CN104203216A - 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法 - Google Patents

热敏纳米颗粒制剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104203216A
CN104203216A CN201380014896.2A CN201380014896A CN104203216A CN 104203216 A CN104203216 A CN 104203216A CN 201380014896 A CN201380014896 A CN 201380014896A CN 104203216 A CN104203216 A CN 104203216A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposome
approximately
doxorubicin
concentration
liposomal formulation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380014896.2A
Other languages
English (en)
Inventor
R·A·里德
苏大水
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Imunon Inc
Original Assignee
Celsion Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celsion Corp filed Critical Celsion Corp
Priority to CN201710048411.1A priority Critical patent/CN106727329B/zh
Publication of CN104203216A publication Critical patent/CN104203216A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种热敏脂质体制剂，更特别地涉及一种包含磷脂和表面活性剂的脂质体制剂，其中所述脂质体支持在低于或等于约8℃的温度下长期储存，控制降解物形成以最大化产品效价，并且在温和的较高温度下释放它们的包含物。还描述了制备制剂的方法。

Description

热敏纳米颗粒制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种热敏脂质体制剂，更特别地涉及一种包含磷脂和表面活性剂的脂质体制剂，其中所述脂质体支持在低于或等于约8℃的温度下长期储存，控制降解物形成以最大化产品效价，并且在温和的体温过高(hyperthermic)温度下释放其包含物。还描述了制备制剂的方法。
背景技术
脂质体是由至少一个包封水性内部隔室的脂质双层膜组成。脂质体可以通过膜类型和尺寸表征。小单层囊泡(SUV)具有单层膜且直径通常介于0.02至0.25μm之间；大单层囊泡(LUV)通常大于0.25μm。寡层大囊泡(oligolamellar large vesicle)和多层大囊泡具有多个、通常同心的膜层，并且通常大于0.25μm。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大囊泡内的几个小囊泡，称为多囊囊泡。
脂质体可以配制成载有治疗剂、药物或其它活性剂，所述治疗剂、药物或其它活性剂包含在水性内部空间(水溶性活性剂)或分布在脂质双层内(水不溶性活性剂)。脂质体也可以结合允许活性剂递送到特定目标位置的抗体或靶分子。将药物包囊在脂质体中(1)降低了药物的毒性，(2)避免了身体的防御，所述防御通常识别外源颗粒并且将它们作为靶标通过肝和脾的网状内皮系统(RES)除去，和(3)使该药物载体靶向于作用的治疗位置，并且一旦到达该位置，快速释放药物以便其可以作用于靶组织。进一步，可以通过将聚乙二醇脂质引入到脂质体膜而抑制脂质体被网状内皮系统(RES)的细胞从血液清除；这些脂质抑制标识供RES摄取的脂质体的蛋白质吸附。
脂质体可以设计为不渗漏的，但是如果该脂质体膜中出现小孔，或者如果该膜变成液体(例如，发生从固相或凝胶相到液相的相变)，或者如果该膜降解或溶解，则变成可渗漏的。这样的渗透性分解可以通过施加电场(电穿孔)或将脂质体暴露于酶或表面活性剂而诱发。另一种方法包括使膜的温度升高至其由凝胶向液相转化温度附近的温度，此时似乎在部分液体和部分固体膜中的相边界区域的孔缺陷能增加水、离子和小分子的跨膜转运。临床上体温升高称为体温过高(Hyperthermia)。该过程用于升高受试者的目标部位的温度，并且如果热敏脂质体可以递送到该目标部位，则该温度升高可以触发脂质体内含物的释放，引起治疗剂在目标部位的选择性递送和释放，如Yatvin等人,Science 204:188(1979)最初描述的。然而，该技术受到其中脂质体的相变温度高于(大于37℃)正常组织温度的条件的限制。
体温过高引起多种生物学变化。综述参考Issels RD.Hyperthermia adds to Chemotherapy,European J of Cancer(2008)44:2546-2554。温和的体温过高范围(39-44℃)内的温度调节局部的生理变化，比如血流量、血管系统渗透性和组织氧合作用增加。支持实体瘤的血管系统的结构混乱，且内衬微血管系统的内皮细胞没有密封在一起，通常导致多孔性(porous quality)。体温过高引起异常肿瘤微血管系统中的孔径增加，因此增强纳米尺寸分子(比如直径约100nm的脂质体)外渗到肿瘤间质中(Bates DA,Mackillop WJ.Hyperthermia,adriamycin transport,and cytotoxicity in drug-sensitive and-resistantChinese hamster ovary cells,Cancer Res(1986)46:5477-5481；Nagaoka S,Kawasaki S,Sasaki K,Nakanishi T.Intracellular uptake,retention and cytotoxic effect of adriamycin combined withhyperthermia in vitro.Jpn J Cancer Res(1986)77:205-211)。为此，温和的体温过高选择性地对肿瘤细胞致死，抗肿瘤效果随温度升高而增加。
热敏性脂质体将高浓度的化疗剂运载至实体瘤，支持血管系统，并且当加热时局部释放药物。体温过高选择性地提高脂质体摄取、脂质体渗透性、刺激局部药物释放、增加药物流入肿瘤细胞中、和增加药物结合肿瘤细胞DNA(后者对于许多化疗剂的作用机制很重要)。
为了开始使用体温过高治疗深部肿瘤(例如，前列腺、卵巢、结肠直肠和乳腺的肿瘤)，因此，期望设计能够响应温和的体温过高条件(即，在39-45℃范围内的临床可得到的温度)而递送治疗量的活性剂的脂质体制剂。
美国专利No.6,726,925描述了对于周围环境温度的改变敏感的脂质体。该脂质体特别地载有多柔比星，一种批准且经常使用的治疗大量癌症的肿瘤药物。含有多柔比星的脂质体制剂是静脉内给药的，并且与体温过高组合可以提供局部肿瘤控制和改善生活质量。局部温和的体温过高(39.5-45摄氏温度)从脂质体释放包埋的多柔比星。该递送技术使得高浓度的多柔比星优选地沉积在目标肿瘤中。美国专利No.7,901,709描述了一种用于热活化多柔比星的脂质体包囊的方法。
公布的国际申请No.WO 2007/024826描述了一种储存脂质体或纳米颗粒制剂的方法，其包括冷冻这样的制剂。所述制剂描述了储存具有增强的稳定性和储存特性的脂质体的方法。
使体温过高活化的脂质体-药物制剂有效所需的关键设计原理是∶1)接近完全包囊活性剂，以使该药物在体循环中与脂质体结合，2)设计成在正常体温(37℃)下保留药物且在温和的体温过高温度(即41-43℃)下释放药物的膜，3)膜组合物和粒度，其能使脂质体保持在体循环中足够长时间以允许应用加热模态触发药物释放至其目标，和4)脂质体尺寸，其允许脂质体穿过渗漏性肿瘤微血管系统从血流外渗而使化疗药物靶向于肿瘤部位。
本发明人发现关于多柔比星的脂质体制剂(例如美国专利No.7,901,709中公开的)一个另外的重要设计问题是多柔比星复合物(共晶体或盐)的形成对于最终药物产品稳定性的稳定作用。成功控制降解速率将导致对药物产品的储存温度和长期稳定性的显著影响。两种感兴趣的降解产物为8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A。
本发明解决了多柔比星脂质体制剂中药物降解产生柠檬酸盐复合物(共晶体或盐)的长期存在的问题。已经发现柠檬酸盐复合物在多柔比星不稳定性和降解物形成方面起重要作用。更具体地，8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的形成可以通过将柠檬酸盐复合物的形成改变成硫酸盐复合物(共晶体或盐)的形成而显著减少。另外，本发明保持了上述对于含有活性剂的有效的体温过高活化的脂质体制剂的关键设计原理。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和包埋在该脂质体内的多柔比星；所述脂质双层包含∶
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质(lysolipid)，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述脂质双层成分是以(i)∶(ii)∶(iii)为约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；其中该悬浮液中脂质体具有约50至约150nm之间的平均粒度，
其中在约低于或等于8℃下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于0.5％，并且其中杂质A为当使用高效液相色谱(HPLC)进行分离时具有约1.4的相对保留时间的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱缓冲液。
在另一个方面，本发明提供一种将多柔比星负载到热敏脂质体的方法，其包括：
(a)制备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度铵离子，所述脂质双层包含：
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述脂质双层成分以(i)：(ii)：(iii)为约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；并且
其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150nm之间的平均粒度；
(b)将多柔比星的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述多柔比星被吸收到所述脂质体中。
在另一个方面，本发明包括通过上述方法制备的脂质体制剂。
在另一个方面，本发明包括包含多柔比星和显像剂的脂质体制剂。在仍然另一个方面，本发明包括包含多柔比星和另一种药物的脂质体制剂。
本发明的这些及其它方面和优点为下文详细描述的。
附图说明
图1图解表示含有二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)作为磷脂、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000(DSPE-MPEG)和单硬脂酰基-磷脂酰胆碱(MSPC)作为溶解脂质的双层膜的脂质体。指示出溶解脂质单体的定向及其存在于该脂质双层的内层和外层中。
图2为铵-负载的多柔比星脂质体的制备方法的示意图。
图3为通过挤压法形成的NH4 +-负载的多柔比星脂质体的粒度分布。
图4描绘使用本领域已知的方法制备的pH-负载的脂质体的差示扫描量热法图表(扫描速率2℃/分钟)。
图5描绘本发明的NH4 +-负载的脂质体的差示扫描量热法图表(扫描速率2℃/分钟)。
图6描绘根据本领域已知的方法制备的pH-负载的脂质体的穿隧型电子显微镜照片。
图7描绘根据本发明制备的NH4 +-负载的脂质体的穿隧型(tunneling)电子显微镜照片。
图8显示基于pH-负载的和NH4 +-负载的脂质体的溶液温度的多柔比星释放曲线的比较。
图9a和9b显示分别在pH-负载的和NH4 +-负载的多柔比星脂质体中8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的水平的比较。“A”和“B”条指示使用源自不同供应商的赋形剂制备的制剂的杂质水平。图9a和9b也显示三个重复运行的根据本发明制备的NH4 +-负载的多柔比星脂质体的杂质8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的水平。
图10显示在2-8℃下长时间储存时在pH-负载的和NH4 +-负载的多柔比星脂质体中多柔比星的水平。
图11显示在2-8℃下长时间储存时在pH-负载的和NH4 +-负载的多柔比星脂质体中降解物生长的水平。
图12显示在-20℃下长时间储存时在pH-负载的和NH4 +-负载的多柔比星脂质体中多柔比星的水平。
图13显示在-20℃下长时间储存时在pH-负载的和NH4 +-负载的多柔比星脂质体中降解物生长的水平。
发明详述
现在，将参照本文给出的实施方案和附图来描述本发明。这些实施方案仅仅是用于举例说明的目的，不应当解释为如权利要求所定义的限制本发明。
在一个方面，本发明提供一种脂质体的制剂，其包含脂质体悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和包埋在该脂质体内的活性剂；所述脂质双层包含∶
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述活性剂选自：多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱，并且
其中所述脂质双层成分是以约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；并且其中该悬浮液中脂质体大小在约50和约150nm之间。
在一个实施方案中，所述活性剂为多柔比星，并且在低于或等于8℃下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于0.5％，其中杂质A为在高效液相色谱(HPLC)中相对保留时间为约1.4的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件。
在一个实施方案中，在低于或等于8℃下储存6个月之后杂质A的相对浓度为低于约0.5％、或低于0.4％、或低于0.3％、或低于0.2％。在另一个实施方案中，在低于或等于8℃下储存一年之后杂质A的相对浓度为低于约0.5％、或低于0.4％、或低于0.3％、或低于0.2％。在另一个实施方案中，在低于或等于8℃下储存约2年之后杂质A的相对浓度为低于约1％、0.75％、0.5％、或低于0.4％、或低于0.3％、或低于0.2％。
在一个实施方案中，在低于或等于8℃下储存6个月之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度为低于约0.5％、低于0.4％、低于0.3％或低于0.2％。在另一个实施方案中，其中在低于或等于8℃下储存约一年之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度为低于约0.5％、低于0.4％、低于0.3％或低于0.2％。在另一个实施方案中，在低于或等于8℃下储存约2年之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度为低于约2.0％、低于1.6％、低于1.5％、低于1.0％、低于0.5％、低于0.4％、低于0.3％或低于0.2％。
在一个进一步的实施方案中，在约低于或等于8℃的温度下储存150天之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8℃的温度下储存约六个月之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8℃的温度下储存约一年之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8℃的温度下储存约两年之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。
在另一个实施方案中，本发明为一种药物组合物，其中在约低于或等于8℃的温度下储存150天之后形成的总降解产物为低于1％、或低于0.5％。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物组合物，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约六个月之后形成的总降解产物为低于1％或低于0.5％。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物组合物，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约一年之后形成的总降解产物为低于1％或低于0.5％。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物组合物，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约两年之后形成的总降解产物为低于2.5％、低于1％或低于0.5％。
在仍然另一实施方案中，脂质体悬浮在包含糖的缓冲液中。所述糖可以是单糖，比如乳糖，或二糖，比如蔗糖。在另一个实施方案中，所述缓冲液进一步包含组氨酸。
在另一个方面，本发明提供一种将活性剂负载到热敏脂质体的方法，其包括：
(a)制备脂质体悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含：
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述脂质双层成分以(i)：(ii)：(iii)为约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；并且
其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150nm之间的平均粒度；
(b)将活性剂的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述活性剂被吸收到所述脂质体中，
其中所述活性剂选自：多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱。
在一个实施方案中，所述活性剂为多柔比星。在另一个实施方案中，溶液中存在的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％的多柔比星被吸收到脂质体中。
在另一个实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约1mM至约200mM，优选地约10至约65mM，最优选地约45mM至约55mM。在一个进一步的实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约50mM。在另一个实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约75mM。
本发明的脂质体由选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺的磷脂组成。所述磷脂优选地具有在体温过高范围(例如，约38℃至约45℃的范围)的较低端的从固体或凝胶形式向液态的转变温度。更优选的是其酰基基团是饱和的磷脂。在一个实施方案中，所述一种或多种磷脂具有两个相同或不同的C14-C20酰基，比如例如二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、或其组合。
本发明的脂质体由一种或多种溶解脂质组成。在一个实施方案中，所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、单月桂酰基磷脂酰胆碱(MLPC)、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(MMPC)、单硬脂酰基磷脂酰胆碱(MSPC)、或其混合物。
在本发明的一个实施方案中，最终脂质体制剂中脂质的总浓度为约10-50mg/mL、约20-50mg/mL、约30-40mg/mL、约20mg/mL、约30mg/mL、或40mg/mL。在另一个实施方案中，所述脂质体制剂中多柔比星的浓度为约0.2-40mg/mL、约0.5-30mg/mL、约1-20mg/mL、约2-10mg/mL、约1mg/mL、约2mg/ml、约3mg/mL、约4mg/mL或约5mg/mL。在本发明的一个实施方案中，多柔比星与脂质的比例为0.02-10、约0.05、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10。
本发明的脂质体包括聚合物-衍生的脂质以减少被RES摄取的脂质体，从而增加脂质体的循环时间。合适的聚合物包括亲水性聚合物，比如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、低聚糖、以及上述的混合物。在一个实施方案中，所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为聚乙二醇衍生的(PEG化的)脂质。优选地，所述PEG化的脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000]。
在一个实施方案中，本发明提供一种使脂质体负载活性剂的方法，所述活性剂为博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨或长春新碱。
在一个实施方案中，所述制备包括在铵盐(以硫酸铵溶液提供)的存在下制备脂质体。在一个实施方案中，所述溶液中硫酸铵的浓度为约100mM至约300mM，优选约200mM。.
在另一个实施方案中，所述铵盐以如下酸的盐提供：己二酸、L-抗坏血酸、L-天门冬氨酸、柠檬酸、富马酸、谷氨酸、戊二酸、马尿酸、盐酸、D,L-乳酸、马来酸、L-苹果酸、磷酸、琥珀酸、或L-酒石酸。在一个进一步的实施方案中，所述溶液中的铵盐为约100mM至约300mM，优选约200mM。
脂质体外部的铵离子被单糖或二糖溶液替代。在一个进一步的实施方案中，所述单糖或二糖溶液的浓度为约5-15％，优选约10％。该替代或交换可以通过技术比如透析或渗滤进行。
在一个进一步的实施方案中，在脂质体外部的铵离子被单糖溶液替代，比如例如乳糖溶液。在另一个实施方案中，在脂质体外部的铵离子被二糖溶液替代，比如例如蔗糖溶液。
在一个实施方案中，在步骤(b)之后，将组氨酸缓冲液加入到脂质体制剂中。在一个进一步的实施方案中，组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约15mM，优选约10mM。
根据本发明，制备脂质体制剂的方法包括在合适的有机溶剂中，
以合适的比例混合双层组分。有用的溶剂包括氯仿、丙酮、甲醇或二氯甲烷。然后，蒸发溶剂以形成干燥的脂质膜。使用含有平衡量的溶解脂质和期望的活性剂(例如多柔比星)的水溶液，将该膜再水合(在高于脂质混合物的相变温度的温度下)。将在再水合之后形成的脂质体挤出形成期望尺寸的脂质体。例如，当制备由80:20DPPC:MSPC组成的脂质体时，在高于该特定脂质混合物的相变温度的温度(高于39℃)下进行再水合。用于再水合脂质膜的水溶液包括平衡量的溶解脂质单体(例如，浓度等于MSPC的临界胶束浓度，约1微摩尔)。
建议的制备方法和控制的说明
用于铵-负载的制剂的大规模批次的制备方法描述如下。该方法可以用于制备各种规模批次的制剂，例如2-2000L规模批次。所建议的制备方法以示意图图解在图2中。
逐步制备方法∶
1.通过将合适量的硫酸铵溶于注射用水(WFI)中，接着进行生物负荷减少过滤(bioburden reduction filtration)。缓冲液的摩尔浓度可以为例如200mM。
2.在高温(45-70℃)下，利用来自步骤1的硫酸铵缓冲液水合该脂质合适的时间段。例如，在60℃下水合该脂质1小时。
3.在高温下，通过具有特定孔径的滤膜挤出水合的混合物，以便获得期望尺寸的脂质体。例如，将该水合的脂质混合物在65℃下挤压穿过80nm的聚碳酸酯滤器，形成～100nm的脂质体。
4.对着糖类溶液(例如10％蔗糖溶液)，交换非脂质体包埋的硫酸铵，接着通过预热的过滤器(比如Sartobran P过滤器)无菌过滤。
5.通过将合适量的组氨酸HCl溶解在WFI中，接着无菌过滤来制备组氨酸HCl缓冲液，例如100mM pH6的组氨酸缓冲液。
6.通过将合适量的多柔比星HCl溶于WFI中，接着无菌过滤，制备多柔比星HCl溶液，例如5.0mg/mL的浓度。
7.混合1.0份的无菌脂质体与0.8份的无菌多柔比星HCl溶液，并在35℃下温育4小时。
8.加入0.2份无菌组氨酸缓冲液，并充分混合。
在一个实施方案中，本发明是通过将多柔比星负载到热敏脂质体中的方法制备的脂质体的制剂，其包含：
(a)制备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含：
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述脂质双层成分以(i)：(ii)：(iii)为约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；和
其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150nm之间的平均粒度；
(b)将多柔比星的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述多柔比星被吸收到所述脂质体中。
已经报道了直径为0.05和0.3微米之间的脂质体适用于肿瘤给药(Allen等人的美国专利No.5,527,528)。根据本发明的脂质体大小分级可以根据本领域已知的方法进行，并且考虑其中所含的活性剂及所期望的效果(参见，例如Martin等人的美国专利No.5,225,212；Allen等人的美国专利5,527,528，将其公开内容以整体通过引用并入本文)。在本发明的一个优选的实施方案中，脂质体的直径为约0.05微米或约0.1微米，至直径为约0.3微米或约0.4微米。脂质体制剂可以包含不同尺寸(大小)的脂质体。有利地，这些脂质体包括本文所述脂质混合物，因此如所述的是热敏的、具有释放所包含药物的能力。
在本发明的一个方面，脂质体制备成具有在所选择尺寸(大小)范围内基本上均匀的尺寸。一种有效的尺寸分级方法包括将脂质体的水性悬浮液挤出穿过一系列具有所选择的均匀孔径的聚碳酸酯膜；该膜的孔径将大致对应于挤出穿过所述膜所产生的脂质体的平均尺寸。参见例如美国专利No.4,737,323。
在本发明的另一个优选的实施方案中，脂质体的直径为约50nm、100nm、120nm、130nm、140nm或150nm、至多约175nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或500nm。
在一个实施方案中，本发明的脂质体制剂储存在低于或等于8℃、约2℃至约8℃、约-80℃至约-15℃、约-30℃至约-15℃或约-15℃至约2℃的温度下。
在另一个方面，所述脂质体制剂包括多柔比星和成像或诊断剂。由于许多原因，需要将显像剂包囊在脂质体中或包囊显像剂与治疗剂的组合物的能力。首先，活性剂的治疗效果将随着显影的显像剂的释放且因此推断药物释放的能力而提高。这可提供确定药物的组织渗透和浓度的工具。进一步，将药物与显像剂结合在脂质体中允许监测和定量药物随时间推移的释放、组织分布和药物清除。其次，携带和释放显像剂的脂质体将使得有机会预筛选患者。例如，选择患者人群可以确定为可能受益于基于肿瘤血管系统的“渗漏性”的治疗性脂质体。如使用显像剂显影的渗漏性是该活性剂外渗穿过微血管系统和任何纤维变性组织以达到和治疗肿瘤的能力的指示物。可以使用的显像剂或诊断剂的实例包括，但不限于X射线成像、磁共振成像(MRI)、超声成像或核医学成像的试剂。
在X射线成像(包括应用比如计算机断层扫描(CT)和数字式减影血管造影(DSA))中，对比度是基于电子密度的差异。在本发明的一个方面，脂质体制剂包含多柔比星和X射线造影剂。X射线造影剂通常是基于重元素，且包括可用于增强胃肠系统的显影的钡盐比如硫酸钡，和可用于胃肠系统的显影和肠胃外研究中的碘化造影剂。碘化的X射线造影剂包括，但不限于碘海醇、碘喷托、碘帕醇、碘克沙醇、碘普胺、碘曲仑、甲泛葡胺、甲泛影酸、二叠氮酸(diatriazoic acid)、碘他拉酸、碘克沙酸及这些酸的盐。
在本发明的另一个方面，所述脂质体制剂包含多柔比星和MRI造影剂。MRI造影剂包括顺磁性螯合物，例如基于锰(2+)、钆(3+)或铁(3+)。亲水性螯合物比如GdDTPA、GdDOTA、GdHPDO3A和GdDTPA-BMA分布在细胞外且由肾脏清除。这样的化合物用于例如显影中枢神经系统中的损伤。更多其它的器官-或组织-特异性试剂包括MnDPDP、GdBOPA、GdEOB-DTPA、顺磁性卟啉、大分子化合物、颗粒和脂质体。
在本发明的仍然另一个方面，脂质体制剂包含多柔比星和超声显像剂。超声显像是基于超声波(例如，在1-10MHz的频率范围中)经由传感器穿透进入人或动物受试者中，该超声波与身体组织和流体的界面相互作用。超声成像中的对比度得自在这样的界面上声波的差示反射/吸收；结果可以使用多普勒技术增强，包括使用彩色多普勒以评估血流。超声造影剂的实例包括基于含气体的半乳糖微晶的包含涂有脂肪酸的含气体的半乳糖微晶的和包含通过部分变性的人血清白蛋白包囊的气泡的
在本发明中可以使用的其他显像剂或诊断剂包括，但不限于荧光剂比如6-羧基荧光素、放射性试剂(比如放射性同位素或包含放射性同位素的化合物，包括碘代辛烷、卤化碳和泛影葡胺钠(renografin))等。
在本发明的另一个方面，脂质体制剂进一步包含另外的活性剂，例如另外的化疗药物。
具体实施方案
实施例1
通过NH4 +-负载制备负载多柔比星的热敏脂质体
通过下述技术制备：包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)的脂质体，其包含86％(mole％)的脂质体膜；约4％(摩尔％)的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG)；和约10％(摩尔％)的1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油磷脂酰胆碱(MSPC)：首先，在200mM的硫酸铵缓冲液中水合合适的脂质组合物，形成多层脂质体。然后，通过挤出穿过80nm过滤器形成小单层脂质体，以在200mM的硫酸铵缓冲液中形成约100nm球体。
然后，使之前步骤中制备的脂质体进行透析或渗滤步骤，以用10％蔗糖溶液交换脂质体外部的硫酸铵，形成跨脂质体膜的铵浓度梯度(即，内部200mM，外部低于1mM)。已知(Haran G,Cohen R,BarLK and Barenholz Y,Transmembrane ammonium sulfate gradients inliposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathicweak bases,Biochimica et Biophysica Acta,1151(1993)201-215201)铵浓度可以有效地且接近定量地促进在高温下将加入的多柔比星溶液负载到该脂质体的内部空间(volumn)。通过在35-39℃下温育而将多柔比星包埋在脂质体的内部水性空间之内。在负载完成时，用组氨酸缓冲液缓冲该脂质体溶液以在储存期间稳定产物pH。
实施例2
pH-负载的热敏多柔比星脂质体的制备
根据在WO 2007/024826中描述的方法，制备使用pH梯度的负载多柔比星的脂质体。含有1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)的脂质体，其包含86％(摩尔％)的脂质体膜；约4％(摩尔％)的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG)；和约10％(摩尔％)的1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基磷脂酰胆碱(MSPC)。其是通过下述技术制备的：首先，在300mM的柠檬酸盐缓冲液中水合合适的脂质组合物，形成多层脂质体。然后，通过挤出穿过80nm过滤器形成小单层脂质体，以在300mM的柠檬酸盐缓冲液中形成约100nm球体。
然后，将500mM的碳酸钠溶液加入到之前步骤制备的脂质体中，将外部溶液的pH提高至～7.5。已知(参见例如，Mayer LB,Bally MB,Cullis PR.,Uptake of adriamyacin into large unilamellar liposomesin response to a pH gradient,Biochimica et Biophysiea Acta 857(1986)123-126)跨膜形成的pH梯度可以有效地且接近定量地促进在高温下将加入的多柔比星溶液负载到该脂质体的内部空间。通过在35-39℃下温育，将多柔比星包埋在脂质体的内部水性空间之内。
制剂组合物/赋形剂/功能
表1显示根据实施例1的制剂和根据实施例2的常规pH负载的脂质体之间的比较。如表1所示，两种制剂都包含2.0mg/mL的多柔比星。根据本发明的制剂充分地匹敌于更常规的脂质体多柔比星制剂。使用的所有原料都是药品级的。
表1.2.0mg/mL的多柔比星HCl脂质体产品的组成
a.脂质体内的硫酸铵的浓度(例如150-250mM)
实施例3
最终产物的表征方法
最终产物是以总多柔比星含量、多柔比星降解产物、pH、渗透压、粒度分布、MSPC含量、DPPC含量、DSPE-mPEG含量、包封的多柔比星％、在37℃下的药物释放、及在41℃下的药物释放来表征，以有效地完成产物的评价。目标总多柔比星含量在约1.8至约2.2mg/mL之间。药物包封通常大于90％，且在正常体温(即，37℃)下显示有限的释放(例如，＜10％)，并且在41.0℃下显示释放提高(通常＞80％)。如通过动态光散射测量的脂质体的体积平均粒度为约50至约150nm之间。
实施例4
物理化学性质
脂质体的物理直径
上述实施例1中形成的脂质体的物理化学性质与使用常规缓冲液形成的脂质体的制剂相当。如图3所示，硫酸铵水合的脂质体的粒度分布与柠檬酸盐缓冲液水合的脂质体基本上相同。
脂质组成
如表1所示，本发明的脂质体制剂的脂质组成与本领域已知的脂质体制剂的脂质组成相同。脂质膜组成的功能也通过在37℃和41.0℃下测定药物释放的差异来证实。
多柔比星包囊的程度
本发明提供一种设计利用远端负载方法的脂质体产品(参见例如，Haran G,Cohen R,Bar LK and Barenholz Y.,Transmembraneammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stableentrapment of amphipathic weak bases,Biochimica et Biophysica Acta,1151(1993)201-215201)，以将大于90％的多柔比星包囊在内部水性核中。通过测量产物中通过超滤分离的未包囊的多柔比星(游离Dox)和总多柔比星计算所包囊的多柔比星的％。目前研究显示对于铵-负载的制剂可以获得大于95％的包囊。
另外，各批的热释放性质(在37℃下的释放％和在41℃下的释放％)具有非常高可重现性，且是相当的，如图8所示。
最终产品的表征方法
除了上述的最终产品特性测试的列表之外，已经评估了新制剂的一些其它性质。首先，由于脂质体膜在药物产品的关键设计参数中的重要性，在pH-负载(图4所示)和NH4 +负载(图5所示)制剂上进行差示扫描量热法。各个热分析图显示一个主要的放热(在约41℃)，表明该膜对新制剂与对于pH-负载的脂质体是相当类似的，如所预期的，这是因为缓冲溶液对于膜序的整体结构具有的影响可忽略。
也使用穿隧型电子显微镜检查(TEM)的高分辨技术比较两种制剂的总尺寸和形态。此外，比较在GMP生产设备中以目前制备规模所生产的pH-负载的产品(图6)(其目前用于III期临床研究)与在Celsion以实验室规模使用NH4 +-负载的制剂制备的产品(图7)。这两种制剂的脂质体显示类似的囊泡直径，主要是单层膜，并且在每个脂质体内部显示典型的单晶体，其主要归因于在负载步骤期间脂质体内部的多柔比星药物复合物的形成。总的说来，TEM显示使用pH-负载或NH4 +的系统所产生的脂质体相当类似。
通过将每种样品在指定温度下温育10分钟，确定多柔比星的释放量呈35至45℃的温度函数的温度释放曲线。将试验结果显示在图8中。如上述试验，在GMP生产设备中以目前制备规模所生产的pH-负载的产品(其目前用于III期临床研究)与在Celsion以实验室规模使用NH4 +-负载的制剂制备的产品(图8)之间进行比较。这两种制剂的释放曲线非常类似，二者均显示出在低于39℃的温度下有最小释放，在41.0℃和更高之下接近90％释放。清楚可见，两种制剂都证实在正常体温(即37℃)下具有受限的多柔比星释放、且在温和的体温过高或41-45℃范围的温度下释放大部分药物的设计目标。
该温度释放数据也是脂质膜组合物的显微均匀性的最佳量度。为了使制剂在41.0℃下释放大于90％的药物，大部分脂质体(即，100nm囊泡)必须具有合适的脂质组成，以证实待包装产品的热触发释放。已知不正确的DSPE-MPEG或MSPC水平将不利地影响多柔比星从这些脂质体的释放程度和释放速率。此外，转变温度几乎相同的事实连同可匹敌的DSC扫描(图4和5)，得出结论：缓冲系统的改变对于脂质体膜的影响可忽略，因此，将对于其药物释放性质的影响可忽略。
实施例5
pH-负载和NH4 +-负载的制剂的8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的水平的比较
进行实验室实验以检验pH-负载和NH4 +-负载的制剂中所产生的8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的水平(图9)。对于pH-负载的制剂，检验来自两个供应商的赋形剂：赋形剂A和B。也检验NH4 +-负载的制剂的三个独立制剂。在所有情况中，且对于8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A二者，pH-负载的制剂形成的水平显著地高于NH4 +-负载的制剂。对于具有新来源的赋形剂的pH-负载和NH4 +-负载的制剂，观察到8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的水平降低，而杂质A的水平没有变化。
此外，即使在35℃下温育四小时，NH4 +-负载的制剂的8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素和杂质A的总水平低于0.2％。降解物形成的水平显示为图11中所示稳定性数据中的初始时间点，并且与图10所示多柔比星的值良好相关。
实施例6
稳定性曲线
对于pH-负载和NH4 +-负载的制剂，产生比较稳定性数据。虽然pH-负载的制剂需要储存在-15℃至-30℃下，但是稳定性比较都是在-20℃和在加速稳定性条件(即,+5℃)下储存产生的。在739天之后的多柔比星的试验结果显示铵-负载的制剂的多柔比星损失～4％。相反，pH-负载的制剂在相同时间期间之后的多柔比星的损失为～60％。将多柔比星的试验数据的损失概括在图10和表2中。总降解物的生长证实相同的趋势，即pH-负载的制剂中观察到降解物显著增加，而NH4 +-负载的制剂中降解物生长水平非常低(图11和表2)。
表2.NH4 +-负载且在2-8℃下储存的稳定性数据-多柔比星试验.
NT＝未测试
除了在2-8℃下的稳定性之外，图12和图13显示在-20℃下多柔比星损失试验数据。该数据证实与pH-负载的制剂相比，NH4 +-负载的制剂显示极低的降解物生长水平而多柔比星稳定性提高。
通过LC/MS确认，也观察到由pH-负载和NH4 +-负载的制剂形成的降解产物鉴别为相同的，但是NH4 +-负载的制剂形成的程度更少。此外，在储存至少两年之后，NH4 +-负载的制剂除了降解产物生长水平较低之外，还显示出多柔比星HCl稳定性改善。该NH4 +-负载的制剂在低于或等于8℃的温度下储存至少两年，保持了其溶液pH、脂质体粒度、包囊％、和在41.0℃下多柔比星的释放％。
上述累积稳定性数据证实NH4 +-负载的制剂可以市售作为在低于或等于8℃下储存的冷冻产品提供。预期该新的、最小化总降解物形成将获得储存期限多至2年的商业用途的合格产品。降解水平降低也说明了产品效价维持得到改善。总的说来，所述药物产品的这些改善的组合效应被认为增强了剂量给药的可重现性，获得了较好地运输和储存顺应性，因而形成较高质量的商品。
应当理解，详细说明部分，而非发明简述和摘要部分，旨在用于解释权利要求书。发明简述和摘要部分可以说明本发明的一个或多个但非所有示例性的实施方案，如本发明人预期的，因此，不意味着以任何方式限制本发明和附加权利要求书。
前述具体实施方案的说明应当充分揭示了本发明的一般性质，使得其他人可以在没有过度实验且没有背离本发明的一般原理下，可以通过应用本领域技术之内的知识，容易地修饰和/或调整这样的具体实施方案的各种应用。因此，基于本文所呈现的教导和指导，这样的调整和修饰在所公开实施方案的同等方案的意义和范围内。应当理解，本文的措辞或术语用于说明的目的而不是限制目的，因此本说明书的术语或措辞应当由本领域技术人员根据该教导和指导来解释。
本发明的宽度和范围不应当受任何上述示例性的实施方案的限制，但是仅根据下述权利要求素及其同等物来定义。

Claims (40)

1.脂质体制剂，其包含脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和包埋在所述脂质体内的活性剂；所述脂质双层包含∶
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述活性剂选自：多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱，并且
其中所述脂质双层成分是以约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；并且其中该悬浮液中脂质体大小在约50和约150nm之间。
2.权利要求1的脂质体制剂，其中所述活性剂为多柔比星，并且其中在低于或等于8℃下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于0.5％，并且其中杂质A为在高效液相色谱(HPLC)中相对保留时间为约1.4的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件。
3.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于0.2％。
4.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存约一年之后杂质A的相对浓度低于约0.5％。
5.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存约2年之后杂质A的相对浓度低于约0.75％。
6.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存6个月之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度低于约0.5％。
7.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存约一年之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度低于约0.5％。
8.权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8℃下储存约2年之后8-脱乙酰基-8-羧基柔红霉素的相对浓度低于约1.6％。
9.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约六个月之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的99％，如通过HPLC使用C18尺寸排阻柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。
10.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约一年之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的97％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。
11.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约两年之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的95％，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。
12.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约六个月之后总降解产物的形成低于1％。
13.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约一年之后总降解产物的形成低于1％。
14.权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8℃的温度下储存约两年之后总降解产物的形成低于2.5％。
15.权利要求2的脂质体制剂，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)或其组合；所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、单月桂酰基磷脂酰胆碱(MLPC)、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(MMPC)、单硬脂酰基磷脂酰胆碱(MSPC)或其混合物；并且所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为PEG化的脂质。
16.权利要求2的脂质体制剂，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱，一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000]，并且所述一种或多种溶解脂质为单硬脂酰基磷脂酰胆碱。
17.权利要求2的脂质体制剂，其中所述脂质体进一步包括显像剂或诊断剂。
18.权利要求17的脂质体制剂，其中所述显像剂或诊断剂包埋在脂质体中。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述显像剂或诊断剂为X-射线造影剂、MRI造影剂、超声显像剂、荧光剂或放射性试剂。
20.将活性剂负载到热敏脂质体中的方法，其包括：
(a)制备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含：
(i)一种或多种磷脂，选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；
(ii)一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和
(iii)一种或多种溶解脂质，选自：单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基-乙醇胺；
其中所述脂质双层成分以约80-90:2-8:2-18的摩尔比提供；并且
其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150nm之间的平均粒度；
(b)将活性剂的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述活性剂被吸收到所述脂质体中，
其中所述活性剂选自：多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱。
21.权利要求20的方法，其中所述活性剂是多柔比星。
22.权利要求21的方法，其中所述溶液中存在的至少95％的多柔比星被吸收到脂质体中。
23.权利要求21的方法，其中被吸收到所述脂质体中的多柔比星的浓度为约50mM。
24.权利要求21的方法，其中被吸收到所述脂质体中的多柔比星的浓度为约75mM。
25.权利要求21的方法，其中所述制备包括在铵盐的存在下制备脂质体。
26.权利要求25的方法，其中所述铵盐是以硫酸铵溶液形式提供。
27.权利要求26的方法，其中所述硫酸铵的浓度为约100mM至约300mM。
28.权利要求26的方法，其进一步包括以单糖或二糖溶液替换所述脂质体外部的铵离子。
29.权利要求28的方法，其中所述单糖或二糖溶液的浓度为约5-15％。
30.权利要求29的方法，其中所述脂质体外部的铵离子被单糖溶液替换。
31.权利要求30的方法，其中所述单糖溶液为乳糖溶液。
32.权利要求21的方法，其进一步包括在步骤(b)之后添加组氨酸缓冲液。
33.权利要求32的方法，其中所述组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约15mM。
34.权利要求21的方法，其中所述一种或多种磷脂具有两个相同或不同的C14-C20酰基。
35.权利要求34的方法，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)或其组合。
36.权利要求21的方法，其中所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、单月桂酰基磷脂酰胆碱(MLPC)、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(MMPC)、单硬脂酰基磷脂酰胆碱(MSPC)、或其混合物。
37.权利要求21的方法，其中所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为PEG化的脂质。
38.权利要求37的方法，其中所述PEG化的脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000]。
39.权利要求21的方法，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱，一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[聚(乙二醇)2000]，并且所述一种或多种溶解脂质为单硬脂酰基磷脂酰胆碱。
40.通过权利要求21的方法制备的脂质体制剂。
CN201380014896.2A 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法 Pending CN104203216A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710048411.1A CN106727329B (zh) 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261600418P 2012-02-17 2012-02-17
US61/600,418 2012-02-17
PCT/US2013/026453 WO2013123407A1 (en) 2012-02-17 2013-02-15 Thermosensitive nanoparticle formulations and method of making the same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710048411.1A Division CN106727329B (zh) 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104203216A true CN104203216A (zh) 2014-12-10

Family

ID=48984771

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380014896.2A Pending CN104203216A (zh) 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法
CN201710048411.1A Active CN106727329B (zh) 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710048411.1A Active CN106727329B (zh) 2012-02-17 2013-02-15 热敏纳米颗粒制剂及其制备方法

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20130230457A1 (zh)
EP (1) EP2814464B1 (zh)
JP (3) JP2015507019A (zh)
KR (1) KR102161271B1 (zh)
CN (2) CN104203216A (zh)
AR (1) AR090080A1 (zh)
AU (1) AU2013221292A1 (zh)
CA (1) CA2864469C (zh)
ES (1) ES2773299T3 (zh)
HK (1) HK1200733A1 (zh)
MX (1) MX2014009827A (zh)
PH (1) PH12014501866A1 (zh)
RU (1) RU2014133467A (zh)
SG (1) SG11201404979RA (zh)
TW (2) TWI637754B (zh)
WO (1) WO2013123407A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107864624A (zh) * 2015-07-22 2018-03-30 光谱医药公司 用于硫酸长春新碱脂质体注射剂的即用型制剂

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
JP2016530294A (ja) 2013-09-03 2016-09-29 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3291797B1 (en) * 2015-05-04 2020-09-02 Versantis AG Method for preparing transmembrane ph-gradient vesicles
GB201509934D0 (en) 2015-06-08 2015-07-22 King S College London Nanoparticles
CN105078892B (zh) * 2015-09-06 2018-05-01 重庆医科大学 阿苯达唑热敏脂质体的制备方法
MA43184A (fr) * 2015-11-02 2021-04-14 Fujifilm Corp Composition liposomale et son procédé de production

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
IT1230505B (it) * 1988-10-11 1991-10-25 Sicor Spa Procedimento per la conversione della daunorubicina in doxorubicina.
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US6110491A (en) * 1996-10-22 2000-08-29 Hermes Biosciences, Inc. Compound-loaded liposomes and methods for their preparation
US6726925B1 (en) * 1998-06-18 2004-04-27 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
US6200598B1 (en) * 1998-06-18 2001-03-13 Duke University Temperature-sensitive liposomal formulation
US6593308B2 (en) * 1999-12-03 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Targeted drug delivery with a hyaluronan ligand
JP2003521366A (ja) * 2000-01-28 2003-07-15 アルザ・コーポレーション 過飽和溶液中に取り込まれた化合物を含有するリポソーム
US20020028237A1 (en) * 2000-04-20 2002-03-07 Colbern Gail T. Method for reducing toxicity of a cytotoxic agent
US8980310B2 (en) * 2002-12-31 2015-03-17 Bharat Serums and Vaccines, Ltd. Non-pegylated long-circulating liposomes
EP1643972A4 (en) * 2003-06-27 2010-01-20 Smithkline Beecham Corp STABILIZED LIPOSOMAL TOPOTECAN COMPOSITION AND METHOD
EP1689364A4 (en) * 2003-11-20 2008-10-29 Ym Biosciences Inc STABLE LIPOSOMAL COMPOSITIONS COMPRISING LIPOPHILIC AMINE CONTAINING PHARMACEUTICAL AGENTS
EP1817004A2 (en) * 2004-11-15 2007-08-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Combination therapy associating preferably a ceramide with a cytotoxic drug
US20060127467A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-15 Watkin Kenneth L Nanoparticles for delivery of therapeutic agents using ultrasound and associated methods
TWI388344B (zh) * 2005-08-23 2013-03-11 Celsion Corp 儲存奈米微粒調合物之方法
US7951789B2 (en) * 2006-12-28 2011-05-31 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
CA2700810A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Universitatsspital Basel Immunoliposomes for treatment of cancer
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
WO2009059449A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Celsion Corporation Novel thermosensitive liposomes containing therapeutic agents
WO2009064696A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 The Regents Of The University Of California Sterol-modified amphiphilic lipids
TWI397428B (zh) * 2009-12-29 2013-06-01 Ind Tech Res Inst 標的第四介白素受體之傳輸系統
WO2011109334A2 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 The Regents Of The University Of California Localization of agents at a target site with a composition and an energy source
US20140227343A1 (en) * 2011-01-31 2014-08-14 Centre National De La Recherche Scientifique Method of monitoring the release from liposomes of a product of interest using superparamagnetic nanoparticles

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARISKA DE SMET ETAL: "Temperature-sensitive liposomes for doxorubicin delivery under MRI guidance", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107864624A (zh) * 2015-07-22 2018-03-30 光谱医药公司 用于硫酸长春新碱脂质体注射剂的即用型制剂
CN107864624B (zh) * 2015-07-22 2021-05-25 光谱医药公司 用于硫酸长春新碱脂质体注射剂的即用型制剂

Also Published As

Publication number Publication date
TWI684463B (zh) 2020-02-11
TW201345565A (zh) 2013-11-16
JP2015507019A (ja) 2015-03-05
SG11201404979RA (en) 2014-10-30
CN106727329A (zh) 2017-05-31
CA2864469A1 (en) 2013-08-22
KR102161271B1 (ko) 2020-09-29
KR20140126381A (ko) 2014-10-30
JP2018058858A (ja) 2018-04-12
US10251901B2 (en) 2019-04-09
MX2014009827A (es) 2014-09-22
ES2773299T3 (es) 2020-07-10
TW201841622A (zh) 2018-12-01
EP2814464A1 (en) 2014-12-24
CA2864469C (en) 2020-07-07
US20130230457A1 (en) 2013-09-05
TWI637754B (zh) 2018-10-11
US20170080003A1 (en) 2017-03-23
JP2020050681A (ja) 2020-04-02
HK1200733A1 (zh) 2015-08-14
CN106727329B (zh) 2020-11-03
AU2013221292A1 (en) 2014-09-11
JP6824452B2 (ja) 2021-02-03
EP2814464B1 (en) 2019-12-18
WO2013123407A1 (en) 2013-08-22
EP2814464A4 (en) 2015-08-05
AR090080A1 (es) 2014-10-15
PH12014501866A1 (en) 2014-11-17
RU2014133467A (ru) 2016-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6824452B2 (ja) 感熱性ナノ粒子製剤およびその製造方法
Chiu et al. Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive liposomes via complexation with the transition metal manganese
CN1960707B (zh) 用于治疗和/或诊断用途的脂质集合体
CA2335250C (en) Temperature-sensitive liposomal formulation
US9492385B2 (en) Temperature-sensitive liposomal formulation
US20090232730A1 (en) Method of producing immunoliposomes and compositions thereof
EP1731172B1 (en) Liposome preparation
JP2006298840A (ja) リポソーム含有製剤の製造方法およびリポソーム含有製剤
JP2003530362A (ja) 診断剤をターゲッティングするための脂質ベースの系
US20150150801A1 (en) Double-layered liposome comprising inner liposome comprising hydrophobic active ingredient and use of the double-layered liposome
US20150182627A1 (en) Liposome including active ingredient and imaging agent and use thereof
US20120141381A1 (en) Methods For Loading Contrast Agents Into A Liposome
JP2006298842A (ja) リポソーム含有製剤の製造方法およびリポソーム含有製剤
JP2007284395A (ja) リポソーム含有製剤の製造方法
JP2005220034A (ja) Ｘ線検査用造影剤の製造方法
Woo Thermosensitive liposomal cisplatin: formulation development, in vitro characterization and in vivo plasma elimination studies
JP2005179214A (ja) Ｘ線検査用造影剤
JP2006298841A (ja) リポソーム含有ｘ線造影剤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1200733

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20141210

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1200733

Country of ref document: HK