PL226015B1

PL226015B1 - Liposomowy preparat zawierajacy przeciwnowotworowa substancje aktywna, sposob jego wytwarzania i zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL226015B1
Application number: PL394082A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Gubernator; Arkadiusz Kozubek; Piotr Paduszyński; Piotr Paduszynski; Dominik Lipka
Original assignee: Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną
Priority date: 2011-03-03
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2017-06-30
Also published as: CN103415283A; AU2012222891A1; ES2703750T3; JP2014506918A; PL394082A1; US20140056968A1; EP2680821B1; WO2012117385A3; CA2828971A1; EP2680821A2; WO2012117385A2

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający substancję przeciwnowotworową charakteryzujący się tym, że zawiera substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych oraz witaminę lub jej pochodną, sposób jego otrzymywania oraz kompozycja zawierająca przedmiotowy preparat.

Description

Przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający przeciwnowotworową substancję aktywną, sposób jego wytwarzania i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, mający zastosowanie w medycynie.

Liposomy stanowią zamknięte struktury, jedno- lub wielowarstwowe, w których podwójna warstwa amfifilowego lipidu stanowi otoczkę mikrokropelki wody (liposomy jednowarstwowe) lub też błony lipidowe układają się koncentrycznie na przemian z warstwami wody (liposomy wielowarstwowe). Amfifilowe lipidy tworzące dwuwarstwę posiadają polarną grupę hydrofilową i jeden lub więcej hydrofobowych prostych łańcuchów wielowęglowych (>C8). Grupy polarne mogą stanowić pochodne fosforanów, siarczanów i związków azotu, ale najczęściej stosowane są fosfolipidy, zwłaszcza pochodzeni a naturalnego, jak na przykład fosfatydylocholiny będące wynikiem rafinacji tłuszczów roślinnych, fosfolipidy syntetyczne, dostępne handlowo preparaty fosfolipidowe, w tym fosfolipidy modyfikowane chemicznie przy zastosowaniu pochodnych glikolu etylenowego i pochodne cholesterolu. Substancja lecznicza, zależnie od rozpuszczalności, umiejscowiona jest w warstwie wodnej lub w warstwie lipidowej liposomu.

Znanych jest szereg sposobów otrzymywania liposomów. Klasyczna metoda wytwarzania liposomów wielowarstwowych polega na odparowaniu roztworu lipid-rozpuszczalnik organiczny i rehydratacji filmu lipidowego wodnym roztworem substancji leczniczej (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Inne techniki obejmują emulgowanie lipidu w dwufazowej mieszaninie fazy wodnej i organicznej zawierającej lipid, przy jednoczesnym odparowywaniu rozpuszczalnika organicznego (np. opisy patentowe US 4522803, 5030453 i 5169637), tworzenie emulsji woda w oleju, z której odparowywana jest faza organiczna do uzyskania żelu, następnie mieszanego do otrzymania liposomów oligowarstwowych (US 4235871) oraz wielokrotnie powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania (US 5008050). Liposomy jednowarstwowe otrzymuje się z liposomów wielowarstwowych działaniem ultradźwięków, metodą ekstruzji (np. US 4975282), homogenizacji, jak również wstrzykiwania eterowych lub etanolowych roztworów lipidów do fazy wodnej (Deamer R., Uster P. „Liposome preparation; Methods and Mechanisms”, w: „Liposomes”, wyd. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).

W przypadku wielu grup terapeutyków zarówno wydajność zamykania substancji czynnej w pęcherzykach, jak i trwałość liposomów (in vitro i in vivo) stanowią poważny problem techniczny. W szczególności klasyczne preparaty liposomowe trudno rozpuszczalnych w wodzie taksoidów na bazie lecytyny sojowej lub syntetycznego analogu fosfolipidowego (Bartoli i in. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel i in. In Vivo 6, 1992, 23-28), wykazują tendencję do agregowania, a także niestabilność, powodującą „wyciekanie substancji aktywnej z liposomu i jej krystalizację. W wielu przypadkach sporządzenie liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych o efektywnym stosunku lipid/lek wymaga stosowania specjalnych zabiegów, takich jak na przykład opisany w publikacji WO 9202208 i zgłoszeniu patentowym EP 546951 A1 dodatek ujemnie naładowanych fosfolipidów lub ujawnione w japońskim opisie patentowym JP 06254379 dodawanie alkoholu wielowodorotlenowego i czwartorzędowych soli amoniowych. Udoskonalone postaci liposom owe, zapewniające większą trwałość poprzez steryczną stabilizację powierzchni sfery lipidowej, stanowią tzw. liposomy „Stealth” (D. D. Lasic, F. Martin „Stealth liposomes”, CRC Press Boca Raton, 1995). Jedną z metod zmierzających do opracowania bardziej trwałych form liposomowych stało się użycie do opłaszczania liposomów hydrofilowego glikolu polietylenowego, opisane m.in. w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 9422429. Do lecznictwa została wprowadzona liposomowa postać doksorubicyny powlekanej glikolem polietylenowym pod nazwą handlową Doxil®. Preparat Doxil® zawiera doksorubicynę zamkniętą w liposomowych nośnikach Stealth, składających się z trzech składników lipidowych - uwodornionej lecytyny z soi, cholesterolu i karbaminianowego koniugatu distearynylofosfatydyloetanoloaminy z metoksylową pochodną glikolu polietylenowego 2000 w odpowiednim stosunku molowym. Długi czas półtrwania liposomów Stealth, związany także z niskim wyciekiem leku, uzyskuje się stosując unikalne metody ładowania, które zapewniają wysoką wydajność ładowania i utrzymywanie leku we wnętrzu przez dłuższy czas. Metody te obejmują ładowanie gradientem elektrolitu (zgłoszenie EP 361894 A1) lub gradientem pH (publikacja WO 8806442). W publikacji WO 8806442 składniki warstwy lipidowej stanowią klasyczne związki lipidowe, takie jak fosfatydylocholiny naturalne i syntetyczne, z ewentualnym dodatkiem cholesterolu, a w procesie enkapsulacji wykorzystuje się gradient pH. Zgodnie z opisem, ograniczona szybkość wyciekania zamkniętego składnika biologicznie aktywnego jest wynikiem różnic pH po dwu stronach błony lipidowej. Metoda ładowania

PL 226 015 B1 gradientem pH ograniczona jest jednak tylko do leków rozpuszczających się w fazie wodnej, będących słabymi kwasami lub zasadami. Preparaty liposomowe zawierające topotekan i lipidy w proporcji 0,05:0,2, ładowane metodą gradientu pH lub jonoforetyczną, opisane są w publikacji WO 0202078. W skład warstwy lipidowej wchodzą sfingomielina i cholesterol. W opisie zgłoszenia międzynarodowego WO 9915153 ujawnione są m.in. liposomy taksolu, charakteryzujące się stężeniem substancji aktywnej w liposomie nie wyższym niż 5 mg/ml i zawierające jako lipid syntetyczną lecytynę dilauroilofosfatydylocholinę. Autorzy deklarują, że stosunek lek:lipid mieści się w zakresie od 1:1 do 1:2000, korzystnie 1:30, nie przedstawiają jednak informacji na temat trwałości tych preparatów liposomowych, przeznaczonych do podawania substancji przeciwnowotworowych drogą wziewną.

Stabilne preparaty liposomowe uzyskiwano dotychczas głównie dzięki stosowaniu specjalnych zabiegów bądź modyfikacji cząsteczek substancji aktywnej, np. przez dołączanie łańcuchów węglowodorowych, polimerycznych lub peptydowych. W polskich patentach nr 190077 i 190078 wysoki poziom enkapsulacji doksorubicyny lub mitoksantronu przy korzystnym stosunku lek:lipid w preparacie liposomowym uzyskano w wyniku modyfikacji składu warstwy lipidowej, która zawiera oprócz klasycznych składników, lecytyny jajecznej i uwodornionej lecytyny jajecznej, wodorosiarczanową pochodną acylową rezorcyny. Stabilne preparaty liposomowe paklitakselu uzyskano przez dodatek do kompozycji lipidowej kardiolipiny (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5424073, 5648090, 5939567 i 6146659). Z opisu patentowego US 6146659 wynika, że w tym przypadku wydajność zamykania paklitakselu w pęcherzykach liposomowych przekracza 90%, przy stosunku wagowym substancji aktywnej do nośnika lipidowego około 7%. Generalnie, możliwość inkorporowania paklitakselu do liposomów, wskutek jego wysokiej hydrofobowości, ograniczona jest do 1-10% (w/w), najczęściej 2-8% (w/w) w stosunku do nośnika lipidowego. Współczynnik ten tylko nieznacznie udaje się poprawić (do 12-14% w/w) w wyniku modyfikacji cząsteczki paklitakselu, np. przez dołączenie łańcuchów węglowodorowych (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5919815, 5939567, 6118011).

W dalszym ciągu istnieje zatem potrzeba opracowania liposomowych preparatów farmaceutycznych, zwłaszcza liposomowych preparatów zawierających hydrofobowe substancje przeciwnowotworowe, o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, czyli umożliwiających przenoszenie takiej samej ilości substancji aktywnej przez mniejszą ilość lipidowego nośnika.

Druga niezaspokojona potrzeba to dostarczenie liposomu, zawierającego dwie substancje antynowotworowe do terapii skojarzeniowej o zwiększonym efekcie terapeutycznym, charakteryzuj ącego się dużą stabilnością.

Nieoczekiwanie wspomniane problemy rozwiązał prezentowany wynalazek.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający substancję przeciwnowotworową charakteryzujący się tym, że zawiera substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 3 do 12 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych oraz witaminę lub jej pochodną. Korzystnie liposomowy preparat według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera antracykliny. Korzystniej liposomowy preparat według wynalazku charakteryzuje się tym, że witaminą jest kwas askorbinowy lub jego sól, korzystnie askorbinian amonu, kwas foliowy lub jego sól, korzystnie folian amonu lub kwas pantotenowy, korzystnie jego sól amonowa. Równie korzystnie liposomowy preparat według wynalazku charakteryzuje się tym, że pochodną witaminy jest metotreksat.

Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) przygotowanie jednowarstwowych liposomów poprzez uwodnienie mieszaniny fosfolipidów, korzystnie uwodornionej lecytyny sojowej lub jajecznej lub distearylofosfatydylocholiny oraz cholesterolu, korzystnie w ilości od 30 mg/ml do 60 mg/ml w 300 mM roztworze witaminy lub jej pochodnej, korzystnie soli amonowej kwasu askorbinowego lub foliowego lub pantotenowego;

b) zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny liposomów w roztworze soli witaminy lub jej pochodnej w ciekłym azocie i ciepłej wodzie, o temperaturze powyżej temperatury przejścia fazowego głównego lipidu, w celu wyrównania stężeń soli witaminy lub jej pochodnej po obu stronach błon liposomów;

c) zmniejszanie wielkości i warstwowości liposomów, korzystnie przeprowadzanie procesu ekstruzji liposomów przez filtry poliwęglanowe o odpowiednich średnicach por w ekstruderze wysokociśnieniowym lub w homogenizatorze wysokociśnieniowym;

d) wymianę zewnętrznego roztworu liposomów, korzystnie poprzez dializę lub sączenie molekularne, na obojętny bufor, korzystnie PBS w celu utworzenia gradientu pH/jonowego;

PL 226 015 B1

e) dodanie przeciwnowotworowej substancji aktywnej, korzystnie antarcykliny;

f) podgrzewanie zawiesiny do temperatury wyższej niż wynosi temperatura przejścia fazowego głównego fosfolipidu budującego liposomy, korzystnie do 60°C.

Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że na etapie a) dodaje się pegylowaną fosfatydyloetanoloaminę w celu stabilizacji liposomów w krwioobiegu. Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że pochodną witaminy wykorzystywaną w etapie a) jest metotreksat lub jego sól amonowa.

Trzecim przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, charakteryzująca się tym, że zawiera liposomowy preparat zawierający substancję przeciwnowotworową zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 3 do 12 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych oraz witaminę lub jej pochodną. Równie korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera metotreksat lub jego sól oraz związek z grupy antracyklin.

Liposom według wynalazku charakteryzuje się korzystnym stosunkiem lipid/substancja aktywna oraz wysoką skutecznością zamykania leków w liposomach już po 5-10 minutach prowadzenia reakcji według sposobu prezentowanego w opisie. Dodatkowo sposób według wynalazku pozwala na przygotowanie liposomów do tak zwanej terapii skojarzonej gdzie stosuje się dwa różne leki w celu zwiększenia efektu terapeutycznego. Tak więc w tym przypadku wykorzystuje się jeden lek do zamykania drugiego, otrzymując w konsekwencji dwa leki zamknięte w strukturze jednego liposomu. Takie postępowanie dodatkowo pozwala na zmniejszenie ucieczki kompleksu pochodnej witaminy, np. metotreksatu i antracykliny co stabilizuje oba leki w liposomie. W przypadku samego metotreksatu jego wyciek po podaniu dożylnym może być zbyt szybki z powodu obecności roztworu wodnego leku, podczas gdy wyprecypitowana forma leku jest faworyzowana z uwagi na większą stabilność.

Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres obrazujący kinetykę zamykania Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol dzięki zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej kwasu askorbinowego. Warunki zamykania leku opisano w przykładzie 1A-C; fig. 2 - wpływ stosunku lek lipid na wydajność zamykania Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol dzięki zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej kwasu askorbinowego. Warunki zamykania leku opisano w przykładzie 2A; fig. 3 to retencja Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol dzięki zamknięta przy zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej kwasu askorbinowego. Warunki zamykania leku opisano w przykładzie 3A, a fig. 4 przedstawia wydajność zamykania Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol przy zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej kolejno kwasu foliowego, kwasu pantotenowego oraz metotreksatu. Warunki zamykania leku takie jak przedstawiono w przykładzie 4A-D.

Przykład 1

A. Otrzymywanie liposomów zawierających kwas askorbinowy.

Do 100 ml kolby okrągłodennej dodano 35,28 uwodornionej lecytyny sojowej (HSPC) i 13,02 mg cholesterolu (Chol) oraz 11,67 mg pegylowanej distearylofosfatydyloetanoloaminy (DSPE-PEG 2000) w postaci chloroformowych roztworów, a następnie rozpuszczalnik organiczny odparowano przy użyciu wyparki próżniowej. Do suchej pozostałości dodano 1,5 ml roztworu soli amonowej kwasu askorbinowego (pH = 4,0) o stężeniu 300 mM, a następnie uwadniano w temperaturze 64°C do momentu otrzymania liposomów wielowarstwowych. Zawiesinę liposomów poddano kilkukrotnemu procesowi zamrażania i rozmrażania na przemian w ciekłym azocie i wodzie o temperaturze 64°C, a następnie procesowi kalibracji w kalibratorze ciśnieniowym przez filtr poliwęglanowy o 100 nm wielkości porów w temperaturze 64°C.

B. Generowanie gradientu jonowego soli amonowej kwasu askorbinowego.

Liposomy uzyskane w pkt. A naniesiono na kolumnę (1x20 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-50 fine, zrównoważoną w buforze PBS, po czym dokonano ich odsolenia, wymieniając zewnętrzny roztwór (300 mM roztwór soli amonowej kwasu askorbinowego) na bufor fosforanowy (PBS, pH = 7,4). Po rozdzieleniu liposomów oznaczono zawartość lipidów metodą Stewarda.

PL 226 015 B1

C. Zamykanie Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol.

Do zawiesiny liposomów o składzie HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol zawierających 300 mM sól amonową kwasu askorbinowego dodano roztwór chlorowodorku epirubicyny w 150 mM NaCI o stężeniu 6 mg/ml w takiej ilości, aby na 5 części wagowych lipidów przypadała jedna część wagowa leku. Zawiesinę wymieszano i podgrzano przez 60 minut w temperaturze 60°C, pobierając próbki zawiesiny w wybranych odstępach czasu. Po inkubacji oznaczono wydajność zamykania leku, która po 10 minutach wynosiła 98%. Warunki eksperymentu ustalono w taki sposób, aby końcowe stężenie lipidów wynosiło 15 mg/ml. Szczegółowy przebieg procesu zamykania leku przedstawiono na fig. 1

Przykład 2

A. Wpływ stosunku lek lipid na wydajność zamykania Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol dzięki zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej kwasu askorbinowego.

Liposomy przygotowano jak w przykładzie 1A-C, z tą różnicą, że proces zamykania leku prowadzono dla kilku stosunków wagowych lek/lipid - 1:5 (0,2) do 1:1 (1,0). Czas zamykania leku w każdym przypadku ustalono na 10 minut w 60°C. Po każdej inkubacji rozdzielano liposomy od nie zamkniętego leku w celu oznaczenia wydajności zamykania leku. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 2.

Przykład 3

A. Wpływ czasu przechowywania liposomów w 4°C na retencję epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol, w których lek zamknięto gradientem jonowym 300 mM soli amonowej kwasu askorbinowego.

Liposomy otrzymane jak w przykładzie 1 inkubowano 10 min w celu zamknięcia leku a następnie nie zamknięty lek oddzielono od liposomów na mini kolumnie 0,5x7 cm wypełnionej żelem Sephadex G-50 fine. Oddzielone liposomy zebrano, a następnie po oznaczeniu ilości lipidów rozcieńczono buforem PBS pH = 7,4 tak, aby końcowe stężenie lipidów wynosiło 10 mg/ml. Liposomy przechowywano w 4°C. Z uzyskanej porcji liposomów w wybranych odstępach czasowych pobierano 50 pl próbki liposomów, a następnie dokonywano ich rozdziału w celu oznaczenia ilości uwolnionego leku. Otrzymane dane przedstawiono na fig. 3.

Przykład 4

A. Otrzymywanie liposomów zawierających sól amonową kwasu foliowego, pantotenowego oraz metotreksatu.

Liposomy przygotowano jak w przykładzie 1 A-B, z ta różnicą, iż zamiast 300 mM roztworu soli amonowej kwasu askorbinowego, pH = 4,0 zastosowano roztwór 300 mM soli amonowej kwasu foliowego, pH = 7,8 lub 300 mM soli amonowej kwasu pantetonowego pH = 7,8 lub 300 mM soli amonowej metotreksatu.

B. Zamykanie Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol przy zastosowaniu gradientu jonowego soli amonowej kwasu foliowego.

Do zawiesiny liposomów o składzie HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol zawierających 300 mM sól amonową kwasu foliowego dodano roztwór chlorowodorku epirubicyny w 150 mM NaCI o stężeniu 6 mg/ml w takiej ilości, aby na 5 części wagowych lipidów przypadała jedna część wagowa leku. Zawiesinę wymieszano i podgrzano przez 10 minut w temperaturze 60°C. Po inkubacji oznaczono wydajność zamykania leku, która wynosiła 99%. Warunki eksperymentu ustalono w taki sposób, aby końcowe stężenie lipidów wynosiło 15 mg/ml. Szczegółowy przebieg procesu zamykania leku przedstawiono na fig. 4.

C. Zamykanie Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol przy zastosowaniu gradientu jonowego soli amonowej kwasu pantotenowego.

Zamykanie leku w liposomach przeprowadzono jak w przykładzie 4B, z tym wyjątkiem, iż liposomy zawierały zamiast 300 mM sól amonową kwasu foliowego pH = 7,8, 300 mM sól amonową kwasu pantetonowego. Wydajność zamykania leku wynosiła 97%.

D. Zamykanie Epirubicyny w liposomach HSPC/Chol/DSPE-PEG 2000 5,5:4:0,5 mol/mol przy zastosowaniu gradientu jonowego 300 mM soli amonowej metotreksatu pH = 7,8.

Zamykanie leku w liposomach przeprowadzono jak w przykładzie 4B, z tym wyjątkiem, iż liposomy zawierały zamiast 300 mM sól amonową kwasu foliowego pH = 7,8, 300 mM sól amonową m etotreksatu. Wydajność zamykania leku wynosiła 97%.

Uzyskane wyniki zamykania z punktów B-D, dla 300 mM soli kwasu foliowego, pantotenowego oraz metotreksatu przedstawiono na fig. 4.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Liposomowy preparat zawierający substancję przeciwnowotworową, znamienny tym, że zawiera substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych oraz witaminę lub jej pochodną.
2. Liposomowy preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję aktywną zawiera antracykliny.
3. Liposomowy preparat według zastrz. 4, znamienny tym, że witaminą jest kwas askorbinowy lub jego sól, korzystnie askorbinian amonu, kwas foliowy lub jego sól, korzystnie folian amonu lub kwas pantotenowy, korzystnie jego sól amonowa.
4. Liposomowy preparat według jakiegokolwiek zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że pochodną witaminy jest metotreksat.
5. Sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienny tym, że obejmuje:

a) przygotowanie jednowarstwowych liposomów poprzez uwodnienie mieszaniny fosfolipidów, korzystnie uwodornionej lecytyny sojowej lub jajecznej lub distearylofosfatydylocholiny oraz cholesterolu, korzystnie w ilości od 30 mg/ml do 60 mg/ml w 300 mM roztworze witaminy lub jej pochodnej, korzystnie soli amonowej kwasu askorbinowego lub foliowego lub pantotenowego;

b) zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny liposomów w roztworze soli witaminy lub jej pochodnej w ciekłym azocie i ciepłej wodzie, o temperaturze powyżej temperatury przejścia fazowego głównego lipidu, w celu wyrównania stężeń soli witaminy lub jej pochodnej po obu stronach błon liposomów;

c) zmniejszanie wielkości i warstwowości liposomów, korzystnie przeprowadzanie procesu ekstruzji liposomów przez filtry poliwęglanowe o odpowiednich średnicach por w ekstruderze wysokociśnieniowym lub w homogenizatorze wysokociśnieniowym;

d) wymianę zewnętrznego roztworu liposomów, korzystnie poprzez dializę lub sączenie molekularne, na obojętny bufor, korzystnie PBS w celu utworzenia gradientu pH/jonowego;

e) dodanie przeciwnowotworowej substancji aktywnej, korzystnie antarcykliny;

f) podgrzewanie zawiesiny do temperatury wyższej niż wynosi temperatura przejścia fazowego głównego fosfolipidu budującego liposomy, korzystnie do 60°C.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że na etapie a) dodaje się pegylowaną fosfatydyloetanoloaminę w celu stabilizacji liposomów w krwioobiegu.
7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że pochodną witaminy wykorzystywaną w etapie a) jest metotreksat lub jego sól amonowa.
8. Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienna tym, że zawiera liposomowy preparat zawierający substancję przeciwnowotworową zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 3 do 12 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 5 części wagowych składników lipidowych oraz witaminę lub jej pochodną.
9. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera metotreksat lub jego sól oraz związek z grupy antracyklin.