并调节表面活性剂的量，以获得所需的药物释放速率；

其中，所述表面活性剂是非离子型去污剂；并且

其中，所述表面活性剂选自下组：聚山梨醇酯20和BRIJ 30。

本发明的另一个方面是治疗方法，由此，如上所述的任何方法基于患者的检测的症状来进行；和

所述制剂的给予通过选自下组的途径进行：注射、吸入、鼻内给予、口服、和静脉输注。

本发明的一个方面是治疗患者中的感染的方法，其包括：

使制剂气溶胶化，所述制剂包含游离的第一药学活性药物和以纳米晶体形式包封在脂质体中的第二药学活性的药物，所述纳米晶体在冻融之后形成；和

将该气溶胶吸入所述患者的肺，其中，所述游离药物包含所述制剂中游离药物与包封的药物两者总计的1％～50％；

其中，所述感染是选自下组的微生物的感染：分枝杆菌、铜绿假单胞菌和土拉弗朗西斯菌。

本发明的一个方面是治疗患者中的抗生素抗性感染的方法，其包括：

使制剂气溶胶化，所述制剂包含30％的游离环丙沙星和70％的包封在脂质体中的环丙沙星；和

将该气溶胶吸入所述患者的肺，由此，90％或更多的所述脂质体在经过气溶胶化之后保持结构完整性，

其中，所述抗生素抗性感染包括生物膜中的微生物或吞噬在巨噬细胞中的微生物；

其中，所述感染是生物膜中的微生物感染；

其中，所述感染是吞噬在巨噬细胞中的微生物的感染；

其中，所述感染是选自下组的微生物的感染：分枝杆菌、铜绿假单胞菌和土拉弗朗西斯菌；

其中，所述脂质体的平均粒径是约75nm～约120nm，并且是单层的；

其中，所述脂质体以约30比70(加或减10％)的比例包含胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)，该HSPC是一种半合成的完全氢化的天然大豆卵磷脂衍生物；

其中，所述制剂还包含适于肺部递送的赋形剂，该赋形剂包含乙酸钠，和，等张缓冲剂；

其中，90％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后，提供0.5％-10％/小时的环丙沙星释放速率；

其中，95％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后，提供1％-8％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述脂质体以29.4比70.6的比例包含胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)，并且是单层的，并且其中，98％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且提供2％-6％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述脂质体还包含0.1-0.3％的聚山梨醇酯20，和200-400mg/mL的蔗糖。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述气溶胶化和吸入每天重复一次，持续七天或更久的时程。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述气溶胶化和吸入每天重复一次，持续7天到56天的时程。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述制剂包含50mg-500mg的环丙沙星。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述制剂包含75mg-300mg的环丙沙星。

本发明还包括如本文所述的任何方法，其中，所述制剂是雾化的，且包含150mg的环丙沙星。

阅读以下更完整描述的制剂和方法细节，本领域技术人员将明白本发明的这些和其他目的、优点和特征。

附图的简要说明

结合附图，本发明的方面和实施方式将通过如下详细描述来得到最好的理解。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。相反，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图：

图1显示在-50℃冻融之后，环丙沙星的包封率与脂质体中表面活性剂(聚山梨醇酯20)和脂质的比例的关系。研究了九种制剂，其具有不同的蔗糖与脂质比例(2:1、3:1和4:1)和三种浓度的环丙沙星(10、12.5和15mg/mL)。在冻融之后似乎能够达到一个药物包封百分比的范围。因此，基于对表面活性剂、表面活性剂浓度、脂质体中表面活性剂与脂质的比例、药物浓度、糖的选择、糖浓度、和所述脂质体中糖与脂质的比例的选择，可对所述制剂设计所需的％包封率。

图2与图1相类似，不同之处在于，该图是各制剂在融化之前保持冷冻6周之后所得。研究了九种制剂，其具有不同的蔗糖与脂质比例(2:1、3:1和4:1)和三种浓度的环丙沙星(10、12.5和15mg/mL)。在冻融之后似乎能够达到一个药物包封百分比的范围。因此，基于对表面活性剂、表面活性剂浓度、脂质体中表面活性剂与脂质的比例、药物浓度、糖的选择、糖浓度、和所述脂质体中糖与脂质的比例的选择，可对所述制剂设计所需的％包封率。

图3是cryoTEM显微照片，显示冻融后，所述脂质体中存在环丙沙星纳米晶体。比例尺为100nm。所述制剂为：12.5mg/mL脂质体环丙沙星，其包含67.5mg/mL蔗糖和0.1％聚山梨醇酯20。脂质含量是约22.5mg/mL，隐含蔗糖与脂质的比例是约3:1(以重量计)。cryoTEM通过如下方式进行：将样品从12.5mg/mL环丙沙星稀释至5mg/mL，然后将该样品冷冻在液态乙烷中，并玻璃化。

图4是冻融之前的，相同脂质体制剂的cryoTEM显微照片，显示脂质体中不存在纳米晶体或沉淀的药物。方法如图3中所述。

图5-图9显示包封的环丙沙星从特定脂质体制剂释放的体外释放(IVR)速率概况。IVR方法如Cipolla等(2014)中所述。

图10-12显示冻融后的CFI制剂的cryoTEM图像。

图13显示冻融后和采用PARI eFlow雾化器进行后续网格雾化的图11中的CFI制剂的cryoTEM图像。

发明详述

在描述本发明的配制环丙沙星包封的脂质体和递送所述脂质体来预防和/或治疗囊性纤维化和其它医学病症的方法，和与所述方法联用的装置和制剂之前，应理解，本发明不限于所述的具体方法、装置和制剂，因为，显见地，所述方法、装置和制剂可以变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的各较小范围。所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上限、下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围，以设定范围内任何限值的明确排除为准。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“一种制剂”则包括多种这样的制剂，且提到“所述方法”则包括本领域技术人员已知的一种或多种方法及其等同物等等。

提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。

本文中所用的抗感染剂指：具有抵抗感染，例如细菌、病毒、真菌、分枝杆菌，或原生动物感染的作用的物质。

本发明涵盖的抗感染剂包括但不限于：喹诺酮(例如萘啶酸、西诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等)、磺胺类(例如，磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、硫代异噁唑、磺乙酰胺等)、氨基糖甙类(例如，链霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素等)、四环素(例如氯四环素、氧四环素、甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺四环素等)、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶(例如，甲氧苄氨嘧啶，常与磺胺甲恶唑联用、吡嗪酰胺等)、青霉素(例如，青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林、巴氨西林、羧苄青霉素、卡茚西林、羟基噻吩青霉素、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林等)、青霉素酶抗性青霉素(例如，甲氧西林、苯甲异噁唑青霉素、氯洒西林、双氯青霉素、萘夫西林等)，第一代头孢菌素(例如，头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉啶、先锋霉素、头孢匹林、头孢唑啉等)、第二代头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢羟唑、头孢尼西、头孢西丁、头孢替坦、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢美唑、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢雷特等)、第三代头孢菌素(例如，头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢布坦等)、其它β-内酰胺类(例如，亚胺培南、美罗培南、氨曲南、克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等)、β-内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸)、氯霉素、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、多粘菌素(例如，多粘菌素A、B、C、D、E.亚类.1(粘菌素A)，或E.亚类.2、粘菌素B或C等)粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜(例如，氨苯砜、阿地砜钠等)、氯法齐明、萨力多胺，或可被脂质包封的任何其它抗细菌剂。抗感染剂可包括抗真菌剂，包括多烯抗真菌剂(例如，两性霉素B、制真菌素、游霉素等)、氟胞嘧啶、咪唑类(例如，咪康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑等)、三唑类(例如，依曲康唑、氟康唑等)、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬，或可被脂质包封或复合的任何其它抗真菌剂，及其药学上可接受的盐，及其组合。讨论和实施例主要涉及环丙沙星，但不意在将本发明的范围限于该抗感染剂。可以使用药物的组合。

生物膜是任何微生物的组，其中，细胞在某一表面上彼此粘连。这些贴壁细胞常常包埋在胞外聚合物质(EPS)的自产基质中。生物膜胞外聚合物质，其也称作粘菌(slime)(尽管并不是被称为粘菌的所有物质都是生物膜)，是一种聚合聚集物，其一般包含胞外DNA、蛋白质和多糖。生物膜可在活体(living)或非活体(non-living)表面上形成，并且可普遍出现于自然环境、工业或医院设施上。在生物膜中生长的微生物细胞与相同生物体的浮游细胞(planktonic cell)存在生理学差异，其不同的是，浮游细胞是可以在液体介质中飘浮或游动的单个细胞。

已发现，身体中的许多微生物感染均涉及生物膜，估计占全部感染的80％。其中可能牵涉生物膜的感染性过程包括一些常见问题，例如尿道感染、导尿管感染、中耳感染、牙菌斑形成、齿龈炎、被覆隐形眼镜，和较不常见但更致命的过程，例如，心内膜炎、囊性纤维化中的感染，和永久留置装置(例如人工关节和心脏瓣膜)中的感染。更近期地，注意到，细菌的生物膜可能会损害皮肤创伤的愈合，并且降低感染皮肤创伤的愈合或治疗中的局部抗细菌功效。

本发明涵盖的支气管扩张剂包括但不限于β₂-肾上腺素受体激动剂(例如沙丁胺醇、班布特罗、沙丁胺醇、沙美特罗、福莫特罗、福莫特罗、左旋沙丁胺醇、丙卡特罗、茚达特罗、卡莫特罗、米维特罗、普卡特罗、特布他林等)，和抗毒蕈碱剂(例如曲司氯胺、异丙托铵、格隆铵、阿地铵等)。可以使用药物的组合。

本发明的抗炎剂包括但不限于，吸入型皮质类固醇(例如倍氯米松、布地奈德、环索奈德、氟替卡松、艾泼诺酯、莫米松等)，三烯受体拮抗剂和白三烯合成抑制剂(例如孟鲁司特、齐留通、异丁司特、扎鲁司特、普鲁司特、阿美卢班、替鲁斯特(tipelukast)等)，环氧酶抑制剂(例如布洛芬、酪洛芬、酮咯酸、吲哚美辛、萘普生、扎托布洛芬、氯诺昔康、美洛昔康、塞来昔布、罗美昔布、依托考昔、吡罗昔康、安吡昔康、辛诺昔康、双氯芬酸、联苯乙酸、氯诺昔康、美沙拉秦、三氟醋铆酸、替诺立定、艾拉莫德、帕米格雷等)。可以使用药物的组合。

本文中所用的“制剂”指：干粉形式或悬浮或溶解于液体中的形式的，脂质体-包封的抗感染剂，其中，伴随任何赋形剂或其它活性成分。

术语“对象”、“个体”、“患者”和“宿主”在本文中可互换使用，并且指任何脊椎动物，具体地是任何哺乳动物，且最具体地，包括人类对象、农场动物，和哺乳动物宠物。所述对象可以但不必处于医疗保健专业人员(例如，医生)的护理之下。

“稳定的”制剂是，在储存和暴露至相对高的温度之后，其中的蛋白质或酶基本保持它们的物理和化学稳定性和完整性的制剂。用于检测肽稳定性的多种分析技术是本领域可获得的，并且在如下文献中有综述：《肽与蛋白质药物递送》(Peptide and Protein DrugDelivery)，247-301，Vincent Lee编，纽约州纽约的马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)出版(1991)，和Jones,A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90。可以在所选温度下储存所选时间，以测定稳定性。

可被治疗的“哺乳动物”是指可被分类为哺乳动物的任何动物，其中包括人、家畜、以及动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。

“紊乱”是，能够从采用本文所述的方法和组合物的治疗受益的状况。

聚山梨醇酯20是表面活性剂并且一些常见商品名称包括Alkest TW 20和吐温20。从化学角度来看，它是聚山梨醇酯表面活性剂，它的稳定性和相对的无毒性质允许它被用于药学应用。它是去水山梨糖醇月桂酸酯的聚氧乙基衍生物，并且与聚山梨醇酯范围内的其它成员的区分点在于脂肪酸酯部分和聚氧乙烯链的长度。

BRIJ 30是表面活性剂。从化学角度来看，它是聚氧乙烯化的直链醇，其平均分子量为362。其实验式为

C₁₂H₂₅(OCH₂CH₂)₄OH。

发明通述

环丙沙星是成熟建立且广泛使用的广谱氟喹诺酮抗生素，其指示用于治疗因铜绿假单胞菌所致的下呼吸道感染，其在患有囊性纤维化的患者中常见。吸入型抗微生物剂的主要益处在于，它们将抗生素递送靶向主要感染区域，并且避免GI相关的副作用；然而，药物的较差溶解性和苦味限制了适用于吸入的制剂的开发。此外，环丙沙星的快速组织分布意味着肺部中的较短药物停留时间，因此限制了口服或静脉药物给予的治疗益处。可被冷冻并在融化之后提供改性的二相释放概况的脂质体包封的环丙沙星制剂，通过改善的生物药学特征和机理(例如改变的药物PK和生物分布、从运载体持续的药物释放、向疾病位置增强的递送，和保护活性药物物质不被降解)，将会降低限制并改善对CF患者中因绿脓假单胞菌肺部感染所致的肺部感染的控制。

本发明包括将环丙沙星(或不同的免疫钝化剂；例如，希舒美)与其它药物组合的制剂；例如，脂质体环丙沙星，其通过吸入途径递送。所述脂质体包封的环丙沙星可用除环丙沙星以外的抗生素取代，并且可不采用脂质体配制。其它药物不必是抗生素，并且可以是据信在递送至肺时具有一些有益性质的任何药物。这些药物中的一种或多种也在冻融过程中形成脂质体包封的纳米晶体。

本发明不限于治疗患有PA或NTM肺部感染的患者，还包括其它胞内感染和一般肺部感染，包括CF患者。事实上，有许多患者和适应症可受益于该治疗，包括非CF支气管扩张、肺炎，和其它肺部感染。该治疗模式也将施用于其它肺部疾病，包括COPD、哮喘、肺动脉高压等，其中游离和包封的环丙沙星的制剂与其它药物联合递送，以允许较高剂量地给予其它药物或较安全地给予其它药物。

本发明还涉及吸入型游离环丙沙星(或不同的免疫钝化剂；例如，希舒美)联合通过吸入给予的其它药物的应用。这些其它药物可包括核苷酸(DNA、RNA、siRNA)、减小粘液的粘弹力的酶，例如DNA酶和其它粘痰溶解剂、上调氯离子通道或增加跨细胞离子流的化学品、尼古丁、P2Y2激动剂、弹性蛋白酶抑制剂包括Α-1抗胰蛋白酶(AAT)、N-乙酰半胱氨酸、抗生素和阳离子肽，例如羊毛硫氨酸抗生素，且具体地是耐久霉素、短效支气管扩张剂(例如，β2-肾上腺素受体激动剂如沙丁胺醇或茚达特罗)、M3毒蕈硷拮抗剂(例如，异丙托溴铵)、K+-通道开放剂、长效支气管扩张剂(例如，福莫特罗、沙美特罗)、类固醇(例如，布地奈德、氟替卡松、去炎松、倍氯米松、环索奈德等)、黄嘌呤、白三烯拮抗剂(例如，孟鲁司特钠)、磷酸二酯酶4抑制剂、腺苷受体拮抗剂、其它混杂抗炎性(例如，Syk激酶抑制剂(AVE-0950)、类胰蛋白酶抑制剂(AVE-8923和AVE-5638)、速激肽拮抗剂(AVE-5883)、诱导型一氧化氮合成酶抑制剂(GW-274150)等)、转录因子诱饵、TLR-9激动剂、反义寡核苷酸、siRNA、DNA、CGRP、利多卡因、反β2-激动剂、抗感染性氧化剂疗法、细胞因子调节剂(例如，CCR3受体拮抗剂(GSK-766994、DPC-168、AZD-3778)、TNF-α生成抑制剂(LMP-160和YS-TH2)，和IL-4拮抗剂(AVE-0309))、IgE小分子抑制剂、细胞粘附分子(CAM)抑制剂、靶向VLA4受体或整合素α4β1的小分子(例如，R-411、PS-460644、DW-908e和CDP-323)、免疫调节剂包括通过抑制钙调磷酸酶阻断T细胞信号转导的那些(他克莫司)、肝素中和剂(Talactoferrin Alfa)、胞浆PLA2抑制剂(艾非拉地)，或其组合。组合产品的递送可通过如下方式来实现：将药物并入一种稳定制剂，或在分开的容器中提供所述药物(其在给予时合并)，或者依次递送所述产品。

本发明的组合物可由脂质体的液体制剂制备，其包含多元醇和表面活性剂。所述成分可，例如，对生物活性物质提供保护，为组合物提供结构稳定性、增强的溶解性，和其它所需的特点。组合物的多元醇在所述液体制剂中存在的量可以是约1重量％～至多至40重量％，或约5重量％～约20重量％。“多元醇”是具有多个羟基的物质，且包括糖(还原糖和非还原糖)、糖醇和糖酸。本文优选的多元醇的分子量小于约600kDa(例如在约120-400kDa的范围)。“还原糖”是含有半缩醛基团的多元醇，该基团可还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其它氨基发生共价反应。“非还原糖”是不具有还原糖的这些特性的糖。还原糖的例子是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括，例如，蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油是糖醇的例子。糖酸包括L-葡糖酸和其金属盐。所述多元醇可包括例如，蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨醇、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、L-葡糖酸、和/或此类类似物质。

所述组合物中的表面活性剂可以约0.01重量％～约2重量％范围的量存在于所述液体制剂中。表面活性剂可包括例如，非离子型去污剂，如聚乙二醇去水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80或聚山梨醇酯80)、BRIJ 30、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(普流罗尼克)等等。表面活性剂还可包括烷基苯基烷氧基化物、醇烷氧基化物、脂肪胺烷氧基化物、聚氧化乙烯甘油脂肪酸酯、蓖麻油烷氧基化物、脂肪酸烷氧基化物、脂肪酸酰胺烷氧基化物、脂肪酸聚二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚乙二醇酯、异十三烷醇、脂肪酸酰胺、甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油类、烷基多苷、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇烷基醚、聚丙二醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物、聚丙烯酸酯、丙烯酸接枝共聚物、烷基芳基磺酸盐或酯、苯基磺酸盐或酯、烷基硫酸盐或酯、烷基磺酸盐或酯、烷基醚硫酸盐或酯、烷基芳基醚硫酸盐或酯、烷基聚乙二醇醚磷酸盐或酯、聚芳基苯基醚磷酸盐或酯、烷基磺基琥珀酸盐或酯、烯烃磺酸盐或酯、石蜡磺酸盐或酯、石油磺酸盐或酯、牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木质素磺酸、磺化萘浓缩物、木质素-亚硫酸盐废液、烷基磷酸盐或酯、季铵化合物、胺氧化物、甜菜碱，和/或此类类似物质。

所述组合物可包括其它成分，例如pH缓冲剂、其它药物，和其它赋形剂。所述组合物的缓冲剂可包括，例如，磷酸钾、磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、磷酸盐、咪唑、琥珀酸钠、碳酸氢铵，和/或碳酸盐，以保持pH在约pH 3～约pH 8，或约pH 4～pH 6或pH 5左右。

本发明包括治疗方法，其中，本发明的制剂通过任何已知给药途径(例如，注射、吸入、鼻部给予、口服和静脉输注)来给予。尽管优选的给药方法是通过吸入，其中，本发明特别适合用于治疗肺中的生物膜形式的感染。本发明的制剂特别适于根除因多种原因以生物膜形式在肺中形成的感染。首先，本发明的脂质体特别耐受气溶胶化之后的破裂，其中，90％或更多、95％或更多、98％或更多的脂质体保持其结构完整性，由此，在通过喷雾器或移动通过多孔膜的孔而经气溶胶化之后，药物制剂保持装载于脂质体中。在所述制剂到达肺部组织之后，于相对较低的pH(例如，6.5或更小、6.0或更小、5.5或更小、5.0或更小)溶解于溶剂运载体(其可以是水性运载体)中的药物提供立即释放且与细菌接触。之后，脂质体溶解或其双层变得更具透过性，并且提供包封在脂质体内的制剂的释放。之后，纳米晶体缓慢溶解。因此，本发明的制剂可以一天一次为基础进行递送，并且提供用于药物(例如，环丙沙星)在一段较长时间内的控释。

由于多种因素，生物膜难以通过抗生素根除。首先，它们通常被致密表多糖基质围绕，该基质会抑制一些抗生素(包括氨基糖甙类作为一类)扩散进入生物膜。第二，快速生长的细菌细胞的外层也“保护”处于生物膜内部的细胞不与抗生素接触。第三，生物膜内部的细胞缺乏氧气，从而是生长缓慢或静止的，因此本质上对抗生素接触较不敏感。最后，有证据显示，存在顽固得难以杀灭的“持留(persister)”细胞，并且也可能存在其它未知的抗性机理。

I.包含环丙沙星纳米晶体的脂质体的生成

大多数脂质体制剂对于冷冻不稳定。随着瓶装制剂经历低于冻结的温度，与冰冷表面(例如，通常是瓶底或瓶壁)接触的水将优先开始冻结，形成水晶体，导致所述制剂中的赋形剂和其它组分在剩余液体体积中变得更加浓缩。随着时间推移，所有液体将最终被冻结，但已知该浓缩效应会降低许多产品的稳定性。pH在冷冻过程中和冷冻态下也会变化，从而这也会影响制剂的稳定性。最后，冷冻过程本身可能会影响超分子磷脂组装。脂质体尤其对冷冻过程不稳定，因为水同时存在于脂质双层的内部和外部。脂质双层可与水分子形成氢键。随着水晶体形成，它们可能会造成脂质体囊泡破裂。融化之后，脂质成分将不再重新形成囊泡，而是保持在沉淀或聚结状态。

冻干或喷雾干燥可能会造成在干燥和再水合过程中的脂质体融合以及相分离。糖的添加癌，例如，蔗糖和海藻糖，能够使一些脂质体制剂在冷冻-干燥或喷雾干燥过程中稳定，在其过程中，水分别通过升华或蒸发而被移除。通过向溶液添加大容量(bulk)以防止囊泡之间产生直接接触并减小囊泡的移动性，通过将膜维持在柔性状态，冷冻/冻干保护剂限制了冷冻-干燥和再水合过程中由冰晶造成的脂质双层的机械损伤和破裂。糖分子可与脂质体形成氢键，因此“替代”了脂质体周围的水分子。初始实验显示，添加糖不使脂质体制剂对冷冻-干燥或喷雾-干燥稳定。然而，进一步实验显示，糖与表面活性剂(在该情况中，聚山梨醇酯20)的不同组合使脂质体对冷冻稳定。融化之后，制剂保持澄清，其中对于特定添加的聚山梨醇酯20浓度，平均囊泡大小出现了仅数纳米的较小变化。冻融后，当采用糖和表面活性剂以特定模式配制时，单层囊泡没有形成多层囊泡。这与较大的300-700nm多层囊泡不同，其在冻融后，在仅向供于吸入(CFI)制剂的脂质体环丙沙星添加糖的一些情况中形成：囊泡中的许多失稳，以至于它们形成聚集物并从溶液沉淀出来。

惊人的是，我们发现，向CFI药物产物添加蔗糖和聚山梨醇酯20的组合获得了这样的制剂，其可被冷冻且在融化后维持其超分子脂质体结构，其中囊泡大小分布以及大部分包封的药物的保留方面的变化很小。单独添加表面活性剂，不添加蔗糖或其它糖，没有使脂质体在冻融后保持其结构。其它冷冻保护剂，包括糖(例如海藻糖)，也可与吐温20联用。已证明海藻糖具有该功效。本发明不限于吐温20作为具有该能力的唯一表面活性剂，本文中采用吐温20只是为了作为本发明的一个示例。

本发明另一个新方面是，所述制剂中糖和表面活性剂的特定浓度将决定冻融后从脂质体释放多少游离药物(图1)。对于那些赋形剂浓度的恰当选择将允在最终瓶中生成许多种包封药物和游离药物。一种实施方式是产生稳定的冷冻制剂，其在融化后与现有制剂的组分和具体性质相匹配，例如约30％游离环丙沙星和70％脂质体包封的环丙沙星的混合物这能够通过添加约0.1～0.3％吐温20和200～400mg/mL蔗糖来实现。

一项长期稳定性研究显示，保持瓶在融化之前冷冻6周获得了与立即冻融相似比例的游离和包封的药物(图2)。因此，本发明的另一个方面是储存脂质体药物产品多年并减少脂质降解和物理不稳定性的可能。

惊人的是，我们还发现，对于蔗糖和表面活性剂的特定组合，能够在脂质体内部产生药物纳米晶体。如果糖浓度足够高以防止冻融后脂质体破坏和/或聚集，则能够在囊泡内部形成环丙沙星的纳米晶体，其使囊泡失去其圆形形状并形成椭圆形状。纳米晶体长度可在100nm级别，并且在脂质体囊泡内部形成(图3)。脂质体中的一些可能会损失一些或其全部包封的药物含量，游离药物的量取决于添加的表面活性剂的量。图3显示不包含纳米晶体的脂质体的存在，并且其在密度上较轻，这与已经损失了一些或全部其所包封的药物相一致。相同制剂在冻融前的cryoTEM显微照片指示，不存在纳米晶体的情况(图4)，并且脂质体具有较暗阴影，表明其中存在药物。这些图像证实，纳米晶体响应冻融而产生。

根据本发明的一些方面，提供一种配制环丙沙星和其它抗感染剂的方法，所述方法通过将这些药物包封在脂质体中来进行。由生物相容性且生物可降解的天然产生的材料组成，脂质体用于包封生物活性材料用于多种目的。具有多种层、尺寸、表面电荷和组分，已开发出用于脂质体制备和在其中包封药物的多种方法，所述方法中的一些已被扩大规模至工业水平。可设计脂质体作为持续释放药物的仓库，并且，在某些应用中，协助药物跨过细胞膜。

脂质体的持续释放性质可通过脂质膜的性质来调节，也可通过在脂质体组分中纳入其它赋形剂来调节。药物释放速率主要受控于磷脂性质变化，例如氢化的(--H)或未氢化的(--G)，或磷脂/胆固醇比例(该比例越高，释放速率越快)，活性成分的亲水性/亲脂性性质，和脂质体制造的方法。本发明的关键方面是：药物释放速率也可受控于脂质体内纳米晶体的形成，并且，更具体地，受控于通过采用特定制剂工具和赋形剂的冻融过程的形成。

II.含有环丙沙星的脂质体的药物制剂

在一个优选的实施方式中，脂质体包封的环丙沙星在气溶胶吸入装置中给予患者，但可通过静脉途径，通过注射或其它递送途径给予。在一些实施方式中，环丙沙星被包封在脂质体中，联合同样被包封的其它药物。在一些实施方式中，环丙沙星被包封在脂质体中，联合未被包封的其它药物。在一些实施方式中，脂质体联合未被包封的环丙沙星，伴随未经包封的药物，或其各种组合被给予。

无关所述药物制剂的形式，优选产生约0.5μm～12μm，优选1μm～6μm，且更优选约2～4μm的供于吸入的液滴或颗粒。通过产生具有相对较窄的尺寸范围的吸入的颗粒，能够进一步提高药物递送系统的效率，并改善给药的可重复性。因此，优选所述颗粒不仅具有0.5μm～12μm或2μm～6μm或约3～4μm范围内的尺寸，而且还具有窄范围内的平均粒径，从而递送至患者的80％或更多的颗粒具有平均粒径±20％之内的粒径，优选平均粒径±10％且更优选±5％。

本发明的制剂可采用一次性包装和便携式、手持式、电池供电装置，例如AERx装置(美国专利号5,823,178，加利福尼亚州海沃德阿拉迪姆)给予患者。或者，本发明的制剂可采用机械(非电子)装置施用。可用于递送所述制剂的其它吸入装置包括传统喷射式喷雾器、超声喷雾器、柔雾吸入器、干粉吸入器(DPI)、定量雾化吸入器(MDI)等系统。优选地，相比初始比例，游离环丙沙星与包封的环丙沙星的比例应在雾化后保持恒定；即，在可能会导致包封的抗生素的一部分的过早释放的雾化过程中应不造成对脂质体的损坏。采用我们的新型制剂观察到的该发现是预料之外的(Niven RW和Schreier H，1990)，但确保吸入该气溶胶的动物或人类将会获得整个肺中沉积的可重复比例的游离药物与包封药物。

气溶胶可通过施加压力使药物通过膜上的孔来产生，所述孔的大小在约0.25-6微米范围内(美国专利5,823,178)。当孔具有该大小时，通过这些孔逸出以产生气溶胶的颗粒将具有0.5-12微米范围内的直径。药物颗粒可以随着意在将所述颗粒保持在该大小范围内的气流中释放。可以通过利用振动装置来促进小颗粒的产生，所述振动装置提供约800-约4000千赫范围内的振动频率。本领域技术人员应理解，可对参数进行一些调节，例如通过其释放药物的孔的大小、振动频率、压强，和基于所述制剂的密度和粘度的其它参数，但应注意，一些实施方式的目标是提供具有约0.5-12微米范围内的直径的气溶胶化的颗粒。

所述脂质体制剂可以是低粘度液体制剂。所述药物单独或联合运载体的粘度应足够低，从而该制剂可受压从开口挤出，以形成气溶胶，例如，采用20-200psi以形成气溶胶，其优选具有约0.5-12微米范围内的粒径。

在一个实施方式中，将低沸点、高挥发性的推进剂与本发明的脂质体和药学上可接受的赋形剂相联合。所述脂质体可以推进剂中的干粉形式或悬液形式提供，或者，在另一个实施方式中，所述脂质体溶解于推进剂中的溶液中。这些制剂均可以容易地包括在容器中，其具有阀作为其唯一开口。因为所述推进剂是高度挥发性的，即，具有低沸点，该容器的内容物将处于压力之下。

根据另一种制剂，含有环丙沙星的脂质体在冻融前以溶液制剂形式提供。在冻融后可能产生包含环丙沙星的脂质体的气溶胶化形式的、具有改性的释放速率、可通过肺内途径被吸入并递送至患者的任何制剂，均可与本发明联用。

III.给药方案

基于上文内容，本领域技术人员应理解，可采用多种不同的治疗和给药手段来治疗单一患者。因此，已接受所述药物(例如，静脉内环丙沙星或抗生素等形式的药物)的患者可通过吸入本发明的制剂而受益。一些患者可通过吸入仅接受包含环丙沙星的脂质体制剂。所述患者可具有囊性纤维化症状，被诊断为具有肺部感染，包括胞内感染，或具有身体状况的一些症状，该症状可通过给予所述患者抗生素(例如，环丙沙星)而受益。本发明的制剂还可用于诊断。在一个实施方式中，例如，患者可接受本发明的制剂的剂量作为进程的部分以诊断肺部感染，其中所述患者的症状中的一种或多种响应所述制剂而改善。

患者通常将接受约0.01-10mg的环丙沙星/kg/天，±20％或±10％的剂量。该剂量通常将通过至少一次，优选数次“气鼓(puff)”从该气溶胶装置给予。每天的总剂量优选以每天至少一次给予，但可分成每天2个或更多个剂量。一些患者可通过如下方式受益：使所述患者在数天或数周的时程中“携载”更高剂量的环丙沙星或者更高给药频率，随后给予减小的或维持的剂量。因为囊性纤维化通常是慢性病症，希望患者在一段延长的时间中接受所述治疗。

先前已显示，在土拉弗朗西斯菌小鼠模型中，脂质体包封的氟喹诺酮抗生素的吸入可有效治疗肺部感染，并且显示优于游离的或未包封的氟喹诺酮(CA 2,215,716，CA 2,174,803和CA 2,101,241)。然而，作者们并未预期冷冻脂质体制剂和冻融后提供改性的释放概况的潜在益处，尤其是脂质体中存在纳米晶体的情况，其滞缓或改性包封的药物的释放。根据本发明的一个方面，即刻递送高浓度的抗生素，同时也提供治疗剂在数小时或一天过程中的持续的释放。

因此，如上所述，本发明一些方面的制剂包括游离的或非包封的环丙沙星与脂质体包封的环丙沙星的组合。所述制剂可提供即刻益处，其中游离的环丙沙星导致细菌集落或生物膜周围的肺部液体中的抗生素浓度的快速增加，并降低所述细菌的活力，随后的来自包封的环丙沙星的持续的益处继续杀灭细菌或降低其再生的能力，或降低产生抗生素抗性集落的可能性。本领域技术人员应理解，本发明的制剂在治疗因患者而异的医学病症方面的相对优势。

IV.联合治疗

本发明的脂质体制剂可与如上所述的其它药物同时给予。例如，本发明的脂质体可伴随如下药物使用，例如DNA酶、粘痰溶解剂、上调氯离子通道或增加跨过细胞上皮表面的离子流的化学品、支气管扩张剂、类固醇、P2Y2激动剂、弹性蛋白酶抑制剂例如Α-1抗胰蛋白酶(AAT)、N-乙酰半胱氨酸、增强抗生素抵抗生物膜细菌的活性的物质例如水杨酸钠、干扰素γ、干扰素α，或选自下组的氟喹诺酮：氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、伊洛沙星、洛美沙星、米洛沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、罗索沙新、芦氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、替马沙星和妥舒沙星，或选自下组的抗生素：妥布霉素、粘菌素、阿奇霉素、阿米卡星、头孢克洛(Ceclor)、氨曲南、阿莫西林、头孢他啶、头孢氨苄(Keflex)、庆大霉素、万古霉素、亚胺培南、多利培南、哌拉西林、米诺环素，或红霉素。

前述内容只是说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计各种安排，虽然本文没有明确描述或显示这些安排，但它们均体现本发明的原理并包含在本发明构思和范围内。而且，本文所述的所有实施例和条件语言主要旨在辅助读者理解本发明的原理和本发明对发展现有技术作出的贡献，且不对这些具体引用的实施例和条件构成限制。而且，本文有关本发明原理、方面、实施方式以及具体实施例的所有陈述都应包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物应包括目前已知的等同物和将来开发的等同物，即新开发的具有相同功能的任何元件，无论其是何种结构。因此，本发明的范围不限于本文所示和所述的示例性实施方式。适当的是，本发明的范围和构思由所附权利要求书限定。

V.治疗方法

至此，我们主要讨论了本发明治疗囊性纤维化和非CF支气管扩张患者，和以及具有NTM感染的那些中的感染的应用。然而，本领域技术人员应显见，本发明具有那些模式以外的应用和优势。该治疗方法可应用于涉及鼻部通道、气道、内耳或肺的感染的其它疾病状态，包括但不限于：支气管扩张，肺结核，肺炎；包括但不限于呼吸机相关的肺炎、社区获得型肺炎、支气管肺炎、肺叶性肺炎；如下因素所致的感染：肺炎链球菌、衣原体、支原体肺炎、葡萄状球菌、其中可产生感染的预防性治疗或预防(例如，插管或通风患者)、肺移植患者中的感染、支气管炎、百日咳(哮咳)、内耳感染、咽部链球菌感染、吸入炭疽、兔热病，或窦炎。

实验部分

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不表示下述实验是所实施的仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

实施例1

将环丙沙星(50mg/mL)包封进入脂质体，所述脂质体由氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)(70.6mg/mL)(一种半合成的完全氢化的天然大豆卵磷脂衍生物(SPC))，和胆固醇(29.4mg/mL)组成。脂质组成双层，平均粒径为75～120nm。无菌悬液悬浮于等张缓冲液(25mM组氨酸、145mM NaCl，pH 6.0，300mOsm/kg)中。这些脂质体环丙沙星制剂包含约1％的未包封的环丙沙星，并且可以气溶胶形式，例如通过雾化，给予患者。脂质体环丙沙星也可与游离环丙沙星，以20mg/mL，在乙酸钠缓冲液中组合，并作为气溶胶给予患者。

实施例2

脂质体环丙沙星(CFI)的制剂采用批次ARA048、ARA51和ARA52以50mg/mL制备。12.5mg/mL的CFI制剂通过如下方式制备：用0.5mL的180mg/mL蔗糖，用0.1mL的1％聚山梨醇酯20、0.1mL的pH 4乙酸盐缓冲液，和0.05mL的水稀释0.25mL的50mg/mL CFI，至约pH 5下0.1％聚山梨醇酯20、90mg/mL蔗糖中12.5mg/mL CFI的终浓度。

将这些制剂各一瓶冷冻(在液氮中)，然后融化以形成脂质体内的纳米晶体。CFI样品中的包封率百分比通过检测游离药物和总药物来确定。游离药物为约1～约2mg/mL，其表示10～18％的游离药物。因此，包封率百分比在82～90％范围内。

表1：游离药物和包封率百分比：

将这些样品的体外释放概况与对照CFI样品做比较，该对照CFI样品未经冷冻，因此不包含纳米晶体。全部CFI样品被稀释(12μL@12.5mg/mL)到3.0mL HEPES缓冲盐水(HBS)中至0.05mg/mL CFI的终浓度。将胎牛血清(Hyclone Serum)，批次#AWC99946，目录号#SH30075.03，(容器混合物)保质期至2016年3月(3.0mL)添加至稀释的CFI，并且在混合后，将管贮存在冰水中以阻止释放的起始(0.025mg/mL CFI)。对于各制剂，从瓶转移0.5mL等份至10个独立的HPLC瓶。重复的瓶代表各时间点。排除各制剂的两个T＝0瓶，将8x5＝40个剩余的瓶置于37℃振荡水浴中。起始定时器。30、60、120和240分钟后，对各制剂移出重复的瓶，并将其置入冰水浴以终止反应。向含有0.5mL样品的各瓶添加0.5mL HBS缓冲液，并混合内含物(0.0125mg/mL CFI)。将400μL等份转移至离心滤器，并以10,000rcf离心10分钟。将滤出物转移至HPLC瓶，以通过HPLC检测游离药物。

冻融后，来自CFI制剂的释放与环丙沙星纳米晶体的形成相一致，其相较于对照CFI延缓了释放概况(图5)。T＝0释放表示体外释放之前包封的药物的量，其对于对照CFI是低于1％，而对于纳米晶体制剂是6～9％。在该试验的4小时时程中，全部样品最终释放接近至其包封的药物的100％。然而，对照CFI的释放速率较快，其在50分钟后释放接近65％，相比之下，冻融后纳米晶体的样品仅释放40％。

实施例3

对来自与实施例2所述相同的方式制备的批次ARA051的CFI样品重复IVR实验，结果示于图6。在该情况中，报告了CFI样品在冻融前和冻融后的体外释放概况。冻融前，CFI样品与对照CFI相似，而冻融后，T＝0释放从1％增加至约12％，但从该点处开始的延迟释放概况与环丙沙星纳米晶体的存在相一致。

实施例4

在该实验中，采用两个批次的CFI，其包含脂质体内蔗糖和脂质体外蔗糖。一个批次的50mg/mL CFI，ARA054-01，内部具有50mM蔗糖(约17.1mg/mL)，而第二批次，ARA054-02，内部具有150mM蔗糖(约51.3mg/mL)。两者均在25mM组氨酸和300mM蔗糖(约102.6mg/mL)(脂质体外)pH 6.0中配制。所述批次物通过添加0.25mL至0.5mL水和0.25mL 180mg/mL蔗糖稀释4倍，以外部蔗糖浓度为约70.7mg/mL为结束。所述制剂均不含任何表面活性剂。制备重复的瓶，并且各制剂的一个瓶在液氮中冷冻，然后融化，以观察该制剂能否耐受冻融过程，以及基于较慢IVR概况是否能归咎于环丙沙星纳米晶体的存在。也使用对照CFI批次0060。

如实施例2所述进行IVR试验，且数据示于图7。在IVR试验中，冻融前，对照CFI样品与两种制剂相当。在不存在表面活性剂的情况中，冻融后，T＝0的释放量相对不变，其中，接近99％被包封。孵育50分钟之后，对照样品具有约60～70％的释放，相比之下，批次ARA054-01和ARA054-02冻融后分别是30％和40％释放。两个特征均与造成延迟释放概况的环丙沙星纳米晶体的形成相一致。批次ARA054-01相比批次ARA054-02具有较慢的释放速率，表明相比具有较高内部蔗糖的批次，具有较低内部蔗糖的脂质体中的纳米晶体具有较慢的释放。

实施例5

在该实验中，采用一个批次的CFI，其仅在脂质体外空间中包含90mg/mL蔗糖。没有向脂质体添加表面活性剂。制备重复的瓶。一瓶在液氮中冷冻，然后融化。另一瓶不冷冻，且用作对照。

如实施例2所述进行IVR试验，且数据示于图8。在IVR试验中，对照CFI样品与先前的IVR试验(实施例2-4)中的对照CFI制剂相当。在不存在表面活性剂的情况中，冻融后，T＝0的释放量不变，其中，接近99％维持被包封。孵育50分钟后，对照样品具有约70％的释放，相比之下，冻融后样品具有30％释放。冻融后的CFI样品的IVR概况与造成延迟释放概况的环丙沙星纳米晶体的形成相一致。

实施例6

在该实验中，采用一个批次的CFI，其仅在脂质体外空间中包含90mg/mL蔗糖。作为聚山梨醇酯20的替代，向脂质体添加不同浓度的BRIJ 30(0.01％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％)。各制剂的一瓶在液氮中冷冻，然后融化。不含BRIJ30且不接触冻融的CFI用作对照。

如实施例2所述进行IVR试验，且数据示于图9。在IVR试验中，对照CFI样品与先前的IVR试验(实施例2-5)中的对照CFI制剂相当。在表面活性剂存在下，T＝0时的释放量随着表面活性剂的量的增加而增加。孵育50分钟后，对照样品具有约70％的释放，相比之下，包含BRIJ 30的样品冻融后具有30～60％的释放。冻融后的CFI样品的IVR概况与造成延迟释放概况的环丙沙星纳米晶体的形成相一致。

实施例7

在该实验中，对冻融后的12.5mg/mL脂质体环丙沙星制剂拍摄cryoTEM图像，该制剂包含90mg/mL蔗糖和0.05％聚山梨醇酯20(图10)，0.1％聚山梨醇酯20(图11)，或0.2％聚山梨醇酯20(图12)。冻融后，包含0.1％聚山梨醇酯20的CFI制剂采用PARI eFlow网格雾化器雾化，并且收集的气溶胶也用CryoTEM成像来分析(图13)。脂质含量是约22.5mg/mL，隐含蔗糖与脂质的比例是约4:1(以重量计)。cryoTEM通过如下方式进行：将样品从12.5mg/mL环丙沙星稀释至5mg/mL，然后将该样品冷冻在液态乙烷中，并玻璃化。具有最少聚山梨醇酯20的样品(图10)具有较多含较长纳米晶体的伸长的脂质体，而具有0.1％聚山梨醇酯20的样品(图11)具有较多含较短纳米晶体的圆形脂质体，并且似乎在网格雾化之后未变化(图13)。具有0.2％聚山梨醇酯20的样品具有更多‘空’脂质体，这与更多包封药物的释放相一致，因此增加了立即释放药物的部分。

本文中，本发明以认为是最实用且优选的实施方式的方式显示并描述。然而，应理解锇，本领域技术人员在阅读了该公开内容之后能够做出偏离上述具体实例但仍在本发明范围内的明显修改。

虽然参考具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。

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Claims (15)

1.一种制剂，所述制剂包含：

脂质体，其中所述脂质体包含：

脂质双层；和

冷冻保护剂；

药学活性药物的纳米晶体，其被所述脂质双层围绕，其中，所述纳米晶体的尺寸是200nm或更小。

2.如权利要求1所述的制剂，其还包含：

表面活性剂；并且

其中，所述冷冻保护剂是多元醇。

3.如权利要求2所述的制剂，其中，所述多元醇选自下组：海藻糖和蔗糖；并且

其中，所述表面活性剂是非离子型去污剂。

4.如权利要求1-3中任一项所述的制剂，其还包含：

药学上可接受的运载体。

5.如权利要求4所述的制剂，其还包含：

溶解于所述运载体中的药学活性药物。

6.如权利要求1-3中任一项所述的制剂，其还包含：

液体形式的药学活性药物，其中，分散有所述脂质体。

7.如权利要求1-6中任一项所述的制剂，其中，所述药物是抗感染药物。

8.如权利要求7所述的制剂，其中，所述抗感染药物选自下组：喹诺酮、磺胺、氨基糖苷、四环素、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明，萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬及其组合；

其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：脂肪酸；溶血脂质；鞘脂类；鞘磷脂；糖脂(glycolipid)；糖脂(glucolipid)；鞘糖脂；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；载有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；具有醚和酯联脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、心磷脂、磷脂、具有不对称酰基链的合成的磷脂；和具有共价结合的聚合物的脂质；和

其中，所述脂质体包含选自下组的磷脂：磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸，及其混合物；其中，所述磷脂以与改性剂的共混物形式提供，所述改性剂选自下组：胆固醇、十八胺、硬脂酸、生育酚，及其混合物；并且其中，所述脂质体是单层的或多层的。

9.如权利要求1-8中任一项所述的制剂，

其中，所述纳米晶体的尺寸是100纳米或更小；

其中，所述脂质双层包含HSPC和胆固醇；

所述冷冻保护剂选自下组：蔗糖和海藻糖；

所述表面活性剂选自下组：聚山梨醇酯20和BRIJ 30；且

所述药物是环丙沙星。

10.如权利要求1-9中任一项所述的制剂，

其中，脂质体包含以1:10-10:1(w/w)的比例，或优选1:1-5:1(w/w)的比例存在的多元醇和磷脂酰胆碱富含型磷脂；

其中，所述纳米晶体的尺寸是50纳米-75纳米；

其中，所述表面活性剂存在的量是0.01％-1％，或优选0.05％-0.4％；

其中，当经历如下条件时，90％或更多的所述脂质体保持结构完整性：脂质体温度下降至-20℃～-80℃范围内的低温；并且

在所述低温下贮存一周或更久的一段时间；并且

通过将该温度升温至5℃～30℃的温度来融化。

11.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中，所述制剂被气溶胶化成颗粒，所述颗粒的气动直径在1微米-12微米范围内，并且，脂质体的直径在20纳米-1微米范围内，其中，至少90％的所述脂质体包含允许所述脂质体在气溶胶化之后保持结构完整性的组合物。

12.一种通过包括如下步骤的方法生成的脂质体制剂：

提供药学活性药物的溶液；

围绕所述溶液形成球形脂质双层，由此在脂质体中包封溶液；

冷冻所述脂质体；

使所述脂质体保持冷冻一段时间；

将所述脂质体的温度升高至高于所述溶液的凝固点的温度，由此，在其中形成所述药学活性药物的纳米晶体，所述纳米晶体的尺寸是100纳米-50纳米。

13.如权利要求12所述的制剂，其中，冷冻达到-20℃～-80℃的温度，并且所述冷冻维持一周或更久的一段时间，

其中，所述脂质体包含冷冻保护剂和表面活性剂；

其中，所述冷冻保护剂优选是多元醇，

其中，所述多元醇优选选自下组：蔗糖和海藻糖，

其中，所述表面活性剂优选是非离子型去污剂，并且

其中，所述药物优选是抗感染药物。

14.如权利要求13所述的制剂，其中，所述抗感染药物选自下组：喹诺酮、磺胺、氨基糖苷、四环素、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明，萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬及其组合，

其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：脂肪酸；溶血脂质；鞘脂类；鞘磷脂；糖脂(glycolipid)；糖脂(glucolipid)；鞘糖脂；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；载有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；具有醚和酯联脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、心磷脂、磷脂、具有不对称酰基链的合成的磷脂；和，具有共价结合的聚合物的脂质，

其中，所述脂质体包含选自下组的磷脂：磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸，及其混合物；其中，所述磷脂以与改性剂的共混物形式提供，所述改性剂选自下组：胆固醇、十八胺、硬脂酸、生育酚，及其混合物；并且其中，所述脂质体是单层的或多层的。

15.如权利要求12-14中任一项所述的制剂，其中，所述脂质双层包含HSPC和胆固醇；

所述冷冻保护剂选自下组：蔗糖和海藻糖；

所述表面活性剂选自下组：聚山梨醇酯20和BRIJ 30；且

所述药物是环丙沙星。