JP2003504391A

JP2003504391A - 脂質に被包された治療剤の製造方法

Info

Publication number: JP2003504391A
Application number: JP2001510431A
Authority: JP
Inventors: モーラー、ノーバート; ウォン、キム、エフ; カリス、ピーター、アール
Original assignee: イネックスファーマスーティカルズコーポレイション
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2003-02-04
Anticipated expiration: 2020-07-14
Also published as: ES2235916T3; WO2001005373A9; EP1194122B1; AU771706B2; AU769357B2; IL147089A; WO2001005373A1; WO2001005374A1; CN1228041C; BR0012624B1; DE60017406D1; JP2011225618A; DE60017406T2; CA2378438C; CA2378430A1; ATE286719T1; JP5388395B2; AU6256200A; IL147089A0; BR0012624A

Abstract

(57)【要約】帯電した治療剤が脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化剤とを結合させて、不安定化溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成することによって調製される。該不安定化溶媒は、該予め形成された脂質小胞を崩壊することなく該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。前記の得られた混合物は、前記予め形成された脂質小胞の内部に前記治療剤を被包させるのに十分な時間の間、定温放置される。次いで、前記不安定化剤は除去されて、脂質で十分に被包された治療剤の粒子が生成される。前記の予め形成された脂質小胞は、前記帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、脂質で被包された（lipid-encapsulated）治療剤の粒子（とりわけ
、アンチセンス療法又は遺伝子治療に有用である、脂質で被包された治療用核酸
粒子）の新規な製造方法に関する。

【０００２】（発明の背景）治療剤用キャリヤとして脂質粒子を使用する概念は、多数の人々によって検討
されてきた。製剤は、脂質の外側に対する治療剤の錯形成反応（complexation;
錯化）、或いは治療剤の実際的閉じ込め（entrapment）に依存してきた。とはい
え、いずれのタイプの製剤を造る能力も、脂質粒子を造るために採用される方法
だけでなく、脂質及び治療剤の特性の適合性（matching）に左右される。治療剤
が閉じ込められた粒子の場合、閉じ込め方法は、受動的である（即ち、諸脂質粒
子は治療剤の存在下で組み立てられ、治療剤の幾らかは偶然に閉じ込められる）
か；又は能動的である（即ち、誘導されたある種の勾配の結果として、脂質粒子
の内側の中に、治療剤が引張られるか又は推し進められる）ことがある。脂質粒
子をキャリヤとして利用する努力が多く成されているにもかかわらず、脂質で閉
じ込められた治療剤を実際に適用することを制限する諸問題が残されている。こ
れら問題には、薬物／脂質の基部上への治療剤の取り込みレベルが低いこと；治
療剤を捕獲する効率が低いこと；及び脂質被包された治療剤の粒子を大規模に製
造するための適切な手段が欠如していること；が含まれる。

【０００３】脂質と治療剤の間にかなりの静電的相互作用が存在しており、脂質で十分に被
包された治療剤の粒子は、大規模には製造されてこなかった。基本的な問題は凝
集である。帯電した脂質を逆符号に帯電した治療剤と混合すると、通常、凝集が
生じ、治療に使用できないどころか、その後の処理加工に使用することができな
い乳白色の毛房状塊を含有する溶液が生じる結果となる。この凝集の問題は、非
常に有用である治療用組成物の開発を妨げてきた。

【０００４】帯電脂質及び逆符号に帯電した治療剤を用いたベンチスケール（bench scale;
卓上規模）の製剤は、バリー（Bally）等の米国特許第５，７０５，３８５号明
細書（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／４０９６４号明細書；米国特許出願シリアル番
号０８／４８４，２８２号明細書；同０８／４８５，４５８号明細書；同０８／
６６０，０２５号明細書；及び同０９／１４０，４７６号明細書も参照のこと）
並びにセンプル（Semple）等のＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／５１２７８号明細
書（米国特許出願シリアル番号０８／８５６，３７４号明細書も参照のこと）に
記述される受動的カプセル化方法で、カチオン性脂質及びアニオン核酸を使用し
てうまく達成された。これら米国特許及び特許出願は全て本発明の譲受人に譲渡
されている。また、これら明細書に言及することにより、それらの内容を本明細
書に組み入れる。更に、「ウィーラー（Wheeler）等：安定化されたプラスミド
−脂質の粒子（Stabilized plasmid-lipid particles），構造と特徴（Construc
tion and characterization），Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：２７１〜２８１（１９
９９）」も参照のこと。これらの技術では、ＰＥＧ−脂質、ＡＴＴＡ−脂質等の
凝集防止性脂質（同時係属出願の米国特許出願０８／９９６，７８３号明細書に
開示されている。この明細書に言及することにより、その内容を本明細書に組み
入れる）が採用されている。その凝集防止性脂質によって、複雑な凝集形成が効
果的に防止される。得られた、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、（３０
〜２５０ｎｍの範囲に）制御された大きさ；（例えば、ヌクレアーゼ抵抗によっ
て測定される）十分なカプセル化；血清中での安定性；等の優れた薬物特性を有
する。

【０００５】ＷＯ９８／５１２７８号明細書には、受動的閉じ込め（entrapment）を使用し
て、脂質被包された治療剤の粒子を調製するためのベンチスケール法が記述され
ている。この既知の方法には、脂質の水和工程及びリポソームのサイジング工程
という２つの基本工程が採用されている。脂質の水和工程では、カチオン性脂質
溶液（９５％ＥｔＯＨ溶媒）が、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．８）に入れたポ
リヌクレオチド治療剤の入っている容器の中に１滴ずつ撹拌されながら添加され
、ＥｔＯＨ４０％、脂質９．９ｍｇ／ｍｌ及びポリヌクレオチド２．０ｍｇ
／ｍｌの最終組成物となる。この水和工程から得られる脂質の粒子は、典型的に
は直径４００ｎｍ以上であって、治療に役立つものとして一般的に使用するには
大き過ぎる。このため、適切な大きさの脂質粒子を得るためには、高温押し出し
（６５℃で）、及び随意的には凍結融解（液体窒素から６５℃水浴まで）のよう
な、大規模な二次生成処理が必要である。これを使用したカプセル化の効率は、
回収される最終［薬物］：［脂質］比に関してはかなり高い（６０〜９０％）が
、最終粒子製剤の中に出発ポリヌクレオチドが取り込まれる絶対効率（absolute
efficiency）は、準最適である（２５〜４５％）。

【０００６】リポソームの分野で採用されている従来の諸方法を用いて、これらの粒子を商
業的に大規模に製造しても、効率よくは達成されない。「バンガン（Bangham）
，ＡＤ．等：カチオンに対するリン脂質構造の透過性に及ぼすステロイド及びス
トレプトリシンＳの影響（The action of steroid and streptolysin S on the
permeability of phospholipid structures to cations），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１３，１３８〜１４７（１９６５）」によってリポソームの調製方法が最初
に記述されて以来、リポソーム／薬物の製剤を製造することに関する多くの技術
が出現してきたにもかかわらず、これらの問題は存在する。

【０００７】脂質粒子を大規模に製造する既知技術は、次のカテゴリー：（１）脂質膜の水
和（即ち、受動的閉じ込め）；（２）逆相蒸発；（３）高圧押し出し；及び（４
）溶媒注入（希釈化）；に大きく分類することができる［例えば、マーチン（Ma
rtin）等の米国特許第４，７５２，４２５号明細書；同第４，７３７，３２３号
明細書を参照のこと］。当業界で開示されている、脂質粒子を製造するための詳
細な文書には、シュナイダー（Schneider）等の米国特許第５，２７０，０５３
号明細書、同第５，４６６，４６８号明細書；「アイゼル（Isele），Ｕ．等
：有機溶媒の制御希釈による単量体亜鉛フタロシアニンを含有するリポソームの
大規模製造（Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zin
c Phthalocyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents），Ｊ．Ｐｈ
ａｒｍａ．Ｓｃｉ．第８３巻（１１），１６０８〜１６１６（１９９４）」；
「クリフナー（Kriftner），ＲＷ．：リポソームの製造（Liposome Production
）（１９９２）」；「ブルアン−ファルコ（Bruan-Falco）等編集：エタノー
ル注入技術（The Ethanol Injection Technique），リポソーム誘導体（Liposom
e Derivatives），Berlin, Springer-Verlag, 第９１頁〜１００頁（１９９２）
」；「クレマー（Kremer）等：変形注入法により調製した可変直径の小胞（Ve
sicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method）,
生化学（Biochemistry）１６（１７）、３９３２〜３９３５（１９７７）」
；「バツリ（Batzri），Ｓ及びコーン（Korn），ＥＤ．：高周波分解なしで調
製した単二重層リポソーム（Single Bilayer Liposome Prepared Without Sonic
ation），Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２９８，１０１５〜１０１
９（１９７３）」；が包含される。

【０００８】上記に言及した諸方法又は諸文書のいずれも、上記バリー（Bally）等及び上
記センプル（Semple）等の優れた薬物特性を有する、帯電脂質及び逆に帯電した
治療剤から成る製剤のスケールアップには適していない。上記バリー（Bally）
等及び上記センプル（Semple）等に記述されている製造技術は、わずか１〜１０
０ｍｌのために開発されたものであり、扱い難く、しかも、大規模製造（即ち、
２０〜２００リットルの規模のもの）では維持できないほど非効率なものとなる
。本発明によって、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を大規模に調製する方
法であって、脂質及び治療剤が逆に帯電している該調製方法が初めて提供される
。これらの粒子は、治療用組成物として、また、試験等のために有用である。

【０００９】（発明の概要）本発明による、帯電した治療剤が脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予
め形成された脂質小胞、帯電した治療剤及び不安定化剤（destabilizing agent
）から成る脂質組成物を結合させて、予め形成された小胞と治療剤の混合物を不
安定化溶媒中で形成することによって調製する。不安定化溶媒は、予め形成され
た脂質小胞を崩壊することなく、該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である
。得られた混合物は、予め形成された脂質小胞の内部に、治療剤をカプセル封じ
（encapsulation）させるのに十分な時間の間、定温放置（incubate）する。次
いで、不安定化剤を除去して、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を得る。予
め形成された脂質小胞は、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と
、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する。修
飾脂質は、予め形成された小胞の凝集を遅らせるが妨げないのに有効な量で、予
め形成された小胞中に存在する。本発明の好ましい態様において、脂質粒子を大
規模（例えば、２０〜２００リットル）で効率的に形成するのに有効な、核酸（
例えば、アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド）を含有する治療剤溶液は
、エタノールの２５〜４０％水溶液に入れた予め形成された脂質小胞と結合させ
る。脂質で十分に被包された治療剤の粒子が自然発生的に製造される結果となる
には、この混合物を約１時間の間、定温放置すれば十分である。

【００１０】（発明の詳細な説明）（定義）本出願書類で使用する用語は、当業者に理解される通常の意味に解釈されるよ
うに意図されているが、幾つかの用語については、いかなる不明確さをも避ける
ために明確に定義する。従って、本出願の明細書（及び特許請求の範囲）におい
て使用する用語：「帯電脂質（charged lipid）」は、カチオン電荷若しくは負電荷を有する脂
質種、又は、正味中和していない、両性イオンである脂質種のことを言い、概し
て、その脂質が見出される溶液のｐＨを参照する必要がある。

【００１１】「不安定化（destabilization）」は、脂質膜が溶媒と相互作用する結果とし
ての、脂質膜の特性の変化を言う。脂質膜が不安定化するとき、初期の脂質膜の
基本形態は維持されている。しかし、低分子量の溶質の漏れ速度が増大し、脂質
はその脂質膜を横切って「フリップ・フロップし（flip-flop）」、急速に他の
脂質粒子に変化し得る。本発明における脂質膜の不安定化は、例えば、２５〜４
０％のエタノール濃度で観察される。本明細書では、脂質小胞を不安定化させる
が崩壊はさせない溶媒を、不安定化性溶媒（destabilizing solvents）と呼ぶ。「崩壊（disruption）」は、初期の脂質膜の基本形態が喪失する程度に、脂質
膜の性質が変成することを言う。脂質膜の崩壊は、例えば、６０％を越えるエタ
ノール濃度で観察される。

【００１２】「十分に被包された（fully encapsulated; 十分にカプセルに包まれた）」は
、脂質粒子であってそこでは治療剤がリポソーム等の脂質小胞の内腔（lumen）
の中に入っているか又は脂質粒子の二重層の内部に埋め込まれていて、治療剤の
いかなる部分も脂質粒子を取り囲む外部媒体に直接接近することができない該脂
質粒子を言う。脂質粒子であってそこでは治療剤が十分に被包されている該脂質
粒子は、粒子であってそこでは治療剤が（例えば、イオン的相互作用によって）
その脂質粒子の外部と複合体を形成している該粒子、或いは、粒子であってそこ
では治療剤が部分的に脂質内に埋め込まれ、また部分的に外部媒体にさらされて
いる該粒子とは全く異なる。被包（encapsulation; カプセル化; カプセル封じ
）の程度は、入手可能な治療剤を劣化させる諸方法を用いて、決定することがで
きる。ポリヌクレオチドの場合、これらの方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化（Nu
clease Digestion）、血清ヌクレアーゼ（Serum Nuclease）、及び小球菌ヌクレ
アーゼ（Micrococcal Nuclease）分析法が包含される。もう１つの方法として、
オリグリーン（OliGreen）（登録商標）検定法を採用することができる。定量的
な意味において、「十分に被包された」治療剤は、治療剤の９０％より多い量が
自由形態（free form; 拘束されていない形態）で劣化するという条件下で、脂
質粒子中における治療剤の１０％未満（好ましくは治療剤の５％未満）が劣化す
る治療剤である。更に、本発明から逸脱することなく、十分には被包されていな
い１種以上の追加治療剤を、錯形成反応（complexation）又は別のやり方で、そ
の脂質粒子と結合させることができる。

【００１３】「水和（hydration）」は、脂質粒子（リポソームを包含する）を形成する一
般的プロセスを言う。このプロセスにおいて、脂質を取り囲む溶媒中の水の量は
、約５％未満の濃度（この濃度で脂質分子は、通常、個々に溶媒和されている）
から４０〜６０％以上の濃度（この濃度で脂質は、自発的に膜、ミセル又は粒子
の形を取る）まで増加する。「脂質（lipid）」は、脂肪酸のエステルであって水には溶けないが多くの有
機溶媒には溶けることを特徴とする諸有機化合物の群を言う。それらは通常、少
なくとも３つの種類：（１）ワックスの他に油脂を包含する「単純脂質」；（２
）リン脂質及び糖脂質を包含する「複合脂質」；並びに、（３）ステロイド等の
「誘導脂質」；に分けられる。多種多様の脂質が本発明に使用することができ、
それらの幾つかを下記に説明する。

【００１４】「予め形成された小胞」（preformed vesicle）」は、本発明の方法で使用さ
れる出発脂質組成物を言い、脂質小胞が包含される。これら小胞は、概して球形
又は卵形の自己閉鎖構造（self-closed structure）を有する。この自己閉鎖構
造は、１つ以上の脂質層から形成され、また、溶媒の一部を含有する内腔（inte
rior lumen）を有する。これら小胞は、単層構造、少層構造（oligolamellar st
ructure）又は多重膜構造である場合がある。

【００１５】本明細書に開示する発明は、脂質で被包された治療剤の粒子を造るするための
新規な方法であって、とりわけ、カチオン性脂質及びアニオンポリヌクレオチド
を形成するときに見られるように、脂質及び治療剤が逆に帯電している場合、そ
のような諸粒子の大規模製造に適用することのできる該方法に関する。本発明は
、予め形成された脂質小胞を治療剤の溶液と混ぜ合わせれば、結果的に、治療上
有用な粒度の、脂質で十分に被包された治療剤が自発的に形成され得るという予
期されない驚くべき観察結果に依る。従って、脂質で十分に被包された治療剤の
粒子は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と治療剤の溶液とを混合
し、次いで、前記脂質小胞中に前記治療剤を被包するの時間の間、前記の得られ
た混合物を定温放置する諸工程を含む方法による本発明に従って形成される。脂
質成分は、小胞を破壊することなく、脂質の膜を不安定化するのに有効な溶媒系
を更に含有する。

【００１６】本発明の方法は、該方法を当業界にとって実質的に有用であるようにする幾つ
かの重要な特徴を有する。第１に、該方法は、単一バッチ中における被包済み治
療剤のかなりの量（例えば、１００ｇを超える量）を製造するのに使用すること
のできる大規模な方法である。第２に、治療剤を導入して、治療する上で有用な
粒度の粒子を得た後に脂質粒子を処理することが必要でないようなやり方で、予
め形成された脂質小胞の粒度は実質的に維持される。第３に、被包の効率は高い
。第４に、粒子の中に負荷される治療剤の量は多い。

【００１７】本発明で使用される脂質粒子は、少なくとも（１）治療剤の電荷と反対の実効
電荷を有する帯電脂質；及び（２）凝集を制限するのに有用な、ポリエチレング
リコール置換基等の変性剤を含有する修飾脂質；を包含する幾つかの種類の脂質
を組み合わせることによって形成される。加えて、製剤には、中性脂質又はステ
ロールが含有されることがある。上述の全ての成分を用いて脂質粒子を配合する
場合、次の量の各脂質成分：帯電脂質１０〜４０モル％；中性脂質２５〜４０
モル％；ステロール３５〜５５モル％；及び修飾脂質０．５〜１５モル％；を
使用するのが適切である。特定の脂質諸成分は、次の非制限的諸例の中から選定
することができる。

【００１８】帯電脂質生理的ｐＨでカチオンに帯電した脂質は、Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチ
ルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）
プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ
,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ
−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウ
ムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタ
ン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１,２−ジ
ミリスチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）（N-（1,2-dimyristyloxyprop-3-yl）
-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide）；を包含するが、それらに
限定されない。更に、本発明で使用することができる多数のカチオン性脂質製剤
が、市販されている。これら製剤には、例えば、リポフェクチン（Lipofectin）
（登録商標）［米国ニューヨーク州、グランドアイランド、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ
からの、ＤＯＴＭＡと、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ）とを含有する、市販のカチオンリポソーム］；リポフェクタミ
ン（Lipofectamine）（登録商標）［ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、Ｎ−（１−（
２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド
）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰ
Ａ）と、ＤＯＰＥとを含有する、市販のカチオンリポソーム］；及び、トランス
フェクタム（Transfectam）（登録商標）［米国ウィスコンシン州、プロメガ社
（Promega Corp.）からの、エタノールに入ったジオクタデシルアミドグリシル
カルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含有する、市販のカチオン性脂質］；が包
含される。

【００１９】幾つかのカチオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質
は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではカ
チオン性が強く、生理的ｐＨではカチオン性が弱い（又はカチオンではない）と
いう、本発明にとって重要な結果を与える。そのようなカチオン帯電脂質は、Ｎ
−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリ
ド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパ
ン（ＤＯＤＡＰ）を包含するが、それらに限定されない。

【００２０】生理的ｐＨでのアニオン性帯電脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスフ
ァチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファ
チジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノール
アミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチ
ジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイ
ルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール
、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジ
ルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等を
包含するが、それらに限定されない。

【００２１】幾つかのアニオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質
は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではア
ニオン性が強く、生理的ｐＨではアニオン性が弱い（又はアニオンではない）と
いう、本発明にとって重要な結果を与える。当業者は、本明細書に開示する原理
に基づいて、そのようなアニオン帯電脂質を認識することができる。

【００２２】中性脂質及びステロール用語「中性脂質（neutral lipid）」は、生理的ｐＨにおいて非荷電形態又は
両性イオン形態で存在する多くの脂質種のあらゆる物を言う。そのような脂質に
は、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノー
ルアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレ
ブドシド及びジアシルグリセロールが包含される。

【００２３】修飾脂質本発明で使用される好ましい製剤の中には、ＰＥＧ−脂質、ポリアミドオリゴ
マー−脂質（例えば、ＡＴＴＡ−脂質）等の凝集防止性脂質、及び立体障壁又は
「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」−脂質を含有するものが幾つかある。そのよう
な諸脂質は、シアーズ（Sears）の米国特許第４，３２０，１２１号明細書；チ
ョウイ（Choi）等の米国特許第５，８２０，８７３号明細書；ホランド（Hollan
d）等の米国特許第５，８８５，６１３号明細書；ＷＯ９８／５１２７８［発明
者センプル（Semple）等］；及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願
シリアルＮｏ．０９／２１８９８８号明細書；に記述されている。これらは全て
、言及することによって、本願明細書に組み入れる。これらの脂質は、逆に帯電
した脂質と治療剤とを含有する製剤が沈降したり、凝集するのを防止する。これ
らの脂質はまた、生体内における循環寿命（circulation lifetime）を改善する
のに使用することができる［クリバノフ（Klibanov）等：ＦＥＢＳＬｅｔｔｅ
ｒｓ，２６８（１），２３５〜２３７（１９９０）を参照］か、又は、それら脂
質は、生体内で製剤から外れて迅速に交換されるように選定することができる（
米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照）。とりわけ有用な交換性脂質は
、一層短いアクリル鎖を有するＰＥＧ−セラミド（即ち、Ｃ１４若しくはＣ１８
、本明細書ではＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８と称する）、又
はＣ１４アクリル鎖を有するＰＥＧ−ＰＥである。

【００２４】幾つかの脂質粒子製剤は、ある種の標的細胞又は標的組織でリポソームの局在
化（localization）を助長するように設計されたターゲッティング成分（target
ing moieties）を有することがある。ターゲッティング成分は、調製の間か又は
調製の後、脂質粒子の外部二重層に連結させることができる。これらの方法は、
当業界では周知である。加えて、幾つかの脂質粒子製剤は、ＰＥＡＡ等のフソジ
ェニックポリマー（fusogenic polymers）；血球凝集素；他のリポペプチド（米
国特許出願シリアルＮｏ．０８／８３５，２８１号明細書、及び同６０／０８３
，２９４号明細書を参照。これら明細書は、言及することによって本明細書に組
み入れる）；並びに、生体内及び／又は細胞内運搬（intracellular delivery）
のために有用な他の特徴；を使用することができる。

【００２５】予め形成された脂質小胞は、エタノール又は他の有機溶媒の溶液中、単一脂質
水和工程を用いて調製することができる。エタノール又は他の有機溶媒の割合は
、脂質粒子がその溶媒（通常、６０％を超える量のエタノール）の中に分解もさ
れず再融解もされないが、本発明の自発的被包化プロセスを可能にする条件（エ
タノール約５％〜５０％、一層好ましくはエタノール２５〜４０％）を与える
ようなやり方で、選定しなければならない。別の方法として、膜の不安定化に寄
与する、洗剤等の追加配合剤を、脂質小胞の溶液中に含有させることができる。
本明細のために、「有機溶媒（organic solvent）」は、完全に有機の溶媒（即
ち、１００％エタノール）か、又は部分的に有機の溶媒（例えば、水中のエタノ
ール等、即ち、２０％エタノール、４０％エタノール等）を意味する。エタノー
ル又は他のアルコール類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、
アセトン、他のケトン類、その他同種類のものを包含する、多種多様の水混和性
有機溶媒を使用することができる。一層大きい極性又は一層小さい極性を有する
溶媒が有用な場合もある。洗剤溶液には、β−Ｄ−グルコピラノシド；トウィー
ン（Tween）２０；ＷＯ９６／４０９６４号明細書及び米国特許出願シリアル
Ｎｏ．０９／１６９５７３号明細書（これら両方の明細書は、言及することによ
って本明細書に組み入れる）に開示されているもの；並びに、逆に帯電した脂質
及び治療剤を混合する間、粒子の凝集を防止することができるところの、及び／
又は、同じ溶解度の特徴を与えることができるところの、他のあらゆる洗剤若し
くは立体障壁化合物；が包含される。全ての有機溶媒又は洗剤溶液は、配合プロ
セスによって患者への投与が妨げられないように、薬学的に痕跡量又はそれ以上
の量で許容され得るのが好ましい。

【００２６】アニオン性治療剤には、実質的に負の電荷を有するか；又は、該治療剤の他の
カチオン電荷の基によって妨げられることなくカチオン性脂質と相互作用をする
ことのできる、負に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのよ
うな治療剤には、オリゴヌクレオチド；核酸；（タンパク質−核酸等を包含する
）変性核酸；負の電荷の基を有するペプチド及びタンパク質；植物アルカロイド
等の従来の薬物；並びに、負の電荷の基を有する類似体；等（しかし、それらに
限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する、既知の又は潜在的な治療
剤のいかなる物も包含される。本質的にアニオン性でない諸治療剤は、本発明で
容易に使用するためにアニオン基で誘導してもよい。例えば、パクリタキセルは
、その２’炭素に結合したポリグルタミン酸基で誘導することができる。

【００２７】カチオン性治療剤には、実質的に正の電荷を有するか；又は、該治療剤の他の
負電荷の基によって妨げられることなく負の脂質と相互作用をすることのできる
、正に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのような治療剤に
は、カチオン電荷に結合した修飾核酸；正の電荷の基を有するペプチド及びタン
パク質；植物アルカロイド等の従来の薬物；並びに、正の電荷の基を有する類似
体；等（しかし、それらに限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する
、既知の又は潜在的な治療剤のいかなる物も包含される。本質的にカチオン性で
ない諸治療剤は、本発明で容易に使用するためにカチオン基で誘導してもよい。

【００２８】帯電した諸治療剤は典型的には当初、通常、ある量のエタノール又は他の有機
溶媒を含有する緩衝水溶液に入れる。塩濃度は、本発明で使用する自己集合プロ
セス(self assembly process)（米国特許出願シリアルＮｏ．０９／１６９５７
３号明細書；これに言及することにより本明細書に組み入れる）に強い影響を及
ぼす場合があるので、使用する緩衝塩は注意深く選定しなければならない。更に
、全ての緩衝液は、微量が最終製剤に残存することがあるため、薬学的に受け入
れられなければならない。適切な緩衝液は、ホスホロチオエート型オリゴデオキ
シヌクレオチドに対しては３００ｍＭクエン酸塩緩衝液である。一層小さい結合
親和性(binding affinities)を有する、ホスホジエステルベースのオリゴデオキ
シヌクレオチド及びプラスミドＤＮＡに対しては、イオン強度が一層小さい緩衝
液が適切である。例えば、典型的なクエン酸塩濃度は２５〜１５０ｍＭであり、
最大の閉じ込めが生じるのは約５０ｍＭである。エタノール、又は含有されるこ
ともある他の有機溶媒は、水性有機混合物中の治療剤の溶解度によって制御され
るし、また、治療剤と予め形成された脂質小胞との最終混合物の望ましい特性に
よっても制御される。

【００２９】脂質、不安定化溶媒及び治療剤は、一緒に作用して、脂質で十分に被包された
組成物が提供されるように選定する。従って、もし治療剤がポリアニオン性オリ
ゴヌクレオチドであるならば、脂質成分は、安定化溶媒中の諸条件下でカチオン
性である脂質を含有するように選定する。逆に、もし治療剤がカチオン性である
ならば、脂質成分は、不安定化溶媒中の諸条件下でアニオン性である脂質を含有
するように選定すべきである。このことは、脂質溶液中に含有される全ての脂質
が帯電していなければならないことも、幾らかの量の、同様に帯電している脂質
若しくは両性イオン性脂質の取り込みを排除することも意味していない。上記の
ことは単に、脂質溶液が、治療剤の実効電荷と反対の実効電荷を有する脂質を持
っていなければならないことを意味する。

【００３０】本発明の方法では、脂質粒子及び治療剤の比較的希薄な溶液を使用する。治療
剤溶液は通常、治療剤１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／
ｍｌの濃度を持ち、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／ｍｌの範
囲の（予め形成された脂質小胞と混合した後の）最終濃度を生じる。予め形成さ
れた脂質小胞は治療剤溶液と混合して、（治療剤溶液と混合した後の）得られた
脂質濃度が約１．５〜３０ｍｇ／ｍｌ（約２〜４０ｍＭ）、好ましくは１０ｍｇ
／ｍｌとなるようにする。ポリヌクレオチド治療剤と共に使用する予め形成され
た小胞の好ましい組成物は、標準的脂質比［ＰＥＧ−ｃｅｒＣ14：ＤＯＤＡＰ：
ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（モル比５：２５：２５：４５）］で造られる。この溶液
は、１００％エタノールに入れ、水性緩衝液（例えば、ｐＨ４．０の３００ｍ
Ｍクエン酸塩）と混合することによって、エタノール５〜５０％（好ましくはエ
タノール４０％）に希釈する。

【００３１】被包化は、脂質溶液とオリゴヌクレオチド溶液とを一緒に十分に混合されるま
で撹拌し；次いで、全く混合しないで、或いは約１〜２時間の間、穏かに混合し
て、定温放置する；ときに生じる。次いで、得られた溶液を透析して、エタノー
ル；又は脂質粒子の膜を不安定にする他の物質；を取り除く。粒子の外部と複合
体を形成するかも知れない治療剤を解放するために、（帯電脂質が滴定可能であ
る場合）ｐＨを調整し、表面電荷を中性化することもある。

【００３２】本発明の方法によると、定温放置工程の終りに、自発的に形成され、十分に被
包された治療剤の粒子であって、治療用途に受け入れられ；且つ、予め形成され
た脂質小胞の出発サイドに基づいて予測することのできる；粒度を有する該粒子
が生じることとなる。従って、当業者に知られているタイプの分粒工程(sizing
step)は通常、必要でない。このことは好都合である。なぜなら、治療剤を取り
込んだ後、脂質小胞に対して何ら機械的応力を加える必要がなく；また、治療剤
を減損させる危険性も、治療剤を損傷させる危険性も全くないからである。生成
物粒子を更に分粒することが望まれるなら、得られた脂質粒子を分流するための
随意的工程を採用することができる。また、分粒工程は、望ましい粒度の出発小
胞を得るために、治療剤を導入する前の予め形成された小胞を調製する工程の一
部として、採用することができる。

【００３３】脂質粒子を分粒するための方法は幾つかあり、通常、これらの方法のいずれも
、分粒することが本発明の一部として使用されるとき、採用することができる。
押し出し(extrusion)方法は、リポソームを分流するための好ましい方法である
。「ホープ(Hope)，ＭＪ等：押し出しによるリポソーム粒度の減縮及び単層小胞
の調製(Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicle
s by Extrusion Techniques)，Ｉｎ：ＬｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（Ｇ．，グレゴリアディス(Gregoriadis)，編集）」を参照。この方法は、小孔
ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通過させてリポソームを押し出
し、リポソーム粒度を小さくして比較的明確な粒度分布にすることから成る。典
型的には、リポソームの望ましい粒度分布が達成されるまで、懸濁液をその膜に
１回以上循環させる。リポソームは、リポソーム粒度を漸進的に小さくするため
に、孔が逐次的に小さくなって孔膜を通過させて押し出すことができる。

【００３４】リポソーム［サイジング・リポソーム(sizing reposomes)］の母集団の粒度を
小さくするためには、当業者に知られている種々の代替的方法を利用することが
できる。１つの分粒方法は、米国特許第４，７３７，３２３号明細書に記述され
ており、その明細書は言及することにより本明細書に組み入れる。浴超音波分解
若しくはプローブ超音波分解によりリポソーム懸濁液を超音波処理することによ
って、粒度を漸進的に小さくし、直径が約０．０５μｍ未満の小さい単層小胞に
する。均質化(homogenization)はもう１つの方法である。この方法は、大きいリ
ポソームを崩壊させて一層小さいリポソームにするためのエネルギーを奪い取る
ことに依る。典型的な均質化において、多重膜小胞は、選定したリポソーム粒度
（典型的には、約０．１〜０．５μｍ）が観測されるまで、標準エマルション・
ホモジェナイザー(standard emulsion homogenizer)を通して再循環させる。リ
ポソーム小胞の粒度は、「Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０，４２１〜４５０（１９８１）」に記述されるよう
に、準電光散乱(quasi-electric light scattering)（ＱＥＬＳ）によって決定
することができる。リポソームの平均直径は、形成されたリポソームの超音波分
解により小さくすることができる。断続的超音波分解サイクルは、ＱＥＬＳ評価
と交互に入れ替えて、能率的なリポソーム合成を導くことができる。

【００３５】種々のリポソーム分粒方法によって造られたリポソームの好ましい粒度は、あ
る程度、リポソームが造られている用途に左右されるが、通常、２５〜２５０ｎ
ｍの範囲内となる。適切な粒度の具体的な諸例は、以下の諸例に開示する。本発明により造られる脂質粒子の研究において、中空の大きい単層膜小胞（Ｌ
ＵＶ）は、閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞に転化されるということが
、意外なことに発見された。いかなる特定の機構に縛られる意図はないが、生じ
ているプロセスは、図１に示されるようなものであって、カチオンに帯電した脂
質と、アニオン性治療剤とが想定される。そのプロセスは、単層小胞１０で出発
する。単層小胞１０は、カチオン性脂質を含有する結果として、二重層壁の内側
表面及び外側表面に正の表面電荷を有する。アンチセンス・オリゴヌクレオチド
１１等のアニオン性治療剤を添加することによって、中間複合体１２が形成され
ることとなる。中間複合体１２において、治療剤の分子１１は、イオン機構／静
電気機構によって、ＬＵＶの表面上で、逆に帯電した脂質に結合されている。

【００３６】このプロセスの次工程は、凝集工程であると思われる。凝集工程において、Ｌ
ＵＶ／治療剤の複合体の凝集体１３が形成される。この凝集工程は非常に複雑で
あり、帯電した治療剤によって影響されるだけでなく；外見上、不安定化剤（例
えば、エタノール）の量、及び予め形成された小胞中の変性脂質の量に依存して
いるようである。これらの諸プロセスに関するある種の限定された知識は、当業
者に提供されているが、本発明のベースとなっている現象を当業者は、予測する
ことも説明することもできない。カチオン性のリポソーム／ＤＮＡ複合体は、接
触領域の平らな二重層隔膜を有する凝集したリポソームのクラスター(clusters)
；ＤＮＡで被覆されたリポソーム；及び、（凝集した）多重膜構造であって、脂
質の二重層の間にＤＮＡが挟まれている該構造；を包含する多種多様の異なった
構造を示すことが知られている［グスタフソン(Gustafsson)等，１９９５；ラシ
ク(Lasic)，１９９７；ラシク等，１９９７；ヒューブナー(Huebner)等，１９９
９；シュ(Xu)等，１９９９］。後者の構造は、二重層又はリポソームを平らに積
み重ねたものであり、それら構造の外部表面にはしばしば、開放二重層セグメン
トを示す。類似の諸構造は、負に帯電したリポソームにＣａ²⁺が結合した後で観
察されてきた［パパハドジョポーロス(Papahadjopoulos)，１９７５；ミラー(Mi
ller)及びダール(Dahl)，１９８２；ランド(Rand)等，１９８５；カカール(Kach
ar)等，１９８６］。これらの系で構造変形が生じることは、二重層の破壊及び
融合のような、接着媒介プロセスの結果であると考えられた［ランド(Rand)等，
１９８５；カカール(Kachar)等，１９８６；ヒューブナー(Huebner)等，１９９
９］。第１に、リポソームは、ＤＮＡ又はＣａ²⁺によって架橋して凝集する。接
触領域の急速な広がりは、諸リポソームが互いに平らになるように変形する。こ
のために、二重層は増大した張力下に置かれる。もし張力（接着エネルギー）が
十分に大きいならば、脂質膜上にかかる応力は、融合（面積／体積比の増大）及
び／又は破壊（体積損）によって取り除かれる。面積が約３％だけ増大したとき
、大抵の二重層は破壊する［エバンズ(Evans)及びパルセジアン(Parsegian)，１
９８３］。二重層が破壊するとき、小胞は互いに平らになって崩壊し、多重膜の
積み重なったもの(stacks)を形成する。エタノール等の膜不安定化剤は、カチオ
ン性リポソームが、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドと相互作用を起こすとき、構
造の再配列が生じるのを調整することができる。

【００３７】本発明の方法において、エタノールの存在下で単層小胞から多重膜リポソーム
が形成されることはまた、それらの形成のための接着媒介プロセス(adhesion-me
diated process)の証拠となる。しかし、この場合の生成物は同心二重層殻であ
るため、そのプロセスは、ある点で、終端膜(terminated membranes)を有する複
合体と相違する。後者の諸構造を形成するためには、エタノール又は類似の不安
定化剤が必要であるが、これらの構造の再配列がどのように影響を受けるのかは
っきりしていない。これらの再配列は、脂質のフリップ・フロップ（これは、ア
ルコール濃度と相関がある）だけでなく；一層小さい諸分子に対する膜透過性障
壁の損失、及び迅速な脂質交換とも相関がある。加えて、ＬＵＶから変性脂質を
交換することは、脂質小胞の再組織化にとって重要な因子である。いずれにして
も、ある種の機構によって、凝集体１３は再配列して、薄層間及び小胞の内部に
閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞１４を形成する。この再配列は、形成
される凝集体の性質だけでなく、凝集体が定温放置される温度にも左右される。
治療剤の中には、多重膜小胞の外部の電荷と結合したままであるものがある。こ
れらは、電荷の中和(neutralization)（例えば、滴定可能な帯電済み脂質の場合
は、酸若しくは塩基を用いて）、又はイオン交換によって取り除くことができる
。

【００３８】脂質小胞及び不安定化溶媒の幾つかの特性は、最終生成物の特性に重要であり
；また、これらの諸特性の選定は、生成物の多重膜小胞の特性を制御するのに使
用することができる；ことが実験によって見出された。これらの諸特性には、（１）予め形成された脂質小胞中に、治療剤の電荷と逆の電荷を有する帯電脂
質が含有されていること；（２）凝集を遅らせるには十分な量であるが、凝集を妨げるには十分でない量
で、修飾脂質が含有されていること。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄の場合、その量は、約
２．５〜１０％であることが分かった；（３）不安定溶媒中に、（例えば、エタノール、洗剤等の）不安定剤が、予め
形成された脂質小胞を不安定にするがそれら予め形成された脂質小胞を崩壊しな
い量で含有されていること；及び（４）凝集工程及び閉じ込め工程が減結合しない(decoupled)温度で、脂質で
十分に被包された治療剤の粒子の集合体を予め形成すること。通常、これは、室
温（〜２０^oＣ）以上の温度範囲で操作する必要があり、この温度範囲は不安定
剤の濃度及び脂質の組成に左右される；が包含される。

【００３９】本発明の方法は、従来の混合装置を用いて実施することができる。しかし、大
規模製造のためには、同時に出願されたＰＣＴ出願［主題：脂質小胞を調製する
ための方法と装置(Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles
)；シリアル番号はまだ与えられていない；出願日：２０００年７月１４日；代
理人生理番号：８０４７２−６］に記載されている、特別に適合した装置を使用
することが望ましい。その明細書は、言及することによって本明細書に組み入れ
る。さて、本発明の方法は、次の非限定的諸例に言及して、更に説明される。

【００４０】例次の諸例で使用する諸物質は次のように供給される：この研究で使用した、ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴデオキシヌ
クレオチド及びプラスミドＤＮＡは、イネックス製薬（Inex Pharmaceuticals）
（バーナビー（Burnaby），ＢＣ，カナダ）によって提供された。オリゴヌクレ
オチドのｍＲＮＡ標的及び配列は次の通りである：ヒトｃ−ｍｙｃ，５’−ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’（配列ＩＤ
番号１）；ヒトＩＣＡＭ−１，５’−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡ−３’
（配列ＩＤ番号２）；及びＦＩＴＣ−標識ヒトＥＧＦＲ，５’−ＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣ−３’
（配列ＩＤ番号３）。

【００４１】１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は
、ノーザン・リピッズ（Northern Lipids）（バンクーバー（Vancouver），ＢＣ
，カナダ）から購入した。また、１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニ
ウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホセリン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−４−イ
ル）（ＮＢＤ−ＰＳ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンｂスルホニル）[1,2-diol
eoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-（lissamine rhodamine b sulfonyl
）]（ＬＲｈ−ＰＥ）；及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−
４−イル）（ＮＢＤ−ＰＥ）；は、アバンチ・ポーラー・リピッヅ（Avanti Pol
ar Lipids）（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。１−ヘキサデカノイ
ル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン[1-Hex
adecanoyl-2-（1-pyrenedecanoyl）-sn-glycero-3-phosphocholine]（Ｐｙ-ＨＰ
Ｃ）；及びオリゴヌクレオチド−結合染料オリグリーン[oligonucleotide-bindi
ng dye OliGreen]は、モレキュラ・プローブズ（Molecular Probes）（Ｅｕｇｅ
ｎｅ，ＯＲ）から入手した。１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレン−グ
リコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイルスフィンゴシン（ＰＥＧ-Ｃ
ｅｒＣ₁₄）；放射能標識［³Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄；及び１−Ｏ−（２’−
（ω−メトキシポリエチレン−グリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ドデカノ
イルスフィンゴシン（ＰＥＧ-ＣｅｒＣ₂₀）；は、ＩＮＥＸファルマシューティ
カルズ（Pharmaceuticals）（Ｂｕｒｎａｂｙ，ＢＣ，カナダ）によって提供さ
れた。コレステロール（chol）；ｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｏ
ＧＰ）；トリトン（Triton）Ｘ−１００；カルセイン；ジクロロジメチルシラ
ン；ヒドロ亜硫酸ナトリウム（亜ジチオン酸塩）；２−ｐ−トルイジニルナフタ
レン−６−スルホネート（ＴＮＳ）；ポリアネトールスルホン酸（ＰＡＳＡ）；
は、シグマ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，カナダ）から入手した。四酸化オスミウ
ム；クエン酸鉛；マレイン酸；カコジル酸ナトリウム；及び埋め込み樹脂Ｅｍｂ
ｅｄ８１２；は、エレクトロン・マイクロスコープ・サイエンシズ（Electron
Microscopy Sciences）（フォートワシントン（Fort Washington），ＰＡ）か
ら購入し、また、低融点（Ｌ．Ｍ．Ｐ）アガロースは、ライフ・テクノロジーズ
（Life Technologies）（Ｂｕｒｌｉｎｔｏｎ，オンタリオ）から購入した。コ
レステロール（ＣＨＯＬ）は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical
Company）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズリー州，米国）から購入した。ＰＥＧ−セ
ラミドは、ＰＣＴＷＯ９６／４０９６４号明細書（この明細書は、言及するこ
とによって本明細書に組み入れる）記述されている手順を用いながら、イネック
ス・ファルマシューティカルズ社（Inex Pharmaceuticals Corp.）のチャオ・ワ
ング（Zhao Wang）博士が合成した。［³Ｈ］又は［¹⁴Ｃ］−ＣＨＥは、ＮＥＮ（
米国マサチューセッツ州、ボストン）から購入した。脂質は全て、９９％を越え
る純度であった。エタノール（９５％）、メタノール、クロロホルム、クエン酸
、ＨＥＰＥＳ及びＮａＣｌは全て、商業的供給業者から購入した。

【００４２】分析方法：脂質−治療剤が「十分に被包」されているように「被包」され
ているかどうかを決定するために使用した分析方法は、ＷＯ９８／５１２７８
号明細書に開示されている（その明細書は、言及することによって本明細書に組
み入れる）。そのような方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化、血清ヌクレアーゼ、
及び小球菌ヌクレアーゼ分析法が包含される。

【００４３】オリグリーン（Oligreen）分析は、小胞の中に負荷されたオリゴヌクレオチド
を定量するのに使用した。水溶液中の１本鎖オリゴヌクレオチドを定量するため
の蛍光染料結合分析（fluorescent dye binding assay）は、ビオルミン（Biolu
min）（登録商標）９６０蛍光プレート・リーダー［米国カリフォルニア州サニ
ーベール、モレキュラー・ダイナミックス（Molecular Dynamics）］を用いて確
立した。手短に言えば、被包済みオリゴヌクレオチドのアリコートは、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ；２０ｍＭＨＥＰＥＳ，１４５ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ
７．５）で希釈した。希釈率１：２００のオリグリーン（Oligreen）（登録商標
）試薬の１００μリットル［トリトン（Triton）Ｘ−１００洗剤０．１％を含
有するものと含有しないものの両方］に、希釈試料の１０μリットルアリコート
を添加した。被包済みオリゴを定量するため、トリトンＸ−１００洗剤０．１
％を含有するものと含有しないものを用いて、オリゴ標準曲線を作成した。オリ
グリーン（Oligreen）（登録商標）−アンチセンス複合体の蛍光性（fluorescen
ce）は、４８５ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を用いて測定した。表
面関連アンチセンス（surface associated antisense）は、洗剤の不存在下及び
存在下の蛍光測定値を比較することによって決定した。

【００４４】動的光散乱（dynamic light scattering）：粒度は、ＮＩＣＯＭＰ３７０粒
度測定器［カリフォルニア州サンタバーバラ、ニコン・パーティクル・サイジン
グ社（Nicomp Particle Sizing Inc.）］を用いて、動的光散乱によって決定し
た。本出願書類全体に渡り、実験による相関関数からのキュムラント適合度（cu
mulant fit）によって得られた数平均粒度（number-averaged sizes）が与えら
れている。多分散性（polydispersity）は、モノモードガウス粒度分布（monomo
dal Gaussian size distribution）の半値高さ半値幅（half-width at half-hei
ght）として表わす。エタノール／クエン酸塩緩衝液の粘度は、ウベローデ型粘
度計［キャノン（Cannon）５０］を用いて決定した。２３℃の水と比較して測
定した、同一温度のエタノール／３００ｍＭクエン酸塩緩衝液［４０／６０（ｖ
／ｖ）］の粘度は、２．６７４ｍＰａ*ｓであることが分かった。ゼータ電位は
、クールター（Coulter）光散乱計器［ＤＥＬＳＡ，クールター電子社（Coulter
Electronics Inc.），ＦＬ］を用いた、電気泳動光散乱によって決定した。

【００４５】脂質のフリップ・フロップ（flip-flop）：脂質のフリップ・フロップは、
亜ジチオン酸ナトリウムを用いて［マッキンタイヤ（McIntyre）及びスレイト（
Sleight）（１９９１）；レンツ（Lentz）等（１９９７）］、蛍光脂質、ＮＢＤ
−ＰＳを、非蛍光化合物まで化学還元することによって決定した。リポソームは
、２０ｍＭ脂質で、１モル％ＮＢＤ−ＰＳの存在下、押し出すことによって調
製した。外部単一層に位置するＮＢＤ−ＰＳのみが、外部媒体に添加された還元
剤（亜ジチオン酸塩）に接近することができる。内部単一層から外部単一層まで
のそれの再分配は、外部膜のリーフレット（leaflet）中でＮＢＤ−ＰＳが還元
された後、生じる。１モルの亜ジチオン酸ナトリウムを、１モルのＴＲＩＳで新
たに調製した。外部単一層中のＮＢＤ−ＰＳは、ＮＢＤに応じた亜ジチオン酸ナ
トリウムの１００倍過剰のモルを添加し；次いで、１０分間定温放置する；こと
によって還元した。反応の完了は、４６５ｎｍでの還元励起（reduction exciti
ng）の前後において、５２０ｎｍでの亜ジチオン酸塩の蛍光発光を測定すること
によって調べた。次いで、過剰の亜ジチオン酸塩は、「セファデックス（Sephad
ex）Ｇ５０カラム」でのサイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chr
omatography）によって排除した。リポソームは、４０％エタノールの存在下で
定温放置し、最終脂質濃度１５０μＭに対応するアリコートを種々の時間ポイ
ントで測定のために取り去った。

【００４６】漏出試験：ＬＵＶｓのエタノール誘導透過性を、種々の温度で、また、閉じ
込められた溶質の大きさ（分子量）の関数として測定した。漏出に対する低分子
量のマーカーとしては、カルセインを使用し、また、高分子量のマーカーとして
は、ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量１９５００）を使用した。自
己消光濃度で閉じ込められたカルセインの漏出の後、カルセインの蛍光の脱消光
（dequenching）をモニタリングした。ＬＵＶｓは、水酸化ナトリウムを添加す
ることによってｐＨ７．５に調整した、カルセイン７５ｍＭ及びＨＥＰＥＳ
５ｍＭを含有する水溶液で、脂質膜を水和し；次いで、５回の凍結／融解サイク
ルにかけ；二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通して（１０回通過）押し出
しを行う；ことによって調製した。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄／
ＤＯＤＡＰの押し出しは、６０℃で行った。閉じ込められなかったカルセインは
、「ＤＥＡＥセファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラム」でのアニオン交換
クロマトグラフィによって、等浸透圧性（isoosmotic）ＨＢＳ緩衝液に対して交
換した。リポソームの原液（stock solution; 貯蔵液）は、２５℃、４０℃又は
６０℃で予備均衡化された、変動量のエタノールを含有するＨＢＳで、３μＭの
脂質濃度に希釈した。対応する温度で５分間定温放置を行った後、「Perkin Elm
er ＬＳ５０蛍光計（Perkin Elmer）」を用いて、５２０ｎｍでの蛍光を測定
した［励起波長４８８ｎｍ；４３０ｎｍでのロングパス・フィルタ（long-pass
filter）］。１０％「Triton Ｘ−１００」溶液を添加して、最終濃度を０．０
５％にすることによって、１００％漏出（最大の脱消光）のための値を得た。カ
ルセインの漏出は、漏出（％）＝（Ｆ_s−Ｆ_b）／（Ｆ_Tx−Ｆ_b）*１００［式中、Ｆ_sは試料の蛍光であり；Ｆ_bは、エタノールの不存在下で、カルセイン
含有リポソームに対応するバックグラウンドであり；Ｆ_Txは、「Triton Ｘ−１
００」値である］に従って計算した。

【００４７】ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量１９５００）は、０．５モル％
ＬＲｈ−ＰＥを取り入れて、４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にして、ＤＳＰＣ／Ｃ
ｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄／ＤＯＤＡＰのリポソーム中に閉じ込めた。閉じ込
めは、エタノールに溶解した脂質を、ＨＢＳに入れたＦＩＴＣ−デキストラン溶
液に添加し；次いで、押し出しを行い（二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタ、
２回通過）；次いで、透析によってエタノールを除去する；ことによって実施し
た。閉じ込められなかったＦＩＴＣ−デキストランは、「セファローズ（Sephar
ose）ＣＬ４Ｂカラム（１．５×１．５ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフ
ィーによって排除した。４０％エタノールにさらされたリポソームからのＦＩＴ
Ｃ−デキストランの損失は、「セファローズＣＬ４Ｂカラム（１．５×１．５
ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフィーによって解放されるＦＩＴＣ−デキ
ストランを除去した後、決定した。ＦＩＴＣ／ＬＲｈ−ＰＥの比は、エタノール
添加の前後に測定した。ＦＩＴＣ及びＬＲｈ−ＰＥの蛍光は、励起波長をそれぞ
れ４８５ｎｍ及び５６０ｎｍに設定して、５１５ｎｍ及び５９０ｎｍで測定した
。

【００４８】脂質混合（Lipid mixing）：ドナー（ＮＢＤ−ＰＥ）とアクセプター（ＬＲ
ｈ−ＰＥ）の間で、共鳴エネルギー移動の損失が生じた後に、エタノール誘導脂
質混合／交換が生じ、また、これらドナー及びアクセプターは、非標識標的膜の
中にプローブが希釈されるとき、極めて接近している［ストラック（Struck）等
，１９８１］。ＬＵＶｓは、ＮＢＤ−ＰＥとＬＲｈ−ＰＥの両方を０．７５モル
％含有した。標識リポソーム及び非標識リポソームは、ｐＨ７．５のＨＢＳ中
で、２０ｍＭの脂質濃度で押し出しを行うことによって調製した。標識リポソー
ム及び非標識リポソームにエタノールを添加して、最終エタノール濃度が４０％
（ｖ／ｖ）になるようにした。次いで、標識リポソーム及び非標識リポソームの
エタノール性分散系を、１：５のモル脂質比で混合し；次いで、適切な温度で定
温放置した。所定の時間ポイントで、アリコートを回収し；次いで、ＨＢＳ２
ｍｌに加えて、１５０μＭの最終脂質濃度を与えた。ＮＢＤ及びＬＲｈの発光ス
ペクトルは、励起波長を４６５ｎｍに設定して（４３０ｎｍ発光、ロングパス・
フィルタ）、５０５〜６５０ｎｍの範囲で測定した。バックグラウンドを差し引
いた後（１５０μＭ脂質の非標識リポソーム）、共鳴エネルギー移動の損失は、
ＮＢＤ／ＬＲｈ比の増加として表わした。

【００４９】ピレン−ＨＰＣ分析：ピレン−ＨＰＣは、高濃度で励起状態の二量体を形成
し、モノマーとは異なる波長で蛍光を発する。エキシマーの形成は、拡散律速過
程であり、２つの分子が一緒になって二量体を形成する必要がある。膜中のピレ
ン−ＨＰＣの横への可動性（lateral mobility）が減少することも、脂質を混合
すること（標的膜）も、ピレンエキシマーの蛍光が減少することとなり得る［フ
ックストラ（Hoekstra），１９９０；デュポールテイル（Duportail）及びリア
ノス（Lianos），１９９６］。外側相を分離すれば、通常、ピレンエキシマーの
蛍光が減少することとなる［デュポールテイル及びリアノス，１９９６］。この
試験の理論的根拠は、リポソーム膜に及ぼすオリゴヌクレオチド結合の影響を調
べることであった。オリゴヌクレオチドを閉じ込めるリポソームのピレン−ＨＰ
Ｃの蛍光は、膜間ｐＨ勾配が減損する前後に、中空の対照リポソームと比較した
。内部のｐＨが７．５に増大することによって、膜結合済みオリゴヌクレオチド
が解放されることになる。７モル％の濃度でピレン−ＨＰＣを取り込んでいるリ
ポソームは、ｐＨ４のクエン酸塩緩衝液に、エタノールに溶解した脂質を添加
することによって調製した。アリコートを取り去り、上述のようにオリゴヌクレ
オチドを被包した。残りの初期リポソームは、後続の諸工程の全てにおいて同様
のやり方で処理した（以下の閉じ込みを参照）。ｐＨ勾配は、ｐＨ７．５に調
整した酢酸アンモニウムを用いて消失させた。リポソームは、適切な緩衝液、ｐ
Ｈ７．５のＨＢＳ、又はｐＨ７．５の１５０ｍＭ酢酸アンモニウムで希釈し
て、２μＭの最終脂質濃度にした。ピレン−ＨＰＣ発光スペクトルは、３４５ｎ
ｍで励起し、３５０ｎｍの発光カットオフ・フィルタを用いて、３６５〜５５０
ｎｍの波長領域で記録した。［３９７ｎｍでのモノマーの蛍光］対［４７８ｎｍ
での二量体の蛍光］の強度比は、ｐＨ勾配が消失する前後において、オリゴヌク
レオチド含有リポソームに対しても、初期リポソームに対してもプロットした。

【００５０】 ³¹ＰＮＭＲ分光分析法：８１ＭＨｚで作動する「ブルーカー（Bruker）Ｍ
ＳＬ２００」分光計を用いて、³¹ＰＮＭＲスペクトルを得た。１０ｍｍプロー
ブの２．０ｍｌ試料について、２０００Ｈｚのスペクトル幅と、３秒インターパ
ルス遅れを伴う２．８μｓ５０°パルスとを使用することによって、８００又は
２４００走査（scans）に対応する自由誘導減衰（free induction decays）（Ｆ
ＩＤｓ）を集めた。減結合している（decoupling）プロトンは全く使用しなかっ
た。線広がり（line broading）の２５Ｈｚに対応する指数的増加は、フーリエ
変換を行う前にＦＩＤｓに適用した。化学シフトは、外部の８５％リン酸（Ｈ₃
ＰＯ₄）に関係した。ｐＨ７．５での遊離オリゴヌクレオチド及び被包されたオ
リゴヌクレオチドのスピン格子緩和時間（Ｔ₁）は、Ｔ₁ ^free＝１．７秒、及びＴ ₁ ^enc. ＝２．１秒と本質的に同一であった。Ｔ₁値は、逆位−回復パルス配列（in
version-recovery pulse sequence）によって測定した。５０°パルスに対する
３秒のインターパルス遅れによって、全てのアンチセンス共鳴の完全な緩和が可
能となる。

【００５１】超遠心分離法（Ultracentrifugation）：オリゴヌクレオチドを被包したリ
ポソーム、及びオリゴヌクレオチドを被包しなかったリポソームは、ｐＨ７．
５のＨＢＳ中のショ糖１％、２．５％、１０％及び１５％（ｗ／ｖ）であって
、それぞれ３．５、３．５、２．５及び１．５ｍｌの段階容量を有するものから
成るショ糖段階勾配（sucrose step gradient）について、超遠心分離法によっ
て分別した。「ＳＷ４１Ｔｉ」回転子を組み合わせた「ベックマン（Beckmann）
Ｌ８−７０」超遠心分離機を使用して、３６０００ｒｐｍ（ＲＣＲ_Rmax ２２１
０００ｘｇ）で２時間の間、諸試料を分離した。勾配は、上部から分別するか；
又は針でチューブに穴をあけた後、注射器を用いて個々のバンドを除去した。

【００５２】極低温透過型電子顕微鏡検査（Cryo-Transmission Electron Microscopy）（c ryo-TEM）：試料の１滴を、穴あき炭素膜を有する、標準電子顕微鏡グリッド
に塗った。過剰の液は、炭素膜の穴を覆っている水の薄層を残しながら、ろ紙で
吸い取ることによって除去した。グリッドは、液体エタンで急速に凍結し、小胞
が無定形氷の薄膜中に埋め込まれる結果となった。「フィリップス（Philips）
ＣＭ２００ＦＥＧ」電子顕微鏡の「Ｇａｔａｎ」低温ホールダーを用い、６６
０００倍、１．５μｍ以下の焦点ボケの極低温条件下で、氷中の小胞の画像を得
た。

【００５３】凍結破断電子顕微鏡検査（Freeze-Fracture Electron Microscopy）：試料
は、２５％グリセロールの存在下、液体Ｎ₂で冷却した液体フロン（Freon）２
２の中にそれら試料を沈めることによって、極低温固定した。破面は、「バルツ
ァーズ凍結エッチング（Balzers Freeze-Etching）ＢＡＦ４００Ｄ（リヒテ
ンシュテインのバルツァーズ（Balzers））」を使用して、白金（４５°）で一
定方向に影を投じ、また、炭素（９０°）で被覆した。「ＪＥＯＬＭｏｄｅｌ
ＪＥＭ１２００ＥＸ」電子顕微鏡［カナダ、ＱＣ、モントリオール、Soquel
ec］を使用して、レプリカ（replicas）を分析した。

【００５４】透過型電子顕微鏡検査（Transmission Electron Microscopy）（TEM）：小
胞は、２％四酸化オスミウムの１容量を、ＨＢＳに入れた小胞の０．５容量に
加えることによって固定し；次いで、１７０００ｘｇ、４℃で４５分間、遠心分
離機で分離した。得られたペレットは、等容量の３％アガロース／ＰＢＳと混合
し、顕微鏡のスライドの上にピペットで移し、次いで、４℃に冷却した。小胞を
含有する、固化したアガロースは、１ｍｍの断片に切断し、次いで、更なる処理
を行うため、ガラス管に移した。それらブロック（blocks）は、２％酢酸ウラニ
ルで１時間染色する前に、ｐＨ５．２の０．０５Ｍマレイン酸で、３×５分間
の間、洗浄した。組織片は、一連の傾斜アルコール（５０〜１００％）で脱水し
；［エポキシ樹脂（ＥＭｂｅｄ８１２）］：［プロピレンオキシド］比を増大
させて浸透させ；次いで、１００％「ＥＭｂｅｄ８１２」の中に６０℃で２４
時間の間、埋め込んだ。極薄切片は、２％クエン酸鉛で染色し、次いで、「ツァ
イス（Zeiss）ＥＭ１０Ｃ」透過型電子顕微鏡（ドイツ、オーベルコッヒェン
）を使用して検査を行った。

【００５５】位相差蛍光顕微鏡検査（Phase contrast and fluorescence microscopy）：
光学的仕様「エキサイテーション４７５±２０／２色性５００／エミッション
５３５±２２．５」を有する、オメガ・オプティカル（Omega Optical）（バー
モント州ブラトルバロ）からの「１．６ｘ optovar」レンズ及び「ＸＦ１００」
フィルターセットと組み合わせた、「Plan Apochromat 63x/1.4NA」油浸レンズ
を使用している、「Zeiss Axiovert １００」顕微鏡によって、位相差蛍光顕微
鏡検査を行った。画像は、「Zeiss ＭＣ８０ＤＸ」顕微鏡カメラを用いて、１
６００ＩＳＯの「Kodak Ektachrome Ｐ１６００」カラー・リバーサル・フィル
ムに記録した。スライド及びカバーガラスは、ジクロロジメチルシランでシリコ
ン化して、さもなければ負に帯電するガラス表面を中和した。

【００５６】（例１）ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＤＯＤＡＰ、ＤＰＳＣ及びＣＨＯＬを、５：２５：２
５：４５のモル比で含有する脂質混合物から、中空の予め形成された小胞を調製
した。それら４種の脂質を１００％エタノールに溶解し、全脂質濃度２５ｍｇ
／ｍｌ（３３ｍＭ）にした。次いで、エタノール性脂質は、０．２５ｍｍのオリ
フィス直径を有する噴射ノズルを通して、３００ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ
４．０）を含有する容器の中に導入した。容器及び全ての溶液は室温であった
。エタノール性脂質の全容量は６リットルであり、脂質を導入するための流量は
、２００〜３００ｍｌ／分であった。クエン酸塩緩衝液の全容量は９リットルで
あった。その結果として得られた１５リットルの混合物は、４０％のエタノール
濃度と１８０ｍＭのクエン酸塩を有した。中央粒径１７０±２０ｎｍの小胞が
生成した。空の予め形成された小胞は、二枚の８０ｎｍの積み重ね膜を使用して
いる、低圧（最高水準の５００〜１０００ｐ．ｓ．ｉ．から低下させた１００ｐ
．ｓ．ｉ．）の押出し回路（extrusion circuit）を、６５℃で１〜３回通過さ
せることによって、中央粒径９０〜１２０ｎｍの大きさに造った。次いで、そ
れら中空の予め形成された小胞は、容器（reservoir）２０の中に貯留し、次い
で、治療剤の溶液を添加するまで、４０℃に保持した。

【００５７】（例２）例１の予め形成された小胞を使用して、治療剤として、オリゴヌクレオチド
ＩＮＸ−６２９５（配列ＩＤ番号１）を使用した、脂質で十分に被包された治療
剤の粒子を造った。蒸留水に入れたオリゴヌクレオチドＩＮＸ−６２９５は、
１００％エタノールを追加することによって希釈し、４０％エタノールに入って
いるオリゴヌクレオチド１０、２０、３０、４０又は５０ｍｇ／ｍｌという種
々の溶液を作った。エタノール性オリゴヌクレオチドは、４０℃の容器２０に入
れた予め形成された小胞に、穏かに混合しながら添加した。エタノール性オリゴ
ヌクレオチドの量及び容量を計算して、［薬物］：［脂質］の最終重量比０．
１〜０．２５を与えた。次いで、その混合物は、１時間の間、穏かに且つ断続的
に混ぜ合わせながら、４０℃で定温放置した。定温放置した後、その溶液は、ダ
イアフィルトレーション（diafiltration）によって処理し、遊離の又は過剰の
付随オリゴヌクレオチドを取り除き、エタノールを除去し、次いで、緩衝系をｐ
Ｈ７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。濃化、除菌及びパ
ッケージを行うことによって、商業用製品の製剤が完成する。

【００５８】（例３）例２の手順は、種々のパラメータに変化を加えて繰り返して、本発明の、脂質
で十分に被包された治療剤の粒子の調製にとっていずれのパラメータが重要であ
るかを決定した。これらの実験において、全オリゴヌクレオチドの回収率（収率
）；全脂質の回収率（収率）；及び被包化効率；は、製品とプロセスの質を示す
ものと考えた。全オリゴヌクレオチドの回収率は、式：［｛最終オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／｛初期オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％を用いて計算した。全脂質の回収率は、式：［｛最終脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／｛初期脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％を用いて計算した。被包化効率（Ｅ．Ｅ．）；は、［｛初期オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／初期脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝／｛最終オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／最終脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝］×１００％を用いて計算した。被包された（即ち、二重層の中に組み込まれたか、又は脂質粒子の内部に閉じ
込められた）オリゴの割合は、上述のオリグリーン分析（OliGreen assay）によ
って決定した。

【００５９】［初期薬物］：［初期脂質］の比の有意性を判断するために、２つの異なる出
発比（starting ratios）を用いて実験を行った。表１にその結果をまとめる。
オリゴヌクレオチドを負荷するプロセスに、小胞の粒度の変化は全く観察されな
かった。

【００６０】

【００６１】定温放置の温度の有意性を判断するために、室温と２種の高めた温度とで１時
間の間、実験を行った。表２にその結果をまとめる。示される通り、６０℃とい
う一層高い温度は、プロセスの有効性を損ない始め、また、粒度を増大させる。
従って、一層低い温度が好ましい。

【００６２】

【００６３】定温放置の時間の有意性を判断するために、３種の定温放置時間と、４０℃定
温放置温度とで、実験を行った。表３にその結果をまとめる。示される通り、収
率は、０．５時間〜１時間の間で改善されるが、１時間を越える定温放置時間で
は、実質的に改善されない。このように、使用した装置での最も有効なプロセス
は、約１時間の定温放置時間を使用することである。

【００６４】

【００６５】オリゴヌクレオチド溶液の緩衝液濃度の有意性を判断するために、クエン酸塩
緩衝液の４種の異なる濃度と、初期［薬物］／［脂質］比０．１とで、実験を
行った。表４にその結果をまとめる。

【００６６】

【００６７】混合工程の間の初期エタノール濃度の有意性を判断するために、２種の初期［
薬物］／［脂質］比の各々について３種の異なる初期エタノール濃度で、実験を
行った。表５にその結果をまとめる。各々の出発［薬物］／［脂質］比について
異なる、最適エタノール濃度が存在するようである。表５には記載していない追
加実験では、５０％の初期エタノール濃度を、０．１の［オリゴ］／［脂質］比
と一緒に使用した。この実験で、未知の原因による重大な問題に遭遇し、製品の
収率は全くなかった。

【００６８】

【００６９】初期オリゴヌクレオチド濃度の有意性（従って、同一の初期［薬物］対［脂質
］比を得るための治療剤溶液の容量の有意性）を判断するために、オリゴヌクレ
オチドの４種の異なる濃度の原液（stock solutions）を使用した。表６にその
結果をまとめる。示されるように、このパラメータは、本発明の方法を用いて得
られる結果には重要でないように思われる。

【００７０】

【００７１】（例４）一層大きい治療剤に対する、本発明の適用性を実証するために、プラスミド
ｐＩＮＥＸＬ１０１８（ＣＭＶプロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子
をコード化しており、また、ＳＶ４０エンハンサー及びＡｍｐＬ遺伝子を持って
いる５．５ｋｂプラスミド）を予め形成された脂質小胞の中に負荷した。予め形成された脂質小胞は、１００％エタノールに溶解した諸脂質（２０／４
５／２５／１０モル％比でのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ
１４）１０ｍｇを、２５ｍＭクエン酸塩緩衝液［水酸化ナトリウムでｐＨ４に
調整した、２５ｍＭクエン酸、２５５ｍＭスクロース（ショ糖）］にゆっくり添
加することによって調製した。両方の溶液は、混合する前に、４０℃に予熱した
。最終エタノール濃度は、４０％（ｖ／ｖ）であった。脂質小胞のエタノール分
散系は、室温で、二重に積み重ねた１００ｎｍポリカーボネート・フィルタを２
回通過させて押し出した。それら脂質小胞に、４０％エタノールに入れたプラス
ミドＤＮＡ０．２５ｍｇを室温で添加し、次いで、その試料は４０℃で１時間
の間定温放置した。初期［プラスミド］／［脂質］比は０．０２５であった。続
いて、その試料は、ｐＨ７の２５ｍＭ生理食塩水（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５
０ｍＭＮａＣｌ）２リットルに対して合計１８〜２０時間の間透析した。

【００７２】閉じ込め効率（trapping efficiency）は、残存している外部プラスミドＤＮ
Ａを除去した後、ＤＥＡＥセファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラムでのアニ
オン交換クロマトグラフィによって決定した。プラスミドＤＮＡは、ブライ・ダ
イアー抽出法（Bligh Dyer extraction）によってプラスミドから分離した後、
ＤＮＡ結合系ピコグリーン脂質（DNA Binding System PicoGreen lipid）を用い
て、フィスケ・サバロウ（Fiske and Subbarrow）による無機リン酸塩分析によ
って定量した。加えて、最終脂質濃度は、蛍光標識済み脂質、リサミンローダ
ミン−ＰＥ０．２５モル％を、脂質小胞の中に組み入れることによって決定し
た。最終のプラスミド脂質比は０．０２２であった。この値は、８８％の閉じ込
めに相当する。得られた脂質被包済み治療剤の粒子は、１００ｎｍの平均粒度と
、非常に小さい粒度分布とを有した。

【００７３】（例５）リポソームの調製：エタノール／緩衝液の溶液に入った大きい単層リポソー
ムは、押し出したリポソームにエタノールを添加するか；又はエタノールに溶解
した脂質を水性緩衝液に添加し、次いで、押し出す；ことによって調製した。両
者いずれの方法も、同じ閉じ込め結果を与え、下記に一層詳細に記述する：１．ｐＨ４のクエン酸塩緩衝液に入れた脂質膜を水和し、凍結／融解サイク
ルを５回行った後、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（１０回
通過）押し出すことによって、大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）を生成した。
ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４のリポソームの場合、押
し出しは６０℃で行った。次いで、急速に混合しながら、エタノールをゆっくり
添加した。エタノールを除去した後、動的光散乱法によって決定した、典型的な
リポソーム粒度は、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ₁₄系につ
いて９０±２０ｎｍであった。エタノール濃度がある上限値を越えるや否や、リ
ポソームが不安定になり、合体して大きい脂質構造になるため、エタノールをゆ
っくり添加すること及び急速に混合することは、重要である。後者は、脂質の組
成に依存する。例えば、エタノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）を越えるとき、初期
に半透明のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ₁₄／ＤＯＤＡＰリポソーム分散
系は、乳白色になる。

【００７４】２．大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）は、エタノール（０．４ｍｌ）に溶解
した脂質をｐＨ４のクエン酸塩緩衝液（０．６ｍｌ）に室温でゆっくり添加し
、次いで、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（２回通過）押し
出すことによって調製した。エタノール中で行った動的光散乱測定値と、透析に
よってエタノールを除去した後に行った動的光散乱測定値とは、粒度の有意差を
示さず、粒度は典型的には７５±１８ｎｍである。激しく混合しながらエタノー
ルを非常にゆっくり添加して、エタノール濃度が局部的に高くなるのが回避され
る場合、押し出し工程は省略することができる。

【００７５】閉じ込め方法：オリゴヌクレオチド溶液は、エタノール性リポソーム分散へ
、渦巻き状に撹拌しながらゆっくり添加し；次いで、その溶液は、適切な温度で
１時間の間、定温放置し；クエン酸塩緩衝液に対して２時間の間透析して大半の
エタノールを除去し；次いで、ＨＢＳ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ／１４５ｍＭＮａ
Ｃｌ；ｐＨ７．５）に対して再び透析した。ＤＯＤＡＰは、ｐＨ７．５で、電
荷中性となり、外側膜表面に結合したオリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質と
の結合から解放される。次いで、ｐＨ７．５のＨＢＳで平衡状態に保たれてい
る「ＤＥＡＥ−セファローズ（sepharose）ＣＬ−６Ｂカラム」によるアニオ
ン交換クロマトグラフィにより、被包されなかったオリゴヌクレオチドを取り除
いた。エタノールに代えてオクチルグルコシドを使用した場合、洗剤をリポソー
ムに添加して（１：１ｖ／ｖ）、最終濃度が３０〜４０ｍＭの範囲になるよう
にした。初期の透析工程をｐＨ４のクエン酸塩緩衝液に対して行い、その工程
を５時間に伸ばしたことを除いて、後続の諸工程は全て上述のように実施した。
次の諸例において、別に断らない限り、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ₁₄ ／ＤＯＤＡＰリポソーム（２０：４５：１０：２５モル％）；ｃ−ｍｙｃ（配列
ＩＤＮｏ．１）；４０％（ｖ／ｖ）エタノール；３００ｍＭクエン酸塩緩衝液
；及び４０℃での定温放置；を使用した。

【００７６】閉じ込め効率の決定：閉じ込め効率は、外部オリゴヌクレオチドを除去した
後、アニオン交換クロマトグラフィによって決定した。オリゴヌクレオチドの濃
度は、「島津ＵＶ１６０Ｕ分光光度計」による紫外分光法によって決定した。
１：２．１：１のクロロホルム／メタノール／水相（試料／ＨＢＳ）の容量比の
クロロホルム／メタノールに試料を可溶化した後、２６０ｎｍでの吸光度を測定
した。混合した後、溶液が完全に透明にならなかった場合、メタノール５０〜
１００μｌを更に添加した。もう１つの方法として、１００ｍＭオクチルグル
コシドに試料を可溶化した後、吸光度を読み取った。アンチセンスの濃度は、ｃ［μｇ／μｌ］＝Ａ₂₆₀*１ＯＤ₂₆₀ユニット［μｇ／ｍｌ］*希釈因子（fa
ctor）［ｍｌ／μｌ］（式中、希釈因子は、試料の容量［μｌ］で除した全分析容量［ｍｌ］によって
与えられる）に従って計算した。ＯＤ₂₆₀ユニットは、個々のデオキシヌクレオ
チドの対吸光係数（pairwise extinction coefficients）から計算した。これら
対吸光係数は、隣接相互作用を考慮している。１ＯＤは、３０．９７μｇ／ｍｌ
のｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１）；３３．３７μｇ／ｍｌのｈ−ＩＣＡＭ−
１（配列ＩＤ．Ｎｏ．２）；及び３４μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ（配列ＩＤ．Ｎｏ．
３）；に対応する。脂質濃度は、ブライ・ダイアー抽出法（ブライ及びダイアー
，１９５９）により、オリゴヌクレオチドから脂質を分離した後、無機リン酸分
析によって決定した。手短に言えば、水相（試料／ＨＢＳ）２５０μｌに、メ
タノール５２５μｌ及びクロロホルム２５０μｌを添加して、透明な単一相［
水相／メタノール／クロロホルム（１：２．１：１容量比）］を形成した。溶液
が透明でない場合、少量のメタノールを追加した。次いで、ＨＢＳ２５０μｌ
及び等量のクロロホルムを添加した。諸試料は混合し、３０００ｒｐｍで５〜１
０分間、遠心分離機で分離した。これによって、透明な２相系が得られた。クロ
ロホルム相は、フィスケ・サバロウ法（１９２５）により、リン脂質含有量を分
析した。別に断らない限り、閉じ込め効率は、［オリゴヌクレオチド］対［脂質
］重量比（ｗ／ｗ）として表わす。

【００７７】（例６）例５の手順の後、押し出しにより調製した１００ｎｍのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／
ＤＯＤＡＰリポソーム（変性なし脂質成分）に、増加量のエタノールを添加した
。全ての試料は、オリゴヌクレオチドを添加すると直ちに乳白色になった。これ
は、オリゴヌクレオチドにより誘導された凝集を示す。ｐＨ４において０．０
３５のモル［ＯＤＮ］／［脂質］比でアンチセンス・オリゴヌクレオチドと共に
定温放置を行った後、エタノールと、閉じ込められなかったオリゴヌクレオチド
とを取り除いた。表７に、得られた多重膜小胞の最終粒度と共に、動的光散乱に
よって決定した被包効率を記載する。エタノール濃度が増大するにつれて、ます
ます多くのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが閉じ込められる。同時に、粒度
及び多分散性（polydispersity）が増大することは、ＬＵＶｓ（大きな単膜リポ
ソーム）が一層大きな脂質構造に漸次再編成されたことを反映している。これら
一層大きな脂質構造は、大部分が大きな多重膜リポソームであると思われる。こ
れらの系の粒度のために、閉じ込められなかった外部のオリゴヌクレオチドを除
去するのに使用したアニオン交換カラムの上で失われる脂質もあることに注目す
べきである。溶出した部分は、全脂質の約５０〜６０％に相当する。４０％以上
のエタノール濃度で、初期リポソームは、不安定になり、融合し、乳白色の分散
系を形成する。

【００７８】

【００７９】これらの諸結果は、エタノールによって脂質膜が、大きな多重膜リポソームの
共心薄層（concentric lamallae）間にオリゴヌクレオチドを閉じ込めさせる構
造的再配列（structural rearrangements）を生じ易くなることを実証する。し
かし、得られるリポソームの粒度を容易に制御することはできない。

【００８０】（例７）修飾脂質（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）２．５〜１０モル％を含有するリポソームを造
り、次いで、例５及び６の諸プロトコルを用いて試験を行った。各々の場合、Ｐ
ＥＧ−Ｃｅｒ濃度の減少は、ＤＰＳＣレベルの増大によって調整した。リポソー
ムの中に修飾脂質を取り込むこと（incorporation）によって、アンチセンス含
有リポソームの最終粒度が調節されることが分かった。リポソームは、ＰＥＧ−
Ｃｅｒが存在する場合、それが存在しない場合と比べて、一層大きいエタノール
濃度で安定する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ２．５モル％を含有する試料については、濁
度がわずかに増大するのが認められたが、４０％エタノール中では、それら分散
系は光学的に半透明のままであった。安定性が増大したことはまた、閉じ込め（
entrapment）が生じるために必要なエタノールの量が一層多いことに反映される
（表８、図２）。図２には、被包効率が、ＰＥＧ−Ｃｅｒ１０モル％を含有す
るリポソームに対するエタノール濃度の関数として描かれる。最大の閉じ込めは
、４０％エタノールで達成され、また、閉じ込めが生じるためには、２５％（ｖ
／ｖ）を越えるエタノール濃度（＞４．３Ｍ）が必要であった。エタノールが存
在しないと、閉じ込めは全く見出されなかった。表８には、動的光散乱によって
決定される閉じ込め効率及び粒度が、図２から決定される最小エタノール濃度及
び最大エタノール濃度での、ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量（２．５〜１０モル％）の関
数として記載される。初期の被押し出しリポソームの粒度は、括弧内に与えられ
る。閉じ込めが生じるために必要なエタノールの量は、リポソームのＰＥＧ−Ｃ
ｅｒ含有量に依存する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ２．５モル％を含有するリポソームに
では、２５％エタノールでオリゴヌクレオチドの約１５％が閉じ込められた。対
照的に、ＰＥＧ−Ｃｅｒ１０モル％において、２５％エタノールの存在下では
実質的に閉じ込めは達成されず（≦５％）、また、４０％エタノールの存在下で
は６０％であった。全ての場合、初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は
０．０３７（モル／モル）であった。ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量が２．５モル％から
１０モル％まで増大するとき、閉じ込めレベルは、４０％エタノール中で、４５
％からほぼ６０％まで増大した。リポソーム粒度及び多分散性は１３１±４０ｎ
ｍから１００±２６ｎｍまで減少した。

【００８１】

【００８２】（例８）脂質膜上でエタノールをかき乱す効果は、脂質の水和；アシル鎖のオーダー（
order）；小さいイオンの膜透過性；及びＤＰＰＣ系における鎖の相互からみ合
いの誘導；の変化に関連して、主に低いエタノール濃度（＜１５％、ｖ／ｖ）で
研究されてきた［スレイター（Slater）及びハング（Hung），１９８８；バーチ
フェルド（Barchfeld）及びディーマー（Deamer），１９８８；シュビッヒテン
ホーベル（Schwichtenhovel）等，１９９２；スレイター（Slater）等，１９９
３；バリー（Barry）及びゴーリッヒ（Gawrisch），１９９４；ビエル（Vierl）
等，１９９４；ロベッケ（Lobbecke）及びチェブク（Cevc），１９９５；コマツ
（Komatsu）及びオカダ（Okada），１９９６；ホルテ（Holte）及びゴーリッヒ
（Gawrisch），１９９７］。閉じ込めるために必要な高濃度のエタノールにおい
てリポソームが依然として無傷であるか否かを問うことは道理にかなっている。
図３Ａには、エタノールの濃度の関数として、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃ
ｅｒＣ₁₄／ＤＯＤＡＰリポソーム中の自己消光濃度（self-quenching concentra
tions）で閉じ込められたカルセインの解放（黒丸）が、同一の脂質組成のリポ
ソームを使用して得られた被包効率と共に描かれている。漏出の実験も被包の実
験も、４０℃で行った。カルセイン（６２３の分子量を持つ小さい分子）の漏出
は、３０％以下のエタノールで出発し、約４０％のエタノールで最大に達する。
オリゴヌクレオチドの閉じ込めは、類似のエタノール依存を示し、その閉じ込め
が、リポソーム膜の透過性障壁の不安定性と相関関係が高いことを表わしている
。カルセインとは対照的に、ＦＩＴＣ−デキストラン（分子量１９５００）の
解放は、４０％エタノール中で１０％未満である。このことは、オクチルグルコ
シド等の洗剤についても報告されてきたように［アルモッグ（Almog）等，１９
９０］、透過性障壁の損失が、分子量依存であることを示す。４０％エタノール
に入った巨大リポソームの位相差顕微鏡検査によっても、無傷のリポソーム構造
が明らかとなった。

【００８３】脂質はまた、リポソームの間、並びにリポソームから成る脂質二重層の内部単
一層及び外部単一層の間で、迅速に交換できる。図３Ｂに示されるように、ＮＢ
Ｄ−ＰＥ／ＬＲｈ−ＰＥＦＲＥＴ分析によって検出されるような脂質混合（lip
id mixing）は、４０％エタノール中で、有効に隣接している。小胞粒度の増大
は全く観察されず、脂質混合がリポソームの融合よりむしろリポソーム間の迅速
な脂質交換から生じていることを示している。図３Ｂに示される結果はまた、亜
ジチオン酸ナトリウムとの化学還元に基づく、外部脂質単一層中に位置している
ＮＢＤ−ＰＳの蛍光の損失によって示される通り、諸脂質が、リポソーム脂質の
二重層の一方側から他方側へ迅速に移動する（フリップ・フロップする）ことを
実証する。

【００８４】（例９）被包に基づく濁度の増大は、閉じ込みが初期凝集工程［小凝集（microaggrega
tes）の形成］によって先行されることを示す。その凝集工程及び閉じ込みは、
低温で切り離すことができる。オリゴヌクレオチドを添加する時又は添加の直後
に、試料は濁り、また、濁度は時間が経てば増大する。エタノールが存在しない
場合、濁度がわずかに増大するのみであり、その後、光の透過率は一定のままで
ある。４０℃で調製した試料とは対照的に、４℃で定温放置した試料は、エタノ
ールを除去すると、再び半透明になり、リポソームはオリゴヌクレオチドを閉じ
込めない。図４には、閉じ込め効率が、温度の関数として、カルセインの漏出デ
ータと共にプロットされている。漏出データは、カルセインの５０％解放を引き
起こすのに必要なエタノール濃度として与えられる。また、リポソーム膜の不安
定性と閉じ込め効率の間には、質的な相関関係が存在する。

【００８５】（例１０） ³¹Ｐ−ＮＭＲは、オリゴヌクレオチドの閉じ込みを分析するのに使用すること
ができる。図５のＡ及び図５のＢは、溶解状態のｃ−ｍｙｃの³¹Ｐ−ＮＭＲスペ
クトルを示し（図５のＡ）、また、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−
ＣｅｒＣ₁₄リポソームに閉じ込められたｃ−ｍｙｃの³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルを
示す（図５のＢ）。それらリポソームは、初期に、内部ｐＨが４であり外部ｐＨ
が７．５である膜間ｐＨ勾配を示した。これらの条件下で、閉じ込められたオリ
ゴヌクレオチドは、正に帯電したリポソーム膜としっかりと結合している。この
固定化によって、ＮＭＲ信号は消失する（disappearance）（幅が広がる）結果
となる（図５のＢ）。酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ勾配が消滅し、外部
ｐＨが７．５に調整されるとき、ＤＯＤＡＰは脱プロトン化し、オリゴヌクレオ
チドはリポソーム膜から解離する。このことは、ＮＭＲ信号の回復（recovery）
（図５のＣ）によって実証される。しかし、この回復は不完全であり、初期信号
の約５０％である。この信号の減衰は、ＮＭＲ共鳴の飽和に起因するものではな
い。それは、２つの可能性：被包されたアンチセンスの量がその溶解度を越えて
、その一部が沈降すること；又は、アンチセンス分子の移動度が、例えば、２つ
の接近して並んでいる二重層の間に固定化されることによって、空間的に制約さ
れること；に起因するのかも知れない（図３Ａを参照）。オリゴヌクレオチドが
、被包されてリポソームの水性内部に局部集中したことを確認するために、Ｍｎ
ＳＯ₄ ５ｍＭを外部溶液に添加した（図５のＤ）。Ｍｎ²⁺は、膜不透過性常磁性
線広がり剤（membrane impermeable paramagnetic line broadening agent）で
あって、オリゴヌクレオチドだけでなく、接近可能な全てのリン酸基、リン脂質
の信号を消滅させる。しかし、オリゴヌクレオチドの信号は、影響されないまま
であり、ＯＧＰを有するリポソームの可溶化に基づいてのみ消滅した（図５のＥ
）。初期リポソーム（図５のＢ）が、Ｍｎ²⁺の不存在下で、ＯＧＰにより可溶化
されるとき、全体のオリゴヌクレオチド信号は回復する。これらのデータによっ
て、オリゴヌクレオチドがリポソーム内に閉じ込められ、また、外部膜と単純に
は結合しないことが明白に実証される。閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、
オリゴヌクレオチド結合性染料オリグリーン（OliGreen）に接近しなかったこと
にも注目すべきである。

【００８６】オリゴヌクレオチドの全体像から見たＮＭＲ研究によって、オリゴヌクレオチ
ドとリポソームの間の相互作用が説明される。脂質の動特性の変化及び膜組織は
、ピレン標識脂質を用いて精査することができる［デュポーテイル（Duportail
）及びリアノス（Lianos），１９９６］。ピレン標識脂質は、高濃度で、励起状
態の二量体を形成する。これら二量体は、モノマーと異なる波長で蛍光を発する
。エキシマーの形成は、拡散律速過程（diffusion-controlled process）であっ
て、一緒になって二量体を形成する２つの分子を必要とする。それらオリゴヌク
レオチドの結合によって、リポソームを制御するのに関与し、オリゴヌクレオチ
ドを含有しない全ての脂質種の横への移動性（lateral mobility）が著しく減少
する結果となる。その膜は横方向に圧搾される。これは、ピレン−ＨＰＣのエキ
シマー蛍光の減少が観測されることによって得られる。膜間ｐＨ勾配の減損によ
って、エキシマー蛍光が増加し、脂質の移動性が回復する結果となる。

【００８７】（例１１）閉じ込め効率と同様、アンチセンスを閉じ込めているリポソームの粒度も、初
期［アンチセンス］対［脂質］比に依存する。図６は、高い［アンチセンス］対
［脂質］比でオリゴヌクレオチドを効率よく閉じ込め得ることを示す。閉じ込め
効率は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットされて
いる。最大閉じ込め効率での結合レベルは、脂質１ｍｇ当りオリゴヌクレオチド
０．１６ｍｇ（０．０２４モル／モル）である。これは、１００ｎｍのリポソ
ーム当り約２２５０分子のオリゴヌクレオチドに相当し、また、この閉じ込め手
順が高効率であることを実証する。閉じ込め効率は、受動的被包化（passive en
capsulation）によって得られたものより、約３桁大きい。［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比を増大させるとき、試料の多分散性も粒
度も、リポソーム単独の７０±１０ｎｍから、０．２の初期［ＯＤＮ］対［脂質
］重量比の１１０±３０ｎｍまでわずかに増大する。凍結破断電子顕微鏡検査（
freeze-fracture electron microscopy）により、初期［オリゴヌクレオチド］
対［脂質］比の増大と共に、一層大きいリポソームの数が増大することが分かっ
た。また、初期に半透明であったリポソーム分散系は、［アンチセンス］対［脂
質］比が増大するにつれて、ますます濁ってくることに注目すべきである。

【００８８】（例１２）接近して向き合っている膜であってそれら膜の多層構造がＴＥＭ（透過型電子
顕微鏡検査）によって観察される該膜の形成を、ＰＥＧコーティングは妨げるこ
とが期待される。従って、放射能標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄を使用することによっ
て、ＰＥＧ−Ｃｅｒの命運について試験を行った。アンチセンス・オリゴヌクレ
オチドを、非標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄ １０モル％と、５．９の［³Ｈ］／［Ｃ₁₄ ］比での、コレステロールマーカーとしての［¹⁴Ｃ］−コレステロールヘキサデ
シルエーテル（ＣＨＥ）とに加えて、痕跡量の［³Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄を
含有するリポソーム中に被包した。この比は、見掛けの［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［
Ｃｈｏｌ］比を表わし、また、［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］のモル比に代
えて使用される。初期の［アンチセンス］対［脂質］重量比は０．２９であった
。閉じ込めは、最終的に０．１６の最終［アンチセンス］対［脂質］比となった
。遊離のＰＥＧ−Ｃｅｒミセル及びＰＥＧミセルは、ショ糖段階勾配（sucrose
step gradient）［ＨＢＳに入ったショ糖１％、２．５％、１０％、１５％（ｗ
／ｖ）］を用いて、超遠心分離法によってリポソームから分離した。中空のリポ
ソームは、５．５の見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比で、２．５％シ
ョ糖と１０％ショ糖の境界に集まる。このバンド（band）は、全脂質の約８０％
を占める。アンチセンス含有リポソームは、同一の位置に弱いバンドを示し、こ
のバンドは全脂質の９％未満に相当する。しかし、大抵のリポソームアンチセン
スは、１５％ショ糖層又は下部のペレットに移動する。表９に、勾配のリポソー
ム含有フラクション（fractions）の全分析を示す。それら結果は、高い［オリ
ゴヌクレオチド］対［脂質］比で調製した試料を表わす。相対的な［ＰＥＧ−Ｃ
ｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比は、勾配の下部の方に向かい漸進的に減少している。Ｐ
ＥＧ−Ｃｅｒの５０％以上が、初期リポソーム（見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［
Ｃｈｏｌ］比は５．５）に比べて下部フラクションから失われている。［ＤＳＰ
Ｃ］／［Ｃｈｏｌ］比は変化していない。ＰＥＧ−Ｃｅｒの２７％は、コレステ
ロールの６．６％と共に、上部フラクションに見出すことができる。ほぼ同じ量
の非リポソーム結合ＰＥＧ−Ｃｅｒが、中空の対照リポソームに見られる。

【００８９】上記勾配の諸フラクションの更なる分析によって、アンチセンス含有リポソー
ムはそれらのアンチセンス含有量及び粒度において大きな差異を示すことが分か
る（表９）。平均粒度も［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比も、上部から下部
へ増大する。三つの主要集団を、明瞭なバンドとして確認することができる（表
１０）。それらの相対割合は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比に依存
する（表１０）。第１の集団は、低い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．０３〜０．
０５）のアンチセンス含有リポソームである。第２の集団は、０．１４〜０．１
５の［ＯＤＮ］／［脂質］比を有するリポソームである。最後の集団は、非常に
高い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．２９ｍｇ／ｍｇ）を有するリポソームである
。最後の集団は、初期［ＯＤＮ］／［脂質］比が減少しているそれら初めの２つ
の集団に有利なように減少している。最後の集団は、光学的に濁っているのに対
して、他の２つの集団は、半透明である。閉じ込み率と粒度の観測差異を、極低
温透過型電子顕微鏡検査によって認識される形態の不均質性と関連付けることを
試みた。アンチセンスは、高い初期［オリゴヌクレオチド］／［脂質］比（０．
２８ｍｇ／ｍｇ）で閉じ込められ、また、表１０のフラクション１５及び１７に
対応する２つの主要フラクションは、透析によりショ糖を除去した後、極低温透
過型電子顕微鏡検査によって検査した。上部のフラクションは専ら、二重層リポ
ソームであってそれらの多くがバルブ（bulbs）を示す該二重層リポソームから
成るのに対し、下部のフラクションは、二重層リポソームと多重膜リポソームの
混合物を含有した。

【００９０】

【００９１】

【００９２】（例１３）エタノールの存在下、カチオン性リポソームにオリゴヌクレオチドを添加すれ
ば、ドメイン形成を生じさせることができる。見られる多重膜リポソームの形成
は、リポソームの接着によって先行されなければならない。しかし、エタノール
の不存在下では、１０モル％ＰＥＧ−Ｃｅｒは接着を完全に妨げる。エタノール
の存在下では、２つの効果：即ち、第１に、迅速な脂質交換による、非膜取り込
み済み（non membrane-incorporated）ＰＥＧ−Ｃｅｒの量の増加；及び、ＰＥ
Ｇ−Ｃｅｒ中で消耗されアンチセンス・オリゴヌクレオチド中で富化される小さ
いドメインの形成；が、リポソームの接着に寄与し得る。後者の可能性を研究し
た。オリゴヌクレオチド結合の効果は、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと併せ
てＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄の巨大リポソームを用
いて、位相差蛍光顕微鏡により視覚化した。観察された大抵のリポソームは、多
重膜であり、内部構造を示した。エタノールの不存在下で、巨大リポソームは崩
壊して不規則形状の凝集体となり、また、アンチセンスの添加によって一層小さ
いリポソームとなった。グリーンＦＩＴＣ蛍光発光（green FITC fluorescence
）によって、オリゴヌクレオチドの位置が明らかとなった。４０％エタノールの
存在下では、全く異なる事態が与えられる。初期に丸いリポソームは、オリゴヌ
クレオチドを添加して５〜１０分間は西洋なし形状をしており、また、これらオ
リゴヌクレオチドは、これらリポソーム構造体の一方側では半円形で置かれてい
る。内部膜は、この馬蹄形のものから圧搾される。この馬蹄形のものは、（とり
わけ、温度が上昇するとき）引き離されて崩壊し、蛍光が完全にグリーンに見え
る、緻密でわずかに不規則な構造体となる。オリゴヌクレオチドの分離は、エタ
ノールがドメインの形成を刺激し得ることを表わしている。

【００９３】（例１４）本発明の被包化手順は、特定のオリゴヌクレオチド及び脂質の組成に左右され
ないし、また、使用される高いクエン酸塩濃度にも制限されない。被包化は、５
０ｍＭクエン酸塩緩衝液で最も効率が高く、一層低いクエン酸塩濃度でも一層高
いクエン酸塩濃度でも減少する。粒度及び多分散性は、２５ｍＭ以下のクエン酸
塩濃度ではかなり増大する。図７は、プラスミド−ＤＮＡも、ｃ−ｍｙｃ（配列
ＩＤ番号１）以外の諸オリゴヌクレオチドも、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ
／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄のリポソーム中に効率よく閉じ込めることができることを
示す。初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］重量比は０．１ｍｇ／ｍｇであ
り、オリゴヌクレオチドを閉じ込めるために、３００ｍＭクエン酸塩緩衝液を使
用した。ｐＤＮＡの閉じ込めは、０．０３の［ｐＤＮＡ］対［脂質］重量比で、
５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。ホスホロチオエート型アンチセンス・オ
リゴヌクレオチドと異なり、ホスホジエステルベースの分子は、３００ｍＭクエ
ン酸塩緩衝液等の高いイオン強度の緩衝液では、被包することができない。これ
は恐らく、結合親和性（binding affinities）の差異を反映する［センプル（Se
mple）等，２０００］。大きい分子の効率のよい被包化とは対照的に、ＡＴＰの
１０％未満は、０．２ｍｇ／ｍｇの初期［ＡＴＰ］対［脂質］比で、ＤＳＰＣ／
Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄のリポソーム中に閉じ込めることが
できる。ＡＴＰの閉じ込めは、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。表５は、
この閉じ込め手順が、ＤＯＰＥ系を含有する他の諸脂質組成物に拡張することが
できることを実証する。負に帯電したリポソーム；及び正に帯電した、ポリリシ
ンを含む高分子電解質；に関する予備結果によって、閉じ込みが、エタノール中
における、高分子電解質と、逆に帯電したリポソームとの相互作用の一般的特徴
であることが分かる。

【００９４】（例１５）エタノールに代えて、オクチルグルコシド（ＯＧＰ）を使用した。洗剤をリポ
ソームに添加し（１：１ｖ／ｖ）、最終濃度を３０〜４０ｍＭの範囲とした。
後続の諸工程は全て、例５で記述した通りに実施した。但し、ｐＨ４のクエン
酸塩緩衝液に対する初期透析工程は５時間に延長した。オリゴヌクレオチドは、
外部から添加されるオリグリーン（Oligreen）、蛍光オリゴ−結合性染料から保
護されるべきことが分かった。初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は、０
．２３（ｍｇ／ｍｇ）であった。粒度は、数平均粒度を表わす。ＤＳＰＣ／Ｃｈ
ｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄は、２０／４５／２５／１０モル％であ
った。表１１に、被包化の観察レベル、及び最終粒度をまとめる。

【００９５】

【００９６】当業者が、本発明、及び本明細書の諸技術を使用すれば、脂質で十分に被包さ
れた治療剤の粒子を生成するための、他の方法並びに手段を認識することが可能
であり、それら方法及び手段の全ては、特許請求の範囲に包含される。

【００９７】（参考文献）アルバースドーファ（Albersdorfer），Ａ．；Ｔ．，フェーダー（Feder）；
Ｅ．，ザックマン（Sackmann）：長領域斥力と短領域引力の相互作用による接着
性誘導済みドメインの形成（Adhesion-induced domain formation by interplay
of long-range repulsion and short-range attraction force: a model membr
ane study），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７３，２４５〜５７（１９９７）．アルモグ（Almog），Ｓ．；Ｂ．Ｊ．，リトマン（Litman）；Ｗ．，ウィムレ
イ（Wimley）；Ｊ．，コーヘン（Cohen）；Ｅ．Ｊ．，ワクテル（Wachtel）；Ｙ
．，バーレンホルツ（Barenholz）；Ａ．，ベン・ショール（Ben-Shaul），Ｄ．
，リヒテンベルク（Lichtenberg）：ホスファチジルコリンとオクチルグルコシ
ドの混合物における凝集と相変態の状態（States of aggregation and phase tr
ansformation in mixtures of phosphatidylcholine and octyl glucoside），
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，４５８２〜４５９２（１９９０）．アンジェロバ（Angelova），Ｍ．Ｉ．；Ｎ．，フリストファ（Hristova）；Ｉ
．，ツォネバ（Tsoneva）：巨大多重膜カチオン小胞への局部的微量注入に関す
るＤＮＡ誘導エンドサイトーシス（DNA-induced endocytosis upon local micro
injection to giant unilamellar cationic vesicles），Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙ
．Ｊ．，２８，１４２〜５０（１９９９）．ベイリー（Bailey），Ａ．Ｌ．；Ｐ．Ｒ．，クリス（Cullis）：アミノ脂質の
不斉性トランス二重層の分布による膜融合の調整（Modulation of membrane fus
ion by asymmetric transbilayer distribution of amino lipids），Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，１２５７３〜８０（１９９４）．バーヒフェルト（Barchfeld），Ｇ．Ｌ．；Ｄ．Ｗ．，デーマー（Deamer）：
全身麻酔薬の作用に関連するプロトン及びカリウムに対する脂質二重層の透過性
に及ぼすアルコールの影響（Alcohol effects on lipid bilayer permeability
to proton and potassium relation to action of general anesthetics），Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４４，４０〜４８（１９８８）．

【００９８】バリー（Barry），Ｊ．Ａ．；Ｋ．，ゴーリッシュ（Gawrisch）：リン脂質の
二重層の脂質・水の界面に結合するエタノールに関する直接的ＮＭＲの証拠（Di
rect NMR evidence for ethanol binding to the lipid-water interface of ph
ospholipid bilayers），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，８０８２〜８８（
１９９５）．ブライ（Bligh），Ｅ．Ｇ．；Ｗ．Ｊ．，ダイヤー（Dyer）：Ｃａｎ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，９１１〜１７（１９５９）．ボッツォラ（Bozzola），Ｊ．Ｊ．；Ｌ．Ｄ．，ラッセル（Russell）：電子顕
微鏡（Electron Microscopy），（Chapter 19-Interpretation of micrographs
），出版者ジョーン（Jones）及びバートレット（Bartlett），トロント（１９
９９）．チョン（Chonn），Ａ．；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）：リポソーム技術にお
ける近年の進歩と、全身へ遺伝子を送り出すためのそれら技術の適用（Recent a
dvances in liposome technologies and their applications for systemic gen
e deliverty），Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌ．Ｒｅｖ．，３０，７３〜８３（１
９９８）．デュポールテイル（Duportail），Ｄ．；リアノス（Lianos），Ｐ．：ピレン
及びピレン誘導体を用いた小胞の蛍光精査（Fluorescence probing of vesicles
using pyrene and pyrene derivatives），ＩｎＶｅｓｉｃｌｅｓ（編集：Ｍ
．ロソフ（Rosoff）），ｐ．２９５〜３６６（１９９６）．エバンス（Evans），Ｅ．Ａ．；Ｖ．Ａ．，（Parsegian）：細胞と小胞の凝集
における膜の変形と接着のエネルギー特性（Energetics of membrane deformati
on and adhesion in cell and vesicle aggregation），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，４１６，１３〜３３（１９８３）．

【００９９】フェルグナー（Felgner），Ｐ．Ｌ．；Ｔ．Ｒ．，ガーデック（Gadek）；Ｍ．
，ホルム（Holm）；Ｒ．，ローマン（Roman）；Ｈ．Ｓ．，チャン（Chan）；Ｍ
．，ウェンツ（Wenz）；Ｊ．Ｐ．，ノースロップ（Northrop）；Ｇ．Ｍ．，リン
ゴールド（Ringold）；Ｈ．ダニールソン（Danielson）：効率のよい、脂質媒介
ＤＮＡのトランスフェクション操作（Lipofection: a highly efficient, lipid
-mediated DNA transfection procedure），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３〜１７（１９８７）．フェルグナー（Felgner），Ｐ．Ｌ．：遺伝子治療のための非ウィルス方法（
Nonviral strategies for gene therapy），ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉ
ｃａｎ，２７６，１０２〜１０６（１９９７）．フィスケ（Fiske），Ｃ．Ｈ．；Ｙ．，サバロウ（Subbarow）：Ｊ．，Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，６６，３２５〜３２９（１９２５）．ガオ（Gao），Ｘ．；Ｌ．，ファング（Huang）：カチオンリポソーム媒介遺伝
子の運搬（Cationic liposome-mediated gene transfer），ＧｅｎｅＴｈｅｒ
ａｐｙ，２，７１０〜７２２（１９９５）．ジェニス（Gennis），Ｒ．Ｂ．：生体膜：分子構造と機能（Biomembranes: Mo
lecular Structure and Function），ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ニュー
ヨーク（１９８９）．グスタフソン（Gustafsson），Ｊ．；Ｇ．，アルビドソン（Arvidson）；Ｇ．
，カールソン（Karlsson）；Ｍ．アルムグレン（Almgren）：極低温により視覚
化されたカチオンリポソームとＤＮＡの間の複合体（Complexes between cation
ic liposomes and DNA visualized by cryo-TEM），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３５，３０５〜１２（１９９５）．ヒルシュバイン（Hirschbein），Ｂ．Ｌ．；Ｋ．Ｌ．，フェロン（Fearon）：
オリゴヌクレオチドの研究開発におけるＰ−３１ＮＭＲスペクトロスコピー−解
説（P-31 NMR spectroscopy in oligonucleotide research and development-co
mmentary），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ，７，５５〜６１（１９９７）．

【０１００】フックストラ（Hoekstra），Ｄ．：膜の融合をモニタリングするための蛍光分
析：胆汁脂質分泌物と小胞の相互作用における電位の適用（Fluorescence assay
s to monitor membrane fusion: potential application in biliary lipid sec
retion and vesicle interactions），Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２，６１Ｓ〜
６６Ｓ（１９９０）．ホルテ（Holte），Ｌ．Ｌ．；Ｋ．，ゴーリッシュ（Gawrisch）：ＭＡＳ−Ｎ
ＯＥＳＹスペクトルを用いたリン脂質多層中のエタノール分布の検出（Detectin
g ethanol distribution in phospholipid multilayers with MAS-NOESY Spectr
a），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，４６６９〜７４（１９９７）．ヒューブナー（Huebner），Ｓ．；Ｂ．Ｊ．，バタスビ（Battersby）；Ｒ．，
グリム（Grimm）；Ｇ．，チェブク（Cevc）：脂質ＤＮＡ複合体の形成：極低温
電子顕微鏡により観察される、ＤＮＡの存在下での脂質二重層の再編成と融合（
Lipid-DNA complex formation: reorganization and fusion of lipid bilayers
in the presence of DNA as observed by cryo-electron microscopy），Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７６，３１５８〜３１６６（１９９９）．ハイアット（Hyatt），Ｍ．Ａ．：電子顕微鏡の原理と技術（Principles and
Techniques of Electron Microscopy），出版者エドワード・アーノルド（Edw
ard Arnold），ロンドン，英国（１９８１）．カチャー（Kachar），Ｂ．；Ｎ．，フラー（Fuller）；Ｒ．Ｐ．，ランド（Ra
nd）：ホスホファチジルセリン含有小胞のカルシウム誘導相互作用に対する形態
学的反応（Morphological responses to calcium-induced interactions of pho
sphatidylserine-containing vesicles），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，５０，７７
９〜８８（１９８１）．

【０１０１】コマツ（Komatsu），Ｈ．；Ｓ．，オカダ（Okada）：エタノール誘導の外側相
の分離による、ホスホファチジルコリン／ホスホファチジルエタノールアミン混
合のリポソーム膜のエタノール強化透過（Ethanol-enhanced permeation of pho
sphaditylcholine/phosphatidylethanolamine mixed liposomal membranes due
to ethanol-induced lateral phase separation），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２８３，７３〜７９（１９９６）．ラシック（Lasic），Ｄ．Ｄ．：遺伝子運搬におけるリポソーム（Liposomes i
n Gene Delivery），Ｃｈａｐｔｅｒ７，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａ
ｔｏｎ（１９９７ａ）．ラシック（Lasic），Ｄ．Ｄ．；Ｈ．，ストレイ（Strey）；Ｍ．Ｃ．Ａ．，ス
チュアート（Stuart）；Ｒ．，ポドゴールニック（Podgornik）；Ｐ．Ｍ．，フ
レデリック（Frederik）：ＤＮＡリポソーム複合体の構造（The structure of D
NA-liposome complexes），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９，８３２〜
３３（１９９７ｂ）．レックバンド（Leckband），Ｄ．Ｅ．；Ｃ．Ａ．，ヘルム（Helm）；Ｊ．，イ
スラエルアクビリ（Israelachvili）：二重層の接着と融合におけるカルシウム
の役割（Role of calcium in adhesion and fusion of bilayers），Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１１２７〜１１４０（１９９３）．レンツ（Lentz），Ｂ．Ｒ．；Ｗ．，タルボット（Talbot）；Ｊ．，リー（Lee
）；Ｌ．-Ｘ．，チョン（Zheng）：トランス二重層脂質の再分配はモデル膜のポ
リ（エチレングリコール）処理を伴うが融合により誘導されない（Transbilayer
lipid redistribution accompanies poly（ethylene glycol） treatment of m
odel membranes but is not induced by fusion），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３６，２０７６〜２０８３（１９９７）．

【０１０２】ロベッケ（Lobbecke），Ｌ．；Ｇ．，チェブク（Cevc）：ホスファチジルコリ
ンの二重層膜の相挙動と相互連結とに及ぼす短鎖アルコールの影響（Effects of
short-chain alcohols on the phase behavior and interdigitation of phosp
hatidylcholine bilayer membranes），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，１２３７，５９〜６９（１９９５）．リポースキー（Lipowsky），Ｒ．：膜の立体配座（The conformation of memb
ranes），Ｎａｔｕｒｅ，３４９，４７５〜８１（１９９１）．マクドナルド（Macdnald），Ｐ．Ｍ．；Ｋ．Ｊ．，クローウェル（Crowell）
；Ｃ．Ｍ．，フランシン（Franzin）；Ｐ．，ミトラコス（Mitrakos）；Ｄ．Ｊ
．，セムキシン（Semchyschyn）：脂質の二重層膜中の高分子電解質誘導ドメイ
ン：重水素ＮＭＲ透視図（Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer
membranes: the deuterium NMR perspective），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，７６，４５２〜４６４（１９９８）．マウレル（Maurer），Ｎ．；Ａ．，モリ（Mori）；Ｌ．，パルマー（Palmer）
；Ｍ．Ａ．，モンク（Monck）；Ｋ．Ｗ．Ｃ．，モク（Mok）；Ｂ．，ムイ（Mui
）；Ｑ．Ｆ．，アクホング（Akhong）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）：遺伝子薬
物の細胞内運搬のための脂質ベース系（Lipid-based systems for the intracel
lular delivery of genetic drugs），Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６
，１２９〜１４０（１９９９）．マッキンタイア（McIntyre），Ｊ．Ｃ．；Ｒ．Ｇ．，スレイト（Sleight）：
リン脂質膜の不斉性のための蛍光分析（Fluorescence assay for phospholipid
membrane asymmetry），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１１８１９〜２７（
１９９１）．

【０１０３】メイ（May），Ｓ．；Ｄ．，ハリス（Harris）；Ａ．，ベン・ショール（Ben-S
haul）：カチオン性脂質ＤＮＡ複合体の相挙動（The phase behavior of cation
ic lipid-DNA complexes），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８，１６８１〜９７（２
０００）．マイアー（Meyer），Ｏ．；Ｄ．，キルポーチン（Kirpotin）；Ｋ．，ホン（H
ong）；Ｂ．，シュテルンベルク（Sternberg）；Ｊ．Ｗ．，パーク（Park）；Ｍ
．Ｃ．，ウッドル（Woodle）；Ｄ．パパハジョロポーロス（Papahadjopoulos）
：オリゴヌクレオチドのキャリヤとしてのポリエチレングリコールで被覆したカ
チオンリポソーム（Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as
carriers for oligonucleotides），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１５
６２１〜７（１９９８）．ミラー（Miller），Ｄ．Ｃ．；Ｇ．Ｐ．，ダール（Dahl）：カルシウム誘導リ
ポソーム融合における初期事象（Early events in calcium-induced liposome f
usion），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６８９，１６５〜９（
１９８２）．ミトラコス（Mitrakos），Ｐ．；Ｐ．Ｍ．，マクドナルド（Macdonald）：²Ｈ
ＮＭＲで検出される、脂質二重層膜中のカチオン性両親媒性物質のＤＮＡ誘導
外側分離（DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lip
id bilayer membranes as detected via ²H NMR），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３５，１６７１４〜２２（１９９６）．ニーダム（Needham），Ｄ．；Ｅ．，エバンス（Evans）：２０℃以下１０℃以
上の巨大脂質（ＤＭＰＣ）の小胞二重層の構造と機械的性質、２４℃での液晶−
結晶相転移（Structure and mechanical properties of giant lipid （DMPC）
vesicle bilayers from 20^oC below to 10^oC above the liquid crystal-crysta
lline phase transition at 24^oC），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，８２６
１〜６９（１９８８）．オリボン（Ollivon），Ｍ．；Ｏ．，アイデルマン（Eidelman），Ｒ．，ブル
ーメンソール（Blumenthal）；Ａ．，ウォルター（Walter）：卵ホスファチジル
コリン及びオクチルグルコシドのミセル−小胞転移（Micell-vesicle transitio
n of egg phosphatidylcholine and octyl glucoside），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，２７，１６９５〜１７０３（１９８８）．

【０１０４】パパハドロポーロス（Papahadlopoulos），Ｄ．；Ｗ．Ｊ．，ベイル（Vail）
；Ｋ．，ヤコブソン（Jacobson）；Ｇ．，ポステ（Poste）：渦巻き型脂質シリ
ンダー：単層脂質小胞の融合による製剤（Cochleate lipid cylinders: formati
on by fusion of unilamellar lipid vesicles），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ．，３９４，４８３〜９１（１９７５）．ラドラー（Radler），Ｊ．Ｏ．；Ｉ．，コルトバー（Koltover）；Ａ．，ジェ
ーミソン（Jamieson）；Ｔ．，サルディット（Salditt）；Ｃ．Ｒ．，サフィー
ニャ（Safinya）：自己集合したカチオン性脂質−ＤＮＡ遺伝子キャリヤ複合体
の構造及び界面の特徴（Structure and interfacial aspects of self-assemble
d cationic lipid-DNA gene carrier complexes），Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１４，
４２７２〜８３（１９９８）．ランド（Rand），Ｒ．Ｐ．；Ｂ．，カチャー（Kachar）；Ｔ．Ｓ．，リース（
Reese）：諸ホスファチジルセリン小胞の間のカルシウム誘導相互作用の動的形
態（Dynamic morphology of calcium-induced interactions between phosphati
dylserine vesicles），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，４７，４８３〜９（１９８５）
．ザックマン（Sackmann），Ｅ．：小胞及び細胞の形状と形状転移とに関する膜
曲げエネルギーの概念（Membrane bending energy concept of vesicle- and ce
ll-shapes and shape transitions），ＦＥＢＳＬｅｔ．，３４６，３〜１６
（１９９４）．

【０１０５】サフィーニャ（Safinya），Ｃ．Ｒ．；Ｅ．Ｂ．，シロタ（Sirota）；Ｄ．，
ルー（Roux）；Ｇ．Ｓ．，スミス（Smith）：興味ある膜の一般性：界面の剛性
に及ぼす共界面活性剤の影響（Universality in interesting membranes: The e
ffect of cosurfactants on the interfacial rigidity），Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．
Ｌｅｔｔ．，６２，１１３４〜３７（１９８９）．センプル（Semple），Ｓ．Ｃ．；Ｓ．Ｋ．，クリマック（Klimuk）；Ｔ．Ｏ．
，ハラシム（Harasym）；Ｎ．，ドスサントス（Dos Santos）；Ｓ．Ｍ．，アン
セル（Ansell）；Ｋ．Ｆ．，ウォン（Wong）；Ｎ．，マウレル（Maurer）；Ｈ．
，スターク（Stark）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）；Ｍ．Ｊ．，ホープ（Hope
）；Ｐ．，シェラー（Scherrer）：イオン性アミノ脂質を用いた脂質小胞中のア
ンチセンス・オリゴヌクレオチドの効率的被包化：新規で小さな多重膜リポソー
ム構造体の形成（Efficient encapsulation of antisense oligonucleotide in lipid vesicles
using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar ves
icle structures）（２０００）．ジーゲル（Siegel），Ｄ．Ｐ．；Ｗ．Ｊ．，グリーン（Green）；Ｙ．，タル
モン（Talmon）：ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構：温度ジャンプ極低
温透過電子顕微鏡を用いた研究（The mechanism of lamellar-to-inverted hexa
gonal phase transitions: a study using temperature-jump cryotransmission
electron microscopy），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６６，４０２〜１４（１９９
４）．ジーゲル（Siegel），Ｄ．Ｐ．；Ｒ．Ｍ．，エパンド（Epand）：ホスファチ
ジルエタノールアミンにおける、ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構：膜
融合機構の影響（The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase tr
ansition in phosphatidylethanolamine: implications for membrane fusion m
echanisms），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７３，３０８９〜３１１１（１９９７）
．

【０１０６】スレイター（Slater），Ｓ．Ｊ．；Ｃ．，ホー（Ho）；Ｆ．Ｊ．，タッデオ（
Taddeo）；Ｍ．Ｂ．，ケリー（Kelly）；Ｃ．Ｄ．，スタッブス（Stubbs）：膜
中の脂質−脂質相互作用に対する水素結合の寄与及び脂質順序の役割：コレステ
ロール、増加したリン脂質の不飽和度及びエタノールの影響（Contribution of
hydrogen bonding to lipid-lipid interactions in membranes and the role o
f lipid order: effects of cholesterol, increased phospholipid unsaturati
on, and ethanol），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３７１４〜３７２１．スレイター（Slater），Ｊ．Ｌ．；ファング（Huang），Ｃ．-Ｈ．：相互にか
み合った二重層膜（Interdigitated bilayer membranes），Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉ
ｄＲｅｓ．，２７，３２５〜３５９（１９８８）．ストラック（Struck），Ｄ．Ｋ．；Ｄ．，フックストラ（Hoekstra）；Ｒ．Ｅ
．，パガーノ（Pagano）：膜をモニタリングするための共鳴伝達の使用方法（Us
e of resonance energy transfer to monitor membrane fusion），Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，２０，４０９３〜４０９９（１９８１）．トーカン（Tocanne），Ｊ．Ｆ．；Ｊ．，テシエ（Teissie）：膜モデル系にお
ける、リン脂質のイオン化及びプロトンのリン脂質支持界面側方拡散（Ionizati
on of phospholipids and phospholipid-supported interfacial lateral diffu
sion of protons in membrane model systems），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，１０３１，１１１〜１４２（１９９０）．ホイラー（Wheeler），Ｊ．Ｊ．；Ｌ．，パルマー（Palmer）；Ｍ．，オッサ
ンロー（Ossanlou）；Ｉ．，マクラクラン（MacLachlan）；Ｒ．Ｗ．，グラハム
（Graham）；Ｍ．Ｊ．，ホープ（Hope）；Ｐ．，シェラー（Scherrer）；Ｐ．Ｒ
．，カリス（Cullis）：安定化したプラスミド脂質粒子：構造と特性（Stabiliz
ed plasmid-lipid particles: construction and characterization），Ｇｅｎ
ｅＴｈｅｒａｐｙ，６，２７１〜２８１（１９９９）．フィール（Vierl），Ｕ．；Ｌ．，ロベッケ（Lobbecke）；Ｎ．，ナーゲル（N
agel）；Ｇ．，チェブク（Cevc）：脂質の二重層膜のコロイドと相の挙動に及ぼ
す溶質の影響：エタノール−ジパルミトイルホスファチジルコリン混合物（Solu
te effects on the colloidal and phase behavior of lipid bilayer membrane
s: ethanol-dipalmitoylphosphatidylcholine mixtures），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ
．，６７，１０６７〜１０７９（１９９４）．シュ（Xu），Ｙ．；Ｓ．Ｗ．，ホイ（Hui）；Ｐ．，フレデリック（Frederick
）；Ｆ．Ｃ．，ショカ（Szoka）：カチオンリポソームの物理化学特性と精製（P
hysicochemical characterization and purification of cationic liposomes）
，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７７，３４１〜５３（１９９９）．

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に関する、諸手順工程の考えられるモデルを示す。

【図２】被包効率（encapsulation efficiencies）を、ＰＥＧ−Ｃｅｒ１０モル％を
含有するリポソームのためのエタノール濃度の関数として表わす。

【図３Ａ】エタノール濃度の関数としての、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄／
ＤＯＤＡＰのリポソーム中の自己消光（self-quenching）濃度で閉じ込められた
カルセインの解放（黒丸）を、同じ脂質組成のリポソームを用いて得られた被包
効率（白丸）と共に描く。

【図３Ｂ】本発明の方法を用いて、脂質で閉じ込められた核酸を形成する間の、脂質の迅
速な交換を示す。

【図４】温度の関数としてプロットした、閉じ込め効率と、カルセイン漏出のデータと
を示す。

【図５】Ａ、Ｂ及びＣは、脂質と結合したオリゴヌクレオチドのＮＭＲスペクトルを示
す。

【図６】初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットした、閉じ込
め効率のグラフを示す。

【図７】幾つかの種類のアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドとプラスミドＤＮ
Ａ（ｐＤＮＡ）とに対する被包効率を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/16 Ａ６１Ｋ 47/16 47/18 47/18 47/24 47/24 47/28 47/28 48/00 48/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウォン、キム、エフカナダ国ブリティッシュコロンビア、ヴァンクーヴァー、ウエストサーティンスアヴェニュー 4595 (72)発明者カリス、ピーター、アールカナダ国ブリティッシュコロンビア、ヴァンクーヴァー、ウエストファーストアヴェニュー 3732 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 DD19H DD19Q DD37Y DD43Y DD52F DD63H DD70H FF21 FF66 4C084 AA01 AA02 AA03 AA13 AA17 BA05 BA35 CA62 MA05 MA24 NA10 NA14 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA05 MA24 NA14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】帯電した治療剤の、脂質で十分に被包された治療剤粒子を製
造する方法であって、予め形成された脂質小胞から成る脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化
溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成するための不安定化剤とを
混合する工程であって、不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊するこ
となく脂質小胞の膜を不安定化するのに有効であり、予め形成された脂質小胞の内部に治療剤を被包するのに十分な時間、前記混合
物を定温放置する工程、前記不安定化剤を除去する工程、からなり、予め形成された脂質小胞が、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持
つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質から
なり、及び、修飾脂質が、予め形成された小胞の凝集を遅らせるものの妨げない
有効な量で、予め形成された小胞中に存在する、上記製造方法。
【請求項２】予め形成された脂質小胞中の帯電脂質がカチオン性脂質から
なり、治療剤がアニオン性治療剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】治療剤がポリヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】カチオン性脂質が、ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモ
ニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモ
ニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレス
テロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１,２−ジミリスチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−
Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ＤＯＴＭＡ及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（
ＤＯＰＥ）から成るカチオン性リポソーム；Ｎ−（１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミ
ンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセ
テート（ＤＯＳＰＡ）及びＤＯＰＥから成るカチオン性リポソーム；エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧ
Ｓ）から成るカチオン性脂質；Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウム
クロリド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−
プロパン（ＤＯＤＡＰ）から成る群から選ばれる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】脂質組成物が、帯電脂質１０〜４０モル％、中性脂質２５
〜４０モル％、ステロール３５〜５５モル％、及び修飾脂質２．５〜１０モル
％から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】不安定化剤がエタノールである、請求項１〜５のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項７】エタノールが、不安定化溶媒中に２５〜４０％の濃度で存在
する、請求項６記載の方法。
【請求項８】不安定化剤が界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項９】不安定化溶媒が、更にクエン酸塩緩衝液２５〜３００ｍＭ
から成る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】混合物は、約４０℃の温度で定温放置する、請求項１〜９
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】修飾脂質が、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ₁₄である、請求項１〜１０
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】予め形成された脂質小胞が、カチオン性脂質；ＤＯＰＥ及
びＤＳＰＣから成る群から選ばれる中性脂質；修飾脂質；並びにコレステロール
を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。