KR20070011331A

KR20070011331A - 리포솜 제제

Info

Publication number: KR20070011331A
Application number: KR1020067019769A
Authority: KR
Inventors: 마사시 이소자끼; 게이스께 요시노; 교꼬 다구찌; 마사요 곤도
Original assignee: 테루모 가부시키가이샤
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2007-01-24
Also published as: EP1731172A4; EP1731172B1; CN1938048B; CN1938048A; JPWO2005092388A1; US20080279916A1; EP1731172A1; WO2005092388A1; KR101245990B1; JP4833836B2; US8241663B2

Abstract

친수성 고분자에 의한 막 수식에 의한 혈중 안정성 등의 효과를 손상시키지 않고, 산성하에 안정성을 손상시키는 약물을 안정적으로 담지할 수 있는 보존 안정성이 우수한 리포솜 제제로서, 인지질을 주요 막 재료로서 포함하는 지질 이중막으로 형성된 단일 라멜라 소포와, 상기 소포 내에 존재하는 pH가 5 이하인 내수상을 구비하며, 약물을 담지시킨 리포솜으로서, 상기 소포는 외표면만이 친수성 고분자로 수식된 리포솜 제제를 제공한다.

리포솜, 친수성 고분자, 인지질, 단일 라멜라 소포, 혈중 안정성

Description

리포솜 제제 {LIPOSOME PREPARATION}

본 발명은 약물 전달 시스템에 유용한 리포솜 제제에 관한 것이다.

최근, 약물을 안전하고 효율적으로 목적 병소 부위에 송달·분포시키는 약물 전달 시스템(DDS)이 활발히 연구되고 있다. 그 방법의 하나로서, 리포솜, 에멀젼, 리피드 마이크로 스페어, 나노 파티클 등의 폐쇄 소포를 약물의 운반체(담체)로서 이용하는 것이 검토되고 있다. 그러나 폐쇄 소포를 사용하는 DDS의 실용화에는 극복해야 하는 여러 가지 과제가 있고, 그 중에서도, 생체측의 이물질 인식 기구로부터의 회피 및 체내 동태의 제어는 중요하다. 즉, 폐쇄 소포를 표적 부위에 높은 선택성으로 송달시키기 위해서는, 간장, 비장 등의 세포망 내피계 조직(RES)에서의 포착을 회피하고, 혈액 중의 옵소닌 단백질이나 혈장 단백질 등과의 상호작용(흡착)에 의한 응집을 방지하여 혈중 안정성을 높일 필요가 있다.

이 과제를 해결하는 방법으로, 친수성 고분자에 의한 막 수식이 알려져 있다. 친수성 고분자로 수식된 폐쇄 소포, 특히 리포솜은 높은 혈중 체류성이 얻어짐으로써, 종양 조직이나 염증 부위 등의 혈관 투과성이 항진한 조직에 대해 수동적인 집적이 가능해져, 실용화가 진행되고 있다(특허 문헌 1 내지 3 및 비특허 문헌 3 내지 5 등 참조). 친수성 고분자로 막을 수식하기 위한 수식제로는, 일반적 으로 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 인지질 또는 콜레스테롤 등의 지질을 결합한 폴리에틸렌글리콜 유도체가 바람직하게 사용된다. 상업적으로 입수가능한 범용의 수식제는 디아실포스파티딜에탄올아민 등의 인지질을 결합한 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.

상기한 바와 같은 수식이 실시되는 리포솜은 지질 이중막으로 형성되는 폐쇄된 소포이고, 그 소포 공간 내에 수상(내수상)을 포함한다. 리포솜은 지질 이중막층의 1장의 막으로 이루어지는 단일 라멜라 소포(소형 라멜라 소포(Small Unilamellar Vesicle, SUV), 대형 라멜라 소포(Large Unilamellar Vesicle, LUV)) 및 복수매로 이루어지는 다중 라멜라 소포(Multilamellar Vesicle, MLV) 등의 막 구조가 알려져 있다. 리포솜에 내포된 약물의 누출을 억제하기 위해서, 리포솜의 막 구조를 MLV막으로 하는 제안도 있다(특허 문헌 4 참조).

또한, 상기한 바와 같은 리포솜 내에의 약물 봉입 방법은 여러 가지 있지만, pH 구배법 등의 이온 구배법(특허 문헌 5 내지 7, 비특허 문헌 6 등 참조)을 이용하면, 약물을 고농도로 봉입할 수 있다는 것이 알려져 있다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 공표 (평)5-505173호 공보

[특허 문헌 2] 일본 특허 공고 (평)7-20857호 공보

[특허 문헌 3] 일본 특허 제2667051호 공보

[특허 문헌 4] 국제 공개 01/000173호 공보

[특허 문헌 5] 미국 특허 제5077056호 명세서

[특허 문헌 6] 일본 특허 제2847065호 공보

[특허 문헌 7] 일본 특허 제2659136호 공보

[비특허 문헌 1] Cancer Lett., 1997, 118(2), p.153

[비특허 문헌 2] Br. J. Cancer., 1997, 76(1), p.83

[비특허 문헌 3] D. D. Lasic저 "LIPOSOMES from Physics to Applications", Elsevier, 1993

[비특허 문헌 4] Martin C. Woodle, Gerrit Storm 편 "Long Circulating Liposomes: Old Drugs, New Therapeutics", Springer, 1997

[비특허 문헌 5] D. D. Lasic, D. Papahadjopoulos 편 "Medical Applications of LIPOSOMES", Elsevier, 1998

[비특허 문헌 6] G. Gregoriadis 편 "Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques" 2nd edition, Vol.I-III, CRC Press

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

상기한 바와 같은 리포솜에 담지시키는 약물 중에는, 중성 조건보다 높은 pH 영역에서는 안정성이 나쁜 약물이 있고, 이 경우에는 약물이 지질 이중막 중에 포함되거나, 내수상으로 포함되어도, 리포솜의 내수상을 산성으로 유지할 필요가 있다. 또한 pH 구배를 이용하여 약염기성의 약물을 리포솜에 봉입(담지)하는 경우에는, 시트르산 완충액을 사용하여 내수상의 pH를 4 전후의 산성 조건으로 하고, 리포솜의 주요 막 재료의 상전이점 이상의 온도(예를 들면 60 ℃ 정도)까지 가온한다. 그러나, 이와 같이 리포솜내가 산성 조건이고, 경우에 따라서는 고온에 노출됨으로써, 제조시 및 보존 기간 중에 막의 열화에 의해 안정성이 저하되는 것이 염려된다. 이 점을 착안하여, 산성으로 유지할 필요가 있는 약물을 특히 친수성 고분자로 막 수식한 리포솜에 담지시킨 리포솜 제제의 보존성에 대해서 검토한 바, 몇 개의 친수성 고분자 수식 리포솜에서는, 미수식의 리포솜보다도 제조시 또는 보존 기간 중에 담지하고 있는 약제의 분해가 발생하기 쉬운 경우가 있고, 그 결과, 리포솜 제제로서의 보존 안정성을 손상시키기 쉽다는 지견을 얻었다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여, 산성으로 유지할 필요가 있는 약물 또는 약물을 봉입하기 위한 수단에 기인하여 결과적으로 산성 조건하에 유지된 형태가 된 약물을 특히 친수성 고분자로 막 수식한 리포솜에 담지시키는 경우에, 친수성 고분자 본래의 막 수식 효과를 유지한 상태에서 막 안정성이 우수하고, 보존 안정성이 우수한 리포솜 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자는 상기를 감안하여 일반적인 인지질을 주요 막 재료로 하고, 친수성 고분자로 막 수식한 리포솜으로, 산성 환경에서 유지할 필요가 있는 약물을 내수상에 유지한 리포솜 제제에 대해서 더욱 검토한 바, 내수상의 산성 환경에 대하여 지질의 가수분해가 발생하고, 그 결과, 리포솜 제제로서의 보존 안정성이 손상되기 쉽다는 지견을 얻었다. 이것에 기초하여 더욱 검토하고, 유지 안정성이 손상되기 쉬운 리포솜 제제는 친수성 고분자가 막의 내외 표면에 모두 수식된 것을 지견하였다. 이들로부터, 리포솜의 외표면만을 친수성 고분자로 수식하면 좋다는 것을 상도하였다. 그래서 이러한 구조의 리포솜 제제는, 내수상이 산성 환경하에서도 보존 안정성을 확보할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 아미노기, 아미디노기, 구아디니노기 등을 포함하는 염기성 화합물(양이온화제)에 의한 막 수식은, 내수상이 산성 환경하에서도 리포솜 막을 안정화시키는 효과가 있고, 따라서 이러한 염기성 화합물을 막 성분으로서 포함하는 리포솜 제제는 보존 안정성이 우수하다는 것을 발견하여 이하와 같은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

(1) 인지질을 주요 막 재료로서 포함하는 지질 이중막으로 형성된 단일 라멜라 소포와, 상기 소포 내에 존재하는 pH가 5 이하인 내수상을 구비하고, 약물을 담지시킨 리포솜으로서, 상기 소포는 외표면만이 친수성 고분자로 수식된 것인 리포솜 제제.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 약물이 pH 5보다 큰 pH 영역에서 불안정한 약물인 리포솜 제제.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 약물을 적어도 0.05 mol 약물/mol 지질의 농도로 담지하는 리포솜 제제.

(4) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 약물을 적어도 0.1 mol 약물/mol 지질의 농도로 담지하는 리포솜 제제.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 주요 막 재료가 상전이점 50 ℃ 이상의 인지질인 리포솜 제제.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인지질이 수소 첨가된 인지질인 리포솜 제제.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인지질이 스핑고인지질인 리포솜 제제.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 상기 인지질 이외의 다른 지질류를 더 포함하는 리포솜 제제.

(9) 상기 (6) 또는 (7)에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 콜레스테롤을 더 포함하는 리포솜 제제.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 아미노기, 아미디노기 및 구아디니노기로부터 선택되는 기를 포함하는 염기성 화합물을 더 포함하는 리포솜 제제.

(11) 상기 (10)에 있어서, 상기 염기성 화합물이 3,5-디펜타데실옥시벤즈아미딘 염산염인 리포솜 제제.

(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 상기 친수성 고분자가 분자량 500 내지 10,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜인 리포솜 제제.

(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 친수성 고분자가 친수성 고분자의 인지질 또는 콜레스테롤 유도체로 도입되는 것인 리포솜 제제.

(14) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 40 내지 140 nm 정도인 리포솜 제제.

(15) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 50 내지 130 nm인 리포솜 제제.

(16) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 60 내지 120 nm인 리포솜 제제.

(17) 상기 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 내수상의 pH가 2 내지 5인 리포솜 제제.

(18) 상기한 바와 같은 리포솜 제제의 제조 방법으로서, 내수상의 pH가 5 이하가 되도록 인지질을 포함하는 지질 이중막의 단일 라멜라층 구조의 소포를 제조한 후, 친수성 고분자 지질 유도체를 첨가하여 상기 소포의 외표면만을 수식하고, 소포의 제조시에 내수상에 미리 첨가하거나, 소포 조제 후에 소포외로부터 상기 지질 이중막을 통과시켜 약물을 봉입하여 약물을 담지시킨 상기 (1)에 기재된 리포솜 제제의 제조 방법.

(19) 상기 (18)에 있어서, 약물의 봉입은 소포 제조 후에 이온 구배법을 이용하여 소포외로부터 상기 지질 이중막을 통과시킴으로써 행해지는 것인 리포솜 제제의 제조 방법.

<발명의 효과>

상기한 바와 같은 특정 구조의 리포솜이면, 막내외 쌍방 모두 친수성 고분자를 부가하여 막 수식하는 경우에 비해, 전체에서는 상대적으로 낮은 수식률로 친수성 고분자의 효과를 발현할 수 있다. 즉 필요없는 수식을 포함하지 않기 때문에, 리포솜 막의 안정성이 우수하며, 산성 환경하에 내수상에서의 지질이 필요없는 가수분해를 억제할 수 있다. 특히, 본 발명에 관한 리포솜 제제는, 상술한 제약에 의해 산성으로 유지되어 있는 내수상에서 제제의 구조상, 필요없는 것을 적확하게 배제하고, 그것에 따라 필요없는 지질의 가수분해를 억제함으로써, 제조시 및 보존시의 분해를 억제하고, 내봉한 약물을 고농도로 안정적으로 담지할 수 있으며, 친수성 고분자 본래의 높은 혈중 체류성 등의 막 수식 효과를 유지한 상태에서, 보존 안정성이 우수한 리포솜 제제로 할 수 있다. 이러한 특징으로부터, 본 발명의 리포솜 제제는 질환의 치료 및/또는 진단에 효과를 갖는다.

[도 1] 친수성 고분자 지질 유도체(PEG₅₀₀₀-DSPE)의 안정 시험 후의 TLC의 촬영상을 나타낸다.

[도 2] 친수성 고분자 지질 유도체(PEG₅₀₀₀-DSPE)의 안정 시험 후의 TLC의 촬영상을 나타낸다.

[도 3] 보존 시험에서의 PEG₅₀₀₀-DSPE의 잔존율을 나타낸 도면이다.

[도 4] 보존 시험에서의 HSPC의 분해물의 비율(％)을 나타낸 도면이다.

[도 5] 보존 시험에서의 HSPC의 분해물의 비율(％)을 나타낸 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

리포솜은 인지질 이중막을 포함하는 폐쇄 소포이고, 그 소포 공간 내에 수상(내수상)을 포함한다. 리포솜 제제는, 이 리포솜을 담체로 하고, 이것에 약물을 담지시킨 것이다. 리포솜은 상술한 바와 같이 지질 이중막의 1장의 층으로 이루어지는 단일 라멜라(1장의 막) 소포(SUV, LUV) 및 복수매로 이루어지는 다중 라멜라 소포(MLV) 등이 알려져 있지만, 본 발명에 관한 리포솜은 1장의 막이다. 그 중에 서도, 특히 LUV(large unilamellar vesicle) 리포솜이다. 또한, SUV(small unilamellar visicle)도 바람직하다.

또한 본 발명에서는, 리포솜 제제를 구성하는 전체 소포 중, 단일 라멜라 소포가 차지하는 비율은, 존재비로 전체의 50％ 이상일 수 있고, 80％ 이상인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 약제를 담지시키는 리포솜은 pH 5 이하의 내수상을 포함하며, 단일 라멜라 지질 이중막은 후술하는 바와 같이, 그 외막 표면만이 선택적으로 친수성 고분자로 표면 수식된 특정한 막 수식 구조를 갖는다.

상기 지질 이중막은, 그 주요 막 재료로서 적어도 인지질을 포함한다.

인지질은 일반적으로 분자 내에 장쇄 알킬기로 구성되는 소수성기와 인산기로 구성되는 친수성기를 갖는 양친매성 물질이다. 본 발명에서 사용되는 인지질로는, 포스파티딜콜린(=레시틴), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 등의 글리세롤린 지질; 스핑고미엘린(Sphingomyelin) 등의 스핑고인지질; 카르디올리핀 등의 천연 또는 합성의 디포스파티딜계 인지질 및 이들의 유도체; 이들을 통상법에 따라서 수소 첨가한 것(예를 들면, 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린) 등을 들 수 있다. 이하, 이들 인지질을 "인지질류"라 칭하는 경우도 있다.

이들 중에서도, 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린(HSPC) 등의 수소 첨가된 인지질, 스핑고미엘린(SM) 등이 바람직하다.

리포솜은 주요 막 재료로서 단일종의 인지질을, 또는 복수종의 인지질을 포 함할 수 있다.

또한, 리포솜은 주요 막 재료로서 상전이 온도가 생체내 온도(35 내지 37 ℃)보다 높은 인지질을 사용하는 것이 바람직하다. 그 이유는, 이러한 인지질을 사용함으로써, 보존시에 또는 혈액 등의 생체 중에서 리포솜 내에 봉입된 약물이 리포솜으로부터 외부로 용이하게 누출되지 않도록 하는 것이 가능해지기 때문이다. 이들 리포솜은 주요 막 재료의 상전이 온도 이상으로 제조하는 것이 바람직하다. 그 이유는, 주요 막 재료의 상전이 온도 이하의 온도에서는 입경 제어가 곤란하기 때문이다. 예를 들면, 주요 막 재료의 상전이 온도가 50 ℃ 부근인 경우, 50 내지 80 ℃ 정도가 바람직하고, 보다 구체적으로는 60 내지 70 ℃ 정도로 제조되는 것이 바람직하다.

본 발명의 특정 형태의 리포솜을 안정적으로 형성할 수 있는 것이면, 상기 주요 막 재료와 함께 다른 막 성분을 포함하고 있을 수 있다. 예를 들면, 인지질 이외의 지질 또는 그의 유도체(이하, 다른 지질류라 칭하는 경우도 있음)를 포함하고, 상기 인지질과 함께 혼합 지질에 의한 막을 형성하는 것이 바람직하다.

다른 지질류로는 인산을 포함하지 않는 지질을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않지만 글리세로 당지질, 스핑고 당지질 및 안정화제로서 후술하는 콜레스테롤 등의 스테롤 등 및 이들의 수소 첨가물 등의 유도체를 들 수 있다. 리포솜은 주요 막 재료로서의 인지질과 함께, 다른 지질류를 포함하는 혼합 지질에 의한 막으로 형성되는 것이 바람직하다.

지질 이중막을 구성하는 막 지질 전체 중, 주요 막 재료인 인지질의 비율은 통상 20 내지 100 mol％이고, 바람직하게는 40 내지 100 mol％이다.

또한 상기 다른 지질류의 막 지질 전체 중의 비율은 통상 0 내지 80 mol％이고, 바람직하게는 0 내지 60 mol％이다.

본 발명에서, 상기한 바와 같은 지질 이중막은 외막측이 선택적으로 친수성 고분자로 수식되어 있다. 친수성 고분자로는, 특별히 한정되지 않지만 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리프로필렌글리콜, 피콜, 폴리비닐알코올, 스티렌-말레산 무수물 교대 공중합체, 디비닐에테르-말레산 무수물 교대 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필옥사졸린, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리히드록시프로필메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리아스팔트아미드, 합성 폴리아미노산 등을 들 수 있다.

또한 이들 친수성 고분자는, 지질에 결합하지 않은 측의 말단이 알콕시화(예를 들면, 메톡시화, 에톡시화, 프로폭시화)되어 있는 것이 보존 안정성이 우수하기 때문에 바람직하다.

이들 중에서도, 제제의 혈중 체류성을 우수한 것으로 하는 효과가 있기 때문에, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리글리세린(PG), 폴리프로필렌글리콜(PPG)이 바람직하다.

PEG의 분자량은 특별히 한정되지 않는다. PEG의 분자량은 통상 500 내지 10,000 달톤이고, 바람직하게는 1,000 내지 7,000 달톤, 보다 바람직하게는 2,000 내지 5,000 달톤이다.

PG의 분자량은 특별히 한정되지 않는다. PG의 분자량은 통상 100 내지 10000 달톤이고, 바람직하게는 200 내지 7000 달톤, 보다 바람직하게는 400 내지 5000 달톤이다. PPG의 분자량은 특별히 한정되지 않는다. PPG의 분자량은 통상100 내지 10,000 달톤이고, 바람직하게는 200 내지 7,000 달톤, 보다 바람직하게는 1,000 내지 5,000 달톤이다.

이들 중에서도, 폴리에틸렌글리콜은 가장 범용이고, 혈중 체류성을 향상시키는 효과가 있어 바람직하다.

폴리에틸렌글리콜은 -(CH₂CH₂O)_n-의 반복 구조를 갖는 직쇄상의 고분자이다. 폴리에틸렌글리콜은 물에도 유기 용매에도 가용인 양친매성의 특성을 갖는 고분자이며, 독성이 낮기 때문에, 의약품의 안정화, 체내 동태의 개선을 위해 널리 응용되고 있다. 이 독성이 낮은 것으로 알려져 있는 폴리에틸렌글리콜로 수식된 담체(예를 들면 리포솜) 중에 약물을 담지한 약물 담체(예를 들면 리포솜 제제)는 안전성이 높다.

또한, 본 발명에서 "혈중 체류성"이란, 예를 들면 약물 담체가 투여된 숙주에서, 약물이 담체에 내봉된 상태에서 혈액 중에 존재하는 성질을 의미한다.

약물은 담체로부터 방출되면 빠르게 혈중으로부터 소실되고, 폭로한다. 혈중 체류성이 양호하면, 약물을 보다 적은 양으로 투여하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에서 "폭로"란, 담체의 외부에 방출된 약물이 외부 환경에 대 하여 작용을 미치는 것을 의미한다. 구체적으로는, 방출된 약물은 표적 부위에 근접하여, 접촉함으로써 그 작용(예를 들면 항종양 효과)을 발휘한다. 약물이 표적 부위에 작용함으로써, 표적 부위의 DNA 합성이 행해지고 있는 세포 주기에 특정 세포에 국소적으로 작용하는 등의 기대된 효과를 나타낸다.

이러한 리포솜은 후술하는 바와 같이 지질 이중막의 단일 라멜라 소포의 미수식 리포솜을 형성한 후, 외부로부터 친수성 고분자로 막 표면을 수식하면, 지질 이중막의 외막만을 선택적으로 표면 수식할 수 있다. 이 때, 친수성 고분자의 도입을 위한 수식제로서, 친수성 고분자 지질 유도체를 사용하면, 친수성 고분자 부분이 외측을 향해서 돌출된 상태이고, 소수성 부분인 지질 부분이 리포솜의 지질 이중막 중에 포함되어 안정적으로 유지되기 때문에, 리포솜의 지질 이중막의 외막 표면 상에 지질에 결합한 친수성 고분자를 존재시키고, 분포시킬 수 있다.

상기 친수성 고분자 지질 유도체의 지질(소수성 부분)로는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 소수성의 영역을 갖는 화합물(소수성 화합물)을 들 수 있다. 소수성 화합물로는, 후술하는 혼합 지질을 구성하는 인지질, 스테롤 등의 다른 지질류, 또는 직쇄 지방족 알코올, 직쇄 지방족 아민, 글리세린 지방산 에스테르 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 인지질이 바람직한 양태 중 하나이다.

상기 인지질에 포함되는 아실쇄는 포화 지방산인 것이 바람직하다. 아실쇄의 길이는 C₁₄-C₂₀이 바람직하고, C₁₆-C₁₈인 것이 보다 바람직하다. 아실쇄로는, 예를 들면 디팔미토일, 디스테아로일, 팔미토일스테아로일을 들 수 있다.

인지질은 특별히 제한되지 않는다. 인지질로는, 예를 들면 상기한 친수성 고분자와 반응 가능한 관능기를 갖는 것을 사용할 수 있다. 이러한 친수성 고분자와 반응 가능한 관능기를 갖는 인지질의 구체예로는, 아미노기를 갖는 포스파티딜에탄올아민, 히드록시기를 갖는 포스파티딜글리세롤, 카르복시기를 갖는 포스파티딜세린을 들 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민을 사용하는 것이 바람직한 양태 중 하나이다.

친수성 고분자의 지질 유도체는 상기 친수성 고분자와 상기 지질로부터 유도된다. 친수성 고분자와 지질과의 조합은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 조합한 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 인지질, 스테롤 등의 다른 지질류, 직쇄 지방족 알코올, 직쇄 지방족 아민, 글리세린 지방산 에스테르 중에서 선택되는 1개 이상과, PEG, PG, PPG 중에서 선택되는 1개 이상이 결합한 친수성 고분자의 유도체를 들 수 있다. 친수성 고분자가 PEG인 경우, 지질로서 인지질, 콜레스테롤을 선택하는 것이 바람직한 양태 중 하나이다. 이러한 조합에 의한 PEG의 지질 유도체로는, 예를 들면 PEG의 인지질 유도체 또는 PEG의 콜레스테롤 유도체를 들 수 있다.

친수성 고분자의 지질 유도체는, 지질의 선택에 의해 양의 전하, 음의 전하, 중성의 선택이 가능하다. 예를 들면, 지질로서 DSPE를 선택한 경우, 인산기의 영향으로 음의 전하를 나타내는 지질 유도체가 되며, 지질로서 콜레스테롤을 선택한 경우, 중성의 지질 유도체가 된다. 지질의 선택은 그 목적에 따라 선택하는 것이 가능하다.

본 발명에서는, 상기 예시한 친수성 고분자의 지질 유도체 중에서도, PEG의 인지질 유도체가 바람직한 양태 중 하나로서 들 수 있다. PEG의 인지질 유도체의 구체예로는, 폴리에틸렌글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE)을 들 수 있다. PEG-DSPE는 범용의 화합물이고 입수 용이하기 때문에 바람직하다.

이러한 친수성 고분자의 지질 유도체는, 종래 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다. 친수성 고분자의 지질 유도체의 일례인 PEG의 인지질 유도체를 합성하는 방법으로는, 예를 들면 PEG에 대하여 반응 가능한 관능기를 갖는 인지질과, PEG를 촉매를 사용하여 반응시키는 방법을 들 수 있다. 이 촉매로는, 예를 들면 염화시아눌, 카르보디이미드, 산 무수물, 글루타르알데히드를 들 수 있다. 이러한 반응에 의해, 상기 관능기와 PEG를 공유 결합시켜 PEG의 인지질 유도체를 얻을 수 있다.

본 발명에서, 리포솜은 상기 친수성 고분자 또는 친수성 고분자의 지질 유도체를 단독으로 또는 2종 이상의 조합으로 포함하고 있을 수 있다.

상기 친수성 고분자 지질 유도체에 의한 막 지질(총 지질)의 수식률은 막 지질에 대한 비율로, 통상 0.1 내지 20 mol％, 바람직하게는 0.1 내지 5 mol％, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5 mol％로 할 수 있다. 또한, 간장 내에서 작용시키는 약제를 내봉시킨 경우 등의, 혈중 체류성을 그만큼 필요로 하지 않을 때에는 리포솜 제제의 보존시 안정성을 주된 목적으로서 수식률을 0.25 내지 5 mol％로 설정하는 것이 바람직하다.

여기서의 총 지질이란, 친수성 고분자 지질 유도체 이외의 막을 구성하는 모 든 지질의 총량이고, 구체적으로 인지질류 및 다른 지질류, 또 다른 표면 수식제를 포함하는 경우에는 이 표면 수식제도 포함한다.

이러한 친수성 고분자의 지질 유도체를 사용하여 표면 수식된 리포솜은 혈장 중의 옵소닌 단백질 등이 해당 리포솜의 표면에 흡착하는 것을 방지하여 해당 리포솜의 혈중 안정성을 높이고, RES에서의 포착을 회피하는 것이 가능해지며, 약물의 송달을 목적으로 하는 조직이나 세포에 대한 송달성을 높일 수 있다.

특히 본 발명에서는, 리포솜은 친수성 고분자가 리포솜 외표면에만 분포하는 조건하에서 형성되고, 지질 이중막의 외막이 상기 친수성 고분자로 선택적으로 수식되어 있다. 이러한 리포솜에서는, 그 외막 표면의 친수성 고분자쇄는 리포솜 외측을 향해서 분포되어 있고, 한편 지질 이중막의 내수상측 내막은 표면 수식되어 있지 않기 때문에, 내수상 내에는 실질적으로 친수성 고분자쇄가 분포되지 않는다. 이러한 분포 구조이면, 내수상이 산성 조건이어도, 이중막의 내외막의 양측 상에 친수성 고분자가 분포되는 것에 비하여, 막의 안정성을 확보할 수 있다. 또한 이중막의 내외막의 양측 상에 분포되는 것에 비하여, 전체량으로서 적은 친수성 고분자로 혈중 안정성의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 관한 리포솜은 상기 인지질, 다른 지질, 친수성 고분자 및 그의 지질 유도체와 함께, 상기 막 구조를 유지할 수 있는 것이며, 리포솜에 포함할 수 있는 다른 막 성분을 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 포함할 수 있다.

다른 막 성분으로는, 지질의 물성을 변화시켜 담체의 막 성분에 원하는 특성을 부여하기 위한, 상기 친수성 고분자 이외의 표면 수식제를 들 수 있다. 다른 표면 수식제로는 특별히 한정되지 않지만, 지질에 상기 친수성 고분자 이외의 화합물이 결합한 것을 들 수 있다.

친수성 고분자 이외의 화합물로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 글루쿠론산, 시알산, 덱스트란, 플루란, 아밀로스, 아밀로펙틴, 키토산, 만난, 시클로덱스트린, 펙틴, 카라기난 등의 수용성 다당류; 산성 관능기를 갖는 화합물; 아미노기, 아미디노기, 구아디니노기 등의 염기성 관능기를 갖는 염기성 화합물 등을 들 수 있다.

특히, 본 발명에서는 이들 화합물 중에서도 염기성 화합물을 지질의 가수분해를 억제하는 물질로서 함유할 수 있다. 일반적으로 지질은 온도, pH에 의해서 가수분해가 일어나는 것이 알려져 있다. 특히 Sn-1과 Sn-2 위치에서의 지방산 에스테르는 가수분해를 받기 쉽고, 리소 지질 및 지방산에 분해되는 것이 알려져 있다 [Grit 등, Chem. Phys. Lipids 64, 3-18, 1993]. 이들 분해물은 종래의 지질막 조성을 어지럽히고, 그에 따라 지질막의 투과성을 높임으로써, 리포솜의 안정성이 손상된다.

이 때문에 특히 산성 환경에서 유지할 필요가 있는 약제를 내수상으로 유지하기 위해서는, 산성 환경에서의 지질의 안정성을 향상시킬 필요가 있지만, 본 발명에서는 염기성 화합물을 막에 함유시킴으로써, 리포솜 표면을 양으로 대전시킴으로써 지질의 가수분해를 억제할 수 있다.

염기성 화합물로는 특별히 한정되지 않지만, 옥타데실아민(ODA), N-메틸-n-옥타데실아민(MODA), N,N-디메틸-n-옥타데실아민(DMODA), 브롬화스테아릴트리메틸 암모늄(TMODA) 등의 아민(암모늄염도 포함함) 화합물을 들 수 있다. TMODA 등의 4급 암모늄염을 갖는 지질 유도체는 낮은 농도로 지질막 표면을 양으로 대전하는 것이 가능하기 때문에 바람직하다.

또한, 염기성 화합물로는, 일본 특허 공개 (소)61-161246호에 개시된 DOTMA, 일본 특허 공표 (평)5-508626호에 개시된 DOTAP, 일본 특허 공개 (평)2-292246호에 개시된 트랜스펙탐(Transfectam), 일본 특허 공개 (평)4-108391호에 개시된 TMAG, 국제 공개 제97/42166호에 개시된 3,5-디펜타데실옥시벤즈아미딘 염산염, DOSPA, TfxTM-50, DDAB, DC-CHOL, DMRIE 등의 화합물도 들 수 있다.

상기 다른 표면 수식제가 지질에 염기성 관능기를 갖는 화합물이 결합한 물질인 경우에는, 양이온화 지질이라 불린다. 양이온화 지질의 지질 부분은 리포솜의 지질 이중막 중에 안정화되고, 염기성 관능기 부분은 담체의 지질 이중층의 막표면 상(외막 표면상 및/또는 내막 표면 상)에 존재할 수 있다. 양이온화 지질로 막을 수식함으로써, 리포솜 막과 세포와의 접착성 등을 높일 수 있다.

본 발명에서, 상기 리포솜의 내수상은 pH 5 이하이고, 바람직하게는 pH 2 내지 pH 5이며, 보다 바람직하게는 pH 3 내지 pH 5이고, 특히 바람직하게는 약 pH 4이다. 이에 따라, pH 5를 초과하면 불안정한 약물을 안정적으로 담지할 수 있다. 내수상의 pH는 리포솜 제조시에 생체 내에서 허용할 수 있는 생리적 pH의 완충액으로 조정할 수 있다.

상기한 바와 같은 리포솜에는 여러 가지 약물을 담지시킬 수 있다. 예를 들면 치료를 위한 약물로는, 구체적으로 핵산, 폴리뉴클레오티드, 유전자 및 그의 유 연체, 항암제, 항생 물질, 효소제, 항산화제, 지질 흡수 저해제, 호르몬제, 항염증제, 스테로이드제, 혈관 확장제, 안지오텐신 변환 효소 저해제, 안지오텐신 수용체 길항제, 평활근 세포의 증식·유주(遊走) 저해제, 혈소판 응집 저해제, 항응고제, 케미칼 메디에이터의 유리 저해제, 혈관 내피 세포의 증식 촉진 또는 억제제, 알드스 환원 효소 저해제, 메산기움 세포 증식 저해제, 리폭시게나제 저해제, 면역 억제제, 면역 부활제, 항바이러스제, 마이야르 반응 억제제, 아밀로이드 시스 저해제, 일산화질소 합성 저해제, AGE(Advanced glycation endproducts) 저해제, 라디칼 스캐빈저, 단백질, 펩티드, 글리코사미노글리칸 및 그의 유도체, 올리고당 및 다당 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다.

본 발명의 리포솜 제제는 pH 5보다 큰 pH에서는 불안정하게 되는 약물을 특히 안정적으로 담지할 수 있다. 이러한 약물로는, 구체적으로 염산 도파민, 메실산가벡사이트, 노르에피네프린, 염산브롬헥신, 메토클로프라미드, 에피네프린, 비타민 B1, 비타민 B6, 카르보플라틴, 염산겜시타빈, 타르타르산비노레빈, 황산빈크리스틴, 염산 독소루비신, 염산에필비신, 염산다우노루비신 등을 들 수 있다.

또한 진단을 위한 약물로는, X선 조영제, 초음파 진단제, 방사성 동위 원소 표지 핵 의학 진단약, 핵 자기 공명 진단용 진단약 등의 체내 진단약을 들 수 있다. 이외에, 본 발명의 리포솜의 막 형태를 손상시키지 않고, pH 5 이하의 액 성분에 함유 또는 접촉하여도 영향을 받지 않는 약물, 또는 pH 5 이하의 내수상으로 봉입하는 데에 알맞은 약물이면, 치료용 약물도 진단용 약물도 특별히 한정되지 않고 담지시킬 수 있다.

약물은 그 종류에 따라서도 원하는 담지량이 다르지만, 일반적으로는 고담지율인 것이 바람직하다. 본 발명에서는, 내수상 pH가 5 이하임으로써, 이온 구배법을 이용하여 약물을 고농도로 담지할 수 있다.

본 발명의 리포솜 제제에서 바람직한 약물 담지량은 리포솜 막의 총 지질에 대한 농도로, 적어도 0.05 mol 약물/mol 지질이고, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mol 약물/mol 지질이다. 여기서의 총 지질이란, 친수성 고분자 지질 유도체 이외의 막을 구성하는 모든 지질의 총량이고, 구체적으로 인지질류 및 다른 지질류, 또 다른 표면 수식제를 포함하는 경우에는 이 표면 수식제도 포함한다.

또한 본 발명에서 "담지"란, 본질적으로 리포솜(담체)의 폐쇄 공간 내에 약물이 봉입된 상태를 말하지만, 약물의 일부를 막내에 포함하는 상태에서, 또는 리포솜의 외표면에 부착한 상태에서 포함하고 있을 수 있다.

본 발명의 리포솜 제제는 투여 경로 순서로 의약적으로 허용되는 안정화제 및/또는 산화 방지제를 더 포함할 수도 있다.

안정화제로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 락토오스 또는 수크로오스와 같은 당류를 들 수 있다. 또한, 막 구성 성분의 다른 지질로서 상술한 콜레스테롤 등의 스테롤은 이 안정화제로서 작용한다.

산화 방지제로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 아스코르브산, 요산, 토코페롤 동족체(예를 들면, 비타민 E)를 들 수 있다. 또한, 토코페롤에는 α, β, γ, δ의 4개의 이성체가 존재하지만 본 발명에서는 모두 사용할 수 있다. 사용되는 안정화제 및/또는 산화 방지제는 제형에 따라서 상기 중에서 적절하게 선택되 지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 안정화제 및 산화 방지제는 각각 단독으로 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 산화 방지의 관점에서는 상기 분산체는 질소 충전으로 포장하는 것이 바람직하다.

본 발명의 리포솜 제제는 투여 경로 순서로 의약적으로 허용되는 첨가물을 추가로 포함할 수도 있다. 이러한 첨가물의 예로서, 물, 생리 식염수, 의약적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 크산탄검, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토오스, PBS, 생체 내분해성 중합체, 무혈청 배지, 의약 첨가물로서 허용되는 계면활성제, 상술한 생체 내에서 허용할 수 있는 생리적 pH의 완충액 등을 들 수 있다.

첨가물은 상기 중에서 적절하게 선택되거나, 이들을 조합하여 사용되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 리포솜 제제의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 구상 또는 그에 가까운 형태를 취한 경우에는, 입자 외경의 직경이 LUV인 경우는 70 nm 내지 140 nm, 바람직하게는 80 nm 내지 130 nm, 보다 바람직하게는 90 nm 내지 120 nm이다. 또한, SUV의 경우는 40 nm 내지 140 nm, 바람직하게는 50 내지 130 nm, 보다 바람직하게는 60 내지 120 nm이다.

입자 외경의 직경이란, 동적 광산란법에 의해 측정되는 리포솜 제제 전체 입자의 직경의 평균값이고, 본 발명에서 구체적으로는 제타사이저(Zetasizer)(Malvern Instruments. 3000 HS 또는 S ZEM 5002)를 사용하여 측정하였다.

리포솜 제제의 제조에서는, 최종 멸균법으로서 여과 멸균법이 이용된다. 여과 멸균법에서는 리포솜은 투과하지만, 지표균으로서 사용되는 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta)(크기, 약 0.3×0.8 ㎛)는 여과되지 않는 것이 요구되기 때문에, 브레분디모나스 디미누타에 비해 충분히 작은 입자일 필요가 있다. 입경이 100 nm 부근인 것은, 이 여과 멸균 공정을 보다 확실하게 한 후에도 중요하다.

본 발명에서는, 이들 첨가물을 포함하는 양태의 리포솜 제제를 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법, 예를 들면 0 내지 8 ℃에서의 냉장 또는 1 내지 30 ℃의 실온에서 보존할 수 있다.

이어서, 본 발명의 특정 구조의 리포솜의 바람직한 제조 방법을 예시하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

예를 들면 플라스크 내에서, 인지질 등의 막 구성 성분을 클로로포름 등의 유기 용매에 의해 혼합하고, 유기 용매를 증류 제거 후에 진공 건조함으로써 플라스크 내벽에 박막을 형성시킨다. 이어서, 해당 플라스크 내에 내수용액을 첨가하고, 격하게 교반함으로써, 리포솜 분산액을 얻는다. 리포솜의 내수상의 pH는 첨가하는 내수상 용액을 필요에 따라 pH 조정제 등으로 원하는 pH로 조정함으로써 조정 할 수 있다. 이어서, 얻어진 리포솜 분산액을 원심 분리하고, 상청을 경사 분리하여 정제함으로써, 리포솜 분산액으로서 얻을 수 있다. 친수성 고분자에 의해 리포솜 표면을 수식하는 수단으로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 인지질이나 콜레스테롤 등과의 유도체가 바람직하게 사용되고, 상술한 수법 등을 이용하여 얻은 리포솜 분산액에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 그대로 또는 수용액으로서 첨가함으로써 PEG쇄가 외표면에만 분포하는 리포솜을 제조할 수 있다.

또한 상기와는 별도로 반응 활성인 관능기를 갖는 인지질 등의 막 구성 지질을 함유하는 리포솜을 통상법으로 제조한 후, 리포솜 외액에 편말단 활성화 PEG를 첨가하여 관능기를 갖는 인지질 등의 막 구성 지질과 결합시킴으로써, 리포솜을 제조할 수도 있다.

또한 리포솜은 상기 방법 이외에도, 상기한 각 구성 성분을 혼합하고, 고압 토출형 유화기에 의해 고압 토출시킴으로써 얻을 수도 있다. 이 방법은, "생명 과학에서의 리포솜"[데라다, 요시무라 등; 슈프링거·페어라크 도쿄(1992)]에 구체적으로 기재되어 있고, 이 기재를 인용하여 본 명세서에 기재되어 있는 것으로 한다.

상기에서, 리포솜을 원하는 크기로 조절하기 위해서, 몇가지 기술이 이용 가능하다(비특허 문헌 6). 이 기재를 인용하여 본 명세서에 기재되어 있는 것으로 한다.

리포솜 분산액은 익스트루더를 사용하여, 필터를 복수회 강제 통과시킴으로써 단일 라멜라화할 수 있다. 통상, 필터는 소망 직경보다 대직경의 공경을 가진 것, 마지막으로 소망 직경이 얻어지지만 공경이 다른 것을 2종 이상 사용한다. 입 구 직경이 다른 필터를 사용하여, 익스트루젼의 횟수를 많게 할수록 단일 라멜라화율이 높아지고, 실질적으로 1장의 막 리포솜이라 간주할 수 있다. 실질적으로 단일 라멜라 소포란, 구체적으로는 리포솜 제제를 구성하는 전체 담체(소포) 중, 단일 라멜라 소포가 차지하는 비율이 존재비에서 전체의 50％ 이상인 것이 좋고, 80％ 이상인 것이 바람직하다.

상기한 바와 같은 리포솜에 약물을 담지하기 위해서는 약물을 포함하는 수용액에서 리포솜을 구성하는 지질막을 수화시킴으로써 약물을 리포솜에 담지시키는 방법(패시브 로딩(Passive loading)), 또는 리포솜 막의 내측/외측에 이온 구배를 형성함으로써, 약물은 이 이온 구배에 따라서 리포솜 막을 투과시켜 담지시키는 방법(리모우트 로딩(Remote loading))이 있다(상기 조절 기술을 기재한 문헌 및 미국 특허 제5192549호, 미국 특허 제5316771호 등 참조). 본 발명에서의 리포솜 제제의 바람직한 제조 방법은 리모우트 로딩이다. 이 방법에서는 높은 약물/지질을 달성할 수 있고, 임상에 유효한 고담지율의 리포솜 제제를 얻을 수 있다.

리모우트 로딩법은 내수상과 외수상 사이에 pH 구배를 형성함으로써 달성할 수 있다. pH 구배를 형성하는 방법으로서, 미리 낮은 pH에서 상기한 방법으로 리포솜을 제조하고, 그 후 외수상을 치환함으로써 pH 구배를 형성할 수 있다.

리포솜 막을 사이에 두고 형성되는 구배로서 Na⁺/K⁺ 농도 구배를 사용하는 방법이 있다. Na⁺/K⁺ 농도 구배에 대한 리모우트 로딩법에 의해 미리 형성되어 있는 리포솜 중에 약제를 첨가하는 기술은, 미국 특허 제5077056호에 기재되어 있고, 이것을 참조하여 행할 수 있다. 또한 이 기재를 인용하여 본 명세서에 기재되어 있는 것으로 할 수 있다.

리포솜의 내측과 외측 사이에 pH 구배를 형성하는 방법은, 내측이 높고/외측이 낮은 암모늄 이온 농도 구배 및/또는 양성자화할 수 있는 아미노기를 갖는 유기 화합물 농도 구배를 사용할 수도 있다. 양성자화할 수 있는 아미노기를 갖는 유기 화합물은 저분자량의 것이 바람직하고, 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 아미노에탄올 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 암모늄 이온 농도 구배에 대한 리모우트 로딩법에 의해 미리 형성되어 있는 리포솜 중에 약제를 첨가하는 기술은, 미국 특허 제5192549호에 기재되어 있고, 이것을 참조하여 행할 수 있다. 또한 이 기재를 인용하여 본 명세서에 기재되어 있는 것으로 할 수 있다. 구체적으로는, 0.1 내지 0.3 M의 암모늄염(예를 들면 황산암모늄)을 함유하는 수성 완충액 중에서 미리 리포솜을 형성하고, 외부 매체를 암모늄 이온을 함유하지 않은 매질, 예를 들면 수크로오스 용액과 교환함으로써 암모늄 이온 구배를 형성한다. 내부 암모늄 이온은 암모니아 및 양성자에 의해 평형화하고, 암모니아는 지질막을 투과하여 확산함으로써 리포솜 내부에서 소실된다. 암모니아의 소실에 따라 리포솜 내의 평형이 양성자 생성의 방향으로 연속적으로 이동한다. 그 결과, 리포솜 내에 양성자가 축적되고, 리포솜의 내측/외측에 pH 구배가 형성된다. 이 pH 구배를 갖는 리포솜 분산액에 약제를 첨가함으로써 약제가 리포솜 중에 내봉된다.

암모늄 이온 구배를 형성하는 암모늄염은 특별히 한정되는 것은 아니지만 황산암모늄, 수산화암모늄, 아세트산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 시트르산암모늄, 숙신산암모늄, 암모늄락토비오네이트, 탄산암모늄, 타르타르산암모늄, 및 옥살산암모늄이 포함된다.

리포솜의 내측과 외측 사이에 pH 구배를 형성하는 방법은 이온운반체를 사용하는 방법도 있다. 이온운반체를 사용하여 리포솜의 내측과 외측 사이에 pH 구배를 형성하고, 리모우트 로딩법에 의해 리포솜 중에 약제를 도입하는 기술은 미국 특허 제5837282호에 기재되어 있고, 이것을 참조하여 행할 수 있다. 또한 이 기재를 인용하여 본 명세서에 기재되어 있는 것으로 할 수 있다.

리포솜의 내측과 외측 사이에 pH 구배를 형성하고, 리모우트 로딩법의 구체예로는 이하의 방법이 있다.

플라스크 내에서, 인지질 등의 막 구성 성분을 클로로포름 등의 유기 용매에 의해 혼합하고, 유기 용매를 증류 제거 후에 진공 건조함으로써 플라스크 내벽에 박막을 형성시킨다. 이어서, 산성 완충액(예를 들면 pH 4의 완충액)을 첨가하고 진탕하여 리포솜 분산액을 얻는다. 또한 필요에 따라 리포솜 입경의 조절을 행하고, 리포솜 외액을 겔 여과 등의 방법에 의해 pH가 중성 부근의 외수상으로 치환하는 방법이나 적당한 pH 조정제에 의해 리포솜 외수상의 pH를 중성 부근(예를 들면 pH 7 내지 7.5 부근)으로 조정하는 방법 등에 의해 pH 구배를 형성하고, 이 리포솜 분산액에 약물을 포함하는 수용액을 첨가한 후, 이 용액을 특정 시간 가온함으로써 약물을 담지시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서, 친수성 고분자의 수식은 상술한 바 와 같이 지질 이중막의 단일 라멜라 소포를 형성한 후이면, 약물 담지 조작의 전후 중 어느 때나 행할 수 있다.

리포솜 제제의 비경구적 투여의 경로로는, 예를 들면 점적 등의 정맥내 주사(정맥 주사), 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사를 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절하게 투여 방법을 선택할 수 있다. 리포솜 제제의 구체적인 투여 방법으로는, 의약 조성물을 실린지나 점적에 의해서 투여할 수 있다. 또한,카테터를 환자 또는 숙주의 체내, 예를 들면 관강 내, 예를 들면 혈관 내에 삽입하여, 그 선단을 표적 부위 부근에 유도하고, 해당 카테터를 통해서 원하는 표적 부위 또는 그 근방 또는 표적 부위에의 혈류가 기대되는 부위로부터 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 리포솜 제제는, 병에 이미 고통받는 환자에게 질환의 증상을 치유하거나, 적어도 부분적으로 저지하기 위해서 충분한 양으로 투여된다. 예를 들면 리포솜 제제에 봉입되는 약물의 유효 투여량은, 통상 1일에 체중 1 kg 당 0.01 mg 내지 100 mg의 범위에서 선택된다. 그러나, 본 발명의 리포솜 제제는 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다. 투여 시기는 질환이 발생한 후부터 투여할 수 있고, 또는 질환의 발증이 예측될 때에 발증시의 증상 완화를 위해 예방적으로 투여할 수도 있다. 또한, 투여 기간은 환자의 연령, 증상에 의해 적절하게 선택할 수 있다.

이어서 실시예, 시험예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예, 시험예로 한정되는 것은 아니다.

또한, 각 예에서 사용한 성분의 분자량은 다음과 같다.

수소 첨가 대두 레시틴(HSPC라 약기, 분자량 790, 리포이드(Lipoid)사 제조 SPC3)

콜레스테롤(Chol이라 약기, 분자량 386.65, 솔베이(Solvay)사 제조)

스핑고미엘린(Sphingomyelin; SM이라 약기, 분자량 703.3, 아반티 폴라 리피도스(Avanti Polar Lipidos)사 제조)

폴리에틸렌글리콜 5000-포스파티딜에탄올아민(PEG₅₀₀₀-DSPE라 약기, 분자량 6075, 닛본 유시사 제조)

3,5-디펜타데실옥시벤즈아미딘 염산염(분자량 609.41)

옥타데실아민(Octadecylamine; ODA라 약기)(도쿄 가세이: 분자량 269.51)

N-메틸-n-옥타데실아민(N-Methyl-n-octadecylamine; MODA라 약기)(도쿄 가세이: 분자량 283.54)

N,N-디메틸-n-옥타데실아민(N,N-Dimethyl-n-octadecylamine; DMODA라 약기)(도쿄 가세이: 분자량 297.56)

브롬화스테아릴트리메틸암모늄(Stearyltrimethylammonium Bromide; TMODA라 약기)(도쿄 가세이: 분자량 392.5)

독소루비신(염산 독소루비신: Doxorubicin Hydrochloride USP23(보령(BORYUNG)): 분자량 579.99)

(실시예 1)

독소루비신 내봉 리포솜의 제조예

이 실시예 1에서는, 본 발명의 리포솜 제제예를 나타낸다. 이하에 나타낸 바와 같이, 저 pH 조건하(pH 4)에서 제조한 리포솜에 친수성 고분자 지질 유도체(PEG₅₀₀₀-DSPE: 분자량 5000 달톤의 폴리에틸렌글리콜의 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 유도체)를 첨가함으로써, 리포솜의 외막 표면에 친수성 고분자(PEG쇄)를 분포시키고, 추가로 이온 구배법에 의해 약물을 도입함으로써 LUV 리포솜을 제조하였다.

수소 첨가 포스파티딜콜린(HSPC):콜레스테롤(Chol)=54:46의 몰비로 t-부탄올에 용해시키고, 동결 건조시켜 막 성분의 혼합 지질을 제조하였다.

300 mM의 시트르산 용액과 300 mM의 시트르산삼나트륨 용액을 혼합하고, pH 4.0으로 조정한 내수상 용액과 pH 7.5로 조정한 외수상 용액을 제조하였다.

상기에서 제조한 혼합 지질을 0.37 g 칭량한 후에, 내수상 용액 10 ㎖를 첨가하고, 68 ℃의 항온조에서 15 분간 팽윤한 후, 볼텍스에서 교반하고, 리포솜 조분산액을 제조하였다. 68 ℃로 가온한 익스트루더(Lipex Biomembranes사 제조)를 사용하여 공경 200 nm의 필터를 5회 통과시키고, 공경 100 nm의 필터로 교환 후, 추가로 2회 동일한 조작을 행하여(φ 200 nm×5, φ 100 nm×5, φ 100 nm×5), LUV 리포솜 분산액을 제조하였다. 익스트루젼 후의 샘플은 빙냉하였다.

상기에서 제조한 리포솜 분산액을 외수상으로 충분히 치환한 겔 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow)에서 겔 여과를 행하고, pH 구배를 형성하였다. 겔 여과 후의 샘플은 빙냉하였다.

겔 여과 후의 리포솜의 지질 정량(HSPC 정량)을 행하고, HSPC 정량으로부터 산출된 HSPC 농도를 바탕으로 PEG₅₀₀₀-DSPE(닛본 유시사 제조)를 1.0 mol％가 되도록 첨가하고, 60 ℃, 30 분간 교반하여 PEG₅₀₀₀-DSPE를 도입하였다.

또한 HSPC 정량으로부터 산출된 HSPC 농도를 바탕으로, 염산 독소루비신/HSPC=0.2(w/w)가 되도록 염산 독소루비신량을 계산하고, 계산 결과를 바탕으로 필요량의 염산 독소루비신를 칭량하고 10％ 수크로오스(pH 9.0) 용액을 사용하여 10 mg/㎖의 용액을 제조하였다. 리포솜 분산액에 소정량의 염산 독소루비신 용액(10 mg/㎖)을 첨가하여 60 ℃에서 60 분간 교반을 행하여 염산 독소루비신의 도입을 행하였다. 염산 독소루비신 도입 후의 샘플은 빙냉하였다. 10％ 수크로오스(pH 6.5)로 충분히 치환한 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow, φ 2.8 cm×20 cm)을 사용하여 겔 여과를 행하여 리포솜에 봉입되어 있지 않은 염산 독소루비신을 제거하였다.

실시예 1에서, 리포솜 인지질은 인지질 C 테스트 와꼬(와꼬 쥰야꾸사 제조)를 사용하여 정량하였다.

또한 리포솜 내에 봉입된 독소루비신 농도는, 독소루비신 리포솜 40 ㎕에 메탄올 2 ㎖를 첨가한 용액에 대해서, 480 nm에서의 흡광도를 분광 광도계로 측정하여 구하였다.

입경은 리포솜 분산액 20 ㎕를 생리 식염수에서 3 ㎖로 희석하고, 제타사이저 3000 HS(Malvern Instruments.)로 측정한 평균 입경이다. 얻어진 리포솜을 하 기 표 1에 나타낸다.

(비교예 1)

독소루비신 내봉 리포솜의 제조예

이 비교예 1에서는, 본 발명 범위외의 리포솜 제제예를 도시한다. 친수성 고분자 지질 유도체(PEG₅₀₀₀-DSPE)를 리포솜 형성시에 공존시킴으로써, 리포솜의 이중막의 내외막의 양측상에 친수성 고분자(PEG쇄)를 분포시킨 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 리포솜 성분을 사용하여 리포솜 제제를 제조하였다.

즉, 실시예 1과 동일한 혼합 지질(HSPC:Chol=54:46)을 0.37 g 칭량하고, 그 후 HSPC 농도를 바탕으로 PEG₅₀₀₀-DSPE를 2.0 mol％가 되도록 PEG₅₀₀₀-DSPE를 0.073 g 칭량하고, 에탄올 1 ㎖를 첨가한 후, 65 ℃의 항온조에서 30 분간 용해시켰다. 완전 용해 확인 후, 내수상 10 ㎖를 첨가하고, 추가로 65 ℃에서 60 분간 가온 교반을 행하여 리포솜 조분산액을 제조하였다. 익스트루더를 이용하여, 실시예 1과 동일한 조작을 행하고, 익스트루젼 후의 샘플은 빙냉하였다.

제조한 리포솜을 외수상으로 충분히 치환한 겔 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow)으로 겔 여과를 행하고, 실시예 1과 동일하게 pH 구배를 형성하여, 겔 여과 후의 샘플은 빙냉하였다.

겔 여과 후의 리포솜의 지질 정량(HSPC 정량)에 의해 산출된 HSPC 농도를 바탕으로, 염산 독소루비신/HSPC=0.2(w/w)가 되도록 염산 독소루비신량을 계산하고, 계산 결과를 바탕으로 필요량의 염산 독소루비신를 칭량하고, 10％ 수크로오스(pH 9.0) 용액을 사용하여 10 mg/㎖의 용액을 제조하였다.

리포솜 분산액에 소정량의 염산 독소루비신 용액(10 mg/㎖)을 첨가하고, 실시예 1과 동일하게 염산 독소루비신의 도입 조작을 행하여, 리포솜에 봉입되어 있지 않은 염산 독소루비신를 제거하였다.

실시예 1과 동일하게 리포솜 인지질의 정량, 리포솜 내에 봉입된 독소루비신량, 입경을 측정하였다. 얻어진 리포솜을 표 1에 나타낸다.

(실시예 2)

본 발명의 독소루비신 내봉 리포솜의 제조예

막 성분에 스핑고미엘린(SM):Chol=55:45의 혼합 지질을 사용하여, 본 발명의 리포솜 제제를 제조하였다. SM:Chol을 55:45의 몰비로 클로로포름/메탄올 혼합액에 용해시키고, 용매를 감압 증류 제거하여 박막을 형성하였다. 300 mM의 시트르산 용액과, 300 mM의 시트르산삼나트륨 용액을 혼합하고 pH 4.0로 조정하여 내수상 용액으로 하였다. 혼합 지질 0.30 g을 칭량하고, 내수상 용액 5 ㎖를 첨가하고, 70 ℃에서 10 분간 수화시켰다. 때때로, 55 ℃로 따뜻하게 한 버스형 소니케이터로 초음파를 가함으로써, 지질을 균일하게 분산시켰다.

얻어진 지질 분산액을 65 ℃로 보온한 익스트루더(Lipex Biomembranes사 제조)를 사용하여, 공경 400 nm의 필터를 3회 통과시키고, 공경 200 nm의 필터로 교환한 후 추가로 3회 통과시키고, 공경 100 nm의 필터로 교환한 후 추가로 2회 동일한 조작을 행하였다(φ 400 nm×3, φ 200 nm×3, φ 100 nm×5, φ 100 nm×5). 익스트루젼 후의 샘플은 빙냉하였다.

제조한 리포솜을 생리 식염수로 충분히 치환한 겔 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow)으로 겔 여과를 행하였다. 겔 여과 후의 샘플은 빙냉하였다.

겔 여과 후의 리포솜의 지질 정량(SM 정량)을 행하고, SM 정량으로부터 산출된 SM 농도를 바탕으로 PEG₅₀₀₀-DSPE를 0.75 mol％가 되도록 첨가하고 60 ℃, 30 분간 교반하여 PEG₅₀₀₀-DSPE를 도입하였다.

또한 SM 정량으로부터 산출된 SM 농도를 바탕으로, 리포솜의 총 지질량에 대하여 20 mol％ 염산 독소루비신량을 계산하고, 계산 결과를 바탕으로 필요량의 염산 독소루비신를 칭량하여, 생리 식염수를 사용하여 10 mg/㎖의 용액을 제조하였다. 리포솜 분산액에 소정량의 염산 독소루비신 용액(10 mg/㎖)을 첨가하고 1 N NaOH 또는 포화 탄산수소나트륨수로 pH 7.4로 조정한 후, 65 ℃에서 30 분간 교반을 행하여 염산 독소루비신의 도입을 행하였다. 염산 독소루비신 도입 후의 샘플은 빙냉하였다. 생리 식염수로 충분히 치환한 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow)을 사용하여 겔 여과를 행하여 리포솜에 봉입되어 있지 않은 염산 독소루비신을 제거하였다.

실시예 1과 마찬가지로, 리포솜 인지질의 정량, 리포솜 내에 봉입된 독소루비신량, 입경을 측정하였다. 얻어진 리포솜을 표 1에 나타낸다.

(실시예 3)

HSPC:Chol:3,5-디펜타데실옥시벤즈아미딘 염산염을 50/42/8의 몰비로 t-부탄올에 용해시키고, 동결 건조시켜 혼합 지질을 얻었다.

300 mM의 시트르산 용액과, 300 mM의 시트르산삼나트륨 용액을 혼합하여 pH 4로 조정한 내수상 용액으로 하였다.

혼합 지질 0.30 g을 칭량하고, pH 4로 조정한 내수상 용액 5 ㎖를 첨가하고, 70 ℃에서 10 분간 수화시켰다. 때때로, 55 ℃로 따뜻하게 한 버스형 소니케이터로 초음파를 가함으로써 지질을 균일하게 분산시켰다. 얻어진 지질 분산액을 73 ℃로 보온한 익스트루더(Lipex Biomembranes사 제조)를 사용하여, φ 0.4 ㎛의 막 필터를 3회, φ 0.2 ㎛를 3회, φ 0.1 ㎛를 10회 통과시킴으로써 LUV의 분산액을 얻었다. 얻어진 리포솜의 입경은 111.3 nm였다.

상기에서 제조한 리포솜 분산액을 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow, φ 1.5 cm×25 cm)에 첨가하고, 생리 식염수로 용출시켜 겔 여과하고, 외수상을 생리 식염수로 치환하였다.

PEG₅₀₀₀-DSPE를 생리 식염수에 10 mg/㎖가 되도록 용해하고, 이것을 외수상으로 리포솜의 총 지질량에 대하여 0.75 mol％분의 PEG₅₀₀₀-DSPE가 되도록 첨가하고, 교반하면서 60 ℃에서 30 분간 배양하였다.

독소루비신을 생리 식염수에 10 mg/㎖가 되도록 용해시키고, 이 액을 리포솜의 총 지질량에 대하여 20 mol％의 독소루비신이 되도록 첨가하고, 1 N NaOH 또는 포화 탄산수소나트륨수로 pH 7.4로 조정한 후, 65 ℃에서 30 분간 배양하였다.

상기에서, 리포솜 인지질은 실시예 1과 동일하게 정량하였다.

입경은 리포솜 분산액 100 ㎕를 생리 식염수로 3 ㎖에 희석하여, 제타사이저 S ZEM 5002(Malvern Instruments.)로 측정하였다. 리포솜 내에 봉입된 독소루비신량(약물 담지량=약제/지질)은 독소루비신 리포솜 0.1 ㎖에 1 N HCl 0.3 ㎖와 이소프로판올 3.6 ㎖를 혼합한 액에 대해서, 480 nm에서의 흡광도를 분광 광도계로 측정하여 구하였다. 독소루비신량은 0.12 mol/mol이었다.

(시험예 1)

이하의 4종의 완충액에 PEG₅₀₀₀-DSPE(닛본 유시사 제조)를 5 mg/㎖가 되도록 용해시키고, 65 ℃에서 90 분간 가열하였다. 또한, PEG₅₀₀₀-DSPE를 동일한 완충액에 10 mg/㎖가 되도록 용해시키고, 40 ℃에서 1주간 보존하였다.

완충액 (1): 황산암모늄(250 mM)

완충액 (2): L-히스티딘(10 mM), 10％ 수크로오스 pH 6.5

완충액 (3): 시트르산(300 mM) pH 4.0

완충액 (4): 시트르산(300 mM) pH 7.5

보존 후의 용액을 10 ㎕ 칭량하고, 20 cm×20 cm의 실리카겔 박층판의 하부로부터 1 cm의 부분에 지점을 정하였다. 미리 클로로포름/메탄올/암모니아수 (28) 혼합액(85:14:1)의 전개 용매로 평형화한 유리 용기 내에 실리카겔 박층판을 넣고, 전개 용매로 약 15 cm 전개하고, 요오드 발색법에 의해 분해물을 검색하였다. 이 박층 크로마토그래피(TLC)를 도 1 내지 2에 도시한다. 도 1은, PEG₅₀₀₀-DSPE 용액을 65 ℃, 90 분간 가온 후의 TLC의 결과이고, 도 2는 PEG₅₀₀₀-DSPE 용액을 40 ℃, 1주간 가온 후의 TLC의 결과이다. 그 결과, pH 5 이상의 완충액에 용해시킨 것에 대해서는, 가온 전후에서 분해물의 (리소체)의 위치(Lyso-PEG Std의 지점 참조)에 지점의 증대를 인정하지 않았지만, pH 4의 완충액 중에 용해시킨 것에 대해서는 명확히 분해물(리소체)의 지점의 증대를 인정하였다.

시험예 1은, 산성 조건하에서의 친수성 고분자 지질 유도체(PEG₅₀₀₀-DSPE)의 안정성의 데이터를 나타낸다. PEC₅₀₀₀-DSPE는 산성 조건(완충액 (3) 시트르산 pH 4.0)으로 가온하면 분해가 진행되는 것을 나타내고 있다. 즉, 비교예 1에 예시한 산성 완충액 조건하에서 PEG₅₀₀₀-DSPE가 존재하는 방법으로 제조하는 리포솜에서는, 제조시 및 보존시에 PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해가 예상된다. 또한, 비교예 1의 방법에서 제조한 리포솜은 내수상이 산성이고, 내수상측에 분포하는 PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해도 예상된다. 그 결과를 시험예 2에 나타낸다.

(시험예 2)

실시예 1과 비교예 1의 리포솜에서의 PEG 의 분해 거동 비교

실시예 1과 비교예 1에 의해서 제조한 리포솜 2종을 40 ℃에서 1주간·2주간 보존 후, HPLC법을 이용하여 PEG₅₀₀₀-DSPE 정량하였다. 결과를 4 ℃ 보존의 PEG 리포솜에 대한 PEG₅₀₀₀-DSPE의 잔존율로 도 3에 도시한다.

시험예 2의 결과는, 비교예 1의 리포솜에서는 PEG₅₀₀₀-DSPE의 잔존율이 저하되고, PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해가 일어나는 것을 나타내고 있다. 한편, 실시예 1의 본 발명의 리포솜에서는 PEG₅₀₀₀-DSPE의 잔존율에 변화가 없고, PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해가 일어나는 것을 나타내고 있다.

즉 PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해를 방지함으로써, PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해에 따른 지질 이중막의 불안정화, 리포솜의 담지 약제의 누출, 리포솜의 응집, 리포솜의 혈장 단백이나 옵소닌 단백과의 흡착 방지 효과의 저하, 리포솜의 혈중에서의 안정성을 손상시키는 등의 과제를 극복할 수 있다.

(실시예 4)

HSPC:Chol:염기성 지질((1) ODA, (2) MODA, (3) DMODA 또는 (4) TMODA)=50:42:8(mol비)이 되도록 각 지질을 칭량하고, 에탄올에 용해시켰다. 완전 용해 확인 후, 황산암모늄 용액(250 mM)을 9 ㎖ 첨가하고, 68 ℃에서 가온 교반을 행하였다. 가온 교반 종료 후 68 ℃로 가온한 익스트루더를 사용하여 1.0 MPa에서 공경 200 nm의 필터를 2.0 MPa에서 5회 통과시키고, 공경 100 nm의 필터에 교환하여 추가로 5회 통과시켰다. 재차 공경 100 nm의 필터로 교환하고, 2.0 MPa에서 추가로 5회 통과시켰다. 익스트루젼 후의 샘플에 PEG₅₀₀₀-DSPE 도입률 0.75 mol％가 되도록 PEG₅₀₀₀-DSPE 용액(36.74 mg/㎖(RO 물))을 2 ㎖ 첨가하여 60 ℃, 30 분간 가온 교반을 행하여 PEG₅₀₀₀-DSPE를 도입하였다. 도입 후의 샘플은 빙냉하였다. 상기에서 사용한 염기성 지질의 각 구조를 이하에 나타낸다.

상기에서 제조한 리포솜 분산액을 10％ 수크로오스(pH 9.0)의 용액으로 충분히 치환한 겔 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow)으로 겔 여과를 행하고, pH 구배를 형성하였다. 겔 여과 후의 샘플은 빙냉하였다.

또한 HSPC 정량으로부터 산출된 HSPC 농도를 바탕으로, 염산 독소루비신(Dox)/총 지질(mol/mol)=0.16(Dox/총 지질(w/w)=0.18)이 되도록 염산 독소루비신량을 계산하였다. 계산 결과를 바탕으로 필요량의 염산 독소루비신를 칭량하고, 10％ 수크로오스(pH 9.0) 용액을 사용하여 10 mg/㎖의 용액을 제조하였다. 리포솜 분산액에 소정량의 염산 독소루비신 용액(10 mg/㎖)을 첨가하고 60 ℃에서 60 분간 교반을 행하여 염산 독소루비신의 도입을 행하였다. 염산 독소루비신 도입 후의 샘플은 빙냉하였다. 10％ 수크로오스(pH 6.5)의 용액으로 충분히 치환한 칼럼(Sepharose 4 Fast Flow, φ 2.8 cm×20 cm)을 사용하여 겔 여과를 행하고, 리포솜에 봉입되어 있지 않은 염산 독소루비신을 제거하였다.

상기 각 염기성 지질에 대응하여 얻어진 리포솜 제제 (1) 내지 (4)의 인지질의 정량, 입경 및 제타(Zeta) 전위를 측정하였다.

이 실시예에서, 리포솜 인지질은 인지질 C 테스트 와꼬(와꼬 쥰야꾸사 제조)를 사용하여 정량하였다.

입경은 리포솜 분산액 20 ㎕를 생리 식염수에서 3 ㎖로 희석하고, 제타사이저 3000 HS(Malvern Instruments.)로 측정한 평균 입경이다. 입경은 리포솜 분산액 20 ㎕를 생리 식염수에서 3 ㎖로 희석하고, 제타사이저 3000 HS(Malvern Instruments.)로 측정한 평균 입경이다.

제타(Zeta) 전위를 이하와 같이 측정하였다.

2.5 ㎖의 실린지에 RO 물을 약 2.5 ㎖ 칭량한다. 압자를 당기면서 실린지 선단부로부터 리포솜 분산액을 20 ㎕ 및 둘베코(Dulbecco's) PBS를 20 ㎕ 첨가한 후, 압자를 가압하여 에어를 제거한다. 전도 혼화하여 균일하게 분산시킨 후 제타사이저 3000 HS에서 제타 전위 측정을 행한다.

실시예 4의 리포솜 제제 (1) 내지 (4)에 대한 측정 결과를 실시예 1의 리포솜 제제에 대한 측정 결과와 동시에 하기 표 2에 나타낸다.

(실시예 5)

HSPC:Chol:염기성 지질(TMODA)=((1) 53.5:45.5:1), (2) (53:45:2), (3) (52:44:4), (4) (45.4:38.6:16)(mol비)가 되도록 각 지질을 칭량하고, 에탄올에 용해시켰다. 이후의 조작은 (실시예 4)와 마찬가지의 조작 순서로 제조하였다.

실시예 4와 마찬가지로, 상기 각 염기성 지질비에 대응하여 얻어진 리포솜 제제 (1) 내지 (4)의 인지질의 정량, 입경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(시험예 3)

리포솜 제제에서의 PEG 의 분해 거동

실시예 4 및 실시예 5에서 제조한 리포솜 제제(각 실시예의 리포솜 제제 (4))를 40 ℃에서 2주간 보존 후, HPLC법을 이용하여 PEG₅₀₀₀-DSPE 정량하였다. 실시예 1(염기성 화합물 없음)의 리포솜 제제의 결과(시험예 2)와 함께, 4 ℃ 보존의 PEG 리포솜에 대한 PEG₅₀₀₀-DSPE의 잔존율로 하기 표 3에 나타낸다. 염기성 화합물을 함유함으로써, 염기성 화합물의 함량 의존적으로 PEG₅₀₀₀-DSPE의 함량 저하가 한층더 억제되어 있다는 것을 알 수 있었다.

(시험예 4)

리포솜 제제에서의 HSPC 의 분해 거동

실시예 4 및 실시예 1에서 제조한 리포솜 제제를 40 ℃에서 1주간/2주간 보존 후, HPLC법을 이용하여 HSPC의 분해물의 비율(％)을 정량하였다. HSPC 분해물의 비율(％)의 계산 방법을 이하에 나타낸다.

시험예 4의 결과를 도 4 및 도 5에 도시한다.

도 4에 도시한 바와 같이, 실시예 4의 리포솜 제제는 실시예 1의 리포솜에 비해 HSPC의 분해물의 비율(％)이 적고, HSPC의 가수분해가 억제되어 있는 것을 나타내고 있다. 또한 HSPC의 분해물의 비율(％)은 염기성 화합물의 구조에 크게 의 존하지 않는다는 것을 알 수 있다.

도 5는, 실시예 4의 리포솜 제제의 0주, 1주, 2주(도면 중, 0 W, 1 W, 2 W)의 각 시험 기간에서의 염기성 화합물(TMODA)의 함유율(mol％)에 대한 HSPC의 분해물의 비율(％)에 대한 결과를 도시한다. 도 5에 도시한 바와 같이, 염기성 화합물의 함유율(mol％)이 높아짐에 따라, HSPC의 분해물의 비율(％)이 억제되어 있는 것을 알 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, PEG 지질(PEG₅₀₀₀-DSPE)을 리포솜의 지질 이중막의 외측에 담지함으로써, PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해를 방지할 수 있다. 또한, 염기성 화합물을 지질막에 도입함으로써 PEG₅₀₀₀-DSPE의 분해를 한층 더 억제하고, HSPC의 가수분해도를 억제할 수 있고, 산성 환경에서 유지할 필요가 있는 약물을 내수상으로 포함시키는 경우에도 리포솜 제제를 안정화시킬 수 있다. 본 발명에 의해, 리포솜 제제에서의 지질 이중막은 불안정화, 리포솜의 담지 약제의 누출, 리포솜의 응집, 리포솜의 혈장 단백이나 옵소닌 단백과의 흡착 방지 효과의 저하, 리포솜의 혈중에서의 안정성을 손상시키는 등의 과제를 극복할 수 있다.

Claims

인지질을 주요 막 재료로서 포함하는 지질 이중막으로 형성된 단일 라멜라 소포, 및 상기 소포 내에 존재하는 pH가 5 이하의 내수상을 구비하며, 약물을 담지시킨 리포솜으로서, 상기 소포는 외표면만이 친수성 고분자로 수식된 것인 리포솜 제제.
제1항에 있어서, 상기 약물이 pH 5보다 큰 pH 영역에서 불안정한 약물인 리포솜 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약물을 적어도 0.05 mol 약물/mol 지질의 농도로 담지하는 리포솜 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약물을 적어도 0.1 mol 약물/mol 지질의 농도로 담지하는 리포솜 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주요 막 재료가 상전이점 50 ℃ 이상의 인지질인 리포솜 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질이 수소 첨가된 인지 질인 리포솜 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질이 스핑고인지질인 리포솜 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 상기 인지질 이외의 다른 지질류를 더 포함하는 리포솜 제제.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 콜레스테롤을 더 포함하는 리포솜 제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중막의 막 성분으로서, 아미노기, 아미디노기 및 구아디니노기로부터 선택되는 기를 포함하는 염기성 화합물을 더 포함하는 리포솜 제제.
제10항에 있어서, 상기 염기성 화합물이 3,5-디펜타데실옥시벤즈아미딘 염산염인 리포솜 제제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 고분자가 분자량 500 내지 10,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜인 리포솜 제제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 고분자가 친수성 고분자의 인지질 또는 콜레스테롤 유도체로 도입되는 것인 리포솜 제제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 40 내지 140 nm인 리포솜 제제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 50 내지 130 nm인 리포솜 제제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포솜 제제의 평균 입경이 60 내지 120 nm인 리포솜 제제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 내수상의 pH가 2 내지 5인 리포솜 제제.
내수상의 pH가 5 이하가 되도록 인지질을 포함하는 지질 이중막의 단일 라멜라층 구조의 소포를 제조한 후, 친수성 고분자 지질 유도체를 첨가하여 상기 소포의 외표면만을 수식하고, 소포의 제조시에 내수상에 미리 첨가하거나, 소포 조제 후에 소포 외로부터 상기 지질 이중막을 통과시켜 약물을 봉입하여 약물을 담지시 키는, 제1항에 기재된 리포솜 제제의 제조 방법.