PT706373E

PT706373E - Taxol encapsulado num liposoma e um metodo

Info

Publication number: PT706373E
Application number: PT93908379T
Authority: PT
Inventors: Aquilur Rahman; Rafael Rafaeloff; Syed Rafat Husain
Original assignee: Univ Georgetown
Priority date: 1992-03-23
Filing date: 1993-03-23
Publication date: 2000-11-30
Also published as: DE69329073D1; DE69329073T2; AU3922193A; GR3034024T3; CA2132711A1; ES2148223T3; CA2132711C; US5424073A; EP0706373B1; ATE194767T1; EP0706373A4; US5648090A; DK0706373T3; WO1993018751A1; EP0706373A1

Description

DESCRIÇÃO

"TAXOL ENCAPSULADO NUM LIPOSOMA E UM MÉTODO DE O UTILIZAR" A presente patente diz respeito ao taxol encapsulado num liposoma e a um método de o utilizar.

Conhecimentos prévios 0 taxol que é o 6,12b-bis(acetilóxi)-12-(benzoilóxi)-2a,3,4.4a,5,6,9,10,l 1,12,12a,12b-dodecahidro-4,11 -dihidróxi-4a,8,13,13-tetrametil-5-oxo-7,11 -metano-14-ciclodeca(3,4) benz(1.2-6)oxet-9-il-éster do ácido (2aR-(2aa,4p,4ap,6p,9a (aR*^S*), 11a,12a, 12aa,12ba))-3-(P-(benzoilamino)-a-hidroxibenzenopropanóico, apresenta a fórmula (I):

O taxol foi inicialmente isolado a partir da casca da árvore do teixo do pacífico, Taxus breviofolia Taxaceae e foi demonstrado exibir uma significante actividade anti-neoplástica contra o melanoma B16 implantado intraperitonealmente (i.p.), a leucemia L1210, a leucemia P388 e contra o xenoenxerto de tumor mamário MX-1 humano. Mais recentemente, foi determinado que o taxol exibe a capacidade de encolher tumores em 30 a 40% dos tumores de entre mulheres com tumores no ovário em estado avançado. O taxol representa também uma significativa promessa no tratamento de cancro de peito metastático.

ir $ ''i / / / s 0 Taxol inibe a replicação celular normal in vitro através da promoção da formação de microtubos e estabilização dos polímeros de tubulina contra a despolimerização. O taxol funciona como um veneno do eixo mitótico e é um inibidor potente da replicação de células in vitro. O taxol aumenta notavelmente todos os aspectos da polimerização, iniciação e alongamento da tubulina, os quais são tomados mais rápidos.

Como foi observado em experiências clínicas, o taxol apresenta uma actividade suficiente contra os cancros de linfoma, do ovário e de peito.

Devido à sua limitada solubilidade em água, o taxol é preparado e administrado num suporte que contém cromofóro EL, um óleo de rícino polioxietilado e etanol numa razão de 50:50 (vol./vol.). Esta solução é ainda diluída de 1:10 com soro fisiológico antes de ser administrado em seres humanos. Em experiências clínicas, foram observados repetidos problemas de reacções anafilactóides, dispneia, hipertensão e passagem de líquidos. A toxicidade cardíaca do taxol é um dos limites do tratamento e por sua causa, o paciente tem que ser hospitalizado para ser possível uma infusão contínua do medicamento.

Adicionalmente, a estabilidade do taxol uma vez diluído em soro fisiológico é bastante baixa. O medicamento degrada-se dentro de 24 horas e, deste modo, toma-se difícil controlar a administração da dosagem aos pacientes. Adicionalmente, o medicamento precipita da solução diluída e consequentemente tem que ser utilizado um filtro em linha para a infusão do medicamento aos pacientes.

As tentativas para impedir a cardiotoxicidade do taxol e a reacção anafilactóide têm incidido em tratamentos prévios dos pacientes com anti-histamínicos e corticosteróides, e também no prolongamento do tempo de infusão de seis para vinte quatro horas. Mesmo com estas modificações, os pacientes sofrem com severas toxicidades que frequentemente são fatais.

Até agora o taxol tem sido convencionalmente obtido a partir das árvores de teixo do Pacífico nas florestas do Noroeste do Pacífico, implicando o sacrifício de cerca de seis

árvores para obter uma quantidade suficiente de medicamento para tratar um paciente. Embora tenha sido recentemente anunciado que o taxol pudesse ser produzido sinteticamente, ver The Wall Street Journal, 18 de março de 1992, o rendimento é necessariamente pequeno devido ao grande número de passos envolvidos na síntese.

Deste modo, mesmo que até pudessem ser inventadas sínteses melhoradas do taxol, um grande número de desvantagens inerentes ao taxol permaneceriam. A patente EUA N.° 4.534.899 descreve um composto de fosfolípidos que inclui um material que forma Iípidos o taxol. No entanto, os problemas associados à utilização do taxol não são completamente superados através do fornecimento do taxol dentro de uma cápsula liposomática tal como é descrito na Patente EUA N.° 4.534.899.

Assim, existe uma necessidade de um método através do qual as anteriores desvantagens possam ser evitadas ou o seu impacto minimizado.

Descrição da Patente

Adequadamente, é um dos objectivos da presente patente disponibilizar o taxol dentro de uma cápsula liposomática que minimize as anteriores desvantagens.

Também é um objectivo da presente patente descrever um método para o tratamento do cancro em mamíferos.

Adicionalmente, é um objectivo particular da presente patente fornecer um método para tratar cancro de linfoma, do peito, do ovário, do pulmão e do cólon, em mamíferos.

Adequadamente, os anteriores objectivos e outros são atingidos através da utilização do taxol, e dos seus derivados antineoplásticos, dentro de uma cápsula liposomática.

Breve descrição dos Desenhos

Figura 1 representa a estabilidade do taxol liposomático a diferentes temperaturas. ί ΐ S / f

Figura 2 representa gradação de toxicidades do taxol livre e do liposomático em ratos normais.

Figura 3 representa a citotoxicidade do taxol em células-mãe HL. 60 de leucemia.

Figura 4 representa o consumo do taxol pelas células-mãe HL 60.

Figura 5 representa a citotoxicidade do taxol em células HL 60/VCR.

Figura 6 representa o consumo do taxol pelas células HL 60/VCR.

Melhor Procedimento para executar a Patente A presente patente diz genericamente respeito ao taxol dentro de uma cápsula de liposoma bem como a métodos de utilizar o referido. Geralmente, qualquer método de utilização do taxol com um objectivo terapêutico convencional pode ser executado de acordo com a presente patente apresentando resultados surpreendentemente melhorados.

Parcialmente, a presente patente fornece um sistema de libertação do taxol no interior de um mamífero anfitrião o qual é caracterizado por 1) evitar os problemas de solubilidade do taxol, 2) melhorar a estabilidade do taxol, 3) evitar as reacções anafilactóides e de cardiotoxicidade, 4) capacidade para administrar o taxol na forma de um bolus ou de uma curta infusão em lugar de uma longa infusão (24 horas) do taxol livre, 5) uma eficácia terapêutica melhorada do taxol, e 6) modulação da resistência a drogas múltiplas nas células de cancro.

Tal como é aqui utilizado, o termo "liposoma" diz respeito a uma estrutura fechada composta de bicamadas de lípidos que cercam um espaço aquoso interno.

Adicionalmente, tal como é aqui utilizado, a frase "taxol ou um seu derivado antineoplástico” diz respeito ao taxol ou a qualquer derivado do taxol o qual seja ou possa ser utilizado na quimioterapia de cancro devido às suas propriedades anti-neoplásticas. É particularmente notável que embora seja aceite que o taxol funcione como um composto antineoplástico através da promoção da formação de microtubos e da estabilização de polímeros da tubulina contra a despolimerização, os derivados da presente patente não estão limitados aos compostos que funcionem através de nenhum mecanismo em particular.

Como exemplo, além do taxol, também os seus derivados tais como o taxasmo ou outros mencionados na síntese e actividade anti-cancerígena de derivados do taxol D.G.I. Kingston et al, Estudos em Química Orgânica, volume 26. intitulado "Novas tendências na Química dos Produtos Naturais" 1986, Atta-ur-Rahman, P.W. le Quesue, Editores (Elvesier, Amsterdão 1986), págs. 219-235 são explicitamente englobados dentro da presente patente.

Normalmente, de acordo com a presente patente, o taxol ou um seu derivado é dissolvido num dissolvente adequado. Como dissolvente, pode ser utilizado qualquer dissolvente não-polar ou ligeiramente polar, tal como o etanol, o metanol, o clorofórmio ou a acetona. Em seguida, é dissolvida a cardiolipina num dissolvente adequado tal como foi descrito para taxol e as duas soluções são misturadas.

Após o referido procedimento, a substância que forma os lípidos é dissolvida num dissolvente adequado o qual é geralmente um dissolvente de baixa polaridade tal como clorofórmio ou um dissolvente não-polar, tal como o n-hexano. A mistura de dissolventes, entre o acima referido e a solução que contém o material que forma os lípidos, é realizada e os dissolventes são removidos originando um filme fino e seco constituído por lípidos e medicamento.

Os liposomas são então formados através da adição à mistura referida de soro fisiológico. Após o que podem ser formados liposomas multi-lamelares através da mistura dos liposomas, por exemplo, através criação de vórtices.

Normalmente, os liposomas podem ser liposomas neutros, negativos ou positivos. Os liposomas positivos, por exemplo, podem ser formados a partir de uma solução que contenha fosfatidil-colina, colesterol e estarilamina. Os liposomas negativo podem, por exemplo, ser formados a partir de soluções que contenham fosfatidil-colina, colesterol e fosfatidil-serina.

Adicionalmente, ao misturar o soro fisiológico com ó filme, fino e seco, de lípido e medicamento, pode ser utilizado qualquer tipo de dispersão contanto que homogenize 6

fortemente a mistura. Tal homogenização pode ser efectuada através da utilização de um vórtice, um agitador magnético ou ultra-sons. A cardiolipina de acordo com a presente patente pode ser obtida ou uma fonte natural ou de uma fonte sintética tal como é conhecido de quem tenha conhecimentos neste campo.

Resumo da Patente

De acordo com a presente patente é disponibilizado um liposoma que inclui um material que forma liposomas, cardiolipina e taxol.

Preferivelmente, o referido material que forma liposomas é pelo menos um dos lípidos seleccionados de entre o grupo constituído pela fosfatidil-colina, colesterol e fosfatidil-serina. A cardiolipina é preferivelmente seleccionada de entre o grupo constituído pela cardiolipina natural e pela cardiolipina sintética. O liposoma pode apresentar uma carga negativa, uma carga positiva ou pode ser neutro. Adicionalmente, o liposoma pode incluir vesículas unilamelares ou multilamelares. A presente patente também disponibiliza uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais liposomas tais como foram acima descritos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

De acordo com a presente patente, também é disponibilizada a utilização da acima descrita composição farmacêutica para a produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada de entre o grupo constituído pelos cancros de linfoma, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do ovário e cancro de peito num mamífero.

A presente patente disponibiliza adicionalmente a utilização acima descrita, em que é induzida hipotermia localizada nos tecidos cancerosos do mamífero, simultaneamente com ou subsèquentemente à administração do medicamento.

De acordo com uma configuração adicional da presente patente, é disponibilizada adicionalmente a utilização acima descrita nos casos em que o mamífero é um humano.

Tendo descrito a presente patente será feita agora referência a determinados exemplos que são fornecidos somente para propósitos de ilustração e os quais não são supostos constituírem limitações.

Exemplo 1

Foram adicionadas 2.81 μΜ de cardiolipina em etanol a 2.93 μΜ de taxol dissolvidas em clorofórmio. A esta mistura, foram adicionadas 14.16 μΜ de fosfatidil-colina dissolvida em hexano e 9.83 μΜ de colesterol em clorofórmio. A mistura foi suavemente agitada e em seguida os dissolventes foram evaporados sob vácuo a menos de 30°C. Foi formado um filme seco fino de lípido e medicamento. Após terem sido adicionados 2,5 ml de soro fisiológico, os liposomas foram formados. Os frascos foram colocados no vórtice durante 1/2 hora de modo a formar liposomas multilamelares. Estes liposomas foram então sonicamente tratados durante 1/2 hora num aparelho sónico de corneta com um sistema de aquecimento de copo o qual origina pequenos liposomas unilamelares. Os liposomas foram então dializados contra 1 litro de soro fisiológico durante 24 horas. Depois da conclusão da diálise, foi dissolvida uma alíquota de liposomas em metanol e foi analisada através de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). A eficiência de encapsulação do taxol lipossomático apresentou-se maior do que 95% da dose de contribuição inicial. A concentração do taxol nestes liposomas foi de 0.95 mg/ml.

Exemplo 2

Nesta experiência foram utilizadas as mesmas condições experimentais e apenas as quantidades de medicamento e lípidos foram variadas. Para esta experiência foram utilizadas as seguintes concentrações: Taxol 5,86 μΜ, cardiolipina 5,62 μΜ, fosfatidil- colina 28,18 μΜ e colestrol 19.38 μΜ. Os dissolventes foram então evaporados sob vácuo e as camadas secas de lípidos e medicamento foram dispersas com 5 ml de um soro fisiológico com 7% trealose, hidratadas, passadas em vórtice e tratadas com som. Os liposomas foram então dializados durante 24 horas e a percentagem de encapsulação do taxol nos liposomas foi superior a 94% tal como foi determinado por HPLC.

Estudos de estabilidade

Os liposomas do taxol foram preparados como sempre utilizando a cardiolipina, a fosfatidil-colina e o colesterol. Foi colocada uma alíquota destes liposomas à temperatura ambiente e outra à temperatura de refrigeração (4°C). Tal como é apresentado na Figura 1, os liposomas de taxol à temperatura ambiente eram estáveis durante quatro dias. Pelo contrário, o taxol livre numa concentração de 0,6 mg/ml em soro fisiológico degrada-se no prazo de 3 horas. O taxol liposomático à temperatura de refrigeração foi estável durante 1 mês.

Num outro conjunto de experiências, os liposomas do taxol foram preparados do modo habitual mas em vez de utilizar soro fisiológico, foi utilizado trealose (um açúcar de diglucose) a 7% em soro fisiológico para suspender de novo os liposomas. Foram colocadas alíquotas destes liposomas a -20°C e a -80°C. A -20°C, os liposomas do taxol também foram estáveis durante 1 mês tal como foi determinado por HPLC. A experiência foi terminada nesta altura. Os liposomas com 7% de trehalose foram congelados a -80°C durante 5 meses. Intermitentemente, os liposomas foram descongelados e foram congelados novamente. Este processo foi repetido várias vezes. No término dos 5 meses, os liposomas foram dializados contra uma solução de trehalose a 7% e o conteúdo do taxol lipossomático dializados foi mensurado através de HPLC, e foi encontrado ser 93% da concentração inicial do taxol nesses liposomas. Esta experiência demonstra que os liposomas do taxol com trehalose como excipiente pode constituir meios efectivos para armazenar os liposomas congelados e pode ser eficazmente ser utilizado para aplicações clínicas e terapêuticas depois de descongelar os liposomas.

Avaliação da toxicidade dos liposomas do taxol

Neste estudo foram utilizados ratos CD2F1 machos com um peso entre 22-25 g. O Taxol livre, o qual é preparado com cromofóro EL, foi diluído com soro fisiológico para obter uma concentração de 1.25 mg/mol. Os liposomas do taxol foram preparados utilizando cardiolipina, fosfatidil-colina e colesterol. A concentração final do taxol lipossomático era de 1.25 mg/ml. Dez ratos em cada um dos grupo foram injectados com taxol livre ou com taxol encapsulado em liposomas numa dose de 25 mg/kg i.v. Esta é a dose mais alta de taxol livre que poderia ser injectada nos ratos por causa das limitações de solubilidade e do seu conteúdo alcoólico. Foram repetidas as mesmas doses nos ratos nos 5o e 9o dia. Não pode ser dada nenhuma injecção adicional aos ratos que receberam taxol livre devido à esclerose da veia. Tal como é apresentado na Figura 2, no 12° dia, três ratos do grupo do taxol livre morreram devido à toxicidade enquanto que não foi encontrada qualquer toxicidade ou mortalidade nos ratos que foram injetados com taxol encapsulado em liposomas.

Avaliação terapêutica do taxol Livre e do Taxol Encapsulado em Liposomas em Ratos apresentando Leucemia L1210

Foi propagado cancro leucémico de murino L1210 em ratos DBA/2 fêmeas. Com propósitos terapêuticos, foram feitos implantes i.p. a ratos CD2F1 com lxlO5 células de leucemia L1210 e vinte e quatro horas depois da implantação do tumor, os ratos foram injectados ou com taxol livre ou com taxol encapsulado em liposomas. Todos os ratos receberam uma dose de 6 mg/kg i.p. nos Io e 5o dias. Os ratos de controle apresentando o tumor foram injectados com soro fisiológico normal com um volume igual ao utilizados nos ratos da experiência. Todas as injeções foram feitas na base de 2% do peso corporal. Os ratos foram pesados nos dias em que foi dada a injecção, as doses de medicamento foram calculadas com base no peso corporal e o tempo de sobrevivência foi registado em dias. A tabela 1 mostra a eficácia do taxol livre e do taxol encapsulado em liposomas na taxa de sobrevivência de ratos que apresentavam um tumor L1210. Os ratos quando injectados com taxol livre numa dose de 6 mg/kg i.p. nos Γ a 5o dias exibiram uma T/C de 1.35% (medicados vs controle). A mesma dose do taxol quando injectada na forma Ρ,

de medicamento encapsulado em liposomas originou uma razão de T/C de 178% o que demonstra que a sobrevivência dos ratos que apresentam tumores é substancialmente aumentada quando é utilizada esta modalidade de tratamento. Estes estudos não só demonstram que a toxicidade do taxol é reduzida quando este se encontra encapsulado em liposomas mas que esta utilização de cápsula também aumenta a razão terapêutica em ratos que apresentem tumores.

Avaliação da Citotoxicidade do Taxol Livre e do Taxol Encapsulado em Liposomas em Células de Leucemia Humanas HL-60

Foram feitas crescer células de leucemia promielocíticas HL-60 num tecido de cultura num substrato de RPMI-1640 completado com 10% de soro fetal de bovino. Todas as culturas foram mantidas em frascos plásticos de cultura de tecidos e mantidas numa incubadora a 37°C com ar humedecido contendo 5% de CO2.

Foi utilizado 0 método de inibição do crescimento para determinar a citotoxicidade do taxol livre e do taxol encapsulado em liposomas. Para estas experiências, foram colocadas lxlO3 células em fase de crescimento exponencial em frascos de 25 cm3. Estes foram então expostos a concentrações variáveis do taxol livre e do taxol lipossomático durante 72 horas a 37°C. As células foram contadas num hemocitômetro e a sua viabilidade foi determinada através da exclusão com azul de tripano. A sobrevivência celular foi comparada à das células de controle e foram determinados os valores IC50 (concentração inibidora para 50% das células) para cada um dos medicamentos. Tal como é apresentado na Figura 3, os valores de IC50 para o taxol livre eram de 0.0025 eg/ml e foram obtidos os mesmos valores de IC50 para o taxol encapsulado em liposomas. Estas experiências demonstram que o taxol livre e o taxol em liposomas são equivalentes no que respeita à sua eficácia para produzir citotoxicidade para com as células de leucemia HL-60.

Acumulação Intracelular de Taxol Livre e de Taxol Encapsulado em Liposomas O conteúdo celular do taxol foi determinado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). rç.esumidamente, foram incubadas células com um crescimento exponencial em caixinhas de petri de 100 mm com um substrato que continha 0 medicamento a

37°C. As células foram tratadas durante 1 a 4 horas com ou taxol livre ou taxol lipossomático com uma concentração de medicamento de 10 pg/ml, e foram então centrifugadas e enxaguadas duas vezes com PBS. Os agregados de células foram suspensos em 0.5 ml de solução de SDS a 2% e depois levados ao ultra-sons durante 5 minutos num ultra-sons “cup-horn”. Os tecidos celulares homogenizados foram extraídos com 2 ml de metanol. Uma alíquota desta solução foi injectada em HPLC para determinação quantitativa do taxol. Tal como é apresentado na Figura 4, a concentração celular de medicamento quando exposto com o taxol livre alcançou o seu nível máximo depois de 1 hora, sendo o valor de 5.18 pg/10'' células. A mesma concentração de taxol foi observada depois de 2 e 4 horas de exposição ao medicamento. No entanto, com o taxol lipossomático, a concentração celular em seco estava constantemente mais baixa do que a observada com o taxol livre. A 1 hora de exposição, a concentração celular do n taxol era de 2.5 pg/10 células e este valor era mais ou menos semelhante ao de 2 e 4 horas de exposição com taxol liposomas. Esta experiência demonstra que até mesmo se o conteúdo de medicamento encapsulado em liposomas nas células HL-60 for menor, a citotoxicidade é semelhante com qualquer uma das modalidades de tratamento.

Modulação da Resistência a Drogas múltiplas em Células de cancro através do Taxol Li20somal A resistência das células de tumor à quimioterapia é um das razões principais dos fracassos no tratamento dos pacientes de cancro. Durante os últimos dez anos, uma das ênfases principais foi atribuída à definição dos mecanismos de resistência dos tumores à quimioterapia. Esta resistência dos tumores foi demonstrada ser o resultado da expressão ampliada da resistência genética a drogas múltiplas nas células de cancro. O produto deste gene de resistência a drogas múltiplas, a p-glicoproteína de 170,000 daltons, funciona como uma bomba de efluxo e confere resistência à acção citotóxica dos medicamentos quimio-terapêuticos para o cancro, estruturalmente não relacionados, através da produção de níveis intracelulares mais baixos dos medicamentos.

As nossas experiências demonstram que o taxol encapsulado em liposomas apresenta uma capacidade significativa para superar a resistência a drogas múltiplas. Estas experiências foram realizadas em células HL 60/VCR que são células de leucemia

humana promielocíticas e que derivam de células-mãe HL-60 e que são tornadas resistentes à vincristina o que demonstra o fenótipo de resistência a múltiplas drogas. As células HL-60 VCR foram cultivadas num substrato a 37°C com 5% de CO.

Um número exactamente conhecido de células foi colocado em frascos de tecidos de cultura e estas foram tratadas com concentrações variáveis do taxol livre, do taxol encapsulado em liposomas e de liposomas em branco que representam a mesma concentração de lípidos das utilizadas para o taxol. Depois de 72 horas de incubação, as células em cada um dos frascos foram contadas através de um hemocitômetro e a sua viabilidade foi determinada através da exclusão de azul de tripano. Foi determinada a percentagem de células tratadas relativamente às do controle sem tratamento. A actividade citotóxica foi expressa como IC50 o que foi definido como a concentração de medicamento que resulta em 50% de sobrevivência das células quando comparadas ao controle.

As curvas de sobrevivência das células de HL-60/VCR após a exposição ao taxol livre e ao taxol encapsulado em liposomas são apresentadas na Figura 5. O IC50 para o taxol livre nas HL-60/VCR é de 2.43 pg/ml o que demonstra que esta linhagem celular é 1280 vezes mais resistente do que a linhagem de células-mãe HL-60. Porém, o IC50 para 0 taxol lipossomático é de apenas 0.37 μg/ml. Isto demonstra que o taxol lipossomático sensibiliza 7 vezes mais as HL-60/VCR quando comparado ao taxol livre. Consequentemente, é possível afirmar que o taxol encapsulado em liposomas modula a resistência aos medicamentos no fenótipo de resistência a drogas múltiplas 0 que potencialmente seria uma grande vantagem numa situação clínica onde uma grande população de pacientes não responde à quimioterapia por causa da resistência a drogas múltiplas.

Acumulação Intracelular de Taxol em Células com Resistência a Drogas Múltiplas O conteúdo celular do taxol foi determinado através de Cromatografia Líquida de Alta Pressão. Resumidamente, as células de HL-60/VCR em fase de crescimento exponencial com resistência a drogas múltiplas foram incubadas em caixas de petri de 100 mm com um substrado contendo o medicamento a 37°C e contendo também, ou

taxol livre ou taxol encapsulado em liposomas. As células foram tratadas durante 1 a 4 horas com qualquer um dos medicamentos e foram depois centrifugadas e enxaguadas duas vezes com PBS. As células foram suspensas em PBS frio, contadas e novamente centrifugadas. Os agregados de células foram suspensos em 0.5 ml de solução de SDS a 2% e depois tratados com ultra-sons durante 5 minutos num ultra-sons de “cup-hom” (Sistemas de Calor, Farmingdate, N.Y.). O tecido celular homogenizado resultante foi extraído com 4 ml de metanol, levado a vórtice durante 1 minuto e centrifugado durante 20 minutos a 3000 rpm. As amostras foram analisadas utilizando HPLC. A concentração de medicamento em cada 10 células foi calculada utilizando uma curva de calibração padrão de células induzidas com medicamento e foram depois tratadas de um modo similar ao anteriormente feito. A Figure 6 ilustra a acumulação do taxol em células HL60/VCR de fenótipo resistente após o tratamento com 10 pg/ml de medicamento livre e de taxol encapsulado em liposomas durante um período de 1 a 4 horas. As células HL-60/VCR resistentes apresentaram um conteúdo máximo de taxol encapsulado em liposomas e com o decorrer do tempo de exposição a acumulação intracelular de medicamento aumentou correspondentemente. Após 4 horas, a acumulação de medicamento era de 10.54 pg/lO7 células com taxol lipossomático enquanto que com o taxol livre era apenas de 3.04 pg/lO7 células o que demonstra uma diminuição três vezes menor da absorção celular. A mesma relação foi observada com um menor tempo de exposição celular onde era evidente uma diferença de concentração de medicamento de duas vezes entre o taxol livre e o taxol lipossomático. Estes dados sugerem que modulação da resistência aos medicamentos em células HL-60/VCR pode ser parcialmente explicada através da absorção celular melhorada de medicamento no caso do taxol encapsulado em liposomas. A absorção celular melhorada e a modulação eficaz da resistência a drogas múltiplas em células HL-60/VCR provocadas pelo taxol encapsulado em liposomas demonstra que esta modalidade de tratamento pode ser de grande valor clínico para pacientes nos quais previamente fracassou a quimioterapia de cancro. De um modo gerai, esta modalidade de tratamento é mais eficaz do que o taxol livre e pode ser aplicada com sucesso em pacientes de cancro.

De acordo com a presente patente, esta pode ser utilizada para tratar qualquer mamífero, tal como uma vaca, cavalo, porco, cão ou gato. No entanto, é particularmente preferível se o mamífero a ser tratado for humano.

Tal como foi acima referido, a tabela 1 é apresentada de seguida.

TABELA

Avaliação terapêutica do taxol Livre e do Encapsulado em Liposomas

Taxol Contra Leucemia L1210 Dose % TJC 6mg/kg Taxol livre 135 6mg/kg Taxol encapsulado em liposomas 178

De um modo geral o taxol, por exemplo, pode ser obtido, por processos de isolamento, na forma de um produto natural a partir da casca da árvore do teixo do Pacífico. Ver M.C. Wani et al, J. Amer. Chem. Soe., Vol. 93, (1971). No entanto, o taxol ou um seu derivado antineoplástico podem ser sintetizados num laboratório. Ver J. -N. Denis et al, J. Amer. Chem. Soe., Vol. 110, Págs 5917-5919 (1988).

Adicionalmente, tanto o taxol como os seus derivados de acordo com a presente patente podem ser utilizados para tratar qualquer forma de cancro num mamífero, em particular aqueles compostos que funcionam promovendo a formação de microtubos e os quais impeçam o processo de separação da tubulina. Porém, os presentes compostos são particularmente adequados no tratamento de cancros de linfoma, ovário, peito, pulmão e no cólon, de mamíferos: particularmente nos dos humanos.

De acordo com a presente patente, o taxol encapsulado em liposomas ou um seu derivado antineoplástico são normalmente administrados intravenosamente ou intraperitonealmente ao mamífero. Adicionalmente, o composto ou compostos presentes são normalmente administrados numa quantidade de cerca de 50 a 250 mg mg de composto activo/m2 de área de superfície do mamífero anfitrião.

Por exemplo, para um humano de cerca de 70 kg peso corporal é administrada uma quantidade de cerca de 0,5 a 5,0 mg de composto activo por kg de peso corporal. De preferência, é administrado cerca de 1.0-3.0 mg de composto activo por kg de peso corporal.

Deste modo, a presente patente também descreve métodos de tratamento de vários cancros de mamíferos, em particular de cancros em humanos.

Além do referido, a presente patente também descreve um método de modular a resistência a drogas múltiplas em células de cancro que vão ser submetidas a quimioterapia. De acordo com este aspecto da presente patente, foi descoberto que utilizando as composições de liposomas da presente patente, é possível reduzir a tendência das células de cancro que vão ser submetidas a quimioterapia para desenvolver resistência aos agentes utilizados na quimioterapia.

Em particular, as composições de liposomas presentes não só reduzem a tendência das células de cancro submetidas a quimioterapia, com taxol ou com os seus derivados, para desenvolver resistência aos referidos, mas as composições presentes também reduzem a tendência das células de cancro para desenvolver resistência a outros agentes utilizados para quimioterapia, tais como, por exemplo, os glicosídeos de antraciclina.

Adicionalmente, de acordo com a presente patente, foi descoberto que as composições de liposoma presentes podem ser administradas intravenosamente ou intraperitonealmente a uma parcela isolada de um corpo de um mamífero, em particular de um corpo humano, tal como um braço ou uma pema ou, no caso de um humano, uma mão. Então, essa parcela do corpo do mamífero pode ser sujeita a um tratamento de hipertermia. Os tratamentos de Hipertermia são bem conhecidos para quem tenha experiência neste campo. Muito surpreendentemente, foi descoberto que ao efectuar o tratamento de hipertermia, o liposoma administrado se fundia dando origem a uma dosagem extremamente localizada de taxol ou dos seus derivados. Claro que a dosagem administrada irá depender do peso corporal do mamífero que se deseja tratar e da opinião do médico que prescreveu o tratamento. De acordo com este aspecto da 16 presente patente, o tratamento de hipertermia pode ser administrado antes, ao mesmo tempo ou depois do ingrediente ou ingredientes activos terem sido administrados, e os liposomas podem ser ou administrados localmente ou através de todo o corpo.

Após ter sido descrita a presente patente deverá ser óbvio para alguém com experiência neste campo que podem ser feitas muitas modificações e alterações nas configurações acima descritas sem que por isso se saia do espirito e campo de aplicação da presente patente.

Lisboa,2 \ AGO. 2000

Dra. Maria Silvina Fcrrcira

Agente Gíir:;·1 R. Castilho, 2 li ·.'. Telefs. 213 íl-I

13 254 6i3

Claims

17 Ρ REIVINDICAÇÕES 1. Um liposoma compreendendo um material que forme liposomas, cardiolipina e taxol.

2. O liposoma da reivindicação 1, em que o referido material que forma liposomas é pelo menos um dos lípidos seleccionado de entre o grupo constituído pela fosfatidil-colina, colesterol e fosfatidil-serina.

3. O liposoma da reivindicação 1, em que a referida cardiolipina é seleccionada de entre o grupo constituído pela cardiolipina natural e pela cardiolipina sintética.

4. O liposoma da reivindicação 1, em que o referido liposoma apresenta uma carga negativa, uma carga positiva ou é neutro.

5. O liposoma da reivindicação 1, em que o referido liposoma inclui vesículas unilamelares ou multilamelares.

6. Uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais liposomas de acordo com as reivindicações de 1 a 5 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

7. Utilização da composição farmacêutica da reivindicação 6, na produção de um medicamento para tratar uma doença seleccionada de entre o grupo constituído por linfoma, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do ovário e cancro de peito num mamífero.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que é induzida hipertermia localizada nos tecidos cancerosos do referido mamífero simultaneamente com ou subsequente à administração do referido medicamento.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o referido mamífero é um humano. Lisboa, 2 1 AGO. 2000