MXPA05010499A

MXPA05010499A - Particulas lipidicas que tienen un revestimiento lipidico asimetrico y metodo de preparacion de las mismas.

Info

Publication number: MXPA05010499A
Application number: MXPA05010499A
Authority: MX
Inventors: Yuanpeng Zhang
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-30
Publication date: 2006-05-25
Also published as: EP1613285A2; US20040191306A1; US20060165770A1; JP2007524604A; WO2004089339A2; KR20060034215A; CA2520864A1; AU2004227847A1; US7005140B2; WO2004089339A3

Abstract

Se describe un metodo para preparar particulas lipidicas que tienen un revestimiento lipidico asimetrico; la composicion lipidica del revestimiento lipidico exterior de las particulas varia de las superficies interior a exterior; las particulas lipidicas asimetricas se forman al preparar una composicion lipidica que contiene un lipido cargado y un agente terapeutico, en donde las particulas tienen cada una un revestimiento lipidico exterior con una laminilla lipidica externa y una estructura lipidica interna; posteriormente, las particulas se incuban bajo condiciones efectivas para remover el lipido cargado de la laminilla lipidica externa, haciendo de esta manera asimetrico el revestimiento lipidico; las particulas tienen la capacidad de recuperar carga superficial a traves de la translocacion de los lipidos.

Description

PARTICULAS LIPIDICAS QUE TIENEN UN REVESTIMIENTO LIPID1CO ASIMETRICO Y METODO DE PREPARACION DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una composición de partícula lipídica que tiene un revestimiento lipídico asimétrico, para uso en la administración de agentes terapéuticos a una persona, y más específicamente, a una célula.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las vesículas lipídicas, o liposomas, han demostrado utilidad para la administración de agentes terapéuticos y agentes diagnósticos a tejidos y órganos blanco. Las vesículas lipídicas tienen un interior acuoso encerrado por una o más bicapas lipídicas, en donde el agente terapéutico es atrapado en los espacios acuosos interiores o dentro de la bicapa lipídica. Por lo tanto, se pueden transportar por las vesículas lipídicas tanto fármacos solubles en agua como fármacos insolubles en agua dentro de los espacios acuosos y la bicapa lipídica, respectivamente. La acción de muchos fármacos implica su interacción directa con sitios dentro de la célula. Para su acción, el fármaco debe pasar a través de la membrana celular para alcanzar el citoplasma. El éxito para lograr la administración intracelular de un agente atrapado en un liposoma ha sido limitado por una variedad de razones. Una razón es que los liposomas se remueven rápidamente de la circulación por el sistema retículoendotelial, después de la administración sistémica a la corriente sanguínea. Otra razón es la dificultad inherente para administrar una molécula, en particular una molécula grande y/o cargada, dentro del citoplasma celular y/o del núcleo. La limitación de la toma rápida por el sistema retículoendotelial se ha superado en gran medida por una adición de un revestimiento superficial de polímero hidrófilo sobre los liposomas para enmascarar la vesícula del reconocimiento y toma por el sistema retículoendotelial. El tiempo de vida extendido en la circulación sanguínea del liposoma que tiene un revestimiento de cadenas de polietilenglicol polimérico (PEG) (Patente de E.U.A. No. 5,013,556) permite una mayor oportunidad para la toma por una célula. La administración de moléculas cargadas intracelularmente permanece como un reto técnico. En particular, la administración de ácidos nucleicos, tanto de ADN como de ARN, ha sido un reto, debido a la carga y tamaño de las moléculas. Las proteínas, péptidos, y compuestos fármacos cargados implican la misma dificultad técnica de transporte a través de una membrana celular. Un método para la administración de agentes negativamente cargados, particularmente fragmentos de ácidos nucleicos para terapia génica, ha sido la formación de complejos de ADN o ARN con un lípido catiónico. La interacción electrostática del lípido catiónico con el ácido nucleico permite la formación de partículas del lípido-ácido nucleico en un intervalo de tamaño adecuado para la administración in vivo. El lípido catiónico positivamente cargado sobre la superficie externa de la partícula es benéfica para la interacción con membranas celulares negativamente cargadas, para promover la fusión o toma de las partículas del lípido-ácido nucleico dentro de la célula. No obstante, la presencia de la carga positiva sobre la superficie externa de las partículas lipídicas preparadas con lípidos catiónicos es detrimental para el objetivo de lograr un tiempo de vida largo en la circulación sanguínea para una biodistribución extendida. La carga sobre las partículas ocasiona la unión inmediata con las superficies tisulares en o cerca del sitio de la administración, limitando sustancialmente la disponibilidad de partículas para circulación y distribución al sitio blanco. Sería deseable diseñar una composición de vesícula lipídica que es neutra después de la administración para permitir la biodistribución, incluso de la que está cargada después de un período de tiempo, por ejemplo, después de la biodistribución de las partículas, para permitir la interacción con las membranas celulares para la unión y administración intracelular del agente atrapado.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Por consiguiente, es un objetivo de la invención el proveer una composición de partícula lipídica que incluye un lípido cargado para la interacción con un agente terapéutico cargado, el cual incluso contiene una carga de superficie externa mínima después de su formación. Es otro objetivo de la invención el proveer una composición de partícula Hpídica que incluye un lípido cargado y tiene una carga de superficie extema mínima después de la formación de la partícula, pero que es capaz de desarrollar una carga durante el tiempo, tal como durante la incubación a temperatura fisiológica. En un aspecto, la invención incluye un método para preparación de partículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico externo. El método comprende la preparación de partículas lipídicas compuestas de (i) una composición lipídica que contiene un lípido cargado y (ii) un agente terapéutico. Cada una de las partículas tiene un revestimiento lipídico externo que tienen una hoja lipídica externa y una estructura lipídica interna. Luego las partículas se incuban bajo condiciones efectivas para remover dicho lípido cargado a partir de la hoja lipídica externa. En una modalidad, las partículas lipídicas están compuestas de una composición lipídica que contiene al menos un lípido catiónico. En otra modalidad, el paso de preparación comprende (i) la formación de vesículas lipídicas compuestas de la composición lipídica y (ii) la formación de complejos de las vesículas lipídicas con el agente terapéutico. La incubación de las partículas lipídicas, en una modalidad, implica la incubación en un medio que contiene vesículas lipídicas no cargadas. En otra modalidad, al medio de incubación se le puede añadir un conjugado de lípido-polímero-ligando. En otra modalidad, el medio de incubación puede incluir adicionalmente un derivado lipídico con un polímero hidrófilo. Un ejemplo de un derivado lipídico con un polímero hidrófilo es un derivado de fosfolípido con polietilenglicol. En otras modalidades, la incubación de las partículas se lleva a cabo a una temperatura menor de aproximadamente 15°C y/o por un tiempo mayor de aproximadamente 5 horas. En una modalidad, las partículas lipídicas son liposomas. En incluso otras modalidades, las partículas lipídicas se preparan para que tengan un agente terapéutico atrapado seleccionado a partir del grupo que consiste de un fármaco cargado, una proteína, un péptido, y un ácido nucleico. En otro aspecto, la invención incluye una composición que comprende partículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico compuesto de una hoja Iipídica externa y una estructura Iipídica interna. El revestimiento lipídico se forma de una composición Iipídica (i) que comprende un lípido cargado y (ii) que tiene una temperatura de transición de fase de gel-fase cristalina, en donde las partículas lipídicas tienen una carga pequeña o no apreciable a una temperatura menor de la temperatura de transición de fase de la composición Iipídica, pero tiene una carga mensurable después de la incubación a una temperatura superior a la temperatura de transición de fase. En una modalidad, la composición Iipídica tiene una transición de fase de entre aproximadamente 34-38°C.

En incluso otro aspecto, la invención incluye un método para preparación de partículas lipídicas que tienen una composición lipídica cargada asimétrica en su revestimiento lipídico externo antes de su administración in vivo. El método incluye la preparación de partículas lipídicas que comprenden (i) una composición lipídica que contiene un lípido cargado y (??) un agente terapéutico, en donde cada una de las partículas tiene un revestimiento lipídico externo teniendo una HOJA lipídica externa y una estructura lipídica interna. Las partículas se incuban bajo condiciones efectivas para remover los lípidos cargados a partir de la hoja lipídica externa. En una modalidad, la incubación se realiza incubando a una temperatura menor de aproximadamente15°C. En otra modalidad, el período de incubación es por un tiempo mayor de aproximadamente 5 horas. En otra modalidad, el medio de incubación comprende vesículas lipídicas neutras. Estos y otros objetivos y características de la invención se apreciarán más completamente cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención en conjunción con los dibujos anexos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 E son ilustraciones de las partículas lipídicas descritas en la presente invención; La figura 2A es un diagrama de flujo esquemático que muestra los pasos de formación de las partículas lipídicas; La figura 2B es una ilustración esquemática de una partícula ejemplar de lípido-ADN en cada paso de la formación; La figura 3 es una gráfica del potencial zeta, en mV, como una función de la concentración lipídica catiónica (DOTPA, porcentaje molar) para liposomas catiónicos; La figura 4A es una gráfica del potencial zeta, en mV, de partículas lipídicas asimétricas que consisten de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:24:24:2) como una función del tiempo de incubación, en horas, a 37°C en un regulador del pH (diamantes) y en un regulador del pH que contiene vesículas lipídicas neutras (triángulos); La figura 4B es una gráfica del potencial zeta, en mV, de partículas lipídicas asimétricas que consisten de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:25.5:22.5:2) como una función del tiempo de incubación, en horas, a 37°C, en un regulador del pH (diamantes) y en un regulador del pH que contiene vesículas lipídicas neutras (triángulos); La figura 5 es una gráfica del potencial zeta, en mV, de partículas lipídicas asimétricas que consisten de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:25.5:22.5:2) y se almacenan a 4°C por dos meses, como una función del tiempo de incubación, en horas, a 37°C, en un regulador del pH (diamantes) y en un regulador del pH que contiene vesículas lipídicas neutras (triángulos); y La figura 6 es una gráfica que muestra la expresión de luciferasa en las células, en pg/mg de proteína, por seis formulaciones de partículas lipídicas compuestas de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:25.5:22.5:2), en donde las formulaciones 1-3 son partículas control sin bicapa asimétrica y las formulaciones 4-6 son partículas lipídicas que tienen una bicapa externa asimétrica, en donde todas las formulaciones se incubaron a 37°C antes de la transfección por tiempos de 0 horas (formulaciones 1, 3), 48 horas (formulaciones 2, 5) y 60 horas (formulaciones 3, 6).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I. Definiciones "Partícula lipídica" como se utiliza en la presente invención se refiere a partículas de cualquier forma o tamaño que tienen al menos una bicapa lipídica. Es decir, el término incluye vesículas unilamelares, plurilamelares, y multilamelares. En algunas partículas, porciones de la partícula pueden ser porciones unilamelares y otras porciones pueden ser multilamelares. Las partículas pueden ser esféricas, o pueden ser más globulares en forma. Incluido dentro del término "partícula lipídica" se encuentran los liposomas así como complejos de lípidos con otros componentes de la partícula. La partícula puede tener un espacio acuoso definido, por ejemplo, un liposoma, o puede tener cavidades o regiones de espacio(s) acuoso(s), por ejemplo, complejos lipidíeos.

Abreviaturas: DMTAP: 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano; DOPE: dioleoilfosfatidiletanolamina; PEG: polietilenglicol; DS: diestearoilo; mPEG-DS: metoxi(polietilenglicol)-diestearoilo.

II. Partículas lipídicas y método de preparación En un aspecto, la invención se refiere un método para preparación de partículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico externo que tiene una superficie externa y una porción lipídica interna, y un gradiente de la composición a través del revestimiento lipídico que se extiende entre la superficie externa y la región lipídica interna. Dichas partículas tienen un gradiente de la composición a través de toda o de una porción del revestimiento lipídico que tiene lo que se refiere como una composición lipídica asimétrica, como se ilustrará a continuación en las figuras 1A-1E, en donde se muestran ilustraciones idealizadas de dichas partículas lipídicas. La figura 1A muestra una partícula lipídica unilamelar 10 que tiene un revestimiento lipídico externo particular 12. Se muestra una porción del revestimiento lipídico en vista esquemática para ilustrar de mejor forma el arreglo de los lípidos. El revestimiento está comprendido de una superficie de revestimiento externa 14 y una superficie de revestimiento interna 16. Como se ilustra en la presente invención, el revestimiento toma la forma de una bicapa lipídica; no obstante esta ilustración está idealizada y el revestimiento lipídico puede tener un arreglo más complejo de lípidos. La superficie de revestimiento externo corresponde a una hoja lipídica externa del revestimiento, mientras que los grupos de cabezas polares de los lípidos en la hoja están orientados para contacto con el medio externo masivo en el cual las partículas están suspendidas. La superficie de revestimiento interno corresponde a una estructura lipídica interna, la cual puede ser una hoja lipídica o puede ser un arreglo más complejo de lípidos, en donde los grupos de cabezas polares de los lípidos en la hoja interna están orientados para tener contacto con el espacio acuoso de la partícula. La hoja lipídica externa tiene una carga baja o mínima, en virtud de que está comprendida predominantemente de lípidos que no contienen carga positiva (catiónica) o negativa (aniónica), por ejemplo, lípidos que forman vesículas neutras u otros lípidos neutros. En una modalidad preferida, la hoja lipídica externa está comprendida de lípidos neutros o aniónicos; es decir, la hoja lipídica externa contiene poca carga catiónica o carga catiónica no apreciable debido a la presencia de lípidos catiónicos. La estructura lipídica interna está comprendida de lípidos cargados. Esta característica se ilustra en la figura 1A por la indicación de lípidos positivamente cargados en 18, 20 en la estructura lipídica interna que provee carga positiva sobre la superficie de revestimiento interno. Para esta partícula lipídica que tiene un revestimiento lipídico unilamelar, la diferencia en la composición lipídica entre las hojas lipídicas internas y externas forma lo que se refiere en la presente invención como un revestimiento lipídico asimétrico. Más específicamente, la diferencia en composición lipídica cargada a través del grosor del revestimiento lipídico externo se refiere como un revestimiento lipídico externo asimétrico.

Las figuras 1B-1C son ilustraciones de una vesícula lipídica multilamelar, que también se prepara mediante el método a ser descrito para producir una bicapa o revestimiento lipídico externo asimétrico. Con referencia inicial a la figura 1B, la vesícula 24 tiene una pluralidad de capas de revestimiento lipídico anidadas, concéntricas, indicadas como una bicapa idealizada 26, 28, 30. En la práctica, el número de bicapas lipídicas puede ser mucho más de las tres ¡lustradas en el dibujo y puede ser más compleja en el arreglo lipídico que la bicapa simplificada mostrada. Se muestra una porción del revestimiento lipídico, que comprende las bicapas lipídicas 26, 28, 30, en vista esquemática para facilitar la observación del arreglo lipídico. El revestimiento lipídico 30 es la capa lipídica más externa y se encuentra en contacto con el medio externo en el cual las partículas están suspendidas. Otro revestimiento lipídico 30 tiene una superficie externa 32 y una superficie interna 34, en donde la superficie extema se define por una hoja lipídica externa 36 y la superficie interna se define por una estructura lipídica interna 38. La hoja lipídica externa 36 es distinta en su composición lipídica en relación a la composición lipídica de la estructura lipídica interna 38 en en tanto la hoja lipídica externa tiene menos lípidos cargados, y más preferiblemente menos lípidos catiónicos. En contraste, la estructura lipídica interna incluye lípidos catiónicos que resultan en una carga de superficie positiva a lo largo de la superficie interna 38, como se indica por los símbolos más en 40, 42. Por lo tanto, en una partícula lipídica multilamelar ilustrada en la figura 1B, el revestimiento lipídico externo es asimétrico con respecto a su composición lipídica. La figura 1C muestra una partícula lipídica 44 similar a una partícula lipídica 24 de la figura 1B, y los elementos similares se modifican por identidades numéricas semejantes. La partícula 44 incluye una pluralidad de capas lipídicas, tales como las capas 26, 28, 30. El revestimiento lipídico externo 30 tiene una superficie externa 32 y una superficie interna 34. En esta modalidad, la composición lipídica del revestimiento lipídico externo 30 es relativamente constante entre la superficie externa 32 y la superficie interna 34, en donde el revestimiento lipídico externo tiene lípidos mínimamente cargados. No obstante, la capa lipídica interna a partir del revestimiento lipídico externo 30, incluye lípidos cargados en esta composición como se indica por los símbolos más 43, 45, 47. Por lo tanto, en esta modalidad de la partícula lipídica, el revestimiento lipídico asimétrico es con respecto a la composición lipídica del revestimiento lipídico externo 30 a la estructura lipídica interna o capas lipídicas. Es decir, el revestimiento lipídico como un todo es asimétrico con respecto a su composición lipídica puesto que se extiende a partir de la superficie externa de la partícula hacia las regiones internas de la partícula. La figura 1 D muestra otra modalidad de una partícula lipídica multilamelar 46, similar a aquella descrita en la figura 1B. No obstante, la partícula 46, incluye un derivado lipídico con un polímero hidrófilo, tales como los lípidos 48, 50, 52, los cuales son representativos de los derivados lipidíeos en cada una de las bicapas lipídicas, 54, 56, 58 como se muestran en el dibujo. Como se discutirá a continuación, las partículas que tienen un polímero-derivado Iipídico distribuido a través del revestimiento Iipídico de la partícula se forman al incluir el polímero-derivado Iipídico en la mezcla lipídica durante la formación de la partícula. El revestimiento Iipídico externo 58 en la partícula 46 tiene una composición lipídica asimétrica debido a la ausencia de lípidos cargados en la hoja lipídica externa 60 y la presencia de lípidos cargados, tales como los lípidos 62, 64, en la estructura lipídica interna 66. La presencia de lípidos cargados en la HOJA lipídica interna resulta en una superficie de revestimiento Iipídico interno cargada, como se indica por los símbolos más a lo largo de la superficie del revestimiento interno. La partícula lipídica en la figura 1D incluye una característica adicional que se puede incluir opcionalmente. Las partículas lipídicas también se pueden preparar para que incluyan ligandos direccionadores, tales como los ligandos 70, 72, que actúan como dispositivos direccionales para traer a las partículas lipídicas hacia un sitio deseado para acción terapéutica. Los ligandos direccionadores unidos a las partículas lipídicas se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,891 ,468, 6,056,973 y 6,180,134, la descripción de estas patentes con respecto a las porciones adecuadas para ligandos direccionadores, preparación de conjugados lipidíeos que portan los ligandos, y preparación de partículas lipídicas que comprenden conjugados de lípido-Iigando se incorporan como referencia en la presente invención. Los ligandos direccionadores se pueden incorporar dentro de las partículas lipídicas después de la formación mediante incubación de las partículas lipídicas pre-formadas en una solución micelar de conjugados de lípido-ligando o de lípido-enlazador-ligando. Los ligandos direccionadores también se pueden incorporar dentro de las partículas lipídicas mediante la inclusión de un conjugado-ligando en la composición lipídica para la formación de la partícula. Otra partícula lipídica ejemplar se ilustra en la figura 1E. Como se mencionó anteriormente, las ilustraciones en las figuras 1A-1D están altamente idealizadas, mostrado partículas esféricas, con capas lipídicas definidas y espacios acuosos definidos. En la práctica, las partículas pueden ser mucho más complejas en estructura, como se ilustra parcialmente en la figura 1E. La figura 1 E muestra una partícula de lípido-ADN 51 comprendida de lípidos catiónicos (denotados por un grupo de cabeza negra, tales como los lípidos 53, 55) y lípidos neutros (denotados por un grupo de cabeza blanca, tales como los lípidos 57, 59). El ADN 61 está dispuesto en el interior de la partícula y vía la interacción de la carga se reviste con más lípidos catiónicos que con lípidos neutros. La partícula tiene una hoja lipídica extema 63 definida y una estructura lipídica interna comprendida de la capas lipídicas internas a la hoja lipídica externa. Las estructuras lipídicas internas incluyen así a la hoja interna 65 en oposición a la hoja externa 63 y las bicapas internas rodeando el ADN, tal como la bicapa 67, 69. La partícula '51 tiene cavidades de espacio acuoso, tal como la cavidad 71 , pero no tienen el compartimento interno acuoso definido común en los liposomas convencionales.

A. Preparación de la partícula lipídica Como se discutió anteriormente, particularmente con respecto a las figuras 1 B-1C, las partículas descritas en la presente invención tienen un revestimiento lipídico asimétrico con respecto ya sea a una capa lipídica particular en la partícula (por ejemplo, figura 1B en donde la composición lipídica de la capa lipídica externa es asimétrica) o con respecto al revestimiento lipídico conforme se extiende a partir de la superficie externa de la partícula hacia las regiones internas de la partícula (figura 1C). La preparación de dichas partículas lipídicas asimétricas se describirá a continuación. Se prepararon las partículas lipídicas que tenían un revestimiento lipídico externo asimétrico de conformidad con un método ilustrado en términos generales en la figura 2A, en donde se provee un diagrama de flujo esquemático de los pasos básicos implicados en la formación de las partículas lipídicas. La figura 2B provee una ilustración esquemática de la naturaleza de una partícula lipídica ejemplar en cada paso en la formación. En términos generales, el primer paso es preparar las vesículas lípidas a partir de una composición lipídica que incluye un lípido cargado, tal como un lípido catiónico. A continuación, las vesículas lipídicas se mezclan con un agente terapéutico, para la formación en un complejo del agente con las vesículas lipídicas cargadas, formando así partículas lipídicas. Una partícula ejemplar que corresponde a este paso se muestra como la partícula 80 en la figura 2B. La partícula 80 comprende lípidos catiónicos (denotados por un grupo de cabeza negra, tales como los lípidos 82, 84) y lípidos neutros (denotados por un grupo de cabeza blanca, tales como los lípidos 86, 88). El ADN 90 se dispone en el interior de la partícula y vía Interacción de carga se reviste con más lípidos catiónicos que con lípidos neutros. Al continuar con referencia a la figura 2A, luego las partículas lipídicas son incubadas en un medio y bajo condiciones que logran la extracción de lípidos cargados a partir del revestimiento lipídico externo o a partir de la hoja externa de revestimiento lipídico más externo de las partículas lipídicas. Se muestra la naturaleza de la partícula de lípido-ADN después de la incubación con un medio para incubación que comprende una suspensión de los liposomas neutros como la partícula 100 en la figura 2B. La incubación de la partícula resultó en la remoción de los lípidos catiónicos a partir de la hoja lipídica externa 102, como se denota en el esquema por los pocos lípidos con un grupo de cabeza negra en relación con la partícula 80 antes de la incubación. La diferencia en la composición entre la hoja lipídica externa y las estructuras lipídicas internas provee una composición lipídica asimétrica a la partícula. La partícula asimétrica 100 tiene una carga de superficie reducida en relación con la partícula 80 antes de la incubación. En una modalidad de la invención, la incubación es adecuada para remover los lípidos cargados a partir de la hoja lipídica externa y a partir de las estructuras lipídicas internas limítrofes con la hoja lipídica externa. En otra modalidad, la incubación se lleva a cabo de dicha manera, por ejemplo al variar el tiempo de incubación, temperatura, y/o medio, para remover los lípidos cargados principalmente a partir de la hoja lipídica externa. Esta última modalidad se ilustra en ia partícula 110 en la figura 2B, y se discutirá más completamente a continuación. En breve, en esta última modalidad, los lípidos cargados están presentes en la estructura lipídica interna, tal como en la hoja lipídica 104 de la partícula 100, y está disponible para la translocación o "flip-flop" a una hoja lipídica externa. La translocación se logra mediante la incubación de las partículas a una temperatura adecuada para permitir el movimiento de los lípidos, típicamente a una temperatura superior a la temperatura de transición de fase de la composición lipídica. La concentración más alta de lípidos cargados en las capas lipídicas internas permite la translocación de los lípidos cargados hacia la región de más baja concentración en la hoja lipídica externa. La translocación resulta en una regeneración de la carga de superficie en la partícula de lípido-ADN, como se ilustra en la partícula 110 por la presencia incrementada de lípidos catiónicos (representados por los grupos de cabeza polar negra) en relación con aquellos en la partícula 00. También es posible generar partículas lipídicas asimétricas al preparar ¡nicialmente las vesículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico externo asimétrico y luego formando un complejo de las vesículas asimétricas con un fármaco cargado. En esta modalidad, las partículas lipídicas comprendidas de un lípido cargado se incuban bajo condiciones adecuadas para la remoción de una mayoría de lípidos cargados a partir del revestimiento lipídico externo u hoja, generando así vesículas asimétricas.

Después de la formación del revestimiento lipídico asimétrico, las vesículas lipídicas asimétricas se forman subsecuentemente en un complejo con un fármaco para formar partículas asimétricas de lípido-fármaco. 1. Preparación de las vesículas lipídicas Las vesículas lipídicas, típicamente liposomas unilamelares o multilamelares, se preparan a partir de una composición lipídica que incluye un lípido cargado, preferiblemente un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser el lípido único formador de vesícula en la composición, o puede ser uno o dos o diversos lípidos, formadores de vesícula o no formadores de vesícula, en la composición. Las vesículas unilamelares ejemplares preparadas en apoyo de la invención se prepararon a partir de una composición lipídica que comprende un lípido catiónico formador de vesícula, lípidos neutros, y un derivado lipídico formador de vesícula con un polímero hidrófilo. Un lípido catiónico formador de vesícula es uno que tiene un grupo de cabeza polar con una carga positivamente neta, al pH operacional, por ejemplo, pH 4-9. Los lípidos catiónicos ejemplares incluyen 1,2-dioleliloxi-3-(trimetilam¡no)propano (DOTAP); bromuro de N-[1-(2,3,-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (D RIE); bromuro de N-[1-(2,3,-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidrox¡ etilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 1,2-dímiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP); dioleoilfosfatidilcolina (DOPC); 3ß[?-(?',?'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol); dimetildioctadecilamonio (DDAB), agentes tensioactivos catiónicos, esterol aminas, y otros. También es posible volver a un lípido neutro o negativamente cargado catiónico mediante derivación con una porción catiónica. Por ejemplo, un fosfolípido, tal como fosfatidiletanolamina, se puede derivar en su grupo de cabeza polar con una porción positiva, por ejemplo, lisina, como se ilustra, por ejemplo, para el lípido derivado DOPE con L-lisina (LYS- DOPE) (Guo, L. et al., Journal of liposome Research 3(1): 51-70 (1993)). También se incluyen en esta clase de lípidos catiónicos los glicolípidos, tales como cerebrósidos y gangliósidos que tienen un grupo catiónico de cabeza polar. Otro lípido catiónico formador de vesícula el cual se puede emplear es colesterol amina y esteróles catiónicos relacionados. Se apreciará que el lípido cargado incluido en la formación de las vesículas lipídicas puede ser un lípido aniónico, tal como dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG); dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE); dioleoilfosfatidilcolina (DOPC); y otros. La composición lipídica para la preparación de las vesículas lipídicas, además de las especies lipídica cargadas, puede incluir a otros lípidos. Típicamente, la composición incluirá un lípido formador de vesícula, el cual se refiere a un lípido que se puede formar espontáneamente hacia vesículas en bícapa en un medio acuoso, como se ejemplifica por los fosfolípidos. La composición lipídica también puede incluir lípidos que se incorporan de manera estable hacia bicapa lipídica, con su porción hidrófoba en contacto con la región interior, hidrófoba de la membrana en bicapa, y su porción del grupo de cabeza orientada hacia la superficie polar exterior de la membrana lipídica en bicapa. Los lípidos formadores de vesícula preferiblemente son los que tienen dos cadenas de hidrocarburo, típicamente cadenas acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Existe una variedad de lípidos sintéticos formadores de vesícula y lípidos formadores de vesícula que se presentan de manera natural, incluyendo los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, y esfingomielina, en donde las dos cadenas de hidrocarburo típicamente tienen entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono en longitud, y tienen grados variables de insaturación. Los fosfolípidos con cadenas acilo que tienen grados variables de saturación se pueden obtener comercialmente o se pueden preparar de conformidad con los métodos publicados. En una modalidad, el lípido formador de vesícula se selecciona para lograr un grado específico de fluidez o rigidez para controlar las condiciones efectivas para la inserción de un conjugado de lípido-ligando direccionador y/o para permitir la translocación de los lípidos cargados a partir de la estructura lipídica interna a la hoja lipídica externa después de la administración in vivo de las partículas lipídicas, como se describirá. Las partículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico más rígido se obtuvieron mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido, por ejemplo, un lípido que tiene una temperatura de transición de fase relativamente alta, por ejemplo, hasta 60°C. Los lípidos rígidos, por ejemplo, saturados contribuyen a una mayor rigidez de la membrana en el revestimiento lipídico. También se sabe que otros componentes lipidíeos, tal como colesterol, contribuyen a la rigidez de la membrana en estructuras lipídicas. Los lípidos rígidos ejemplares incluyen diestearil fosfatidilcolina (DSPC), la cual tiene una temperatura de transición de fase de 62°C, y fosfatidilcolina hidrogenada de soya (HSPC), la cual tiene una temperatura de transición de fase de 58°C. Una bicapa más fluida se logra mediante la incorporación de un lípido relativamente fluido, típicamente uno que tiene una fase lípida con una temperatura de transición de fase liquida-fase cristalina relativamente baja, por ejemplo, en o por debajo de la temperatura corporal de aproximadamente 37-38°C. Los ejemplos de lípidos que tienen una temperatura de transición de fase por debajo de 38°C son fosfatidilcolina de huevo (-15 a -7°C), dimiristoilfosfatidilcolina (23°C), 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (27°C), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidiIcolina (35°C), dimiristoilfosfatidilglicerol (23°C), esfingomielina de cerebro (32°C) (Szoka, F. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980)). Las temperaturas de transición de fase de muchos lípidos se tabulan en una variedad de fuentes, tales como Szoka & Papahadjopoulos, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467-508 (1980), Avanti Polar Lipids catalogue, y Lipid Thermotropic Phase Transition Datábase (LIPIDAT, NIST Standard Reference Datábase 34). Como se mencionó anteriormente con respecto a la figura 1 D, las partículas lipídicas pueden incluir opcionalmente un revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas y/o cojugados direccionadores unidos a lípido. Cualquiera de estas características se puede incorporar dentro de las partículas lipídicas mediante la inclusión de un lípido derivado de un polímero y/o un lípido derivado de un ligando en la composición lipídica utilizada para la formación de las vesículas lipídicas en el paso inicial del método. También es posible incorporar estas características en las partículas lipídicas en el tercer paso del proceso, cuando las partículas lipídicas se incuban en un medio. En este caso, se incluye el lípido derivado de un polímero y/o un lípido derivado de un ligando en el medio de incubación y se inserta dentro del revestimiento lipídico externo de las partículas lipídicas durante la incubación. Este método denominado de "inserción" se ha descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,891,468, 6,056,973, y 6,210,707. Se han descrito los derivados lipidíeos con un polímero hidrófilo, y liposomas que contienen lípidos derivados de polímeros (Patente de E.UA No. 5,013,556; Patente de E.U.A. No. 5,395,619). Los lípidos derivados de polímeros incorporados dentro de un revestimiento de lipídico forman un revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas alrededor de la vesícula lipídica. El revestimiento de superficie de las cadenas poliméricas hidrófilas es efectivo para incrementar el tiempo de vida en circulación sanguínea in vivo de las partículas lipídicas cuando se compara con las partículas lipídicas que carecen de dicho revestimiento. Los lípidos formadores de vesícula adecuados para derivación con un polímero hidrófilo incluyen cualquiera de aquellos lípidos anteriormente listados, y, en particular fosfolípidos, tal como diestearil fosfatidiletanolamina (DSPE). Los polímeros hidrófilos adecuados para derivación con un lípido formador de vesícula incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxletilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias peptídicas hidrófilas. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros o como copolímeros en bloque o copolímeros al azar. Una cadena polimérica hidrófila preferida es el polietilenglicol (PEG), preferiblemente como una cadena PEG que tiene un peso molecular entre 500-10,000 Daltones, más preferiblemente entre 1 ,000-5,000 Daltones. Los análogos metoxi o etoxi-encasquetados del PEG (por ejemplo, mPEG) también son polímeros hidrófilos preferidos, comercialmente disponibles en una variedad de tamaños poliméricos, por ejemplo, 120-20,000 Daltones. Se ha descrito la preparación de lípidos formadores de vesícula derivados con polímeros hidrófilos, por ejemplo en la Patente de E.U.A. No. 5,395,619. También se ha descrito la preparación de liposomas incluyendo dichos derivados lipidíeos, en donde típicamente, entre 1-20 del porcentaje molar de dicho derivado lipídico se incluye en la formulación del liposoma. También se han descrito los derivados lipidíeos con ligandos direccionadores (Patente de E.U.A. No. 5,891 ,468, 6,056,973, y 6,210,707).

Los ligandos direccionadores típicamente son porciones que son parte de un par de unión de receptor-ligando, en donde el ligando del par está unido a las partículas lipídicas para permitir que las partículas se unan específicamente a un blanco particular que contiene su par receptor. Los ligandos ejemplares se establecen en la Patente de E.U.A. No. 5,891 ,468, y se incorporan como referencia en la presente invención. Los ligandos particularmente preferidos son aquellos que después de la unión a un receptor celular son internalizados por la célula. Dichos ligandos permiten la administración intercelular de los contenidos de las partículas lipídicas. 2. Formación de partículas lipídicas vía la formación de complejos de las vesículas lipídicas con un agente terapéutico Al continuar con referencia a las figuras 2A y 2B, después de la formación de las vesículas lipídicas cargadas, las vesículas se mezclan con un agente terapéutico para formar partículas lipídicas. Como se utiliza en la presente invención, "vesículas lipídicas" se refiere a las estructuras lipídicas, las cuales pueden ser liposomas unilamelares o multilamelares pequeños o grandes o pueden ser estructuras lipídicas que tienen capas lipídicas menos definidas. "Partículas lipídicas" se refiere a las vesículas lipídicas que forman un complejo con un agente terapéutico, y más particularmente con un agente terapéutico cargado. Como se mencionó anteriormente, las vesículas lipídicas incluyen un lípido cargado, para comunicar una carga general a la vesícula. La carga general puede ser negativa, mediante la inclusión de lípidos aniónicos, o positiva, mediante la inclusión de lípidos catiónicos. El agente terapéutico mezclado con las vesículas lipídicas cargadas también está cargado, y más específicamente, porta una carga opuesta a la carga de las vesículas lipídicas. Las vesículas lipídicas catiónicas se mezclan con un complejo de agente terapéutico negativamente cargado para formar partículas lipídicas. De manera similar, las vesículas lipídicas aniónicas se mezclan con un complejo de agente terapéutico positivamente cargado para formar partículas lipídicas. Los agentes terapéuticos positivamente y negativamente cargados se conocen en la técnica. Un agente terapéutico negativamente cargado preferido es un ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, de cadena sencilla o de cadena doble. En una modalidad, el ácido nucleico es un oligonucleótido de ADN antisentido compuesto de secuencias complementarias a su blanco, usualmente un ARN mensajero (ARNm) o un precursor de ARNm. El ARNm contiene información genética en la orientación funcional, o sentido y la unión del oligonucleótido antisentido inactiva al ARNm pretendido y previene su traducción hacia proteína. Dichas moléculas antisentido se determinan basándose en experimentos bioquímicos que muestran que las proteínas se traducen a partir de ARNs específicos y que una vez que se conoce la secuencia del ARN, se puede diseñar una molécula antisentido que se unirá a ésta a través de la complementariedad de pares de bases de Watson-Crick. Dichas moléculas antisentido típicamente contienen entre 10-30 pares de bases, más preferiblemente entre 10-25, y más preferiblemente entre 15-20. El oligonucleótido antisentido se puede modificar para que tenga una resistencia mejorada a la hidrólisis por nucleasa, como con fosforotioato, metilfosfonato, fosfodiéster y p-etoxi oligonucleótidos (WO 97/07784). Los ácidos nucleicos son útiles como agentes terapéuticos para una variedad de terapias, incluyendo, pero no limitadas a, tratamiento de enfermedades y condiciones virales, malignas e inflamatorias, tales como, fibrosis quística, deficiencia en adenosinadesaminasa y SIDA. Se contempla el tratamiento del cáncer mediante administración de genes supresores de tumor, tales como APC, DPC4, NF-1 , NF-2, MTS1, RB, p53, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, o administración de oncogenes, tales como PDGF, erb-B, erb-B2, RET, ras (incluyendo Ki-ras, N-ras), c-myc, N-myc, L-myc, Bcl-1, Bcl-2 y MDM2. También se contempla la administración de los siguientes ácidos nucleicos para el tratamiento de las condiciones indicadas: HLA-B7, tumores, carcinoma colorectal, melanoma; 1L-2, cánceres, especialmente cáncer de mama, cáncer de pulmón, y tumores; IL-4, cáncer; TNF, cáncer; IGF-1 antisentido, tumores cerebrales; IFN, neuroblastoma; GM-CSF, carcinoma de célula renal; MDR-1, cáncer, especialmente cáncer avanzado, cánceres de mama y de ovario; Factor VIII, hemofilia, y HSV timidina cinasa, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, mesotelioma, y cáncer ovárico. Además de los ácidos nucleicos, las moléculas de fármacos orgánicos cargados también son adecuadas para la formación de complejo con las vesículas lipídicas. Se conoce en la técnica una variedad de fármacos cargados y se reconoce fácilmente por aquellos expertos en la técnica. 3. Incubación de partículas lipídicas para crear el revestimiento lipídico externo asimétrico Al continuar con referencia a las figuras 2A y 2B, después de la formación en complejo de las vesículas lipídicas con el agente terapéutico, las partículas lipídicas son incubadas bajo condiciones efectivas para extraer al menos una porción de los lípidos cargados a partir de la capa del revestimiento lipídico externo o a partir de la hoja lipídica externa del revestimiento lipídico externo. Como se discutió anteriormente en las figuras 1A a 1 E, las partículas lipídicas incluyen un revestimiento lipídico externo que comprende una estructura lipídica interna y una superficie lipídica externa. La superficie lipídica externa u hoja se encuentra en contacto con el medio de incubación externo. Las partículas lipídicas se incuban para lograr la remoción de sustancialmente todos los lípidos cargados a partir de la hoja externa o a partir del revestimiento lipídico más externo, por lo tanto volviendo asimétrico al revestimiento lipídico externo. El grado de remoción de los lípidos cargados se determina y controla por factores tales como el tiempo de incubación, temperatura, y medio, como se describirá adicionalmente. La remoción de los lípidos cargados a partir del revestimiento lipídico extemo u hoja se logra al colocar las partículas lipídicas en un medio dentro del cual los lípidos cargados se particionan. Están disponibles las condiciones para llevar a cabo el particionamiento de los lípidos a partir de las partículas en el medio, e incluyen la selección del medio de incubación, de la temperatura del medio de incubación, y del tiempo de incubación. En estudios que se llevan a cabo en apoyo de la invención, fue efectivo un medio de incubación que comprendía una suspensión acuosa de vesículas lipídicas neutras para ocasionar el particionamiento de los lípidos catiónicos a partir del revestimiento lipídico externo u hoja del revestimiento lipídico de las partículas. Un medio de incubación que contenía vesículas lipídicas neutras sirvió como un vertedero para los lípidos catiónicos, ocasionando el movimiento de los lípidos catiónicos a partir de una alta concentración en el revestimiento extemo de la partícula lipídica hacia una concentración baja en el medio de incubación. Un medio de incubación preferido contiene el mismo lípido neutro presente en las partículas lipídicas, de manera que no ocurre un movimiento substancial del lípido neutro a partir de las partículas hacia el medio de incubación. Otros medios ejemplares de incubación son aquellos que incluyen un lípido negativamente cargado, un agente tensioactivo, partículas poliméricas, u otros materiales capaces de extraer un lípido cargado a partir de las partículas lipídicas. En otra modalidad, después de la incubación de las partículas lipídicas para reducir la carga de superficie catiónica, las partículas se incuban subsecuentemente en un segundo medio que incluye una especie lipídica negativamente cargada para introducir una carga negativa a la hoja lipídica externa de las partículas lipídicas.

Como se mencionó anteriormente, las partículas lipídicas pueden incluir opcionalmente un revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas y/o conjugados direccionadores unidos al lípido. Los lípidos derivados con polímero o lípidos derivados con ligando se pueden incorporar dentro de las partículas lipídicas mediante la inclusión de uno o de ambos conjugados en el medio de incubación. Los conjugados se insertan dentro del revestimiento lipídico externo de las partículas lipídicas durante la incubación. La inserción de un conjugado de lípido-polímero y/o un conjugado de ligando direccionador del lípido durante la incubación de las partículas lipídicas se puede modificar en un extremo de conformidad con la composición de la bicapa lipídica, el ligando direccionador, y otros factores. Por ejemplo, se puede lograr una velocidad rápida de inserción mediante una temperatura de incubación más elevada, pero se debe balancear en contra de la temperatura a la cual se puede calentar de manera segura el ligando sin afectar su actividad. La temperatura de transición de fase de los lípidos en la composición lipídica también impondrá la temperatura adecuada para inserción. También se apreciará que la inserción puede variar por la presencia de solventes, tales como solventes amfipáticos incluyendo polietilenglicol y etanol, o detergentes.

B. Caracterización de las partículas lipídicas Las partículas lipídicas se prepararon como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, las vesículas unilamelares pequeñas catiónicas (SUVs) se prepararon a partir de una composición lipídica de DMTAP, DOPE, colesterol, y mPEG-DSPE. Las vesículas lipídicas catiónicas se formaron en complejo con un ADN plasmídico que contiene un gen reportero de luciferasa para formar partículas lipídicas. La formación en complejo de las SUV's catiónicas y el ácido nucleico se realizó a una temperatura de aproximadamente 0°C. Las partículas lipídicas se separaron a partir de las SUV's catiónicas y/o del ácido nucleico que no habían formado complejo. Posteriormente, las partículas lipídicas se incubaron en un medio de incubación que comprendía SUV's neutras (POPC, colesterol, y mPEG-DSPE) a una temperatura de 4°C por 24 horas. Después de la incubación, las partículas lipídicas, actualmente con una bicapa lipídica externa asimétrica, se aislaron a partir de los otros componentes lipidíeos en el medio de incubación mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para análisis de la carga mediante potencial zeta. Los valores de potencial zeta proveen una medición de la carga aparente de la superficie externa de las partículas. Más específicamente, el potencial zeta es una medición del potencial que se genera a través de la ¡nterfaz entre una capa limítrofe con el líquido en contacto con un sólido y la capa difusa móvil en el cuerpo del líquido, por ejemplo, el plano de deslizamiento. Los valores de potencial zeta se midieron como se establece en la sección de métodos a continuación, utilizando un aparato comercialmente disponible. La figura 3 muestra la relación entre el potencial zeta, en mV, para las vesículas lipídicas catiónicas comprendidas de DOTAP (x mol%), POPC (55-x mol%), colesterol (40 mol%), y distearilo derivado con polietilenglicol (PEG-DS, 5 mol%), en donde la cantidad de DOTAP se indica a lo largo del eje x de la gráfica en mol%. Las vesículas lipídicas se prepararon en las composiciones indicadas y se moldearon por extrusión a un tamaño de aproximadamente 100 nm. El potencial zeta se midió en NaCI 5 mM a 25°C. El potencial zeta se incrementa como una función de la concentración del lípido catiónico, DOTAP, con un incremento rápido en el potencial zeta observado conforme la concentración se incrementa a partir de 0-10 de porcentaje molar, y un incremento más lento para las composiciones que tienen más de 10 de porcentaje molar de DOTAP. En otro estudio, se prepararon las partículas lipídicas de conformidad con el ejemplo 1. La composición lipídica consistió de DMTAP (50 mol%), DOPE (24 mol%), colesterol (24 mol%), y PEG-DS (2 mo!%). Después de la formación en complejo de las vesículas lipídicas con ADN, pero antes de la incubación para la generación del revestimiento lipídico asimétrico, se reservó una muestra de las partículas lipídicas para análisis del potencial zeta como un control comparativo. Las partículas remanentes se incubaron en un medio que contenía vesículas lipídicas neutras (ejemplo 1) por diversos tiempos para generar un revestimiento lipídico asimétrico. Las partículas lipídicas asimétricas se separaron a partir de las otras vesículas lipídicas en el medio de incubación utilizando centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y se midió el potencial zeta. Los resultados se muestran en el cuadro A, junto con el tamaño de las partículas, determinado por dispersión dinámica de la luz.

CUADRO 1A Potencial zeta de las partículas lipídicas y partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones El potencial zeta de las partículas lipídicas sin revestimiento lipídico asimétrico fue de 17.27 mV, indicando una carga positiva en la superficie externa de las partículas. La incubación de las partículas en un medio de incubación que contenía vesículas lipídicas neutras por 24 horas a 25°C y por 3.5 horas a 37°C fue efectiva para reducir el potencial zeta a 8.30 mV y 8.63 mV, respectivamente, indicando que la carga de superficie se había reducido significativamente.

Se llevó a cabo un estudio similar utilizando partículas lipídicas comprendidas de DMTAP (50 mol%), POPC (24 mol%), colesterol (24 mol%), y PEG-DS (2 mol%). Las mediciones del potencial zeta se llevaron a cabo en una muestra de las partículas lipídicas después de la formación en complejo de las vesículas lipídicas con ADN, pero antes de la incubación para la generación del revestimiento lipídico asimétrico, como un control. Las partículas se incubaron en un medio de incubación a diferentes tiempos y temperaturas para generar un revestimiento lipídico asimétrico. Las mediciones de potencial zeta y tamaño de las partículas, determinados mediante dispersión dinámica de la luz, se muestran en el cuadro 1B.

CUADRO 1B Potencial zeta de las partículas lipídicas y partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones La incubación de las partículas lipídicas en un medio que contenía vesículas lipídicas neutras fue efectiva para extraer lípidos catiónicos a partir de la hoja lipídica externa, como se evidencia por el potencial zeta disminuido en las partículas lipídicas asimétricas en relación con las partículas control. En resumen, las partículas lipídicas que tenían un lípido cargado en la composición del revestimiento lipídico se incubaron en un medio para extraer el lípido cargado a partir del revestimiento externo, como se evidencia por las mediciones de potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas. La presencia del lípido cargado durante la formación de la partícula es ventajosa en tanto que la interacción carga-carga entre el lípido y el agente terapéutico cargado permite la formación eficiente de las partículas. La remoción del lípido cargado a partir del revestimiento lipídico externo es ventajosa en tanto que después de la administración in vivo una carga de superficie reducida o ausente permite un tiempo de circulación en sangre más largo para una biodistribución más extendida. Para determinar si las partículas lipídicas anteriormente descritas con respecto a los cuadros 1A, 1 B, y en el ejemplo 1 podrían permanecer no cargadas después de la administración in vivo, las partículas lipídicas asimétricas se colocaron a una temperatura de 37°C por 15 horas, para simular las condiciones después de la administración in vivo. El potencial zeta de las partículas se midió después del periodo de 15 horas, y los resultados se muestran en los cuadros 2A, 2B. También, para determinar el grado en que el revestimiento lipídico rodeó y protegió al ADN atrapado, se añadió un colorante (reactivó para cuantificación de ADNcs PicoGreen®) que emite fluorescencia cuando se está en contacto con el ADN a una alícuota de cada preparación. El porcentaje de la protección del ADN se determinó mediante la comparación de la emisión fluorescente de las partículas lipídicas en comparación con aquella del ADN desnudo tratado con el colorante. El porcentaje de protección del ADN también se muestra en los cuadros 2A, 2B.

CUADRO 2A Tamaño de partícula, porcentaje de ADN protegido, v potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones Partículas lipídicas preparadas a partir de una composición de DMTAP/DOPC/colesterol/mPEG-DS (50/24/24/2).

CUADRO 2B Tamaño de partícula, porcentaje de ADN protegido, y potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones 1Partículas lipídicas preparadas a partir de una composición lipídica de DMTAPIPOPC/colesterol/mPEG-DS (50/24/24/2). El potencial zeta de las partículas lipídicas que tiene lípidos catiónicos en la hoja lipídica externa (partículas control) se incrementan durante las condiciones de estimulación in vivo, indicando la presencia incrementada de la carga en las superficies de la partícula externa. El potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas no tuvo un cambio significativo después de la exposición a las condiciones de estimulación in vivo de 15 horas a 37°C. Por ejemplo, las partículas lipídicas asimétricas comprendidas de DMTAP, DOPE, colesterol, y mPEG-DS (cuadro 2A) tuvieron un potencial zeta de 8.30 mV después de la formación. El hecho de que el potencial zeta de las partículas cambiara muy poco después de la incubación a 37°C sugiere que la incubación inicial a 25°C por 24 horas o a 37°C por 3.5 horas fue adecuado para remover los lípidos catiónicos a partir del revestimiento lipídico externo. Se evaluó la capacidad de las partículas lipídicas asimétricas para transfectar células in vitro. Las composiciones de partícula lipídica anteriormente descritas se pusieron en contacto con células in vitro de conformidad con el procedimiento descrito en el ejemplo 2. La expresión de luciferasa por las células se determinó como una indicación de la transfección. Los cuadros 3A y 3B muestran la expresión de luciferasa por las células transfectadas con partículas asimétricas preparadas como se describe en el ejemplo 1.

CUADRO 3A Expresión de luciferasa después de la transfeccion in vitro de un plásmido que codifica luciferasa atrapado en partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones 1 Partículas lipídicas preparadas a partir de una composición de D TAP/DOPC/colesterol/mPEG-DSPE(50/24/24/2).

CUADRO 3B Expresión de luciferasa después de la transfeccíón ¡n vitro de un plásmido que codifica luciferasa atrapado en partículas lipídicas asimétricas tratadas bajo diversas condiciones 1 Partículas lipídicas preparadas a partir de una composición de DMTAP/DOPC/colesterol/mPEG-DSPE (50/24/24/2). Los cuadros 3A y 3B muestran que las partículas lipídicas asimétricas tienen una capacidad reducida para transfectar con relación a las partículas control que contienen una carga de superficie positiva. La menor relación de transfección provee evidencia adicional de la carga de superficie reducida en las partículas lipídicas asimétricas. En resumen, los datos en los cuadros 1A-1 B, 2A-2B, y 3A-3B ilustran un primer aspecto de la invención en donde una composición de partícula lipídica se prepara a partir de un lípido cargado, y las partículas se incuban para reducir la carga de superficie, con relación a la carga de superficie antes de la incubación. Las partículas se forman bajo condiciones en donde una porción sustancial de los lípidos cargados se remueve a partir del revestimiento lipídico externo. Las partículas tienen una carga reducida con relación a las partículas de la misma composición lipídica pero no son tratadas para la remoción de todos o de una porción de los lípidos cargados a partir del revestimiento lipídico externo. En otro aspecto, la invención provee una partícula lipídica asimétrica que tiene una carga de superficie baja o mínima después de la formación, pero es capaz de recuperar o generar una carga de superficie externa después de la exposición a condiciones in vivo. Este aspecto se discutió brevemente antes con respecto a la partícula 110 en la figura 2B. Después de la distribución de las partículas lipídicas in vivo, la presencia de una carga de superficie puede ser benéfica. Por ejemplo, después de la distribución y entrada a un tumor, podría ser deseable la presencia de una carga de superficie para ocasionar la unión de las partículas lipídicas con las membranas celulares. Las partículas lipídicas que tienen un revestimiento lipídico asimétrico, en donde la hoja lipídica externa del revestimiento no está cargada y la estructura lipídica externa está cargada después de la formación de la partícula lipídica asimétrica, preparada como se describió anteriormente, son capaces de llevar a cabo la translocacion de los lípidos catiónicos después de la formación de la partícula. Debido al gradiente de concentración de los lípidos cargados en la partícula lipídica, en donde se presenta una concentración mayor de los lípidos cargados en el interior de la partícula que sobre la superficie externa de la partícula, se presenta una transferencia gradual del lípido cargado a temperatura corporal. La transferencia gradual, o translocación, de lípidos cargados a partir de las estructuras lipídicas internas a la hoja lipídica externa se demostró en diversos estudios, que se describen a continuación. En este aspecto de la invención, se provee una composición de partícula lipídica en donde las partículas lipídicas se preparan a partir de un lípido cargado, pero las partículas no tienen una carga de superficie apreciable a una primera temperatura, típicamente a temperatura menor que la temperatura de transición de fase del revestimiento lipídico. Incluso, después de la exposición a una temperatura mayor que la temperatura de transición de fase del revestimiento lipídico, las partículas tienen una carga de superficie mensurable. La translocación de los lípidos cargados a partir de las estructuras lipídicas internas hacia la hoja lipídica externa se discutió anteriormente con respecto a la figura 2B y se ilustra por las partículas 100, 110 en la figura 2B. Con respecto a las partículas preparadas para el estudio en los cuadros 2A, 2B, la composición lipídica comprendía un 50 de porcentaje molar de DMTAP el cual tenía una temperatura de transición de fase de gel-fase de líquido cristalino (Te) de entre aproximadamente 20-24°C (Zelphati et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 11493 (1996)). Por lo tanto el DMTAP se caracteriza como un lípido fluido, y la adición del colesterol hace a la composición lipídica más rígida. La DOPE a una temperatura superior a aproximadamente 11°C se encuentra en una fase hexagonal. Se espera que la incubación de las partículas a 37°C lleven a la composición DMTAP/DOPE/coIesterol/mPEG-DS por arriba de su temperatura de transición de fase, en donde los lípidos son fluidos. La translocación de los lípidos a partir de una hoja lipídica hacia otra hoja lipídica ocurre fácilmente cuando los lípidos se encuentran en su estado fluido por arriba de su temperatura de transición de fase. Por lo tanto, las partículas asimétricas las cuales no tienen carga apreciable después de la formación se vuelven cargadas cuando los lípidos en el revestimiento lipídico se llevan a una temperatura por arriba de su transición de fase, como se evidencia, por ejemplo, por las mediciones de potencial zeta. La translocación de los lípidos catiónicos a partir de la hoja lipídica interna hacia la hoja lipídica externa se ¡lustra en las figuras 4A-4B. Las partículas lipídicas se preparan como se describe en el ejemplo 3 para que tengan un revestimiento lipídico de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:24:24:2), y se volvieron asimétricas mediante la incubación por 24 horas a 0-4°C en un medio que comprende vesículas lipídicas neutras que tienen una composición lipídica de DOPE/colesterol/mPEG- DS. Las partículas lipídicas asimétricas se mantuvieron entonces a 37°C por hasta 90 horas, y a tiempos seleccionados, se tomó una muestra para las mediciones del potencial zeta. El medio en el cual las partículas lipídicas asimétricas se incubaron a 37°C fue agua sola o fue una suspensión de vesículas lipídicas neutras formadas de POPC/colesterol/mPEG-DS (58:40:2). Las mediciones de potencial zeta como una función del tiempo de incubación, en horas, se muestran en la figura 4A. Las partículas lipídicas asimétricas incubadas en el medio que contenía vesículas lipídicas neutras (triángulos) tuvieron un potencial zeta inicial de aproximadamente 11 mV. Después de la incubación por 20 horas a 37°C, el potencial zeta se incrementó a aproximadamente 16 mV. Después de 42 horas de incubación, el potencial zeta se incrementó a 18 mV, sin un incremento adicional observado. Las partículas lipídicas asimétricas que se incubaron en un regulador del pH solo (diamantes) también mostraron un incremento en el potencial zeta después del periodo de incubación, indicando la translocación o "flip-flop" de los lípidos catiónicos a partir de la hoja lipídica interna hacia la hoja lipídica externa. La figura 4B es una gráfica similar para las partículas lipídicas asimétricas de una composición lipídica ligeramente diferente; DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:25.5:22.5:2). En la presente invención, las partículas lipídicas asimétricas incubadas en la presencia de las vesículas lipídicas neutras (cuadrados) incrementaron el potencial zeta durante el periodo de incubación de 75 horas. Se observó un resultado similar para las partículas lipídicas asimétricas incubadas en un regulador del pH solo (diamantes). La estabilidad de las partículas lipídicas asimétricas se analizó en otro estudio. Las partículas lipídicas preparadas como se describe en el ejemplo 1 se prepararon y almacenaron a 4°C por dos meses. Después de los dos meses del almacenamiento, las partículas se mantuvieron en un medio a 37°C, con y sin vesículas lipídicas neutras, por aproximadamente 100 horas. El potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas se evaluó después del tiempo incubación de 100 horas para monitorear la translocación de los lípidos catiónicos a partir de la hoja lipídica interna hacia la hoja lipídica externa. Los resultados se muestran en la figura 5. El potencial zeta de las partículas lipídicas asimétricas se incrementó durante el tiempo de incubación, cuando se incubaron en un regulador de pH solo (diamantes) o en un regulador del pH que contenía vesículas lipídicas neutras (cuadrados). El incremento en el potencial zeta es indicativo de movimientos de los lípidos catiónicos a partir de la hoja interna hacia la hoja externa, mostrando que el revestimiento lipídico asimétrico fue estable durante el período de almacenamiento de 2 meses. Se llevó a cabo un estudio de transfección in vitro en las partículas lipídicas asimétricas que habían sido almacenadas a 4°C por dos meses. Se preparó una composición de partícula lipídica asimétrica que consistía de DMTAP/DOPE/colesterol/mPEG-DS (50:24:24:2) como se describe en el ejemplo 1. Posteriormente las partículas lipídicas asimétricas se mantuvieron a 4°C por dos meses. Se preparó una composición control que consistía de los mismos lípidos, pero la cual no se sometió al paso de incubación para generar una bicapa lipídica asimétrica. La composición control también se almacenó a 4°C por dos meses. Después del almacenamiento, las dos formulaciones se incubaron a 37°C. Las muestras de las formulaciones después de la incubación a 37°C por 0 horas, 48 horas, y 60 horas se pusieron en contacto con células in vitro y se midió la expresión de luciferasa. Los resultados se muestran en la figura 6. En la figura 6, los número de la formulación 1 , 2, y 3 corresponden a las partículas lipídicas control que carecen de un revestimiento lipídico asimétrico. Los número de la formulación 4, 5, y 6 corresponden a las partículas lipídicas lipídicas. Las formulaciones 1 y 4 muestran la expresión de luciferasa antes de la incubación a 37°C (incubación por 0 horas a 37°C). La partícula lipídica asimétrica tuvo una menor expresión de luciferasa, por lo tanto una menor capacidad de transfección, debido a la ausencia de carga positiva sobre la superficie externa de la partícula. Las formulaciones 2 y 5 corresponden a la formulación control y a la formulación de partícula lipídica asimétrica después de la incubación a 37°C por 48 horas. La expresión de luciferasa de la formulación 5 tuvo un incremento con relación a aquella de la formulación 4 debido a la translocación de los lípidos catiónicos a partir de la hoja interna hacia la hoja externa durante el período de incubación de 48 horas, el cual estimula las condiciones in vivo. Las formulaciones 3 y 6 corresponden a la formulación control y a la formulación de partícula lipídica asimétrica después de la incubación a 37°C por 60 horas. La expresión de luciferasa de la formulación 6 tuvo un incremento en relación con aquellas de las formulaciones 4 y 5 debido a la translocación adicional de los lípidos catiónicos a partir de la hoja interna hacia la hoja externa durante el período de incubación de 60 horas. La expresión de luciferasa de las formulaciones control 2 y 3 disminuyó como un resultado de la incubación a 37°C. Los datos presentados en la figura 6 muestran que la composición de partícula lipídica asimétrica tuvo inicialmente una baja relación de transfección, debido a la ausencia de carga en la superficie de la partícula. La exposición de las partículas a una temperatura cercana a, de, o superior a la temperatura de transición de fase de la composición lipídica permite la translocación, o "flip-flop" de los lípidos cargados a partir de la hoja lipídica interna hacia la hoja lipídica externa, generando una carga de superficie en las partículas lipídicas asimétricas. La presencia de la carga mejora la transfección puesto que la carga mejora la unión entre las partículas y las células. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención aquí descrita y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Métodos Medición del potencial zeta: Los valores de potencial zeta de los liposomas catiónicos y de las partículas de lípido-ADN se midieron mediante Zetasizer 2000 (Malvern Ins.). Específicamente, se añadieron 50 µ1_ de liposomas a 5 ml_ de una solución acuosa que contenía NaCI 5 mM (elaborada a partir de una dilución de 30 veces de solución salina USP con agua Milli-Q) y se inyectó dentro de la cámara para muestra de conformidad con el procedimiento proporcionado por el vendedor del instrumento. Se realizaron tres mediciones para cada muestra a 25°C.

Dispersión dinámica de la luz: Se determinaron los tamaños de la partícula lipídica obtenidos mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) utilizando un aparato Coulter N4MD, operado de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como el diámetro medio en nm y desviación estándar de una distribución Gaussiana de las partículas por volumen relativo.

EJEMPLO 1 Preparación de las partículas lipídicas asimétricas Los liposomas catiónicos (vesículas unilamelares) se prepararon a partir de una composición lipídica de DMTAP/DOPE/CHOL/PEG-DS (50/24/24/2 mol/mol). Las soluciones para almacenamiento de lipidos individuales se realizaron en cloroformo/metanol (90:10 v/v) a 10 mg/mL para DMTAP (Avanti Polar üpids, 890860, 20 mg/mL para DOPE (Avanti Polar Lipids, 850725), 20 mg/mL para colesterol, y 10 mg/mL para PEG-DS (metoxi-polietilenglicol-distearoilo, peso molecular de mPEG 2000 Daltones, Shearwater polímeros Inc). Las alícuotas de las soluciones del solvente que contienen la cantidad adecuada de lipidos para una suspensión lipídica final de 2 mL a una concentración lipídica de 20 m se tomaron utilizando pipetas de desplazamiento positivo y se mezclan en botellas de fondo redondo de 10 mL. El solvente se removió lentamente mediante evaporación rotatoria a aproximadamente 45°C para formar una película delgada alrededor de la botella. El solvente residual se removió mediante vacío durante toda la noche. Luego el lípido se hidrató mediante la adición de 2 mL de agua deionizada a 50°C por 0.5-1 hora con agitación. Posteriormente la suspensión lipídica se sometió a extrusión a través de un expulsor Lipex® (volumen de 10 mL, Northern Lipids, Inc.) con dobles filtros de policarbonato (0.8 µ?? sobre 0.1 µ??) por 10 pasos a 50°C. El diámetro final del liposoma fue de 17+30 nm como se mide mediante un clasificador de tamaño de partícula en submicras Coulter (modelo N4MD). Después de la extrusión, se añadieron 2 mL de agua deionizada dentro del expulsor y se empujó a través del filtro para enjuagar los liposomas remanentes. Este enjuague se mezcló con los liposomas hasta un volumen final de 4 mL. La concentración lipídica final fue de aproximadamente 10 mM.

A. Preparación de liposomas neutros para incubación Se prepararon los liposomas neutros con una composición de POPC/DOPE/CHOL/PEG-DS (58/40/2 mol/mol) mediante un procedimiento similar a aquel proporcionado en 1 , anteriormente mencionado. La solución para almacenamiento del solvente se realizó a 40 mg/mL de POPC (Avanti Polar Lipids, 850457). La concentración lipídica final fue de 47.1 m y el diámetro medio de la partícula fue de 108+40 nm.

B. Preparación del complejo de lípido-ADN plasmídico Un ADN plasmídico (pCC-luciferasa) a una concentración de 1 mg/mL en agua se inyectó lentamente dentro de la suspensión del liposoma catiónico (10 mM de lípido neutro/DOPE/colesterol/mPEG-DS, 50/24/24/2 mol/mol, como se preparó en el ejemplo 1, en donde el lípido neutro fue ya sea DOPE o POPC) colocada en un contenedor de hielo-agua. La inyección de ADN se llevó a cabo utilizando una bomba para infusión establecida a una velocidad en 10 µ?/?t??? con agitación constante. El volumen final de los complejos fue de 1.6 mL con la concentración del ADN de 0.5 mg/mL y la concentración del lípido de 5 mM, por ejemplo la relación ADN/lípido de 1 µg por 20 nmoles de lípido.

C. Preparación de las partículas asimétricas de lípido-ADN Los complejos de lípido asimétrico-ADN se prepararon mediante la mezcla de partículas de complejos de lípido-ADN con un exceso de 10 veces de liposomas neutros ("liposomas vertedero") preparados como se describe en 2, anteriormente mencionado. Específicamente, 1.28 mL de los complejos de lípido-ADN preparados como en 3, anteriormente mencionados que contenían 6.4 µ????ße de lípidos se mezclaron lentamente con 2 mL de liposomas neutros para incubación (POPC/CHOL/mPEG-DS, 58/40/2 mol/mol) que contenían 64 µ????ßß de lípidos. Las mezclas se colocaron en un baño de hielo-agua antes de la incubación bajo diversas condiciones como se muestra en las figuras 4A hasta 6. Después del término de la incubación, los liposomas vertedero fueron separados posteriormente mediante un método de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Específicamente, se cargó un gradiente de sacarosa de un paso en tubos de ultracentrífuga transparentes (4.0 mL 11x60 mm, Beckman catálogo 344062 para el rotor SW 60 Ti). Los gradientes fueron de 25, 20, 15, 10, y 5 % en peso de sacarosa (de la parte inferior hacia la parte superior). La cantidad de las muestras cargadas típicamente fue de 0.8-1 mL. Típicamente la centrifugación se realizó a 40,000 rpm por 3 horas a 20°C. Los complejos de lípido-ADN típicamente se localizaron en una banda débil en la interfaz de 10-15%. Los liposomas vertedero usualmente se retuvieron por arriba de la región de 10% de sacarosa. Posteriormente la banda del complejo de ADN se removió cuidadosamente utilizando una pipeta. Para la preparación de un gran volumen de las partículas lipídicas asimétricas-ADN, se utilizaron tubos de centrífuga de 40 mL con el rotor SW28 (Beckman). El volumen de la muestra cargada en el tubo fue de 4 mL. La centrifugación tomó típicamente 15-20 horas a 40,000 rpm a 20°C. La concentración final de ADN en las partículas lipídicas asimétricas-ADN se determinó mediante un ensayo fluorescente utilizando el reactivo para cuantificación de ADNcs PicoGreen® (Molecular Probes, P-7581). La curva estándar se generó a partir de una serie de soluciones de ADN plasmídico de hasta 2000 ng/mL de ADN (pCC-Luc) en Tris HCI 10 mM y EDTA 1 mM a pH 7.0. El intervalo lineal se encontró hasta 000 ng/mL.

EJEMPLO 2 Transfección in vitro Las partículas lipídicas asimétricas-ADN y diversos controles preparados como se describió en el ejemplo 1 se compararon in vitro. Las células BH se sembraron en placas de 6 pozos a 1.13 x104 células/pozo y se incubaron la 37°C, 5% de C02, por 48 horas con medio MEM completo. Antes de la transfección, las células se enjuagaron dos veces con 1.0 mL de medio MEM libre de suero. Se mezcló una alícuota de la muestra para transfección con medio MEM libre de suero para lograr una concentración deseada del ADN plasmídico (típicamente 60-200 gímL de pCC-Luc). Posteriormente para la transfección, se colocó una cubierta de 1 mL sobre las células enjuagadas seguido por incubación a 37°C por 5 horas. Después de la incubación, el medio que contenía la muestra se aspiró y se reemplazó con 1.0 mL de medio EM completo y la incubación se continuó bajo la misma condición por 16.5 horas adicionales. La actividad de luciferasa se ensayó utilizando el sistema de ensayo para luciferasa de Promega (número de catálogo E1500). Las células se enjuagaron dos veces con solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) y luego se añadieron 250 µL· del reactivo para lisis Cell Culture Lysis 1X. Las células Usadas se transfirieron a tubos de microcentrífuga después de dos incubaciones de 8 minutos (con agitado de las placas) a temperatura ambiente. Posteriormente los tubos se centrifugaron a 14K por 10 minutos. La actividad de luciferasa se ensayó inmediatamente utilizando 20 µL· de la jnuestra mediante un luminómetro (100 µ?. de luciferina y regulador de pH para ensayo que contiene ATP, mediciones de 10 segundos). La unidad relativa de luz se normalizó por la cantidad de proteína en los extractos. El contenido de proteína se ensayó utilizando el reactivo para proteína de BioRad. Se transfirieron 10 microlitros de células lisadas a una placa de 96 pozos de fondo plano y se añadieron 200 µL· del reactivo. Se midió la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de placas de Molecular Devices. EJEMPLO 3 Preparación de las partículas lípídicas asimétricas Las partículas lipídicas se formaron como se describió en el ejemplo 1, excepto que la temperatura de la solución para incubación que comprendía SUVs neutras (véase el paso 4 en el ejemplo 1) se mantuvo entre 0-4°C con un baño de hielo. Aunque la invención se ha descrito con respecto a modalidades particulares, será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse de la invención.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para preparar partículas lipídicas que tienen una cubierta lipídica externa, que comprende: preparar partículas lipídicas que comprenden (i) una composición lipídica que contiene un lípido cargado y (i¡) un agente terapéutico, cada una de dichas partículas teniendo una cubierta lipídica externa que tiene una hoja lipídica externa y una estructura lipídica interna; e incubando dichas partículas bajo condiciones efectivas para jemover dicho lípido cargado a partir de la hoja lipídica externa.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha preparación comprende la preparación de partículas lipídicas compuestas de una composición lipídica que contiene al menos un lípido catiónico.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha preparación comprende (i) formar vesículas lipídicas compuestas de dicha composición lipídica y (ii) formar un complejo de dichas vesículas lipídicas con dicho agente terapéutico.

4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque dicha incubación comprende incubar dichas partículas lipídicas en un medio que contiene vesículas lipídicas no cargadas.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha incubación incluye adicionalmente añadir al medio un conjugado de lípido-polímero-ligando.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha incubación incluye adicionalmente añadir al medio un derivado lipídico con un polímero hidrófilo.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha adición comprende añadir un derivado fosfolipídico con polietilenglicol.

8.- El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado además porque dichas partículas lipídicas son liposomas.

9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque dicha incubación se lleva a cabo a una temperatura menor de aproximadamente 15°C.

10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque dicha incubación es por un tiempo mayor de aproximadamente 5 horas.

11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque dicha preparación comprende la preparación de partículas lipídicas que tienen un agente terapéutico atrapado seleccionado a partir del grupo que consiste de un fármaco cargado, una proteína, un péptido, y un ácido nucleico.

12.- Una composición, que comprende partículas lipídicas que tienen un revestimiento Iipídico compuesto de una hoja lipídica externa y una estructura lipídica interna, dicho revestimiento Iipídico está formado de una composición lipídica (i) que comprende un lípido cargado y (ii) que tiene una temperatura de transición de fase de gel-fase cristalina, dichas partículas lipídicas no tienen una carga apreciable a una temperatura menor de dicha temperatura de transición de fase pero tienen una carga mensurable después de la incubación a una temperatura por arriba de dicha temperatura de transición de fase.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha composición lipídica comprende un lípido catiónico.

14. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dichas partículas lipídicas incluyen adicionalmente un agente terapéutico que tiene una carga.

15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicho agente terapéutico en un ácido nucleico.

16. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizada además porque dicha composición lipídica tiene una transición de fase de entre aproximadamente 34-38°C.

17. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizada además porque dichas partículas lipídicas son liposomas.

18. - Un método de preparación de partículas lipídicas que tienen una composición lipídica cargada asimétrica en su revestimiento lipidico externo antes de la administración in vivo, que comprende: la preparación de partículas lipídicas que comprenden (i) una composición lipídica que contiene un lípido cargado y (i¡) un agente terapéutico, cada una de dichas partículas teniendo una cubierta lipídica extema teniendo una hoja lipídica externa y una estructura lipídica interna; e incubando dichas partículas bajo condiciones efectivas para remover los lípidos cargados a partir de la hoja lipídica externa.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha incubación incluye incubar a una temperatura menor de aproximadamente 15°C.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, caracterizado además porque dicha incubación incluye incubar por un tiempo mayor de aproximadamente 5 horas.

21.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8-20, caracterizado además porque dicha incubación incluye incubar en un medio que comprende vesículas lipídica neutras.