JP5388395B2 - 脂質に被包された治療剤の製造方法 - Google Patents
脂質に被包された治療剤の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5388395B2 JP5388395B2 JP2001510431A JP2001510431A JP5388395B2 JP 5388395 B2 JP5388395 B2 JP 5388395B2 JP 2001510431 A JP2001510431 A JP 2001510431A JP 2001510431 A JP2001510431 A JP 2001510431A JP 5388395 B2 JP5388395 B2 JP 5388395B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipid
- therapeutic agent
- ethanol
- liposomes
- vesicles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
- A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Description
本発明は、脂質で被包された(lipid-encapsulated)治療剤の粒子(とりわけ、アンチセンス療法又は遺伝子治療に有用である、脂質で被包された治療用核酸粒子)の新規な製造方法に関する。
治療剤用キャリヤとして脂質粒子を使用する概念は、多数の人々によって検討されてきた。製剤は、脂質の外側に対する治療剤の錯形成反応(complexation; 錯化)、或いは治療剤の実際的閉じ込め(entrapment)に依存してきた。とはいえ、いずれのタイプの製剤を造る能力も、脂質粒子を造るために採用される方法だけでなく、脂質及び治療剤の特性の適合性(matching)に左右される。治療剤が閉じ込められた粒子の場合、閉じ込め方法は、受動的である(即ち、諸脂質粒子は治療剤の存在下で組み立てられ、治療剤の幾らかは偶然に閉じ込められる)か;又は能動的である(即ち、誘導されたある種の勾配の結果として、脂質粒子の内側の中に、治療剤が引張られるか又は推し進められる)ことがある。脂質粒子をキャリヤとして利用する努力が多く成されているにもかかわらず、脂質で閉じ込められた治療剤を実際に適用することを制限する諸問題が残されている。これら問題には、薬物/脂質の基部上への治療剤の取り込みレベルが低いこと;治療剤を捕獲する効率が低いこと;及び脂質被包された治療剤の粒子を大規模に製造するための適切な手段が欠如していること;が含まれる。
本発明によって、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を大規模に調製する方法であって、脂質及び治療剤が逆に帯電している該調製方法が初めて提供される。これらの粒子は、治療用組成物として、また、試験等のために有用である。
本発明による、帯電した治療剤が脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞、帯電した治療剤及び不安定化剤(destabilizing agent)から成る脂質組成物を結合させて、予め形成された小胞と治療剤の混合物を不安定化溶媒中で形成することによって調製する。不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく、該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。得られた混合物は、予め形成された脂質小胞の内部に、治療剤をカプセル封じ(encapsulation)させるのに十分な時間の間、定温放置(incubate)する。次いで、不安定化剤を除去して、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を得る。予め形成された脂質小胞は、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する。修飾脂質は、予め形成された小胞の凝集を遅らせるが妨げないのに有効な量で、予め形成された小胞中に存在する。本発明の好ましい態様において、脂質粒子を大規模(例えば、20〜200リットル)で効率的に形成するのに有効な、核酸(例えば、アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド)を含有する治療剤溶液は、エタノールの25〜40%水溶液に入れた予め形成された脂質小胞と結合させる。脂質で十分に被包された治療剤の粒子が自然発生的に製造される結果となるには、この混合物を約1時間の間、定温放置すれば十分である。
(定義)
本出願書類で使用する用語は、当業者に理解される通常の意味に解釈されるように意図されているが、幾つかの用語については、いかなる不明確さをも避けるために明確に定義する。従って、本出願の明細書(及び特許請求の範囲)において使用する用語:
「帯電脂質(charged lipid)」は、カチオン電荷若しくは負電荷を有する脂質種、又は、正味中和していない、両性イオンである脂質種のことを言い、概して、その脂質が見出される溶液のpHを参照する必要がある。
「崩壊(disruption)」は、初期の脂質膜の基本形態が喪失する程度に、脂質膜の性質が変成することを言う。脂質膜の崩壊は、例えば、60%を越えるエタノール濃度で観察される。
「脂質(lipid)」は、脂肪酸のエステルであって水には溶けないが多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする諸有機化合物の群を言う。それらは通常、少なくとも3つの種類:(1)ワックスの他に油脂を包含する「単純脂質」;(2)リン脂質及び糖脂質を包含する「複合脂質」;並びに、(3)ステロイド等の「誘導脂質」;に分けられる。多種多様の脂質が本発明に使用することができ、それらの幾つかを下記に説明する。
生理的pHでカチオンに帯電した脂質は、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC); N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA); N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB); N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP); 3β−(N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(DC−Chol); N−(1,2−ジミリスチルオキシプロップ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide);を包含するが、それらに限定されない。更に、本発明で使用することができる多数のカチオン性脂質製剤が、市販されている。これら製剤には、例えば、リポフェクチン(Lipofectin)(登録商標)[米国ニューヨーク州、グランドアイランド、GIBCO/BRLからの、DOTMAと、1,2−ジオレオイル−sn−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)とを含有する、市販のカチオンリポソーム];リポフェクタミン(Lipofectamine)(登録商標)[GIBCO/BRLからの、N−(1−(2,3−ジオレイロキシ)プロピル)−N−(2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)と、DOPEとを含有する、市販のカチオンリポソーム];及び、トランスフェクタム(Transfectam) (登録商標)[米国ウィスコンシン州、プロメガ社(Promega Corp.)からの、エタノールに入ったジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(DOGS)を含有する、市販のカチオン性脂質];が包含される。
用語「中性脂質(neutral lipid)」は、生理的pHにおいて非荷電形態又は両性イオン形態で存在する多くの脂質種のあらゆる物を言う。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブドシド及びジアシルグリセロールが包含される。
本発明で使用される好ましい製剤の中には、PEG−脂質、ポリアミドオリゴマー−脂質(例えば、ATTA−脂質)等の凝集防止性脂質、及び立体障壁又は「ステルス(stealth)」−脂質を含有するものが幾つかある。そのような諸脂質は、シアーズ(Sears)の米国特許第4,320,121号明細書;チョウイ(Choi)等の米国特許第5,820,873号明細書;ホランド(Holland)等の米国特許第5,885,613号明細書;WO98/51278[発明者 センプル(Semple)等];及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願シリアルNo.09/218988号明細書;に記述されている。これらは全て、言及することによって、本願明細書に組み入れる。これらの脂質は、逆に帯電した脂質と治療剤とを含有する製剤が沈降したり、凝集するのを防止する。これらの脂質はまた、生体内における循環寿命(circulation lifetime)を改善するのに使用することができる[クリバノフ(Klibanov)等:FEBS Letters,268(1),235〜237(1990)を参照]か、又は、それら脂質は、生体内で製剤から外れて迅速に交換されるように選定することができる(米国特許第5,885,613号明細書を参照)。とりわけ有用な交換性脂質は、一層短いアクリル鎖を有するPEG−セラミド(即ち、C14若しくはC18、本明細書ではPEG−CerC14及びPEG−CerC18と称する)、又はC14アクリル鎖を有するPEG−PEである。
本発明により造られる脂質粒子の研究において、中空の大きい単層膜小胞(LUV)は、閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞に転化されるということが、意外なことに発見された。いかなる特定の機構に縛られる意図はないが、生じているプロセスは、図1に示されるようなものであって、カチオンに帯電した脂質と、アニオン性治療剤とが想定される。そのプロセスは、単層小胞10で出発する。単層小胞10は、カチオン性脂質を含有する結果として、二重層壁の内側表面及び外側表面に正の表面電荷を有する。アンチセンス・オリゴヌクレオチド11等のアニオン性治療剤を添加することによって、中間複合体12が形成されることとなる。中間複合体12において、治療剤の分子11は、イオン機構/静電気機構によって、LUVの表面上で、逆に帯電した脂質に結合されている。
(1)予め形成された脂質小胞中に、治療剤の電荷と逆の電荷を有する帯電脂質が含有されていること;
(2)凝集を遅らせるには十分な量であるが、凝集を妨げるには十分でない量で、修飾脂質が含有されていること。PEG−CerC14の場合、その量は、約2.5〜10%であることが分かった;
(3)不安定溶媒中に、(例えば、エタノール、洗剤等の)不安定剤が、予め形成された脂質小胞を不安定にするがそれら予め形成された脂質小胞を崩壊しない量で含有されていること;及び
(4)凝集工程及び閉じ込め工程が減結合しない(decoupled)温度で、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の集合体を予め形成すること。通常、これは、室温(〜20OC)以上の温度範囲で操作する必要があり、この温度範囲は不安定剤の濃度及び脂質の組成に左右される;
が包含される。
さて、本発明の方法は、次の非限定的諸例に言及して、更に説明される。
次の諸例で使用する諸物質は次のように供給される:
この研究で使用した、ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド及びプラスミドDNAは、イネックス製薬(Inex Pharmaceuticals)(バーナビー(Burnaby),BC,カナダ)によって提供された。オリゴヌクレオチドのmRNA標的及び配列は次の通りである:
ヒトc−myc,5’−TAACGTTGAGGGGCAT−3’(配列ID番号1);
ヒトICAM−1,5’−GCCCAAGCTGGCATCCGTCA−3’(配列ID番号2);及び
FITC−標識ヒトEGFR,5’−CCGTGGTCATGCTCC−3’(配列ID番号3)。
漏出(%)=(Fs−Fb)/(FTx−Fb)*100
[式中、Fsは試料の蛍光であり;Fbは、エタノールの不存在下で、カルセイン含有リポソームに対応するバックグラウンドであり;FTxは、「Triton X−100」値である]に従って計算した。
例1の予め形成された小胞を使用して、治療剤として、オリゴヌクレオチド INX−6295(配列ID番号1)を使用した、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を造った。蒸留水に入れたオリゴヌクレオチド INX−6295は、100%エタノールを追加することによって希釈し、40%エタノールに入っているオリゴヌクレオチド 10、20、30、40又は50mg/mlという種々の溶液を作った。エタノール性オリゴヌクレオチドは、40℃の容器20に入れた予め形成された小胞に、穏かに混合しながら添加した。エタノール性オリゴヌクレオチドの量及び容量を計算して、[薬物]:[脂質]の最終重量比 0.1〜0.25を与えた。次いで、その混合物は、1時間の間、穏かに且つ断続的に混ぜ合わせながら、40℃で定温放置した。定温放置した後、その溶液は、ダイアフィルトレーション(diafiltration)によって処理し、遊離の又は過剰の付随オリゴヌクレオチドを取り除き、エタノールを除去し、次いで、緩衝系をpH 7.4のリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)と交換した。濃化、除菌及びパッケージを行うことによって、商業用製品の製剤が完成する。
例2の手順は、種々のパラメータに変化を加えて繰り返して、本発明の、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の調製にとっていずれのパラメータが重要であるかを決定した。これらの実験において、全オリゴヌクレオチドの回収率(収率);全脂質の回収率(収率);及び被包化効率;は、製品とプロセスの質を示すものと考えた。全オリゴヌクレオチドの回収率は、式:
[{最終オリゴ濃度(mg/ml)×最終容量(ml)}/
{初期オリゴ濃度(mg/ml)×初期容量(ml)}]×100%
を用いて計算した。
全脂質の回収率は、式:
[{最終脂質濃度(mg/ml)×最終容量(ml)}/
{初期脂質濃度(mg/ml)×初期容量(ml)}]×100%
を用いて計算した。
被包化効率(E.E.);は、
[{初期オリゴ(mg/ml)/初期脂質(mg/ml)}/
{最終オリゴ(mg/ml)/最終脂質(mg/ml)}]×100%
を用いて計算した。
被包された(即ち、二重層の中に組み込まれたか、又は脂質粒子の内部に閉じ込められた)オリゴの割合は、上述のオリグリーン分析(OliGreen assay)によって決定した。
一層大きい治療剤に対する、本発明の適用性を実証するために、プラスミドpINEX L1018(CMVプロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子をコード化しており、また、SV40エンハンサー及びAmpL遺伝子を持っている5.5kbプラスミド)を予め形成された脂質小胞の中に負荷した。
予め形成された脂質小胞は、100%エタノールに溶解した諸脂質(20/45/25/10モル%比でのDSPC/Chol/DODAP/PEG−Cer14)10mgを、25mMクエン酸塩緩衝液[水酸化ナトリウムでpH 4に調整した、25mMクエン酸、255mMスクロース(ショ糖)]にゆっくり添加することによって調製した。両方の溶液は、混合する前に、40℃に予熱した。最終エタノール濃度は、40%(v/v)であった。脂質小胞のエタノール分散系は、室温で、二重に積み重ねた100nmポリカーボネート・フィルタを2回通過させて押し出した。それら脂質小胞に、40%エタノールに入れたプラスミドDNA 0.25mgを室温で添加し、次いで、その試料は40℃で1時間の間定温放置した。初期[プラスミド]/[脂質]比は0.025であった。続いて、その試料は、pH 7の25mM生理食塩水(20mM HEPES、150mM NaCl)2リットルに対して合計18〜20時間の間透析した。
最終のプラスミド 脂質比は0.022であった。この値は、88%の閉じ込めに相当する。得られた脂質被包済み治療剤の粒子は、100nmの平均粒度と、非常に小さい粒度分布とを有した。
リポソームの調製: エタノール/緩衝液の溶液に入った大きい単層リポソームは、押し出したリポソームにエタノールを添加するか;又はエタノールに溶解した脂質を水性緩衝液に添加し、次いで、押し出す;ことによって調製した。両者いずれの方法も、同じ閉じ込め結果を与え、下記に一層詳細に記述する:
1.pH 4のクエン酸塩緩衝液に入れた脂質膜を水和し、凍結/融解サイクルを5回行った後、二重に積み重ねた100nmフィルタを通過させて(10回通過)押し出すことによって、大きな単膜リポソーム(LUVs)を生成した。DODAP/DSPC/Chol/PEG−Cer14のリポソームの場合、押し出しは60℃で行った。次いで、急速に混合しながら、エタノールをゆっくり添加した。エタノールを除去した後、動的光散乱法によって決定した、典型的なリポソーム粒度は、DODAP/DSPC/Chol/PEG−Cer14系について90±20nmであった。エタノール濃度がある上限値を越えるや否や、リポソームが不安定になり、合体して大きい脂質構造になるため、エタノールをゆっくり添加すること及び急速に混合することは、重要である。後者は、脂質の組成に依存する。例えば、エタノール濃度が50%(v/v)を越えるとき、初期に半透明のDSPC/Chol/PEG−Cer14/DODAPリポソーム分散系は、乳白色になる。
c[μg/μl]=A260*1OD260ユニット[μg/ml]*希釈因子(factor)[ml/μl]
(式中、希釈因子は、試料の容量[μl]で除した全分析容量[ml]によって与えられる)に従って計算した。OD260ユニットは、個々のデオキシヌクレオチドの対吸光係数(pairwise extinction coefficients)から計算した。これら対吸光係数は、隣接相互作用を考慮している。1ODは、30.97μg/mlのc−myc(配列ID.No.1);33.37μg/mlのh−ICAM−1(配列ID.No.2);及び34μg/mlのEGFR(配列ID.No.3);に対応する。脂質濃度は、ブライ・ダイアー抽出法(ブライ及びダイアー,1959)により、オリゴヌクレオチドから脂質を分離した後、無機リン酸分析によって決定した。手短に言えば、水相(試料/HBS) 250μlに、メタノール 525μl及びクロロホルム 250μlを添加して、透明な単一相[水相/メタノール/クロロホルム(1:2.1:1容量比)]を形成した。溶液が透明でない場合、少量のメタノールを追加した。次いで、HBS 250μl及び等量のクロロホルムを添加した。諸試料は混合し、3000rpmで5〜10分間、遠心分離機で分離した。これによって、透明な2相系が得られた。クロロホルム相は、フィスケ・サバロウ法(1925)により、リン脂質含有量を分析した。別に断らない限り、閉じ込め効率は、[オリゴヌクレオチド]対[脂質]重量比(w/w)として表わす。
例5の手順の後、押し出しにより調製した100nmのDSPC/Chol/DODAPリポソーム(変性なし脂質成分)に、増加量のエタノールを添加した。全ての試料は、オリゴヌクレオチドを添加すると直ちに乳白色になった。これは、オリゴヌクレオチドにより誘導された凝集を示す。pH 4において0.035のモル[ODN]/[脂質]比でアンチセンス・オリゴヌクレオチドと共に定温放置を行った後、エタノールと、閉じ込められなかったオリゴヌクレオチドとを取り除いた。表7に、得られた多重膜小胞の最終粒度と共に、動的光散乱によって決定した被包効率を記載する。エタノール濃度が増大するにつれて、ますます多くのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが閉じ込められる。同時に、粒度及び多分散性(polydispersity)が増大することは、LUVs(大きな単膜リポソーム)が一層大きな脂質構造に漸次再編成されたことを反映している。これら一層大きな脂質構造は、大部分が大きな多重膜リポソームであると思われる。これらの系の粒度のために、閉じ込められなかった外部のオリゴヌクレオチドを除去するのに使用したアニオン交換カラムの上で失われる脂質もあることに注目すべきである。溶出した部分は、全脂質の約50〜60%に相当する。40%以上のエタノール濃度で、初期リポソームは、不安定になり、融合し、乳白色の分散系を形成する。
修飾脂質(PEG−Cer) 2.5〜10モル%を含有するリポソームを造り、次いで、例5及び6の諸プロトコルを用いて試験を行った。各々の場合、PEG−Cer濃度の減少は、DPSCレベルの増大によって調整した。リポソームの中に修飾脂質を取り込むこと(incorporation)によって、アンチセンス含有リポソームの最終粒度が調節されることが分かった。リポソームは、PEG−Cerが存在する場合、それが存在しない場合と比べて、一層大きいエタノール濃度で安定する。PEG−Cer 2.5モル%を含有する試料については、濁度がわずかに増大するのが認められたが、40%エタノール中では、それら分散系は光学的に半透明のままであった。安定性が増大したことはまた、閉じ込め(entrapment)が生じるために必要なエタノールの量が一層多いことに反映される(表8、図2)。図2には、被包効率が、PEG−Cer 10モル%を含有するリポソームに対するエタノール濃度の関数として描かれる。最大の閉じ込めは、40%エタノールで達成され、また、閉じ込めが生じるためには、25%(v/v)を越えるエタノール濃度(>4.3M)が必要であった。エタノールが存在しないと、閉じ込めは全く見出されなかった。表8には、動的光散乱によって決定される閉じ込め効率及び粒度が、図2から決定される最小エタノール濃度及び最大エタノール濃度での、PEG−Cer含有量(2.5〜10モル%)の関数として記載される。初期の被押し出しリポソームの粒度は、括弧内に与えられる。閉じ込めが生じるために必要なエタノールの量は、リポソームのPEG−Cer含有量に依存する。PEG−Cer 2.5モル%を含有するリポソームにでは、25%エタノールでオリゴヌクレオチドの約15%が閉じ込められた。対照的に、PEG−Cer 10モル%において、25%エタノールの存在下では実質的に閉じ込めは達成されず(≦5%)、また、40%エタノールの存在下では60%であった。全ての場合、初期の[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比は0.037(モル/モル)であった。PEG−Cer含有量が2.5モル%から10モル%まで増大するとき、閉じ込めレベルは、40%エタノール中で、45%からほぼ60%まで増大した。リポソーム粒度及び多分散性は131±40nmから100±26nmまで減少した。
脂質膜上でエタノールをかき乱す効果は、脂質の水和;アシル鎖のオーダー(order);小さいイオンの膜透過性;及びDPPC系における鎖の相互からみ合いの誘導;の変化に関連して、主に低いエタノール濃度(<15%、v/v)で研究されてきた[スレイター(Slater)及びハング(Hung),1988;バーチフェルド(Barchfeld)及びディーマー(Deamer),1988;シュビッヒテンホーベル(Schwichtenhovel)等,1992;スレイター(Slater)等,1993;バリー(Barry)及びゴーリッヒ(Gawrisch),1994;ビエル(Vierl)等,1994;ロベッケ(Lobbecke)及びチェブク(Cevc),1995;コマツ(Komatsu)及びオカダ(Okada),1996;ホルテ(Holte)及びゴーリッヒ(Gawrisch),1997]。閉じ込めるために必要な高濃度のエタノールにおいてリポソームが依然として無傷であるか否かを問うことは道理にかなっている。図3Aには、エタノールの濃度の関数として、DSPC/Chol/PEG−CerC14/DODAPリポソーム中の自己消光濃度(self-quenching concentrations)で閉じ込められたカルセインの解放(黒丸)が、同一の脂質組成のリポソームを使用して得られた被包効率と共に描かれている。漏出の実験も被包の実験も、40℃で行った。カルセイン(623の分子量を持つ小さい分子)の漏出は、30%以下のエタノールで出発し、約40%のエタノールで最大に達する。オリゴヌクレオチドの閉じ込めは、類似のエタノール依存を示し、その閉じ込めが、リポソーム膜の透過性障壁の不安定性と相関関係が高いことを表わしている。カルセインとは対照的に、FITC−デキストラン(分子量 19500)の解放は、40%エタノール中で10%未満である。このことは、オクチルグルコシド等の洗剤についても報告されてきたように[アルモッグ(Almog)等,1990]、透過性障壁の損失が、分子量依存であることを示す。40%エタノールに入った巨大リポソームの位相差顕微鏡検査によっても、無傷のリポソーム構造が明らかとなった。
被包に基づく濁度の増大は、閉じ込みが初期凝集工程[小凝集(microaggregates)の形成]によって先行されることを示す。その凝集工程及び閉じ込みは、低温で切り離すことができる。オリゴヌクレオチドを添加する時又は添加の直後に、試料は濁り、また、濁度は時間が経てば増大する。エタノールが存在しない場合、濁度がわずかに増大するのみであり、その後、光の透過率は一定のままである。40℃で調製した試料とは対照的に、4℃で定温放置した試料は、エタノールを除去すると、再び半透明になり、リポソームはオリゴヌクレオチドを閉じ込めない。図4には、閉じ込め効率が、温度の関数として、カルセインの漏出データと共にプロットされている。漏出データは、カルセインの50%解放を引き起こすのに必要なエタノール濃度として与えられる。また、リポソーム膜の不安定性と閉じ込め効率の間には、質的な相関関係が存在する。
31P−NMRは、オリゴヌクレオチドの閉じ込みを分析するのに使用することができる。図5のA及び図5のBは、溶解状態のc−mycの31P−NMRスペクトルを示し(図5のA)、また、DODAP/DSPC/Chol/PEG−CerC14リポソームに閉じ込められたc−mycの31P−NMRスペクトルを示す(図5のB)。それらリポソームは、初期に、内部pHが4であり外部pHが7.5である膜間pH勾配を示した。これらの条件下で、閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、正に帯電したリポソーム膜としっかりと結合している。この固定化によって、NMR信号は消失する(disappearance)(幅が広がる)結果となる(図5のB)。酢酸アンモニウムの添加によってpH勾配が消滅し、外部pHが7.5に調整されるとき、DODAPは脱プロトン化し、オリゴヌクレオチドはリポソーム膜から解離する。このことは、NMR信号の回復(recovery)(図5のC)によって実証される。しかし、この回復は不完全であり、初期信号の約50%である。この信号の減衰は、NMR共鳴の飽和に起因するものではない。それは、2つの可能性:被包されたアンチセンスの量がその溶解度を越えて、その一部が沈降すること;又は、アンチセンス分子の移動度が、例えば、2つの接近して並んでいる二重層の間に固定化されることによって、空間的に制約されること;に起因するのかも知れない(図3Aを参照)。オリゴヌクレオチドが、被包されてリポソームの水性内部に局部集中したことを確認するために、MnSO4 5mMを外部溶液に添加した(図5のD)。Mn2+は、膜不透過性常磁性線広がり剤(membrane impermeable paramagnetic line broadening agent)であって、オリゴヌクレオチドだけでなく、接近可能な全てのリン酸基、リン脂質の信号を消滅させる。しかし、オリゴヌクレオチドの信号は、影響されないままであり、OGPを有するリポソームの可溶化に基づいてのみ消滅した(図5のE)。初期リポソーム(図5のB)が、Mn2+の不存在下で、OGPにより可溶化されるとき、全体のオリゴヌクレオチド信号は回復する。これらのデータによって、オリゴヌクレオチドがリポソーム内に閉じ込められ、また、外部膜と単純には結合しないことが明白に実証される。閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合性染料オリグリーン(OliGreen)に接近しなかったことにも注目すべきである。
閉じ込め効率と同様、アンチセンスを閉じ込めているリポソームの粒度も、初期[アンチセンス]対[脂質]比に依存する。図6は、高い[アンチセンス]対[脂質]比でオリゴヌクレオチドを効率よく閉じ込め得ることを示す。閉じ込め効率は、初期[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比の関数としてプロットされている。最大閉じ込め効率での結合レベルは、脂質1mg当りオリゴヌクレオチド 0.16mg(0.024モル/モル)である。これは、100nmのリポソーム当り約2250分子のオリゴヌクレオチドに相当し、また、この閉じ込め手順が高効率であることを実証する。閉じ込め効率は、受動的被包化(passive encapsulation)によって得られたものより、約3桁大きい。
[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比を増大させるとき、試料の多分散性も粒度も、リポソーム単独の70±10nmから、0.2の初期[ODN]対[脂質]重量比の110±30nmまでわずかに増大する。凍結破断電子顕微鏡検査(freeze-fracture electron microscopy)により、初期[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比の増大と共に、一層大きいリポソームの数が増大することが分かった。また、初期に半透明であったリポソーム分散系は、[アンチセンス]対[脂質]比が増大するにつれて、ますます濁ってくることに注目すべきである。
接近して向き合っている膜であってそれら膜の多層構造がTEM(透過型電子顕微鏡検査)によって観察される該膜の形成を、PEGコーティングは妨げることが期待される。従って、放射能標識PEG−CerC14を使用することによって、PEG−Cerの命運について試験を行った。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、非標識PEG−CerC14 10モル%と、5.9の[3H]/[C14]比での、コレステロールマーカーとしての[14C]−コレステロールヘキサデシルエーテル(CHE)とに加えて、痕跡量の[3H]−PEG−CerC14を含有するリポソーム中に被包した。この比は、見掛けの[PEG−Cer]/[Chol]比を表わし、また、[PEG−Cer]/[Chol]のモル比に代えて使用される。初期の[アンチセンス]対[脂質]重量比は0.29であった。閉じ込めは、最終的に0.16の最終[アンチセンス]対[脂質]比となった。遊離のPEG−Cerミセル及びPEGミセルは、ショ糖段階勾配(sucrosestep gradient)[HBSに入ったショ糖 1%、2.5%、10%、15%(w/v)]を用いて、超遠心分離法によってリポソームから分離した。中空のリポソームは、5.5の見掛け[PEG−Cer]/[Chol]比で、2.5%ショ糖と10%ショ糖の境界に集まる。このバンド(band)は、全脂質の約80%を占める。アンチセンス含有リポソームは、同一の位置に弱いバンドを示し、このバンドは全脂質の9%未満に相当する。しかし、大抵のリポソームアンチセンスは、15%ショ糖層又は下部のペレットに移動する。表9に、勾配のリポソーム含有フラクション(fractions)の全分析を示す。それら結果は、高い[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比で調製した試料を表わす。相対的な[PEG−Cer]/[Chol]比は、勾配の下部の方に向かい漸進的に減少している。PEG−Cerの50%以上が、初期リポソーム(見掛け[PEG−Cer]/[Chol]比は5.5)に比べて下部フラクションから失われている。[DSPC]/[Chol]比は変化していない。PEG−Cerの27%は、コレステロールの6.6%と共に、上部フラクションに見出すことができる。ほぼ同じ量の非リポソーム結合PEG−Cerが、中空の対照リポソームに見られる。
エタノールの存在下、カチオン性リポソームにオリゴヌクレオチドを添加すれば、ドメイン形成を生じさせることができる。見られる多重膜リポソームの形成は、リポソームの接着によって先行されなければならない。しかし、エタノールの不存在下では、10モル%PEG−Cerは接着を完全に妨げる。エタノールの存在下では、2つの効果:即ち、第1に、迅速な脂質交換による、非膜取り込み済み(non membrane-incorporated)PEG−Cerの量の増加;及び、PEG−Cer中で消耗されアンチセンス・オリゴヌクレオチド中で富化される小さいドメインの形成;が、リポソームの接着に寄与し得る。後者の可能性を研究した。オリゴヌクレオチド結合の効果は、FITC標識オリゴヌクレオチドと併せてDSPC/Chol/DODAP/PEG−CerC14の巨大リポソームを用いて、位相差蛍光顕微鏡により視覚化した。観察された大抵のリポソームは、多重膜であり、内部構造を示した。エタノールの不存在下で、巨大リポソームは崩壊して不規則形状の凝集体となり、また、アンチセンスの添加によって一層小さいリポソームとなった。グリーンFITC蛍光発光(green FITC fluorescence)によって、オリゴヌクレオチドの位置が明らかとなった。40%エタノールの存在下では、全く異なる事態が与えられる。初期に丸いリポソームは、オリゴヌクレオチドを添加して5〜10分間は西洋なし形状をしており、また、これらオリゴヌクレオチドは、これらリポソーム構造体の一方側では半円形で置かれている。内部膜は、この馬蹄形のものから圧搾される。この馬蹄形のものは、(とりわけ、温度が上昇するとき)引き離されて崩壊し、蛍光が完全にグリーンに見える、緻密でわずかに不規則な構造体となる。オリゴヌクレオチドの分離は、エタノールがドメインの形成を刺激し得ることを表わしている。
本発明の被包化手順は、特定のオリゴヌクレオチド及び脂質の組成に左右されないし、また、使用される高いクエン酸塩濃度にも制限されない。被包化は、50mMクエン酸塩緩衝液で最も効率が高く、一層低いクエン酸塩濃度でも一層高いクエン酸塩濃度でも減少する。粒度及び多分散性は、25mM以下のクエン酸塩濃度ではかなり増大する。図7は、プラスミド−DNAも、c−myc(配列ID番号1)以外の諸オリゴヌクレオチドも、DSPC/Chol/DODAP/PEG−CerC14のリポソーム中に効率よく閉じ込めることができることを示す。初期の[オリゴヌクレオチド]対[脂質]重量比は0.1mg/mgであり、オリゴヌクレオチドを閉じ込めるために、300mMクエン酸塩緩衝液を使用した。pDNAの閉じ込めは、0.03の[pDNA]対[脂質]重量比で、50mMクエン酸塩緩衝液中で行った。ホスホロチオエート型アンチセンス・オリゴヌクレオチドと異なり、ホスホジエステルベースの分子は、300mMクエン酸塩緩衝液等の高いイオン強度の緩衝液では、被包することができない。これは恐らく、結合親和性(binding affinities)の差異を反映する[センプル(Semple)等,2000]。大きい分子の効率のよい被包化とは対照的に、ATPの10%未満は、0.2mg/mgの初期[ATP]対[脂質]比で、DSPC/Chol/DODAP/PEG−CerC14のリポソーム中に閉じ込めることができる。ATPの閉じ込めは、50mMクエン酸塩緩衝液中で行った。表5は、この閉じ込め手順が、DOPE系を含有する他の諸脂質組成物に拡張することができることを実証する。負に帯電したリポソーム;及び正に帯電した、ポリリシンを含む高分子電解質;に関する予備結果によって、閉じ込みが、エタノール中における、高分子電解質と、逆に帯電したリポソームとの相互作用の一般的特徴であることが分かる。
エタノールに代えて、オクチルグルコシド(OGP)を使用した。洗剤をリポソームに添加し(1:1 v/v)、最終濃度を30〜40mMの範囲とした。後続の諸工程は全て、例5で記述した通りに実施した。但し、pH 4のクエン酸塩緩衝液に対する初期透析工程は5時間に延長した。オリゴヌクレオチドは、外部から添加されるオリグリーン(Oligreen)、蛍光オリゴー結合性染料から保護されるべきことが分かった。初期[オリゴヌクレオチド]対[脂質]比は、0.23(mg/mg)であった。粒度は、数平均粒度を表わす。DSPC/Chol/DODAP/PEG−CerC14は、20/45/25/10モル%であった。表11に、被包化の観察レベル、及び最終粒度をまとめる。
アルバースドーファ(Albersdorfer),A.;T.,フェーダー(Feder);E.,ザックマン(Sackmann):長領域斥力と短領域引力の相互作用による接着性誘導済みドメインの形成(Adhesion-induced domain formation by interplay of long-range repulsion and short-range attraction force: a model membrane study),Biophys.J.,73,245〜57(1997).
アルモグ(Almog),S.;B.J.,リトマン(Litman);W.,ウィムレイ(Wimley);J.,コーヘン(Cohen);E.J.,ワクテル(Wachtel);Y.,バーレンホルツ(Barenholz);A.,ベン・ショール(Ben-Shaul),D.,リヒテンベルク(Lichtenberg):ホスファチジルコリンとオクチルグルコシドの混合物における凝集と相変態の状態(States of aggregation and phase transformation in mixtures of phosphatidylcholine and octyl glucoside),
Biochemistry,29,4582〜4592(1990).
アンジェロバ(Angelova),M.I.;N.,フリストファ(Hristova);I.,ツォネバ(Tsoneva):巨大多重膜カチオン小胞への局部的微量注入に関するDNA誘導エンドサイトーシス(DNA-induced endocytosis upon local microinjection to giant unilamellar cationic vesicles),Eur.Biophy.J.,28,142〜50(1999).
ベイリー(Bailey),A.L.;P.R.,クリス(Cullis):アミノ脂質の不斉性トランス二重層の分布による膜融合の調整(Modulation of membrane fusion by asymmetric transbilayer distribution of amino lipids),Biochemistry,33,12573〜80(1994).
バーヒフェルト(Barchfeld),G.L.;D.W.,デーマー(Deamer):全身麻酔薬の作用に関連するプロトン及びカリウムに対する脂質二重層の透過性に及ぼすアルコールの影響(Alcohol effects on lipid bilayer permeability to proton and potassium relation to action of general anesthetics),Biochim.Biophys.Acta,944,40〜48(1988).
ブライ(Bligh),E.G.;W.J.,ダイヤー(Dyer):Can.J.Biochem.Physiol.,37,911〜17(1959).
ボッツォラ(Bozzola),J.J.;L.D.,ラッセル(Russell):電子顕微鏡(Electron Microscopy),(Chapter 19-Interpretation of micrographs),出版者 ジョーン(Jones)及びバートレット(Bartlett),トロント(1999).
チョン(Chonn),A.;P.R.,カリス(Cullis):リポソーム技術における近年の進歩と、全身へ遺伝子を送り出すためのそれら技術の適用(Recent advances in liposome technologies and their applications for systemic gene deliverty),Adv.Drug Del.Rev.,30,73〜83(1998).
デュポールテイル(Duportail),D.;リアノス(Lianos),P.:ピレン及びピレン誘導体を用いた小胞の蛍光精査(Fluorescence probing of vesicles using pyrene and pyrene derivatives),In Vesicles(編集:M.ロソフ(Rosoff)),p.295〜366(1996).
エバンス(Evans),E.A.;V.A.,(Parsegian):細胞と小胞の凝集における膜の変形と接着のエネルギー特性(Energetics of membrane deformation and adhesion in cell and vesicle aggregation),Ann.N.Y.Acad.Sci.,416,13〜33(1983).
フェルグナー(Felgner),P.L.:遺伝子治療のための非ウィルス方法(Nonviral strategies for gene therapy),Scientific American,276,102〜106(1997).
フィスケ(Fiske),C.H.;Y.,サバロウ(Subbarow):J.,Biol.Chem.,66,325〜329(1925).
ガオ(Gao),X.;L.,ファング(Huang):カチオンリポソーム媒介遺伝子の運搬(Cationic liposome-mediated gene transfer),Gene Therapy,2,710〜722(1995).
ジェニス(Gennis),R.B.:生体膜:分子構造と機能(Biomembranes: Molecular Structure and Function),Springer Verlag,ニューヨーク(1989).
グスタフソン(Gustafsson),J.;G.,アルビドソン(Arvidson);G.,カールソン(Karlsson);M.アルムグレン(Almgren):極低温により視覚化されたカチオンリポソームとDNAの間の複合体(Complexes between cationic liposomes and DNA visualized by cryo-TEM),Biochim.Biophys.Acta,1235,305〜12(1995).
ヒルシュバイン(Hirschbein),B.L.;K.L.,フェロン(Fearon):オリゴヌクレオチドの研究開発におけるP−31NMRスペクトロスコピー−解説(P-31 NMR spectroscopy in oligonucleotide research and development-commentary),Antisense & Nucleic Acid Drug Developement,7,55〜61(1997).
ホルテ(Holte),L.L.;K.,ゴーリッシュ(Gawrisch):MAS−NOESYスペクトルを用いたリン脂質多層中のエタノール分布の検出(Detecting ethanol distribution in phospholipid multilayers with MAS-NOESY Spectra),Biochemistry,36,4669〜74(1997).
ヒューブナー(Huebner),S.;B.J.,バタスビ(Battersby);R.,グリム(Grimm);G.,チェブク(Cevc):脂質DNA複合体の形成:極低温電子顕微鏡により観察される、DNAの存在下での脂質二重層の再編成と融合(Lipid-DNA complex formation: reorganization and fusion of lipid bilayers in the presence of DNA as observed by cryo-electron microscopy),Biophys.J.,76,3158〜3166(1999).
ハイアット(Hyatt),M.A.:電子顕微鏡の原理と技術(Principles and Techniques of Electron Microscopy),出版者 エドワード・アーノルド(Edward Arnold),ロンドン,英国(1981).
カチャー(Kachar),B.;N.,フラー(Fuller);R.P.,ランド(Rand):ホスホファチジルセリン含有小胞のカルシウム誘導相互作用に対する形態学的反応(Morphological responses to calcium-induced interactions of phosphatidylserine-containing vesicles),Biophys.J.,50,779〜88(1981).
ラシック(Lasic),D.D.:遺伝子運搬におけるリポソーム(Liposomes in Gene Delivery),Chapter 7,CRC Press,Boca Raton(1997a).
ラシック(Lasic),D.D.;H.,ストレイ(Strey);M.C.A.,スチュアート(Stuart);R.,ポドゴールニック(Podgornik);P.M.,フレデリック(Frederik):DNAリポソーム複合体の構造(The structure of DNA-liposome complexes),J.Am.Chem.Soc.,119,832〜33(1997b).
レックバンド(Leckband),D.E.;C.A.,ヘルム(Helm);J.,イスラエルアクビリ(Israelachvili):二重層の接着と融合におけるカルシウムの役割(Role of calcium in adhesion and fusion of bilayers),Biochemistry,32,1127〜1140(1993).
レンツ(Lentz),B.R.;W.,タルボット(Talbot);J.,リー(Lee);L.-X.,チョン(Zheng):トランス二重層脂質の再分配はモデル膜のポリ(エチレングリコール)処理を伴うが融合により誘導されない(Transbilayer lipid redistribution accompanies poly(ethylene glycol)treatment of model membranes but is not induced by fusion),Biochemistry,36,2076〜2083(1997).
リポースキー(Lipowsky),R.:膜の立体配座(The conformation of membranes),Nature,349,475〜81(1991).
マクドナルド(Macdnald),P.M.;K.J.,クローウェル(Crowell);C.M.,フランシン(Franzin);P.,ミトラコス(Mitrakos);D.J.,セムキシン(Semchyschyn):脂質の二重層膜中の高分子電解質誘導ドメイン:重水素NMR透視図(Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective),Biochem.Cell Biol.,76,452〜464(1998).
マウレル(Maurer),N.;A.,モリ(Mori);L.,パルマー(Palmer);M.A.,モンク(Monck);K.W.C.,モク(Mok);B.,ムイ(Mui);Q.F.,アクホング(Akhong);P.R.,カリス(Cullis):遺伝子薬物の細胞内運搬のための脂質ベース系(Lipid-based systems for the intracellular delivery of genetic drugs),Mol.Membr.Biol.,16,129〜140(1999).
マッキンタイア(McIntyre),J.C.;R.G.,スレイト(Sleight):リン脂質膜の不斉性のための蛍光分析(Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry),Biochemistry,30,11819〜27(1991).
マイアー(Meyer),O.;D.,キルポーチン(Kirpotin);K.,ホン(Hong);B.,シュテルンベルク(Sternberg);J.W.,パーク(Park);M.C.,ウッドル(Woodle);D.パパハジョロポーロス(Papahadjopoulos):オリゴヌクレオチドのキャリヤとしてのポリエチレングリコールで被覆したカチオンリポソーム(Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as carriers for oligonucleotides),J.Biol.Chem.,273,15621〜7(1998).
ミラー(Miller),D.C.;G.P.,ダール(Dahl):カルシウム誘導リポソーム融合における初期事象(Early events in calcium-induced liposome fusion),Biochim.Biophys.Acta,689,165〜9(1982).
ミトラコス(Mitrakos),P.;P.M.,マクドナルド(Macdonald):2H NMRで検出される、脂質二重層膜中のカチオン性両親媒性物質のDNA誘導外側分離(DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via 2H NMR),Biochemistry,35,16714〜22(1996).
ニーダム(Needham),D.;E.,エバンス(Evans):20℃以下10℃以上の巨大脂質(DMPC)の小胞二重層の構造と機械的性質、24℃での液晶−結晶相転移(Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC)vesicle bilayers from 20oC below to 10oC above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24oC),Biochemistry,27,8261〜69(1988).
オリボン(Ollivon),M.;O.,アイデルマン(Eidelman),R.,ブルーメンソール(Blumenthal);A.,ウォルター(Walter):卵ホスファチジルコリン及びオクチルグルコシドのミセル−小胞転移(Micell-vesicle transition of egg phosphatidylcholine and octyl glucoside),Biochemistry,27,1695〜1703(1988).
ラドラー(Radler),J.O.;I.,コルトバー(Koltover);A.,ジェーミソン(Jamieson);T.,サルディット(Salditt);C.R.,サフィーニャ(Safinya):自己集合したカチオン性脂質−DNA遺伝子キャリヤ複合体の構造及び界面の特徴(Structure and interfacial aspects of self-assembled cationic lipid-DNA gene carrier complexes),Langmuir,14,4272〜83(1998).
ランド(Rand),R.P.;B.,カチャー(Kachar);T.S.,リース(Reese):諸ホスファチジルセリン小胞の間のカルシウム誘導相互作用の動的形態(Dynamic morphology of calcium-induced interactions between phosphatidylserine vesicles),Biophys.J.,47,483〜9(1985).
ザックマン(Sackmann),E.:小胞及び細胞の形状と形状転移とに関する膜曲げエネルギーの概念(Membrane bending energy concept of vesicle- and cell-shapes and shape transitions),FEBS Let.,346,3〜16(1994).
センプル(Semple),S.C.;S.K.,クリマック(Klimuk);T.O.,ハラシム(Harasym);N.,ドスサントス(Dos Santos);S.M.,アンセル(Ansell);K.F.,ウォン(Wong);N.,マウレル(Maurer);H.,スターク(Stark);P.R.,カリス(Cullis);M.J.,ホープ(Hope);P.,シェラー(Scherrer):イオン性アミノ脂質を用いた脂質小胞中のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効率的被包化:新規で小さな多重膜リポソーム構造体の形成
(Efficient encapsulation of antisense oligonucleotide in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures)(2000).
ジーゲル(Siegel),D.P.;W.J.,グリーン(Green);Y.,タルモン(Talmon):ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構:温度ジャンプ極低温透過電子顕微鏡を用いた研究(The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transitions: a study using tomperature-jump cryotransmission electron microscopy),Biophys.J.,66,402〜14(1994).
ジーゲル(Siegel),D.P.;R.M.,エパンド(Epand):ホスファチジルエタノールアミンにおける、ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構:膜融合機構の影響(The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transition in phosphatidylethanolamine: implications for membrane fusion mechanisms),Biophys.J.,73,3089〜3111(1997).
スレイター(Slater),J.L.;ファング(Huang),C.-H.:相互にかみ合った二重層膜(Interdigitated bilayer membranes),Prog.Lipid Res.,27,325〜359(1988).
ストラック(Struck),D.K.;D.,フックストラ(Hoekstra);R.E.,パガーノ(Pagano):膜をモニタリングするための共鳴伝達の使用方法(Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion),Biochemistry,20,4093〜4099(1981).
トーカン(Tocanne),J.F.;J.,テシエ(Teissie):膜モデル系における、リン脂質のイオン化及びプロトンのリン脂質支持界面側方拡散(Ionization of phospholipids and phospholipid-supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems),Biochim.Biophys.Acta,1031,111〜142(1990).
ホイラー(Wheeler),J.J.;L.,パルマー(Palmer);M.,オッサンロー(Ossanlou);I.,マクラクラン(MacLachlan);R.W.,グラハム(Graham);M.J.,ホープ(Hope);P.,シェラー(Scherrer);P.R.,カリス(Cullis):安定化したプラスミド脂質粒子;構造と特性(Stabilized plasmid-lipid particles: construction and characterization),Gene Therapy,6,271〜281(1999).
フィール(Vierl),U.;L.,ロベッケ(Lobbecke);N.,ナーゲル(Nagel);G.,チェブク(Cevc):脂質の二重層膜のコロイドと相の挙動に及ぼす溶質の影響:エタノール−ジパルミトイルホスファチジルコリン混合物(Solute effects on the colloidal and phase behavior of lipid bilayer membranes: ethanol-dipalmitoylphosphatidylcholine mixtures),Biophys.J.,67,1067〜1079(1994).
シュ(Xu),Y.;S.W.,ホイ(Hui);P.,フレデリック(Frederick);F.C.,ショカ(Szoka):カチオンリポソームの物理化学特性と精製(Physicochemical characterization and purification of cationic liposomes),Biophys.J.,77,341〜53(1999).
Claims (12)
- 帯電した治療剤の、脂質で十分に被包された治療剤粒子を製造する方法であって、
予め形成された脂質小胞を含む脂質組成物と、帯電した治療剤と、有機溶媒又は洗剤から選択される不安定化剤とを混合して、不安定化溶媒を形成する工程であって、前記不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である工程、
予め形成された脂質小胞の内部に治療剤を被包するのに十分な時間、前記不安定化溶媒を定温放置する工程、
不安定化剤を除去する工程、
を含み、
前記予め形成された脂質小胞が、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、PEG脂質又はポリアミドオリゴマーから選択される修飾脂質とを含み、
前記修飾脂質が、予め形成された小胞の凝集を遅らせるものの妨げない有効な量で、予め形成された小胞中に存在する、上記製造方法。
- 予め形成された脂質小胞中の帯電脂質がカチオン性脂質からなり、治療剤がアニオン性治療剤である、請求項1記載の方法。
- 治療剤がポリヌクレオチドである、請求項2記載の方法。
- カチオン性脂質が、
ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC);
N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA);
N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB);
N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP);
3β−(N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(DC−Chol);
N−(1,2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE);
DOTMA及び1,2−ジオレオイル−sn−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)を含むカチオン性リポソーム;
N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N−(2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)及びDOPEを含むカチオン性リポソーム;
エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(DOGS)を含むカチオン性脂質;
N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODMA)及び、
1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)
から成る群から選ばれる、請求項2又は3に記載の方法。
- 脂質組成物が、10〜40モル%の帯電脂質、25〜40モル%の中性脂質、35〜55モル%のステロール、及び2.5〜10モル%の修飾脂質を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 不安定化剤がエタノールである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- エタノールが、不安定化溶媒中に25〜40%の濃度で存在する、請求項6記載の方法。
- 不安定化剤が洗剤である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 不安定化溶媒が、更にクエン酸塩緩衝液 25〜300mMを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 不安定化溶媒は、約40℃の温度で定温放置される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾脂質が、PEG−CerC14である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 予め形成された脂質小胞が、カチオン性脂質;DOPE及びDSPCから成る群から選ばれる中性脂質;修飾脂質;並びにコレステロールを含有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14397899P | 1999-07-15 | 1999-07-15 | |
US60/143,978 | 1999-07-15 | ||
PCT/CA2000/000843 WO2001005374A1 (en) | 1999-07-15 | 2000-07-14 | Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011172656A Division JP2011225618A (ja) | 1999-07-15 | 2011-08-08 | 脂質に被包された治療剤の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003504391A JP2003504391A (ja) | 2003-02-04 |
JP5388395B2 true JP5388395B2 (ja) | 2014-01-15 |
Family
ID=22506531
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001510431A Expired - Lifetime JP5388395B2 (ja) | 1999-07-15 | 2000-07-14 | 脂質に被包された治療剤の製造方法 |
JP2001510430A Pending JP2003504390A (ja) | 1999-07-15 | 2000-07-14 | 脂質小胞の製造のための方法および装置 |
JP2011172656A Pending JP2011225618A (ja) | 1999-07-15 | 2011-08-08 | 脂質に被包された治療剤の製造方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001510430A Pending JP2003504390A (ja) | 1999-07-15 | 2000-07-14 | 脂質小胞の製造のための方法および装置 |
JP2011172656A Pending JP2011225618A (ja) | 1999-07-15 | 2011-08-08 | 脂質に被包された治療剤の製造方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1194122B1 (ja) |
JP (3) | JP5388395B2 (ja) |
CN (1) | CN1228041C (ja) |
AT (1) | ATE286719T1 (ja) |
AU (2) | AU769357B2 (ja) |
BR (1) | BR0012624B1 (ja) |
CA (2) | CA2378438C (ja) |
DE (1) | DE60017406T2 (ja) |
ES (1) | ES2235916T3 (ja) |
IL (2) | IL147089A0 (ja) |
WO (2) | WO2001005373A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2697390C1 (ru) * | 2019-03-15 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ синтеза липосомальной формы тироксина |
Families Citing this family (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020119188A1 (en) * | 2000-02-08 | 2002-08-29 | Susan Niemiec | Method of manufacturing liposomes |
US7189705B2 (en) | 2000-04-20 | 2007-03-13 | The University Of British Columbia | Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers |
JP2004508012A (ja) * | 2000-04-20 | 2004-03-18 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | エンドソーム膜不安定剤を用いたsplp媒介性トランスフェクションの強化方法 |
US20040009126A1 (en) * | 2002-03-05 | 2004-01-15 | Transave, Inc. | Inhalation system for prevention and treatment of intracellular infections |
CA2752143C (en) | 2002-05-15 | 2014-09-23 | Sutter West Bay Hospitals | Delivery of nucleic acid-like compounds |
DE60329497D1 (de) | 2002-06-26 | 2009-11-12 | Medigene Ag | Herstellung einer kationisch liposomalen zubereitung, einen lipophilen wirkstoff enthaltend |
WO2004002453A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Protiva Biotherapeutics Ltd. | Method and apparatus for producing liposomes |
US7718189B2 (en) | 2002-10-29 | 2010-05-18 | Transave, Inc. | Sustained release of antiinfectives |
EP1648519B1 (en) * | 2003-07-16 | 2014-10-08 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
EP1771206B1 (en) | 2004-05-05 | 2018-04-11 | Silence Therapeutics GmbH | Lipids, lipid complexes and use thereof |
US7745651B2 (en) | 2004-06-07 | 2010-06-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
WO2005121348A1 (en) * | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
EP1773857A4 (en) | 2004-07-02 | 2009-05-13 | Protiva Biotherapeutics Inc | THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF |
DK1830888T3 (en) * | 2004-12-27 | 2015-10-19 | Silence Therapeutics Gmbh | LIPID COMPLEX COATED WITH PEG AND APPLICATION THEREOF |
US9005654B2 (en) | 2005-07-27 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
CA2628300C (en) | 2005-11-02 | 2018-04-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified sirna molecules and uses thereof |
CA2838111C (en) | 2005-12-08 | 2016-01-19 | Insmed Incorporated | Lipid-based compositions of antiinfectives for treating pulmonary infections and methods of use thereof |
EP2004141A2 (en) * | 2006-03-17 | 2008-12-24 | Novosom AG | An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances |
ES2668554T3 (es) * | 2006-04-06 | 2018-05-18 | Insmed Incorporated | Métodos para la encapsulación liposomal inducida por coacervación y sus formulaciones |
CN102321626B (zh) | 2006-07-21 | 2014-12-10 | 赛伦斯治疗有限公司 | 用于抑制蛋白激酶3表达的方法 |
WO2008137717A1 (en) | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Transave, Inc. | Compositions of multicationic drugs for reducing interactions with polyanionic biomolecules and methods and uses thereof |
US9119783B2 (en) | 2007-05-07 | 2015-09-01 | Insmed Incorporated | Method of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations |
US9333214B2 (en) | 2007-05-07 | 2016-05-10 | Insmed Incorporated | Method for treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations |
US9114081B2 (en) | 2007-05-07 | 2015-08-25 | Insmed Incorporated | Methods of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations |
WO2009038540A1 (en) * | 2007-09-17 | 2009-03-26 | Microspace Rapid Pte Ltd | System and method for providing control of a vehicle |
PL2279254T3 (pl) | 2008-04-15 | 2017-11-30 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych |
CA2984026C (en) | 2008-10-09 | 2020-02-11 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids |
WO2010045512A2 (en) | 2008-10-16 | 2010-04-22 | Mdrna , Inc. | Processes and compositions for liposomal and efficient delivery of gene silencing therapeutics |
US20120034294A1 (en) * | 2008-12-17 | 2012-02-09 | Oncothyreon, Inc. | Method of making small liposomes |
US9018187B2 (en) | 2009-07-01 | 2015-04-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
IL292615B2 (en) | 2009-07-01 | 2023-11-01 | Protiva Biotherapeutics Inc | Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses |
WO2011000108A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein b |
EP2451950B9 (en) | 2009-07-06 | 2016-11-23 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
US9907746B2 (en) | 2009-07-06 | 2018-03-06 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
WO2011056682A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-12 | The University Of British Columbia | Reverse head group lipids, lipid particle compositions comprising reverse headgroup lipids, and methods for the delivery of nucleic acids |
WO2011120023A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting survivin gene expression uses thereof |
EP2558074B1 (en) | 2010-04-08 | 2018-06-06 | The Trustees of Princeton University | Preparation of lipid nanoparticles |
WO2011133584A2 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-27 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting hras gene expression and uses thereof |
WO2011139843A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-10 | Marina Biotech, Inc. | Multi-sirna compositions for reducing gene expression |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
CN103096922B (zh) | 2010-07-06 | 2019-08-06 | 变异生物技术公司 | 用于治疗流行性感冒的组合物和方法 |
EP2663327A4 (en) * | 2011-01-13 | 2015-12-02 | Variation Biotechnologies Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTIONS |
US9579338B2 (en) | 2011-11-04 | 2017-02-28 | Nitto Denko Corporation | Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery |
WO2013064911A2 (en) * | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Nitto Denko Corporation | Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles |
US20140356399A1 (en) | 2012-01-12 | 2014-12-04 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating viral infections |
US20150079077A1 (en) | 2012-01-27 | 2015-03-19 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for therapeutic agents |
JP6402097B2 (ja) | 2012-05-21 | 2018-10-10 | インスメッド インコーポレイテッド | 肺感染症を処置するためのシステム |
BR112015012351A8 (pt) | 2012-11-29 | 2019-10-01 | Insmed Inc | composição de antibiótico de glicopeptídeo à base de lipídeo estabilizado e uso de um componente lipídico, um componente de antibiótico de glicopeptídeo e um aminoácido ou derivado do mesmo |
US9993427B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-06-12 | Biorest Ltd. | Liposome formulation and manufacture |
JP6176548B2 (ja) * | 2013-03-14 | 2017-08-09 | バイオレスト リミテッド | リポソーム処方剤と製造 |
US9693958B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-07-04 | Cureport, Inc. | Methods and devices for preparation of lipid nanoparticles |
US9504405B2 (en) | 2013-10-23 | 2016-11-29 | Verily Life Sciences Llc | Spatial modulation of magnetic particles in vasculature by external magnetic field |
US10542918B2 (en) | 2013-10-23 | 2020-01-28 | Verily Life Sciences Llc | Modulation of a response signal to distinguish between analyte and background signals |
WO2015175939A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Insmed Incorporated | Methods for treating pulmonary non-tuberculous mycobacterial infections |
US9861710B1 (en) | 2015-01-16 | 2018-01-09 | Verily Life Sciences Llc | Composite particles, methods, and in vivo diagnostic system |
WO2018232357A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Rna formulations |
JP7275111B2 (ja) | 2017-08-31 | 2023-05-17 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子の生成方法 |
CN114392233A (zh) * | 2017-10-20 | 2022-04-26 | 生物技术公司 | 适用于治疗的脂质体rna制剂的制备和储存 |
JP7460534B2 (ja) | 2018-03-30 | 2024-04-02 | インスメッド インコーポレイテッド | リポソーム医薬品の連続製造方法 |
KR20210091120A (ko) | 2018-08-29 | 2021-07-21 | 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 | Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정 |
EP3620519A1 (en) * | 2018-09-04 | 2020-03-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Use of isolated milk extracellular vesicles for delivering oligonucleotides orally |
CN113840926A (zh) | 2019-03-19 | 2021-12-24 | 阿克丘勒斯治疗公司 | 脂质包封的rna纳米颗粒的制备方法 |
EP3711749A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-23 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Method of making lipid nanoparticles |
WO2020225769A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Universidade Do Minho | Method for production of liposomes |
CN115427021A (zh) | 2020-02-25 | 2022-12-02 | 翻译生物公司 | 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法 |
IL301253A (en) | 2020-09-13 | 2023-05-01 | Arcturus Therapeutics Inc | As a mass of large RNA lipid nanoparticles |
MX2023006056A (es) | 2020-11-25 | 2023-06-06 | Akagera Medicines Inc | Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas. |
EP4059491A1 (de) | 2021-03-17 | 2022-09-21 | Evonik Operations GmbH | Vorrichtung und verfahren zur herstellung von nanocarriern und/oder nanoformulierungen |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4752425A (en) * | 1986-09-18 | 1988-06-21 | Liposome Technology, Inc. | High-encapsulation liposome processing method |
US4895452A (en) * | 1988-03-03 | 1990-01-23 | Micro-Pak, Inc. | Method and apparatus for producing lipid vesicles |
JPH0665382B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1994-08-24 | 雪印乳業株式会社 | リポソーム調製装置とその装置を使用するリポソーム調製方法 |
US5776486A (en) * | 1993-05-28 | 1998-07-07 | Aphios Corporation | Methods and apparatus for making liposomes containing hydrophobic drugs |
JPH08512056A (ja) * | 1993-06-30 | 1996-12-17 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | リポソームの製造法 |
DE69527206T2 (de) * | 1994-09-30 | 2003-02-27 | Inex Pharmaceuticals Corp | Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen |
DE69841002D1 (de) * | 1997-05-14 | 2009-09-03 | Univ British Columbia | Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln |
WO1999018933A2 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-22 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Methods for encapsulating nucleic acids in lipid bilayers |
EP1030652B1 (en) * | 1997-11-14 | 2012-04-25 | Pacira Pharmaceuticals, Inc. | Production of multivesicular liposomes |
WO2000029103A1 (en) * | 1998-11-13 | 2000-05-25 | Optime Therapeutics, Inc. | Method and apparatus for liposome production |
-
2000
- 2000-07-14 AU AU62562/00A patent/AU769357B2/en not_active Ceased
- 2000-07-14 WO PCT/CA2000/000842 patent/WO2001005373A1/en active Application Filing
- 2000-07-14 DE DE60017406T patent/DE60017406T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 JP JP2001510431A patent/JP5388395B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 CA CA2378438A patent/CA2378438C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-14 AU AU62561/00A patent/AU771706B2/en not_active Ceased
- 2000-07-14 BR BRPI0012624-1A patent/BR0012624B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-14 JP JP2001510430A patent/JP2003504390A/ja active Pending
- 2000-07-14 ES ES00949026T patent/ES2235916T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 WO PCT/CA2000/000843 patent/WO2001005374A1/en active IP Right Grant
- 2000-07-14 CN CN00810355.0A patent/CN1228041C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-14 EP EP00949026A patent/EP1194122B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-14 IL IL14708900A patent/IL147089A0/xx active IP Right Grant
- 2000-07-14 EP EP00949025A patent/EP1196145A1/en not_active Withdrawn
- 2000-07-14 AT AT00949026T patent/ATE286719T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-14 CA CA002378430A patent/CA2378430A1/en not_active Abandoned
-
2001
- 2001-12-13 IL IL147089A patent/IL147089A/en unknown
-
2011
- 2011-08-08 JP JP2011172656A patent/JP2011225618A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2697390C1 (ru) * | 2019-03-15 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ синтеза липосомальной формы тироксина |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60017406D1 (de) | 2005-02-17 |
CN1228041C (zh) | 2005-11-23 |
AU6256100A (en) | 2001-02-05 |
CA2378430A1 (en) | 2001-01-25 |
EP1194122B1 (en) | 2005-01-12 |
AU769357B2 (en) | 2004-01-22 |
ATE286719T1 (de) | 2005-01-15 |
IL147089A (en) | 2006-08-20 |
IL147089A0 (en) | 2002-08-14 |
JP2011225618A (ja) | 2011-11-10 |
EP1196145A1 (en) | 2002-04-17 |
JP2003504390A (ja) | 2003-02-04 |
DE60017406T2 (de) | 2005-09-29 |
WO2001005373A1 (en) | 2001-01-25 |
AU771706B2 (en) | 2004-04-01 |
BR0012624B1 (pt) | 2011-08-09 |
CN1361681A (zh) | 2002-07-31 |
CA2378438C (en) | 2010-05-04 |
ES2235916T3 (es) | 2005-07-16 |
WO2001005373A9 (en) | 2002-08-29 |
CA2378438A1 (en) | 2001-01-25 |
WO2001005374A1 (en) | 2001-01-25 |
EP1194122A1 (en) | 2002-04-10 |
AU6256200A (en) | 2001-02-05 |
JP2003504391A (ja) | 2003-02-04 |
BR0012624A (pt) | 2002-04-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5388395B2 (ja) | 脂質に被包された治療剤の製造方法 | |
US7094423B1 (en) | Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents | |
Jadhav et al. | Novel vesicular system: an overview | |
EP0792142B1 (en) | Fusogenic liposomes | |
Maurer et al. | Spontaneous entrapment of polynucleotides upon electrostatic interaction with ethanol-destabilized cationic liposomes | |
Kisak et al. | The vesosome-A multicompartment drug delivery vehicle | |
US7273620B1 (en) | Triggered release of liposomal drugs following mixing of cationic and anionic liposomes | |
US6673364B1 (en) | Liposome having an exchangeable component | |
Maheswaran et al. | Liposomal drug delivery systems—a review | |
US6991805B1 (en) | Temperature sensitive control of liposome-cell adhesion | |
WO2010095964A1 (en) | A method for amphiphilic drug loading in liposomes by ion gradient | |
Wasankar et al. | Liposome as a drug delivery system-a review | |
Xu et al. | Preparation and characterization of stable pH-sensitive vesicles composed of α-tocopherol hemisuccinate | |
Verma | Liposomes: a targeted drug delivery system-a review | |
Kaur et al. | A Sojourn on Liposomal Delivery System: Recent Advances and Future Prospects | |
Gol et al. | Nanocochleates: A novel approach for drug delivery | |
Kumar et al. | A REVIEW ARTICLE ON A NOVEL AND TARGETED DRUG DELIVERY SYSTEM IN FORM OF LIPOSOMES | |
PL226015B1 (pl) | Liposomowy preparat zawierajacy przeciwnowotworowa substancje aktywna, sposob jego wytwarzania i zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna | |
Leung | Biophysical characterization of lipid nanoparticles containing nucleic acid polymers as produced by microfluidic mixing | |
Kaushal et al. | A COMPREHENSIVE REVIEW: LIPOSOMAL DRUG DELIVERY SYSTEM | |
Sadhu et al. | Liposomes: As 12 | |
Verma et al. | Liposomes as carrier systems | |
Naaz et al. | International Journal of Modern Pharmaceutical Research | |
Hafez | Lipid polymorphism and intracellular delivery | |
Salunke et al. | NIOSOMES AS A TOOL FOR NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM: A REVIEW |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20060314 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070625 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100917 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20101214 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20101221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110317 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110408 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131008 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5388395 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |