JPS60231608A

JPS60231608A - 膜構造が強化されたリポソ−ム

Info

Publication number: JPS60231608A
Application number: JP8518284A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Yamamoto; 雄一山本; Toshihiro Akaike; 敏宏赤池; Yasuhiro Nozaki; 野崎　康博; Shigeo Aoyanagi; 重郎青柳
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1984-04-28
Filing date: 1984-04-28
Publication date: 1985-11-18
Also published as: EP0160286A3; JPS6352010B2; EP0160286A2; EP0160286B1; DE3580507D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は改良されたリポソーム（小胞体）に関するもの
である。

Ｓらに詳しくは、本発明は膜構造が強化されたリポソー
ムに関する。リポソーム（Ｉｉｐｏｓｏｍｅ）は脂質２
分子膜からなる閉鎖小胞体ある。天然の生体膜は脂質の
２分子構造をとっているといわれており、このリポソー
ムは生体膜のモデル膜としてその物理化学的性質の研究
に広く用いられている。また、リポソームは内部の水層
や膜内に種々の物質を閉じ込めることが出来、細胞と融
合したリ、細胞に取り込まれたりするので生体内へ物質
を送り込むキャリヤーとして利用される。リポソームを
利用した研究は生物学、医学、薬学など広範な分野にわ
たっており、酵素や制癌剤を運ぶキャリヤーとしての利
用、免疫学分野での利用、細胞との相互作用、ドラッグ
デリバリ−システムとしての利用等が研究されている。

先行技術および問題点リポソームは上述したように極めて広範な利用分野を有
するが、その問題点として膜構造の脆弱性が指摘されて
いる。即ち、膜形成物質である脂質の化学的または物理
的変化により膜が破壊され保持物質のもれを生じる。そ
こでリポソーム膜の強化法として従来、膜にスフィンゴ
ミエリンを添加して水素結合帯を付与・強化する方法、
トコフェロール等を添加して不飽和脂質の酸化を防止す
る方法等が知られているが、いずれの方法も十分ではな
く、より効果の高い膜強化法の出現が望まれていた。

ＩＩ　、発明の目的従って本発明の目的は、膜構造の強化されたリポソーム
を提供することにある。

本発明のリポソームは、上記目的を達成するために、次
の各項に記載する構成を有する。

（１）リポソームを構成する膜がアスコルビン酸エステ
ル０．１〜２０モル％を含有する脂質からなる膜構造が
強化されたリポソーム。

（２）脂質は不飽和結合を有する脂質である第１項記載
の膜構造が強化されたリポソーム。

（３）不飽和結合を有する脂質はリン脂質である第２項
記載の膜構造が強化されたリポソーム。

（４）リン脂質はホスファチジルコリンまたはスフィン
ゴミエリンである第３項記載の膜構造が強化されたリポ
ソーム。

（５）アスコルビン酸エステルはアスコルビン酸高級モ
ノまたはジエステルである第１項記載の膜構造が強化さ
れたリポソーム。

（６）アスコルビン酸高級モノまたはジエステルは、ア
スコルビン酸モノ若しくはジパルミテートまたはアスコ
ルビン酸モノ若しくはジステアレートである第５項記載
の膜構造が強化されたリポソーム。

（７）リポソームと該リポソームに取りこまれた物質か
らなり、該リポソームを構成する膜が７スコルビン酪エ
ステル０．１〜２０モル％を含有する脂質からなる膜構
造が強化されたリポソニム。

■１発明の詳細な説明本発明者等は、リポソームの膜構造を強化する方法を鋭
意研究した結果、リポソーム膜構成脂質にアスコルビン
酸エステルを添加すると、脂質２分子膜間にアスコルビ
ン酸エステルが入り、疎水結合とともに水素結合帯が強
化され、さらに脂質が不飽和脂肪酸を含んでいる場合に
は、その酸化が防止されることによりリポソーム膜が強
化されることを知った。

本発明はこの知見に基づいて完成されたものであり、本
発明の膜構造が強化されたリポソームは、リポソームを
構成する膜がアスコルビン酸エステル０．１〜２０モル
％を含有する脂質からなる。

本発明におけるリポソーム膜構成脂質には特に制限ハな
く、リポソームを形成するものであれば天然または合成
の脂質が使用可能である。使用される脂質が分子中に不
飽和脂肪酸を含んでいる場合には、その酸化が防止され
る。本発明においてはリン脂質が好適に使用され、その
例として、レシチン、ホスファチジルコリン／、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスフ
ァチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルシオ
リピンおよびこれらを常法に従って水素添加したものが
あげられ、これらを組合せて用いることもできる。特に
ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンが好ま
しい。

本発明で使用されるアスコルどン敢エステルは脂溶性で
あることが必要であり、アスコルビン酸高級脂肪酸モノ
またはジエステルが好ましい。高級脂肪酸としては炭素
数１２〜２２、特にＩ４−１８を有するものが望ましく
、特にバルミチン酸、ステアリン酸が好適である。

アスコルビン酸エステルの使用量は、０．１〜２ｏモル
％、即ち、脂質１００モルに対してアスコルビン酸エス
テルを０．１〜２０モル使用するのが適当である。０．
１モル％より低い濃度では膜構造を強化することができ
ない。２０モル％より高い濃度では膜構造は強化される
が同時にアスコルビン酸の生理活性が発揮されるので一
般的には望ましくない。

本発明のリポソームには、膜の強度を高めるために、さ
らにコレステロール等のステロールを添加することがで
き、また生体中における薬剤の徐放性を調節するために
、電荷を与える物質、例えばホスファチジン酸、ジセチ
ルホスフェート、ステアリルアミン等を添加することが
できる。リポソーム膜はこれらの物質の存在によって破
壊がコントロールされる。

本発明のリポソームは、それ自体、またそれに種々の物
質を包含させて多方面の分野に利用される。

例えば、生体膜への親和性を利用して細胞分離材として
使用することができる。またｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉ
ｎ　ｖｉマ０で不安定なもの、体内で徐々に放出されあ
るいは特定の臓器に速やかに分布することが所望される
薬物のキャリヤーとして利用することもできる。このよ
うな薬物の例としては、インスリン、ヘパリン、ウロキ
ナーゼ、ユビデカレノン、メトトレキセート、ネオマイ
シン、プレオマイシン、テトラサイクリン、チトクロー
ムＣ、アスパラキナーゼ、シトシンアラビノシド等があ
げられる。その他、薬剤以外のものでも、マーカーある
いはプラスミドやＤＮＡ、ＲＮＡ等、生体内に投与して
有効なものであれば特に制限されることはない。

本発明のリポソームはそれ自体公知の方法によって製造
される。

例えば、リポソーム構成脂質およびアスコルビン酸エス
テルおよび所望によりステロール、電荷付与物質、脂溶
性薬物をクロロホルム、エタノール等の適当な有機溶媒
に溶解し、得られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜
を調整する。この薄膜に取り込ませたい物質の水溶液を
加えて激しく攪拌すると、多重層リポソームが形成され
る。これを超音波で処理すると直径約２５０Ａ〜５００
Ａのリポソームが得られる。

リポソームが薬物保持リポソームである場合は、必要に
より生理食塩水等で洗浄した後、ペレット状、懸濁状製
剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤に調整され、経
口用または注射剤等の非経口用製剤として投与される。

■１発明の具体的作用効果本発明のリポソームは、リポソームを構成する膜がアス
コルビン酸エステル０．１〜２０モル％を含有する脂質
からなり、膜構造が強化されている。

本発明のリポソームにおいては脂質２分子膜間にアスコ
ルビン酸エステルが入り、水素結合帯が強化されるので
膜ゐ強度が高められている。

さらに、本発明のリポソームにおいて、脂質が不飽和脂
肪酸を含んでいる場合には、その酸化劣化が防止され、
その結果経時的安定性に優れている。

次に実施例および試験例をあげて本発明の作用効果をさ
らに具体的に説明する。

実施例表１の組成を有するリポソームを逆相法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ、　７５（
８）、　４１９４（１９７＋３）；特開昭５５−１１８
４１５）により作成した。

即ち、所定量の卵黄ホスファチジルフリン、コレステロ
ール、アスコルビン酸エステル、スフィンゴミエリン、
α−トコフェロールをクロロホルム２０ｍ１に溶解した
溶液を５０１のナス型フラスコに入れる。ロータリーエ
バポレーターを用いて溶媒を留去し、フラスコ内壁に薄
膜を形成させた。

次いでジエチルエーテル１８ｍ１を加えて脂質を溶２＋
　２＋解し、更にＣａ　、Ｍｇ　、グルコースを抜・いたタイ
ロード・バッファーを３１加えた。そしてナスフラスコ
内の気相を窒素ガスで置換した後に、ナスフラスコを約
２０℃に保ちながら、均一な懸濁液ができるまで約５分
間超音波照射を行なった。

次にロータリーエバポレターを用いて２０〜２５℃の減
圧下（減圧ゲージ比的４００１１ｍＨｇ）でジエチルエ
ーテルの大部分を留去した。このようにしてできたゲル
状の脂質を１０〜１５秒間ポルテックスで混合した後、
２０〜２５°Ｃの減圧下（減圧ゲージ比的７３０ｍｍＨ
ｇ）でジエチルエーテルを完全に除いた。

２＋　２＋Ｃａ　、Ｍｇ　、グルコースを抜いたタイロードφバッ
ファー１４ｍ１に再懸濁させ、ナスフラスコ内の気相を
窒素ガスで置換した後に、約２０℃で３０分間超音波照
射を行ない、リポソームを単層またはオリゴラメラ層構
造のものに揃えた。

表１リポソーム組成（モル比）総脂質濃度１８ｇｍｏｌ／＋１ｌＥＰＣ！ｌｌＩ員ホスファチジルコリ／Ｃｈｏ　ｌ・　
コレステロールＡＰ　アスコルビル　６−パルミテートＡＤＰ　アスコ
ルビル　２．６−ジパルミテートＡＳ　アスコルビル　
６−ステアレートＳＰＭ　スフィンゴミエリ／ｖＥ　０−トコツユロール（ヒリミンＥ）歳１例上記実施例で得られた各リポソームについて、エタノー
ル抵抗性および抗酸化性を試験した。

（１）エタノール抵抗性試験Ｓ、Ｌ、Ｒｅｇｅｎ、　ｅｔ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｓｏｃ、、　１０２．８６３８−８８４０（１９
８０）に記載の方法に準じてエタノール抵抗性を試験し
た。

２＋即ち、リポソームの１０倍希釈液（Ｇａ　、２＋Ｍｇ、グルコースを抜いたタイロード・バフア−で希釈
する。）　５ｍｌに、エタノールを　０．５．　１．０
、２．０、３．０、４．Ｑ、　５．０、８．Ｑ、　７．
０、１０．（１ｍｌ順次添加し、その都度、波長４００
ｎｍで希釈液の濁度を測定した。グラフの縦軸に濁度、
横軸にエタノール添加量をとり、測定値をプロットし、
エタノール添加量０〜２ｍ１間における回帰直線の傾き
をめた。結果を表２および第１図に示す。傾きの絶対値
の小さい方がエタノール抵抗性大であり、膜構造が強い
といえる。

（２）抗酸化性試験日本生化学会編、脂質の化学、ｐ、５３８〜５３９．１
８７４（東京化学同人）に記載の方法により抗酸化性を
試験した。

即ち、リポソーム０．５誼１にｐＨ５，５の０．２Ｍ酢
　４酸バッファーを２．５１１１１加え、さらに１０　Ｍの
１゜１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル溶液（メ
タノール／水＝４＋１ｉ液）を５ｍｌ加えてよく攪拌し
た。これを４０〜５０℃でインキュベートし、１０分間
毎に波長５１７ｎｍの吸光度を測定した。測定は６０分
間まで行なった。

グラフの縦軸に吸光度、横軸に加温時間をとって測定値
をプロットし、加温時間１０〜８０分間の間における回
帰直線の傾きをめた。結果を表３および第２図に示す。

傾きの絶対値の小さい方か抗酸化性が高いといえる。

表２表３表２、表３、第１図および第２図から明らかなように、
アスコルビン酸エステルはエタノール抵抗性においてス
フィンゴミエリンより膜構造が強化された効果が大きく
、抗酸化性においては、α−トコフェロールと同等の効
果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリポソームのエタノール抵抗性を示す
グラフである。第２図は本発明のリポソームの抗酸化性
を示すグラフである。第１図および第２図のグラフにおいて、×□×　は　本
発明組成１０−０　は　本発明組成２０□口　は　本発明組成３ Δ□Δ　は　対照の濁度および吸光度をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リポソームを構成する膜が７スコルビン酸エステ
ル０．１〜２０モル％を含有する脂質からなる膜構造が
強化されたリポソーム。
（２）脂質は不飽和結合を有する脂質である特許請求の
範囲第１項記載の膜構造が強化されたリポソーム。
（３）不飽和結合を有する脂質はリン脂質である特許請
求の範囲第２項記載の膜構造が強化されたリポソーム。
（４）リン脂質はホスファチジルコリンまたはスフィン
ゴミエリンである特許請求の範囲第３項記載の膜構造が
強化されたリポソーム。
（５）アスコルビン酸エステルはアスコルビン酸高級モ
ノまたはジエステルである特許請求の範囲第１項記載の
膜構造が強化されたリポソーム。
（６）アスコルビン酸高級モノまたはジエステルは　ア
スコルビン酸モノ若しくはジパルミテートまたはアスコ
ルビン酸モノ若しくはジステアレートである特許請求の
範囲第５項記載の膜構造が強化されたリポソーム。
（７）リポソームと該リポソームに取りこまれた物質か
らなり、該リポソームを構成する膜がアスコルビン酸エ
ステル０．１〜２０モル％を含有する脂質からなる膜構
造が強化されたリポソーム。