WO2014050509A1 - リポソームおよびリポソーム製剤 - Google Patents

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WO2014050509A1
WO2014050509A1 PCT/JP2013/074095 JP2013074095W WO2014050509A1 WO 2014050509 A1 WO2014050509 A1 WO 2014050509A1 JP 2013074095 W JP2013074095 W JP 2013074095W WO 2014050509 A1 WO2014050509 A1 WO 2014050509A1
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liposome
peg
sle
drug
lipid
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PCT/JP2013/074095
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French (fr)
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正史 磯崎
祐貴 伊藤
恵子 山下
滋典 野沢
径子 中橋
明文 加藤
長谷川　和正
佐藤　光男
Original Assignee
テルモ株式会社
協和発酵キリン株式会社
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    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a liposome and a liposome preparation that are excellent in blood retention and excellent in target directivity.
  • DDS drug delivery systems
  • a typical example is the use of liposomes as drug carriers (carriers).
  • liposomes as drug carriers (carriers).
  • avoidance from the foreign body recognition mechanism on the living body side and control of pharmacokinetics are important.
  • avoidance of capture by reticuloendothelial tissue (RES) such as liver and spleen
  • RES reticuloendothelial tissue
  • opsonin protein and plasma protein in blood It is necessary to increase the retention
  • membrane modification with a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol (PEG) is known (Patent Document 1).
  • Liposomes modified with hydrophilic polymers can be passively accumulated in tissues with increased vascular permeability, such as tumor tissue and inflammatory sites, due to their high blood retention. Further improvement is desired in practical use.
  • the sugar chain molecule recognition reaction on the target cell membrane surface is known, and in particular, E-selectin, P-selectin and leukocytes expressed in vascular endothelial details during inflammation It is known that the sugar chain sialyl Lewis X (sLe X ) expressed on the cell membrane strongly binds. As for this sLe X , there is a report that cell adhesion inhibitory activity is increased by forming a liposome (see Non-Patent Document 1).
  • a sugar chain is bound to the liposome membrane via a linker protein (human serum albumin).
  • linker protein human serum albumin
  • one end of the linker protein is bound to the liposome membrane, and then the sugar chain is attached to the other end of the linker protein.
  • the binding of the linker protein to the liposome membrane is also a chemical bond.
  • hydrophilization of the liposome surface is described, but the hydrophilic compound is less susceptible to steric hindrance to the sugar chain than the method using a high molecular weight substance such as PEG, and the sugar chain molecule recognition reaction by the lectin on the surface of the target cell membrane. Teaches that low molecular weight compounds are preferred, especially tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • the non-patent document 1 relates to sLe X liposome as a multivalent ligand and E-selectin-mediated cell adhesion inhibition, and does not mention any encapsulation of the drug in the liposome, nor describes pharmacokinetics and drug efficacy. .
  • the inventor of the present application examined the pharmacokinetics of the sLe X liposome shown here, and obtained the knowledge that sufficient retention in blood could not be obtained even though it was a PEG-modified liposome.
  • An object of the present invention is to provide a liposome and a liposome preparation that are useful as a carrier for DDS and have excellent retention in blood and excellent targeting properties.
  • the inventors have revealed that an intensive study on the above problems, coordination oligosaccharides identified in sLe X, a sLe X-PEG on the liposome surface via a PEG of average molecular weight (Mw) of the specific chain length of from 4000 to 7000
  • Mw average molecular weight
  • the liposome is extremely limited with a modification ratio of sLe X -PEG of 0.8 to 2.5 mol%, it can exhibit long blood retention and high target directivity.
  • a liposome preparation in which an anticancer agent was encapsulated in such a liposome was excellent in pharmacokinetics and drug efficacy. Accordingly, the present invention as described below is provided.
  • the sLe X -PEG-modified liposome according to the present invention is an aqueous suspension of closed vesicles formed of a lipid bilayer membrane containing at least a phospholipid as a membrane material, which is substantially the surface of the closed vesicles.
  • Mw average molecular weight
  • the modification rate of the membrane material with the sLe X -PEG with respect to the total lipid amount is 0.8 to 2.5 mol%.
  • the particularly preferred average molecular weight of the PEG is 5000.
  • the sLe X -PEG modification rate is preferably 0.9 to 2 mol%.
  • the membrane material usually contains cholesterol.
  • the modification is usually introduced by using a sLe X -PEG-lipid derivative as a surface modifier and disposing the lipid portion of the surface modifier in the lipid bilayer membrane.
  • the lipid part of the surface modifier is preferably distearoyl phosphatidylethanolamine.
  • a liposome preparation containing a drug encapsulated in the closed vesicle of the liposome as described above is provided.
  • a liposome preparation in which the drug is an anticancer agent and / or an anti-inflammatory agent is a preferred embodiment.
  • an anticancer agent and / or an anti-inflammatory agent is a preferred embodiment.
  • a high antitumor effect has been confirmed and can be provided as a highly effective anticancer agent preparation.
  • the liposome according to the present invention is excellent in both retention in blood and target directivity, and is useful as a DDS.
  • the cell adhesion inhibitory activity of sLe X can be exerted despite containing a hydrophilic polymer, inflammation and angiogenesis are caused and vascular endothelial cells express E-selectin, P-selectin and the like. Specific accumulation at the lesion site is expected.
  • the blood vessel of the site expressing E-selectin, P-selectin, etc. has an enlarged cell gap of endothelial cells, and the accumulated liposome diffuses from the gap to the lesion site and its surroundings, and the lesion site and its surroundings.
  • a target-directed drug such as an anticancer agent or an anti-inflammatory agent
  • a liposome preparation containing such a drug
  • the pharmacokinetics (retention property in blood) test of various liposome preparations shows the drug concentration in plasma after administration of the liposome preparation.
  • the AUC calculated from the drug concentration in plasma after administration of the liposome preparation in the pharmacokinetic (retention in blood) test of various liposome preparations is shown.
  • the result of the binding test (binding inhibition of sLe X modified protein to CHO / E-selectin) of various liposome preparations is shown.
  • the result of the binding test (binding inhibition of sLe X modified protein to CHO / E-selectin) of various liposome preparations is shown.
  • the result of the binding test with respect to E-selectin of various liposome formulation is shown.
  • the tumor volume in the pharmacological effect (antitumor) test of various liposome preparations is shown.
  • the body weight fluctuation rate in the drug efficacy (antitumor) test of various liposome preparations is shown.
  • Liposomes are lipid bilayer closed vesicles formed by aqueous suspensions of lipids containing phospholipids. Liposome preparations carry drugs in the liposome's vesicle space (inner aqueous phase). It is.
  • the liposome according to the present invention may be a unilamellar vesicle (SUV, LUV) consisting of a single membrane of a lipid bilayer or a multilamellar vesicle (MLV) consisting of a plurality, but is usually a monolayer.
  • the proportion of unilamellar vesicles in the total vesicles constituting the liposome preparation may be 50% or more of the whole, and preferably 80% or more.
  • Liposomes are essentially made of a membrane material whose phase transition point is higher than the in-vivo temperature (35 to 37 ° C.) in order to prevent the encapsulated drug from easily leaking out during storage or in a living body such as blood.
  • the phospholipid used as the main membrane material of the lipid bilayer membrane preferably has a phase transition point of 50 ° C. or higher.
  • hydrogenated phospholipid such as hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), sphingo Myelin and the like are preferred.
  • the lipid bilayer membrane contains at least the above phospholipid and is usually contained in an amount of 50 mol% or more in the total amount (mole) of membrane material.
  • the membrane material may contain other membrane components together with the phospholipid as long as it can stably form liposomes.
  • Other membrane components include, for example, other lipids that do not contain phosphoric acid, and include, but are not limited to, sterols such as glyceroglycolipids, glycosphingolipids and cholesterol, and derivatives such as hydrogenated products thereof. be able to.
  • a lipid bilayer from a mixed lipid containing phospholipid and other lipids, particularly cholesterol.
  • a particularly preferred membrane material is a mixed lipid of HSPC and cholesterol.
  • HSPC / cholesterol (molar ratio) is usually 80/20 to 50/50.
  • the size of the liposome is not particularly limited, but in the case of a spherical shape or a shape close thereto, the particle diameter (diameter of particle outer diameter) is 50 nm to 200 nm, preferably 90 nm to 150 nm.
  • the diameter of the particle outer diameter is an average value of the diameters of all the liposome preparation particles measured by the dynamic light scattering method, and is measured using Zetasizer (Malvern Instruments. 3000HS or Zetasizer Nano ZS90). can do.
  • the liposome preparation carrying the drug in the liposome is required to not be filtered in the indicator sterilization Brevundimonas ⁇ diminuta (size, about 0.3 ⁇ 0.8 ⁇ m) in the filter sterilization in which the filter sterilization method is applied as the final sterilization, It is necessary that the particles be sufficiently small compared to Brevundimonas diminuta. It is important that the particle size is about 100 nm in order to make the filtration sterilization process more reliable.
  • the lipid bilayer membrane of the liposome as described above is substantially modified only with sialyl Lewis X (sLe X ) via a PEG chain.
  • sialyl Lewis X sialyl Lewis X (sLe X ) via a PEG chain.
  • sLe X sialyl Lewis X
  • sLe X sialyl Lewis X
  • PEG polyethylene glycol
  • it means that it is sufficiently less than the modification with sLe X , and typically means that sLe X occupies 80% or more of the total polymer that modifies the liposome.
  • PEG is limited to a chain length of average molecular weight (Mw) 4000-7000, typically Mw5000.
  • Mw average molecular weight
  • sLe X is an oligosaccharide (tetrasaccharide) having the following structure. sLe X
  • sLe X -PEG sLe X-PEG
  • sLe X-PEG sLe X-PEG
  • sLe X-PEG sLe X-PEG
  • An amino group or the like can be introduced at one end of PEG as a linking group with sLe X.
  • sLe X-PEG- lipid derivatives usually, sLe X -PEG- lipid derivatives.
  • a hydrophobic lipid moiety enters the lipid bilayer of the liposome and is stably held (anchor), so that the PEG-bonded to the lipid is formed on the surface of the lipid bilayer of the liposome. Distribution and coordination can be performed in a state in which the sLe X chain protrudes outward.
  • lipids hydrophobic moieties
  • examples of such lipids include, but are not limited to, phospholipids, long-chain aliphatic alcohols, sterols, polyoxypropylene alkyls, or glycerin fatty acid esters.
  • phosphatidylethanolamine which is a phospholipid, and its acyl chain is preferably a saturated fatty acid.
  • the chain length of the acyl chain is usually preferably C 14 -C 20 , more preferably C 16 -C 18 , and specifically, dipalmitoyl, distearoyl or palmitoyl stearoyl.
  • distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE) is commercially available, and PEG-DSPE in which PEG is bound thereto is particularly easily available as a general-purpose compound.
  • a compound in which the amino group is introduced at the PEG free end of PEG-DSPE is also commercially available so that the chain length of PEG can be selected, and sLe X -PEG-lipid derivatives can be easily prepared.
  • the sLe X -PEG modification rate on the liposome surface is 0.8 to 2.5 mol%, preferably 0.9 to 2 mol%.
  • the surface modification in the present invention only the outer liquid side surface of the closed vesicle is modified, the sLe X -PEG chain is distributed only on the outer liquid side surface, and the sLe X -PEG chain is substantially contained in the inner aqueous phase.
  • a structure that does not exist is particularly preferred. With such a distribution structure, for example, even when the inner aqueous phase is in an acidic condition, the stability of the membrane is improved as compared with the case where sLe X -PEG chains are distributed on both the inner and outer liquid sides of the double membrane. The desired effect can be obtained with a low modification rate.
  • liposomes having a structure in which only the outer liquid side surface of such closed vesicles is selectively modified is known, and can be obtained by forming an unmodified liposome and applying a modification step as described later. be able to.
  • the liposome according to the present invention can contain, in addition to the lipid and the modifying agent, other membrane components that can retain the structure and can be included in the liposome as long as the object of the present invention is not impaired.
  • the other membrane component may include a three-dimensional surface modification with a modifier other than the above sLe X -PEG in order to change the physical properties of the lipid and impart desired properties to the membrane component of the carrier.
  • a lipid is bound to a compound other than the sLe X -PEG, such as a hydrophilic compound.
  • Examples of compounds other than sLe X -PEG include water-soluble polysaccharides such as PEG, glucuronic acid, sialic acid, dextran, pullulan, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, and carrageenan; compounds having an acidic functional group A basic compound having a basic functional group such as an amino group, an amidino group, or a guanidino group; Examples of basic compounds include DOTMA disclosed in JP-A No.
  • DOTAP disclosed in JP-A-5-508626
  • Transfectam disclosed in JP-A-2-292246,
  • TMAG disclosed in Kaihei 4-108391
  • 3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride disclosed in WO 97/42166
  • DOSPA DOSPA
  • TfxTM-50 DDAB
  • DC-CHOL DC-CHOL
  • DMRIE DMRIE
  • the other surface modifier is a substance in which a compound having a basic functional group is bound to a lipid
  • it is called a cationized lipid and is said to be able to enhance the adhesion between the liposome membrane and the cell.
  • the lipid part of the cationized lipid is stabilized in the lipid bilayer of the liposome, and the basic functional group part is present on the membrane surface (on the outer membrane surface and / or on the inner membrane surface) of the lipid bilayer of the carrier be able to.
  • the pH of the internal aqueous phase of the liposome is not limited as long as it can stably carry a drug.
  • the liposome in which only the outer liquid side surface of the preferred embodiment of the present invention is modified is excellent in the membrane stability and shape stability of the liposome even when the inner aqueous phase pH is, for example, 5 or less.
  • the liposome according to the present invention as described above is excellent in blood retention and exhibits high target directivity.
  • “Retention in blood” means the property that a drug in a state of being supported on a liposome carrier is present in blood in a host administered with a liposome preparation.
  • the above liposomes can carry various drugs.
  • therapeutic drugs specifically, nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof, anticancer agents, antibiotics, enzyme agents, antioxidants, lipid uptake inhibitors, hormone agents, anti-inflammatory agents, steroid agents , Vasodilator, angiotensin converting enzyme inhibitor, angiotensin receptor antagonist, smooth muscle cell proliferation / migration inhibitor, platelet aggregation inhibitor, anticoagulant, chemical mediator release inhibitor, vascular endothelial cell proliferation promotion Or inhibitors, aldose reductase inhibitors, mesangial cell growth inhibitors, lipoxygenase inhibitors, immunosuppressants, immunostimulants, antiviral agents, Maillard reaction inhibitors, amyloidosis inhibitors, nitric oxide synthesis inhibitors, AGEs ( Advanced glycation endproducts) inhibitors, radical scavengers, proteins, peptides, glycos Minogurikan and its derivatives, oligo
  • diagnostic drug examples include in-vivo diagnostic agents such as an X-ray contrast agent, an ultrasonic diagnostic agent, a fluorescent contrast agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis.
  • in-vivo diagnostic agents such as an X-ray contrast agent, an ultrasonic diagnostic agent, a fluorescent contrast agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis.
  • the preferred drug loading is at least 0.05 mol drug / mol lipid, more preferably at least 0.1 mol drug / mol lipid, as a concentration relative to the total lipid of the liposome membrane.
  • “supporting” essentially means a state in which the drug is enclosed in the closed space of the liposome (carrier), but a part of the drug is contained in the membrane or outside the liposome. You may include in the state adhering to the surface.
  • the liposome preparation of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable stabilizer and / or antioxidant depending on the administration route.
  • Stabilizers include, but are not limited to, substances that reduce membrane fluidity, and include saccharides such as glycerol and sucrose.
  • sterols such as cholesterol described above as other lipids of the membrane component act as this stabilizer.
  • Antioxidants include, but are not limited to, ascorbic acid, uric acid or tocopherol analogues such as vitamin E. There are four isomers of ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ in tocopherol, and any of them can be used in the present invention.
  • the liposome preparation of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable additive depending on the administration route.
  • a pharmaceutically acceptable additive include water, saline, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), Mannitol, sorbitol, lactose, PBS, biodegradable polymer, serum-free medium, surfactant acceptable as a pharmaceutical additive, Such as buffers at physiological pH acceptable in the predicate the in vivo and the like.
  • the additive is appropriately selected from
  • a liposome preparation containing these additives can be provided as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be stored in a conventional manner, for example, refrigeration at 0 to 8 ° C. or room temperature at 1 to 30 ° C.
  • a film constituent component such as phospholipid is mixed with an organic solvent such as chloroform, and the organic solvent is distilled off, followed by vacuum drying to form a thin film on the inner wall of the flask.
  • the inner aqueous phase solution is added to the flask and stirred vigorously. Then, the suspension is centrifuged, and the supernatant is decanted and purified to obtain a liposome suspension.
  • liposomes sLe X-PEG chains by adding to the liposome suspension is distributed only on the outer surface can do.
  • liposomes containing membrane-constituting lipids such as phospholipids having reactive functional groups are produced by a conventional method, and then one-end activated PEG-sLe X is added to the liposome outer solution to Only the outer surface of the liposome can be modified by binding to a membrane-constituting lipid such as a phospholipid having a group.
  • a liposome containing a membrane-constituting lipid such as PEG-phospholipid having a reactive functional group is produced by a conventional method
  • an sLe X derivative having an active functional group is added to the liposome external solution to add the functional group. Only the outer surface of the liposome can be modified by binding with a membrane-constituting lipid such as PEG-phospholipid.
  • the liposome can also be obtained by mixing the above-described constituent components and discharging them at high pressure with a high-pressure discharge type emulsifier.
  • This method is specifically described in “Liposomes in Life Science” (Terada, Yoshimura et al .; Springer Fairlark Tokyo (1992)), and is described in this specification with reference to this description. To do.
  • the liposome suspension can be made into a unilamella by forcibly passing the filter a plurality of times using an extruder.
  • filters having a pore diameter larger than the desired diameter and finally having a desired diameter but having different pore diameters are used.
  • the unilamellarization rate increases as the number of extrusions is increased using filters with different calibers, and can be regarded as LUV liposome substantially.
  • membrane components such as phospholipids are mixed with an organic solvent such as chloroform in the flask, and the organic solvent is distilled off, followed by vacuum drying. To form a thin film.
  • an acidic buffer for example, pH 4 buffer
  • the liposome particle size is sized, and the liposome external solution is replaced with an external solution with a pH near neutral by a method such as gel filtration, or the pH of the liposome external solution is adjusted to near neutral with an appropriate pH adjuster.
  • a pH gradient is formed by a method such as adjusting to pH 7 to 7.5, for example, and an aqueous solution containing the drug is added to the liposome suspension, and the solution is heated for a certain time to carry the drug. it can.
  • the modification of sLe X -PEG can be performed either before or after the drug loading operation as long as the vesicle of the lipid bilayer membrane is formed as described above.
  • a liposome suspension is obtained using an ammonium sulfate solution after forming the thin film.
  • an ammonium ion gradient is formed on the inside / outside of the liposome, and an aqueous solution containing the drug is added thereto.
  • the drug can be supported by heating for a period of time.
  • the pH of the inner aqueous phase of the liposome can be reduced to 5 or less by adding an appropriate pH adjusting agent to the ammonium sulfate suspension.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection
  • an appropriate administration method depending on the age and symptoms of the patient Can be selected.
  • the pharmaceutical composition can be administered by syringe or infusion.
  • the catheter is inserted into the body of the patient or host, for example, into a lumen, for example, into a blood vessel, the tip thereof is guided to the vicinity of the target site, and blood flow to the desired target site, the vicinity thereof, or the target site through the catheter. It is also possible to administer from the site where is expected.
  • the liposome formulation of the present invention is administered to a patient already suffering from a disease in an amount sufficient to cure or at least partially block the symptoms of the disease.
  • the effective dose of a drug encapsulated in a liposome preparation is usually selected in the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight per day.
  • the liposome preparation of the present invention is not limited to these doses.
  • the administration time may be administered after the disease has occurred, or may be administered prophylactically to relieve symptoms at the time of onset when the onset of the disease is predicted. The administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • a liposome preparation encapsulating a drug may be simply referred to as a liposome.
  • Doxorubicin hydrochloride (molecular weight 579.98): RPG Lifescience LTD ICG: Indocyanine green (molecular weight 774.96, manufactured by Sigma Ardrich) HSPC (molecular weight 790, manufactured by Lipoid, SPC3) Hydrogenated soybean phosphatidylcholine Chol (molecular weight 386.65, manufactured by Solvay): cholesterol PEG 5000 : molecular weight 5000 polyethylene glycol or polyethylene glycol chain PEG 2000 : molecular weight 2000 polyethylene glycol or polyethylene Glycol chain DSPE: Distearoylphosphatidylethanolamine PEG 5000 -DSPE (molecular weight 6123, manufactured by NOF Corporation): Polyethylene glycol (PEG 5000 : molecular weight 5000 polyethylene glycol or polyethylene glycol chain
  • PEG 5000 -DSPE Polyethylene glycol (PEG
  • DSPE-050PA (trade name) (molecular weight 5657, NOF) having a polyethylene glycol chain with a molecular weight of 5000 was placed in an eggplant flask, dissolved in 10 mL of chloroform, the solution was distilled off under reduced pressure, and a vacuum pump And dried under reduced pressure (2 hours) to form a thin film. 22.5 mL of 200 mM sodium borate buffer (pH 9.0) was added thereto, and the mixture was stirred at about 60 ° C. and hydrated. Thereafter, the temperature was adjusted to about 50 ° C., 251.9 mg of sialyl lewis X-lactose (Tokyo Kasei) was added, and the mixture was stirred for 3 hours.
  • the heating was set to 40 ° C., and a 2.5 mL solution of 137.5 ⁇ L of dehydrated methanol (Kanto Chemical) in pyridine borane (Wako Pure Chemical Industries) was added dropwise. 16 hours later, 24 hours later, 40 hours later) Further dropwise, and stirred for 7 days.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, 5 mL of water was added, and the mixture was desalted by passing through 200 mL of a gel filtration chromatography column (Sephadex G-25, GE Healthcare Bioscience) equilibrated with water, and the preparative solution was freeze-dried.
  • Synthesis Example 2 Synthesis of sLe X- linked PEG 2000 -DSPE sLe was prepared in the same procedure as in Synthesis Example 1 except that DSPE-020PA (trade name) having a polyethylene glycol chain with a molecular weight of 2000 was used instead of DSPE-050PA. X 1 -PEG 2000 -DSPE was obtained.
  • Example 1 Preparation of sLe X -PEG Modified Liposomes (Doxorubicin Formulation) (1) Formation of Liposome Suspension 0.707 g of hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) and 0.2947 g of cholesterol (Chol) were weighed, and 70 ° C. 1 mL of absolute ethanol warmed in 1 was added and dissolved by heating. To 1 mL of the obtained lipid ethanol solution, 9 mL of 250 mM ammonium sulfate aqueous solution heated to about 70 ° C. was added and stirred to prepare a crude liposome suspension.
  • HSPC hydrogenated soybean phosphatidylcholine
  • Chol cholesterol
  • a filter (pore size 0.2 ⁇ m ⁇ 3 times, 0.2 ⁇ m ⁇ 10 times, polycarbonate membrane, Whatman) attached to an extruder T10 (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 70 ° C. with this crude liposome suspension. Were sequentially passed through to obtain a liposome suspension.
  • “Drug concentration” is the concentration (measured value) of the drug carried on the liposome in the liposome suspension, and is indicated by the drug / liposome suspension.
  • Total lipid concentration is the total lipid concentration (measured value) in the liposome suspension. However, “total lipid” does not include PEG derivatives.
  • “Modification rate” is the ratio of the molar concentration (measured value) of the modifying agent to the molar concentration (measured value) of the total lipid. For example, when the modifying agent is sLe X -PEG 5000 -DSPE, Desired.
  • Drug / lipid ratio indicates the ratio of the drug concentration to the total lipid concentration as a molar ratio.
  • Particle size is an average particle size of drug-encapsulated liposomes measured with a particle size distribution system (Zetasizer 3000HS, Malvern Instruments).
  • Example 2 Preparation of sLe X -PEG Modified Liposomes (Doxorubicin Formulation) (1) Formation of Liposome Suspension 7.0870 g of HSPC and 2.9612 g of cholesterol were weighed and 10 mL of absolute ethanol heated at 70 ° C. was added. And dissolved by heating. 90 mL of 250 mM ammonium sulfate aqueous solution heated to about 70 ° C. was added to 10 mL of the obtained lipid ethanol solution, and stirred to prepare a crude liposome suspension.
  • a filter (pore size 0.2 ⁇ m ⁇ 3 times, 0.1 ⁇ m ⁇ 10 times, polycarbonate membrane, Whatman) attached to an extruder T100 (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 70 ° C. with this crude liposome suspension. Were sequentially passed through to obtain a liposome suspension.
  • Comparative Example 5 Preparation of sLe X -PEG Modified Liposomes (Doxorubicin Formulation) (1) External Solution Replacement Liposome suspension obtained in the same manner as in Comparative Example 4 (1) Formation of Liposome Suspension Example 1 As in (2) above, the external suspension of the liposome suspension was replaced with a gel column, the HSPC concentration was measured, and the total lipid concentration was calculated.
  • FIG. 2 shows the AUC (area under blood concentration) calculated from the plasma concentration.
  • the AUC of the PEG-sLe X- modified liposome decreased, but the sLe X- modified liposome via PEG 2000 (Comparative Example 1, While the reduction rate of 5) is about 40% or more, the reduction rate of liposomes (Examples 1 and 2) modified with sLe X via PEG 5000 is as small as about 10%, and the retention in blood is high. It was not inferior to PEG-modified liposomes.
  • the expression plasmid was introduced into CHO (DXB11) (obtained from the University of Tokyo Medical Research Institute) according to a conventional method (Cytotechnology 13, 79-88 (1993)), and then E-selectin-expressing cell line (CHO / E-) was obtained by gene amplification using methotrexate. got selectin).
  • Human ⁇ 2,3-sialyltransferase IV DNA was incorporated into pAGE249 (JBC 269, 14730 (1994)), and human ⁇ 1,3-fucosetransferase VII DNA was incorporated into a pKANTEX93-derived vector to prepare an expression plasmid.
  • the binding activity (%) of the sLe X- modified protein at each addition amount (lipid concentration) was determined from the fluorescence intensity measured by adding various liposome preparations simultaneously with a certain concentration of sLe X- modified protein. The results are shown in FIGS. A smaller binding activity (%) indicates that the binding of the sLe X modified protein to CHO / E-selectin is inhibited.
  • the liposomes of Comparative Example 2 and Comparative Example 4 did not affect the binding of sLe X- modified protein and CHO / E-selectin, but the liposomes of Example 1, Example 2, Comparative Example 1, and Comparative Example 5 were Binding of sLe X- modified protein to CHO / E-selectin was inhibited in a concentration-dependent manner.
  • the liposome of Example 1 showed stronger binding inhibitory activity than the liposome of Comparative Example 1.
  • Table 8 summarizes the results of the evaluation of the binding performance (binding evaluation-2) and the blood retention in the above Examples and Comparative Examples.
  • binding evaluation-2 binding evaluation-2
  • Table 8 summarizes the results of the evaluation of the binding performance (binding evaluation-2) and the blood retention in the above Examples and Comparative Examples.
  • the sLe X -PEG liposome of the present invention retains the long blood retention of the conventional PEG liposome (Comparative Example 2) almost equivalently, while having a strong binding performance that is not comparable to the PEG liposome. Have.
  • the retention in blood and the binding property are particularly superior to those of the sLe X -PEG liposome having a short PEG chain length.
  • the tumor volume of the Day 16 Comparative Example 1 liposome administration group was significantly smaller than the Doxil formulation. Moreover, the Example 1 liposome showed a significant tumor growth inhibitory effect compared to Doxil and Comparative Example 1 liposome after Day 12. The body weight tended to decrease after the second administration in any of the liposome administrations, but the body weight transition of Example 1 liposome administration was equivalent to that of doxil.
  • Example 3 Preparation of ICG-labeled sLe X -PEG Modified Liposome Formulation (1) Formation of Liposome Suspension 1.6 mg of ICG was dissolved in 16 mL of 10 mM phosphate buffer to prepare an inner aqueous phase. 1.0046 g of mixed lipid in which HSPC and cholesterol were mixed at 54:46 (molar ratio) was weighed, and 1 mL of absolute ethanol heated at 70 ° C. was added and dissolved by heating. To 1 mL of the obtained lipid ethanol solution, 9 mL of an inner aqueous phase heated to about 70 ° C. was added and stirred to prepare a crude liposome suspension.
  • This crude liposome suspension was attached to a filter (pore size 0.2 ⁇ m ⁇ 3 times, 0.1 ⁇ m ⁇ 10 times, polycarbonate membrane, Whatman) attached to an extruder T10 (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 70 ° C. Were sequentially passed through to obtain a liposome suspension.

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Abstract

　本発明は、脂質二重膜で形成される閉鎖小胞の表面を、平均分子量（Ｍｗ）４０００～７０００のＰＥＧ鎖を介してオリゴ糖ｓＬｅＸで０.８～２.５ｍｏｌ％修飾する、血中滞留性に優れかつ標的指向性にも優れたリポソームおよびリポソーム製剤を提供する。

Description

リポソームおよびリポソーム製剤
　本発明は、血中滞留性に優れかつ標的指向性にも優れたリポソームおよびリポソーム製剤に関する。
　近年、薬物を安全にかつ効率よく標的部位に送達・分布させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が盛んに研究されている。その代表的な方法として、リポソームの薬物運搬体（担体）としての利用が挙げられる。リポソームを用いるＤＤＳの実用化に際して、生体側の異物認識機構からの回避および体内動態の制御は重要である。特に、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織(ＲＥＳ)での捕捉を回避し、血液中のオプソニン蛋白質や血しょう蛋白質などとの相互作用（吸着）による凝集を防止して血中安定性（滞留性）を高める必要がある。この課題を解決する方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性高分子による膜修飾が知られている（特許文献１）。
　親水性高分子で修飾されたリポソームは、高い血中滞留性が得られることにより、腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進した組織への受動的な集積が可能となるが、標的指向性については実用上さらなる改善が望まれている。
　標的指向性、特に標的部位への選択的結合に関連して、標的細胞膜面上の糖鎖分子認識反応が知られ、特に、炎症時に血管内皮細部に発現するＥ-セレクチン、Ｐ-セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）とが強く結合することが知られている。このｓＬｅＸについて、リポソーム化により細胞接着阻害活性が高まるとの報告がある（非特許文献１参照）。ここでは、ｓＬｅＸを、ＰＥＧ（繰り返し単位数ｎ＝４２～４８）－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）と結合させたｓＬｅＸ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ誘導体を合成し、ＰＥＧリポソームの膜材であるＰＥＧ－ＤＳＰＥ、リン脂質およびコレステロールの混合脂質中に０～５ｍｏｌ％の各種割合で含ませたリポソームについて、in vitroでＥ-セレクチン介在細胞接着阻害を評価している。ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソームによる阻害はｓＬｅＸオリゴ糖単体に比べ５０００倍以上であることが示される。
　標的指向性リポソームを提案する特許文献もある（特許文献２参照）。ここでは、糖鎖をリンカー蛋白質（ヒト血清アルブミン）を介してリポソーム膜に結合しており、具体的には、リポソーム膜にリンカー蛋白質の一端を結合させ、次いで、リンカー蛋白質の他端に糖鎖を化学的に結合させている。リンカー蛋白質のリポソーム膜への結合も化学結合である。また、リポソーム表面の親水性化が記載されるが、親水性化合物は、ＰＥＧなどの高分子量物質を用いる方法に比べ、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応が妨げられないとして低分子化合物、とりわけトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが好ましいことを教示する。
特開平０２－１４９５１２号公報 国際公開２００５－０１１６３３号
J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6101-6104
　上記非特許文献１は、多価リガンドとしてのｓＬｅＸリポソームとＥ-セレクチン介在細胞接着阻害に関するものであり、該リポソーム内に薬物を封入することは何ら言及せず、薬物動態および薬効も記載しない。本願発明者は、ここに示されるｓＬｅＸリポソームの体内動態について検討したところ、ＰＥＧ修飾リポソームであるにも拘わらず十分な血中滞留性が得られないという知見を得た。細胞接着性は、血中滞留性と相反する一面でもあることから、親水性高分子修飾による血中滞留性向上効果が知られ、糖鎖修飾による標的指向性が示唆されているとしても、血中滞留性と標的指向性の両方に優れるリポソームの設計が容易な訳ではない。
　本発明は、ＤＤＳの担体として有用な血中滞留性に優れかつ標的指向性にも優れるリポソームおよびリポソーム製剤を提供することを目的とする。
　本願発明者は、上記課題について鋭意検討したところ、ｓＬｅＸに特定されるオリゴ糖を、平均分子量（Ｍｗ）４０００～７０００の特定鎖長のＰＥＧを介してｓＬｅＸ－ＰＥＧをリポソーム表面に配位させ、かつ該ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる修飾率が０.８～２.５ｍｏｌ％の極めて限定されたリポソームとすれば、長い血中滞留性と高い標的指向性を発揮しうることを見出した。特に、試験例として後述するように、このようなリポソームに薬物として抗癌剤を封入したリポソーム製剤が薬物動態および薬効に優れていることを確認できた。したがって、以下のような本発明を提供する。
　本発明に係るｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソームは、少なくともリン脂質を膜材として含む脂質二重膜で形成される閉鎖小胞の水性懸濁液であって、実質的に、該閉鎖小胞の表面が、平均分子量（Ｍｗ）４０００～７０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を介してオリゴ糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）が配位するようにＰＥＧとｓＬｅＸとの結合鎖（ｓＬｅＸ－ＰＥＧ）のみで修飾され、かつ該ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる前記膜材の総脂質量に対する修飾率が０.８～２.５ｍｏｌ％である。
　前記閉鎖小胞の外液側表面のみが前記ｓＬｅＸ－ＰＥＧで修飾されている態様が好ましい。
　前記ＰＥＧの特に好ましい平均分子量は５０００である。
　前記ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率は、好ましくは０.９～２ｍｏｌ％である。
　前記膜材は、通常、コレステロールを含む。
　前記修飾は、通常、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ－脂質誘導体を表面修飾剤として、該表面修飾剤の脂質部分が前記脂質二重膜内に配置されることにより導入されている。
　前記表面修飾剤の脂質部分は、好ましくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミンである。
　本発明では、上記のようなリポソームの前記閉鎖小胞内に封入された薬物を含むリポソーム製剤を提供する。
　特に薬物が抗癌剤および／または抗炎症剤であるリポソーム製剤は好ましい態様である。特に、実施例で後述するように既存のリポソーム製剤（抗癌剤）ドキシルに比べ、高い抗腫瘍効果が確かめられており、有効性の高い抗癌剤製剤として提供することができる。
　本発明に係るリポソームは、血中滞留性と標的指向性のいずれにも優れ、ＤＤＳとして有用である。本発明では、親水性高分子を含むにも拘わらずｓＬｅＸの細胞接着阻害活性を発揮できることから、炎症、血管新生を生じて血管内皮細胞がＥ-セレクチン、Ｐ-セレクチン等を発現している病巣部位への特異的集積が期待される。Ｅ-セレクチン、Ｐ-セレクチン等を発現している部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームはその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散し、病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれて薬物を放出すると考えられる。このため、とりわけ抗癌剤、抗炎症剤などの標的指向性の切望される薬物の担体として特に有用であり、このような薬物を含むリポソーム製剤の好ましい態様として提供し得る。
各種リポソーム製剤の薬物動態（血中滞留性）試験における、リポソーム製剤投与後の血漿中の薬物濃度を示す。 各種リポソーム製剤の薬物動態（血中滞留性）試験における、リポソーム製剤投与後の血漿中の薬物濃度より算出したＡＵＣを示す。 各種リポソーム製剤の結合性試験（ＣＨＯ／Ｅ-selectinに対するｓＬｅＸ修飾タンパクの結合阻害）の結果を示す。 各種リポソーム製剤の結合性試験（ＣＨＯ／Ｅ-selectinに対するｓＬｅＸ修飾タンパクの結合阻害）の結果を示す。 各種リポソーム製剤のＥ-selectinに対する結合性試験の結果を示す。 各種リポソーム製剤の薬効（抗腫瘍）試験における腫瘍体積を示す。 各種リポソーム製剤の薬効（抗腫瘍）試験における体重変動率を示す。
　以下、本発明をより具体的に説明する。
　リポソームは、リン脂質を含む脂質の水性懸濁により形成される脂質二重膜の閉鎖小胞であり、リポソーム製剤は、このリポソームの小胞空間内（内水相）に薬物を担持させたものである。
　本発明に係るリポソームは、脂質二重膜の一枚膜からなるユニラメラ小胞（ＳＵＶ、ＬＵＶ）でも、複数枚からなる多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）でもよいが、通常は一枚膜である。なお本発明では、リポソーム製剤を構成する全小胞中、ユニラメラ小胞が占める割合は、存在比で全体の５０％以上であればよく、８０％以上であることが好ましい。
　脂質二重膜を構成するリン脂質としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、さらにスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質や、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質もしくはこれらの誘導体、およびこれらを常法にしたがって水素添加したものなどを挙げることができる。
　リポソームは、封入された薬物が、保存時にあるいは血液などの生体中で容易に漏出しないようにするため、本質的に相転移点が生体内温度（３５～３７℃）より高い膜材が用いられ、さらに、リポソーム製造時には、生体温度より高い温度５０℃～７０℃程度、典型的に６０℃前後の温度に曝される場合もあり、熱によるリポソーム形成に対する影響が大きくなるので、これらの温度より高い相転移点を持つ膜材が特に好ましい。したがって、脂質二重膜の主膜材となるリン脂質は、相転移点は５０℃以上のものが好ましく、上記のうちでも、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）などの水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましい。
　脂質二重膜は少なくとも上記リン脂質を含み、通常、膜材全量（モル）中に５０モル％以上含む。膜材は、リポソームを安定的に形成できるものであれば、リン脂質とともに他の膜成分を含んでいてもよい。他の膜成分としては、たとえば、リン酸を含まない他の脂質類が挙げられ、特に限定されないがグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質およびコレステロールなどのステロールおよびこれらの水素添加物などの誘導体などを挙げることができる。
　本発明では、リン脂質とともに他の脂質類特にコレステロールを含む混合脂質から脂質二重膜を形成することが好ましい。特に好ましい膜材は、ＨＳＰＣとコレステロールとの混合脂質であり、その場合、ＨＳＰＣ／コレステロール（モル比）が通常８０／２０～５０／５０である。
　リポソームの大きさは特に限定されないが、球状またはそれに近い形態をとる場合には、粒子径（粒子外径の直径）が、５０ｎｍ～２００ｎｍ、好ましくは９０ｎｍ～１５０ｎｍである。
　なお、本明細書において、粒子外径の直径は、動的光散乱法により測定されるリポソーム製剤全粒子の直径の平均値であり、Zetasizer（Malvern Instruments.3000ＨＳまたはZetasizer Nano ZS90）を用いて測定することができる。
　リポソームに薬物を担持したリポソーム製剤は、最終滅菌として濾過滅菌法が施される濾過滅菌において、指標菌Brevundimonas diminuta（サイズ、約０.３×０.８μｍ）は濾過されないことが要求されるため、Brevundimonas diminutaに較べ十分に小さい透過粒子であることが必要である。このような濾過滅菌工程をより確実にする上でも粒径が１００ｎｍ程度であることは重要である。
　上記のようなリポソームの脂質二重膜は、実質的に、ＰＥＧ鎖を介してシアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）のみで修飾されている。
　ここで、「実質的に、ＰＥＧ鎖を介してｓＬｅＸのみで修飾されている」とは、ＰＥＧ鎖を介したｓＬｅＸによる修飾以外に、ＰＥＧ等の高分子による修飾を有しないか、有していてもｓＬｅＸによる修飾に比べて十分に少ないことを意味し、典型的には、リポソームを修飾する全高分子中の８０％以上をｓＬｅＸが占めることを意味する。本発明においては、意図的にｓＬｅＸ以外の高分子修飾を行わないことが好ましい。
　本発明において、ＰＥＧは、平均分子量（Ｍｗ）４０００～７０００、典型的にＭｗ５０００の鎖長に限定されている。
　分子量４０００のＰＥＧの場合、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－単位の理論繰り返し数ｎは９１である。平均分子量Ｍｗ４０００のＰＥＧは、通常ｎ＝８０～１００である。なお、Ｍｗ２０００のＰＥＧは、通常ｎ＝４２～４８である。
　本明細書では、ＰＥＧについて、「分子量」の語は、通常、重量平均分子量の意味で用いられる。
　ｓＬｅＸは、下記構造のオリゴ糖（四糖類）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　　　　　　ｓＬｅＸ
　本発明では、ＰＥＧとｓＬｅＸとの結合鎖（ｓＬｅＸ－ＰＥＧ）で修飾することにより、ＰＥＧ鎖を介してｓＬｅＸをリポソームの表面に配位させている。ｓＬｅＸ－ＰＥＧの構築には、ｓＬｅＸをラクトースなどの誘導体として導入することができる。ＰＥＧの一端にはｓＬｅＸとの結合基としてアミノ基などを導入することができる。
　本発明では、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾剤として、通常、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ－脂質誘導体が好ましい。脂質誘導体を用いると、疎水性である脂質部分がリポソームの脂質二重膜中に入り込み安定して保持される（アンカー）ので、リポソームの脂質二重膜の表面上に、脂質に結合したＰＥＧ－ｓＬｅＸ鎖が外方に向かって突出した状態で分布・配位させることができる。
　このような脂質（疎水性部分）としては、特に限定されないが、リン脂質、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステルなどが挙げられる。通常、リン脂質のホファチジルエタノールアミンであり、そのアシル鎖が飽和脂肪酸であることが好ましい。このアシル鎖の鎖長は、通常Ｃ１４－Ｃ２０、さらにはＣ１６－Ｃ１８が好ましく、具体的には、ジパルミトイル、ジステアロイルあるいはパルミトイルステアロイルである。なかでもジステアロイルホファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）は市販されており、特にこれにＰＥＧを結合したＰＥＧ－ＤＳＰＥは汎用の化合物として入手容易である。ＰＥＧ－ＤＳＰＥのＰＥＧ自由端に上記アミノ基を導入した化合物もＰＥＧの鎖長を選択可能に市販されており、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ－脂質誘導体を容易に調製することができる。
　本発明において、リポソーム表面のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率は、０.８～２.５ｍｏｌ％、好ましくは０.９～２ｍｏｌ％である。
　なお、本明細書において、「修飾率」は、修飾剤の種類を問わず以下の式で規定される。
修飾率（ｍｏｌ％）＝（修飾剤濃度（ｍＭ）／膜材の総脂質濃度（ｍＭ））×１００
　なお、本明細書において、「総脂質量」には修飾剤中の脂質を含まない。
　本発明における表面修飾は、閉鎖小胞の外液側表面のみが修飾され、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ鎖が外液側表面にのみ分布し、内水相内には実質的にｓＬｅＸ－ＰＥＧ鎖が存在しない構造が特に好ましい。このような分布構造であれば、たとえば内水相が酸性条件であっても、二重膜の内外液側の両方にｓＬｅＸ－ＰＥＧ鎖が分布するものに比して、膜の安定性を確保でき、かつ少ない修飾率で所望の効果を得ることができる。
　このような閉鎖小胞の外液側表面のみが選択的に修飾された構造のリポソームの製造プロセスは公知であり、後述するように未修飾のリポソームを形成した後、修飾工程を付すことにより得ることができる。
　本発明に係るリポソームは、上記脂質および修飾剤とともに、上記構造を保持しうるものであってリポソームに含むことができる他の膜成分を、本発明の目的を損なわない範囲で含むことができる。
　他の膜成分は、脂質の物性を変化させ担体の膜成分に所望の特性を付与するための、上記ｓＬｅＸ－ＰＥＧ以外の修飾剤による立体構造的な表面修飾を含んでいてもよい。具体的には、脂質に、前記ｓＬｅＸ－ＰＥＧ以外の化合物たとえば親水性化合物が結合したものが挙げられる。
　ｓＬｅＸ－ＰＥＧ以外の化合物としては、たとえばＰＥＧ、グルクロン酸、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどの水溶性多糖類；酸性官能基を有する化合物；アミノ基、アミジノ基、グアジニノ基などの塩基性官能基を有する塩基性化合物などが挙げられる。塩基性化合物としては、特開昭６１－１６１２４６号に開示されたＤＯＴＭＡ、特表平５－５０８６２６号に開示されたＤＯＴＡＰ、特開平２－２９２２４６号に開示されたトランスフェクタム（Transfectam）、特開平４－１０８３９１号に開示されたＴＭＡＧ、国際公開第９７／４２１６６号に開示された3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩、ＤＯＳＰＡ、ＴｆｘＴＭ-５０、ＤＤＡＢ、ＤＣ-ＣＨＯＬ、ＤＭＲＩＥなどの化合物が挙げられる。
　他の表面修飾剤が、脂質に、塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合にはカチオン化脂質と称され、リポソーム膜と細胞との接着性等を高めることができるとされている。カチオン化脂質の脂質部分はリポソームの脂質二重膜中に安定化され、塩基性官能基部分は担体の脂質二重層の膜表面上（外膜表面上および／または内膜表面上）に存在することができる。
　本発明において、上記リポソームの内水相ｐＨは、薬物を安定に担持することができればよい。本発明の好ましい態様の外液側表面のみが修飾されたリポソームは、内水相ｐＨがたとえば５以下であっても、リポソームの膜安定性・形状安定性に優れている。
　上記のような本発明に係るリポソームは、血中滞留性に優れ、かつ高い標的指向性を発揮する。
　なお「血中滞留性」とは、リポソーム製剤を投与した宿主において、リポソーム担体に担持された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
　上記のようなリポソームには、種々の薬物を担持させることができる。たとえば治療のための薬物としては、具体的に、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、ＡＧＥｓ（Advanced glycation endproducts）阻害剤、ラジカルスカベンチャー、タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖および多糖およびそれらの誘導体等が挙げられる。
　また診断のための薬物としては、Ｘ線造影剤、超音波診断剤、蛍光造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬が挙げられる。
　薬物はその種類によっても所望担持量が異なるが、一般的には高担持率であることが望ましい。
　本発明のリポソーム製剤において、好ましい薬物担持量は、リポソーム膜の総脂質に対する濃度で、少なくとも０.０５ｍｏｌ薬物／ｍｏｌ脂質であり、より好ましくは少なくとも０．１ｍｏｌ薬物／ｍｏｌ脂質である。
　なお本発明において「担持」とは、本質的に、リポソーム（担体）の閉鎖空間内に薬物が封入された状態をいうが、薬物の一部を、膜内に含む状態で、あるいはリポソームの外表面に付着した状態で含んでいてもよい。
　本発明のリポソーム製剤は、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤および／または酸化防止剤をさらに含むものであってもよい。
　安定化剤としては、特に限定されないが膜流動性を低下させる物質が挙げられ、グリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。また、膜構成成分の他の脂質として上述したコレステロールなどのステロールはこの安定化剤として作用する。
　酸化防止剤としては、特に限定されないがアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体、たとえばビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、本発明においてはいずれも使用できる。
　本発明のリポソーム製剤は、投与経路次第で医薬的に許容される添加物をさらに含むものであってもよい。このような添加物の例として、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤、前述した生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。
　添加物は、上記の中から適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明では、これら添加物を含む態様のリポソーム製剤を、医薬組成物として供することができる。本発明の医薬組成物は、通常の方法、たとえば０～８℃での冷蔵あるいは１～３０℃の室温で保存することができる。
　次に、本発明の特定構造のリポソームの好ましい製造方法例を示すが、これに限定されるものではない。
　たとえばフラスコ内で、リン脂質等の膜構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、当該フラスコ内に内水相溶液を加え、激しく撹拌する。次いで、遠心分離し、上清をデカンテーションし精製することにより、リポソーム懸濁液を得ることができる。
　ｓＬｅＸ－ＰＥＧによりリポソーム表面を修飾する手段として、ｓＬｅＸ－ＰＥＧの脂質誘導体をそのままあるいは水溶液として、リポソーム懸濁液に添加することによりｓＬｅＸ－ＰＥＧ鎖が外表面にのみ分布するリポソームを製造することができる。
　また上記とは別に、反応活性な官能基を持つリン脂質等の膜構成脂質を含有するリポソームを常法にて製造した後、リポソーム外液に片末端活性化ＰＥＧ－ｓＬｅＸを添加して官能基を持つリン脂質等の膜構成脂質と結合させることにより、リポソームの外表面のみを修飾することもできる。あるいは、反応活性な官能基を持つＰＥＧ－リン脂質等の膜構成脂質を含有するリポソームを常法にて製造した後、リポソーム外液に活性官能基を有するｓＬｅＸ誘導体を添加して官能基を持つＰＥＧ－リン脂質等の膜構成脂質と結合させることにより、リポソームの外表面のみを修飾することもできる。
　またリポソームは、上記方法以外にも、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。この方法は、「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田、吉村ら；シュプリンガー・フェアラーク東京（1992））に具体的に記載されており、この記載を引用して本明細書に記載されているものとする。
　上記において、リポソームを所望のサイズにサイジングするために、いくつかの技術が利用可能である（G.Gregoriadis編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques」2ndedition,Vol.Ｉ-III、CRC Press）。この記載を引用して本明細書に記載されているものとする。
　リポソーム懸濁液は、エクストルーダーを用いて、フィルターを複数回強制通過させることによりユニラメラ化することができる。通常、フィルターは、所望径より大径の孔径をもつもの、最後に所望径の得られるものの孔径の異なるものを２種以上使用する。口径の異なるフィルターを用いて、エクストルージョンの回数を多くするほどユニラメラ化率が高くなり、実質的にＬＵＶリポソームとみなすことができる。
　上記のようなリポソームに薬物を担持するには、薬物を含む水溶液でリポソームを構成する脂質膜を水和させることにより薬物をリポソームに担持させる方法（Passive loading）、またはリポソーム膜の内側／外側にイオン勾配を形成し、このイオン勾配に従い薬物をリポソーム膜透過させ担持させる方法（Remote loading）がある（前記サイジング技術を記載した文献および米国特許第５１９２５４９号、米国特許第５３１６７７１号など参照）。後者のRemote loadingは、高い薬物／脂質を達成でき、臨床に有効な高担持率のリポソーム製剤を得ることができることから好ましい。
　例えば、ｐＨ勾配によるイオン勾配を用いるRemote loading法としては、フラスコ内で、リン脂質等の膜構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次いで、酸性緩衝液（例えばｐＨ４の緩衝液）を加え振とうしリポソーム懸濁液を得る。さらに必要に応じリポソーム粒径のサイジングを行い、リポソーム外液をゲルろ過などの方法によりｐＨが中性付近の外液に置換する方法や適当なｐＨ調整剤によりリポソーム外液のｐＨを中性付近（例えばｐＨ７～７．５付近）に調整する方法等によりｐＨ勾配を形成し、このリポソーム懸濁液に薬物を含む水溶液を加え、この溶液をある時間加温することにより薬物を担持させることができる。なお、ｓＬｅＸ－ＰＥＧの修飾は、前述した通り脂質二重膜の小胞を形成した後であれば、薬物担持操作の前後どちらでも行うことができる。
　また、アンモニウムイオン勾配を用いる方法としては、上記薄膜形成後、硫酸アンモニウム溶液を用いリポソーム懸濁液を得る。次いで、透析あるいはゲルろ過法によりリポソームの外液のアンモニウムイオンをナトリウムまたはカリウムイオンなどに置換することにより、リポソームの内側／外側にアンモニウムイオン勾配を形成し、ここに薬物を含む水溶液を加え、ある時間加温することにより薬物を担持することができる。また、硫酸アンモニウム懸濁液に適当なｐＨ調整剤を加えることにより、リポソームの内水相のｐＨを５以下とすることもできる。
　リポソーム製剤の非経口的投与の経路としては、たとえば点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。リポソーム製剤の具体的な投与方法としては、医薬組成物をシリンジや点滴によって投与することができる。また、カテーテルを患者または宿主の体内、たとえば管腔内、たとえば血管内に挿入して、その先端を標的部位付近に導き、当該カテーテルを通して、所望の標的部位またはその近傍あるいは標的部位への血流が期待される部位から投与することも可能である。
　本発明のリポソーム製剤は、病気に既に悩まされる患者に、疾患の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。たとえばリポソーム製剤に封入される薬物の有効投与量は、通常、一日につき体重１ｋｇあたり０.０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかしながら、本発明のリポソーム製剤はこれらの投与量に制限されるものではない。投与時期は、疾患が生じてから投与してもよいし、あるいは疾患の発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるべきものではない。
　なお、以下の実施例では、薬物を内封したリポソーム製剤を単にリポソームと称することがある。
＜材料＞
塩酸ドキソルビシン（分子量５７９.９８）：RPG Lifescience LTD
ＩＣＧ：インドシアニングリーン（分子量７７４.９６，Sigma Ardrich社製）
ＨＳＰＣ（分子量７９０，Lipoid社製，ＳＰＣ３）水素添加大豆ホスファチジルコリン
Ｃｈｏｌ（分子量３８６.６５,Solvay社製）：コレステロール
ＰＥＧ5000：分子量５０００のポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール鎖
ＰＥＧ2000：分子量２０００のポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール鎖
ＤＳＰＥ：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥ（分子量６１２３，日本油脂社製）：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ5000）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ（分子量２８９８，日本油脂社製）：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ2000）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＥ－０５０ＰＡ（商品名）（分子量５６５７，日油）：ポリエチレングリコール鎖の分子量が５０００のＮ-（アミノプロピルポリエチレングリコール）カルバミルジステアロイルホスファチジル-エタノールアミン
ＤＳＰＥ－０２０ＰＡ（商品名）（分子量２８９９，日油）：ポリエチレングリコール鎖の分子量が２０００のＮ-（アミノプロピルポリエチレングリコール）カルバミルジステアロイルホスファチジル-エタノールアミン
（合成例１）ｓＬｅＸ結合ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　分子量５０００のポリエチレングリコール鎖を有するＤＳＰＥ－０５０ＰＡ（商品名）（分子量５６５７，日油）６２２.３ｍｇをナスフラスコに入れて、クロロホルム１０ｍＬで溶解させた後、溶液を減圧留去し、さらに真空ポンプで減圧乾燥（２時間）し、薄膜を形成した。
　そこに２００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.０）を２２.５ｍＬ加え、約６０℃で撹拌し、水和した。その後、加温を約５０℃として、sialyl lewis X-lactose（東京化成）２５１.９ｍｇを加え３時間攪拌した。さらに、加温を４０℃として、ピリジンボラン（和光純薬）１３７.５μＬの脱水メタノール（関東化学）２.５ｍＬ溶液を滴下、その後、ピリジンボラン１３７.５μＬのメタノール２.５ｍＬ溶液を３回（１６時間後、２４時間後、４０時間後）追加滴下し、７日間撹拌した。
　反応液を減圧濃縮後、５ｍＬの水を加え、水で平衡化したゲルろ過クロマトカラム（Sephadex G-25，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）２００ｍＬに通し、脱塩し、分取液を凍結乾燥した。
　次に、凍結乾燥した反応物に水５ｍＬを加え溶解し、セルロース透析膜（Spectra/por（登録商標）7，MWCO 3500，Spectrum Laboratories）を用いて１ＭＮａＣｌ溶液に対して２４時間、次いで水に対して２４時間透析し、そして凍結乾燥した。さらに、得られた反応物を、シリカゲルクロマトグラフィー（富士シリシア）にかけ、５０％～６０％メタノール（国産化学）－クロロホルム（国産化学）溶出画分より、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥ０.１１ｇを得た。
（合成例２）ｓＬｅＸ結合ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの合成
　ＤＳＰＥ－０５０ＰＡに代えて分子量２０００のポリエチレングリコール鎖を有するＤＳＰＥ－０２０ＰＡ（商品名）を用いた以外は、合成例１と同様な手順でｓＬｅＸ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを得た。
（実施例１）ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）リポソーム懸濁液の形成
　水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）０.７０５７ｇおよびコレステロール（Ｃｈｏｌ）０.２９４７ｇを秤量し、７０℃で加温した無水エタノール１ｍＬを添加し、加温溶解した。
　得られた脂質のエタノール溶液１ｍＬに、約７０℃に加温した２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液９ｍＬを添加し、撹拌して粗リポソーム懸濁液を調製した。
　この粗リポソーム懸濁液を、約７０℃に加温したエクストルーダーＴ１０（Lipex Biomembranes社製）に取り付けたフィルター（孔径０.２μｍ×３回、０.２μｍ×１０回、ポリカーボネートメンブラン、Whatman社）に順次通し、リポソーム懸濁液を得た。
（２）外液置換
　ｐＨ７.５　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液で置換したゲルカラム（Sepharose 4 Fast Flow，Amersham Biosciences）を用いて、上記リポソーム懸濁液の外液置換を行った。リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（３）薬物導入
　リン脂質定量キットを用いて算出した総脂質濃度をもとに、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように塩酸ドキソルビシンの量を計算した。計算結果をもとに必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液（薬物溶液）を調製した。外液置換後のリポソーム懸濁液４.５ｍＬに塩酸ドキソルビシン溶液２.３９ｍＬを加え６０℃で６０分間加温することで薬物導入を行った。導入後のサンプルは氷冷した。
（４）未封入薬物除去
　薬物導入後のリポソーム懸濁液を、ｐＨ７.５　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液で透析を行い、リポソームに封入されていない薬物を除去した。リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（５）表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液４ｍＬを６５℃に加温し、表面修飾剤として合成例１で得たｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が２.０ｍｏｌ％となる量の０.８６ｍＬ加え、６５℃で３０分加温することによりリポソームの膜表面（外表面）をｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾した。加温終了後のリポソーム懸濁液は、速やかに氷冷した。
（６）未封入薬物除去
　薬物導入後のリポソーム懸濁液を、ｐＨ６.５の１０ｍＭ　Ｌ－ヒスチジン／１０％スクロース溶液で充分に置換したカラム（Sepharose 4Fast Flow，Amersham Biosciences）を用いて外液置換し、リポソームに封入されていない薬物を除去した。その後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表１に示す。
　なお、以下の各表中、
「薬物濃度」は、リポソーム懸濁液中のリポソームに担持された薬物濃度（測定値）であり、薬物／リポソーム懸濁液で示す。
「総脂質濃度」は、リポソーム懸濁液中の総脂質濃度（測定値）である。ただし、「総脂質」には、ＰＥＧ誘導体は含まれない。
「修飾率」は、上記総脂質のモル濃度（測定値）に対する修飾剤のモル濃度（測定値）の率であり、たとえば修飾剤がｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの場合には以下の式で求められる。
修飾率（ｍｏｌ％）＝（ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥ濃度（ｍＭ）／総脂質濃度（ｍＭ））×１００
「薬物／脂質比」は、上記総脂質濃度に対する薬物濃度の比をモル比で示す。
「粒子径」は、薬物封入リポソームを粒度分布系（Zetasizer 3000HS，Malvern Instruments社）にて測定した平均粒子径で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例２）ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）リポソーム懸濁液の形成
　ＨＳＰＣ７.０８７０ｇおよびコレステロール２.９６１２ｇを秤量し、７０℃で加温した無水エタノール１０ｍＬを添加し、加温溶解した。
　得られた脂質のエタノール溶液１０ｍＬに、約７０℃に加温した２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液９０ｍＬを添加し、撹拌して粗リポソーム懸濁液を調製した。この粗リポソーム懸濁液を、約７０℃に加温したエクストルーダーＴ１００（Lipex Biomembranes社製）に取り付けたフィルター（孔径０.２μｍ×３回、０.１μｍ×１０回、ポリカーボネートメンブラン、Whatman社）に順次通し、リポソーム懸濁液を得た。
（２）外液置換
　実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、ＨＳＰＣ濃度を測定し、総脂質濃度を算出した。
（３）薬物導入
　実施例１の（３）と同様にして、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように計算した必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液を調製した。
　この塩酸ドキソルビシン溶液７.２ｍＬを外液置換後のリポソーム懸濁液１２ｍＬに加えた以外は実施例１の（３）と同様にして薬物導入工程を行った。
（４）未封入薬物除去
　実施例１の（４）と同様にＨＥＰＥＳ溶液で透析してリポソームに封入されていない薬物を除去し、リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（５）表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液４ｍＬに対し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.０ｍｏｌ％となる０.５２ｍＬ加えた以外は実施例１の（５）と同様にしてリポソーム膜のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾を行なった。
（６）未封入薬物除去
　実施例１の（６）と同様にして、Ｌ－ヒスチジン／スクロース溶液置換カラムを用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（比較例１）ＰＥＧ／ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）ＰＥＧによる表面修飾
　実施例１の（１）と同様にして得られたリポソーム懸濁液を加温状態で維持したまま、表面修飾剤としてＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.５ｍｏｌ％となる量の０.７６ｍＬ直ちに加え、６５℃で３０分加温することによりリポソームの膜表面（外表面）をＰＥＧ修飾した。加温終了後のリポソーム懸濁液は、速やかに氷冷した。
（２）外液置換
　実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、ＨＳＰＣ濃度を測定し、総脂質濃度を算出した。
（３）薬物導入
　実施例１の（３）と同様にして、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように計算した必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液を調製した。
　この塩酸ドキソルビシン溶液１.６ｍＬを外液置換後のリポソーム懸濁液４.５ｍＬに加えた以外は実施例１の（３）と同様にして薬物導入工程を行った。
（４）未封入薬物除去
　実施例１の（４）と同様にしてＨＥＰＥＳ溶液で透析してリポソームに封入されていない薬物を除去し、リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（５）ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる表面修飾
　ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥに代えて、合成例２で得たｓＬｅＸ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.０ｍｏｌ％となる量の０.２９ｍＬ加えた以外は実施例１の（５）と同様にしてリポソーム膜のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾を行なった。
（６）未封入薬物除去
　実施例１の（６）と同様にして、Ｌ－ヒスチジン／スクロース溶液置換カラムを用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（比較例２）ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）ＰＥＧによる表面修飾
　ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が２.５ｍｏｌ％となる量の３.２ｍＬ直ちに加えた以外は比較例１の（１）と同様にしてリポソームの膜表面をＰＥＧ修飾した。
（２）外液置換
　実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、ＨＳＰＣ濃度を測定し、総脂質濃度を算出した。
（３）薬物導入
　実施例１の（３）と同様にして、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように計算した必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液を調製した。
　この塩酸ドキソルビシン溶液２.９９ｍＬを外液置換後のリポソーム懸濁液７ｍＬに加えた以外は実施例１の（３）と同様にして薬物導入工程を行った。
（４）未封入薬物除去
　実施例１の（６）と同様にして、Ｌ－ヒスチジン／スクロース溶液置換カラムを用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（比較例３）ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる低修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
　実施例２の（５）において、得られたリポソーム懸濁液４ｍＬに対し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が実施例２の半量の０.５ｍｏｌ％となる０.２６ｍＬ加えた以外は、実施例２と同様の各工程を実施してリポソーム膜のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾を行なった。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（比較例４）ＰＥＧ／ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）リポソーム懸濁液の形成
　ＨＳＰＣを７.０５９９ｇおよびコレステロールを２. ９４７０ｇ秤量した以外は、実施例２の（１）と同様にしてリポソーム懸濁液を得た。
（２）表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液１０ｍＬを加温状態で維持したまま、総脂質量の１.０ｍｏｌ％の表面修飾剤としてＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を２.６８ｍＬ直ちに加え、６５℃で３０分加温することによりリポソームの膜表面（外表面）をＰＥＧ修飾した。加温終了後のリポソーム懸濁液は、速やかに氷冷した。
（３）外液置換
　実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、ＨＳＰＣ濃度を測定し、総脂質濃度を算出した。
（４）薬物導入
　実施例１の（３）と同様にして、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように計算した必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液を調製した。
　この塩酸ドキソルビシン溶液３.０３ｍＬを外液置換後のリポソーム懸濁液６ｍＬに加えた以外は実施例１の（３）と同様にして薬物導入工程を行った。
（５）未封入薬物除去
　実施例１の（４）と同様にしてＨＥＰＥＳ溶液で透析してリポソームに封入されていない薬物を除去し、リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（６）表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液４ｍＬに対し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.０ｍｏｌ％となる０.５８ｍＬ加えた以外は実施例１の（５）と同様にしてリポソーム膜のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾を行なった。
（７）未封入薬物除去
　実施例１の（６）と同様にして、Ｌ－ヒスチジン／スクロース溶液置換カラムを用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（比較例５）ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム（ドキソルビシン製剤）の調製
（１）外液置換
　比較例４の（１）リポソーム懸濁液の形成と同様にして得たリポソーム懸濁液を実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、ＨＳＰＣ濃度を測定し、総脂質濃度を算出した。
（２）薬物導入
　実施例１の（３）と同様にして、塩酸ドキソルビシン／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が０.１６となるように計算した必要量の塩酸ドキソルビシンを秤量し、ＲＯ水を用いて１５ｍｇ／ｍＬの塩酸ドキソルビシン溶液を調製した。
　この塩酸ドキソルビシン溶液３.２４ｍＬを外液置換後のリポソーム懸濁液６ｍＬに加えた以外は実施例１の（３）と同様にして薬物導入工程を行った。
（３）未封入薬物除去
　実施例１の（４）と同様にしてＨＥＰＥＳ溶液で透析してリポソームに封入されていない薬物を除去し、リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（４）ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液４ｍＬに対し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥに代えて、合成例２で得たｓＬｅＸ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの３７.６５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製し、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.０ｍｏｌ％となる量の０.３９ｍＬ加えた以外は実施例１の（５）と同様にしてリポソーム膜のｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾を行なった。
（５）外液置換
　実施例１の（２）と同様にしてゲルカラムによるリポソーム懸濁液の外液置換を行い、リン脂質定量キットを用いて測定したＨＳＰＣ濃度をもとに、総脂質濃度を算出した。
（６）未封入薬物除去
　実施例１の（６）と同様にして、Ｌ－ヒスチジン／スクロース溶液置換カラムを用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（試験例１）薬物動態（血中滞留性）
　実施例１～２、比較例１～２および５のリポソーム製剤の薬物動態を試験した。
　検体を満たしたシリンジに２７Ｇの翼付静注針を装着し、マウスホルダーにて保定したラットの尾静脈から投与した。投与量は塩酸ドキソルビシンとしてとして２ｍｇ／ｋｇを投与した。
　投与後、０.２５，１，２，４，８，１２，２４，４８時間目に、尾静脈より０.２ｍＬの採血を行った。血漿を分離後、ＨＰＬＣ法により血漿中の塩酸ドキソルビシン濃度を算出した。結果を図１に示す。
　血漿中濃度より算出したＡＵＣ（血中濃度下面積）を図２に示す。
　図２に示されるとおり、ＰＥＧ修飾リポソーム（比較例２）を基準にすると、ＰＥＧ－ｓＬｅＸ修飾リポソームのＡＵＣはいずれも減少したが、ＰＥＧ2000を介してｓＬｅＸ修飾したリポソーム（比較例１，５）の減少率が約４０％以上であるのに対し、ＰＥＧ5000を介してｓＬｅＸ修飾したリポソーム（実施例１，２）の減少率は約１０％程度と小さく、血中滞留性の高いＰＥＧ修飾リポソームと遜色がなかった。
（試験例２）結合性評価－１
　Ｅ-セレクチン（Ｅ-selectin）と各種リポソームの結合活性を、E-selectin発現細胞株に対するシアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）修飾タンパク質の結合阻害活性の測定にて比較した。
　市販プラスミドＢＢＧ５７ (British Biotechnology) 由来のヒトE-selectin ＤＮＡを発現ベクターｐＡＧＥ１１０に組み込み、E-selectin発現プラスミドを作製した。常法（Cytotechnology 13, 79-88(1993)）に従って該発現プラスミドをＣＨＯ（ＤＸＢ１１）（東大医科研より入手）に導入後、メトトレキサートを用いた遺伝子増幅によりE-selectin発現細胞株（ＣＨＯ／Ｅ－selectin）を取得した。
ヒトα２,３シアル酸転移酵素IVのＤＮＡをpＡＧＥ２４９（JBC 269, 14730（1994））に、ヒトα１,３フコース転移酵素VIIのＤＮＡをpＫＡＮＴＥＸ９３由来のベクターにそれぞれ組み込んで発現プラスミドを作製した。これらを常法（Cytotechnology 13, 79-88(1993)）に従ってＣＨＯに導入し、糖転移酵素発現細胞株を得た。この細胞より産生したシアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）修飾タンパク質を、Alexa647ラベリングキット（インビトロジェン）を用いて蛍光標識した。
　播種したＣＨＯ／Ｅ-selectinに、蛍光標識したｓＬｅＸ修飾タンパク質を添加してＦＭＡＴ（Applied Biosystems）を用いて測定し、添加濃度に応じて蛍光強度が増大することを確認した。一定濃度のｓＬｅＸ修飾タンパクと同時に各種リポソーム製剤を添加して測定した蛍光強度から、各添加量（脂質濃度）におけるｓＬｅＸ修飾タンパク質の結合活性（％）を求めた。結果を図３～４に示す。
　結合活性（％）が小さいほど、ＣＨＯ／Ｅ-selectinに対するｓＬｅＸ修飾タンパク質の結合が阻害されていることを示す。
　比較例２、比較例４のリポソームは、ｓＬｅＸ修飾タンパクとＣＨＯ／Ｅ-selectinの結合に影響を与えなかったが、実施例１、実施例２、比較例１、比較例５のリポソームは、ＣＨＯ／Ｅ-selectinに対するｓＬｅＸ修飾タンパクの結合を濃度依存的に阻害した。
　実施例１のリポソームは、比較例１のリポソームと比較してさらに強い結合阻害活性を示した。
（試験例３）結合性評価－２
　Ｅ-selectin と各種リポソームの結合を、ビアコアを用いて比較した。
　BiacoreTM T100（ＧＥヘルスケア）のWizardに従って、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）に抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＧＥヘルスケア）を固定化し、さらに組み換えヒトＥ-selectin -ヒトＩｇＧＦｃ複合体（Ｒ＆Ｄ）を結合させた。
　BiacoreTM T100に、各種リポソームをそれぞれ流入して、チップ上の結合・解離の状態をセンサーグラムとして検出し、リポソーム間で比較した。結果を図５に示す。
＜結合性能と血中滞留性の評価＞
　上記実施例、比較例の結合性能（結合性評価－２）と血中滞留性の評価結果を模式的にまとめて表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　上記に示されるとおり、本発明のｓＬｅＸ－ＰＥＧリポソームは、従来のＰＥＧリポソーム（比較例２）の長い血中滞留性をほぼ同等に保持し、一方ＰＥＧリポソームとは比較にならない強い結合性能を有する。また、ＰＥＧ鎖長が短いｓＬｅＸ－ＰＥＧリポソームよりも血中滞留性および結合性ともに格別に優れている。
（試験例４）抗腫瘍効果
　ＣＨＯ／Ｅ-selectinを免疫不全マウスに皮下移植し、１９日間増殖させた。個体を生理食塩水、ドキシル（登録商標）（既存の塩酸ドキソルビシン内包ＰＥＧ2000化リポソーム製剤，ヤンセンファーマ社）、比較例１のリポソームおよび実施例１のリポソーム投与群に群分けし、各々１ｍｇ／ｋｇをＤａｙ０および７に静脈内投与し、Ｄａｙ１６まで腫瘍径と体重を測定した。
　腫瘍径から腫瘍体積を算出した結果を図６に示す。
　体重からＤａｙ０からの体重変動率を算出した結果を図７に示す。
　Ｄａｙ１６の比較例１リポソーム投与群の腫瘍体積は、ドキシル処方に対して有意に小さかった。また、実施例１リポソームはＤａｙ１２以降、ドキシルおよび比較例１リポソームと比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。
　体重は、いずれのリポソームを投与した場合も２回目投与以降に減少傾向を示したが、実施例１リポソーム投与の体重推移はドキシルと同等であった。
（実施例３）ＩＣＧ標識ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム製剤の調製
（１）リポソーム懸濁液の形成
　１０ｍＭリン酸緩衝液１６ｍＬに１.６ｍｇのＩＣＧを溶解させ、内水相を調製した。
　ＨＳＰＣとコレステロールを５４：４６（モル比）で混合した混合脂質を１.００４６　ｇ秤量し、７０℃で加温した無水エタノール１ｍＬを添加し、加温溶解した。
　得られた脂質のエタノール溶液１ｍＬに、約７０℃に加温した内水相９ｍＬを添加し、撹拌して粗リポソーム懸濁液を調製した。
　この粗リポソーム懸濁液を、約７０℃に加温したエクストルーダーＴ１０（Lipex Biomembranes社製）に取り付けたフィルター（孔径０.２μｍ×３回、０.１μｍ×１０回、ポリカーボネートメンブラン、Ｗｈａｔｍａｎ社）に順次通し、リポソーム懸濁液を得た。
（２）表面修飾
　得られたリポソーム懸濁液２ｍＬを６５℃に加温し、表面修飾剤として合成例１で得たｓＬｅＸ－ＰＥＧ5000－ＤＳＰＥの１３５ｍｇ／ｍＬ水溶液を、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率（ｍｏｌ％）が１.０ｍｏｌ％となる量の０.１ｍＬ加え、６５℃で３０分加温することによりリポソームの膜表面（外表面）をｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾した。加温終了後のリポソーム懸濁液は、速やかに氷冷した。
（３）外液置換
　次いで、リポソーム懸濁液を、ｐＨ６.５の１０ｍＭ　Ｌ－ヒスチジン／１０％スクロース溶液で充分に置換したカラム（Sepharose 4Fast Flow，Amersham Biosciences）を用いて外液置換（未封入薬物除去）した後、フィルター滅菌（Sartrius社、MINISART PLUS ０.２０μｍ）を行って最終製剤とした。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011

Claims (9)

  1. 　少なくともリン脂質を膜材として含む脂質二重膜で形成される閉鎖小胞の水性懸濁液であって、実質的に、該閉鎖小胞の表面が、平均分子量（Ｍｗ）４０００～７０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を介してオリゴ糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）が配位するようにＰＥＧとｓＬｅＸとの結合鎖（ｓＬｅＸ－ＰＥＧ）のみで修飾され、かつ該ｓＬｅＸ－ＰＥＧによる前記膜材の総脂質量に対する修飾率が０.８～２.５ｍｏｌ％である、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾リポソーム。
  2. 　前記閉鎖小胞の外液側表面のみが前記ｓＬｅＸ－ＰＥＧで修飾されている請求項１に記載のリポソーム。
  3. 　前記ＰＥＧの平均分子量が５０００である請求項１または２に記載のリポソーム。
  4. 　前記ｓＬｅＸ－ＰＥＧ修飾率が０.９～２ｍｏｌ％である請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム。
  5. 　前記膜材がコレステロールを含む請求項１～４のいずれかに記載のリポソーム。
  6. 　前記修飾が、ｓＬｅＸ－ＰＥＧ－脂質誘導体を表面修飾剤として、該表面修飾剤の脂質部分が前記脂質二重膜内に配置されることにより導入されている請求項１～５のいずれかに記載のリポソーム。
  7. 　前記表面修飾剤の脂質部分がジステアロイルホスファチジルエタノールアミンである請求項１～６のいずれかに記載のリポソーム。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のリポソームの前記閉鎖小胞内に封入された薬物を含むリポソーム製剤。
  9. 　前記薬物が抗癌剤および／または抗炎症剤である請求項８に記載のリポソーム製剤。
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