KR20110126166A

KR20110126166A - 장기 효과를 갖는 단백질 전달을 위한 단일 단백질 나노캡슐

Info

Publication number: KR20110126166A
Application number: KR1020117023639A
Authority: KR
Inventors: 윤펭 루; 밍 얀; 주안주안 두
Original assignee: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2011-11-22
Also published as: IL215063A0; CA2754885A1; AU2010224253A2; BRPI1009418A2; SG174287A1; WO2010104865A2; EP2406173A2; CN102438936A; JP2012519733A; AU2010224253A1; EP2406173A4; US20110318297A1; US9289504B2; WO2010104865A3

Abstract

단일-단백질 코어 및 상기 단백질 코어에 공유결합에 의해 결합된 얇은 폴리머 쉘(shell)을 갖는 단백질 나노입자.

Description

장기 효과를 갖는 단백질 전달을 위한 단일 단백질 나노캡슐{Single protein nanocapsules for protein delivery with long-term effect}

관련 출원의 상호-참조

본 출원은 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 통합되는, 2009년 3월 9일자로 제출된 미국 가특허출원 제61/158,588호 및 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 통합되는, 2009년 10월 22일자로 제출된 미국 가특허출원 제61/254,121호에 기초한 우선권을 주장한다.

본 발명은 정부의 방어위협감소국(Defense Threat Reducing Agency, DTRA)에 의해 수여받은, 승인번호 제BRBAA07-E-2-0042호의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.

본 발명은 세포내 단백질 전달 비히클(vehicle), 그의 제조 방법, 및 세포 표적으로 단백질을 전달하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

일반적인 진핵 세포는 정상 세포 기능에 관여하는 수천 개의 상이한 단백질을 포함한다. 대부분의 인간 질환은 특정한 단백질의 전신적 또는 국부적인 기능장애와 어떻게든 관련이 있다. 이러한 맥락에서, 단백질 요법 (protein therapy)(Birch 등, Therapeutic Proteins, methods and Protocols, (Humana Press, Totowa), pp. 1-16 2005)은 그와 같은 질환의 치료를 위한 가장 직접적이고 안전한 접근법을 제공한다. 재조합 DNA 기술에 있어서 근래의 진보는 다양한 약학적 단백질(pharmaceutical protein)의 합성을 가능하게 한다 (Nagle 등, Nature Rev. Drug Discov., vol. 2, pp. 75-79, 2003; Brekke 등, Nature Rev. Drug Discov., vol. 2, pp. 52-62, 2003); 그러나, 단백질 요법의 광범위한 사용은, 낮은 세포내 전달 효율 및 프로테아제에 대한 단백질의 낮은(poor) 안정성과 같은, 여러 실질적인 기술적 장벽에 의해 여전히 제한된다.

치료 단백질(therapeutic protein)의 세포내 사용은 암 및 단백질-결핍 질환의 치료에 매우 중요하다(Wadia 등, Protein Transport (Cell-penetrating peptides: Processes and Applications, (CRC Press), p. 365, 2002). 그러나, 세포외 활성 단백질의 광범위한 적용과 비교하여, 세포내 활성 단백질 약물은, 부분적으로는 혈청 중에서의 낮은 안정성 및 세포막을 통한 약한 투과성 때문에, 임상 적용에 있어서 드물다 (Birch 등, Therapeutic Proteins, methods and Protocols, (Humana Press, Totowa), pp. 1-16 2005). 일부 단백질들은 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포외 공간에서 세포 내로 이동할 수 있으나 (Vyas 등, Crit. Rev. Ther, Drug Carrier Syst., vol. 18, pp. 1-76, 2001 ; Sato 등, Adv. Drug De Hv. Rev., vol. 19, pp. 445-467, 1996), 이들은 적절한 세포 구획(compartment)으로 방출되기보다는 엔도좀(endosome) 내에 포획되어 리소좀(lysosome)에서 분해될 수 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위한 노력이 증가하고 있다. 예를 들면, 리포좀-피복(liposome-wrapped) 단백질은 낮은 효율로 세포질로 이동된다는 것이 밝혀졌다 (Straubinger 등, FEBS Lett., vol. 179, pp. 148-154, 1985; Bulmus 등, J. Control Release, vol. 93, pp. 105-120, 2003). 최근에, 여러 소분자 양이온성 펩티드(small cationic peptide)(세포-투과 펩티드(cell-penetrating peptide), CPP로 지칭됨)가 동정되었으며, 단백질 전달을 보조하기 위해 사용되었다 (Fawell 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 664-668, 1994; Morris 등, vol. 19, pp. 1173-1176, 2001); Schwarze 등, Science, vol. 285, pp. 1569-1572, 1999). 현저하게 개선된 세포내 전달 효율 및 세포 내에서의 활성 유지로 인해, 이 전략은 약제학적 적용에 있어서 유망하다. 또한, 이 전략들을 사용하여 단백질을 세포 내로 전달할 수 있더라도, 세포 내에서의 단백질의 낮은 안정성은 치료 단백질의 광범위한 적용을 여전히 방해한다. 다양한 가능성있는 불활성화 인자들 (Fagain 등, Biochim. Biophys. Acta., vol. 1252, pp. 1-14, 1995) 중에서, 혈청 중 프로테아제 소화(protease digestion)는 중요한 인자이며, 성공적인 세포내 단백질 전달을 보장하기 위해 해결될 필요가 있다 (Hooper, N. M. Proteases in Biology and Medicine, (Portland Press, London), 2002).

본 발명의 양태는 단일-단백질 코어(single-protein core) 및 상기 단백질 코어에 공유결합에 의해 결합된(anchored covalently) 얇은 폴리머 쉘(shell)을 갖는 단백질 나노캡슐을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단일-단백질 코어는 복수의 중합가능한 기(polymerizable group)들을 갖는 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 단일-단백질 코어는 단백질 촉매이다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 상기 단백질 촉매의 촉매 활성을 보유한다.

일부 구체예에서, 상기 단일-단백질 코어는 하나 이상의 모노머(monomer) 및 하나 이상의 가교제(crosslinker)와 공중합된다.

일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 추가적으로 표면 개질(surface modification)을 포함한다. 표면 개질제(surface modifier)는 발광 분자(light emitting molecule), 세포-표적화 모이어티(cell-targeting moiety), 펩티드, 단백질, 항체 또는 올리고당일 수 있다. 상기 표면 개질제는 영상화제(imaging agent), 세포 표적화 증진제(cell targeting enhancer) 또는 세포-투과 증진제(cell-penetration enhancer)로서 기능할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 단백질을 하나 이상의 중합가능한 기로 유도체화(derivatize)하고, 유도체화된 단백질을 모노머 단위와 공중합시키는 것에 의해 나노캡슐을 제조하는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 공중합은 가교제를 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 나노캡슐의 표면을 개질시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 세포를 전술된 나노캡슐의 유효 농도에 노출시키는 것에 의해 단백질을 전달하는 방법을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예들이 하기에서 상세하게 설명된다. 구체예들을 기술하는데 있어서, 명료성을 위해 특정한 용어들이 사용되었다. 그러나, 본 발명은 그와 같이 선택된 특정한 용어에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 광범위한 개념을 벗어나지 않으면서 다른 균등한 성분들이 사용될 수 있고, 다른 방법들이 개발될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌들은 각각이 개별적으로 통합되는 것과 마찬가지로, 참조에 의해 통합된다.

본 출원에서 값들의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 경우 하한치 단위의 1/10까지 각각의 사이값, 및 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 사이값들은 본 발명 내에 포함된다. 모든 범위의 말단 값들은 상기 범위에 포함된다.

본 발명의 구체예는 단일-단백질 코어 및 상기 단백질 코어에 공유결합에 의해 결합된 얇은 폴리머 쉘을 갖는 나노캡슐을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 양전하를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 약 5 nm 내지 약 200 nm 사이에서 최대 크기(dimension)를 가질 수 있다. 이 크기는 상기 단일-단백질 코어의 크기 및 상기 얇은 폴리머 쉘의 두께에 따라 달라질 수 있다. 작은 크기 및 전하는 높은 세포내 효율(intracellular efficiency)을 초래한다. 각각의 나노캡슐은 하기 2개의 공유결합에 의해 연결된(covalently-linked) 부위를 포함한다; 단일-단백질 코어 및 얇은 폴리머 네트워크 쉘. 상기 코어-쉘 구조는 단백질분해(proteolysis) 및 열 변성으로부터 단백질을 보호하고, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서의 높은 안정성의 기원이 된다.

본 명세서에서 사용되는, 단일-단백질 코어(single-protein core)는 상기 나노캡슐이 얇은 폴리머 쉘과 함께 단일 기능성 단백질을 포함한다는 것을 의미한다. 빈번하게, 단일 기능성 단백질은 단일 폴리펩티드이다. 목적 단백질이 멀티머(multimer)(예를 들면, 다이머, 호모다이머(homodimer), 헤테로다이머(heterodimer) 등)로서 정상적으로 기능한다면, 단일-단백질 코어는 그 멀티머를 포함한다. 예를 들면, 카스파아제-3(caspase-3, CAS)의 활성형은 다이머이며, 카스파아제-3를 포함하는 나노캡슐은 단일-단백질 코어로서 상기 다이머를 포함한다. 다중 기능을 갖는 융합 단백질이 또한 상기 단일-단백질 코어에 사용될 수 있으나, 하나의 기능적 단위를 형성하기 위해 상호 간에 정상적으로 상호작용하지 않는 복수의 단백질들은 단일-단백질 코어가 아니다. 하나의 기능적 단위를 형성하기 위해 정상적으로 결합하지 않는, 동일한 단백질의 복수의 카피(copy)는 단일-단백질 코어가 아니다.

상기 나노캡슐은 별개의(discrete) 크기 및 낮은 크기 분포를 갖는다. 상기 단일-단백질 코어는 폴리머 코팅 내에 캡슐화(encapsulate)된다. 일부 구체예에서,상기 폴리머 코팅은 가교되어 상기 단백질을 캡슐화하는 폴리머 코팅의 밀도를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 상기 폴리머는 상기 단백질 상의 3개, 4개, 5개, 7개, 10개, 15개, 또는 20개 이상의 위치에서 얇은 폴리머 쉘에 공유결합에 의해 결합된다. 일부 구체예에서, 상기 폴리머는 3개 이상의 위치에서 상기 얇은 폴리머 쉘에 공유결합에 의해 결합된다. 이는 단백질이 폴리머 네트워크 내에 확실하게 캡슐화되도록 한다.

일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 약 5 nm 내지 약 200 nm 사이의 최대 크기를 가질 수 있다. 나노캡슐의 크기는, 부분적으로, 상기 단일-단백질 코어의 크기 및 상기 얇은 폴리머 쉘의 두께에 의존한다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 5 nm 내지 약 100 nm, 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 30 nm 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머 쉘은 약 1 nm 내지 약 20 nm의 두께를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 폴리머 쉘은 약 1 nm 내지 약 10 nm의 두께를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 대략적으로 구형이나, 그의 형태는 단일-단백질 코어의 형태에 따라 다양할 수 있다. 일례로, (예를 들면, 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescence protein, EGFP)과 같이) 약 5 nm의 직경을 가지며, 약 2 nm 두께의 폴리머 쉘을 갖는 단일-단백질 코어는 약 9 nm의 전체 크기를 가질 것이다.

일부 구체예에서, 상기 단백질은 단백질 촉매 (즉, 효소)일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 광 방출과 같은 또다른 기능을 가질 수 있다 (예를 들면, EGFP). 원하는 경우, 개질이 나노캡슐의 형성을 방해하지 않는 한, 화학적으로 개질되거나 또는 공유적으로 개질된 단백질이 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 단백질이 본 발명에 따른 나노캡슐 내에 내입(incorporate)될 수 있으며, 상기 단백질의 유용성에 기반하여 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 미용적(cosmetic) 또는 치료적 적용에 유용하다. 나노입자를 제조하는데 사용되는 예시적인 단백질의 예들은, 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 겨자무 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 수퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 카스파아제-3 및 리파아제를 포함한다. 로다민-B-표지된 HRP, 및 NIR-667-표지된 BSA와 같은, 화학적으로 개질된 단백질이 또한 사용된다. 다양한 서로 다른 적용을 위한 특정한 단백질의 예들이 하기 표에서 제시된다. 단백질의 다른 예들이 당업자에게 자명할 것이다.

일부 구체예에서, 상기 폴리머 쉘은 투과성(permeable)이다. 본 명세서에서 사용되는, 투과성(permeable)은 분자들이 상기 폴리머 쉘의 공극(pore) 또는 구멍(hole)을 통해서, 또는 폴리머를 통한 확산에 의해, 상기 폴리머 쉘을 통과할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 기질, 보조인자(co-factor) 및 기타 화학 성분들이 상기 폴리머 쉘을 통과할 수 있어, 상기 나노캡슐이 단일-단백질 코어의 활성을 유지할 수 있게 한다.

이 나노캡슐 내의 단백질은 비개질된(unmodified) 단백질에 비해 더 안정하다. 안정성은 시간 경과에 따른 단백질 활성의 소실 또는 단백질의 분해 또는 변성에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 프로테아제에 의한 분해에 저항성을 갖는다. 얇은 폴리머 쉘은 프로테아제 효소에 대한 단백질 코어의 노출을 감소시킨다. 결과적으로, 상기 단백질 코어의 활성은 프로테아제의 존재 하에서 (예를 들면, 생체 내, 혈청 내, 또는 세포 내에서), 보호되지 않은 천연(native) 단백질에 비해 보다 길게 지속된다. 상기 얇은 폴리머 쉘은 단백질 구조를 안정화시키고, 상기 단백질의 응집(aggregation)을 방지한다. 따라서, 나노캡슐은 pH 및 온도 변화에 보다 저항성을 가진다. 예를 들면, 나노캡슐은 천연 단백질에 비해 실온 또는 저하된 온도 (즉, 냉동 또는 동결)에서 보다 긴 저장 수명을 갖는다. 마찬가지로, 나노캡슐은 천연 단백질에 비해 복수의 동결/해동(freeze/thaw) 사이클 후에 활성을 보다 적게 상실할 것이다. 상기 얇은 폴리머 쉘에 의해 단백질 구조가 안정화되므로, 상기 나노캡슐은 유기 용매 및 계면활성제에 대해 보다 저항성을 갖는다. 유기 용매 중 용해성을 증대시키기 위해, 폴리머 코팅을 또한 조절할 수 있다. 상기 나노캡슐과 함께 사용될 수 있는 유기 용매 및 계면활성제의 예들은 화장품(즉, 메이크업) 및 약품에 널리 사용되는 다른 것들 중에서도, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide), 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran), 4-디클로로벤젠(4-dichlorobenzene), 파라-디클로로벤젠(para-dichlorobenzene), 1,4-디옥산(1,4-dioxane), 1,4-디옥산 PEG, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 소듐 라우레스 술페이트 또는 옥시놀(sodium laureth sulfate or oxynol), 폴리소르베이트(polysorbate) 60, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올(2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol), 2-부톡시-1-에탄올(2-butoxy-1-ethanol), 알킬 페녹시, 폴리에톡시 에탄올을 포함한다. 기타 유기 용매들은 당업자에게 자명할 것이다. 얇은 폴리머 코팅이 응집을 방지하기 때문에, 상기 나노캡슐은 비보호된 단백질이 응집하는 성향을 보이는 계면 (즉, 기체/액체 또는 액체/고체)에서 보다 안정하다.

일부 구체예에서, 나노캡슐은 단일-단백질 코어의 활성을 유지한다. 단일-단백질 코어가 형광인 경우 (예를 들면, EGFP, 또는 형광 표지된 BSA), 상기 나노캡슐 또한 형광을 나타낸다. 상기 단일-단백질 코어가 효소 활성을 갖는 경우, 상기 효소 활성은 나노캡슐 내에 존재한다. 나노캡슐의 활성은 폴리머 쉘을 갖지 않는 단일-단백질 코어에 비해 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐의 활성은 천연 단백질의 약 30% 이상이다. 다른 구체예에서, 상기 나노캡슐의 활성은 천연 단백질의 약 50% 이상, 천연 단백질의 약 70% 이상, 또는 천연 단백질의 약 90% 이상이다.

일부 구체예에서, 단일-단백질 코어는 복수의 중합가능한 기(polymerizable group)들을 갖는 단백질이다. 중합성 기는 특정한 화학적 조건 하에서 중합하는 화학적 모이어티(chemical moiety)이다. 중합 조건의 예는, 광주압(photopolymerization), 자유 라디칼 중합(free radical polymerization), 및 촉매 유도 중합(catalyst induced polymerization)을 포함한다. 일반적으로, 중합가능한 기의 종류는, 상기 중합가능한 기가 나노캡슐을 생성시키는데 사용되는 모노머와 중합할 수 있는 한, 중요하지 않다. 중합가능한 기들의 예는, 광중합 또는 자유 라디칼 중합에 의해 중합되는, 이중 결합 포함 모이어티(double-bond containing moiety)들을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 중합가능한 기는 비닐(vinyl) 기, 아크릴(acyl) 기, 알킬아크릴 기 (즉, 메타크릴(methacryl)과 같은, 알킬 치환기를 갖는 아크릴 기)이다. 본 명세서에서 사용되는, 아크릴 (알킬아크릴, 메타크릴 등)은 알크릴 에스테르 및 아크릴 아미드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 중합가능한 기는 단백질 코어의 리신(lysine) 잔기에 공유 결합된 아크릴 기이다.

단백질은 용이하게 개질될 수 있는, 다수의 상이한 표면 아미노산을 갖는다. 예를 들면, 리신(lysine), 시스테인(cysteine), 트레오닌(threonine), 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 세린(serine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine), 티로신(tyrosine), 프롤린(proline) 및 트립토판(tryptophan)은 공지된 방법 및 과정을 이용하여 용이하게 개질시킬 수 있다. 단백질을 개질시키는데 사용되는 시약은 하나 이상의 중합가능한 기, 및 상기 단백질의 표면 상의 아미노산 곁사슬(amino acid side-chain)과 반응하는 하나 이상의 반응성 기를 가질 것이다. 아미노산 곁사슬과 반응하는데 사용되는 반응성 기의 예는 아민 포함 잔기 (예를 들면, 라이신) 및 히드록시 포함 잔기 (예를 들면, 트레오닌 또는 세린)와 반응하는, 활성화된 에스테르(activated ester) (예를 들면, 아실 할라이드, 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르); 티올 포함 잔기 (예를 들면, 시스테인)와 반응하는 말레이미드(maleimide); 및 특정한 커플링 시약(coupling reagent)으로 활성화한 경우 카르복시산 포함 잔기 (예를 들면, 글루탐산 및 아스파르트산)와 반응하는 아민을 포함한다. 이러한 방법으로, 중합가능한 기는 단일-단백질 코어에 공유 결합한다. 상기 중합가능한 기는 직접 결합하거나 또는 링커(linker)를 통해 부착될 수 있다.

일부 구체예에서, 링커는 단백질 코어와 중합가능한 기 사이에 존재한다. 링커는 상기 중합가능한 기와 상기 단백질 코어를 분리시키는 화학적 모이어티이다. 링커로서 사용되는 시약은 하나 이상의 중합가능한 기, 및 링커에 의해 분리되는 하나 이상의 반응성 기를 가질 것이다. 상기 반응성 기는, 통상적으로 단백질 표면 상의 아미노산 곁사슬과의 반응에 의해 상기 단백질 코어와 반응하여, 상기 중합가능한 기를, 그와 단일-단백질 코어 사이에 링커가 위치한 상태로, 단일-단백질 코어에 공유 결합한다.

일부 구체예에서, 상기 링커는 분해성(degradable)일 수 있다. 분해성 링커는 특정한 조건 하에 절단되는 화학적 모이어티이다. 예를 들면, 분해성 링커는, 예를 들어 특정한 pH 값 (높은 pH 또는 낮은 pH)에서 가수분해될 수 있거나, 또는 광분해에 의해 (즉, 특정한 파장의 빛을 조사한 경우), 또는 특정한 온도에서, 환원-산화 조건에서, 또는 효소에 의해(즉, 프로테아제에 의해) 절단될 수 있다. 단백질 코어와 반응하기 위한 반응성 기 및 나노캡슐을 생성하기 위한 중합가능한 기를 갖는 한, 임의의 적합한 분해성 링커가 사용될 수 있다. 상기 분해성 링커는 또한 나노캡슐의 중합 동안 안정해야 한다. 링커의 종류는 상기 링커가 절단될 조건에 기반하여 선택될 수 있다. 다수의 링커가 공지되어 있으며, 당업자에게 명백히 자명할 것이다.

일부 구체예에서, 나노캡슐은 모노머 단위(monomer unit)와 공중합된 단일-단백질 코어이다. 모노머 단위는 단일-단백질 코어와 중합하고 코폴리머(copolymer)를 형성하여, 나노캡슐의 폴리머 쉘을 생성시키는 화학적 모이어티이다. 일부 구체예에서, 상기 단일-단백질 코어가 비닐, 아크릴, 알킬아크릴, 또는 메타크릴 기와 같은, 이중 결합을 갖는 중합가능한 기를 가진 경우, 상기 모노머 단위도 또한, 비닐, 아크릴, 아크릴아미도, 알킬아크릴, 알킬아크릴아미도, 메타크릴 또는 메타크릴아미도 기와 같은, 이중 결합을 갖는 중합가능한 기를 갖는다. 상기 단백질의 중합가능한 기, 및 상기 모노머 단위의 중합가능한 기는, 나노캡슐을 생성하는데 이용되는 조건 하에서 코폴리머를 형성할 수 있는 한, 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 예를 들면, 비닐 및 아크릴 기는 자유-라디칼 중합 조건 하에서 코폴리머를 생성할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 2개 이상의 상이한 모노머 단위와 공중합된 단일 단백질 코어이다. 일반적으로, 임의의 수의 상이한 모노머 단위가, 나노캡슐을 생성하는데 사용되는 조건 하에서 코폴리머를 형성할 수 있는 한, 상기 단백질 코어와 코폴리머를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 곁사슬들을 갖는 모노머 단위가 나노캡슐의 표면 특성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 표면 특성은 상이한 모노머 단위 간의 비율을 조절함으로써 제어할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 모노머는 중성, 중성 친수성(neutral hydrophilic), 소수성, 양전하성(positively charged) 또는 음전하성(negatively charged)일 수 있다. 나노캡슐의 용해도는, 예를 들면, 하전된 모노머 단위와 하전되지 않은 모노머 단위, 또는 친수성 또는 소수성 모노머 단위 사이의 비율을 변화시켜 조절할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 양전하 또는 음전하는 갖는다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 모노머 단위는 pH = 7.4에서 양전하 또는 음전하를 갖는다. pH = 7.4에서 전하는 갖는 모노머 단위를 사용함으로써, 하전된 모노머 단위와 하전되지 않은 모노머 단위의 비율을 변화시켜 나노캡슐의 전체 전하를 변경 및 조절할 수 있다. 일부 구체예에서, 모노머 단위는 pH = 7.4에서 양전하를 갖는다. 양전하로 하전된 모노머 단위를 사용함으로써 양전하를 갖는 나노캡슐을 생성시킬 수 있다. 상기 전하는 중성 및 양전하성 모노머 단위의 비율을 변화시켜 조절할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 나노캡슐은 (전술된 바와 같은) 하나 이상의 모노머 단위 및 하나 이상의 가교제(crosslinker)와 공중합된 단일-단백질 코어를 포함한다. 가교제는 2개 이상의 중합가능한 기를 갖는 화합물(chemical compound)이다. 일반적으로, 가교제의 중합가능한 기들이 나노캡슐의 생성에 이용되는 조건 하에서 상기 단백질 코어와 상기 하나 이상의 모노머 단위 간의 가교된 코폴리머를 생성시킬 수 있는 한, 임의의 가교화 화합물(crosslinking compound)이 사용될 수 있다. 가교제의 예들은, 2개의 비닐, 아크릴, 알킬아크릴, 또는 메타크릴 기를 갖는 화합물을 포함한다. 2개의 아크릴 기를 갖는 특정한 가교제의 예들은 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide) 및 글리세롤 디메타크릴레이트( glycerol dimethacrylate)를 포함한다 (양자 모두 도 1에 표시됨).

일부 구체예에서, 상기 가교제는 분해성 가교제이다. 분해성 가교제는 특정한 조건 하에서 절단되어, 상기 나노캡슐의 폴리머 쉘의 적어도 일부를 분해 또는 제거한다. 예를 들면, 분해성 가교제는 (높거나 낮은) 특정한 pH에서 가수분해하거나, (에스테라아제 또는 펩티다아제와 같은) 특이적 효소에 의해 절단되거나, 특정파장에 노출시 광분해에 의해 절단되거나, 또는 특정한 온도에서 절단될 수 있다. 저하된 pH에서 가수분해하는 가교제의 예는, 생리학적 pH (약 7.4)에서 안정하나, 그보다 낮은 pH (약 5.5)에서 가수분해하는, 글리세롤 디메타크릴레이트를 포함한다. 분해성 가교제의 다른 예는, 참조에 의해 전체로서 통합되는 미국 등록특허 제7,056,901호에 개시된 아세탈 가교제(acetal crosslinker)를 포함한다.

분해성 및 비분해성 가교화 기(crosslinking group)들의 추가적인 특정한 예들이 하기 표에 제시된다.

상기 단백질 코어의 기질이 폴리머 코팅을 통과하기에 너무 큰 경우에, 상기 폴리머 코팅을 제거하거나 감소시키는 분해성 가교제가 유용할 수 있다. 예를 들어, 저하된 pH에서 분해하는 분해성 가교제가, 나노캡슐이 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 내부화(internalize)된 후 폴리머 코팅을 제거 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 혈청 및 후기 엔도좀(late endosome)이 각각 ~7.4 및 ~5.5의 pH 값을 갖는다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, pH ~7.4에서 안정하나, pH ~5.5에서 분해되는 분해성 가교제는, 나노캡슐이 세포 내로 도입된 후에만 폴리머 코팅을 제거 또는 감소시킬 것이다. 이러한 방법으로, 단백질 코어는 혈청 중에 존재하는 프로테아제로부터 보호되나, 거대한 기질을 갖는 단백질 코어는 여전히 효과적으로 세포에 전달될 수 있다. 폴리머 코팅이 감소된 후, 단백질 코어의 활성은 여전히 존재한다. 그러나, 폴리머 코팅이 제거된 후에, 상기 단백질 코어는 세포내 프로테아제에 의한 분해에 취약하게 되지만, 이러한 단점은 혈청 중 나노캡슐의 증가된 안정성 및 혈청 프로테아제에 대한 저항성에 의해 상쇄된다.

특정한 구체예에서, 상기 나노캡슐은 표면 개질(surface modification)을 추가적으로 포함한다. 표면 개질은 나노캡슐의 생성 후에 상기 나노캡슐의 표면에 부가되는 화학적 모이어티이다. 반응성 곁사슬(reactive sidechain)이 나노캡슐의 생성을 방해하지 않는 한, 반응성 곁사슬 (또는 보호된 반응성 곁사슬)을 갖는 모노머 단위가 나노캡슐을 생성하기 위해 사용될 수 있다. (필요한 경우, 탈보호 후) 상기 반응성 곁사슬은 표면 개질제(surface modifying agent)와 반응하여 나노캡슐에 표면 개질을 공유 결합시킨다. 표면 개질제는 소분자(small molecule), 폴리머, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 다당류, 또는 항체일 수 있다. 표면 개질은 나노캡슐의 용해도를 변화시키거나, 나노캡슐의 표면 전하를 변화시키거나, 또는 발광(light-emission), 세포 표적화(cell targeting), 또는 세포 투과(cell penetration)와 같은 추가적인 기능을 상기 나노캡슐에 부여할 수 있다. 세포 표적화를 향상시키는 표면 개질은, 비-표적화 세포와 비교하여 표적화된 세포 내로의, 상기 나노캡슐의 증가된 도입(transduction)을 초래한다. 세포 투과를 향상시키는 표면 개질은 세포 투과 증진제(cell penetration enhancer)가 결여된 나노캡슐과 비교했을 때, 세포 내로의 나노캡슐의 증가된 도입을 초래한다. 상기 나노캡슐 상에 둘 이상의 표면 개질이 존재할 수 있다. 소분자 표면 개질의 예는 플루오레세인(fluorescein) 또는 로다민(rhodamine)과 같은 발광 화합물(light emitting compound), 또는 엽산(folic acid)과 같은 세포 표적화 화합물을 포함한다. 폴리머는 용해도를 증가시키는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 특별한 세포 표면 특징에 대한 항체, 세포 신호 단백질(cell signaling protein) 또는 성장 호르몬과 같은, 펩티드들이 세포 표적화를 목적으로 사용될 수 있다. (TAT 또는 안텐네페디아 호메오도메인(antennepedia homeodomain)과 같은) 기타 펩티드들이 나노입자의 세포 투과를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 표면 개질은 항체이다.

제조

본 발명의 구체예는 단백질을 하나 이상의 중합가능한 기로 유도체화(derivatize)하는 단계; 및 그 다음, 상기 유도체화된 단백질을 모노머 단위와 공중합시키는 단계를 포함하는, 단일-단백질 코어 및 상기 단백질 코어에 공유결합에 의해 결합된 얇은 폴리머 쉘을 갖는 나노캡슐의 제조 방법을 포함한다.

일반적인 2-단계 과정이 단일-단백질 나노캡슐을 제조하기 위해 사용된다. 우선, 중합가능한 기들을 단백질 표면에 공유결합에 의해 연결시킨다. 그 다음, 완충 용액 중 기능성 모노머(functional monomer) 및 선택적으로, 가교제의 후속적 중합이 각각의 단백질 코어를 얇은 (가교된 네트워크) 폴리머 피막(skin)으로 피복(wrap)한다. 이러한 일반적인 방법은 원하는 단백질 코어를 갖는 다양한 저-크기-분포의(low-size-distributed) 나노캡슐의 용이한 합성, 및 표면 전하 및 작용기의 용이한 제어를 가능하게 한다.

중합가능한 기들이 효소 표면에 부착되면, 조절가능한 조성, 구조, 표면 특성, 및 기능성(functionality)을 갖는 폴리머 코팅을 생성하기 위해 모노머 (예를 들면, 표 2에 나열된 모노머)를 사용할 수 있다. 효소 활성의 유지를 보장하기 위해 실온 자유-라디칼 중합 기법(room temperature free-radical polymerization technique)을 사용할 수 있다. 이 폴리머 코팅은 캡슐화된 효소에 대한 합성 막으로 작용하므로, 구조적 통합성(structural integrity)을 제공하기에 적합한 기계적 강도를 나타내고, 신속한 기질 수송을 가능하게 하는 효과적인 수송 경로를 보유하며, 및 기질 선택성 및 보습력(moisture retention)을 제공하기 위한 특이적 작용기를 포함한다.

나노캡슐은, 상업적 공급처로부터 직접 얻거나 다른 보고된 방법을 사용하여 얻을 수 있는, 단백질 코어의 생체기능(biofunction)을 변화시키지 않는다.

상기 단백질을 유도체화 또는 개질시키는데 사용되는 시약은 하기 일반 구조를 가지며,

상기 중합가능한 기는 나노캡슐의 생성에 사용되는 조건 하에서 하나 이상의 모노머 및/또는 가교제와 코폴리머를 생성하는 화학적 모이어티이다. 일부 구체예에서, 상기 중합가능한 기는 비닐, 아크릴, 알킬아크릴, 및 메타크릴과 같은, 이중결합을 포함하는 기이다. 앞에서 논의된 바와 같이, 아크릴 (및 알킬아크릴 및 메타크릴)은 아크릴 에스테르 및 아크릴아미드를 모두 포함한다.

연결 기(linking group)는 선택적이며, 상기 중합가능한 기와 상기 단백질 사이에 존재할 수 있다. 연결 기는 반응성 기를 상기 중합가능한 기로부터 분리시키는 화학적 모이어티이다. 상기 연결 기는 임의의 특별한 화학 구조에 제한되지 않으나, 중합 반응을 방해해서는 안된다. 일부 구체예에서, 상기 연결 기는 특정한 조건 하에서 절단되는 분해성 연결 기이다. 예를 들면, 아세탈, 케탈, 또는 에스테르는 특정한 pH에서 가수분해될 수 있다. 이 작용기들 중 하나 이상을 갖는 연결 기들은 pH의 변화에 (예를 들면, 전술된 바와 같이, 엔도좀 내에서) 반응하여 분해될 수 있다.

반응성 기는 상기 단백질에 중합가능한 기를 공유 결합시키기 위해 아미노산 곁사슬과 반응하는 화학적 모이어티이다. 다수의 반응성 기들이 공지되어 있으며 상이한 아미노산 곁사슬과 반응하는데 사용된다. 예를 들면, 아실 할라이드 또는 활성화된 에스테르(예를 들면, N-히드록시숙신이미드 에스테르)는 아민(예를 들면, 리신에 있는 아민) 또는 히드록시(예를 들면, 세린 또는 트레오닌에 있는 히드록시)와 반응한다. 이소시아네이트는 아민과 반응한다. 에폭시드는 아민 또는 티올(thiol) (예를 들면, 시스테인)과 반응한다. 말레이미드는 티올과 반응한다. 다른 작용기들은 하나 이상의 커플링 시약(예를 들면, 카르보디이미드(carbodiimide) 시약)의 존재 하에 아미노산 곁사슬과 반응할 수 있다. 예를 들면, 아민은 카르복시산 아미노산 곁사슬(예를 들면, 글루타메이트 또는 아스파르테이트에 있는 카르복시산 아미노산 곁사슬)과 반응할 수 있다. 기타 반응성 기들이 당업자에게 자명할 것이다.

상기 언급된 단백질 개질 동안, 부위-특이적인 제어된 개질을 실현하기 위해, 공간적으로 정해진 위치에 특정한 아미노산을 도입하기 위해 유전자 재조합 기법이 사용될 수 있다. 이 기법은 상기 개질의 부위 및 밀도의 정확한 제어를 가능하게 한다.

단백질을 유도체화하는데 사용되는 특정한 화합물의 예가 하기 표 1에 제시된다. 다수의 다른 예들이 이용가능하며, 당업자에게 자명할 것이다.

모노머 단위는 하기 일반 구조를 가지며,

상기 중합가능한 기는 나노캡슐을 생성하는데 사용되는 조건 하에서 단백질 코어 및 선택적인 가교제와 코폴리머를 형성하는 화학적 모이어티이다. 중합가능한 기는 앞에서 논의된 모든 기들을 포함한다. 상기 단백질의 중합가능한 기 및 상기 모노머 단위의 중합가능한 기는, 이들이 나노캡슐을 형성하는데 사용되는 조건 하에서 코폴리머를 생성할 수 있는 것이면, 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 비닐 및 아크릴 기는 자유-라디칼 중합 조건에서 코폴리머를 생성할 수 있다.

곁사슬은 중합에 참여하지 않는, 모노머 단위의 일부이다. 일반적으로, 상기 곁사슬은 임의의 구조를 가질 수 있고, 나노캡슐의 원하는 특성에 기반하여 선택될 수 있다. 상기 모노머 단위의 곁사슬은 상기 나노캡슐의 표면 특성에 영향을 미친다. 일부 구체예에서, 상기 곁사슬은 중성, 중성 친수성 (즉, 수용성이나, 하전되지 않음), 소수성, 양전하성 또는 음전하성일 수 있다. 중성 곁사슬은, 아미드, 에스테르, 에테르, 히드록시를 포함하며, 이들 중 일부는 그의 구조에 따라, 친수성 또는 소수성일 수 있다. 양전하성 곁사슬은 (모노 및 디알킬 아민, 및 사치환(tetrasubstituted) 암모늄 화합물과 같은 치환된 아민, 및 이들의 고리형 변이체(cyclic variant)를 포함한) 아민, 구아니딘(guanidine), 및 피리딘 및 이미다졸과 같은 헤테로고리(heterocycle)를 포함한다. 음전하성 곁사슬은 카르복시산을 포함한다. 소수성 곁사슬은 (선형(linear), 분지형(branched) 또는 고리형(cyclic) 알킬 기를 포함한) 알킬 기 및 아릴 기를 포함한다.

특정한 모노머 단위의 예, 및 그의 기능이 하기 표 2에 제시된다.

기능: 1 내지 5: 친수성 표면 및 보습(moisture retention); 2) 온도 반응성; 3) 음전하로 하전된 표면; 4) 표면 개질을 위한 반응성 곁사슬, 5) 양전하로 하전된 표면, 6) 소수성 표면.

개질된 단백질 및 모노머 단위(들)의 중합은, 상기 단백질 및 모노머 단위(들)에 사용되는 중합가능한 기들에 적합하고, 중합 중에 단백질의 기능을 손상시키지 않는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 중합 방법의 예는 전술된 방법들과 같은, 이중 결합을 포함하는 중합가능한 기들의 광중합(photopolymerization) 및 자유-라디칼 중합을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 중합은 자유 라디칼 중합이다.

일부 구체예에서, 중합은 실온에서 수행되나, 단백질의 기능이 중합 중에 소실되지 않는 범위에서, 중합 방법에 따라, 바람직한 경우 온도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 분해성 가교제 또는 연결 기들이 사용되는 경우, 상기 나노입자의 기능은 폴리머 코팅의 분해 후에 측정될 수 있다. 반응 온도는, 중합 반응이 너무 느리게 일어나거나, 또는 중합을 개시하기 위해 상승된 온도가 필요한 경우에 증가시킬 수 있다. 중합 반응이 지나치게 빠르게 일어나는 경우, 온도를 감소시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 중합 반응은 물 또는 수성 완충액(aquous buffer) 중에서 수행된다. 용매가 중합 반응을 방해하거나 상기 단백질을 분해하지 않는 한, 다른 용매들이 바람직하게 사용될 수 있다. 반응 성분들을 용해시키는데 필요한 경우, 물 또는 수성 완충액과 유기 공용매(co-solvent)의 혼합물이, 상기 반응을 방해하거나 단백질 코어를 손상시키지 않는 한, 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합 반응은 완충액 중에서 수행된다.

일부 구체예에서, 상기 공중합 단계는 2개 이상의 상이한 모노머 단위를 포함한다. 일반적으로, 상기 상이한 모노머 단위가 나노캡슐을 생성하는데 사용되는 조건 하에서 모두 코폴리머를 생성할 수 있는 한, 임의의 수의 상이한 모노머 단위가 상기 단백질 코어와 코폴리머를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 나노캡슐의 표면 특성을 변경시키기 위해 상이한 곁사슬을 갖는 모노머 단위를 사용할 수 있다. 표면 특성은 상이한 모노머 단위들 간의 비율을 조절함으로써 제어할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 모노머는 중성, 중성 친수성, 소수성, 양전하성 또는 음전하성일 수 있다. 나노캡슐의 용해도는 하전된 모노머 단위와 비하전된 모노머 단위, 또는 친수성 모노머 단위 또는 소수성 모노머 단위간의 비율을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 공중합 단계는 가교제를 추가적으로 포함한다. 가교제는 연결 기에 의해 분리되는, 2개 이상의 중합가능한 기를 갖는 시약이다. 가교제는 3개 이상의 중합가능한 기를 가질 수 있다. 상기 가교제 상의 중합가능한 기들은, 이들이 나노캡슐을 생성시키는데 사용되는 조건 하에서 모노머 단위(들) 및 단백질 코어와 코폴리머를 생성할 수 있기만 하면, 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 2개의 중합가능한 기들을 갖는 가교제는 하기 일반 구조를 가지며,

상기 중합가능한 기들은 전술된 것들과 동일한 기이다. 상기 연결 기는, 중합 반응을 방해하지 않는 한 임의의 구조를 가질 수 있다. 적합합 링커(linker)들의 예는 (치환된 알킬 기를 포함한) 알킬 기, (치환된 아릴 기를 포함한) 아릴 기, 케톤, 아미드, 에스테르, 에테르 및 이들의 조합을 포함한다. 가교제의 특별한 예들은 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드(N,N'-methylene bisacrylamide) 및 글리세롤 디메타크릴레이트(glycerol dimethacrylate)이다 (도 1을 참조한다).

일부 구체예에서, 상기 연결 기는 분해성이다. 분해성 연결 기는 특정한 조건 하에서 절단될 수 있다. 상기 분해성 연결 기의 구조는 상기 연결 기를 절단하는데 요구되는 조건의 종류를 결정한다. 예를 들면, 상기 연결 기는 pH의 변화 (즉, 증가 또는 감소), 특정한 파장의 빛으로의 노출로 인해, 또는 열에 대한 반응으로서 절단될 수 있다. 분해성 가교제의 예는 글리세롤 디메타크릴레이트이다.

일부 구체예에서, 나노캡슐의 제조 방법은 상기 나노캡슐의 표면을 개질시키는(modify) 단계를 추가적으로 포함한다. 모노머 단위(들)의 곁사슬은 중합 후 나노캡슐의 표면에 존재한다. 나노캡슐의 제조에 반응성 곁사슬 (또는 보호된 반응성 곁사슬)을 갖는 모노머 단위를 사용할 수 있다. 상기 반응성 곁사슬은 중합을 방해하지 않으나, 나노캡슐이 생성된 후 (즉, 중합이 완료된 후) 추가적인 화학적 개질을 거칠 수 있다. 보호된 반응성 곁사슬은 표준 화학적 탈보호법을 사용하여 탈보호시킨 다음, 화학적 개질제(chemical modifying agent)와 반응시킬 수 있다. 반응성 곁사슬을 화학적 시약으로 처리하여, 표면 개질제를 상기 나노캡슐의 표면에 공유 결합시킨다. 표면 개질은 소분자, 폴리머, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 다당류 또는 항체일 수 있다. 표면 개질은 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 친수성 기를 첨가함으로써) 나노캡슐의 용해도를 변화시키거나, (예를 들면, 하전된 표면 개질제를 첨가함으로써) 상기 나노캡슐의 표면 전하를 변화시키거나, 또는 상기 나노캡슐에 발광, 세포 표적화 또는 세포 투과와 같은 부가적인 기능을 부여할 수 있다. 소분자 표면 개질의 예는 플루오레세인(fluorescein), 또는 로다민(rhodamine)과 같은, 발광 화합물(light emitting compound) 또는 엽산과 같은 세포 표적화 화합물을 포함한다. 폴리머는 용해도를 증가시키는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 펩티드 및 폴리펩티드가 세포 표적화를 목적으로 사용될 수 있고, 이들은 특이적 세포 표면 특징에 대해 선택적인 항체, 세포 신호 펩티드(cell signaling peptide), 또는 호르몬을 포함할 수 있다. 나노입자의 세포 투과를 증가시키기 위해 (TAT 또는 안텐네페디아 호메오도메인과 같은) 기타 펩티드를 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 표면 개질은 항체이다. 나노캡슐은 용이하게 유도체화된 표면을 가지므로, 특이적 항체들이 나노캡슐과 접합(conjugate)되어 표적화 전달(targeting delivery)의 추가적인 능력을 제공할 수 있다.

나노캡슐의 크기 및 표면 특성은 상기 나노캡슐의 생성에 사용되는 상이한 모노머 및/또는 가교제의 중량비를 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, DMAEMA(양전하 하전) 대 AAm(중성)의 중량비를 0:1, 1:3 및 1:1로부터 조절함으로써, 각각 -12.8, 8.64 및 15.2 mV로부터의 조절가능한 제타 전위를 갖는 BSA 나노캡슐을 합성할 수 있다 (도 6A). 용해도도 또한 모노머 단위 및 가교제의 종류 및 비율을 변화시킴으로써 용이하게 조절할 수 있다. 친수성 또는 하전된 모노머의 증량은 수 용해도를 증가시킨다. 소수성 모노머의 증량은 유기 용매 또는 혼합된 유기/물 용매 시스템(mixed organic/water solvent system) 중 나노캡슐 용해도를 증가시키는 경향을 나타낸다.

얇은 폴리머 코팅의 투과도(permeability)는 나노캡슐의 제조에 사용되는 반응 혼합물 중 가교제의 비율을 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 일반적으로, 보다 낮은 양의 가교제는 보다 높은 투과도를 초래한다. 마찬가지로, 상기 얇은 폴리머 코팅의 투과도는 가교제 상의 연결 기의 길이를 변화시킴으로써 달라질 수 있다. 일반적으로, 보다 긴 연결기는 증가된 투과도를 야기한다.

이러한 간단한 방법은 임의의 단백질 코어를 사용하여, 잘-제어된 크기, 표면 특성를 갖는 신규한 단백질-세포내-전달 벡터(protein-intracellular-delivery vector)를 제조하기 위한 효과적인 경로를 제공한다.

용도

나노캡슐은 내부에 내입된 단백질과 매우 유사한 세포내 기능을 수행한다. 상이한 기능들을 수행하는 나노캡슐을 생성시키기 위해 다양한 단백질들이 사용될 수 있다. 시험된 예시적인 생활성 단백질은 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 겨자무 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 우 혈청 알부민(bovine serium albumin, BSA), 및 수퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD)를 포함한다.

본 명세서에서 기술되는 나노캡슐은, 개선된 안정성 및/또는 장기 효과를 나타내면서, 인 비트로 또는 인 비보에서 단백질 또는 단백질 활성을 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 나노캡슐은 프로테아제에 의한 분해에 대해 보다 저항성이므로, 단백질 활성은 천연 또는 비보호된 단백질이 투여되는 경우에 비해 보다 장기적인 효과를 갖는다. 그 결과, 동일한 효과를 위해 (비보호된 단백질과 비교했을 때) 보다 적은 (나노캡슐 형태의) 단백질이 요구되며, 그에 의해 효율이 개선된다.

본 발명의 구체예는 세포를 전술된 나노캡슐의 유효 농도에 노출시키는 것에 의한, 단백질의 전달 방법을 포함한다. 상기 세포는 배양물 내 (즉, 인 비트로)에 존재하거나 또는 살아있는 유기체 (즉, 인 비보) 내에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "단백질의 전달(delivering a protein)"은 상기 단백질이 나노캡슐을 형성하도록 변형되기 때문에, 단백질의 활성을 세포로 전달하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 나노캡슐의 활성은 나노캡슐에 사용된 천연 단백질의 활성과 동일한 것이다. 단백질 기질이 나노캡슐을 투과하지 않는 겅우에, 분해성 폴리머 코팅이 사용되어, 상기 폴리머 코팅의 감소 또는 제거 후에 단백질을 세포로 전달시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 단백질은 치료 단백질(therapeutic protein)이다. 치료 단백질은 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는데 사용되는 단백질 또는 효소이다. 일부 구체예에서, 상기 개체는 포유동물, 또는 사람이다.

본 명세서에서 기술되는 나노캡슐은 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 단백질 또는 효소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 나노캡슐은 과증식 질환(hyperproliferative disorder), 암, 또는 종양의 치료에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 나노캡슐은 화장품에 사용될 수 있다.

약제학적 조성물

본 명세서에서 논의되는 나노캡슐은 진단적 또는 치료적 처치 방법에서의 사용을 목적으로, 다양한 조성물로 제제화(formulate)될 수 있다. 상기 조성물 (예를 들면, 약제학적 조성물(phrarmaceutical composition))은 키트로 조립될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물의 유효량 (예를 들면, 약학적으로 유효한 양)을 포함한다.

본 발명의 조성물은, 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제제화할 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 생물학적으로 또는 다른 방식으로 허용불가능하지(undesirable) 않은 물질을 의미하며, 즉, 상기 물질이 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 또는 상기 물질이 함유된 약제학적 조성물 내의 임의의 다른 성분들과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서, 개체에 투여될 수 있는 것을 의미한다. 상기 담체는 당업자에게 잘 알려진 바에 따라서, 일반적으로 활성 성분의 분해를 최소화하고, 개체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약제학적 조성물의 기타 성분들의 논의에 대해서는, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990을 참조한다. 일부 적합한 약제학적 담체들은 숙련된 기술자에게 자명할 것이며, 예를 들면, (멸균 및/또는 탈이온 수를 포함한) 물, (PBS와 같은) 적합한 완충액, 생리학적 염수(physiological saline), (DMEM과 같은) 세포 배양 배지, 인공 뇌척수액 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 키트는 본 발명의 상기 조성물 외에, 기타 약제를 포함할 수 있다. 기타 작용제(agent)(들)를 환자의 치료 중 적합한 시기에, 동시에 또는 순차적으로(sequentially) 투여할 수 있다.

당업자는 구체적인 제제들은 부분적으로, 사용되는 특별한 작용제, 및 선택된 투여 경로에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 매우 다양한 본 발명의 조성물의 적합한 제제가 존재한다.

당업자는 당면한 구체적인 용도에 기반하여, 적합한 또는 적절한 제제가 선택, 적용(adapt) 또는 개발될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 본 발명의 조성물을 위한 투여량(dosage)은 단위 투여 제형일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단위 투여 제형(unit dosage form)"은 동물 (예를 들면, 사람) 개체를 위한 단위 투여량(unitary dosage)으로서 적합한, 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 약제학적으로 허용가능한 희석제(diluent), 담체, 또는 비히클(vehicle)과 함께 원하는 효과를 생성시키기에 충분한 양으로 계산된, 단독의 또는 다른 치료제와 조합된, 본 발명의 작용제의 사전에 정해진 양을 포함한다.

당업자는 개별 환자에서 작용제의 원하는 유효량 또는 유효 농도를 달성하기 위해, 사용되는 조성물의 정확한 제제에 대한 적합한 투여량, 투여계획(schedule), 및 투여 방법을 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서 동물, 특히 사람에 투여되는 본 발명의 조성물의 투여량은, 합리적인 시간 프레임(time frame)에 걸쳐 개체에서 최소한 검출가능한 양의 진단적 또는 치료적 반응을 야기하기에 충분해야 한다. 원하는 효과를 달성하기 위해 사용되는 투여량은, 투여되는 특별한 작용제의 효능(potency), 숙주에서 상기 작용제와 관련된 약력학(pharmacodynamic), 감염된 개체의 질병 상태의 중증도, 개체에 투여되는 기타 약물 등을 포함한, 다양한 인자들에 의해 결정될 것이다. 투여량의 크기는 또한, 사용되는 특별한 작용제 또는 그의 조성물에 수반될 수 있는 유해한 부작용의 존재에 의해 결정될 것이다. 가능한 경우라면, 유해한 부작용을 최소로 유지하는 것이 일반적으로 바람직하다. 생물학적으로 활성을 갖는 물질의 투여량은 다양할 것이다; 각각의 구체적인 작용제에 대한 적합한 양은 숙련된 기술자에게 자명할 것이다.

본 발명의 또다른 구체예는 인 비트로 또는 인 비보에서, 본 명세서에서 개시된 임의의 방법에 사용할 수 있는 키트(kit)이다. 그와 같은 키트는 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 선택적으로는, 상기 키트는 상기 방법을 수행하기 위한 설명서(instruction)를 포함한다. 본 발명의 키트의 선택적 요소는 적합한 완충액, 약제학적으로 허용가능한 담체 등, 용기 또는 패키징 재료(packaging material)를 포함한다. 상기 키트의 시약은, 그 내부에서 상기 시약이, 예를 들면 동결건조(lyophilized) 형태 또는 안정화된 액체 상태로 안정한, 용기 내에 존재할 수 있다. 상기 시약은 또한 단일 사용 제형, 예를 들면, 단일 투여 제형(single dosage form)으로 존재할 수 있다.

전술된 설명으로부터, 본 명세서에 설명된 발명을 다양한 용도 및 조건에 체택하기(adopt) 위해, 이에 대한 변형 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 자명할 것이다. 그와 같은 구체예들도 또한 후술되는 청구항들의 범위 내에 속한다.

본 명세서에서 변수(variable)에 대한 임의의 정의 중 요소들의 나열에 대한 언급은, 임의의 단일 요소 또는 나열된 요소들의 조합 (또는 하위조합)으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 구체예의 언급은 임의의 단일 구체예, 또는 임의의 다른 구체예 또는 그의 일부와 조합된 구체예들을 포함한다.

단수형(single tense)으로 제시된 용어는 문맥이 달리 명시하지 않는 경우 복수형을 또한 포함한다.

하기 개시되는 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공되나, 그의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 다른 변형물들은 당업자에게 자명할 것이며, 첨부된 청구범위에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 데이터베이스, 및 특허들은 모든 목적을 위해 참조에 의하여 본 명세서에 통합된다.

본 발명의 화합물의 제조 방법, 특성 규명(characterizing) 방법 및 사용 방법이 하기 실시예에서 예시된다. 출발 물질은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따르거나 또는 본 명세서에 예시된 바와 같이 제조된다. 하기 실시예들은 본 발명이 보다 완전히 이해될 수 있도록 하기 위해 제공된다. 이 실시예들은 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로든지 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1은 아크릴아미드 (1), 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (2), 및 비-분해성(non-degradable) 가교제 메틸렌비스아크릴아미드(methylenebisacrylamide) (3) 또는 산-분해성(acid-degradable) 글리세롤 디메타크릴레이트 (4)의 인 시튜 공중합 단계에 의해 제조된, 분해성 및 비-분해성 폴리머 쉘을 갖는 예시적인 양이온성 단일-단백질 나노캡슐의 합성 및 세포 흡수(cellular uptake)를 보여주는 개략도이다: I, 단백질 표면에 중합가능한 아크릴 기를 접합(conjugate)시키는 것에 의한 중합가능한 단백질의 생성 단계; II, 상기 1, 2, 및 3으로부터의 비-분해성 나노캡슐의 생성 단계; III, 상기 1, 2, 및 4로부터의 분해성 나노캡슐의 생성 단계; IV, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의한 상기 분해성 또는 비-분해성 나노캡슐의 세포 흡수 단계; V, 내부화(internalization) 후 분해성 나노캡슐의 쉘이 파괴되어 단백질 적재물(protein cargo)을 방출시켜, 거대 분자 기질과 상호작용할 수 있도록 하는 단계.
도 2는 N-아크릴옥시숙시니미드(NAS)로 개질시키기 전과 후 단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다: 도 2A는 천연(native) EGFP (1) 및 개질된 EGFP (2)를 보여준다. 도 2B는 천연 HRP (1) 및 개질된 HRP (2)를 보여준다. 도 2C는 천연 SOD (1) 및 개질된 SOD (2)를 보여준다. 도 2D는 천연 카스파아제-3(Caspase-3) (1) 및 개질된 카스파아제-3 (2)을 보여준다.
도 3은 489 nm의 여기 파장을 사용한, 50 mM pH 7.0 인산염 완충액 중 천연 EGFP 및 nEGFP의 형광 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 예시적인 나노캡슐의 크기를 보여준다. 도 4A는 HRP 나노입자의 TEM 이미지를 보여준다. 도 4B는 HRP 나노캡슐의 AFM 이미지를 보여준다. 도 4C는 단일 1.4-nm 골드-양자점으로 표지된(gold-quantum-dot-labelled) HRP 코어를 함유하는 나노캡슐의 TEM 이미지를 보여준다. 이 도면들은 단일-코어 나노스케일 구조물(nanoscale architecture)의 생성을 확인한다.
도 5는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 측정된 HRP 및 nHRP의 크기 분포를 나타낸다.
도 6은 제타 전위(zeta potential)에 대한 모노머 중량비의 효과를 나타낸다. 도 6A는 상이한 모노머 중량비 (위에서부터 아래로; DMAEMA (2)/ AAm (1) = 0, 1/3, 1)로 제조된 나노캡슐들의 제타 전위 분포를 나타낸다. 도 6B는 상이한 모노머 중량비 (위에서부터 아래로: 모노머 2 대 모노머 1 = 1/6, 1/3, 1, 제타 전위: 2.23, 5.83 내지 10.93 mV)로 제조된 nHRP의 제타 전위 분포를 나타낸다.
도 7은 천연 HRP (좌측) 및 nHRP (우측)의 상대 촉매 활성을 나타낸다. 천연 HRP와 nHRP의 활성 시험은 기존의 프로토콜을 따랐다 (Davis 등, J Biol. Chem., vol. 256, pp. 5992-5996, 1981). 요약하면, 1회 시행 동안, 시험관에 0.9 ml의 pH 5.5, 10O mM 포스페이트 시트레이트, 0.05 ml의 0.02 M H₂O₂ 및 lO ㎕의 0.2 ㎍/mL HRP 또는 nHRP를 첨가하였다. 0.02 M TMB를 포함하는 DMSO 0.05 mL를 첨가하여 반응을 개시시키고, 655 nm에서 모니터링하였다. TMB의 산화 속도를, TMB의 산화 생성물에 대한 몰 흡수 계수(molar absorption coefficient)(39,000 M^- ^lcm^-1)를 사용하여 흡착 곡선(adsorption curve)의 초기 직선 부분의 기울기로부터 해석하였다.
도 8은 예시적 나노캡슐의 프로테아제에 대한 안정성을 보여준다. 도 8A는 50 ℃에서 1 mg/mL 트립신 및 키모트립신에 노출시킨 후 천연 EGFP 및 EGFP 나노캡슐의 형광 강도의 비교를 보여주며, EGFP 나노캡슐이 프로테아제에 대해 매우 안정하다는 것을 시사한다 (형광 강도는 프로테아제 노출 전 비처리된(untouched) EFGP에 대해 정규화(normalize)시켰다). 도 8B는 3, 48, 및 144 시간 동안 400 nM EGFP 나노캡슐과 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포의 세포 형광 강도(cellular fluorescence intensity)를 나타내며, 세포 증식에 기인한 강도의 감소를 보여준다. 도 8C는 3시간 동안 400 nM TAT-EGFP 융합 단백질과 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포의 세포 형광 강도를 나타내며, 비개질된(unmodified) 단백질의 신속한 분해를 시사한다. 도 8D는 상이한 시점에 nEGFP 또는 TAT-EGFP 융합 단백질을 처리한 후 세포들의 세포 형광 강도를 나타낸다.
도 9는 정해진 온도에서 EGFP 나노캡슐 또는 비처리된 EGFP와 3시간 동안 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포들의 형광 현미경 이미지를 보여주며, 세포들을 DAPI로 대비염색시켰다 (스케일 바(scale bar) = 50 ㎛).
도 10은 로다민-표지된(rhodamine-labelled) nHRP의 흡수를 보여주는 형광 이미지를 나타낸다. 세포들을 EEA1 (초기 엔도좀(endosome)의 경우) 또는 Rab7 (리소좀(lysosome)의 경우)로 대비염색시켰다
도 11은 상이한 시간으로 EGFP 나노캡슐과 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포 형광 강도를 보여준다. HeLa 세포들을 400 nM EGFP 나노캡슐과 상이한 시간 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 트립신 처리하고(trypsinize), FACS 분석을 수행하였다.
도 12는 TAT-EGFP 및 안텐나페디아-EGFP 컨쥬게이트(antennapedia-EGFP conjugate)와 비교한 나노캡슐, 및 세포 흡수에 대한 제타 전위의 효과를 나타낸다. 도 12A는 상이한 농도의 nEGFP (11.7 nm, 제타 전위 10.9 mV), TAT-EGFP 융합 단백질 또는 천연 EGFP와 인큐베이션시킨 HeLa 세포의 형광-보조 세포 분류(fluoresence-assisted cell sorting)를 나타낸다. 도 12B는 천연(naive) EGFP, EGFP 나노캡슐(nEGFP), 안텐나페디아-EGFP 컨쥬게이트(ANTE-EGFP)로 처리한 후, HeLa 세포의 세포 형광 분포를 나타낸다. 도 12C는 EGFP 나노캡슐의 제타 전위와, EGFP 나노캐슐과 3시간의 공동배양 후 HeLa 세포의 세포 형광 강도 간의 상관관계를 보여준다.
도 13은 나노캡슐 흡수에 대한 연장된 인큐베이션 시간의 효과를 나타낸다. 도 13A 및 13B는 상이한 시간 동안 nEGFP와 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포 형광 강도를 보여준다. HeLa 세포를 400 nM nEGFP와 상이한 시간 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 트립신 처리하고, FACS 분석을 수행하였다.
도 14는 세포 흡수에 대한 나노캡슐 크기의 효과를 보여준다. 상이한 크기를 갖는 (적색: 7.53 nm, 녹색: 10.6 nm, 자색: 15.7 nm) nEGFP와 인큐베이션시킨 후 세포 형광 강도 분포.
도 15는 상이한 온도에서, 3가지 다른 엔도사이토시스 억제제, 아밀로리드(Amiloride), CPZ 및 β-시클로덱스트린 (β-CD)의 존재 하에 HeLa 세포의 평균 세포 형광 강도를 나타낸다. 형광 강도는 37 ℃에서 nEGFP와 인큐베이션시킨 세포들에 대해 정규화시켰다.
도 16은 100 μM 클로로퀸(chloroquine)의 처리 또는 미처리 하에 3시간 동안 EGFP 나노캡슐과 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다 (스케일 바 = 20 ㎛).
도 17은 골드 양자점-표지된 HRP 나노캡슐과 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포의 TEM 이미지를 나타낸다. 진한 화살표는 세포 시토졸(cytosol) 중 단일 나노캡슐의 분산을 보여주며; 옅은 화살표는 나노캡슐의 집합체(cluster)를 보여준다.
도 18은 다중 단백질 전달을 예시한다. 도 18A는 로다민-B-표지된 nHRP (적색), nEGFP (녹색), 및 NIR-667-표지된 nBSA (청색)의 도입(transduction) 후 HeLa 세포의 공초점 이미지를 보여준다. 도 18B는 나노캡슐들을 HeLa 세포 내로 동시에 도입시킨 후 nEGFP, NIR-667-표지된 nBSA, 및 로다민-B-표지된 nHRP의 공동 국지화 정량(co-localization quantification)을 나타낸다.
도 19는 EGFP 나노캡슐과 3시간 동안 공동배양하고, 뒤이어 신선한 배지에서 12시간 동안 인큐베이션시킨 후에, MTT 분석에 의해 결정한 HeLa 세포의 상대 세포 증식율(relative cellular proliferation rate)을 나타내며, 세포 증식율은 어떠한 작용제도 처리하지 않은 HeLa 세포에 대해 정규화시켰다.
도 20은 3시간 동안 상이한 농도의 HRP 또는 HRP 나노캡슐과 인큐베이션시키고, 뒤이어 PBS로 세척하고, 10분 동안 PBS 중 1 mM TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 및 1 μM H₂O₂와 인큐베이션시킨 후의 HeLa 세포의 사진을 보여준다.
도 21은 세포 내의 HRP 및 SOD 나노캡슐의 활성을 나타낸다. 도 21A는 400 nM의 천연 HRP 또는 nHRP를 도입하고, 12시간 동안 IAA와 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포 생존율(viability)을 나타내는 MTT 분석을 보여준다. 세포 증식율을 미처리된 세포에 대해 정규화시켰다. 도 21B는 nSOD 및 파라콰트(paraquat)와 인큐베이션시킨 후 HeLa 세포 생존율을 나타낸다. 미처리된 세포들을 100% 세포 증식 대조군으로 사용하였고, 파라콰트만으로 처리된 세포들을 0% 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 3회씩 실시된 3가지 독립적 실험들로부터의 오차 바(error bar)와 함께 표시된, 평균값을 나타낸다.
도 22는 EGFP 나노캡슐 또는 HRP 나노캡슐을 투여하고, 1 mM 디히드로에티듐(dihydroethidium)에 노출시킨 후 C57BL/6 마우스의 조직 절편의 공초점 이미지를 나타낸다.
도 23은 예시적인 분해성 나노캡슐에 있어서, 서로 다른 pH에서의 크기 변화를 나타낸다. 도 23A는 pH 5.5에서 분해성 CAS 나노캡슐(de-nCAS) 및 비분해성 CAS 나노캡슐(nCAS)의 크기를 나타낸다. 도 23B는 pH 7.4에서 분해성 CAS 나노캡슐(de-nCAS) 및 비분해성 CAS 나노캡슐(nCAS)의 크기를 나타낸다.
도 24는 50 ℃에서, pH 7.4 완충액 중 1 mg mL^-1 트립신 및 a-키모트립신에 노출시킨 후 천연 EGFP, 비분해성 EGFP 나노캡슐(nEGFP) 및 분해성 EGFP 나노캡슐(de-nEGFP)의 형광 강도를 나타낸다. 형광 강도는 프로테아제 첨가 전의 천연 EGFP에 대해 정규화시켰다.
도 25는 nEGFP 또는 de-nEGFP와 3시간 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 신선한 배지 중에 인큐베이션시킨 후, 상이한 시점에서의 HeLa 세포의 형광 강도를 나타낸다. 형광 강도는 신선한 배지를 사용한 추가적인 인큐베이션을 거치지 않은, 각각의 세포에 대해 정규화시켰다.
도 26은 다양한 농도의 de-nCAS, nCAS, CAS, de-nBSA 또는 nBSA와 48시간 동안 인큐베이션시킨 후 세포 증식 프로파일을 나타내는, MTT 분석을 보여준다. 데이터를 미처리된 세포에 대해 정규화시켰다.
도 27은 천연 CAS, nCAS 또는 de-nCAS를 도입시킨 HeLa 세포를 나타내는 APO-BrdUTM TUNEL 분석을 보여준다. de-nCAS와 인큐베이션시킨 세포 중, PI로 염색시킨 핵 및 Alexa Fluor 488로 염색시킨 절단 말단 표지(nick end label)는 아폽토시스성 DNA 분절화(apoptotic DNA fragmentation)를 보여준다. 데이터는 3회 반복실시된 3회의 독립적 실험으로부터의 오차 바와 함께 표시된, 평균값들을 나타낸다.

실시예

재료

모든 화학물질들은 달리 언급되지 않은 경우 Sigma-Aldrich로부터 구입하였으며, 수령받은 상태로 사용하였다. N-(3-아미노프로필) 메타크릴아미드 히드로클로라이드는 Polymer Science, Inc로부터 구입하였다. 토끼 항-EEA 항체 및 토끼 항-Rab7 항체는 Cell Signaling Technology, Inc로부터 구입하였다. Alexa488 염소 항-토끼 IgG 및 APO-BrdUTM TUNEL 아폽토시스 키트는 Invitrogen Life Technologies, Inc.로부터 구입하였다. 술프히드릴-함유 Cys(Npys) 안텐나페디아 펩티드(Sulfhydryl-containing Cys(Npys) antennapedia peptide)를 AnaSpec, Inc.로부터 구입하였다. 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트는 사용 전에 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 그 후 -20 ℃에서 보관하였다.

기기

나노캡슐의 IR 스펙트럼을 PerkinElmer Paragon 1000 FT-IR 분광계(spectrometer)에서 얻었다. 자외-가시광선 스펙트럼은 GeneSys 6 분광계 (Thermo Scientific)를 사용하여 얻었다. 형광 스펙트럼은 QuantaMaster Spectrofluorimeter (Photon Technology International)를 사용하여 얻었다. 나노캡슐의 TEM 이미지는 Philips EM120 TEM에서 100000X로 얻었다. 관찰 전에, 나노캡슐을 1% pH 7.0 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, PTA) 용액을 사용하여 음성 염색(negatively stain)시켰다. 제타 전위(zeta potential) 및 입자 크기 분포를 Malvern 입도 분석기(particle sizer) Nano-ZS로 수득하였다. 나노캡슐의 SEM 이미지를 JEOL JSM-6700F SEM을 사용하여 얻었다. 실리콘 표면 상의 건조 샘플을 측정 전에 골드로 스퍼터-코팅(sputter-coat)시켰다. 새로 절단된 운모 표면에서 공중 태핑 모드(tapping mod in air)로 작동되는 Nanoscope Ⅲ (Digital Instruments, Santa Barbara, USA)를 사용하여 샘플의 AFM 측정을 수행하였다. 세포의 형광 이미지는 Zeiss Axio Observer.Zl 형광 현미경 또는 Leica TCS SP MP 도립 공초점 현미경(Inverted Confocal Microscope)을 사용하여 수득하였다. 세포 형광 강도 분포는 Becton Dickinson FACScan 분석용 유세포 분석기(Analytic Flow Cytometer)로 결정하였다. 여기광으로 488 nm의 아르곤 레이저를 사용하였다. 질량 스펙트럼은 Applied Biosystem Voyager-DE-STR MALDI-TOF 질량분석계를 사용하여 수득하였다.

EGFP 및 TAT - EGFP 의 준비

종래에 보고된 서열에 따라 (Caron 등, Mol . Ther ., vol. 3, pp. 310-318, 2001)), His이 태그된 EGFP(His-tagged EGFP) 및 TAT-EGFP 융합 단백질의 서열을 디자인하였다. 융합 단백질을 형질전환시킨 대장균(Escherichia coli) BL21 내에서 발현시키고, 니켈-수지 친화성 컬럼(Sigma aldrich)을 사용하여 정제하였다. EGFP 및 TAT-EGFP를 His-태그 펩티드(His-tag peptide)의 추가적인 가공 없이 하기 실험에 직접 사용하였다. EGFP의 농도를 489 nm에서 흡광 계수(extinction coefficient) 53,000 M^-1cm^-1에 의해 결정하였다.

안텐나페디아 펩티드 EGFP 컨쥬게이트의 제조

EGFP를 pH 7.2의 50 mM 소듐 포스페이트, 0.15M NaCl 중에 2 mg/mL의 농도로 용해시켰다. EGFP 용액 1 mL에 DMSO 중 2 mM 농도의, Sigma-aldrich에서 구입한 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP) 25 ㎕를 첨가하였다. 혼합하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 개질된 EGFP를 5O mM 소듐 포스페이트, 0.15 M NaCl, 1O mM EDTA, pH 7.2를 사용한 겔 여과에 의해, 반응 부산물 및 비개질된(unmodified) EGFP로부터 정제하였다. AnaSpec, Inc.에서 구입한 술프히드릴-함유 Cys(Npys) 안텐나페디아 펩티드를 0.5 mg 첨가하여 안텐나페디아 펩티드 EGFP 컨쥬게이트(conjugate)를 생성시키고, 최종 컨쥬게이트를 겔 여과에 의해 정제하였다. MALDI-MS에 의해 얻은 안텐나페디아 펩티드 대 EGFP의 비율은 약 1:1이었다.

단백질 농도 분석

나노캡슐 형태의 단백질 함량을 비신코닌산(bicinchoninic acid, BCA) 비색 단백질 분석(colorimetric protein assay)에 의해 결정하였다. 간략하게, 25 mM BCA, 3.2 mM CuSO₄ 및 적절하게 희석된 단백질/나노캡슐을 함유하는 터트레이트(tertrate) 완충액 (pH 11.25)을 60 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용액을 실온까지 냉각시키고, 562 nm에서의 흡광 판독을 자외-가시광선 분광계를 사용하여 수행하였다. 알려진 농도의 BSA 용액을 표준으로 사용하였다.

아폽토시스 분석

상업적으로 입수가능한 APO-BrdU 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 절단부 라벨링(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling, TUNEL) 분석 키트를 사용하여 분리된(isolated) HeLa 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 검출하였다. 요약하면, 세포들을 6-웰 플레이트(six=well plate)에 웰당 100,000개의 세포 밀도로 접종(seed)하고, 10% 소 성장 혈청(bovine growth serum, BGS)을 포함하는 2 mL의 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)에서 배양하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 5 % CO₂, 37 ℃에서 12시간 동안 인큐베이션시켜, 70-80 % 컨플루언시(confluency)에 도달한 후, 단백질/나노캡슐을 첨가하였다. 24시간의 인큐베이션 후에, 세포를 우선 pH 7.4의 포스페이트-완충 염수 중 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 뒤이어 얼음에서 70% 에탄올로 처리하였다. 그 다음, 세포들에 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(terminal deoxynucleotidyl transferase) 및 브로모데옥시우리딘(BrdUrd)을 포함하는 DNA 표지화 용액(DNA labeling solution)을 로딩하였다. 세포들을 그 다음 Alexa Fluor^® 488 색소로 표지화된 항-BrdUrd 항체로 염색시켰다. 상기 세포들을 최종적으로 RNase A를 포함하는 프로피듐 요오다이드(propidium iodide, PI) 용액으로 염색하고, Alexa Fluor 488 및 PI에 적합한 필터를 사용하여 형광 현미경(Zeiss, Observer Zl) 하에서 가시화하였다.

실시예 1 - 나노캡슐 합성

분해성 또는 비분해성 가교제를 포함하는 EGFP 나노캡슐

도 1에 도시된 바와 같이, 중합가능한 비닐 기를 단백질 (I)에 공유결합에 의해 연결시킨다. 모노머 (1, 2) 및 가교제 (3 또는 4)를 포함하는 수성 용액 중에서의 뒤이은 중합은 각각의 단백질 코어를 얇은 폴리머 쉘로 피복시킨다. 이 체계(scheme)는 각각 비분해성 (3) 또는 분해성 (4) 가교제의 사용에 의한, 비분해성 (II) 또는 분해성 (III) 피막(skin)을 갖는 단백질 나노캡슐의 합성을 가능하게 한다. 이하 본 명세서에서는, 비분해성 및 분해성 나노캡슐을 각각 nProtein 및 de-nProtein으로 표기하며, 상기 접두어 'n'은 '나노캡슐(nanocapsule)'을 의미한다. 양이온성 (2) 또는 중성 (1) 모노머와 같은, 적절한 모노머의 선택은 표면 전하의 정확한 제어를 가능하게 한다. 단백질 코어는 방대한 단백질 라이브러리로부터 선택할 수 있다.

단백질 개질

3.8 mL의 pH 8.5, 50 mM 소듐 카르보네이트 완충액 중 10 mg EGFP의 일 부피를, 40 mL 디메틸 술폭시드 (dimethyl sulfphoxide, DMSO) 중 4 mg N-아크릴옥시숙신이미드와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 반응 용액을 pH 7.0, 20 mM 포스페이트 완충액에 대해 완전히 투석시켰다.

개질 정도(degree of modification)를 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행시간 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDITOF) 질량 스펙트럼을 사용하여 측정하였고, 단백질 당 5 내지 20개의 비닐 기로 다양했다 (도 2, 표 3).

N-아크릴옥시숙신이미드로 개질시키기 전과 후 단백질 분자량 (MALDI-TOF 질량 분석기로 측정)

명칭	분자량 ( MALDI - TOF MS )	몰 비 (시약 대 단백질)	분자량 증가	비닐 기의 수	잔여 활성(%)
천연 EGFP	29422
N-아크릴옥시숙신이미드로 개질된 EGFP	30352	300	930	17.2
천연 HRP	43248				100
N-아크릴옥시숙신이미드로 개질된 HRP	43512	50	264	4.9	98
SOD	31469				100
N-아크릴옥시숙신이미드로 개질된 SOD	32543	100	1073	8.6	90
천연 카스파아제 3*	59128				100
N-아크릴옥시숙신이미드로 개질된 카스파아제 3*	59650	100	522	9.8	91

*카스파아제-3는 다이머이다; 질량 판독결과에 2를 곱하여 분자량을 계산하였다.

나노캡슐 중합

1 mg/ml^-의 아크릴로일화(acryloylated) EGFP 용액 5 mL를 사용하여, 30 mL의 탈산소 및 탈이온수(deoxygenated and deionized water) 및 4 mL의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 중 용해시킨 2 mg 암모늄 퍼술페이트를 시험관 내에 첨가하여 아크릴로일화 단백질의 표면으로부터 라디칼 중합을 개시시켰다. 0.5 mL의 탈산소 및 탈이온수 중 용해시킨 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 아크릴아미드 및 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드 (비분해성 가교제) 또는 글리세롤 디메타크릴레이트 (분해성 가교제) (몰 비=5:5:1)의 특정한 양을 60분에 걸쳐서 시험관에 첨가하였다. 반응을 질소 대기 중에서 60분 동안 더 진행시켰다. 최종적으로, 모노머 및 개시제(initiator)를 제거하기 위해 투석을 이용하였다. 합성된 EGFP 나노캡슐은 천연 EGFP와 유사한 형광 스펙트럼을 나타냈다 (도 3). 단백질 나노캡슐의 수율은 95%보다 높았다. 비개질된 EGFP를 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 제거하였다.

HRP 나노캡슐

HRP 나노캡슐을 합성하기 위해, 4-디메틸아미노안티피린 (HRP에 대한 중량비 1:10)을 아크릴로일화 반응 및 중합 반응 동안 안정화제로서 반응 혼합물에 첨가하였다. HRP 나노캡슐을 합성하기 위해 유사한 아크릴로일화, 중합, 및 정제 방법을 수행하였다.

SOD , CAS , BSA , HRP 나노캡슐

EGFP 나노캡슐의 경우와 마찬가지의 방법을 사용하여 SOD, CAS, HRP, NIR-667-표지된-BSA 및 로다민-B 표지된-HRP 나노캡슐을 합성하였다. 컨쥬게이트화 기법(conjugating technique)을 사용하여 상기 단백질들을 개질시켜, NIR-667-표지된 BSA 및 로다민-B-표지된 HRP를 합성하였다. CAS를 EGFP와 마찬가지의 방법을 사용하여 발현 및 정제시켰다; 사용된 플라스미드 pHC332는 Dr, A. Clay Clark (North Carolina State University)로부터 친절하게 제공받았다. 20 mM pH 7.0 포스페이트 완충액에 대한 투석 후, Cu, 소 적혈구에서 유래한 Zn-SOD 및 겨자무 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) (Sigma-Aldrich)를 사용하였다.

Au -나노입자로 표지된 나노캡슐

pH 7.5의 완충 용액 중에서 Au-나노입자 (Nanoprobe, NY로부터의 모노-술포-N-히드록시-숙신이미도 나노골드)를 천연 HRP와 5:1 몰비로 1시간 동안 반응시켰다. 과량의 나노골드를 제거하기 위해 겔 여과 (Superdex-75)를 사용하였다. 상기 나노골드 및 단백질의 몰 농도를, 420 nm에서 나노골드에 대한 몰 흡광 계수 155,000 M^-1cm^-1에 기반하여 자외/가시광선 스펙트럼으로부터 계산하였다. 얻어진 Au-표지된 나노캡슐은 0.94의 골드/HRP 비율을 가졌다. 그 다음, 표지된 HRP를 유사한 프로토콜을 사용하여 나노캡슐을 합성하는데 사용하였다. 보다 우수한 TEM 이미징을 위해, 은 증강 기법(silver enhancement technique)을 사용하였다. 요약하면, Au-표지된 나노캡슐을 TEM 그리드에 적가(drop)하고, 탈이온수로 세척하였다. 그 다음, 상기 그리드를 신선하게 준비된 Ag-함유 현상액(developer)에 1-2분 동안 띄워놓고, 물로 세척하고, pH 7.0에서 1% 소듐 포스포텅스테이트를 사용하여 염색시켰다. 이 방법은 3-4 nm의 직경을 갖는 균일한(uniformed) 나노입자를 생성시켰다.

나노캡슐의 특성 규명

도 4A 및 4B는 약 15 nm의 균일한 직경을 보이는 HRP 나노캡슐의 대표적인 TEM 및 AFM 이미지이다. 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)은 HRP 나노캡슐이 16.8 nm에서 좁은 크기 분포를 나타낸다는 것을 시사한다 (도 5). DLS에 의해 결정된 보다 큰 직경은 수성 용액 중의 수화층(hydration layer)에서 기인할 수 있다. HRP 분자의 수력학적 반경(hydrodynamic radius)은 약 5 nm이므로, 평균 쉘 두께는 약 5 내지 8 nm이다. 각각의 HRP 효소를 1.4 nm 골드 나노입자로 표지화함으로써, 대부분의 나노캡슐들은 단일 골드 나노입자만을 함유하는 것으로 관찰되었으며 (도 4C), 이는 단일-단백질 코어-쉘 구조를 더욱 확인시킨다. 또한, DMAEMA (양전하성) 대 AAm (중성)의 중량비를 0:1, 1:3 및 1:1로 조절하는 것은 각각 -12.8, 8.64 내지 15.2 mV의 조절가능한 제타 전위를 갖는 BSA 나노캡슐의 합성을 가능하게 한다 (도 6). 이 간단한 방법은 잘 제어된 크기, 표면 전하 및 단백질 코어를 갖는 신규한 단백질-세포내-전달 벡터(protein-intracellular-delivery vector)를 제조하기 위한 효과적인 경로를 제공한다.

실시예 2 - 나노캡슐 단백질 활성

천연 HRP (좌측) 및 HRP 나노캡슐 (우측)의 상대 촉매 활성을 결정하였다. 천연 HRP 및 HRP 나노캡슐의 활성 시험은 기존의 프로토콜(Davis 등, J. Biol . Chem., vol. 256, pp. 5992-5996, 1981)을 따랐다. 요약하면, 1회 수행 동안, 0.9 ml의 pH 5.5, 10O mM 포스페이트 시트레이트, 0.05 ml의 0.02 M H₂O₂, 및 1O ㎕의 0.2 ㎍/mL HRP 또는 HRP 나노캡슐을 시험관 내에 첨가하였다. 0.02 M TMB를 포함하는 DMSO 0.05 ml를 첨가하여 반응을 개시시키고, 655 nm에서 모니터링하였다. 상기 TMB의 산화 속도(oxidation rate)를 TMB의 산화 산물에 대한 몰 흡광 계수(molar absorption coefficient) (39,000 M^-1cm^-1)를 사용하여, 흡수 곡선의 초기 선형 부분의 기울기로부터 해석하였다.

실시예 3 - 프로테아제에 대한 안정성

EGFP 및 EGFP 나노캡슐을 PBS 완충액 중 1 mg/mL의 트립신 및 α-키모트립신(chymotrypsin)과 함께 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. EGFP 및 EGFP 나노캡슐의 형광 강도를 489 nm의 여기 파장에서 상이한 시간 간격을 두고 결정하였다.

생리학적 환경에서 프로테아제의 광범위한 존재로 인한 낮은 단백질 안정성은 치료 단백질(therapeutic protein)의 적용에 있어서 또다른 난점이다. 트리펩티드 Ser65-Tyr66-Gly67의 번역후 고리형성(posttranslational cyclization)을 통하여 생성되는, EGFP 분자 내부의 형광단(fluorophore)은 주위 미세환경에 극히 민감하다 (Tsien, R. Y., Annu . Rev . Biochem ., vol. 67, pp. 509-544, 1998). 외부 β-배럴(barrel) 구조의 보호가 없는 경우, 상기 형광단은 용이하게 파괴 및 소멸(quench)될 수 있다 (Ormo 등, Science , vol. 273, pp. 1392-1395, 1996). 폴리머 쉘의 존재는 프로테아제로부터 단백질 코어를 보호한다. 도 8A는 50 ℃에서 3시간 동안 1 mg/mL 프로테아제 (트립신 및 α-키모트립신)에 노출시킨 후 천연 EGFP 및 EGFP 나노캡슐의 형광 강도를 비교한다. 천연 EGFP는 그의 본래 형광 강도의 단지 60%만을 유지한 반면, 상기 나노캡슐은 90% 넘게 유지하였다.

나노캡슐의 안정성을 더욱 확인하기 위해, 나노캡슐의 도입(transduction) 후 세포 형광 강도(cellular fluorescence intensity)를 모니터링하였다. 도 8B는 도입 후 0, 48, 및 144 시간 경과시 HeLa 세포의 형광 강도 분포를 나타낸다. 예상한 대로, HeLa 세포의 형광 강도는 세포 증식(cell propagation)의 결과로서 시간에 따라 감소한다. 그럼에도 불구하고, EGFP 나노캡슐을 도입한 세포들의 형광 강도는 심지어 144시간 후에도 대조군 (천연 EGFP)에 비해 현저하게 높다. 이에 일관되게, TAT-EGFP가 우수한 전달 효율을 갖는 접근법으로 간주되고 있음에도 불구하고, 이들은 다른 단백질들과 마찬가지로 프로테아제의 공격을 받는다. TAT-EGFP와의 인큐베이션 후 48시간 경과시 세포 형광 강도의 91% 소실을 보인 것과 비교하여, EGFP 나노캡슐의 경우 단지 42%의 감소만이 관찰되었다 (도 8D).

실시예 4 - 세포 내부화( cellular internalization )

세포 내부화 연구를 형광 미세현미경 기법(fluorescence microscopic technique) 및 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 평가하였다. HeLa 세포를, 10% 소 성장 혈청(bovine growth serum, BGS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보강한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 배양하였다. 나노캡슐을 첨가하기 하루 전에 세포 (20000개의 세포/웰, 24-웰 플레이트)를 접종하였다. 다양한 농도의 나노캡슐 또는 천연 단백질을 상기 세포 배지 내에 첨가하였다. 37 ℃에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 세포들을 PBS로 3회 세척하고, 형광 현미경으로 가시화하거나, 또는 트립신 처리하고, 원심분리하고 PBS 중에 재현탁시켜 FACS에 의해 분석하였다. 엔도좀(endosome)/리소좀(lysosome) 염색을 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 요약하면, 로다민-표지된 HRP 나노캡슐과 인큐베이션시킨 후에, 세포를 단시간 동안 세척하고, 2% 포름알데히드로 고정시키고, PBS/1% 트리톤(Triton)을 침투(permeate)시키고, 5% BSA로 블로킹하고, 토끼 항-EEA 항체 (초기 엔도좀의 경우) 또는 토끼 항-Rab7 항체 (리소좀의 경우)로 하룻밤 동안 처리하였다. 세포들을 Alexa488 염소 항-토끼 IgG로 염색시킨 다음, 공초점 현미경으로 관찰하였다.

EGFP 나노캡슐을 모델로서 사용하여 세포 도입을 연구하였다. 도 9는 400 nM EGFP 나노캡슐 또는 비개질된 EGFP와 2시간 동안 공동배양한 후 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 비개질된 EGFP와 비교했을 때, 나노캡슐은 HeLa 세포에 의해 보다 효과적으로 내부화되었다. 인큐베이션 시간을 2시간에서 4시간 또는 8시간으로 연장시킨 결과, 형광 강도는 각각 448에서 559 또는 619로 약간 증가하였으며, 이는 흡수(uptake)가 대부분 2시간 내에 종료된다는 것을 시사한다 (도 11). 세포 형광의 강도는 보다 높은 나노캡슐 농도에서 증가하였다 (도 12A). 이와 비교하여, TAT-EGFP 융합 단백질 (TAT는 HIV 바이러스로부터 유래한 세포-투과 펩티드이다)과 2시간 동안 인큐베이션시킨 세포들은 나노캡슐-처리된 세포들의 형광 강도에 비해 100배 더 낮은 형광 강도를 나타냈다 (도 12A). 또한, 나노캡슐의 표면 전하가 세포 흡수 효율에 미치는 효과를 또한 조사하였다. 13.3 mV의 제타 전위를 갖는 400 nM 나노캡슐과 함께 인큐베이션시킨 HeLa 세포들은, 6.7 mV 나노캡슐을 사용하여 얻어진 형광 강도의 3.2배에 해당하는, 398의 평균 형광 강도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 12C).

nEGFP를 운반하는 세포들은 천연 EGFP를 갖는 세포들보다 현저하게 높은 형광 강도를 나타낸다 (도 12A). CPP-보조 전달과 비교하여, 이 전략이 유리하다. 동일한 단백질 농도에서, 나노캡슐과 인큐베이션시킨 세포들은 TAT-EGFP 융합 단백질 (도 12A) 또는 안텐나페디아-EGFP 컨쥬게이트 (도 12B: TAT 및 안텐나페디아는 각각 HIV-Tat 단백질 및 안텐나페디아 호메오도메인에서 유래한 CPP이다)를 갖는 세포들에 비해 수백배 내지 수천배(2 or 3 orders of magnitude) 더 높은 형광 강도를 보인다 (도 12A). 나노캡슐의 흡수는 시간 (도 13), 농도 (도 12A) 및 제타 전위 (도 12C)에 따라 증가하는 것으로 나타났다 그러나, 나노캡슐 크기 (7.5 내지 15.7 nm 범위, 도 14)의 유의한 영향은 관찰되지 않았다

엔도사이토시스 억제

나노캡슐의 흡수 경로는 엔도사이토시스 과정을 포함할 수 있다. HeLa 세포를 EGFP 나노캡슐과 4 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 결과, 37 ℃에서보다 훨씬 더 낮은 세포 흡수를 나타냈다 (도 9). 이러한 관찰결과는 세포 흡수가 주로 활성화된 경로(activated pathway), 즉 엔도사이토시스를 통한다는 것을 확인시켜 주며, 이는 대부분의 양이온성 CPP 및 폴리머를 사용하여 관찰된 엔도사이토시스 과정과 일치한다 (Brooks 등, Adv. Drug Deliv. Rev., vol. 57, pp. 559-577, 2005; Poon 등, Biochem. Soc. Trans., vol. 35, pp. 778-793, 2007; Futami 등, J Biosci. Bioeng., vol. 99, pp. 95-103, 2005; Fischer 등, J. Bio. Chem., vol. 279, pp. 12625-12635, 2004)

HeLa 세포 (20000개의 세포/웰, 24-웰 플레이트)를 나노캡슐을 첨가하기 하루 전날 접종하였다. 실험 전에, 배지를 2 mM 아밀로리드(amiloride)(마크로피노사이토시스(macropinocytosis)의 억제제), 20 ㎍/mL 클로로프로마진 (CPZ, 클라트린(clathrin)-매개 엔도사이토시스의 억제제), 또는 5 mM β-시클로덱스트린(β-CD, 소포(caveolae)-매개 엔도사이토시스의 억제제)를 포함하는 신선한 배지 0.5 ml로 교체하였다. 30분 후에, 50 nM EGFP 나노캡슐을 세포 배지에 첨가하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 세척한 후에, 세포들을 트립신으로 처리하고, 원심분리시키고, PBS 중에 재현탁시키고, FACS에 의해 분석하였다. 엔도사이토시스 억제제를 포함하지 않는 배지에서 인큐베이션시킨 HeLa 세포들을 대조군으로 사용하였다. 적용된 3가지의 엔도사이토시스 억제제 중에 (도 15), 단지 β-시클로덱스트린 (β-CD)만이 나노캡슐 흡수를 효과적으로 억제하여, 소포-매개 엔도사이토시스 경로를 시사했다.

클로로퀸 ( chloroquine ) 처리

EGFP 나노캡슐과 사전-인큐베이션시킨 HeLa 세포의 확대 형광 이미지 (도 16)는 나노캡슐의 불균질(inhomogeneous) 분포를 나타낸다.

HeLa 세포 (20000개의 세포/웰, 24-웰 플레이트)를 상기 나노캡슐을 첨가하기 하루 전날 접종하였다. 실험 전에, 배지를 100 μM 클로로퀸을 포함하는 신선한 배지 0.5 ml로 교체하고; 세포들을 0.2 μM EGFP 나노캡슐과 함께 3시간 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 세척한 후, 세포들을 형광 현미경으로 관찰하였다. 클로로퀸을 포함하지 않는 배지에서 인큐베이션시킨 HeLa 세포들을 대조군으로 사용하였다.

향-리소좀 작용제(lysosomotropic agent)인 클로로퀸 (Fischer 등, J Bio . Chem., vol. 279, pp. 12625-12635, 2004; Ciftci 등, Int. J. Pharm ., vol. 218, pp. 81-92, 2001)은 인큐베이션 동안 배지로 도입되어 엔도좀을 파괴시켰다. 그 결과, 소포(vesicle) 내로 포획된 나노캡슐의 수가 감소하여, 세포 내에서 상기 나노캡슐의 균일한 분산을 초래하였다 (도 16). 그럼에도 불구하고, 클로로퀸의 사용 전에, 고농도의 나노캡슐이 사이토졸(cytosol) 내에서 관찰되어 (도 17에서, 적색 화살표), "프로톤-스폰지(proton-sponge)" 효과에 의한 것일 수 있는, 엔도좀으로부터의 나노캡슐의 부분적 방출을 시사한다 (Akinc 등, J Gene Med., vol. 7, pp. 657-663, 2004).

TEM 연구

나노골드-표지된 나노캡슐을 도입시킨 HeLa 세포를, 4 ℃에서 1시간 동안 1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용하여 고정시키고, 2% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide)를 1시간 동안 처리하고, 단계별(graded series) 에탄올 세척으로 탈수시켰다. 처리된 세포들을 그 다음 Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 포매하였다. 초박(ultrathin) (~ 80 nm) 절편을 2% 우라닐 아세테이트로 염색시키고, TEM을 사용하여 검사하였다.

일관되게, 골드-표지된 나노캡슐과 사전-인큐베이션시킨 HeLa 세포의 TEM 이미지는 엔도좀과 유사한 윤곽을 갖는, 응집된(aggregated) 골드 입자를 보여주어 (도 17, 녹색 화살표), 나노캡슐의 엔도좀 내 포획을 시사한다.

복수 단백질 내부화( multiple protein internalization )

이 방법을, 낮은 독성을 갖는 복수의 단백질 전달로 일반화할 수 있다. 도 18A는 EGFP (녹색), 로다민-B-표지된 HRP (적색) 및 AlexaFluoro-664-표지된 BSA (청색)의 나노캡슐을 동시에 내부화하는 HeLa 세포의 형광 이미지를 나타낸다. 동시 도입 후 공동-국지화(co-localization)의 정량이 도 18B에 제시되어 있다. 그와 같은 복수-단백질 전달은 둘 이상의 단백질이 상승적으로 또는 동시에(in tandem) 작용하는 경우의 치료에 대한 전망을 밝게 한다 (Yamauchi 등, Japan. J. Cancer Res., vol. 83, pp. 540-545, 1992; Kaliberov 등, Cancer Gene Ther., vol. 13, pp. 203-214, 2006).

실시예 5 - 인 비트로 활성

세포 생존율( cell viability )

나노캡슐의 독성을 천연 단백질을 대조군으로 사용하여 MTT 분석에 의해 평가하였다. HeLa 세포 (7000개의 세포/웰)을 상기 나노캡슐에 노출시키기 하루 전날 96-웰 플레이트에 접종하였다. 다양한 농도의 나노캡슐을 상기 세포와 2-4시간 동안 인큐베이션시키고, 혼합물로부터 제거하고, 신선한 배지와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 웰에 MTT 용액 (20 ㎕)을 첨가하고, 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 배지를 제거하고 100 ㎕ DMSO를 상기 세포에 첨가하였다. 플레이트를 교반대(shaking table)에 두고, 150 rpm으로 5분 동안 용액을 완전하게 혼합시킨 다음, 560 nm에서 흡광 판독을 수행하였다. 미처리된 세포들을 100% 세포 증식 대조군으로 사용하였다.

도 19는 상이한 농도의 EGFP 나노캡슐 및 천연 EGFP에 노출시킨 후 HeLa 세포의 생존율을 비교한다. EGFP 나노캡슐 및 천연 EGFP 모두 각각의 시험 농도에서 유사한 세포독성을 나타낸다 (도 19). 17.24 μM EGFP 나노캡슐에 노출된 경우에서조차, 세포 생존율은 단지 15% 만큼 감소했다.

암세포 성장 억제

96-웰 플레이트에 배치된 HeLa 세포 (2000개의 세포/웰)를 HRP 나노캡슐 또는 천연 HRP와 함께 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 서로 다른 농도의 인돌-3-아세트산(IAA)에 12시간 동안 노출시켰다. MTT를 사용하여 분석된 HeLa 세포 생존 곡선으로부터 1/2 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)를 결정하였다.

높은 전달 효율, 낮은 독성 및 장기간의 안정성 외에도, 전달되는 약학적 단백질이 내부화된 후에 완전한 생물촉매(biocatalytic) 활성으로 그의 생활성을 유지할 수 없다면 단백질 전달 시스템은 효과적일 수 없다. 효소 나노캡슐의 전달이 활성을 갖는 세포내 효소를 초래하는지 여부를 결정하기 위해, HRP 및 SOD 나노캡슐의 전달을 시험하였다. 인돌-3-아세트산 (IAA) 및 HRP의 조합은 최근 강력한 전구약물 암 치료법으로서 제안되어 왔다 (Folkes 등, Biochem . Pharmacol ., vol. 61, pp. 129-136, 2001). IAA는 인체에서 우수한 내성을 갖는(well tolerated) 식물 호르몬이며, HRP에 의해 자유 라디칼 중간체(free radical intermediate)로 특이적으로 변환되고, 포유동물 세포에서 아폽토시스를 유도한다 (de MeIo 등, Toxicol . Lett., vol. 148, pp. 103-111, 2004). HRP 나노입자를 합성하였으며, 천연 HRP 활성의 92%를 유지하는 것으로 나타났다 (또 7). HRP 나노캡슐이 세포 내부화 후에 그의 활성을 유지하는지 여부를 결정하기 위해, HeLa 세포를 HRP 및 HRP 나노캡슐과 함께 인큐베이션하고, 발색 기질(chromogenic substrate)인 1 mM TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 및 1 μM H₂O₂에 노출시켰다 (도 20). 나노캡슐이 도입된 세포들은 나노캡슐 농도의 증가에 따라 강화되는 녹색을 나타내며, 이는 세포 내에서 활성을 갖는 나노캡슐의 성공적인 전달을 확인시킨다. HRP 나노캡슐의 세포내 활성을 추가적으로 결정하기 위해, HeLa 세포를 HRP 또는 HRP 나노캡슐과 함께 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, IAA를 배지에 첨가하였다. IAA 농도가 증가할수록 HRP 나노캡슐로 전처리된 세포들은 세포 생존율의 급격한 감소를 보인 반면, 천연 HRP를 처리한 세포들은 대조군 세포와 유사한 결과를 나타내어 (도 21A), 효소가 세포 내에서 생물촉매 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다.

세포내 효소 나노캡슐 활성을 추가적으로 확인하기 위해, SOD 나노캡슐을 세포내 수퍼옥시드 생성 화합물(superoxide generating compound)인, 파라콰트(paraquat)로 처리된 세포 내로 전달하였다. 호기성 세포의 산소 대사 중에 생성되는 부산물인 수퍼옥시드 이온은, 염증, 당뇨, 발암(carcinogenesis), 허혈/재관류 손상(ischemia/reperfusion injury) 및 신경퇴행성 질환과 같은, 광범위한 인간 질환의 개시 및 진행에 관여한다 (Fridovich 등, Ann. Rev . Pharmacol . Toxicol ., vol. 23, pp. 239-257, 1983; Finkel 등, Nature , vol. 408, pp. 239-244, 2000; Ames 등, Proc . Natl . Acad . ScI USA, vol. 90, pp. 7915-7922, 1993). SOD는 수퍼옥시드 음이온을 효과적으로 분해(dismutate)시킬 수 있고, 자유 라디칼의 독성을 제거하는데 핵심적인 역할을 하며, 세포들을 산화적 손상(oxidative damage)으로부터 보호한다 (McCord, J. M., Method in Enzymol., vol. 349, pp. 331-341, 2002). 따라서, 세포내 SOD의 활성은 세포 생존율과 직접적으로 상관시킬(correlate) 수 있다. 도 21B는 SOD 나노캡슐과 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 5 mM의 파라콰트에 12시간 동안 노출시킨 경우, 상대 세포 생존율을 나타낸다. 상기 SOD 나노캡슐은 낮은 나노캡슐 농도에서 세포들을 산화적 손상으로부터 효과적으로 보호한다. 그러나, 나노캡슐 농도를 증가시키면, 세포 생존율은 감소한다. 이 곡선은 다수의 상이한 심근경색 허혈-재관류 모델에서 관찰되는 용량-반응 곡선과 일치하며, 이는 높은 SOD 농도에서 히드록시 라디칼의 증가된 생산량에 기인한 것일 수 있다 (Fridovich, L, Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol ., vol. 23, pp. 239-57, 1983). 그럼에도 불구하고, 이 작업은 다양한 치료법 또는 항노화제(anti-aging agent)를 위한 기능성 나노캡슐의 잠재적 용도를 추가적으로 입증한다.

실시예 5 - 인 비보 생체분포( in vivo biodistribution )

모든 동물 실험은 로스엔젤레스 ARC(Chancellor's Animal Research Committee)에서 캘리포니아 대학에 의해 제정된 실험동물의 보호 및 사용을 위한 지침(Guidelines for the Care and Use of Research Animals)에 따라 수행하였다. 6-8주령의 누드 마우스에 100 ㎕ 나노캡슐 염수 용액 또는 염수 용액(대조군)을 주사하였다. 24시간 및 48시간 후, 마우스를 희생시키고 모든 주요 기관들을 생체 외 이미징을 위해 적출하였다. 그 다음, 나노캡슐을 포함하는 동결시킨 기관들을 동결 배지(freezing medium) 내에 포매시키고, 크리오스타트(cryostat)에서 박편으로 절단하였다(microtome). HRP 나노캡슐을 함유하는 조직 절편들을 디히드로에티듐(Invitrogen)으로 염색시키고, 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였다.

상기 나노캡슐의 인 비보 전달은 누드 마우스에 0.2 mg의 EGFP 나노캡슐 또는 대조군 EGFP를 복강 내 주사하여 수행하였다. 8시간 후, 다양한 기관 절편의 형광 공초점 현미경 분석은 나노캡슐을 주사받은 마우스로부터 검사된 모든 조직에서 강한 신호를 나타냈으며, 반면 대조군 EGFP를 주사받은 마우스에서의 신호는 백그라운드 수준(background level)에 머물렀다 (도 22). 형광 강도는 시간에 따라 감소했으나, 주사 50시간 후에도 높은 수준을 유지하였다. 그와 같은 고도로 안정한 나노캡슐은 줄기세포 이미징 및 종양 추적(tumor tracking)과 같은, 장기간의 안정성을 요구하는 인 비보 세포 이미징 마커(imaging marker)로서 사용될 수 있다. 또한, 주사된 나노캡슐은 조직 내부에서 여전히 활성인 상태로 존재한다. 예를 들면, HRP 나노캡슐 또는 천연 HRP 주사 8시간 후에, 마우스를 희생시키고, 절편화하고, 디히드로에티듐(HRP의 형광 기질)을 사용하여 HRP 활성에 대해 조직을 검사하였다. 형광 공초점 현미경 이미지로부터, 생성물 에티듐으로부터의 적색 형광이 분명하게 관찰되며, 이는 나노캡슐이 인 비보에서 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 6 - 분해성 가교제를 포함하는 나노캡슐

안정성 및 pH -유도( pH - induced ) 분해

비분해성 나노캡슐 플랫폼(platform)을 사용하여, 소분자 기질을 위한 단백질은 장기간의 안정성 및 높은 활성을 갖는 상태로 효과적으로 전달될 수 있다는 것이 입증되었다. 그러나, 거대분자 기질의 경우, 폴리머 피막이 코어 단백질로의 그의 접근을 막을 수 있다. 혈청 및 후기(late) 엔도좀은 각각 ~7.4 및 ~5.5의 pH 값을 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 이러한 장애를 극복하기 위해 산 분해성 나노캡슐이 개발되었다. 예로서 de-nCAS 및 nCAS를 사용하여, pH 5.5 (도 23A) 및 7.4 (도 23B)에서의 크기 변화를 연구하였다. nCAS는 양쪽 pH 값에서 모두 안정하나, de-nCAS는 pH 7.4에서만 안정하다. pH 5.5에서, de-nCAS의 평균 직경은 3시간 내에 20 nm에서, 천연 CAS (~6 nm)와 비슷한 크기인 6 nm로 신속하게 감소한다. 중요하게는, 분해성 나노캡슐은 pH 7.4에서 트립신 및 α-키모트립신에 대해 안정하며 (도 24), 이는 상기 분해성 나노캡슐이 순환계에서 안정하게 잔존할 수 있게 하고, 엔도좀 내에서 분해되어 그의 단백질 적재물을 세포내로 방출시킬 수 있게 한다.

세포내 분해를 추가적으로 정량하기 위해, de-nEGFP 및 nEGFP를 HeLa 세포로 전달시켰다. 24시간 후, de-nEGFP를 갖는 세포의 세포 형광 강도는 nEGFP를 갖는 세포에 비해 현저하게 더 낮았으며 (도 25), 상기 분해성 나노캡슐은 산성 세포내 환경에 반응하여 그의 쉘을 탈복시킬 수 있다는 것을 확인시킨다.

아폽토시스 유도

탈보호 과정은 적재 단백질을 프로테아제 공격에 필연적으로 노출시키지만, 적재 단백질과 거대 기질과의 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들면, 아폽토시스, 네크로시스(necrosis) 및 염증 반응에서 중요한 역할을 수행하는 시스테인 프로테아제 패밀리(cysteine protease family)의 일원인 CAS는, 세포 내의 다른 단백질 기질을 분해하여 아폽토시스를 유발한다 (Nicholson 등. Nature, vol. 376, pp. 37-43, 1995; Porter 등, Cell Death Differ., vol. 6, pp. 99-104, 1999; Oliver 등, Drug Resist. Updates, vol. 8, pp. 163-170, 2005). 도 26에 제시된 바와 같이, HeLa 세포와, 천연 CAS, nCAS, de-nBSA 또는 nBSA의 인큐베이션은, de-nCAS와의 인큐베이션에 비해 현저하게 더 높은, 비슷한 생존율을 보인다. 말단 dUTP 절단부 라벨링 (Terminal dUTP nick-end labelling, TUNEL) 분석 (도 27)은 de-nCAS에 의해 유발된 아폽토시스를 확인시킨다.

결론

형광, 발광(illuminence) 및 치료 단백질의 세포내 사용은 암 및 단백질-결핍 질환의 진단 및 치료에 있어서 매우 중요하다. 2007년에, 치료 단백질 시장은 480억 달러까지 거의 19% 성장하였으며, 2010년에는 900억 달러를 초과하는 매출을 달성할 것으로 예상된다. 그러나, 미래의 성장은 동 산업이 약물 전달 과제, 및 비용 문제를 포함한 다수의 장애를 극복하는지 여부에 크게 좌우된다. 고혈압을 위한 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme), 빈혈을 위한 에리스로포이에틴(erythropoietin), 간염을 위한 인터페론(interferon), 고셰병(Gaucher' s disease)을 위한 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase) 및 효소 전구약물 화학요법을 위한 아스파라기나아제(asparaginase)와 같은 치료 단백질은 특이적이고 효과적인 치료 약물로 인식되어 있다. 녹색-형광 단백질(green-fluorescence protein), 적색-형광 단백질 및 유기 형광 분자로 표지된 단백질, 반딧불이 또는 딱정벌레에서 유래한 루시페라아제(luciferase) 및 겨자무 퍼옥시다아제와 같은, 형광 및 생체발광(bioilluminence) 단백질이 종양 및 혈관 이미징에 널리 사용된다. 이 단일 단백질 폴리머 나노캡슐은 천연 단백질을 직접 사용하는 경우에 비해, 인 비트로 및 인 비보 모두의 세포내 전달에 있어서 보다 높은 효능, 활성 및 안정성을 나타낸다.

단백질 이미징 및 치료법은 암 및 단백질-기능장애 질환(protein-malfunctioned disease)의 진단 및 치료에 대한 가장 직접적이고 안전한 접근법을 제공한다. 그러나, 단백질 이미징 및 치료법의 광범위한 사용은, 낮은 세포내 전달 효율 및 프로테아제에 대한 단백질의 불량한 안정성과 같은, 여러 실질적인 기술적 장벽들에 의해 여전히 제한된다. 이 단일 단백질 폴리머 나노캡슐은 인 비트로 및 인 비보 모두에서 세포내 전달의 높은 효율, 활성 및 안정성을 위한, 치료, 이미징, 및 기타 적용에 있어서 매우 유망한 경로를 제시한다. 이는 천연 단백질에 기반한 경우에 비해, 암에 대한 단백질-기반 이미징의 보다 우수한 대비 및 정확도를 제공하며, 단백질 치료법에 있어서 보다 긴 반감기, 보다 높은 활성, 및 보다 낮은 투여량을 제공한다.

본 발명은 그의 일부 특별한 구체예들을 참고하여 설명 및 예시되며, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 또는 프로토콜의 다양한 개조(adaption), 변화, 변형, 치환, 삭제 또는 부가가 이루어질 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항들의 범위에 의해 정의되며, 그와 같은 청구항들은 합리적인 범위에서 넓게 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims

단일-단백질 코어(single-protein core) 및 상기 단백질 코어에 공유결합에 의해 결합된(covalently-anchored) 얇은 폴리머 쉘(shell)을 포함하는 단백질 나노캡슐.
제1항에 있어서, 상기 단일-단백질 코어는 복수 개의 중합가능한 기(polymerizable group)를 갖는 단백질을 포함하는 것인 나노캡슐.
제2항에 있어서, 상기 중합가능한 기는 이중 결합인 것인 나노캡슐.
제2항에 있어서, 상기 중합가능한 기는 비닐, 아크릴, 알킬아크릴 및 메타크릴(methacryl)로부터 선택되는 것인 나노캡슐.
제1항에 있어서, 상기 나노캡슐은 하나 이상의 모노머 단위(monomer unit)와 공중합된 단일-단백질 코어를 포함하는 것인 나노캡슐.
제5항에 있어서, 상기 나노캡슐은 2개 이상의 상이한 모노머 단위와 공중합된 단일-단백질 코어를 포함하는 것인 나노캡슐,
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 모노머 단위는 pH = 7.0에서 양전하 또는 음전하를 갖는 것인 나노캡슐.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노캡슐은 하나 이상의 모노머 단위 및 하나 이상의 가교제(crosslinker)와 공중합된 단일 단백질 코어를 포함하는 것인 나노캡슐.
제8항에 있어서, 상기 가교제는 분해성(degradable) 가교제인 것인 나노캡슐.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 개질제(surface modifier)를 추가적으로 포함하는 것인 나노캡슐.
제10항에 있어서, 상기 표면 개질제는 발광(light-emitting) 분자, 세포-표적화 모이어티(cell-targeting moiety), 펩티드, 단백질, 항체 또는 올리고당으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 나노캡슐.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 표면 개질제는 영상화제(imaging agent), 세포 표적화 증진제(cell targeting enhancer) 또는 세포-투과 증진제(cell-penetration enhancer)로서 기능하는 것인 나노캡슐.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 개질제는 항체인 것인 나노캡슐.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일-단백질 코어는 단백질 촉매인 것인 나노캡슐.
제14항에 있어서, 상기 나노캡슐은 상기 단일-단백질 코어의 촉매 활성을 갖는 것인 나노캡슐.
단백질을 하나 이상의 중합가능한 기로 유도체화(derivatize)하는 단계; 및
상기 유도체화된 단백질을 모노머 단위와 공중합시키는 단계를 포함하는, 나노캡슐의 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 중합가능한 기는 이중 결합을 포함하는 기인 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 중합가능한 기는 비닐, 아크릴, 알킬아크릴 및 메타크릴로부터 선택되는 것인 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공중합 단계는 2개 이상의 상이한 모노머 단위를 포함하는 것인 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 모노머 단위는 pH = 7.4에서 양전하 또는 음전하를 갖는 것인 방법.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공중합 단계는 가교제를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 가교제는 분해성 가교제인 것인 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노캡슐의 표면을 개질시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 나노캡슐의 유효 농도에 노출시키는 단계를 포함하는, 단백질의 전달 방법.
제24항에 있어서, 상기 단백질은 치료 단백질(therapeutic protein)인 것인 방법.