KR102161271B1

KR102161271B1 - 감열성 나노입자 제제 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR102161271B1
Application number: KR1020147025814A
Authority: KR
Inventors: 로버트 에이. 리드; 다이쉬 수
Original assignee: 셀젼 코퍼레이션
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2013-02-15
Publication date: 2020-09-29
Also published as: TWI684463B; TW201345565A; JP2015507019A; SG11201404979RA; CN106727329A; CA2864469A1; KR20140126381A; JP2018058858A; US10251901B2; MX2014009827A; ES2773299T3; TW201841622A; EP2814464A1; CA2864469C; US20130230457A1; TWI637754B; US20170080003A1; JP2020050681A; HK1200733A1; CN104203216A

Abstract

본 발명은 감열성 리포솜의 제제, 보다 구체적으로 인지질 및 표면 활성제를 포함하는 리포솜의 제제에 관한 것이며, 여기서 리포솜은 약 8℃ 이하의 온도에서의 장기간 저장을 지지하고, 제품 효력을 최대화하기 위해 분해물 형성을 제어하고, 경도 온열요법 온도에서 그의 내용물을 방출한다. 제제의 제조 방법이 또한 기재된다.

Description

감열성 나노입자 제제 및 그의 제조 방법 {THERMOSENSITIVE NANOPARTICLE FORMULATIONS AND METHOD OF MAKING THE SAME}

리포솜은 수성 내부 구획을 둘러싸는 1개 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포솜은 막 유형 및 크기에 의해 특성화될 수 있다. 소형 단층 소포 (SUV)는 단일 막을 갖고, 전형적으로 0.02 내지 0.25 μm 직경 범위이며; 대형 단층 소포 (LUV)는 전형적으로 0.25 μm 초과이다. 소층 대형 소포 및 다층 대형 소포는 다수의, 통상적으로 동심성인 막 층들을 갖고, 전형적으로 0.25 μm 초과이다. 몇몇 비동심성 막을 갖는 리포솜, 즉 보다 대형의 소포 내에 함유된 몇몇 소형 소포는 다소포성 소포체라 칭해진다.

리포솜은 치료제, 약물, 또는 수성 내부 공간 내에 함유되거나 (수용성 활성제) 또는 지질 이중층 내로 분배된 (수불용성 활성제) 다른 활성제를 보유하도록 제제화될 수 있다. 리포솜은 또한 특이적 표적 부위로의 활성제의 전달을 허용하는 항체 또는 표적화 분자에 접합될 수 있다. 리포솜 중의 약물의 캡슐화는 (1) 약물의 독성을 감소시키고, (2) 외래 입자를 정상적으로 인식하고 표적화하여 간 및 비장의 세망내피계 (RES)에 의해 이들을 제거하는 신체 방어를 회피하고, (3) 약물 담체가 작용의 치료 부위로 표적화되도록 하고 여기에서 약물이 표적 조직에 대해 작용할 수 있도록 이를 신속하게 방출한다. 또한, 세망내피계 (RES)의 세포에 의한 혈액으로부터의 리포솜의 클리어런스는 리포솜 막 내로 폴리에틸렌글리콜 지질을 혼입시킴으로써 억제할 수 있으며; 이들 지질은 RES 흡수에 대해 리포솜을 표지하는 단백질 흡착을 억제한다.

리포솜은 누출성이 아니도록 설계될 수 있으나, 리포솜 막에 기공이 발생하는 경우, 막이 유체로 되는 경우 (예를 들어 고체 또는 겔 상으로부터 액체 상으로의 상 전이를 겪는 경우), 또는 막이 분해 또는 용해되는 경우에는 누출성이 될 것이다. 이러한 투과성의 파괴는 전기장 (전기천공)의 적용, 또는 효소 또는 계면활성제에 대한 리포솜의 노출에 의해 유도될 수 있다. 또 다른 방법은 막의 온도를 그의 겔에서 액체로의 상 전이 온도 부근의 온도로 상승시키는 것을 포함하며, 여기서 부분적 액체 및 부분적 고체 막 내의 상 경계 영역에서의 다공성 결함이 막을 가로지르는 물, 이온 및 소분자의 수송을 증가시키는 것으로 보인다. 신체에서의 온도의 임상적 상승은 온열요법으로 불린다. 문헌 [Yatvin et al., Science 204:188 (1979)]에 처음 기재된 바와 같이, 상기 절차는 대상체에서 표적 부위에서의 온도를 상승시키는데 사용되고, 온도-감수성 리포솜이 표적 부위로 전달될 수 있는 경우에 이러한 온도의 증가는 리포솜 내용물의 방출을 유발하여 표적 부위에서의 치료제의 선택적 전달 및 방출을 일으킬 수 있다. 그러나, 상기 기술은 리포솜의 상 전이 온도가 정상 조직 온도보다 높은 (37℃ 초과) 조건으로 제한된다.

온열요법은 다양한 생물학적 변화를 초래한다. 검토를 위해 문헌 [Issels RD. Hyperthermia adds to Chemotherapy, European J of Cancer (2008) 44:2546-2554]을 참조한다. 경도 온열요법 범위 (39-44℃)의 온도는 혈류, 혈관계 투과성 및 조직 산소화의 증가와 같은 국부 생리적 변화를 매개한다. 고형 종양을 지지하는 혈관계는 구조가 무질서하고, 미세-혈관계 내층의 내피 세포는 함께 정상적으로 봉쇄되지 않아 다공성 특질을 발생시킨다. 온열요법은 비정상적 종양 미세혈관계 내의 기공 크기를 증가시키고, 따라서 종양 간질 내로의 나노규모 분자, 예컨대 약 100 nm 직경의 리포솜의 혈관외유출을 증진시킨다 (문헌 [Bates DA, Mackillop WJ. Hyperthermia, adriamycin transport, and cytotoxicity in drug-sensitive and -resistant Chinese hamster ovary cells, Cancer Res (1986) 46:5477-5481; Nagaoka S, Kawasaki S, Sasaki K, Nakanishi T. Intracellular uptake, retention and cytotoxic effect of adriamycin combined with hyperthermia in vitro. Jpn J Cancer Res (1986) 77:205-211]). 이들 이유로, 경도 온열요법은 종양 세포에 대해 선택적으로 치명적이며, 항종양 효과는 온도 증가에 따라 증가한다.

열 감수성 리포솜은 고형 종양 및 지지 혈관계에 대한 고농도의 화학요법제를 보유하고, 가열되는 경우에 약물을 국부적으로 방출한다. 온열요법은 리포솜 흡수, 리포솜 투과성을 선택적으로 증가시키고, 국부 약물 방출을 자극하고, 종양 세포 내로의 약물의 유입을 증가시키고, 종양 세포 DNA에 결합하는 약물을 증가시킨다 (후자는 수많은 화학요법제의 작용 메카니즘에 필수적임).

따라서, 심재성 종양 (예를 들어, 전립선, 난소, 결장직장 및 유방 종양)의 치료를 위한 온열요법의 사용을 시작하기 위해, 경도 온열요법 조건, 즉 39-45℃ 범위의 임상적으로 도달가능한 온도에 반응하여 치료량의 활성제를 전달할 수 있는 리포솜 제제를 고안하는 것이 바람직하다.

미국 특허 번호 6,726,925에는 주위 환경의 온도에서 변경에 감수성인 리포솜이 기재되어 있다. 리포솜은, 특히 폭넓은 범위의 암의 치료를 위해 승인되고 빈번히 사용되는 종양학 약물인 독소루비신과 함께 로딩된다. 독소루비신 함유 리포솜 제제는 정맥내로 및 온열요법과 조합되어 투여되고, 국부 종양 제어를 제공할 수 있고, 삶의 질을 개선한다. 국부 경도 온열요법 (39.5-45℃)은 리포솜으로부터 포획된 독소루비신을 방출한다. 이러한 전달 기술은 고농도의 독소루비신이 표적화된 종양에 우선적으로 침착되도록 할 수 있다. 미국 특허 번호 7,901,709에는 독소루비신의 열-활성화 리포솜 캡슐화 방법이 기재되어 있다.

공개 국제 출원 번호 WO 2007/024826에는 제제를 동결시키는 것을 비롯한, 리포솜 또는 나노입자 제제의 저장 방법이 기재되어 있다. 제제에는 증진된 안정성 및 저장 특성을 갖는 리포솜의 저장 방법이 기재되어 있다.

온열요법적으로 활성화된 리포솜-약물 제제가 유효하도록 하는데 필요한 핵심 설계 원칙은 다음과 같다: 1) 체순환에서 약물이 리포솜과 회합되도록 하기 위한 활성제의 거의 완전한 캡슐화, 2) 정상 체온 (37℃)에서 약물을 보유하고 경도 온열요법 온도 (즉, 41-43℃)에서 약물을 방출하도록 설계된 막, 3) 약물의 그의 표적으로의 방출을 유발하기 위한 가열 양식을 적용하기에 충분히 오랫동안 리포솜이 체순환 내에 유지되도록 하는 막 조성물 및 입자 크기, 4) 누출성 종양 미세-혈관계를 가로지르는 혈류로부터의 혈관외유출을 허용하여 화학요법 약물의 종양 부위로의 표적화를 가능하게 하는 리포솜 크기.

독소루비신의 리포솜 제제에 관하여 본 발명자들에 의해 발견된 추가의 중요한 설계 이슈는 (예를 들어 미국 특허 번호 7,901,709에 개시되어 있음) 완성 약물 제품의 안정성에 대한 독소루비신 복합체 (공-결정 또는 염) 형성의 안정화 효과이다. 분해 속도의 성공적인 제어는 약물 제품의 저장 온도 및 장기간 안정성에 대한 유의한 영향을 가져올 것이다. 관심 대상의 2가지 분해 산물은 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A이다.

본 발명은 시트레이트 복합체 (공-결정 또는 염)에서 일어나는 독소루비신 리포솜 제제에서의 약물 분해에 관한 지속적인 문제를 해결한다. 시트레이트 복합체는 독소루비신 불안정성 및 분해물의 형성에서 유의한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 형성은 시트레이트 복합체의 형성을 술페이트 복합체 (공-결정 또는 염)로 변화시킴으로써 유의하게 감소될 수 있다. 또한, 본 발명은 활성제를 함유하는 효능있는 온열요법적으로 활성화된 리포솜 제제에 대해 상기 나열된 핵심 설계 원칙을 유지한다.

한 측면에서, 본 발명은, 겔-상 지질 이중층을 갖는 리포솜 및 상기 리포솜 내부에 포획된 독소루비신의 현탁액을 포함하며; 상기 지질 이중층은

(i) 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜 에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인지질;

(ii) 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질; 및

(iii) 모노아실포스파티딜 콜린, 모노아실포스파티딜글리세롤, 모노아실포스파티딜이노시톨 및 모노아실포스파티딜-에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 리소지질

을 포함하고;

여기서 지질 이중층 구성성분은 약 80-90:2-8:2-18의 (i):(ii):(iii) 몰비로 제공되고; 여기서 현탁액 중의 리포솜은 약 50 내지 약 150 nm의 평균 입자 크기를 갖고;

여기서 약 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 불순물 A의 상대 농도는 0.5% 미만이고, 여기서 C18 역상 칼럼 및 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 완충제를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 분리가 달성되는 경우에 불순물 A는 약 1.4의 상대 체류 시간을 갖는 피크인,

제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

(a) 겔-상 지질 이중층 및 리포솜 외부보다 높은 리포솜 내부의 암모늄 이온의 농도를 갖는 리포솜의 현탁액을 제조하며, 상기 지질 이중층은

(ii) 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질; 및

을 포함하고,

여기서 지질 이중층 구성성분은 약 80-90:2-8:2-18의 (i):(ii):(iii) 몰비로 제공되고;

여기서 상기 제조는 현탁액 중의 리포솜의 크기를 약 50 내지 약 150 nm의 평균 입자 크기로 감소시키는 것을 포함하는 것인 단계; 및

(b) 리포솜의 현탁액에 독소루비신 용액을 첨가하며, 여기서 독소루비신은 리포솜 내로 흡수되는 것인 단계

를 포함하는, 독소루비신을 온도 감수성 리포솜 내로 로딩하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 제조된 리포솜 제제를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 독소루비신 및 영상화제를 포함하는 리포솜 제제를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 독소루비신 및 또 다른 약물을 포함하는 리포솜 제제를 포함한다.

이들 및 다른 측면 및 본 발명의 이점은 하기에 보다 상세하게 기재된다.

도 1은 인지질로서의 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜) 2000 (DSPE-MPEG), 및 리소지질로서의 모노스테로일-포스파티딜콜린 (MSPC)를 함유하는 이중층 막을 갖는 리포솜을 개략적으로 표현한다. 리소지질 단량체의 배향, 및 지질 이중층의 내부 및 외부 층 둘 다에서의 그의 존재가 나타나 있다.
도 2는 암모늄 로딩 독소루비신 리포솜 제조 방법의 개략적 표현이다.
도 3은 압출 공정에 의해 형성된 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜의 입자 크기 분포이다.
도 4는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조된 pH 로딩 리포솜의 시차 주사 열량측정법 그래프 (분당 2℃의 스캔 속도)를 도시한다.
도 5는 본 발명의 NH₄ ⁺-로딩 리포솜의 시차 주사 열량측정법 그래프 (분당 2℃의 스캔 속도)를 도시한다.
도 6은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조된 pH 로딩 리포솜의 터널링 전자 현미경사진을 도시한다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 NH₄ ⁺-로딩 리포솜의 터널링 전자 현미경사진을 도시한다.
도 8은 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 리포솜에 대한 용액 온도의 함수로서의 독소루비신 방출 프로파일의 비교를 보여준다.
도 9a 및 9b는 pH-로딩 또는 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜에서 각각의 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 수준의 비교를 보여준다. "A" 및 "B" 막대는 상이한 공급업체로부터 공급된 부형제를 사용하여 제조된 제제에 대한 불순물 수준을 나타낸다. 도 9a 및 9b는 또한 본 발명에 따라 제조된 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜의 3회 반복 실행에 대한 불순물 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 수준을 보여준다.
도 10은 2-8℃에서 장기간 동안 저장시에 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜에서의 독소루비신의 수준을 보여준다.
도 11은 2-8℃에서 장기간 동안 저장시에 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜에서의 분해물 성장의 수준을 보여준다.
도 12는 -20℃에서 장기간 동안 저장시에 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜에서의 독소루비신의 수준을 보여준다.
도 13은 -20℃에서 장기간 동안 저장시에 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 독소루비신 리포솜에서의 분해물 성장의 수준을 보여준다.

본 발명은 이제 본원 및 도면에 기재된 실시양태를 참조로 기재될 것이다. 이들 실시양태는 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 특허청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

한 측면에서, 본 발명은, 겔-상 지질 이중층을 갖는 리포솜 및 상기 리포솜 내부에 포획된 활성제의 현탁액을 포함하며; 상기 지질 이중층은

(ii) 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질; 및

을 포함하고;

여기서 활성제는 독소루비신, 블레오마이신, 다카르바진, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플루다라빈, 겜시타빈, 이다루비신, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈크리스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

여기서 지질 이중층 구성성분은 약 80-90:2-8:2-18의 몰비로 제공되고; 여기서 현탁액 중의 리포솜의 크기는 약 50 내지 약 150 nm인,

리포솜 제제를 제공한다.

한 실시양태에서, 활성제는 독소루비신이고, 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 불순물 A의 상대 농도는 0.5% 미만이고, 여기서 불순물 A는 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에서 대략 1.4의 상대 체류 시간을 갖는 피크이다.

한 실시양태에서, 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 불순물 A의 상대 농도는 약 0.5% 미만, 또는 0.4% 미만, 또는 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 8℃ 이하에서 약 1년 저장 후에 불순물 A의 상대 농도는 약 0.5% 미만, 또는 0.4% 미만, 또는 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 8℃ 이하에서 약 2년 저장 후에 불순물 A의 상대 농도는 약 1% 미만, 0.75%, 0.5%, 또는 0.4% 미만, 또는 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만이다.

한 실시양태에서, 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도는 약 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 또는 0.2% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 8℃ 이하에서 약 1년 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도는 약 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 또는 0.2% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 8℃ 이하에서 약 2년 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도는 약 2.0% 미만, 1.6% 미만, 1.5% 미만, 1.0% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 또는 0.2% 미만이다.

추가 실시양태에서, 약 8℃ 이하의 온도에서 150일 저장 후에 독소루비신의 농도는, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 99.5% 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 약 8℃ 이하의 온도에서 약 6개월 저장 후에 독소루비신의 농도는, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 99.5% 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 약 8℃ 이하의 온도에서 약 1년 저장 후에 독소루비신의 농도는, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 99.5% 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 약 8℃ 이하의 온도에서 약 2년 저장 후에 독소루비신의 농도는, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 99.5% 초과이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 약 8℃ 이하의 온도에서 150일 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 1% 미만 또는 0.5% 미만인 제약 조성물이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 약 8℃ 이하의 온도에서 약 6개월 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 1% 미만 또는 0.5% 미만인 제약 조성물이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 약 8℃ 이하의 온도에서 약 1년 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 1% 미만 또는 0.5% 미만인 제약 조성물이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 약 8℃ 이하의 온도에서 약 2년 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 2.5% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만인 제약 조성물이다.

또 다른 실시양태에서, 리포솜은 사카라이드를 포함하는 완충제 중에 현탁된다. 사카라이드는 모노사카라이드, 예컨대 락토스, 또는 디사카라이드, 예컨대 수크로스일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 히스티딘을 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

(ii) 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질; 및

을 포함하고,

(b) 리포솜의 현탁액에 활성제의 용액을 첨가하며, 여기서 활성제는 리포솜 내로 흡수되고,

여기서 활성제는 독소루비신, 블레오마이신, 다카르바진, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플루다라빈, 겜시타빈, 이다루비신, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈크리스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계

를 포함하는, 활성제를 온도 감수성 리포솜 내로 로딩하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 활성제는 독소루비신이다. 또 다른 실시양태에서, 용액 중에 존재하는 독소루비신의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98%가 리포솜 내로 흡수된다.

또 다른 실시양태에서, 리포솜 내로 흡수된 독소루비신의 농도는 약 1 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 10 내지 약 65 mM, 가장 바람직하게는 약 45 mM 내지 약 55 mM이다. 추가 실시양태에서, 리포솜 내로 흡수된 독소루비신의 농도는 약 50 mM이다. 또 다른 실시양태에서, 리포솜 내로 흡수된 독소루비신의 농도는 약 75 mM이다.

본 발명의 리포솜은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜 에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질로 구성된다. 인지질은 바람직하게는 온열요법 범위 (예를 들어, 대략 38℃ 내지 대략 45℃ 범위)의 하한에서 고체 또는 겔 형태에서 액체로의 전이 온도를 보유한다. 아실 기가 포화된 인지질이 보다 바람직하다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 인지질은 2개의 동일하거나 상이한 C₁₄-C₂₀ 아실 기를 가지며, 예컨대, 예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜 글리세롤 (DSPG) 또는 그의 조합이다.

본 발명의 리포솜은 하나 이상의 리소지질로 구성된다. 한 실시양태에서, 리소지질은 모노팔미토일포스파티딜콜린 (MPPC), 모노라우릴포스파티딜콜린 (MLPC), 모노미리스토일포스파티딜콜린 (MMPC), 모노스테아로일포스파티딜콜린 (MSPC) 또는 그의 혼합물이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 최종 리포솜 제제 중의 지질의 총 농도는 약 10-50 mg/ml, 약 20-50 mg/ml, 약 30-40 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml 또는 40 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 리포솜 제제 중의 독소루비신의 농도는 약 0.2 - 40 mg/ml, 약 0.5 - 30 mg/ml, 약 1 - 20 mg/ml, 약 2 - 10 mg/ml, 약 1 mg/ml, 약 2mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 4 mg/ml 또는 약 5 mg/ml이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 지질에 대한 독소루비신 비는 0.02 - 10, 약 0.05, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10이다.

본 발명의 리포솜은 RES에 의한 리포솜 섭취를 감소시키고 따라서 리포솜의 순환 시간을 증가시키기 위한 중합체-유도체화된 지질을 포함한다. 적합한 중합체는 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리딘, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 올리고사카라이드, 및 상기한 것들의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질은 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 (PEG화) 지질이다. 바람직하게는, PEG화 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜) 2000]이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 리포솜에 블레오마이신, 다카르바진, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플루다라빈, 겜시타빈, 이다루비신, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈크리스틴인 활성제를 로딩하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 제조는 황산암모늄 용액으로서 제공되는 암모늄 염의 존재 하에 리포솜을 제조하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 용액 중의 황산암모늄의 농도는 약 100 mM 내지 약 300 mM, 바람직하게는 약 200 mM이다.

또 다른 실시양태에서, 암모늄 염은 아디프산, L-아스코르브산, L-아스파르트산, 시트르산, 푸마르산, 글루탐산, 글루타르산, 히푸르산, 염산, D,L-락트산, 말레산, L-말산, 인산, 숙신산 또는 L-타르타르산의 염으로서 제공된다. 추가 실시양태에서, 용액 중의 암모늄 염은 약 100 mM 내지 약 300 mM, 바람직하게는 약 200 mM이다.

리포솜 외부의 암모늄 이온은 모노사카라이드 또는 디사카라이드 용액으로 대체된다. 추가 실시양태에서, 모노사카라이드 또는 디사카라이드 용액의 농도는 약 5-15%, 바람직하게는 약 10%이다. 이러한 대체 또는 교환은 투석 또는 정용여과와 같은 기술에 의해 수행될 수 있다.

추가 실시양태에서, 리포솜 외부의 암모늄 이온은 모노사카라이드 용액, 예컨대 예를 들어 락토스 용액으로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 리포솜 외부의 암모늄 이온은 디사카라이드 용액, 예컨대 예를 들어 수크로스 용액으로 대체된다.

한 실시양태에서, 히스티딘 완충제가 단계 (b) 후에 리포솜 제제에 첨가된다. 추가 실시양태에서, 히스티딘 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM, 바람직하게는 약 10 mM이다.

본 발명에 따른 리포솜 제제의 제조 방법은 이중층 성분을 적합한 유기 용매 중에 적절한 비율로 혼합하는 것을 포함한다. 유용한 용매는 클로로포름, 아세톤, 메탄올 또는 메틸렌 클로라이드를 포함한다. 이어서, 용매를 증발시켜 건조된 지질 필름을 형성한다. 필름은 평형량의 리소지질 및 목적 활성제, 예를 들어 독소루비신을 함유하는 수용액을 사용하여 (지질 혼합물의 상 전이 온도를 초과하는 온도에서) 재수화된다. 재수화 후에 형성된 리포솜을 압출하여 목적 크기의 리포솜을 형성한다. 예를 들어, 80:20 DPPC:MSPC로 구성된 리포솜을 생산하는 경우에, 재수화는 상기 특정한 지질 혼합물의 상 전이 온도를 초과하는 (39℃ 초과) 온도에서 수행된다. 지질 필름을 재수화하는데 사용된 수용액은 평형량의 리소지질 단량체 (예를 들어, MSPC의 임계 미셀 농도와 동일한 농도, 약 1 마이크로몰)를 포함한다.

제안된 제조 방법 및 제어의 설명

대규모 배치의 암모늄 로딩 제제의 제조 방법이 하기 기재된다. 방법은 다양한 크기 배치의 제제, 예를 들어 2 - 2000 L 규모 배치의 생산에 이용될 수 있다. 제안된 제조 방법은 도 2에 개략적으로 예시된다.

단계적 제조 방법:

1. 주사용수 (WFI) 중에 적절한 양의 황산암모늄을 용해시켜 황산암모늄 완충제를 제조하고, 이어서 바이오버든 감소 여과를 진행한다. 완충제의 몰농도는 예를 들어 200 mM일 수 있다.

2. 지질을 승온 (45 - 70℃)에서 적절한 시간 동안 단계 1로부터의 황산암모늄 완충제를 이용하여 수화시킨다. 예를 들어, 지질을 60℃에서 1시간 동안 수화시킨다.

3. 승온에서 특정한 기공 크기를 갖는 필터 막을 통해 수화된 지질 혼합물을 압출하여 목적 크기의 리포솜을 수득한다. 예를 들어, 수화된 지질 혼합물을 65℃에서 80 nm 폴리카르보네이트 필터 막을 통해 압출하여 ~100 nm 리포솜을 형성한다.

4. 비-리포솜 포획된 황산암모늄을 사카라이드 용액, 예를 들어 10% 수크로스 용액으로 교환하고, 이어서 예열된 필터, 예컨대 사르토브란(Sartobran) P 필터를 통해 멸균 여과를 진행한다.

5. WFI 중에 적절한 양의 히스티딘 HCl을 용해시켜, 히스티딘 HCl 완충제, 예를 들어 100 mM 히스티딘 완충제 (pH 6)를 제조하고, 이어서 멸균 여과를 진행한다.

6. WFI 중에 적절한 양의 독소루비신 HCl을 용해시켜 독소루비신 HCl 용액 (예를 들어 5.0 mg/mL 농도)을 제조하고, 이어서 멸균 여과를 진행한다.

7. 1.0 부의 멸균 리포솜과 0.8 부의 멸균 독소루비신 HCl 용액을 혼합하고, 35℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다.

8. 0.2 부의 멸균 히스티딘 완충제를 첨가하고, 잘 혼합한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(ii) 친수성 중합체로 유도체화된 하나 이상의 인지질; 및

을 포함하고,

를 포함하는, 독소루비신을 온도 감수성 리포솜 내로 로딩하는 방법에 의해 제조된 리포솜 제제이다.

0.05 내지 0.3 마이크로미터 직경의 리포솜이 종양 투여에 적합한 것으로 보고된 바 있다 (미국 특허 번호 5,527,528 (Allen et al.)). 본 발명에 따른 리포솜의 크기조절은 내부에 함유된 활성제 및 목적 효과를 고려하여 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,212 (Martin et al.); 미국 특허 번호 5,527,528 (Allen et al.)을 참조하며, 이들 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 약 0.05 마이크로미터 또는 약 0.1 마이크로미터 직경, 내지 약 0.3 마이크로미터 또는 약 0.4 마이크로미터 직경이다. 리포솜 제제는 다양한 크기의 리포솜을 함유할 수 있다. 유리하게는, 이들 리포솜은 본원에 기재된 지질 혼합물을 포함하고, 따라서 기재된 바와 같이 함유된 약물을 방출하는 능력을 갖는 온도-감수성이다.

본 발명의 한 측면에서, 리포솜은 선택된 크기 범위에서 실질적으로 균질한 크기를 갖도록 제조된다. 하나의 효과적인 크기조절 방법은 선택된 균일한 기공 크기를 갖는 일련의 폴리카르보네이트 막을 통해 리포솜의 수성 현탁액을 압출하는 것을 포함하며; 막의 기공 크기는 대략 상기 막을 통한 압출에 의해 생산된 리포솜의 평균 크기에 상응할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,737,323을 참조한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 약 50 nm, 100 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm 또는 150 nm로부터 약 175 nm, 180 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm 또는 500 nm까지의 직경이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제제는 8℃ 이하, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 -80℃ 내지 약 -15℃, 약 -30℃ 내지 약 -15℃, 또는 약 -15℃ 내지 약 2℃의 온도에서 저장된다.

또 다른 측면에서, 리포솜 제제는 독소루비신 및 영상화제 또는 진단제를 포함한다. 수많은 이유로 인해 영상화제를 리포솜 중에 또는 영상화제를 치료제와 조합하여 캡슐화하는 능력이 바람직하다. 첫 번째로, 활성제의 치료 효능은 영상화제의 방출을 시각화하여 약물의 방출을 추론하는 능력과 함께 증가될 것이다. 이는 약물의 조직 침투 및 농도를 결정하는 도구를 제공할 것이다. 또한, 리포솜 중에서 약물을 영상화제와 조합하는 것은 경시적 약물 방출, 조직 분포 및 약물 클리어런스의 모니터링 및 정량화를 가능하게 할 것이다. 두 번째로, 영상화제를 보유하고 방출하는 리포솜은 스크린전 환자에게 기회를 허용할 것이다. 예를 들어, 선택 환자 집단은 종양 혈관계의 "누출성"을 기초로 하여 치료 리포솜으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 것으로서 확인될 수 있다. 영상화제를 사용하여 시각화된 이러한 누출성은 종양에 접근하고 이를 치료하기 위해 미세혈관계 및 임의의 섬유화 조직을 가로질러 혈관외유출되는 활성제의 능력의 지표이다. 사용될 수 있는 영상화제 또는 진단제의 예는 X선 영상화, 자기 공명 영상화 (MRI), 초음파 영상화 또는 핵 의학 영상화를 위한 작용제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 디지털 감산 혈관조영 (DSA)과 같은 적용을 비롯한 X선 영상화에서, 조영은 전자 밀도에서의 차이를 기초로 한다. 본 발명의 한 측면에서, 리포솜 제제는 독소루비신 및 X선 조영제를 포함한다. X선 조영제는 일반적으로 무거운 원소를 기초로 하며, 위장계의 시각화를 증진시키는데 사용될 수 있는 바륨 염, 예컨대 바륨 술페이트, 및 위장계의 시각화 및 비경구 연구 사용될 수 있는 아이오딘화 조영제를 포함한다. 아이오딘화 X선 조영제는 아이오헥솔, 아이오펜톨, 아이오파미돌, 아이오딕사놀, 아이오프로미드, 아이오트롤란, 메트리자미드, 메트리조산, 디아트리아조산, 아이오탈람산, 아이옥사글리산 및 이들 산의 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 리포솜 제제는 독소루비신 및 MRI 조영제를 포함한다. MRI 조영제는, 예를 들어 망가니즈 (2+), 가돌리늄 (3+) 또는 철 (3+) 기반의 상자성 킬레이트를 포함한다. 친수성 킬레이트, 예컨대 GdDTPA, GdDOTA, GdHPDO3A 및 GdDTPA-BMA는 세포외로 분포되고, 신장에 의해 제거된다. 이러한 화합물은 예를 들어 중추 신경계에서 병변을 시각화하는데 유용하다. 다른 추가의 기관- 또는 조직-특이적 작용제는 MnDPDP, GdBOPA, GdEOB-DTPA, 상자성 포르피린, 거대분자 화합물, 입자 및 리포솜을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 리포솜 제제는 독소루비신 및 초음파 영상화제를 포함한다. 초음파 영상화는 트랜스듀서를 통한 인간 또는 동물 대상체 내로의, 예를 들어 1-10 MHz의 주파수 범위의 초음파의 침투를 기초로 하며, 초음파는 신체 조직 및 체액의 계면과 상호작용한다. 초음파 영상에서의 조영은 이러한 계면에서의 음파의 차별적 반사/흡수로부터 유래하며; 결과는 혈류를 평가하기 위한 색 도플러의 사용을 비롯한 도플러 기술을 사용하여 증진될 수 있다. 초음파 조영제의 예는 기체-함유 갈락토스 미세결정을 기재로 하는 에코비스트(Echovist)®; 지방산으로 코팅된 기체-함유 갈락토스 미세결정을 포함하는 레보비스트(Levovist)®; 및 부분적으로 변성된 인간 혈청 알부민에 의해 캡슐화된 기포를 포함하는 인포손(Infoson)®을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 영상화제 또는 진단제는 형광 작용제, 예컨대 6-카르복시플루오레세인, 방사성 작용제 (예컨대 방사성동위원소, 또는 방사성동위원소를 함유하는 화합물, 예를 들어 아이오도-옥탄, 할로카본 및 레노그라핀) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 리포솜 제제는 추가의 활성제, 예를 들어 또 다른 화학요법 약물을 추가로 포함한다.

실시예

실시예 1

NH₄ ⁺-로딩에 의한 독소루비신 로딩 온도-감수성 리포솜의 제조

리포솜 막의 86% (mol %)를 차지하는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린 (DPPC); 대략 4% (mol %)의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리에틸렌 글리콜 2000 (DSPE-mPEG); 및 대략 10% (mol %)의 1-스테아로일-2-히드록시-sn-글리세로 포스파티딜 콜린 (MSPC)을 함유하는 리포솜을 하기 기술에 의해 제조하였다: 먼저, 적절한 지질 조성물을 200 mM 황산암모늄 완충제 중에서 수화시켜 다층 리포솜을 형성하였다. 이어서, 200 mM 황산암모늄 완충제 중에서 80 nm 필터를 통해 압출하여 소형 단층 리포솜을 형성함으로써, 대략 100 nm 구체를 형성하였다.

이어서, 리포솜 외부에 있는 황산암모늄을 10% 수크로스 용액으로 교환하는 투석 또는 정용여과 단계에, 이전 단계에서 제조된 리포솜을 적용하여 리포솜 막을 가로지르는 암모늄 농도 구배를 형성하였다 (즉, 200 mM 내부, 1 mM 미만 외부). 암모늄 농축이 승온에서 리포솜의 내부 부피로의 첨가된 독소루비신 용액의 로딩을 효과적으로 및 거의 정량적으로 촉진시킬 수 있음이 공지되어 있다 (문헌 [Haran G, Cohen R, Bar LK and Barenholz Y, Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases, Biochimica et Biophysica Acta, 1151 (1993) 201-215 201]). 35 - 39℃에서 인큐베이션하여 독소루비신을 리포솜의 내부 수성 부피 내에 포획시켰다. 로딩 완료시, 저장 동안 제품 pH를 안정화시키기 위해 리포솜 용액을 히스티딘 완충제로 완충시켰다.

실시예 2

pH-로딩 온도 감수성 독소루비신 리포솜의 제조

pH 구배를 사용하여 로딩된 독소루비신을 함유하는 리포솜을 WO 2007/024826에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 리포솜 막의 86% (mol %)를 차지하는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린 (DPPC); 대략 4% (mol %)의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리에틸렌 글리콜 2000 (DSPE-mPEG); 및 대략 10% (mol %)의 1-스테아로일-2-히드록시-sn-글리세로 포스파티딜 콜린 (MSPC)을 함유하는 리포솜을 하기 기술에 의해 제조하였다: 먼저, 적절한 지질 조성물을 300 mM 시트레이트 완충제 (pH = 4) 중에서 수화시켜 다층 리포솜을 형성하였다. 이어서, 300 mM 시트레이트 완충제 중에서 80 nm 필터를 통해 압출하여 소형 단층 리포솜을 형성함으로써, 대략 100 nm 구체를 형성하였다.

이어서, 500 mM 탄산나트륨 용액을 이전 단계에서 제조된 리포솜에 첨가하여 외부 용액을 ~ 7.5의 pH로 증가시켰다. 막을 가로질러 형성된 pH 구배가 승온에서 리포솜의 내부 부피로의 첨가된 독소루비신 용액의 로딩을 효과적으로 및 거의 정량적으로 촉진시킬 수 있음이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mayer LB, Bally MB, Cullis PR., Uptake of adriamyacin into large unilamellar liposomes in response to a pH gradient, Biochimica et Biophysiea Acta 857 (1986) 123-126] 참조). 35 - 39℃에서 인큐베이션하여 독소루비신을 리포솜의 내부 수성 부피 내에 포획시켰다.

제제 조성물/부형제/기능성

표 1은 실시예 1에 따른 제제, 및 실시예 2에 따른 통상의 pH 로딩 리포솜 사이의 비교를 보여준다. 표 1로부터 확인되는 바와 같이, 제제는 둘 다 2.0 mg/mL의 독소루비신을 함유하였다. 본 발명에 따른 제제를 보다 통상의 리포솜 독소루비신 제제와 잘 비교하였다. 사용된 모든 원료는 제약 등급의 것이었다.

<표 1>

실시예 3

최종 제품 특성화 방법

최종 제품을 총 독소루비신 함량, 독소루비신 분해 산물, pH, 오스몰랄농도, 입자 크기 분포, MSPC 함량, DPPC 함량, DSPE-mPEG 함량, % 캡슐화된 독소루비신, 37℃에서의 약물 방출, 및 41℃에서의 약물 방출에 대해 특성화하여 제품의 평가를 효과적으로 완료하였다. 표적 총 독소루비신 함량은 약 1.8 내지 약 2.2 mg/mL였다. 약물 캡슐화는 전형적으로 90% 초과였으며, 정상 체온 (즉 37℃)에서 제한된 방출, 예를 들어 < 10%를 나타냈고, 41.0℃에서 증진된 방출, 전형적으로 > 80%를 나타냈다. 동적 광 산란에 의해 측정시, 리포솜의 부피 평균 입자 크기는 약 50 내지 약 150 nm였다.

실시예 4

생리화학적 특성

리포솜의 물리적 직경

상기 실시예 1에서 형성된 리포솜의 물리화학적 특성은 통상의 완충제를 사용하여 형성된 리포솜 제제와 유사하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 황산암모늄 수화된 리포솜의 입자 크기 분포는 시트레이트 완충제 수화된 리포솜과 본질적으로 동일하였다.

지질 조성물

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리포솜 제제의 지질 조성물은 당업계에 공지된 리포솜 제제의 지질 조성물과 동일하였다. 또한, 37℃ 및 41.0℃ 둘 다에서의 차별적 약물 방출을 시험함으로써 지질 막 조성물의 기능성을 확인하였다.

독소루비신 캡슐화의 정도

본 발명은 내부 수성 상 중에 90% 초과의 독소루비신이 캡슐화되도록 원격 로딩 절차 (예를 들어, 문헌 [Haran G, Cohen R, Bar LK and Barenholz Y., Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases, Biochimica et Biophysica Acta, 1151 (1993) 201-215 201] 참조)를 이용하여 설계된 리포솜 제품을 제공한다. 캡슐화된 독소루비신의 %를 한외여과에 의해 분리된 비-캡슐화된 독소루비신 (유리 Dox), 및 제품의 총 독소루비신을 측정함으로써 계산하였다. 본 연구는 95% 초과의 캡슐화가 암모늄 로딩 제제에 대해 달성될 수 있음을 보여주었다.

추가로, 각각의 배치의 열 방출 특성, 37℃에서의 % 방출 및 41℃에서의 % 방출은 배치 사이에서 매우 재현가능하였고, 도 8에 나타낸 바와 같이 유사하였다.

최종 제품 특성화 방법

상기 언급된 완성 제품 특성화 시험의 목록 이외에도, 새로운 제제의 몇몇 다른 특성을 평가하였다. 먼저, 약물 제품에 대한 핵심 설계 파라미터에서의 리포솜 막의 중요성으로 인해, 시차 주사 열량측정법을 pH-로딩 (도 4에 나타냄) 및 NH₄ ⁺-로딩 (도 5에 나타냄) 제제에 대해 수행하였다. 각각의 온도기록도는 약 41℃에서 하나의 주요 발열을 보여주었고, 이는 완충 용액이 막 순서의 전체적 구조에 대해 무시가능한 효과를 가져야 하기 때문에 예상대로 새로운 제제에 대한 막이 pH-로딩 리포솜에 대한 것과 상당히 유사하다는 것을 시사한다.

2가지 제제의 전체적 크기 및 형태를 또한 터널링 전자 현미경검사 (TEM)의 고해상도 기술을 사용하여 비교하였다. 다시, 현재 III상 연구에 사용되고 있는, GMP 제조 시설에서 본 발명의 제조 규모로 생산된 pH-로딩 제품 (도 6)의, 셀시온(Celsion)에서 실험실 규모로 NH₄ ⁺-로딩 제제를 사용하여 제조된 제품 (도 7)에 대한 비교를 수행하였다. 2가지 제제에 대한 리포솜은 유사한 소포 직경, 우세한 단층 막을 보여주었고, 로딩 단계 동안 리포솜 내부에서 독소루비신 약물 복합체 형성을 일으키는, 각각의 리포솜 내부의 전형적 단결정이 나타났다. 전체적으로, TEM은 pH 또는 NH₄ ⁺- 로딩 시스템을 사용하여 생성된 리포솜이 상당히 유사하다는 것을 보여준다.

35 내지 45℃의 온도의 함수로서 방출된 독소루비신의 양을 측정하는 온도 방출 프로파일을 명시된 온도에서 10분 동안 각각의 샘플을 인큐베이션함으로써 결정하였다. 시험의 결과는 도 8에 제시되어 있다. 이전 시험에서와 같이, 현재 III상 연구에 사용되고 있는, GMP 제조 시설에서 본 발명의 제조 규모로 생산된 pH-로딩 제품의, 셀시온에서 실험실 규모로 NH₄ ⁺-로딩 제제를 사용하여 제조된 제품에 대한 비교를 수행하였다 (도 8). 방출 곡선은 2가지 제제에 대해 매우 유사하였으며, 둘 다 39℃ 미만의 온도에서 최소 방출을 보여주었고 41.0℃ 이상에서 거의 90% 방출을 보여주었다. 명백히, 제제는 둘 다 정상 체온, 즉 37℃에서 독소루비신 방출이 제한되고 경도 온열요법 또는 41-45℃ 범위의 온도에서 대부분의 약물이 방출되는 설계 표적을 지지한다.

온도 방출 데이터는 또한 지질 막 조성물의 현미경적 균일성의 최고 척도이다. 41.0℃에서 90% 초과의 약물을 방출하는 제제를 위해, 대부분의 리포솜 (즉, 100 nm 소포)은 벌크 제품에 대한 열 유발 방출을 입증하기에 적절한 지질 조성물을 가져야 한다. 부정확한 수준의 DSPE-MPEG 또는 MSPC가 이들 리포솜으로부터의 독소루비신에 대한 방출 정도 및 속도에 유해하게 영향을 미칠 것임이 공지되어 있다. 또한, 전이 온도가 비교 DSC 스캔 (도 4 및 5)과 관련하여 거의 동일하다는 사실은, 완충제 시스템의 변화가 리포솜 막에 대해 무시가능한 영향을 가지며 따라서 그의 약물 방출 특성에 대해 무시가능한 영향을 가져야 한다는 결론을 이끌어 낸다.

실시예 5

pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 제제에 대한 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 수준의 비교

pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 제제에서 생성된 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 수준을 검사하기 위해 실험실 실험을 수행하였다 (도 9). 두 제공자로부터 공급된 부형제, 부형제 A 및 B를 pH-로딩 제제에 대해 검사하였다. NH₄ ⁺-로딩 제제의 3개의 독립적 제제를 또한 검사하였다. 모든 경우에, 및 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A 둘 다에 대해, 형성된 수준은 NH₄ ⁺-로딩 제제보다 pH-로딩 제제의 경우에 유의하게 더 높았다. 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 감소된 수준이 새로운 공급원의 부형제를 사용한 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 제제에 대해 관찰되었고, 불순물 A의 수준에서는 변화가 없었다.

또한, NH₄ ⁺-로딩 제제에 대한 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신 및 불순물 A의 조합 수준은 심지어 35℃에서 4시간의 인큐베이션 시간에도 불구하고 0.2% 미만이었다. 분해물 형성의 수준을 도 11에 제시된 안정성 데이터에서 초기 시점으로서 나타냈고, 이는 도 10에 제시된 독소루비신 값과 크게 상호관련되었다.

실시예 6

안정성 프로파일

비교 안정성 데이터를 pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 제제에 대해 생성하였다. pH-로딩 제제는 -15℃ 내지 -30℃에서의 저장을 필요로 하지만, -20℃ 및 가속 안정성 조건, 즉 +5℃ 저장 둘 다에서 안정성 비교를 생성하였다. 739일 후의 독소루비신 검정의 결과는 암모늄-로딩 제제의 경우에 ~ 4 % 독소루비신의 손실을 보여주었다. 대조적으로, pH 로딩 제제의 경우에 동일한 기간 후의 독소루비신의 손실은 ~ 60 %였다. 독소루비신의 손실 검정 데이터는 도 10 및 표 2에 요약되어 있다. 총 분해물 성장도 동일한 경향을 지지하였으며, 즉 pH-로딩 제제의 경우에 분해물의 유의한 증가가 관찰되었고, NH₄ ⁺-로딩 제제의 경우에 매우 낮은 수준의 분해물 성장이 관찰되었다 (도 11 및 표 2).

<표 2>

2-8℃에서의 안정성 이외에도, 도 12 및 도 13은 -20℃에서의 독소루비신의 손실 검정 데이터를 제시한다. 데이터는 NH₄ ⁺-로딩 제제가 pH-로딩 제제와 비교하여 매우 낮은 수준의 분해물 성장 및 증가된 독소루비신 안정성을 나타낸다는 것을 입증한다.

또한, LC/MS에 의해 확인된, pH-로딩 및 NH₄ ⁺-로딩 제제로부터 형성된 분해 산물의 정체가 동일하지만 NH₄ ⁺-로딩 제제의 경우에 형성이 보다 적은 정도로 일어난다는 것이 관찰되었다. 또한, NH₄ ⁺-로딩 제제는 2년 이상의 저장에 걸쳐 보다 낮은 수준의 분해 산물 성장 이외에도 개선된 독소루비신 HCl 안정성을 나타냈다. NH₄ ⁺-로딩 제제에 대한 용액 pH, 리포솜 입자 크기, % 캡슐화, 및 41.0℃에서의 독소루비신의 % 방출은 8℃ 이하의 온도에서 2년 이상에 걸쳐 유지되었다.

상기 요약된 누적 안정성 데이터는 NH₄ ⁺-로딩 제제가 8℃ 이하의 온도에서 저장된, 냉각된 제품으로서 상업적으로 제공될 수 있다는 주장을 지지한다. 새로운 최소화된 총 분해물 형성이 2년 이상의 보관 수명을 갖는 상업적 용도를 위해 허용되는 제품을 생성할 것이라는 것이 예상된다. 감소된 분해 수준은 또한 제품 효력 유지의 개선으로 해석될 것이다. 전체적으로, 약물 제품에 대한 이들 개선의 조합 효과는, 투여 재현성을 증진시키고 보다 우수한 수송 및 저장 순응도를 달성하고 따라서 보다 높은 품질의 상업적 제품으로 이어지는 것으로 간주된다.

발명의 상세한 설명 섹션은 특허청구범위를 해석하는데 사용하기 위해 의도되며 발명의 내용 및 요약서 섹션은 그렇지 않음을 인식해야 한다. 발명의 내용 및 요약서 섹션은 하나 이상으로 기재될 수 있으나, 본 발명자(들)에 의해 고려된 본 발명의 모든 예시적 실시양태를 기재하지는 않으므로, 어떤 방식으로든 본 발명 및 첨부된 특허청구범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않는다.

구체적 실시양태의 상기 기재는 본 발명의 일반적 특성을 충분히 밝혀낼 것이며, 다른 이들은 당업계의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이 이러한 구체적 실시양태를 다양한 적용을 위해 용이하게 변형 및/또는 변경시킬 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 변경 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침을 기초로, 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서의 용어 및 어구가 본 발명의 교시 및 지침을 고려하여 당업자들에게 해석되도록, 본원의 어구 및 용어가 설명을 위한 것이며 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

본 발명의 범위 및 범주는 임의의 상기 기재된 예시적 실시양태에 의해 제한되지 않아야 하며, 단지 하기 특허청구범위 및 그의 등가물에 따라 규정되어야 한다.

Claims

겔-상 지질 이중층을 갖는 리포솜 및 상기 리포솜 내부에 1.8 mg/ml 내지 2.2 mg/ml의 농도로 포획된 독소루비신 술페이트의 현탁액을 포함하는 리포솜 제제로서; 상기 지질 이중층은
(i) 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC);
(ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜) 2000]; 및
(iii) 모노스테아로일포스파티딜콜린 (MSPC)
을 포함하고;
여기서 지질 이중층 구성성분 (i), (ii), 및 (iii)은 86:4:10의 몰비로 제공되고; 여기서 현탁액 중의 리포솜의 크기는 50 내지 150 nm이고,
8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 불순물 A의 상대 농도가 0.5% 미만이고, 불순물 A가 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에서 1.4의 상대 체류 시간을 갖는 피크인
리포솜 제제.
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제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 불순물 A의 상대 농도가 0.2% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 1년 저장 후에 불순물 A의 상대 농도가 0.5% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 2년 저장 후에 불순물 A의 상대 농도가 0.75% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 6개월 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도가 0.5% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 1년 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도가 0.5% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하에서 2년 저장 후에 8-데스아세틸-8-카르복시 다우노루비신의 상대 농도가 1.6% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 6개월 저장 후에 독소루비신의 농도가, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 크기 배제 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 99% 초과인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 1년 저장 후에 독소루비신의 농도가, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 97% 초과인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 2년 저장 후에 독소루비신의 농도가, 아세트산/메탄올 용매 구배 용리 조건을 사용한 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 결정시, 초기 독소루비신 농도의 95% 초과인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 6개월 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 1% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 1년 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 1% 미만인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 8℃ 이하의 온도에서 2년 저장 후에 총 분해 산물의 형성이 2.5% 미만인 리포솜 제제.
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제1항에 있어서, 리포솜이 영상화제 또는 진단제를 추가로 포함하는 것인 리포솜 제제.
제17항에 있어서, 영상화제 또는 진단제가 리포솜 내에 포획되는 것인 리포솜 제제.
제18항에 있어서, 영상화제 또는 진단제가 X선 조영제, MRI 조영제, 초음파 영상화제, 형광 작용제 또는 방사성 작용제인 리포솜 제제.
(a) 겔-상 지질 이중층 및 리포솜 외부보다 높은 리포솜 내부의 암모늄 및 술페이트 이온의 농도를 갖는 리포솜의 현탁액을 제조하며, 상기 지질 이중층은
(i) 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC);
(ii) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜) 2000]; 및
(iii) 모노스테아로일포스파티딜콜린 (MSPC)
을 포함하고,
여기서 지질 이중층 구성성분 (i), (ii), 및 (iii)은 86:4:10의 몰비로 제공되고;
여기서 상기 제조는 현탁액 중의 리포솜의 크기를 50 내지 150 nm의 평균 입자 크기로 감소시키는 것을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 리포솜의 현탁액에 독소루비신 용액을 첨가하며, 여기서 독소루비신은 독소루비신 술페이트의 형태로 리포솜 내로 흡수되고, 리포솜 내의 독소루비신의 농도는 1.8 mg/ml 내지 2.2 mg/ml인 것인 단계
를 포함하는, 독소루비신 술페이트를 온도 감수성 리포솜 내로 로딩하는 방법.
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제20항에 있어서, 용액 중에 존재하는 독소루비신의 적어도 95%가 리포솜 내로 흡수되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 리포솜 내로 흡수된 독소루비신의 농도가 50 mM인 방법.
제20항에 있어서, 리포솜 내로 흡수된 독소루비신의 농도가 75 mM인 방법.
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제20항에 있어서, 상기 제조가 황산암모늄 용액의 존재시에 리포솜을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 황산암모늄의 농도가 100 mM 내지 300 mM인 방법.
제26항에 있어서, 리포솜 외부의 암모늄 이온을 모노사카라이드 또는 디사카라이드 용액으로 대체하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 모노사카라이드 또는 디사카라이드 용액의 농도가 5-15%인 방법.
제29항에 있어서, 리포솜 외부의 암모늄 이온이 모노사카라이드 용액으로 대체되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 모노사카라이드 용액이 락토스 용액인 방법.
제20항에 있어서, 단계 (b) 후에 히스티딘 완충제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 히스티딘 완충제의 농도가 5 mM 내지 15 mM인 방법.
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제20항의 방법에 의해 제조된 리포솜 제제.