KR20070089761A

KR20070089761A - 과포화 용액으로 포획된 화합물을 포함하는 리포좀

Info

Publication number: KR20070089761A
Application number: KR1020077018871A
Authority: KR
Inventors: 로버트 엠 애브라; 예허즈켈 바렌홀쯔; 탈 펠레크-슐만
Original assignee: 알자 코포레이션; 이쑴리서치디벨로프먼트컴파니오브더헤브류유니버시티오브예루살렘
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2007-08-31
Also published as: ZA200205468B; NO20023139L; CN1396822A; HUP0400628A3; EP1274399A1; US20010033861A1; JP2003521366A; CN1236760C; KR20030011767A; KR100782891B1; WO2001054666A1; NO20023139D0; ATE292957T1; CA2398514A1; DK1274399T3; EP1274399B1; DE60110057T2; AU3467001A; AU2001234670B2; IL150483A0

Abstract

과포화 용액으로 포획된 화합물을 갖는 리포좀 조성물 및 상기 조성물을 제조하는 방법이 기재된다.

리포좀, 시스플라틴

Description

과포화 용액으로 포획된 화합물을 포함하는 리포좀 {LIPOSOMES CONTAINING AN ENTRAPPED COMPOUND IN SUPERSATURATED SOLUTION}

본 발명은 리포좀 조성물 및 리포좀의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 리포좀은 리포좀의 수성 코어에 과포화 용액인 약물을 포획(entrap)하여, 리포좀에 높은 약물 대 지질비를 제공한다.

리포좀은 포획된 수성 용적물을 포함하는 완전 밀폐된 지질 이중층막이다. 리포좀은 단일판 소포 (단일막 이중층을 보유) 또는 다중판 소포 (각각이 수성층에 의해 다른 것과 분리된 다중막 이중층을 특징으로 하는 양파같은 구조) 일 수 있다. 이중층은 소수성 "꼬리" 영역 및 친수성 "머리" 영역을 갖는 두 개의 지질 단일층으로 구성된다. 막 이중층의 구조는 지질 단일층의 소수성 (비극성) "꼬리" 가 이중층의 중앙을 향하고, 친수성 "머리" 가 수성상을 향한다.

리포좀의 일차적 용도는 약물, 화장품, 진단 시약, 생활성 화합물 등과 같은 다양한 물질의 담체로서 작용하는 것이다. 리포좀 내에 포획된 친수성 제제는 리포좀 구조 내의 수성 공간, 일차적으로 내부 중앙 구획 및 지질 이중층 간의 공간에 회합된다. 친지성 약물은 전형적으로 지질 이중층에 회합된다.

리포좀 약물 제형은 치료 효율을 개선시키며, 약물 방출과 치료 활성을 연장시키고, 치료 비율을 증가시킬 수 있고, 주어진 종류의 병 또는 장애의 치료에 필요한 약물의 총량을 감소시킬 수 있을 것이다. 리뷰를 위해서는 [Liposomes as Drug Carriers, G. Gregoriadis, Wiley & Sons, New-York (1988)] 을 참고한다.

리포좀을 제조하고, 리포좀에 치료 화합물을 로딩하기 위한 다수의 방법이 존재한다. 약물 로딩의 가장 간단한 방법은 수동 포획으로, 건조 지질막을 수용성 약물을 함유하는 수용액으로 수화시켜 리포좀을 형성한다. 기타 수동 포획 방법에는 미리 형성된 리포좀을 약물 수용액에 첨가하고, 혼합물을 다중판의 반복된 냉동 및 해동으로 수화를 개선시켜 로딩을 증가시키는 냉동-해동 가공 방법, 동결건조 또는 증발에 의해 탈수시키는 탈수-재수화 방법이 관련된다.

그러나 일반적으로, 수동 포획은 낮은 약물 포획 효율을 나타낸다. 낮은 약물 대 지질비는 리포좀 제형으로 효과적인 치료를 달성하기에 상당한 단점이 될 수 있다. 예를 들어, 암 조직의 치료에 있어서, 암 조직 내로의 분출을 위해서는 대략 80-140 nm 크기의 리포좀이 필요하다. 특히 약물이 수동 포획되고/되거나, 약물이 제한된 용해도를 갖고/갖거나, 약물이 지질에 대해 낮은 친화도를 갖는 경우, 작은 크기로 약물 로딩이 제한된다. 낮은 약물 대 지질비는 필요한 약물 용량을 얻기 위해 큰 지질 용량의 투여를 필요로 한다.

약물 포획 효율은 부분적으로 높은 지질 농도의 사용 또는 지질 성분의 특정 조합에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 독소루비신과 같은 양친화성 아민은 음전하를 포함하는 리포좀막 내로 보다 효율적으로 캡슐화될 수 있다 (Cancer Res. 42:4734-4739 (1982)). 상기 리포좀과의 표면 정전형 약물 회합은 시험관 내에서는 매우 안정하지만, 전신 투여시 매우 빠르게, 거의 즉시 방출된다.

따라서, 효과적인 치료를 위해 충분히 높은 약물 대 지질비로, 비하전 및 비친지성 약물, 특히 수성상에 낮은 용해도를 갖는 약물을 로딩하는 것이 해결하기 어려운 문제로 남아 있다.

발명의 개요

하나의 구현예에서, 본 발명은 높은 약물 대 지질비로 리포좀 내에 포획된 친수성 화합물을 갖는 조성물을 포함하는 리포좀을 제공한다. 높은 약물 대 지질비는 과포화 상태로 리포좀 내에 포획된 약물에 의해 얻어진다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 과포화된 상태로 리포좀 내에 포획된 친수성 화합물을 갖는 조성물을 포함하는 리포좀의 제조 방법이 제공된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명에는 리포좀 내에 과포화 상태로 포획된 화합물을 갖는 리포좀의 제조 방법이 포함된다. 본 방법에는 하기가 포함된다: (i) 선택된 조건에 대해 2 배 이상 증가될 수 있는 실온 수용성을 갖는 화합물의 선택; (ii) 리포좀 내에 포획된 화합물의 침전을 억제하기 효과적인 리포좀 크기의 선택; 및 (iii) 리포좀 내 화합물의 캡슐화.

또 다른 구현예에서, 본 방법에 사용하기 위한 화합물은 실온에서 그 수용성이 증가될 수 있다. 수용성 증가의 하나는 (i) 용매 온도의 증가, (ii) 공용매의 첨가 및 (iii) 용매 pH 의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 조건에 대해 일어난 다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 리포좀은 약 60 내지 약 1000 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 리포좀 크기는 약 60 내지 약 1000 nm 의 선택된 크기 간격으로 포획된 화합물을 갖는 리포좀을 제조하여 얻어진다. 제조된 리포좀은 현미경으로 분석되거나, 다른 방법에서는 분광학적으로, 또는 확장 x-선 흡수 미세 구조와 같은 산란 기법을 통해, 침전 화합물의 존재 또는 부재에 대해 분석될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 선택된 화합물은 지질 용액을 약물 용액으로 수화시켜, 리포좀 내에 캡슐화된다. 또 다른 구현예에서, 선택된 화합물은 건조 지질막을 농축 약물 용액으로 수화시켜 포획된다.

추가적인 구현예에서, 리포좀은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 더 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 지질 이중층을 형성하도록 선택된 지질은 경화 (rigid) 지질 이중층을 형성하기에 효과적이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에는 외부 리포좀 현탁액 매질로부터 약물을 실온 용해도 한계 초과로 유지시키도록 선택된 조건을 제거하는 것이 포함된다.

또 다른 양상에서, 본 발명에는 상기 기재된 방법에 따라 제조된 리포좀이 포함되며, 여기서 화합물은 과포화 상태로 리포좀의 중앙 구획에 포획된다. 상기 양상에서, 리포좀 조성물에는 리포좀에 포획된 치료 화합물 및 소포형성 지질로 구성된 리포좀 현탁액이 포함되며, 여기서 리포좀의 중앙 구획에서 침전 약물의 형성을 억제하기에 효과적인 리포좀 크기의 선택을 통해, 하나의 화합물이 리포좀 내에 서 과포화 상태로 유지된다.

하나의 구현예에서, 리포좀 내에 사용하기 위해 선택된 화합물은 수용성이 2 배 이상 증가될 수 있다. 상기 수용성 증가는, (i) 용매 온도의 증가, (ii) 공용매의 첨가 및 (iii) 용매 pH 의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 조건에 대한 반응이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 과포화된 상태로 내부 수성 구획 내에 포획된 화합물을 갖는 리포좀의 제조 방법이 기재된다. 본 방법에는 하기가 포함된다: (i) 화합물이 실온에서 그 용액 중의 용해도 초과의 농도로 용액 중에 존재하는, 화합물의 수용액 제조; (ii) 지질막 또는 지질 용액을 농축 약물 용액으로 수화시켜 리포좀 형성; 및 (iii) 침전 화합물의 형성을 억제하는 크기로 리포좀을 정립하여, 포획된 화합물을 과포화 용액 중에 유지.

또 다른 구현예에서, 선택된 화합물은 약 37℃ 의 온도에서 용액 중 그 용해도 초과의 농도로 수용액 중에 존재하도록 제조된다.

본 발명의 상기 및 기타 구현예는 하기 본 발명의 상세한 설명을 참조로 보다 자세히 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

I. 리포좀의 제조

하나의 양상에서, 본 발명에는 과포화 상태로 리포좀 내에 포획된 화합물을 갖는 리포좀 조성물의 제조 방법이 포함된다. 본원에서 사용되는 "과포하" 에는, 용액이 동일 조건 하에서 포화되기 위해 보통 필요한 것보다 많은 용질을 함유하는 조건이 포함된다. 즉, 용액은 그 미용해 용질과 평형을 이루기 위해 필요한 것보다 많은 용해 용질을 보유한다.

또 다른 양상에서, 리포좀은 포획될 화합물의 선택, 및 실온에서 수중 화합물의 포화 농도 초과의 화합물 농도를 갖는 용액의 제조에 의해 형성된다. 화합물을 함유하고, 실온에서 수중 포화 농도 초과의 농도를 갖는 용액은 여러 방법 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 용매 중 화합물의 용해도를 증가시키기 위한 가열, 수용액으로의 공용매의 첨가 또는 수성 용매의 pH 변화에 의한다. 상기 용액은 본원에서 "농축 용액" 으로 언급된다. 바람직한 구현예에서, 농축 용액을 제조하기 위해 사용되는 절차는, 수성 용매 중 화합물의 용해도를 실온에서의 수성 용매 중 화합물의 용해도에 비해 약 2 배, 바람직하게는 약 3 배, 보다 바람직하게는 약 4 배 증가시키기에 효과적이다.

따라서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위해 포함되는 화합물에는 (i) 용매 온도의 증가, (ii) 공용매의 첨가, 또는 (iii) 용매 pH 의 변화를 통해, 실온 (20-25℃) 수용성이 약 2 배 이상, 바람직하게는 약 3 배 이상, 보다 바람직하게는 약 4 배 이상 증가될 수 있는 화합물이 포함된다. 바람직한 화합물은 온도 증가에 따라 상당한 용해도 증가를 일으키는, 실온에서 제한된 수용성을 갖는 것들이다. 본 발명을 지지하기 위해 수행된 연구에서는, 시스플라틴이 모델 화합물로 사용되었다. 시스플라틴은 물 또는 식염수 중에서 1-2 mg/mL 의 실온 용해도를 갖는다. 약 60-65℃ 에서, 용해도는 약 8-10 mg/mL 로 증가된다. 따라서, 리포좀 제조용 농축 약물 용액을 제조하기 위한 수단으로 온도를 이용하였다.

본 발명에 사용하기 위해 포함되는 기타 화합물에는, 아시클로비어, 갱시클로비어, 탁솔, 카르보플라틴 및 기타 백금 화합물과 같은 치료 약물, 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신 및 이다루비신과 같은 안트라퀴논 뿐만 아니라, 저수용성 항생제, 단백질 및 펩티드가 포함된다.

지질 소포의 제조 방법에 대한 설명을 계속하면, 분리된 용기 내에서 지질을 선택하여, 적합한 용매 중에 용해된 목적한 지질 소포 조성물을 제공할 수 있다. 지질 소포 형성에 적합한 지질은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,013,556 호 Col. 9, 제 34-62 줄 및 미국 특허 제 5,891,468 호 Col 7, 제 5 줄부터 Col. 8 제 48 줄까지를 참고한다. 리포좀 형성에 사용되는 지질 성분은 다양한 소포 형성 지질로부터 선택되며, 전형적으로 인지질 및 스테롤이다. 지질은 비교적 불포화된 아실 사슬을 갖는 지질의 선택을 통해 보다 유동적인 지질 이중층을 갖도록 선택되어, 보다 경화된 이중층에 비해 포획된 화합물에 비교적 더 높은 투과성을 갖는 지질 이중층을 수득할 수 있다. 보다 경화된 이중층은, 포획된 화합물에 더 낮은 투과성을 갖는 지질 이중층을 형성하기 위해, 고포화 인지질을 사용하여 형성된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 중합체와 같은 친수성 중합체 사슬로 유도체화된 지질을 포함하는 리포좀은, 예를 들어 미국 특허 제 5,013,556 호 및 제 5,631,018 호에 기재되어 있다.

지질 이중층의 조성은 포획을 위해 선택된 약물에 따라 선택적으로 다양해진다. 지질 이중층에 더 높은 투과성을 갖는 약물은 포화 또는 지질 경화 성분을 갖는 지질 이중층 형성에 의해 리포좀에 더 잘 보유된다. 지질 이중층에서 지질 성 분을 통해 쉽게 투과성을 갖지 않는 약물들은 유동성 지질 성분으로 형성된 리포좀에 포획될 수 있다.

상기에 기재된 바와 같이 선택된 지질 성분은 적합한 용매 중에 용해될 수 있다. 지질은 약물의 농축 용액으로 수화되어 리포좀을 형성한다. 명세서를 통해 기재되는 상세한 연구에서, 시스플라틴의 농축 용액이 사용되어 지질의 에탄올계 용액이 수화되었다 (실시예 1). 당업자는, 농축 약물 용액이 또한 건조 지질막을 수화시키는데 사용될 수 있고, 지질을 용해시키는 용매가 제거되어 수화용 건조 지질막이 얻어진다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,013,556 Col. 10 제 60-65 줄 참고). 수화 후, 지질-약물 혼합물이 리포좀 형성에 충분한 시간 동안 혼합된다.

리포좀은, 초음파분쇄, 균질화 또는 압출과 같이 당분야에 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 특정 크기로 정립된다. 전형적으로, 리포좀 크기는, 리포좀 조성물의 조건이 농축 용액 중 약물의 용해도를 감소시키도록 변형되는 경우, 리포좀의 중앙 구획 내의 침전물 형성을 억제하도록 선택된다. 상기 크기는 상이한 크기를 갖는 몇몇 리포좀 조성물을 제조하여, 증가된 약물 농도를 유지하는 조건을 변화시키고, 약물 침전물의 존재에 대해 리포좀을 분석하여 결정된다. 본원에서 사용되는 "침전물" 또는 "침전" 은, 결정형, 반고체형 또는 무정형 약물과 같은 임의 형태의 약물을 포함하고자 하는 것이다. 약물 침전물이 존재하지 않는 크기를 갖는 리포좀이 본 발명의 범위에 속한다.

전형적으로, 약 60-1,000 nm 의 크기, 바람직하게는 약 70-500 nm 의 크기를 갖는 리포좀이 적합하다. 약물 침전물의 존재에 대한 리포좀 분석은, 예를 들어 현미경 (전자 현미경 또는 고해상도 극저온 전자 현미경) 을 통한 시각화, 또는 예를 들어 IR, 라만 (Raman), NMR 을 포함하는 다양한 분광측정 기법, 또는 확장 x-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 와 같은 산란 기법에 의해 수행될 수 있다.

리포좀은 전형적으로 침전된 약물의 형성을 억제하도록 선택된 크기로 정립된다. 이는 전형적으로, 실온에서 수중 약물의 용해도를 초과하는 농도로 약물이 유지되는 조건이 리포좀 현탁액의 외부상에서 변화되는 경우 일어난다. 예를 들어, 농축 약물 용액의 제조용 약물의 용해도를 증가시키기 위해 온도 증가가 이용되는 경우, 리포좀 현탁액의 온도가 낮아진다. 약물 용해도를 증가시키기 위해 pH 증가 또는 감소가 이용되는 경우, pH 는 최종 목적 pH 로 조정된다. 약물 용해도를 증가시키기 위해 공용매가 농축 약물 용액에 첨가되는 경우, 공용매는 초여과, 밀도 구매 원심분리, 투석, 증류, 진공 제거 등과 같은 선택된 방법을 통해 외부 리포좀 상으로부터 제거된다.

II. 리포좀의 특징분석

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 실온에서 제한된 수용성을 갖는 약물의 효과적이고 안정한 캡슐화를 제공한다. 상기 화합물은 치료에 유용한 약물 대 지질비로 리포좀 내에 포획하기 어려운 것으로 알려져 있다. 본 발명을 지지하기 위해 수행된 연구에서, 항암제 시스플라틴이 실험 약물로서 사용되었다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법에 실온에서 제한된 수용성을 갖는 다양한 화합물의 사용이 포함됨을 인지해야 하며, 기타 실험 약물이 상기에 기재된다.

시스플라틴 (시스-디아민디클로로 제 2 백금) 은 시스 위치인 두개의 암모니아 분자 및 두개의 클로라이드 원자로 둘러싸인 중앙의 백금 원자를 포함하는 중금속 복합체이다. 시스플라틴은 정소암, 두부암 및 경부암, 그리고 폐암을 포함하는 다양한 고형암의 치료에 널리 사용된다. 기타 암 화학치료제와 마찬가지로, 시스플라틴은 매우 독성을 갖는 약물이다. 시스플라틴의 주요 단점은 주된 용량 제한 요인인 그 심각한 신장독성, 순환 반감기가 단지 수분인 신장을 통한 빠른 배출, 및 혈장 단백질에 대한 강한 친화도이다 (Freise, J. 등, Arch. Int. Pharmacodyn., 258:180-192 (1982)). 독성을 극복하기 위한 방안으로서의 리포좀 내 시스플라틴의 캡슐화는, 예를 들어 Abra 등의 미국 특허 제 5,945,122 호; [Gondal, J.A. 등, Eur. J. Cancer, 29A(11):1536-1542 (1993); Sur, B. 등, Oncology, 40:372-376 (1983); Weiss, R.B. 등, Drugs, 46(3):360-377 (1993)] 에 기재되어 있다. 그러나, 낮은 약물/지질비에 기여하는 실온에서 대략 1-2 mg/mL 인 약물의 낮은 수용성 및 낮은 친지성 둘 다로 인해, 시스플라틴은 전형적으로 리포좀 내에 효율적으로 포획되기 어렵다.

본 발명에 따라, 과포화 상태인 시스플라틴 함유 리포좀이 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조되었다. 간략하게, 약물 수용액은 pH=7 에서 약 20-25℃ 실온에서 용액 중 그 용해도 한계를 초과하는 농도의 약물로 제조되었다. 상기 경우, 약물 용해도는 용액의 온도를 가열하여 증가되었다. 상기에서 논의된 바와 같이, 실온에서 수용액 중 약물 용해도를 증가시키기 위한 기타 방법도 또한 적합하다. 이어서, 제조된 용액을 사용하여, 리포좀 지질 이중층을 형성하기 위해 선택된 지질 을 수화시켜, 리포좀의 중앙 코어 구획에 과포화 약물 용액을 포함하는 리포좀을 형성하였다. 보다 구체적으로, 특히 시스플라틴을 사용하는 경우, 리포좀에는 실온에서의 시스플라틴 용해도 (1-2 mg/mL) 의 약 4 배 초과인 약 8 mg/ml 농도로 포획된 시스플라틴이 포함되었다. 리포좀은 106 nm 의 평균 입자 직경으로 압출에 의해 정립되었다.

8 mg/ml 의 시스플라틴을 함유하는 리포좀은 이제 기재될 바와 같이, NMR 및 확장 X-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 에 의해 분석되었다.

A. NMR 에 의한 분석

NMR 은, 지질 이중층 내 분자 운동의 비등방성 및 막 구조의 비등방성이 상기 기법으로 평가될 수 있기 때문에, 리포좀 제형물의 평가를 위해 강력한 도구가 된다 [Fenske, P.B., Chem. Phys. Lipids 64:143 (1993); Tilcock, C.P.S., Chem. Phys. Lipids 40:109 (1986)]. 시스플라틴이 로딩된 리포좀의 경우, NMR 은 리포좀 인지질 (물리적 상태, 운동 속도) 및 백금 복합체 (산화 상태 및 배위 스피어) 에 대한 정보를 모두 제공한다. NMR 및 원자 흡수 분광측정의 조합을 이용하여, 리포좀 제형물 중 가용성 백금의 양을 정량할 수 있다.

¹⁵N-표지된 시스플라틴을 함유하는 리포좀을 실시예 2 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 시스플라틴의 용해도를 약 8 mg/mL 로 증가시키기 위해, 약물 로딩은 60-65℃ 의 온도에서 수행되었다. 거대 단일판 소포를 형성한 후, 리포좀 현탁액의 온도를 약물 용해도가 약 1-2 mg/mL 인 4℃ 로 낮추었다.

1. ¹⁹⁵ Pt NMR 에 의한 분석

¹⁹⁵Pt NMR 분광측정은 금속의 산화 상태, 및 백금의 제 1 배위 스피어 중 4 개 리간드의 성질에 대한 정보를 제공한다. 이는, Pt 복합체의 화학적 이동 범위가 수천 ppm 에 걸쳐 있고, 화학적 이동이 Pt (2 가 및 4 가) 의 산화 상태 및 Pt 에 결합된 원자의 성질에 모두 민감하기 때문이다.

실시예 2A 에 기재된 바와 같이 제조된 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 는 ¹⁹⁵Pt NMR 분광측정에 의해 분석되었으며, 도 1a-1b 에 스펙트럼을 나타낸다. 도 1a 에 보이는 바와 같이, 광밴드 디커플링된 스펙트럼은 두 개의 동등한 ¹⁵N 원자의 커플링으로 인해 예상되는 3 중선을 나타낸다. 광밴드 디커플링이 없어지면, 각각의 세 개의 ¹⁹⁵Pt 공명은 도 1b 에 보이듯이 6 개의 동등한 수소에 의한 7 중선으로 분할된다.

시스플라틴 함유 리포좀의 ¹⁹⁵Pt NMR 측정은, 도 2 에 보이는 바와 같이 -2139.7 ppm 에서 뚜렷한 단일 화학적 이동 (범위 -1350 내지 -2700 ppm) 을 나타낸다. 이는, 시스플라틴이 손상되지 않은 시스플라틴인 Pt (2 가) 한 종류로 주로 (>90%) 존재함을 시사한다. 추가적인 백금 피크는 검출되지 않아서, 기타 백금종, 즉 백금 트리 또는 테트라-아민이 형성되지 않았음을 시사하지만, 거대 분자와 Pt (2 가) 의 부가물은 ¹⁹⁵Pt NMR 에 의해 관찰되지 않을 것이다. Pt (2 가) 는 특히 이들이 비산성 용액 중에서 가열되는 경우, 2 전자 불균형을 겪어 고체 Pt (0 가) 및 가용성 Pt (4 가) 복합체를 만들 수 있다. 표본에서 흑색 침전물이 검출되지 않아 Pt (0 가) 가 존재하지 않음이 제시되었고, +1000 내지 -500 ppm 영역에서의 ¹⁹⁵Pt NMR 에서 피크가 관찰되지 않아 용액 중에 Pt (4 가) 복합체가 존재하지 않음이 시사되었다.

2. ³¹ P NMR 에 의한 분석

³¹P NMR 을 사용하여, 지질 소포의 인지질 상태를 확인할 뿐만 아니라, 크기 분포에 따른 리포좀 제형물의 균일성 및 판의 수를 확인하였다. 표 1 에 기재된, 그 표본이 ¹⁹⁵Pt NMR 에 의해서도 측정된 리포좀 제형물의 ³¹P NMR 스펙트럼을 측정하였다; 이들은 전형적인 인지질 소포의 약간 비대칭적인 피크를 나타내었다. 동일 표본을 ¹⁹⁵Pt NMR 에 의해 측정하여, 이들의 백금 함량을 확인하였다. 실온에서, 관찰된 ³¹P 피크는 매우 넓었다. 이는 매트릭스 지질의 겔 내지 액체인 결정상 전이 온도 Tm (수소화 포스파티딜콜린의 경우 Tm = 52.5℃) 미만의 콜레스테롤 및 포화 인지질로 구성된 소포의 이전 데이타와도 일치한다 (Lichtenberg D. 등, METHODS OF BIOCHEMICAL ANALYSIS, D. Glick 편저, Vol. 23, Wiley, New York, p. 337 (1998)). 도 3a-3b 에서 보이는 바와 같이, Tm 을 초과하는 60℃ 에서, 백금 함유 (도 3a) 및 대조군 (도 3b) 리포좀 둘 다에서, 첨예한 ³¹P 스펙트럼이 관찰되었다. 60℃ 에서, 대략 10 회 스캔이 높은 신호 대 노이즈 비를 갖는 신뢰할만한 데이타를 제공하기에 충분하였다. 피크 분석에서, 인지질 소포에 대해 예상되는 바와 같이 두 경우 모두 약간 비대칭인 피크 (우측으로 뒤틀림) 를 나타내었다. 높이 중간에서의 선폭 (linewidth) 측정은 제형물 중 인지질과 백금의 상호작용의 척도로서 작용할 수 있다. 높이 중간에서의 선폭 (Δν_1/2) 은 60℃ 에서 측정되었고, 대조군 및 시스플라틴-리포좀 각각에 대해 6.3 ppm 및 4.2 ppm 의 값이 수득되었다. Pt-함유 리포좀 및 대조군 리포좀 간의 비교에서, 백금 및 인지질 간의 약한 상호작용이 시사되었다. 두 소포가 유사한 크기였음에도, Δν_1/2Pt-리포좀 < Δν_1/2대조군이었으므로, 약한 상호작용이 일어날 수 있다. 데이타는 100-200nm 직경 LUV 의 ³¹P 측정 (즉, 계란 PC/DSPG 85/15 Δν_1/2 가 ~ 5ppm) 과 훌륭히 일치한다 [Tilcock, C.P.S., Chem. Phys. Lipids 40:109 (1986)]. 선폭에서, MLV 로의 두드러진 오염은 제시되지 않는다. 따라서, ³¹P NMR 은 육각형 제 2 상태인 인지질이 없다는 피크 모양을 나타내었다.

³¹P 및¹⁹⁵Pt 분광측정용 리포좀 제형물
제형물	P (mg/mL)	인지질 (mM)	총 지질 (mg/mL)	Pt (mg/mL)	크기 (nm)
위약-리포좀	2.65	86	109	-	104
시스플라틴-리포좀	9.75	315	403	1.8	116

3. 이핵 단일 양자 간섭성 (HSQC) 에 의한 분석

¹⁹⁵Pt NMR 이 Pt 복합체의 산화 상태 및 제 1 배위 스피어의 원자 성질에 대한 정보를 제공하지만, 물 리간드, 카르복시 리간드 또는 포스페이트 리간드가 모두 산소 원자를 통해 Pt 에 결합하므로 이들을 구별하지는 못한다. ¹⁵N NMR 분광측정을 ¹⁹⁵Pt NMR 분광측정과 함께 사용하여, 모자라는 정보가 제공되었다 [Barnham, K.J., PLATINUM AND OTHER METAL COORDINATION COMPOUNDS IN CANCER CHEMOTHERAPY 2, Pinedo, H.M. 등 편저, Plenum Press, New York, p. 1-16 (1996); Berners-Price, S.J., J. Am. Chem. Soc. 115:8649 (1993)]. ¹⁵N 화학적 이동 및 ¹⁵N-¹⁹⁵Pt 커플링 상수는 ¹⁵N 에 대해 트랜스인 리간드에 민감하다 [Appleton, T.G. 등, Inorg. Chem. 24:4685 (1985)]. ¹⁴N 의 부재는 ¹⁹⁵Pt 공명을 첨예하게 해서, 커플링 상수 (¹⁹⁵Pt-¹⁵N, ¹⁹⁵Pt-¹H) 가 수득될 수 있다. 그러나, ¹⁵N-표지된 시스플라틴 [시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂] 은 실시예 2 에 기재된 바와 같이 쉽게 제조되지만, ¹⁵N NMR 의 낮은 감도는 상기 실험에서 Pt 복합체를 모니터링하기 위한 그의 사용을 막는다.

역 검출 실험은 ¹⁵N 에 커플링된 양성자를 검출하여, Pt 의 제 1 배위 스피어 상의 리간드 및 그 산화 상태에 근거하는, ¹⁵N 의 커플링 상수 및 화학적 이동에 대한 정보를 제공한다. ¹⁵N-표지된 시스플라틴을 사용하는 주된 장점은, 이핵 단일 또는 다중 양자 간섭성 (각각 HSQC 또는 HMQC) NMR 기법을 적용할 수 있다는 것이다. HSQC 또는 HMQC 는 한 축에 양성자 화학적 이동을, 및 제 2 축에 ¹⁵N 화학적 이동을 갖는 2 차원 역 검출 실험이다. ¹⁵N -표지된 Pt 복합체의 HSQC 또는 HMQC 를 사용하여, 마이크로몰 농도의 Pt 복합체를 성공적으로 검출하였다. 본 발명을 지지하기 위한 연구에서, HSQC 가 HMQC 에 비해 더 좁은 선, 및 더 뛰어난 해상도를 나타내므로 HSQC 가 사용되었다. 전형적인 HSQC 실험에서, 대략 20 분 동안 마이크로몰 농도의 시스플라틴이 관찰되었다. 뛰어난 감도 획득에 덧붙여, HSQC 는 ¹⁵N 에 커플링된 양성자만을 선택적으로 검출하여, (리포좀으로부터의) 용액 중 다른 모든 양성자가 무시되고, 데이타 해석이 간단해진다.

수중 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 HSQC 를 도 4a-4b 에 나타낸다. 해당 피크는, Pt (2 가) 복합체에 특징적인 영역 I 에 놓인다. Pt (4 가) 피크가 예상되는 영역 II (Barnham, K.J., PLATINUM AND OTHER METAL COORDINATION COMPOUNDS IN CANCER CHEMOTHERAPY 2, Pinedo H.M. 등 편저, Plenum Press, New York, p. 1-16 (1996)) 에는 피크가 없다. 영역 I 의 확대를 도 4b 에 나타내며, 세 개의 피크 (A, B 및 C) 가 있고, 각 피크는 추가적인 부수피크 (satellite) (A1', A1", A2' 및 A2") 를 갖는다. 피크 A 는 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 에 속하는 것으로, 두 개의 동등한 질소가 단일 피크를 만든다. 피크 B 및 C 는 시스-[Pt(¹⁵NH₃)₂Cl(H₂O)]⁺ 의 단일 복합체에 속하는 것으로, 피크 B 는 수성 리간드에 트랜스인 질소를 나타내며, 피크 C 는 클로라이드 리간드에 트랜스인 질소를 나타낸다. ¹⁹⁵Pt-¹⁵N 커플링 상수는 A1' 및 A1" 간 거리로부터 측정될 수 있고, ¹⁹⁵Pt-¹H 커플링 상수는 A1" 및 A2" 간 거리로부터 측정될 수 있다. 수용액 중에서 일어난다고 알려져 있는 시스플라틴의 가수분해 반응은 ¹⁹⁵Pt NMR 에 의해서는 쉽게 관찰되지 않지만, HSQC 에 의해서는 쉽게 관찰된다.

~100 nm LUV 의 수성상 내에 수동 캡슐화된 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 HSQC 스펙트럼은 본래 약물의 스펙트럼과 거의 동일하게 나타난다. 그러나, 한 가지 작은 차이가 있다: 부수피크간 거리가 모 화합물에서보다 약간 더 작다. 이는 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 와 지질의 상호작용, 또는 리포좀 내부의 물의 비교적 낮은 "활성" 에 연관될 수 있다. 본래 약물의 스펙트럼에서는 뚜렷이 볼 수 있는 수성종에 기인하는 피크의 부재로 후자가 지지된다. 나아가, 도 5 에 보이는 바와 같이, 시스플라틴-캡슐화 리포좀의 스펙트럼은 Pt (4 가) 영역에 어떠한 피크도 갖지 않아서, 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 을 리포좀 내로 캡슐화하는 단계가 시스플라틴의 불균형화를 유도하지 않았음이 시사된다. 또한, 스펙트럼에서의 ¹⁵NH₄ ⁺ 피크의 부재는 탈아민화 (¹⁵N 리간드의 소실) 가 일어나지 않았고, 모든 Pt (2 가) 복합체가 HSQC 실험으로 설명될 수 있음을 제시한다. 따라서, 캡슐화된 리포좀 중 유일한 Pt 종은 시스플라틴 및 약간의 시스-[Pt(¹⁵NH₃)₂Cl(H₂O)]⁺ 이라고 결론지을 수 있다. 스펙트럼에 미확인 피크 ('X' 로 표시됨) 가 보이는데, 상기 표본의 HPLC 크로마토그램에서는 단지 매우 소량의 불순물 (<5%) 만이 검출되었다 (결과는 나타내지 않음).

시스플라틴을 갖는 최종 제형물은 히스티딘 완충액을 포함하였다. ¹H-¹⁵N-HSQC NMR 은 표본 중 최소한의 불순물도 검출할 정도로 민감하다. 상기 불순물은, 지질 부재 하의 (캡슐화 하지 않음) 리포좀 제조와 동일한 공정 중에 히스티딘 완충액이 존재하는 경우, 또는 리포좀 내 백금 캡슐화 공정 중에 히스티딘 완충액이 존재하는 경우 관찰되었다. 도 6 에서 보이는 바와 같이, 측정된 ¹H-¹⁵N-HSQC 스펙트럼에서, ¹⁵N-표지된 화합물의 것에 덧붙여 피크들이 나타났다. 검출된 임의 시스플라틴-히스티딘종들은 리포좀 내 캡슐화 도중 수성 시스플라틴에 기인한다. 알고 있는 양의 아미노산 히스티딘으로 수행한 추가 실험에서, 상기 외래성 피크는 캡슐화 공정 중 완충액 내 히스티딘으로의 약물의 결합에 기인할 수 있음이 시사되었다. 상기 회합은 비가역적이므로, 일단 결합된 약물은 이용불가능해진다. 히스티딘 아미노기의 관여를 평가하기 위해, 생물학적 완충액에 대한 ¹⁵N-표지된 시스플라틴의 반응성은 N-아세틸-히스티딘의 카르복시기를 이용하여 검사되었다. 1:1 몰비의 ¹⁵N-시스플라틴 및 N-아세틸 히스티딘을 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 도 7 에 보이는 바와 같이, 아마도 시스플라틴-히스티딘종에 속하는 다양한 새 피크들이 나타났다. 상기 결과는 HPLC 를 이용하여 더 확인되었다; 수득한 크로마토그램에서 실제로 시스플라틴-히스티딘종 (검출된 백금의 대략 20-30%) 의 존재가 확인되었다 (결과는 나타내지 않음). 유사한 연구가 N-BOC(t-부톡시카르보닐)-메티오닌으로 수행되었다. 상기 연구에서, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 (도 5), 히스티딘 완충액의 부재 하에 캡슐화가 수행되고, 캡슐화 공정이 완료된 후 히스티딘이 첨가된 시스플라틴-캡슐화 리포좀에서, 히스티딘 완충액 및 ¹⁵N-시스플라틴 간의 접촉이 없어, 누출되지 않고 매우 안정한 리포좀이 수득됨이 제시되었다. 나아가, 시스플라틴-히스티딘종에 속하는 피크들이 관찰되지 않았으므로, 본 연구는 리포좀으로부터 ¹⁵N-표지된 시스플라틴이 누출되지 않았음을 나타내었다.

4. ¹⁹⁵Pt NMR 에 의한 백금 함량의 정량

리포좀 내에 캡슐화되는 백금에 관해 결정될 기타 변수들에는 약물 대 지질비, 및 얼마나 많은 리포좀 약물이 수용성 시스플라틴과 유사하게 행동하는가가 포함된다. 시스플라틴의 경우, 리포좀 내 백금의 가용성 부분만이 방출되어 세포 DNA 에 작용할 수 있을 것으로 예상된다; 임의 백금 침전물은 비이용가능한 약물로서 간주될 수 있다. 따라서, K₂PtCl₄ 를 내부 참조로 수행된 비교 연구에서, 원자 흡수 분광측정과는 달리, ¹⁹⁵Pt NMR 측정을 사용하여 가용성 시스플라틴만을 선택적으로 정량하고, 이에 따라 리포좀 내에 포함된 백금의 물리적 상태의 뚜렷한 지표를 수득할 수 있음이 시사되었다. 고체 상태의 임의 백금 (즉, 침전물 중, 또는 매우 미세한 입자의 현탁액 중) 은 검출되지 않을 것이다; 그 T₂ 가 매우 짧아, 이들이 기준선 내로 사라질 정도로 선이 넓어진다.

리포좀 내 백금 용해도의 온도 상승에 따른 효과를 관찰하기 위해, 리포좀 표본을 37℃ 및 60℃ 에서 둘 다 측정하였다. 온도 상승은 관찰된 피크 면적을 증가시키지 않았다; 그러나, 수성종의 매우 작은 피크들이 60℃ 에서 검출되었다. 이는, 상기 논의된 HSQC NMR 측정에서 수득된 데이타와도 일치한다.

본 연구의 상기 부분에 사용된 4 개의 리포좀 표본은 표 2 에 기재되며, 크기 및 지질 농도가 약간 다르다. 상기 요인은 표본의 점도에 영향을 미쳐, NMR 스펙트럼의 더 넓은 선폭에 기여할 수 있다. 수중 가용성 시스플라틴 표본 및 리포좀 시스플라틴 표본 간의 심각한 차이는 관찰되지 않았다. 60℃ 에서 측정되는 경우, 더 짧은 T₂ 및 급격히 붕괴되는 신호와 일치되게 선이 더 넓어졌다. 리포좀 크기 및 시스플라틴 피크의 선폭 간 직접적인 상관관계가 발견되었다; 리포좀 크기가 증가할수록, 시스플라틴 피크의 폭도 증가하였다. 지질 농도 및 시스플라틴 피크의 폭 간에는 역 상관관계가 존재하였다; 지질 농도가 감소할수록 선폭이 증가하였다.

[¹H,¹⁵N] HSQC NMR 분광측정용 리포좀 제형물
변수	표본 1	표본 2	표본 3	표본 4
크기 (nm)	112	125	100	107
시스-Pt (mg/mL)	1.0	1.0	0.9	0.9
지질 (mM)	104	89	110	110
외부상	10% 수크로오스 1mM NaCl 10mM 히스티딘 pH 6.5	0.9 NaCl 10mM 히스티딘 pH 6.5	3% 수크로오스 3.3% NaCl 10mM 히스티딘 pH 6.5	3% 수크로오스 3.3% NaCl 10mM 히스티딘 pH 6.5
설명			냉동된적 없음	냉동 및 해동됨

상기 연구에 사용하기 위한 리포좀은 리포좀 제형화의 제 1 단계 중 에탄올의 존재 하에 제조되었고, 시스플라틴의 용해도에 대한 에탄올의 효과를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 따라서, 실온 및 65℃ 에서, 0.9% NaCl 중에 및 0.9% NaCl 중 20% 에탄올 중에 1 내지 8 mg/ml 의 시스플라틴의 용해도가 검사되었다. 1 mg/ml 에서 시스플라틴은 모든 조건 하에 가용성이었지만, 8 mg/ml 에서 대부분의 시스플라틴이 실온에서 침전되었고, 65℃ 에서는 대부분 가용성이었다. 실온으로 온도를 낮춤으로써, 20% 에탄올의 부재 및 존재 두 경우 모두에서, 8 mg/ml 시스플라틴의 대부분이 침전되었다. 따라서, 20% 에탄올의 존재는 시스플라틴의 용해도를 개선시키지 못했다고 결론지을 수 있다. NMR 측정에서, 수성상 중 유리 시스플라틴의 용해도는 ~ 2mg/ml 로 제한되며, 온도를 60℃ 로 상승시킬 때 증가된다. NMR 실험에서는 그 적분이 ~ 2 mg/ml 에 비례하는 피크의 검출이 나타났지만, 불용성 백금 침전물은 실제로 검출되지 않았다. 리포좀의 경우, 원자 흡수로 설명되는 거의 모든 시스플라틴이 리포좀 내부 수성상에 가용성이며, 실온에서의 용해도인 2 mg/ml 초과의 내부 리포좀 농도가 제시된다. 리포좀 제조 도중 시스플라틴의 농도가 실온 (또는 4℃) 에서의 용해도를 초과했다는 사실에도 불구하고, 리포좀 내 거의 모든 시스플라틴은 리포좀 내부 수성상 내에서 가용성인 것처럼 행동함이 발견되었다. 용해도 연구에서, 에탄올이 예상보다 더 높은 약물 대 지질비를 일으키지 않음은 뚜렷하다.

NMR 연구에서, 시스플라틴은 리포좀 내로 로딩되는 동안 온전하게 유지되며, 캡슐화된 시스플라틴은 약간의 차이는 있지만 수성상에 용해된 모 화합물과 유사한 것으로 나타났다. 리포좀 내에 존재하는 모든 시스플라틴은 수용성 약물과 마찬가지로 행동하며, 불용성 약물의 흔적은 없다. 리포좀 내 약물은 침전되지 않는다. 이 사실은 하기 기재되는 EXAFS 연구에 의해 더 확인된다.

B. 확장 X-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 에 의한 분석

확장 X-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 는 표본 중 선택된 원자의 국소적 구조에 대한 정보를 제공한다. 본 방법에서, x-선 광효과 과정에서 방출되는 광전자의 산란이 바로 근방의 원자를 스캔하기 위해 이용된다. 산란으로 인한 간섭 패턴은 에너지 또는 광전자 파수 (wavenumber) 단위 상에 x-선 흡수 계수의 작은 진동으로 분석된다. 그 효과는 느린 광전자, 즉 임의 x-선 흡수 에지의 바로 위에서만 분석된다. 따라서, 본 방법의 감도는 표적 원자에 관련된다. 가장 쉽게는 데이타의 파우리어 변환으로 환산되는 진동의 진폭, 상 및 기간으로부터, 근방 원자의 수, 종 및 거리가 추정될 수 있다. 또한, 추가적인 분석으로, 열적 및/또는 구조적 장애 정도가 제공되어, 결정 뿐만 아니라 다양한 무정형 상태인 물질이 연구될 수 있다.

백금의 경우, L3 흡수 에지가 싱크로트론 방사선용 단색화장치 (monochromator) 의 최적 분석이 예상될 수 있는 영역 내에 속한다. 따라서, Pt L3-에지 EXAFS 스펙트럼을 리포좀 캡슐화된 시스플라틴에 대해 측정하여, 표본 중 Pt 원자 주위의 국소적 구조를 결정하였다. 본 시스템은 액체, 냉동 및 동결 건조 상태에서 연구되었다. 비교를 위해, 고체 및 용해 형태인 유리 약물의 Pt L3-에지 EXAFS 도 또한 측정되었다.

결정 및 용해된 시스플라틴, 및 실시예 3 에 기재된 대로 제조된 3 개의 리포좀-캡슐화 시스플라틴 표본 (액체, 냉동 및 동결건조) 에 대한 Pt L3-에지에서의 표준 k2-칭량 EXAFS 스펙트럼 χ(k) 를 도 8 에 나타낸다.

도 8-13 은 도 8 에 나타낸 개별 표본에 대해 k 간격 3Å^-1 내지 12Å^-1 로 계산된, 파우리어-변환된 k²-칭량 EXAFS 스펙트럼이다. 스펙트럼에서의 피크는 Pt 원자에 인접한 원자들의 연속 셸 (shell) 에 해당한다. 구조적 변수들은, 측정된 신호를 FEFF6 프로그램 코드로 인접 원자들의 시험적 공간 분포에서 광전자의 산란 경로 세트로부터 처음부터 구축된 모델 신호와 비교하여, 상기 스펙트럼으로부터 정량적으로 분석된다 [Rehr, J.J. 등, Phys. Rev. Lett. 69:3397 (1992)]. 동일한 방식으로, 근방 원자종들도 그 특이적 산란 상전이에 의해 인지된다.

초기 단계에서, 결정성 시스플라틴 표본의 신호가 분석된다. 비록 그것이 캡슐화 효과의 연구와 직접적으로 관련되지는 않지만, 그 고품질 신호는 수득가능한 해상도의 기준으로 작용한다. 가장 중요하게는, 결정측정 데이타를 사용하여, Pt 원자 근방의 모델을 구축할 수 있다 (Milburn, G.H.W. 등, J. Chem. Soc. A. JCSIA, p. 1609 (1966)). 실제로, 각각 2.05Å 및 2.33Å 에서의 제 1 셸 N 및 C1 근방에 대한 신호가 완전히 일치한다. 두 종은 점유수 2 를 가지며, 뚜렷이 확인된다.

나아가, 2.4 내지 4.0Å 에서 FT 스펙트럼에서의 구조는 결정측정 데이타에서 제시된 바와 같이 (Milburn, G.H.W. 등, J. Chem. Soc. A. JCSIA, p. 1609 (1966)), 3.37Å 에서 두 개의 Pt 를 포함하는, 제 1 셸 근방의 더 높은 수준의 산란, 및 제 2 셸 근방의 산란의 기여에 의해 완전히 설명될 수 있다. 그러나, 결정측정 모델에서 예측된, 거의 동일한 거리의 추가적 C1 및 N 근방의 기여는 적용될 수 없다. 현저하게, 측정 및 모델은 상이한 결정 변형을 참조한다. 상기 방식으로, 최근방, 시스플라틴 분자 자체의 N 및 C1 원자 및 인접 분자의 최근방 Pt 원자는 이들의 예측 위치에 발견될 것이지만, 결정 내 분자의 특정 겹침에 의한 Pt 원자의 주변을 고려하면, 추가적 근방은 예측 위치에 발견되지 않을 것이다. 따라서, 3Å^-1 - 12Å^-1 의 k 영역 및 1.1Å - 4.1Å 의 R 영역 내에서 구축되고 데이타의 최적 피트로 보정된 근방에 대한 변수를 표 3 에 나타낸다.

결정성 시스플라틴, 시스플라틴 포화 수용액 및 리포좀-캡슐화된 시스플라틴의 액체, 냉동 및 동결건조 표본 중 Pt 근처의 최근방 배위 셸의 변수
결정성 시스플라틴
Pt 주변.^a	N^a	R(X)^a	σ²(χ²)^a	피트 r-인자^c
N	2.0(2)^b	2.052(4)	0.0022(9)	0.007
Cl	2.0(2)	2.330(1)	0.0025(3)
Pt	2.0(5)	3.37(2)	0.016(3)
물에 용해된 시스플라틴
N	2.3(4)	2.02(1)	0.002(1)	0.006
Cl	1.9(2)	2.29(1)	0.003(1)
리포좀-캡슐화된 시스플라틴: 액체
N	2.2(4)	2.01(1)	0.002(1)	0.017
Cl	2.3(3)	2.29(1)	0.003(1)
리포좀-캡슐화된 시스플라틴: 냉동
N	2.4(4)	2.00(1)	0.002(1)	0.022
Cl	2.2(3)	2.29(1)	0.003(1)
리포좀-캡슐화된 시스플라틴: 동결건조
N	1.9(3)	2.03(1)	0.002(1)	0.005
Cl	2.2(3)	2.32(1)	0.003(1)
^a약자: 근방 원자 유형, N=수, R=거리, σ²=데비-월러 인자 (Debye-Waller factor) ^b불확실한 마지막 숫자는 괄호안에 나타낸다. ^c피트의 우수함에 대한 측정으로서 피트 r-인자를 마지막 칼럼에 나타낸다 (Stern, E.A. 등,Physica B 208, 209:117 (1995)).

그 최근방이 잘 정의된 결정성 표본을 또한 사용하여, 또다른 변수인 Pt 원자에 대한 EXAFS 신호의 진폭 감소 인자 S_O ² 를 결정할 수 있다. 상기 수는 비슷한 화학적 (공유, 배위) 상태인 중앙 원자를 갖는 상이한 표본 간에 대체가능하다. 결과 (S_O ² = 0.77 ±0.03) 는 이론적 추산치와 훌륭히 일치하며 [Roy, M. 등, J. Phys. IV France 7:C2-151-C2-152 (1997)], 후속 시스플라틴 표본의 분석에 사용된다.

도 10 에 나타낸 시스플라틴의 포화 수용액의 FT 스펙트럼은 캡슐화된 표본 내의 Pt 원자 근방 확인을 위한 또 다른, 아마도 더 밀접한 기본이 된다. 결정성 시스플라틴과의 비교에서, 3.5Å 거리에 달하기까지 모든 세부사항에 현저한 유사성이 나타난다. 따라서, Pt 근방의 모델은 결정성 표본에서와 같이, 분자의 2 N 및 2 Cl 원자의 최근방 셸에 근거한다. 가장 우수한 피트 (표 3) 는 1.1 내지 2.5Å 간격에서, 오차 간격 내에서 결정성 표본에서와 동일한 모델 변수를 갖으며 수득된다. 동일 셸의 더 높은 차수의 산란 기여도는 4Å 까지의 모델 유효성으로 연장되어, 영역 내 작은 이중 피트에 대한 설명을 제공한다. 결정성 표본에서 확인된 바와 같이, 더 큰 거리의 Pt 원자 근방의 존재는 피트에서 완전히 배제된다. 반대 발견에서는, 만약 사실이라면 물리화학적 데이타 (삼투압, 동결점 저하) 로부터 확실히 알려져야 하는 용액 중 시스플라틴 분자의 응집을 지적할 것이다. 기본적 최근방 모델에 대해 생각할 수 있는 연장 가운데, 데이타에 의해 지지되는 단 하나는 O 원자의 거대 확산 셸이다. 현저하게, 이는 분자의 수화 셸을 나타낸다. 강한 상호작용 하에 있는 그 변수는 만족할만한 정확도로 결정될 수 없다. 그러나, 중요한 점은, 이것이 중앙의 Pt 원자의 바로 주변을 향해 내부로 뻗지는 않는다는 것이다.

도 11-13 (각각 액체, 냉동 및 동결건조됨) 에 나타낸 캡슐화된 시스플라틴의 3 개 표본의 스펙트럼은, 비록 상당히 더 지저분하기는 하지만, k- 뿐만 아니라 r-공간에서 시스플라틴 용액의 것과 완전히 일치한다. 1.1Å 내지 2.5Å 의 R 간격에서의 정량적 분석에서 상기 관찰이 확인된다 (표 3). 제 2 셸 Pt 원자 근방의 존재는 다시 배제되어, 캡슐화 시스플라틴 분자의 응집이 시사되지 않는다. 수화 셸의 기여 흔적은 노이즈에 의해 차단된다.

Pt 원자의 근방에서의 결정 구조의 결정은 응집 상태를 결정하는데 도움을 줄 뿐만 아니라, 그 화학적 구조, 이어서 화학적 안정성까지도 밝힐 수 있다. Pt 원자의 제 1 근방인 직접 결합된 C1 및 N 원자는 모든 표본에서 변화되지 않은 거리 및 배위 수로 발견되며, 이는 시스플라틴 분자가 시스템의 물리적 상태에 의해 크게 영향받지 않음을 나타낸다.

제 1 배위 셸에서 2 개의 N 및 2 개의 C1 원자의 관찰은, 캡슐화된 시스플라틴 분자가 화학적으로 안정하며 가수분해되지 않음을, 즉, 물과 1 개 또는 2 개의 C1 원자를 교환하지 않음을 나타낸다. 상기 복합체 및 이해하기 힘든 시스템의 기타 분석이 표본 제조 중 화학적 및 물리적 변화를 일으킬 수 있지만, 이것은 미변화 표본에서 직접 수득될 수 있기 때문에 중요한 관찰이다.

Pt 원자의 3.37Å 에서의 Pt 근방의 부재는, 리포좀 내부 시스플라틴 용액이 결정화되지 않음을 뚜렷이 나타낸다. 보다 구체적으로, 이것은 결정성 표본의 변형에서 결정화되지 않는다 [Milburn, G.H.W. 등, J. Chem. Soc. A. JCSIA, p. 1609 (1966); Moeller, M. 등, Curr. Op. Cooo. Interf. Sci. 2:177-187 (1997)]. 그러나, 시스플라틴의 또 다른 결정 변형이 공지되어 있다 [Milburn, G.H.W. 등, J. Chem. Soc. A. JCSIA, p. 1609 (1966)]. 그것은, 각각의 Pt 원자에 2.03Å 거리인 2 개의 O 근방에 기여하는 삽입된 물 분자를 대신해, 최근방 Pt 가 4Å 거리 밖으로 제거된 수화된 시스플라틴이다 [Kuroda, R. 등, Inorganic Chemistry 22:3620 (1983); Faggiani, R. 등, Canadian Journal of Chemistry 60:529 (1982)]. 캡슐화된 표본이나 단순 용액은 중앙의 Pt 에 그렇게 가까운 O 원자를 나타내지 않는다. 따라서, 수화 결정 구조 리포좀의 형성도 또한 배제된다.

EXAFS 결과는, 시스플라틴이 포스파티딜콜린 이중층에 흡수되지 않음을 나타내는 지질 이중층에 대한 약물의 광범위한 흡수 연구에 의해 지지된다 [Speelmans, G. 등, Biochim. Biophys. Acta 1283:60 (1996)]. 부가적으로, 동일 시스템의 ¹⁹⁵Pt NMR 연구는 어떠한 선폭증대도 나타내지 않았고, 모든 Pt 신호는 유리 약물 용액에서도 또한 확인된 신속하게 회전하는 약물의 좁은 동위원소 신호에 기인할 수 있다.

냉동 및 동결건조 리포좀 표본은 액체인 것과 유사하다. 표 3 의 데이타는 냉동 또는 동결건조 모두 약물 결정화를 유도하지 않음을 나타낸다. 이는, 리포좀 내부와 비견되는 크기의 포어 (<200 nm) 중 물이 대량의 물에서와 같이 행동하지 않는다는 사실과 일치한다. 냉동 또는 용융과 같은 특성은 물 분자의 캡슐화를 위한 거대 표면 대 부피비에 의해 영향받으며, 용질을 결정화시키지 않으면서 유리질 상태로 단순히 냉동될 수 있다 [Holly, R. 등, J. Chem. Phys. 108:4183 (1998)].

NMR 관찰 뿐만 아니라 상기에 나타낸 데이타는, 리포좀 내부의 시스플라틴이 과포화 용액을 형성함을 제시한다. 리포좀 크기에 따라, 전형적으로 1000-3000 개 약물 분자가 포획된다. 상기 연구에서, 리포좀 크기, 및 지질과 약물 농도로부터, 각 리포좀이 평균 3000 개 근처의 시스플라틴 분자를 함유한다고 추정하는 것이 합당하다. 각 시스플라틴 분자 당 60Å³ 의 분자 부피를 가정하면, 상기 분자가 침전시 형성할 가상 결정의 크기를 계산할 수 있다. 분자가 고형 입방체로 회합한다면, 그 측면은 55-60Å 일 것이다.

임의의 특정 이론에 구애받지 않고, 상기 관찰에 대한 하나의 설명은, 구획화된 분자의 수가 결정 싹 (embryo) 으로부터 실제 결정으로의 에너지 장벽을 통과하기에는 너무 작을 수 있다는 것이다. 그래서, 캡슐화된 시스플라틴 분자는 연속적으로 결정 핵으로 회합하고, 결정화를 개시하기 위한 장벽을 극복하기에 충분한 분자가 없으므로, 응집물이 연속적으로 분해된다. 분자의 구획화 및 이들의 작은 수 및 (작은) 크기가 안정한 열역학적 평형을 달성하는 것을 방지하기 때문에, 이들은 "좌절 (frustrated) 시스템" 의 예가 될 것이다.

리포좀 내 과포화 화합물의 현상은 약물 전달 이외의 분야에서의 용도를 발견할 것임이 이해될 것이다. 예를 들어, 반응 역학과 같이, 수요자 측에서 고농도 제제가 필요한 적용은 즉시 사용가능한 고농도 화합물을 유지하기 위한 방법으로부터 혜택을 받을 것이다. 기타 사용 분야에는 진단 키트, 또는 단백질 및 펩티드의 보관 수단이 포함된다.

본 발명의 리포좀은 리포좀의 수성 코어에 과포화 용액인 약물을 포획(entrap)하여, 리포좀에 높은 약물 대 지질비를 제공한다.

하기 실시예로 본원에 기재된 본 발명이 더욱 예시되지만, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 결코 아니다.

실시예 1

시스플라틴 함유 리포좀의 제조

A. 단계 1: 약물 용액 제조

멸균수를 TEFLON 이 깔린 압력 용기 중에서 63-67℃ 로 가열하고, 염화나트륨 (0.9%) 을 첨가하였다. 시스플라틴을 8.5 mg/ml 농도로 첨가하고, 용해될 때까지 대략 15-25 분 동안 혼합하였다.

B. 단계 2: 지질 용해

PEG-DSPE(폴리에틸렌 글리콜-유도체화 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민) 257.0 g, HSPC(수소화 콩 포스파티딜콜린) 719.4 g 및 콜레스테롤 308.4 g (50.6/44.3/5.1 의 몰비) 을 60-65℃ 에서 탈수 에탄올 900 ml 에 첨가하고, 용해될 때까지 대략 2 시간 동안 혼합하였다. 용해된 지질을 약물 용액 7670 g 에 첨가하여, 대략 150 mg/ml 의 총 지질 농도를 얻었다.

C. 단계 3: 지질 수화/약물 로딩

따뜻한 지질 용액을 따뜻한 (63-67℃) 약물 용액에 혼합하면서 신속히 첨가하여, 불균질한 크기를 갖는 리포좀 현탁액을 형성하였다. 현탁액을 63-67℃ 에서 1 시간 동안 혼합하였다. 수화 혼합물 중 시스플라틴 농도는 7.2 mg/ml 이었고, 이 상태에서 대략 30% 의 약물이 리포좀 내에 캡슐화되었다. 총 용액 부피의 10% 는 에탄올이었고, 총 지질 농도는 150 mg 지질/ml 이었다.

D. 단계 4: 압출

테플론이 깔린 스테인레스 강철 용기 내에 놓인 폴리카르보네이트 필터 카트리지를 통한 조절 압출에 의해, 목적하는 평균 입자 집경으로 리포좀을 정립하였다. 리포좀 현탁액은 압출 공정에 걸쳐 6-8 시간 동안, 63-65℃ 에서 유지되었다.

E. 단계 5: 저등급 여과

정립 후, 리포좀 현탁액을 실온 (20-25℃) 으로 냉각하고, 1.2 ㎛ 142-mm 겔만 베르사포 (Gelman Versapor) 필터 (나일론 66 지지체 상의 아크릴계 공중합체) 를 통해 여과하여, 침전 약물을 제거하였다. 상기 단계에서, 대략 50% 의 약물이 캡슐화되었다.

F. 단계 6: 정용여과

멸균수 중에 수크로오스 (100 mg/ml) 및 염화나트륨 (0.058 mg/ml) 을 용해시켜, 수크로오스/염화나트륨 용액을 제조하였다. 2N HCl 또는 NaOH 로 용액의 pH 를 대략 5.5 로 조정하였다. 용액을 0.22㎛ 듀라포어 (Durapore) 필터를 통해 여과하였다.

리포좀 현탁액을 수크로오스/염화나트륨 용액으로 대략 1:1 (v/v) 비로 희석하고, 폴리술폰 중공 섬유 초여과기를 통해 정용여과하였다. 수크로오스/염화나트륨 용액에 대해 8 배 부피의 교환을 수행하여, 에탄올 및 비캡슐화된 약물을 제거하였다. 공정 플루이드 온도를 약 20-30℃ 로 유지하였다. 총 정용여과 시간은 대략 4.5 시간이었다.

이어서, 리포좀 현탁액을 정용여과에 의해 대략 1.2 mg 시스플라틴/ml 로 농축하였다. 정용여과 공정 후 플루이드를 HPLC 로 시스플라틴 함량에 대해 분석하였다. 리포좀은 0.9% 염화나트륨 중 8.5 mg/ml 시스플라틴의 내부 상 및 수크로오스/염화나트륨 용액의 외부상을 가졌다.

G. 단계 7: 희석

수크로오스/염화나트륨 (10% 수크로오스/1mM NaCl) 중에 히스티딘 (10 mM) 을 희석하여, 최종 혼합물 중 1.55 mg/ml 의 표적 히스티딘 농도로 희석액을 제조하였다. 리포좀 현탁액을 히스티딘 현탁액으로 1.05 mg/ml 의 표적 시스플라틴 농도로 희석하였다. 현탁액의 pH 를 2N NaOH 또는 HCl 로 6.5 로 조정하였다.

H. 단계 8: 멸균 여과

리포좀 현탁액을 33-38℃ 로 가열하고, 0.2 ㎛ 겔만 수퍼 (Gelman Supor) 폴리에테르술폰 필터를 통해 여과하였다. 총 여과 시간은 대략 10 분이었다.

실시예 2

NMR 분석

A. ¹⁵ N-표지된 시스플라틴 [시스-Pt( ¹⁵ NH ₃ ) ₂ Cl ₂ ] 의 제조 및 분석

시스-¹⁵N-디아민디클로로 제 2 백금 (시스플라틴) 을 [Boreham 등, Aust. J. Chem. 34:659 (1981)] 에 기재된 절차에 따라 합성하였다. 생성물을 ¹⁹⁵Pt NMR 분광측정 및 티오우레아 시험 둘 다에 의해 분석하였다. 티오우레아를 ¹⁵N-표지된 시스플라틴 용액에 첨가하고, 용액을 40-50℃ 로 가열하였다. 황색의 출현은 생성물이 시스 입체구조로 있다는 것을 시사하는 반면, 무색 용액의 출현은 트랜스 이성질체의 존재를 시사한다. 시스-¹⁵N-DDP 를 DMF 중에 용해시켜, ¹⁹⁵Pt NMR 로 분석하였다.

B. 시스플라틴 함유 리포좀의 제조

1.64 mg/ml Pt 를 함유하는 99 mg/ml 총 지질 78 mM = 2.40 mg/ml 로, ²⁰⁰⁰PEG-DSPE [폴리에틸렌-글리콜 (M.W. 대략 2000)-유도체화 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민], 콜레스테롤, 거대 단일판 리포좀을 이용하여 초기 ¹⁹⁵PtNMR 측정을 수행하였다.

1. 멸균 안정화된 리포좀 내에 캡슐화된 ¹⁵ N-시스플라틴의 제조

¹⁵N-표지된 시스플라틴 8.5 mg/ml 을 65℃ 에서 0.9% NaCl 중에 용해시키고, 상기 온도에서 1 시간 동안 방치하였다. 상기 에탄올계 용액을 약물 혼합물에 첨가하여 지질을 수화시켰다. 지질 (HSPC(수소화 콩 포스파티딜콜린)/콜레스테롤/²⁰⁰⁰PEG-DSPE 51:44:5) 을 에탄올 중에 용해시켰다. 최종 지질 농도는 65℃ 에서 10% 에탄올 중에 150 mg/ml (15%) 이었다. 혼합물을 60℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, 리포패스트 (Lipofast) 주사 압출기를 이용하여 100 nm 및 200 nm 포어 크기 폴리카르보네이트 필터를 통해 65℃ 에서 압출하였다. 정립한 리포좀 (~100 nm) 을 실온으로 냉각하였다. 냉각 중, 무거운 황색 침전물이 형성되었다. 상청액을 수합하여 실온에서 좀 더 방치하였다. 더 많은 침전이 생성되었고, 상청액을 다시 수합하였다. 표본을 2 배 희석하고, 1 mM NaCl 을 함유하는 10% 수크로오스의 100 배 부피에 대해 실온에서 5 회 투석하였다. 상기 조건 하에서, 1 mM NaCl 을 함유하는 10% 수크로오스와 완전 평형이 이루어졌다. 최종적으로, 히스티딘 완충액 (pH 6.5) 을 최종 농도 10 mM 로 첨가하였다. 최종 리포좀 분산액은 투명한 백색이었다. 리포좀 및 두 침전물의 분취량을 이핵 단일 양자 간섭성 (HSQC) 으로 30℃ 에서 분석하였다.

2. HSQC 실험용 표본 제조

¹⁵N-시스플라틴을 65℃ 에서 0.9% NaCl 또는 10% 수크로오스 (8.5 mg/ml) 중에 용해시켰다. 시스플라틴이 없는 대조군 표본을 제조하여, 동일한 절차에 따라 처리하였다. 냉각 후, 히스티딘 완충액 (10 mM, pH=6.5) 을 첨가하였다. 처리 표본을 4℃ 또는 -20℃ 에서 보관하였다.

C. NMR 측정

1. ¹⁹⁵ PtNMR

5 mm 의 컴퓨터로 스위치가능한 탐침이 장착된 7.05 T 마그넷 (magnet) 을 갖는 배리안 (Varian) VXR-300S 분광측정기 상에서 ¹⁹⁵PtNMR 측정을 수행하였다. -1624 ppm 에 세팅된 K₂PtCl₄ 의 외부 참조 신호에 대한 백금의 화학적 이동을 측정하였다. 100.0 kHz 의 스펙트럼 폭, 0.010 s 의 습득 시간을 이용하여, 양성자의 광밴드 디커플링이 있고, 없는 데이타는 수집하였다. 통상, 350,000 펄스 이상이 수득되었고, 300 Hz 의 선폭증대가 적용되었다. 37℃ 및 60℃ 에서 스피닝 없이 표본을 측정하였다. 농도를 아는 내부 참조로서, K₂PtCl₄ 2 mg/ml (4.82 ×10^-3M) 을 포함하는 모세관을 NMR 튜브에 첨가하였다. 가공 및 적분 전의 자연적 선폭 (Hz) 과 동일한 선폭증대를 이용하여 데이타를 아포다이즈시켰다.

2. ³¹ P NMR

5 mm 의 컴퓨터 스위치가능한 탐침을 이용하여, 실온 및 60℃ 에서 ³¹P 측정을 수행하였다. 0 ppm 에 세팅된 인산에 대한 ³¹P 의 화학적 이동을 측정하였다. 10000 Hz 의 스펙트럼 폭 및 1.6 s 의 습득 시간을 이용하여, 양성자의 광밴드 디커플링을 갖는 데이타를 수집하였다. 보통, 250 펄스 이상이 수득되었고, 20.0 Hz 의 선폭증대가 적용되었다. 위약 (대조군) 및 시스플라틴 로딩된 리포좀을 ³¹P NMR 로 연구하였다. 리포좀은 거대 단일판 소포 (LUV) 를 포함하였고, 55:40:5 몰비의 수소화 포스파티딜콜린 (HPC), 콜레스테롤 및 ²⁰⁰⁰PEG-DSPE 로 구성되었다. 본래 리포좀 표본 700㎕ 을 D₂O 70㎕ 과 혼합하여, 표본을 제조하였다.

3. HSQC NMR 측정

5mm 다핵 역 검출 탐침이 장착된 브루커 (Bruker) DXR 400 MHz NMR 분광측정기를 이용하여, 모든 [¹H, ¹⁵N] HSQC 데이타를 수득하였다. INVIGSTP (이중 INEPT(Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer) 전이를 통한 역 검출 2D ¹H-X 상관도, 습득 중 디커플링이 있는 TPPI(시간 비례 위상 증분)를 이용한 상 민감도) 의 브루커 서열을 이용하여, 2D 데이타를 기록하였다. GARP-1 서열을 이용하여 습득 시간 도중, ¹⁵N 스핀을 조사하였다. ¹⁵N 의 화학적 이동은 1M HCl 중 1.5 M NH₄Cl 을 외부 참조로 삼았다: ¹H 의 화학적 이동은 TSP (Me₃Si(CD₂)₂CO₂Na) 를 외부 참조로 삼았다. 0.251s 의 습득 시간, f₂ 및 f₁ 단위 둘 다에서 2KHz 의 스펙트럼 폭, 및 t₁ 의 256 증분을 이용하여, 2-8 전이체가 수득되었다. 모든 스펙트럼을 300°K (27℃) 에서 수득하였다. 스펙트럼을 대략 20 분 동안 수집하여, 선폭증대가 없는 데이타를 브루커 소프트웨어를 이용하여 처리하였다.

4. ¹⁹⁵ PtNMR 에 의한 백금 함량의 정량

K₂PtCl₄ 는 그 화학적 이동 (-1624 ppm) 이 시스플라틴 (-2100 ppm) 과 매우 가깝지만 겹치지 않을 정도로 떨어져 있는 안정한 화합물이므로, 내부 참조로 선택되었다. K₂PtCl₄ (2 mg/mL, 4.82 mM) 을 모세관 중에 봉하고, 진한 염산을 첨가하여 그 가수분해를 방지하였다. 모세관을 표본을 포함하는 5 mm NMR 튜브 내로 삽입하여, 상기 기재된 대로 ¹⁹⁵Pt NMR 스펙트럼을 수득하였다.

본 방법의 정확도를 평가하기 위해, 다양한 농도 (1.54, 2.0 및 2.31 mg/ml) 의 3 개 시스플라틴 표본을 37℃ 에서 모세관의 존재 하에 측정하였다. 곡선 하부 면적을 참조 피크 하부 면적에 대해 적분하여, 원소 백금 농도를 계산하였다. 계산도를 확인하기 위해, 원자 흡수 (AA) 측정을 수행하였다.

5. 원자 흡수 분광측정

배리안 SpectrAA Zeeman 300 분광측정기 상에서 원자 흡수 측정을 수행하였 다. 농도를 아는 K₂PtCl₄ 원액 (250 ng/ml, 6.02 ×10^-7 M) 의 적정 곡선에 따라 백금 농도를 계산하였다.

실시예 3

EXAFS 분석

A. 리포좀 제조

1. 재료

콜레스테롤 (CH) (Croda, Fullerton, CA); 수소화 콩 포스파티딜콜린 (HSPC) (Lipoid, Ludwigshafen, 독일); N-카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000-1,2-디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민 소듐염 (MPEG-DSPE) (Sygena, Liestal, 스위스). 시스플라틴 (USP 등급, 98% 이상 순도) (Heraeus GmbH, Hanau, 독일).

2. 리포좀 제조

리포좀-캡슐화된 시스플라틴을, 에탄올계 지질 용액을 65℃ 에서 약물 용액 내로 주사하여 다중판 소포를 형성시킨 후 냉각 및 투석하는 실시예 1 에 기재된 대로 제조하였다. 리포좀 지질 조성은 HSPC/CH/MPEG-DSPE 가 51:44:5 의 몰비였다. 시스플라틴 농도는 1.1 mg/ml 이었고, 겔 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 약물 캡슐화는 98% 이었다. 총 지질 농도는 118 mM 이었고, 동적 레이저-광 산란 (Coulter 모델 N4MB, Miami, FI) 에 의해 결정된 평균 입자 직경은 106 nm 이었다. 캡슐화된 시스플라틴을 0.9% (w/v) NaCl 용액 중에 용해시키고, 리포좀을 0.9% NaCl 용액, 10 mM 시스티딘 (pH 6.5) 의 수성상에 현탁시켰다.

위약 리포좀을 시스플라틴 리포좀과 동일하지만 약물을 함유하지 않도록 만들었다. 위약 리포좀은 101 nm 의 평균 입자 직경 및 73 mM 의 총 지질 농도를 가졌다.

동결건조된 시스플라틴 리포좀을 하기와 같이 제조하였다. 시스플라틴 함유 조성물의 표본을, 실온에서 12 시간에 걸쳐, 분자량 컷오프 14,000 투석 튜빙 및 10% (w/v) 수크로오스 용액의 20 배 부피 교환액 4 개를 사용하여 투석하였다. 이어서, 10% 수크로오스 용액 중 생성 리포좀 현탁액을 드라이 아이스/이소프로판올 혼합물을 이용하여 급속 냉각하고, 고진공 (100 mTorr) 에서 하룻밤 동안 동결건조시켰다.

B. EXAFS 측정

Deutschen Elektronen-Synchrotron DESY (Hamburg, 독일) 에서 Hamburger Synchrotronstrahlungslabor HASYLAB 내 x-선 빔라인 ROEMO2 (X1.1) 의 발신 모드로 표본의 백금 L₃-에지 EXAFS 스펙트럼을 측정하였다. Si (311) 고정 출구 이중-결정 단색화장치를 12keV 에서 2eV 해상도로 사용하였다. 안정화 피드백 콘트롤을 이용하여 단색화장치 결정을 디튜닝함으로써, 고조파를 효과적으로 제거하였다. 1 바의 아르곤이 충전된 이온화 셀을 사용하여, 표본을 통한 단색화 x-선 빔의 입사 및 투과 플럭스를 검출하였다. 1s/포인트의 적분 시점으로 x-선 광자 에너지의 함수로서 흡광도 스펙트럼을 기록하였다. 에지 위 1000 eV 영역 내에서 표준 다단식 진행을 채택하였다.

액체, 냉동 및 동결 건조된 리포좀-캡슐화된 시스플라틴 표본 및 시스플라틴 수용액을 KAPTON^TM 윈도우로 다양한 길이의 액체 흡광도 셀 중에 제조하였다. 표본 중 Pt 의 매우 낮은 농도로 인해, 최적 흡광도 두께는 액체 표본의 5 mm 두께층 및 동결건조 표본의 2 mm 층에서 발견되었다. 수득된 PtL₃ 에지 점프는 총 2 의 흡광도 두께에서, 리포좀 캡슐화 표본 및 수용액 각각에 대해 단지 0.04 및 0.1 이었다. 10 회 실험 수행을 포개어, 신호 대 노이즈비를 개선시켰다. 참조 스펙트럼은 빈 리포좀 수용액의 5 mm 두께층 상에서 취하였다. 약 1 의 에지 점프로, 분말 결정 표본을 접착 테이프의 다중층 상에 제조하였다. 참조 스펙트럼을 빈 테이프 상에서 측정하였다.

본 발명이 특정 구현예에 대해 기재되었지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명에서 벗어나지 않고 만들어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.

도 1a-1b 는 광밴드 디커플링 (broad band decoupling) 을 갖는 (도 1a) 및 광밴드 디커플링을 갖지 않는 (도 1b) 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 ¹⁹⁵Pt NMR 스펙트럼이다;

도 2 는 리포좀에 캡슐화된 시스플라틴의 ¹⁹⁵Pt NMR 스펙트럼이다;

도 3a-3b 는 시스플라틴 함유 리포좀 (도 3a) 및 대조군인 위약 리포좀 (도 3b) 의 ³¹P NMR 스펙트럼이다;

도 4a-4b 는 수중 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 이핵 단일 간섭성 (heteronuclear single quantum coherence) 분광측정에 의해 수득되는 스펙트럼 (도 4a) 및 영역 I(b) 의 확대 (도 4b) 이다;

도 5 는 리포좀에 캡슐화 후 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 이핵 단일 양자 간섭성 분광측정에 의해 수득되는 스펙트럼이다; "x" 로 표시된 피크는 확인되지 않았다;

도 6 은 히스티딘 완충액의 존재 하에 캡슐화 후 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂ 의 이핵 단일 양자 간섭성 분광측정에 의해 수득되는 스펙트럼이며, 피크 1-7 은 시스-Pt(¹⁵NH₃)₂Cl₂-히스티딘종에 기인한다;

도 7 은 N-아세틸-히스티딘과 인큐베이션 후 시스플라틴의 이핵 단일 양자 간섭성 분광측정에 의해 수득되는 스펙트럼이다;

도 8 은 결정성 시스플라틴, 용해된 시스플라틴 및 3 개의 리포좀에 캡슐화된 시스플라틴 표본 (액체, 냉동 및 동결건조) 의 k² 칭량된 Pt L3-에지 확장 x-선 흡수 미세 구조 (edge extended x-ray absorption fine structure, EXAFS) 스펙트럼이다. 스펙트럼은 뚜렷이 수직 이동하였고, 최적 데이타 (점으로 나타남) 를 실선으로 나타낸다;

도 9 는 결정성 시스플라틴의 EXAFS 스펙트럼의 k²-칭량된 파우리어 (Fourier) 변환이며, 실선은 실험 데이타를 나타내고, 최적 피트 (fit) 모델 함수는 실괘선으로 나타낸다;

도 10 은 수중 용해된 시스플라틴의 EXAFS 스펙트럼의 k²-칭량된 파우리어 변환이며, 설명은 도 9 에서와 같다;

도 11 은 리포좀에 포획된 시스플라틴의 액체 표본의 EXAFS 스펙트럼의 k²-칭량된 파우리어 변환이며, 설명은 도 9 에서와 같다;

도 12 는 리포좀에 포획된 시스플라틴의 냉동 표본의 EXAFS 스펙트럼의 k²-칭량된 파우리어 변환이며, 설명은 도 9 에서와 같다;

도 13 은 리포좀에 포획된 시스플라틴의 동결건조 표본의 EXAFS 스펙트럼의 k²-칭량된 파우리어 변환이며, 설명은 도 9 에서와 같다.

Claims

하기를 포함하는, 과포화 용액의 형태로 포획(entrap)된 화합물을 갖는 리포좀 제조 방법:

조건에 따라 그 실온 수용성이 2 배 이상의 증가가 가능한 화합물의 선택 단계;

상기 화합물의 과포화 수용액으로부터의, 상이한 크기 간격의 리포좀의 제조 단계;

포획된 침전 화합물의 존재 유무에 대한 상기 리포좀의 분석 단계; 및

상기 분석에 기초하여, 포획된 침전 화합물을 갖지 않는 리포좀에 해당하는 크기의 리포좀의 선택 단계.
제 1 항에 있어서, 화합물의 선택에 (i) 용매 온도의 증가, (ii) 공용매의 첨가, 및 (iii) 용매 pH 의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 조건에 따라, 상온에서 증가된 수용성을 갖는 화합물의 선택이 포함되는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포좀의 선택에 60 nm 내지 1000 nm 의 리포좀 크기를 갖는 리포좀의 선택이 포함되는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포좀의 제조에 60 nm 내지 1000 nm 의 리포좀 크기 간 격으로 포획된 화합물을 갖는 리포좀의 제조가 포함되는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포좀의 제조에 70 nm 내지 500 nm 의 리포좀 크기 간격으로 포획된 화합물을 갖는 리포좀의 제조가 포함되는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포좀 제조 단계에 지질 용액의 제조가 포함되는 방법.
제 6 항에 있어서, 지질이 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 지질 용액이 경화 지질 이중층을 형성하기에 효과적인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 화합물의 증가된 수용성을 유지시키는 조건의 변경을 추가적으로 포함하며, 상기 변경은, 외부 현탁 매질 중, 약물을 그의 실온 용해도 초과로 유지시키기 위해 선택된 조건의 변경을 포함하는 방법.
하기를 포함하는, 화합물의 과포화 용액을 함유하는 리포좀 제조 방법:

리포좀의 내부 수성 구획 내에 포획하기 적합한 화합물의 과포화 수용액 제조 단계;

지질막 또는 지질 용액을 화합물의 상기 과포화 용액으로 수화시켜 리포좀을 형성하는 단계;

리포좀을 선택된 크기로 정립하는 단계;

각각의 크기의 리포좀을 침전 화합물의 존재 유무에 대해 분석하는 단계; 및

상기 분석에 기초하여, 침전 화합물을 갖지 않는 리포좀에 해당하는 크기를 갖는 리포좀의 선택하는 단계.
제 7 항에 있어서, 친수성 중합체 사슬이 폴리에틸렌 글리콜인 방법.