FR2682121A1 - Milieux synthetiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications. - Google Patents
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Abstract
Ces milieux synthétiques pour la culture cellulaire contiennent des vecteurs vésiculaires infracellulaires d'affinité spécifique dont la composition membranaire, modifiée par introduction de ligands métaboliques aptes à s'exprimer à l'intérieur et à l'extérieur de leur structure, entraîne une modulation de l'activité de synthèse de la cellule ciblée Les ligands métaboliques sont choisis parmi les initiateurs et les modulateurs de la synthèse cellulaire dotés de fonction ou radical lipophile par acylation, et les vecteurs vésiculaires sont choisis parmi les vésicules, capsules ou sphères artificielles d'un diamètre qui peut aller de 30 à 1000 nanomètres, mis en œuvre pour incorporer une substance active soit dans un milieu aqueux remplissant le volume intérieur du vecteur soit dans la paroi même dudit vecteur puis pour transporter cette substance active vers un site où elle sera libérée et utilisée à différentes fins. Application de ces milieux de culture à la production de peptides de la matrice extracellulaire et de peptides à activité enzymatique.
Description
MILIEUX SYNTHETIQUES POUR LA CULTURE DES FIBROBLASTES ET
LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne des milieux synthétiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications.
LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne des milieux synthétiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications.
On sait que l'abondance de la matrice extracellulaire qui sépare les constituants cellulaires est l'une des caractéristiques du tissu conjonctif. Cette matrice est à l'origine de différentes fonctions remplies par ce tissu. Elle sert d'élément de support biomécanique et sa composition variée influence le comportement cellulaire. Loin d'être une structure stable, cette matrice est en remaniement constant du fait de l'activité cellulaire qui la synthétise et la modifie.
Les changements se produisant au niveau de la matrice extracellulaire peuvent être de nature quantitative ou de nature qualitative. Un déséquilibre entre la synthèse et/ou la dégradation peut contribuer à la mise en place d'une matrice extracellulaire "modifiée" ou pathologique.
On sait qu'une très grande variété des molécules qui composent la matrice extracellulaire (collagènes, protéoglycanes et glycoprotéines) sont synthétisés par les fibroblastes. Le collagène représente un des composants majeurs de la matrice extracellulaire. On connaît actuellement 13 types de collagènes originaires d'une famille d'une vingtaine de gênes. Ces molécules sont formées d'une association de trois chaînes peptidiques en triple hélice alpha. Dans la partie hélicoïdale, une séquence d'amino-acide se répète, où la glycine précède souvent une proline et une hydroxyproline. La structure protéique spécifique permet aux collagènes d'exercer différentes fonctions au sein du tissu conjonctif.
Parmi les différents types de collagène, les collagènes de type I et III constituent le produit de synthèse majeur des fibroblastes. Emonard et Grimaud (Cellular and Molecular Biology, 36 (2) 131-153 - 1990) ont montré que les fibroblastes peuvent contrôler la qualité et la quantité des collagènes non seulement par la diminution de la synthèse, mais aussi par la synthèse des enzymes de dégradation correspondants. . Ainsi, la cellule fibroblastique peut, à elle seule, contrôler l'ensemble du dépôt matriciel conjonctif. Cette cellule fibroblastique est de plus influencée en permanence par des facteurs solubles (cytokines) et par des facteurs insolubles (les composants matriciels). Le résultat de ces interactions conditionne la fonction fibroblastique vers une activité de synthèse ou de dégradation à l'égard de la matrice extracellulaire.Les fibroblastes constituent donc une pièce fondamentale dans la physiologie du tissu conjonctif et le contrôle de ses fonctions est d'une importance capitale dans le domaine biotechtiologique.
Le contrôle de la synthèse du collagène par les fibroblastes est d'une importance majeure pour la physiologie du tissu conjonctif.
En effet, le fibroblaste est la cellule mésenchymateuse responsable de la synthèse, de l'organisation et du remodelage de la matrice conjonctive. Parmi les différentes molécules synthétisées par les fibroblastes, nous avons vu que les collagènes de type I et III sont quantitativement les plus importants. De ce fait,
I'utilisation de la culture de fibroblastes permet d'analyser de manière précise l'action des différentes molécules sur l'activité de synthèse ou de dégradation du collagène.
I'utilisation de la culture de fibroblastes permet d'analyser de manière précise l'action des différentes molécules sur l'activité de synthèse ou de dégradation du collagène.
Un grand nombre de drogues ont déjà été décrites comme susceptibles de modifier la fonction fibroblastique (Bissel et Coll, Hepatology ,vol. 11 n" 3,1990 p.
488-498 - Emonard et Grimaud, in Cellular and Molecular Biology, 36 (2) 131-153 1990 - Kovacs in ImmunologyToday Vol. 12 ,N 1, 1991).
Certaines de celles-ci sont capables de stimuler la synthèse du collagène par les fibroblastes : I'acide ascorbique (Chojkier et coll - Jal of Biological Chemistry - Oct. 5,1989 p. 16957 - 16962), les cytokines comme l'interleukine-1, le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) (Kovacs - Immunology Today 1 - 1991), les peptides dérivés du collagène (Pacini et coll. Res. Comm. in Chemical
Pathology and Pharmacology - Avril 1990 p. 89-101).
Pathology and Pharmacology - Avril 1990 p. 89-101).
D'autres molécules ont été étudiées pour inhiber la synthèse du collagène et parfois induire la synthèse d'enzymes de dégradation (collagénases). Les plus connues sont les hormones corticoïdes, les cytokines comme le facteur dérivé de la nécrose tumorale (TNF) et les interférons; voir: Bissel et Coll, Emonard et Grimaud,
Granstein et coll. (The Jal of Investigative Dermatology suppl. déc.1990) et Kovacs
On a toutefois constaté que les milieux nutritifs les meilleurs ne permettaient pas d'augmenter la teneur en acides aminés au sein des cytoplasmes cellulaires.
Granstein et coll. (The Jal of Investigative Dermatology suppl. déc.1990) et Kovacs
On a toutefois constaté que les milieux nutritifs les meilleurs ne permettaient pas d'augmenter la teneur en acides aminés au sein des cytoplasmes cellulaires.
Or on sait que la synthèse du collagène nécessite un apport important en acides aminés.
II n'est notamment pas possible d'accroître de manière significative la teneur en acide ascorbique d'un milieu nutritif en raison du pH ou des modifications de la pression osmotique lorsque celui-ci est neutralisé.
La demande de brevet déposée le même jour pour "Vecteurs vésiculaires infracellulaires et leur application dans les compositions cosmétiques" décrit et revendique certains vecteurs vésiculaires infracellulaires comportant des ligands métaboliques aptes à s'exprimer à l'intérieur et à l'extérieur de leur structure.
Les inventeurs ont pu déterminer que les aptitudes que présentent l'ensemble de ces vecteurs vésiculaires dans le contrôle de la synthèse du collagène par les fibroblastes leur permettaient de trouver des applications spécialement intéressantes dans la réalisation de milieux de synthèse et de culture des fibroblastes.
En effet l'utilisation de ces vecteurs vésiculaires infracellulaires permet d'ajouter au milieu de culture des éléments nutritifs n'intervenant ni dans le pH ni dans l'expression de la pression osmotique.
L'invention concerne donc des milieux synthétiques pour la culture dès fibroblastes contenant des vecteurs vésiculaires infracellu laires comportant des ligands métaboliques aptes à s'exprimer à l'intérieur et à l'extérieur de leur structure.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les vecteurs sont des vecteurs infracellulaires d'affinité spécifique dont la composition membranaire, modifiée par introduction de ligands métaboliques, entraîne une modulation de l'activité de synthèse de la cellule ciblée.
Ces ligands métaboliques sont choisis de préférence parmi les initiateurs et les modulateurs de la synthèse cellulaire dotés de fonction ou radical lipophile par acylation, tels que les esters gras de l'acide ascorbique et notamment son palmitate, le palmitate d'hydrolysat de collagène, et les esters gras de l'hydroxyproline et plus spécialement son palmitate.
L'acide ascorbique est notamment immobilisé au sein du vecteur sous forme d"ester d'acide gras, ce qui évite toute fuite de composé.
L'hydrophilie de la membrane du vecteur est obtenue par la fixation d'amide grasse (lipoaminoacide) à l'extérieur du vecteur.
On voit tout l'intérêt du transport par un même vecteur d'un stimulant de la synthèse de collagène modifié pour une meilleure encapsulation et d'éléments précurseurs de la synthèse des fibroblastes.
Dans la présente description, le terme vecteur vésiculaire (ou, pour simplifier "vecteur") s'appliquera à tous vésicules, capsules ou sphères artificielles d'un diamètre qui peut aller de 30 à 1000 nanomètres, et qui sont mis en oeuvre pour incorporer une substance active soit dans un milieu aqueux remplissant le volume intérieur du vecteur soit dans la paroi même dudit vecteur puis pour transporter cette substance active vers un site où elle sera libérée et utilisée à différentes fins.
Selon l'invention l'utilisation des vecteurs vésiculaires cités plus haut en tant que vecteurs de molécules bioactives aptes à stimuler la synthèse des collagènes par des cellules comme les fibroblastes ou à inhiber cette synthèse et à induire la synthèse d'enzymes de dégradation renforce ou modifie considérablement l'action de ces molécules ; ils agissent de plus comme modificateurs de leur cytotoxicité ce qui présente un intérêt considérable dans leur application dans les milieux de synthèse et de culture des fibroblastes.
Dans les expériences décrites ci-après on a utilisé plus spécifiquement le palmitate d'ascorbyle, des peptides dérivés du collagène, et le palmitate d'hydroxyproline.
Les résultats des essais présentés ci-après ont été obtenus selon la méthodologie suivante:
Conditions de culture : les fibroblastes sont obtenus à partir d'explants de peau humaine. Les cellules sont maintenues en culture dans du milieu DMEM (Gibco) additionné de 10 % de sérum de veau foetal (Gibco) et d'antibiotiques (pénicilline 100 U/ml, streptomycine 100 Fg/ml). Les subcultures sont réalisées par trypsination (Trypsin-EDTA, Gibco). Les cellules sont utilisées du 2e au 10e passage.
Conditions de culture : les fibroblastes sont obtenus à partir d'explants de peau humaine. Les cellules sont maintenues en culture dans du milieu DMEM (Gibco) additionné de 10 % de sérum de veau foetal (Gibco) et d'antibiotiques (pénicilline 100 U/ml, streptomycine 100 Fg/ml). Les subcultures sont réalisées par trypsination (Trypsin-EDTA, Gibco). Les cellules sont utilisées du 2e au 10e passage.
Conditions de traitements : Les cultures de fibroblastes témoins se réfèrent aux cultures avec vecteurs sans principe actif, en quantité similaire aux autres traitements.
Les cultures traitées avec la molécule en solution se réfèrent aux conditions de la culture témoin et de la molécule sous forme soluble.
Les cultures traitées avec la forme vectoriale de la molécule impliquent que la molécule active soit inclue préalablement dans les vecteurs.
Test de prolifération cellulaire (test MTT) : après ensemencement, les cellules sont incubées trois jours avec du milieu contenant les molécules à tester.
Puis on ajoute le sel de tétrazolium jaune (5 mg / ml).
II est réduit par les réductases mitochondriales des cellules vivantes en un produit formazan violet qui est ensuite solubilisé par de l'HCl 0,04 N dans de l'isopropanol. La réaction colorée est lue à une longueur d'onde de 570 nm par un Multiskan Titertek (Flow Laboratories) et exprimée en densité optique.
Evaluation des collagènes solubles par dosaae radioimmunologique: On prélève 100 cul de surnageant de culture et on y ajoute 100 FI d'anticorps anticollagène de type I ou anti-collagène de type III et 200 l de PBS.
Après 24 heures à 4 C, on ajoute 100 FI de collagène de type I ou de type III marqué à l'iode 125.
On sépare ensuite de l'antigène libre l'antigène lié à l'anticorps par précipitation avec 100 FI d'antisérum de chèvre anti-lgG de lapin en présence de polyéthylène glycol (PEG) 6000. Après centrifugation on mesure la radioactivité du précipité à l'aide d' un compteur LKB 1260 multigamma.
Mesure de l'activité collagénasipue dans le milieu de culture
On mesure la collagénase interstitielle qui dégrade les collagènes interstitiels natifs de type H.
On mesure la collagénase interstitielle qui dégrade les collagènes interstitiels natifs de type H.
a) Préparation du substrat : le collagène de type I, marqué au carbone-14, en solution dans CH3COOH 0,1 M est neutralisé à pH 7,4 par du Tris 1 M et dilué avec le tampon NaCI 0,15 M/CaCl2, 4 mM/Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 contenant du
NEM 0,5 mM et du PMSF 0,1 mM à raison de 10000 cpm/100R1 substrat (= 10000 cpm/essai).
NEM 0,5 mM et du PMSF 0,1 mM à raison de 10000 cpm/100R1 substrat (= 10000 cpm/essai).
b) Dosage de la collagénase 100 rI de milieu sont activés par 10 cil de trypsine (1 mg/ml) à 37 C pendant 10 mn, suivi de l'addition de 10 FI de SBTI (5 mg/ml) 10 mn à température ambiante. 100 rI de milieu sont aussi testés sans activation par la trypsine (mesure de la forme active de l'enzyme).
Le substrat (10000 cpm/essai) est ajouté, éventuellement en présence d'EDTA 25 mM, le volume final étant de 250 zI.
La réaction se déroule pendant 18 h à 25 C puis est stoppée par addition de 20 l d'EDTA 250 mM (10 mn à température ambiante). Le mélange est ensuite chauffé 10 mn à 39 C. Le collagène non dégradé est précipité par l'éthanol à la concentration finale de 18 % (30 mn à température ambiante). Finalement, le mélange est centrifugé à 6000 g pendant 30 mn à 4 C. Des aliquots de 200 FI des surnageants sont mélangés avec 5 ml de liquide scintillant aqueux puis comptés pour leur radioactivité. Une unité de collagénase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour dégrader 1 g de collagène natif par heure à 25 C.
L'étude de l'influence des vecteurs vésiculaires infracellulaires selon l'invention et de l'intérêt qu'ils présentent pour la réalisation de milieux de culture et de synthèse du collagène va maintenant être décrite en détail pour chacune des molécules.
PALMITATE D' ASCORBYLE
L'incorporation de palmitate d'ascorbyle dans les vecteurs potentialise son action sur la synthèse de collagène par les fibroblastes. En effet la moitié de la dose de palmitate d'ascorbyle (12,5 lig/ml) incorporé aux vecteurs selon l'invention est capable d'induire le même niveau de synthèse de collagène de type I que le double de sa dose (25 seg/ml) sous forme soluble. L'effet du palmitate d'ascorbyle incorporé aux vecteurs selon l'invention est encore plus forte sur la synthèse de collagène de type III.
L'incorporation de palmitate d'ascorbyle dans les vecteurs potentialise son action sur la synthèse de collagène par les fibroblastes. En effet la moitié de la dose de palmitate d'ascorbyle (12,5 lig/ml) incorporé aux vecteurs selon l'invention est capable d'induire le même niveau de synthèse de collagène de type I que le double de sa dose (25 seg/ml) sous forme soluble. L'effet du palmitate d'ascorbyle incorporé aux vecteurs selon l'invention est encore plus forte sur la synthèse de collagène de type III.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après.
TABLEAU 1
Stimulation de la synthèse de collagène par le palmitate d'ascorbvle après 48 h de
culture
Collagène I Collagène III
ng/ml ng/ml fibroblastes + vecteurs 67 # 13 < 20 fibroblastes + palmitate d'ascorbyle en solution: 12,5 g/ml 668a,b#71 468a,b#41 fibroblastes + vecteurs chargés en palmitate d'ascorbyle 12,5 lig/ml 950 a,b # 58 882 a,b # 64 fibroblastes + palmitate d'ascorbyle en solution 25 g/ml 952 axe 81 781 a,b.55 fibroblastes + vecteurs chargés en palmitate d'ascorbyle 25 g/l 1275a,b#114 1035a,b#95 a Significatif (p < 0,05) par rapport aux fibroblastes + vecteurs (contrôle) b Significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule soluble
Ces résultats laissent apparaître tout l'intérêt de l'utilisation de ces vecteurs vésiculaires infracellulaires pour la préparation de milieux de culture permettant une forte production de collagène par les fibroblastes en utilisant une faible dose de palmitate d'ascorbyle.
Stimulation de la synthèse de collagène par le palmitate d'ascorbvle après 48 h de
culture
Collagène I Collagène III
ng/ml ng/ml fibroblastes + vecteurs 67 # 13 < 20 fibroblastes + palmitate d'ascorbyle en solution: 12,5 g/ml 668a,b#71 468a,b#41 fibroblastes + vecteurs chargés en palmitate d'ascorbyle 12,5 lig/ml 950 a,b # 58 882 a,b # 64 fibroblastes + palmitate d'ascorbyle en solution 25 g/ml 952 axe 81 781 a,b.55 fibroblastes + vecteurs chargés en palmitate d'ascorbyle 25 g/l 1275a,b#114 1035a,b#95 a Significatif (p < 0,05) par rapport aux fibroblastes + vecteurs (contrôle) b Significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule soluble
Ces résultats laissent apparaître tout l'intérêt de l'utilisation de ces vecteurs vésiculaires infracellulaires pour la préparation de milieux de culture permettant une forte production de collagène par les fibroblastes en utilisant une faible dose de palmitate d'ascorbyle.
PALMITATE D'HYDROLYSAT DE COLLAGENE
Des peptides de collagène sous forme de palmitate ont été utilisés pour stimuler la synthèse des collagènes de type I et III de même que la synthèse de la collagénase interstitielle (MMP-1)
On a pu observer que I'hydrolysat de collagène incorporé dans les vecteurs selon l'invention est moins toxique que sous forme soluble. En effet, une cytotoxicité est détectée à partir d'une dose de 20 g / ml pour la molécule soluble (Tableau 2).
Des peptides de collagène sous forme de palmitate ont été utilisés pour stimuler la synthèse des collagènes de type I et III de même que la synthèse de la collagénase interstitielle (MMP-1)
On a pu observer que I'hydrolysat de collagène incorporé dans les vecteurs selon l'invention est moins toxique que sous forme soluble. En effet, une cytotoxicité est détectée à partir d'une dose de 20 g / ml pour la molécule soluble (Tableau 2).
TABLEAU 2
Analvse de la prolifération des fibroblastes traités avec le Palmitate
d'hydrolysat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Solution 0,486 # 0,026 0,481 # 0,0090,450 + 0,009 0,290a t 0,011 0,093a t 0,009 0,037a t 0,004 vecteur 0,468 t 0,019 0,476 t 0,014 0,478 + 0,012 0,487C# 0,013 0,496C t 0,015 0,493C# 0,011 48 heures
Solution 0,488#0,012 0,474#0,018 0,470#0,008 0,138#0,017 0,058a#0,010 0,033a#0,008 vecteur 0,493 t 0,017 0,489 t 0,0070,494 t 0,008 0,498c~0,017 0,492C#0,013 0,482C#0,006 72 heures
Solution0,491 t 0,0100,492 t 0,021 0,466 t 0,019 0,114as 0,007 0,043a+0,003 0,023a+ # 0,005 vecteur 0,497 t 0,017 0,489 t 0,0160,491 + 0,011 0,478C#0,012 0,502C t 0,021 0,479C# 0,009
Les données sont exprimées en densité optique mesurée après traitement sur des cultures contenant 1 cellules par puits a significatif (p < 0,05) par rapport aux doses les plus faibles c significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
En ce qui concerne la synthèse du collagène, on a noté qu'à partir d'une dose de 5 g / ml, I'hydrolysat de collagène stimule de façon significative la synthèse du collagène de type I. Cet effet est observé en utilisant la molécule incorporée aux vecteurs (tableaux 3 et 4)
TABLEAU 3
Analyse de la synthèse de collagène de type I par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 272#34 253#22 228#8 187a#10 160a#15 135a#10
Solution 274#28 211a#12 203a#13 63a,b#2 49a,b#13 30a,b#3
Vecteur 239#23 297#28 213#20 229C#21 225b,c#27 221b,c#5 48 heures
Témoin 406#37 360#11 299a#27 258a#4 207a#5 183a#5
Solution 454#65 358#13 272a#11 80a,b#5 31a,b#8 41a,b#4
Vecteur 536b#32 502b,c#26 470b,c#48 357a,b,c#16 330a,b,c#16 304a,b,c#24 72 heures
Témoin 454 + 37 383 # 25 249a i40 246a # 3 232a s 8 219a #
Solution 456#29 353a#9 302a#5 97a,b#5 19a,b#5 14a,b#3
Vecteur 601#128 577b,c#41 457b,c#13 352a,b,c#20 360a,b,c#23 325a,b,c#10
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
TABLEAU 4
Analvse de la svnthèse de collagène de tvpe III par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 258#57 253#43 183#18 183#30 127a#22 49a#3
Solution 318#67 292#25 277b#17 25a,b#1 23a,b#2 19a,b#1
Vecteur 309#45 311#12 261c#9 255c#34 211b,c#29 207a,b,c#20 48 heures Témoin 498#74 260#15 206a#30 210a#10 183a#21 106a#6
Solution 744#123 492a,b#15 312a,b#23 27a,b#1 20a,b#3 25a,b#2
Vecteur 780b#76 677b,c#12 665b,c#1205 518a,b,c#29 382a,b,c#48 309a,b,c#26 72 heures
Témoin 507#30 268a#8 182a#37 163a#12 173a#29 128a#1
Solution 569#61 446b#39 352a,b#44 31a,b#3 18a,b#1 15a,b#2
Vecteur 680b#39 793b,c#77 480a,b,c#47 415a,b,c#33 352a,b,c#20 342a,b,c#22
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
La synthèse du collagène de type III n'est stimulée qu'avec une dose de 10 g / ml et uniquement lorsque l'hydrolysat de collagène est incorporé aux vecteurs vésiculaires infracellulaires selon l'invention.
Analvse de la prolifération des fibroblastes traités avec le Palmitate
d'hydrolysat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Solution 0,486 # 0,026 0,481 # 0,0090,450 + 0,009 0,290a t 0,011 0,093a t 0,009 0,037a t 0,004 vecteur 0,468 t 0,019 0,476 t 0,014 0,478 + 0,012 0,487C# 0,013 0,496C t 0,015 0,493C# 0,011 48 heures
Solution 0,488#0,012 0,474#0,018 0,470#0,008 0,138#0,017 0,058a#0,010 0,033a#0,008 vecteur 0,493 t 0,017 0,489 t 0,0070,494 t 0,008 0,498c~0,017 0,492C#0,013 0,482C#0,006 72 heures
Solution0,491 t 0,0100,492 t 0,021 0,466 t 0,019 0,114as 0,007 0,043a+0,003 0,023a+ # 0,005 vecteur 0,497 t 0,017 0,489 t 0,0160,491 + 0,011 0,478C#0,012 0,502C t 0,021 0,479C# 0,009
Les données sont exprimées en densité optique mesurée après traitement sur des cultures contenant 1 cellules par puits a significatif (p < 0,05) par rapport aux doses les plus faibles c significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
En ce qui concerne la synthèse du collagène, on a noté qu'à partir d'une dose de 5 g / ml, I'hydrolysat de collagène stimule de façon significative la synthèse du collagène de type I. Cet effet est observé en utilisant la molécule incorporée aux vecteurs (tableaux 3 et 4)
TABLEAU 3
Analyse de la synthèse de collagène de type I par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 272#34 253#22 228#8 187a#10 160a#15 135a#10
Solution 274#28 211a#12 203a#13 63a,b#2 49a,b#13 30a,b#3
Vecteur 239#23 297#28 213#20 229C#21 225b,c#27 221b,c#5 48 heures
Témoin 406#37 360#11 299a#27 258a#4 207a#5 183a#5
Solution 454#65 358#13 272a#11 80a,b#5 31a,b#8 41a,b#4
Vecteur 536b#32 502b,c#26 470b,c#48 357a,b,c#16 330a,b,c#16 304a,b,c#24 72 heures
Témoin 454 + 37 383 # 25 249a i40 246a # 3 232a s 8 219a #
Solution 456#29 353a#9 302a#5 97a,b#5 19a,b#5 14a,b#3
Vecteur 601#128 577b,c#41 457b,c#13 352a,b,c#20 360a,b,c#23 325a,b,c#10
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
TABLEAU 4
Analvse de la svnthèse de collagène de tvpe III par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 258#57 253#43 183#18 183#30 127a#22 49a#3
Solution 318#67 292#25 277b#17 25a,b#1 23a,b#2 19a,b#1
Vecteur 309#45 311#12 261c#9 255c#34 211b,c#29 207a,b,c#20 48 heures Témoin 498#74 260#15 206a#30 210a#10 183a#21 106a#6
Solution 744#123 492a,b#15 312a,b#23 27a,b#1 20a,b#3 25a,b#2
Vecteur 780b#76 677b,c#12 665b,c#1205 518a,b,c#29 382a,b,c#48 309a,b,c#26 72 heures
Témoin 507#30 268a#8 182a#37 163a#12 173a#29 128a#1
Solution 569#61 446b#39 352a,b#44 31a,b#3 18a,b#1 15a,b#2
Vecteur 680b#39 793b,c#77 480a,b,c#47 415a,b,c#33 352a,b,c#20 342a,b,c#22
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
La synthèse du collagène de type III n'est stimulée qu'avec une dose de 10 g / ml et uniquement lorsque l'hydrolysat de collagène est incorporé aux vecteurs vésiculaires infracellulaires selon l'invention.
Ce même traitement stimule de manière significative la synthèse de collagénase interstitielle (MMP-1) que ce soit sous forme soluble ou sous forme vectoriale. Il faut cependant noter une stimulation significativement plus forte lorsque les molécules sont incorporées dans les vecteurs (tableau 5) .
TABLEAU 5
Dosaae de l'activité de la collaaénase interstitielle (MMP-1) produite par des
fibroblastes traités avec le Palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme rg/ml
1 5 10
Solution 155a#110 1158ai152 1144ai41
Vecteur 2372a,b#328 2463a,biî 67 2050a,bi87
Témoin : 438 # 82
Ces données sont exprimées en mU/ml des surnageants des cultures avec 4.105 cellules et mesurées après 48 heures de traitement.
Dosaae de l'activité de la collaaénase interstitielle (MMP-1) produite par des
fibroblastes traités avec le Palmitate d'hvdrolvsat de collagène
Forme rg/ml
1 5 10
Solution 155a#110 1158ai152 1144ai41
Vecteur 2372a,b#328 2463a,biî 67 2050a,bi87
Témoin : 438 # 82
Ces données sont exprimées en mU/ml des surnageants des cultures avec 4.105 cellules et mesurées après 48 heures de traitement.
a significatif (p < 0,05) par rapport au témoin b significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble.
Les résultats ci-dessus laissent apparaître tout l'intérêt de la forme vectoriale pour la préparation de milieux de culture destinés à stimuler la synthèse de collagène de type I et de son enzyme de dégradation (collagénase interstitielle) par les fibroblastes. Les molécules incorporées dans les vecteurs sont en outre moins toxiques
PALMITATE D'HYDROXYPROLINE
Le traitement de cultures de fibroblastes avec le palmitate d'hydroxyproline montre que la forme soluble est cytotoxique à partir de 20 g / ml.
PALMITATE D'HYDROXYPROLINE
Le traitement de cultures de fibroblastes avec le palmitate d'hydroxyproline montre que la forme soluble est cytotoxique à partir de 20 g / ml.
Cependant son incorporation dans les vecteurs vésiculaires infracellulaires selon l'invention élimine cet effet cytotoxique même à une dose de 80 g / ml (tableau 6)
TABLEAU 6
Analyse de la prolifération des fibroblastes traités avec le Palmitate
d'hydroxyproline
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Solution 0,493 t 0,0290,492 t 0,016 0,502 t 0,019 0,457 i 0,022 0,147a+ 0,019 0,060a+ 0,022
Vecteur 0,483 t 0,026 0,479 t 0,029 0,485 t 0,033 0,502 #0,037 0,4870t 0,019 0,485C# 0,023 48 heures
Solution0,494 s 0,012 0,513 t 0,025 0,511 t 0,020 0,471 #0,028 0,118a#0,018 0,060a # 0,016
Vecteur 0,493 #0,021 0,495 t 0,025 0,487 t 0,035 0,519 t 0,024 0,545C#0,021 0,556a,c#0,022 72 heures
Solution 0,490#0,0190 0,500#0,028 0,496#0,017 0,414a#0,010 0,063a#0,021 0,033a#0,012
Vecteur 0,505 s 0,018 0,515 #0,0170 0,506 +0,020 0,498c# 0,015 0,495c s 0,018 0,520c# 0,022
Les données sont exprimées en densité optique mesurée après traitement sur des cultures contenant 104 cellules par puit a significatif (p < 0,05) par rapport aux doses plus faibles c significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
La synthèse de collagène est stimulée de façon significative par la forme vectoriale de la molécule à une dose de 10 g / ml (tableaux 7 et 8).
TABLEAU 6
Analyse de la prolifération des fibroblastes traités avec le Palmitate
d'hydroxyproline
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Solution 0,493 t 0,0290,492 t 0,016 0,502 t 0,019 0,457 i 0,022 0,147a+ 0,019 0,060a+ 0,022
Vecteur 0,483 t 0,026 0,479 t 0,029 0,485 t 0,033 0,502 #0,037 0,4870t 0,019 0,485C# 0,023 48 heures
Solution0,494 s 0,012 0,513 t 0,025 0,511 t 0,020 0,471 #0,028 0,118a#0,018 0,060a # 0,016
Vecteur 0,493 #0,021 0,495 t 0,025 0,487 t 0,035 0,519 t 0,024 0,545C#0,021 0,556a,c#0,022 72 heures
Solution 0,490#0,0190 0,500#0,028 0,496#0,017 0,414a#0,010 0,063a#0,021 0,033a#0,012
Vecteur 0,505 s 0,018 0,515 #0,0170 0,506 +0,020 0,498c# 0,015 0,495c s 0,018 0,520c# 0,022
Les données sont exprimées en densité optique mesurée après traitement sur des cultures contenant 104 cellules par puit a significatif (p < 0,05) par rapport aux doses plus faibles c significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
La synthèse de collagène est stimulée de façon significative par la forme vectoriale de la molécule à une dose de 10 g / ml (tableaux 7 et 8).
TABLEAU 7
Analvse de la svnthèse de collagène type I par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hydroxyproline
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 246#46 275#22 292#3 259#8 221#11 145a#12 Solution 268#18 232#10 166a,b#15 128a,b#4 61a,b#8 41a,b#2
Vecteur 268#10 288c#14 253c#11 251c#16 184a,c#31 164a,c#7 48 heures
Témoin 487#67 518#0 449#57 392#22 345a#18 298a#15
Solution 519#37 360a,b#42 260a,b#7 227a,b#11 96a,b#6 49a,b#10
Vecteur 528 t 30 605c i 43 423ci69 421a,c#9 422a,b,c#26 401 a,b,c#18 72 heures
Témoin 431#8 446#15 446#52 499#39 368a#18 297a#5
Solution 513#77 470#5 281a,b#15 223a,b#29 73a,b#10 49a,b#3
Vecteur 483#46 516#78 524c#17 526c#90 387a,c#10 354a,b,c#20
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
TABLEAU 8 Analvse de la synthèse de collagène type III par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hydroxyproline
Forme Fg/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 239#33 221#31 224#17 211#14 137a#9 81a#10
Solution 295#24 281#16 154a,b#13 105a,b#6 25a,b#2 24a,b#4
Vecteur 272 i 21 292b i 2 290b,c#16 313b,ct22 215a,b,c#14 119a,b,c#10 48 heures
Témoin 624#83 528#47 376a#36 385a#14 369a#23 310a#14
Solution 588#69 519#20 330a#35 253a,b#18 36a,b#5 18a,b#3
Vecteur 699#177 702b,c#14 509b,c#65 525b,c#14 532b,c#91 494b,c#20 72 heures
Témoin 454#41 450#46 405#49 385#18 313a#29 280a#18
Solution 628#161 548#24 301a#23 240a,b#11 29a,b#1 24a,b#1
Vecteur 519#108 558b#7 616b,c#91 637b,c#38 444b,c#27 419b,c#26
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble.
Analvse de la svnthèse de collagène type I par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hydroxyproline
Forme g/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 246#46 275#22 292#3 259#8 221#11 145a#12 Solution 268#18 232#10 166a,b#15 128a,b#4 61a,b#8 41a,b#2
Vecteur 268#10 288c#14 253c#11 251c#16 184a,c#31 164a,c#7 48 heures
Témoin 487#67 518#0 449#57 392#22 345a#18 298a#15
Solution 519#37 360a,b#42 260a,b#7 227a,b#11 96a,b#6 49a,b#10
Vecteur 528 t 30 605c i 43 423ci69 421a,c#9 422a,b,c#26 401 a,b,c#18 72 heures
Témoin 431#8 446#15 446#52 499#39 368a#18 297a#5
Solution 513#77 470#5 281a,b#15 223a,b#29 73a,b#10 49a,b#3
Vecteur 483#46 516#78 524c#17 526c#90 387a,c#10 354a,b,c#20
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble
TABLEAU 8 Analvse de la synthèse de collagène type III par des fibroblastes traités avec le
palmitate d'hydroxyproline
Forme Fg/ml
1 5 10 20 40 80 24 heures
Témoin 239#33 221#31 224#17 211#14 137a#9 81a#10
Solution 295#24 281#16 154a,b#13 105a,b#6 25a,b#2 24a,b#4
Vecteur 272 i 21 292b i 2 290b,c#16 313b,ct22 215a,b,c#14 119a,b,c#10 48 heures
Témoin 624#83 528#47 376a#36 385a#14 369a#23 310a#14
Solution 588#69 519#20 330a#35 253a,b#18 36a,b#5 18a,b#3
Vecteur 699#177 702b,c#14 509b,c#65 525b,c#14 532b,c#91 494b,c#20 72 heures
Témoin 454#41 450#46 405#49 385#18 313a#29 280a#18
Solution 628#161 548#24 301a#23 240a,b#11 29a,b#1 24a,b#1
Vecteur 519#108 558b#7 616b,c#91 637b,c#38 444b,c#27 419b,c#26
Les données sont exprimées en ng/ml a significatif (p > 0,05) par rapport aux doses plus faibles b significatif (p > 0,05) par rapport au témoin c significatif (p > 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble.
L'activité collagénolytique des fibroblastes est modulée par l'utilisation du palmitate d'hydroxyproline et ses effets sont en relation avec la forme d'utilisation vectoriale ou soluble. La forme soluble stimule de manière significative la synthèse de la collagénase même avec une dose de 1 g I ml . Par contre l'utilisation de la forme vectoriale du palmitate d'hydroxyproline réduit progressivement, de façon dépendante, la synthèse de collagénase (tableau 9).
TABLEAU 9
Dosaae de l'activité de la collaaénase interstitielle (MMP-1) produite par des
fibroblastes traités avec le Palmitate d'hydroxyproline
Forme rg/ml
1 5 10
Solution 1273a#154 1934a#49 2189a#118
Vecteur 1648a,b# 166 1090a,b+66 604a i 101
Témoin : 438 + 82
Ces données sont exprimées en mU/ml des surnageants des cultures avec 4.105 cellules et mesurées après 48 heures de traitement.
Dosaae de l'activité de la collaaénase interstitielle (MMP-1) produite par des
fibroblastes traités avec le Palmitate d'hydroxyproline
Forme rg/ml
1 5 10
Solution 1273a#154 1934a#49 2189a#118
Vecteur 1648a,b# 166 1090a,b+66 604a i 101
Témoin : 438 + 82
Ces données sont exprimées en mU/ml des surnageants des cultures avec 4.105 cellules et mesurées après 48 heures de traitement.
a significatif (p < 0,05) par rapport au témoin b significatif (p < 0,05) par rapport à la molécule sous forme soluble.
La forme vectoriale permet donc de préparer des milieux de culture avec le palm itate d'hydroxyproline incorporé dans les vecteurs vésiculaires infracellu laires selon l'invention pour stimuler la synthèse de collagène sans stimuler la synthèse de collagénase.
On a pu enfin déterminer l'intérêt de l'utilisation, comme modulateurs de la synthèse cellulaire, de peptides dérivés de l'élastine.
Les milieux de culture selon l'invention trouvent en particulier des applications intéressantes dans la production de peptides de la matrice extracellulaire et la production de peptides à activité enzymatique.
Claims (9)
1 - Milieux synthètiques pour la culture cellulaire, caractérisés en ce qu'ils contiennent des vecteurs vésiculaires infracellulaires comportant des ligands métaboliques aptes à s'exprimer à l'intérieur et à l'extérieur de leur structure.
2 - Milieux de synthèse et de culture cellulaire selon la revendication 1 caractérisés en ce que les vecteurs sont des vecteurs infracellulaires d'affinité spécifique dont la composition membranaire, modifiée par introduction de ligands métaboliques, entraîne une modulation de l'activité de synthèse de la cellule ciblée.
3 - Milieux de synthèse et de culture selon la revendication 2 caractérisés en ce que les ligands métaboliques sont choisis parmi les initiateurs et les modulateurs de la synthèse cellulaire dotés de fonction ou radical lipophile par acylation.
4 -Milieux de synthèse et de culture selon la revendication 2 et la revendication 3, caractérisés en ce que les initiateurs de la synthèse cellulaire sont choisis parmi les esters gras de l'acide ascorbique et notamment son palmitate.
5 - Milieux de synthèse et de culture selon la revendication 2 et la revendication 3, caractérisés en ce que le modulateur de la synthèse cellulaire est le palmitate d'hydrolysat de collagène.
6 - Milieux de synthèse et de culture selon la revendication 2 et la revendication 3, caractérisés en ce que les modulateurs de la synthèse cellulaire sont choisis parmi les esters gras de l'hydroxyproline et plus spécialement son palmitate.
7 - Milieux de synthèse et de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que les vecteurs vésiculaires sont choisis parmi les vésicules, capsules ou sphères artificielles d'un diamètre qui peut aller de 30 à 1000 nanomètres, mis en oeuvre pour incorporer une substance active soit dans un milieu aqueux remplissant le volume intérieur du vecteur soit dans la paroi même dudit vecteur puis pour transporter cette substance active vers un site où elle sera libérée et utilisée à différentes fins.
8 - Application des milieux de culture selon l'une quelconque des revendic ations 1 à 7 à la production de peptides de la matrice extracellulaire.
9 - Application des milieux de culture selon l'une quelconque des revendic ations 1 à 7 à la production de peptides à activité enzymatique.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9112598A FR2682121A1 (fr) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | Milieux synthetiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications. |
| EP92420355A EP0537092A1 (fr) | 1991-10-08 | 1992-10-08 | Vecteurs vésiculaires infracellulaires et leurs applications dans les compositions cosmétiques, médicamenteuses et les milieux de culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9112598A FR2682121A1 (fr) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | Milieux synthetiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2682121A1 true FR2682121A1 (fr) | 1993-04-09 |
| FR2682121B1 FR2682121B1 (fr) | 1994-12-23 |
Family
ID=9417857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9112598A Granted FR2682121A1 (fr) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | Milieux synthetiques pour la culture des fibroblastes et leurs applications. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2682121A1 (fr) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2540381A1 (fr) * | 1983-02-08 | 1984-08-10 | Dior Sa Parfums Christian | Procede pour stimuler la croissance des cellules; composition cosmetique, pharmaceutique et composition complementaire pour milieu de culture cellulaire appliquant ce procede |
| EP0160286A2 (fr) * | 1984-04-28 | 1985-11-06 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Liposomes |
| WO1987006460A1 (fr) * | 1986-04-22 | 1987-11-05 | L'oreal | Dispersion de spherules lipidiques |
| EP0424282A1 (fr) * | 1989-10-19 | 1991-04-24 | ERPHAR Société d'Etudes et de Recherches Pharmaceutiques et Cosmétiques | Préparation cosmétique de bronzage |
-
1991
- 1991-10-08 FR FR9112598A patent/FR2682121A1/fr active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2540381A1 (fr) * | 1983-02-08 | 1984-08-10 | Dior Sa Parfums Christian | Procede pour stimuler la croissance des cellules; composition cosmetique, pharmaceutique et composition complementaire pour milieu de culture cellulaire appliquant ce procede |
| EP0160286A2 (fr) * | 1984-04-28 | 1985-11-06 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Liposomes |
| WO1987006460A1 (fr) * | 1986-04-22 | 1987-11-05 | L'oreal | Dispersion de spherules lipidiques |
| EP0424282A1 (fr) * | 1989-10-19 | 1991-04-24 | ERPHAR Société d'Etudes et de Recherches Pharmaceutiques et Cosmétiques | Préparation cosmétique de bronzage |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MATRIX vol. 10, no. 6, Décembre 1990, STUTTGART, ALLEMAGNE pages 373 - 377; H. EMONARD ET AL.: 'Reconstituted basement membrane matrix stimulates interstitial procollagenase synthesis by human fibroblasts in culture.' * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2682121B1 (fr) | 1994-12-23 |
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