FR2637501A1 - Composition stabilisee a base de facteurs de croissance de la famille fgf et de dextrane sulfate, et ses applications - Google Patents

Abstract

Cette composition comprend l'association d'au moins une forme active d'un facteur de croissance de la famille FGF et d'au moins un dextrane sulfate stabilisant l'activité biologique du FGF. Elle est applicable dans les domaines de la médecine, de la chirurgie, de la cosmétologie, de la biotechnologie et de la biologie cellulaire, et plus particulièrement, dans les domaines où les facteurs de croissance peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques, notamment en cicatrisation et régénération tissulaire, ainsi que comme agents cosmétiques.

Description

OPPOSITION STABILISEE A BASE DE FACTEURS DE CROISSANCE DE
LA FAMILLE FGF ET DE DEXTRANE SULFATE, ET SES APPLICATIONS.

La présente invention se rapporte à une composition stabilisée à base d'au moins un facteur de croissance de la famille FGF et de dextrane sulfate, ainsi qu'aux applications de cette composition stabilisée dans les domaines de la médecine, de la chirurgie, de la cosmétologie, de la biotechnologie et de la biologie cellulaire, et, plus particulièrement, dans les domaines ou les facteurs de croissance peuvent autre utilisés comme agents thérapeu- tiques, notamment en cicatrisation et régénération tissulaire, ainsi que comme agents cosmétiques.

La découverte de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes < couramment désignés par l'abréviation FGFs - Fibroblast Growth Factor ) a été faite à la suite des études des activités biologiques facteurs de croissance obtenues dans les extraits d'un tres grand nombre de tissus ou d'organes (cerveau, hypophyse, rétine. humeur vitrée, choroïde, iris, cartilage, rein, foie, placenta, corpus luteum. prostate, os, muscle, etc). La diversité meme des tissus étudiés et des cellules stimulées par ces facteurs in vçtro et in vfvo, ainsi que le grand nombre d'équipes de recherche qui ont indépendamment contribué a la caractérisation, a l'isolement et à l'identification complète de ces facteurs, expliquent la multitude des noms et des sigles donnés par ces différents auteurs pour les désigner.Il apparaît ainsi maintenant de façon claire que tous ces extraits contiennent des facteurs de croissance de la famille des FGFs et que cette famille peut entre représentée par deux branches principales
La première branche a été décrite sous les noms de FOF basique, de facteur de croissance basique ou de type 2 affin pour l'héparine ou Heparin Binding Growth Factors (HBGF II > , de facteur de croissance dérivé du cerveau ou
Brain-Derived Growth Factor II (BDGF Il), de facteur de croissance dérivé de l'oeil ou Eye-Derived Growth Factor I
CEDGF I), de facteur de croissance des astrocytes II ou
AGF II. de facteur de croissance dérivé du cartilage < CDGF II > etc., alors que la deuxième branche de la famille
FGF a été décrite sous les noms de FGF acide ou facteur affin pour l'héparine de type I < HBGF I > , facteur dérivé du cerveau ou BDGF I, de facteur de croissance dérivé de l'oeil ou EDGF II, de facteur de croissance des astrocytes I ou AGF I, de facteur de croissance dérivé du cartilage (CDGF I > , etc. A titre de références bibliographiques concernant les facteurs de croissance, on citera
Roy R. Lobb, dans Analytical Biochemistry 154. 1-14 (1986)", et J. Courty et coll, dans Biochem. Biophys. Res.

Commun., 136, 102-108 < 1986 > .

Ces facteurs ont donc été nommés, soit selon le type de cellules cibles utilisées (facteurs de croissance des fibroblastes, astrocytes ou cellules endothéliales, avec les sigles respectivement FGF, AGF, ECGF), soit selon la source d'où ce facteur est extrait (par exemple, facteur de croissance dérivé du cerveau, dérivé de la rétine ou des yeux, du cartilage, d'hépatocytes en culture, avec les sigles respectivement BDGF, RDGF, EDGF, CDGF, HDGF, etc. > , soit encore selon une propriété biochimique ou biologique (facteurs de croissance affins pour l'héparine (HBGF) ou facteur tumoral angiogénique < TAF > ), les deux principales branches de la famille étant alors nommées selon ces sigles précédés ou suivis de la mention acide ou basique , ou de la mention type I ou type II .

C'est en suivant l'activité biologique sur des cellules en culture que ces facteurs ont pu etre purifiés.

Les premières caractéristiques physico-chimiques < poids moléculaire et point isoélectrique) ont été publiées par
Gospodarowicz, J. Biol. Chem. 250 2515 < 1975 > pour la forme basique, et par Barritault et coll., J. Neurosci. 8, 477-490 < 1982 > pour la forme acide.

La purification à homogénéité des deux formes du
FGF a permis d'établir leurs structures primaires : Esch F.

et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 82, 6507 < 1985 > , pour la forme basique, et Gimenez Gallego et collet Science, 230, 1385-1388 (1985 > , pour la forme acide. L'isolement des deux formes a été grandement favorisé par la découverte d'une forte affinité de ces facteurs pour l'héparine et le utilisation subséquente d'une chromatographie d'affinité sur héparine immobilisée (Shing et col 1., Science, 223.

1296-1299 (1984 > ).

In vitro, les FGFs sont capables de stimuler la prolifération et la différenciation d'un grand nombre de cellules provenant de tissus et especes différents. On citera les cellules fibroblastiques, endothéliales, épithéliales, les kératinocytes, chondrocytes, myoblastes, astrocytes, etc. On signalera également le rôle des FGFs dans la survie neuronale. In vitro, les propriétés neurotrophiques, engiogéniques et cicatrisantes des FGFs ont également été démontrées dans de nombreux systèmes.

Le rôle, dans la stimulation de la croissance de l'épiderme, d'un extrait aqueux de rétine partiellement purifié et contenant donc du FGF comme principe actif, est indiqué dans le brevet français n 2 461 002. Le rôle de ce même extrait sur la cicatrisation d'épithélium de cornée est indiqué dans le brevet américain n- 4 477 435. Depuis lors, de nombreux brevets ont été délivrés et de nombreuses publications scientifiques ont paru, suggérant le rôle des
FGFs purifiés dans la régénération et la cicatrisation de la peau, des vaisseaux, des nerfs, des os, des muscles, etc.

La plupart de ces travaux résultent de la transposition des observations obtenues sur des cellules en culture aux mêmes cellules In vi vo.

Ainsi, l'application topique du FGF seul ou l'utilisation de polymères, d'éponges, de gels ou de pompes permettant un relargage lent des FGFs, peut induire une néoangiogénèse et une régénération nerveuse ou cutanée.

Cependant, l'application topique de FGF acide ou basique doit souvent être itérative pour obtenir les effets maximaux. Ceci est probablement dù d une instabilité thermique de la molécule, une protéolyse par des enzymes, ainsi qu'à une interaction entre les FGFs et les glycoamino- glycanes, comme l'héparane sulfate ou protéohéparane sulfate, des membranes cellulaires ou des membranes basales, entraînant une immobilisation des FGFs pouvant empecher leur accès aux récepteurs cellulaires. A ce propos, une absence de stimulation de la cicatrisation par le FGF de plaies profondes a été rapportée (J. Dermatol. Surg.Oncol. 6, 617625 C1986 > ) lorsque le FGF seul est appliqué d'une manière topique, alors qu'une prolifération fibroblastique et myoblastique est obtenue lorsque des éponges constituées d'alcool polyvinylique imbibé de FGF sont appliquées sous la peau (J.Ceil Biol., 100. 1219 (1985).

On constate par ailleurs que le FGF, aussi bien sous sa forme acide (aFGF) que sous sa forme basique (bFGF), que l'on conserve habituellement à -80'C, perd déjà de son activité lorsqu'il est amené à -20 C comme a température ambiante.

Il apparaît donc la nécessité de stabiliser les facteurs de croissance FGF pour pouvoir envisager réellement leurs applications. Pour les applications in vivo notamment, il serait avantageux que le mode de stabilisation puisse permettre un relargage lent du FGF, ce dernier devenant un agent mitogène local, rentrant dans les processus naturels de régénération cellulaire.

A l'heure actuelle, compte tenu de l'importance des facteurs de croissance dans les domaines précités, on sait que beaucoup de tentatives sont effectuées pour stabiliser les FGFs, mais, à la connaissance de la
Déposante, il n'y a pas encore eu à ce jour de proposition concrète et satisfaisante pour stabiliser les FGFs pour qu'ils conservent leur activité non seulement in vitro, mais également in vive.

La présente invention apporte, quant à elle, une solution au probleme posé, consistant à associer un dextrane sulfate aux FGFs, la composition résultante étant stable au stockage m & e a température ambiante.

La présente invention a donc d'abord pour objet une composition comprenant le association d'au moins une forme active d'un facteur de croissance de la famille FGF et d'au moins un dextrane sulfate stabilisant l'activité biologique du FGF.

Les dextranes sulfates utilisés sont des dextranes sulfates hydrosolubles, insolubles en milieu aqueux ou des méla.ges des deux.

Les dextranes sulfates solubles que l'on peut utiliser pour la mise en oeuvre de l'invention, sont des produits courants, qui sont représentés par la formule

dans laquelle un à trois groupes hydroxyle du motif monomère sont substitués par des groupas -O-SG3H Cforme acide > ou -O-SO3- (forme de sels > . Les produits les plus usuels sont disponibles sous forme de sels de sodium
Les produits préférés peuvent etre des polymères de masse moléculaire comprise entre 15 000 et 800 OOO, notamment entre 5 000 et 500 000, tels que l'on peut s'en procurer auprès de la Société SIGMA (Réf D0768, D6393,
D6001, D7140, D8906 du catalogue 1988 > .

Les dextranes sulfates insolubles sont des dextranes sulfates réticulés selon les procédés habituels de réticulation, en particulier à l'aide d'épichlorhydrine, par exemple, ceux de formule

dans laquelle une fraction des groupes hydroxyles est substituée par des groupes -O-SO3H ou -O-SO3. Ils peuvent se présenter sous forme de poudres ou de gels.

Comme exemple de ces dextranes sulfates, on peut citer celui commercialisé par la Société SIGMA sous la réf D5650 (catalogue 1988 > . On peut également obtenir de tels dextranes selon le protocole décrit par Miletids J. et coll, Anal. Biochem. 105. 304 (1980).

Au sein de la composition selon l'invention, les dextranes sulfates hydrosolubles sont présents à une concentration de 0,1 g à 50 mg par millilitre de mélange final. La concentration des dextrsnes sulfates insolubles dans les mélanges dextranes/FOFs peut aller de 0, 1 g jusque a 500 mg par millilitre ou gramme de mélange final.

La composition selon le invention contint par ailleurs avantageusement des quantités effectives de 0,01 ng à 300 g d'au moins une forme active de FGF par millilitre ou gramrne de mélange final FGF/dextrane sulfate.

Les dextranes sulfates utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention servent de support à la migration et au repeuplement cellulaire. Ils peuvent étre incorpores dans toutes formes de pansements, ou encore sur des fils de suture utilisés en chirurgie, de manière que le facteur associé à ces dextranes sulfates ou le facteur tout seul puisse diffuser vers les tissus cibles.

Les facteurs de croissance FGF utilisés dans cette invention peuvent être des produits naturels, des produits issus de synthèses chimiques ou des produits obtenus par des techniques de recombinaison génétique. Ils peuvent être d' origine humaine ou provenir de autres mammifères et non mammifères. Il n'est généralement pas nécessaire d'utiliser le facteur autologue. En effet, le haut degré de conservation de la structure des FGFs au cours de l'évolution, ainsi que les etudes sur les propriétés in vitro et in vivo indiquent qu'il n'y a pas de spécificité d'espèce pour les deux formes bioactives des FGFs.Egalement, on utilise le
FGF sous sa forme purifiée acide, ou sous sa forme basique, ou encore un mélange des deux formes, ou encore un dérivé ou un analogue d'au moins l'une de ces formes. Le rapport entre les FGFs acide et basique dans la forme mélangée peut être de n'importe quelle valeur entre les deux formes pures.

Différents procédés de purification peuvent être utilisés pour isoler ces deux formes de FGF à partir de sources naturelles < rétine, cerveau, hypophyse, placenta, rein, etc. > , ces procédés étant connus et ayant été décrits par de nombreux auteurs. La méthode préférée est celle décrite par Courty et coll. dans Biochem. Biophys. Res.

Commun., 136. 102-108 < 1986 > . Cette méthode comprend une étape consistant à traiter, pendant une nuit, de l'extrait tissulaire, en présence d'acide acétique å pH 3, exclunnt ainsi tout risque de contamination virale, et à conduire une purification par chromatographie sur héparine immobilisée (héparine Sepharose - PHARI4ACIA > . Les deux formes acide et basique de FGF peuvent ainsi être isolées et séparées, avec les autres protéines ou individuellement, avec un degré de pureté suffisant pour être débarrassées de quantités significatives d'autres matériels contaminants.

Des analogues synthétiques du FGF peuvent être obtenus par synthèse chimique ou par des techniques classiques d'ingénierie génétique, telle l'expression de gènes synthétiques ou le expression de gènes modifiés par mutagenèse dirigée à des sites spécifiques.

Toutes les formes de FGF obtenues d'extraits tissulaires par ingéniérie génétique ou par synthèse cnimique, qu'elles aient ou non une structure modifiée, ainsi que les fragments en dérivant, peuvent être utilisées ou réserve qu'elles soient actives biologiquement - un test in vitro cor.ome celui propose ci-epres pouvant être utilisé.

Les associations de FGFs et de dextranes sulfates de l'invention peuvent titre incorporées dans des supports physiologiquement acceptables pour des applications in vive.

L'application est une application locale, par voie externe sur la peau ou la cornée, notamment pour accélérer la cicatrisation d'une plaie et améliorer la qualité de cette cicatrisation, ou encore par voie interne sur les tissus et organes du corps, par exemple dans le traitement de l'ulcère de l'estomac. Selon les types et lieux d'application, les compositions comprenant l'association des FGFs et des dextranes sulfates seront différentes.La nature même des supports peut être extremement variable et dépend donc du type et lieu d'application, et peut prendre la forme d'un liquide, d'un aérosol, d'une crème, d'un gel, d'un tissu imprégné comme une gaze, un tulle les les associations FGFs- dextrane sulfates de l'invention peuvent également être incorporées à une gélatine constituée par un collagène, quel qu'en soit le type, ou encore1 comme indiqué ci-deqsus, recouvrir des fils de suture.

Les formulations aqueuses de 1' invention seront avantageusement des compositions contenant des tampons et sels permettant de maintenir le mélange au voisinage du pH physiologique et au voisinage de la force ionique physiologique (soit pH de 6,8 à 7,4, et force ionique de O, 1 à 0,2 M). On peut ajouter à la composition des additifs, comme des anesthésiques locaux (par exemple, la lidocaYne), des substances bactériostatiques (par exemple, des sels de sodium, d'argent, leurs dérivés ou des sulfadiazines), des produits aseptisants, comme la Bétadine > , des antibiotiques (par exemple, la streptomycine > , des protéines sériques (par exemple, la sérum albumine ou la fibronectine > , de même que des collagènes hydrosolubles.

Une telle composition aqueuse, renfermant au moins un facteur FGF associé à au moins un dextrane sulfate hydrosoluble ou insoluble, peut entre utilisée directement en solution, en aérosol, en onction, en lotion, en poudre ou en gel, ou servir de solution pour être incluse dans un support pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, tel qu'une pommade, une crème, un gel de collagène ou un gel d'une autre nature, ou de la gélatine ; ou imprégner un gel de collagène, un gel d' une autre nature, ou d'autres substances faisant fonction d'éponge, un pansement, un support de pansement de recouvrement ou un biomatériau devant favoriser directement ou indirectement la réparation tissulaire < par exemple, un fil de suture chirurgical) ; ou être appliquée sur des fibres naturelles ou synthétiques.

Pour des applications sur la peau, les bases de crèmes ou lotions utilisée traditionnellement peuvent être utilisées, comme la lanoline (Silvadene#, Marion# plus particulièrement pour les brûlés, Aquaphor Duke
Laboratories South Norwalk, Connecticut, Equalia tL'Oréal)). Les crèmes peuvent contenir des protéines Cpar exemple, collagène, élastine, etc. > .

Les pansements peuvent être des pansements de textiles, tissus synthétiques ou éponges, ou etre des produits naturels- servant de recouvrement de plaies < par exemple, des gels de collagène, des dermes de origine animale > . La composition FGF-dextrane sulfate en solution doit pouvoir imprégner ces différentes formes de pansements, de manière que le facteur FGF puisse être en contact ou diffuser seul ou associé au dextrane sulfate jusqu'aux tissus cibles.La composition selon le invention est appliquée également de manière à pouvoir être maintenue sur le site de la blessure et sur les blessure, ouvertes, avec maintien de l'hydratation selon les techniques de le homme du métier, particulièrement élaborées dans le domaine des greffes de la peau. Les pansements occlusifs peuvent être imprégnés de la même manière, adsorbés ou recouvrir un support naturel ou synthétique.

Pour les applications sur les cornées, le véhicule doit être compatible avec la tolérance oculaire - on citera comme exemple d'un tel véhicule, le produit commercialisé sous le nom de "Lacribule#"), les solutions salignes, les solutions isotoniques (par exemple, le Neocadron# (Merck Snarp-Dohme) ou des équivalents), ou encore sous forme de gel formant un-écran protecteur de la cornee. Ces véhicule; peuvent contenir également des agents conservateurs comme les chlorures de benzyldiméthyl alkyl ammonium ou le éthylène diamine tétraacétate de sodium < EDTA > .

Il peut également être souhaitable d'inclure, dans des liposomes, une association FGF-dextrane sulfate hydrosoluble de le invention. Ces liposomes peuvent être alors incorporés dans les compositions décrites ci-dessus, par exemple, cremes, pommades, utilisables telles quelles ou pour l'imprégnation de supports, comme les pansements.

Dans le cas où l'on utilise des dextranes sulfates insolubles, ceux-ci peuvent etre simplement associés au FGF, ou bien de telles associations peuvent être incluses dans des supports, comme des crèmes, des gélatines ou des gels de collagenes, ou entre appliquées sur de fibrés synthétiques ou naturelle (fils de suture), ou imprégner des supports habituels de pansements de recouvrement. L'inclusion de ces dextranes sulfates insolubles peut se faire par imbibition et/ou addition d'une solution de collagène et gélification.

On peut notamment utiliser le mode opératoire décrit dans le brevet US-A-4 060 081, suivant lequel on réalise une composition stratifiée composite dans laquelle la partie en contact avec la blessure est couverte de collagène réticulé avec un glycosaminoglycane, le melange étant obtenu par addition dudit glycosaminoglycane au collagène solubilisé, l'ensemble etant précipite ou réticulé par du gluteraldéhyde.

Par ailleurs, comme indiqué ci-dessus, les compositions selon le invention peuvent également se présenter sous une forme applicable localement par voie interne, par exemple comme emplatres gastro-enteriques ou poudres lyophilisée incluses ou non dans des gélules.

La préparation des compositions de traitement de cicatrisation selon l'invention est, d'une manière générale, réalisée selon des méthodes classiques, bien connues en galéniques. Les doses à administrer et leur fréquence sont variables notamment selon l'importance de la plaie.

Enfin, les compositions selon l'invention trouvent également application dans le domaine cosmétique, pour améliorer 11 état de la peau. L'invention vise donc également des compositions contenant, dans un support cosmétiquement acceptable, une association précitée FGF- dextrane sulfate, cette composition se présentant notamment sous forme de lotion, gel ou crème.

On décrira maintenant les effets des dextranes sulfates sur la protection de l activité biologique des
FGFs.

Les méthode d'évaluation fn vitre de l'activité biologique des FGFs sont décrites dans de nombreuses publications, et elles sont toutes basées, soit sur une mesure de le augmentation du ncmbre de cellules induite par des doses croissantes de facteurs ajouté au milieu de culture des cellules, soit sur une augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée dans 1'ADN des cellules stimulées par le facteur de croissance. Dans les deux protocoles, ces augmentations sont dépendantes de la dose de facteur ajoutée, et l'on peut donc établir des effets dose et des courbes dose-réponse avec un effet maximal de stimulation.Par simplification, on définit une unite de stimulation comme la dose de facteur de croissance qui, ajoutée a un millilitre de milieu de culture sur des cellules cibles, est capable d'induire une augmentation du nombre de cellules ou de l'incorporation de thymidine tritiée correspondant à la moitié (50%) de la valeur maximale de cette augmentation mesurée dans la courbe doseréponse. Cette définition et la reproductibilité de ces mesures sont exposées notamment par Plouet et coll., dans Cellular and Molecular Biology, 30. pages 105-110 (1984 > .

Ainsi, plus l'unité est maintenue à une valeur faible, plus le facteur conserve une activité biologique importante.

A - Effet protecteur du dextrane sulfate contre
l'inactivation des FGFs acide et basique par des pH
acides et alcalins.

Dans ces expériences, on utilise des solution meres de FGFs, contenant les FGFs en solution à une concentration de 100 ;g par millilitre, dans un tampon phosphate isotonique (PBS), et contenant ou pas du dextrane sulfate (DS) réf. 6393 du catalogue SIGMA, à 400 pg/ml. Les
FGF acide ou basique utilises sont d'origine bovine et extraits du cerveau de boeuf, selon la publication de Courty et coll. dans "Biochimie, 69, page 511 (1987 > .

10 p1 de cette solution sont prélevés et mélangés, soit à 1 ml de tampon PBS (pH 7z, soit à 1 ml d'acide acétique dilué, ajusté à pH 2 (environ IN), soit à I ml de soude (NaOH) diluée, ajustée à pH 9,0. Ces échantillons sont incubés à 20 C pendant 2 heures et un prélèvement de 1 l est effectué pour le dosage de le activité biologique.

La figure I présente la courbe dose-réponse du bFGF sur des f-ibroblastes de derme humain (AG1523)
Légende de la figure I
Abscisses : doses de facteur de croissance < pg/ml >
Ordonnées : pourcentage de stimulation : : bFGF + DS.à pH 7
# : bFGF à pH 7
# : bFGF + DS à pH 9
# : bFGF à pH 9
e : bFGF + DS à pH 2
# : bFGF à pH 2.

L'augmentation d'incorporation de thymidine tritiée représente la valeur du nombre de coups par minute (cpm) obtenue au plateau de la courbe dose-réponse du bFGF seul moins la valeur en cpm de thymidine tritiée incorporée dans les cellules en absence de FGF et déterminée dans la même expérience.

Le Tableau 1 résume les résultats obtenus avec aFGF et bFGF. L'unité de stimulation est arbitrairement donnée à I pour le aFGF ou le bFGF de départ incubé pendant 2 heures à 20 C.

Tableau 1 pH ~~~~ ~~~~ pH 2 pH 7 pH 9
bFGF (0 C) 0.9
bFGF < 2 H, 20 C) 53 1 13
bFGF + DS (2 H, 20 C) 1 1 2,5
aFGF (0 C) 1
aFGF (2 H, 20 C) 6 1 6 aFGF + DS (2 H, 20 C) 0,5 0,4 2
B - Effet du dextrane sulfate sur l'inactivation des FGFs
par la température après 0,5 heure, 24 heures, 7 jours.

Dans cette expérience, le FGF, préparé comme au point A ci-dessus, pour la forme acide, et par recombinaison génétique pour la forme basique, d'origine humaine, acheté auprès de la Société Amers-ham ou Cliniscience (à Paris), est incubé à 4 C, 20 C, 37 C ou 60 C pendant différentes périodes, en le absence ou en présence de 400 g de dextrane sulfate, puis dosé.

Tableau 2
4 C 20 C 37 C 60 C
bFGF t = O mn 1
bFGF t = 30 mn 1 1 3,5 > 100
tFGF + DS t = 30 an 1 1 1 9
aFGF t = 0 mn i
aFGF t = 30 mn 1 1 2 > 100
aFGF + DS t = 30 mn 0,4 0,4 0,4 5
bFGF t = 24 heures 1 1 6
bFGF + DS t = 24 heures I 1 1
aFGF ' 1 1
aFGF + DS 0,4 0,4 0,4
bFGF t = 7 jours 2 5 > 100
bFGF + DS t = 7 jours 1 1 1
aFGF t = 7 jours 2,5 8 > 100
aFGF + DS t = 7 jours 0,4 0,4 3
Les données rapportées dans les tableaux I et 2 illustrent le effet protecteur très net procuré par le DS sur le FGF. Ainsi, toute le activité biologique du bFGF est conservée après 7 jours d'incubation à 37 C, alors qu'en l'absence de DS, aucune activité n'est détectable.

EXEMPLE D'APPLICATION IN VIVO
Protocole expérimental
Les opérations sont réalisées sur des rats Wistar mâles de 300 à 400 grammes. Chaque expérience est effectuée sur une série de 5 animaux.

Type de plaies
On pratique deux types de plaies cutanées sur la face dorsale, préalablement rasée, des animaux.

1 > Les prélèvements sont effectués par emporte-pièce ou
punch (0,6 cm de diamètre) jusque au plancher
musculaire.

2) Des scarifications de 1 cm de long sont pratiquées au
scalpel. Elles n'affectent que la région dermo
épidermique.

Mode opératoire
Selon le type de plaies, les blessures sont traitées par différents mélanges de produits en solution dans du sérum physiologique tamponné CPBS pEi 7,4 > stérilisé.

Ces solutions sont déposées pour les plaies par punch dans un tampon de collagène COingestat) prédécoupé aux mesures exactes de l'excision tissulaire.

Dans le cas des scarifications, les produits sont déposés directement sous forme liquide sur la plaie.

Les effets de l'association FGF basique ou acide ou un mélange en solution de 1 ng à 10 g/ml) et des dextranes sulfates (en solution de 100 ng à 1 mg/ml) sont évalués et comparés à l'action de chacun des constituants, considérés comme témoins de réaction (collegène, solution de dissolution, FGF, dextrane sulfate > . Le DS était celui disponible chez SIGMA sous la référence 6393.

Chaque série expérimentale d'animaux est sacrifiée à intervalles de temps définie par période de 24 heures, et les régions lésées sont prélevées pour deux types d'études
1) une analyse morphologique externe avec planimétrie de
la plaie.

2 > une étude histologique.

Résultats
I - Effets stabilisant in vivo des dextranes sulfates
Du FGF marqué radioactivement à le iode 1125 est déposé en présence ou en le absence de dextranes sulfates dans un tampon de collagène (selon le protocole décrit par
Moenner M. et colt, dans Proc. Natl. Acad. Sc < US > , 83, pages 5024-5028 (1986)".

La variation de la radioactivité dans le collagène imprégné est appréciée en fonction du temps (figure 2).

Légende de la figure 2
Abcisses : temps en heures
Ordonnées : % de la radioactivité mesurée par
rapport à la radioactivité d'origine
,---, bFGF + DS
collagène {
x---x bFGF #---# bFGF
à 2 cm de la plaie {
bFGF + DS
La radioactivité est mesurée dans le gel de collagène et dans des prélèvements effectués en périphérie de la plaie, à 2 cm de celle-ci, par un punch équivalent à celui d'origine,
II - Etudes morphologiques et planimétriques
A) Plaies Dar emporte-plece
a > Etude morphologique
L'observation de l'évolution des plaies à l'oeil nu permet de constater une action très nette de le association FGF + dextrane sulfate sur la vitesse et la qualité de la cicatrisation superficielle topidermisation + lyse du caillotS.

1) Après 24 heures, les tampons de collagènes imprégnés
par cette association ont totalement adhéré aux parois
de la plaie, et ne peuvent être prélevés que par lésion
des tissus régénérés. Les experimentations témoins ne
manifestent une adhérence totale des collagène qu'au
bout de 36 a 48 heures.

2) La réépithélisation est visible à l'oeil nu au bout du
3ème jour en présence de l'association FGF + dextrine
sulfate, alors qu'une image identique sur les témoins
demande des temps d'expérimentation de 5 à 7 jours.

3) Analyse planimétrique : l'analyse planimétrique de la
surface externe des plaies montre l'absence totale de
rétraction des tissus en régénération.

Les tableaux 3 et 4 rapportent les moyennes de cinq experiences indépendantes concernant
Tableau 3 : Le rapport, exprimé en pourcentage, de la
surface de la cicatrice témoin et de la surface
de la cicatrice traitée par différentes
associations.

Tableau 4 : Le rapport du périmètre de chaque cicatrice
avec la surface de ces memes cicatrices.

L'association FGF + dextrane sulfate dans le support collagène < Tableau 3 > permet une cicatrisation plus harmonieuse, présentant une faible rétraction des tissus < 102,58% au jour 8, contre 49,27 'X, avec FGF seul > .

De plus, le aspect circulaire de la plaie-se conserve d'autant mieux au cours de la cicatrisation que le rapport périmètre P de la plaie / surface S de la plaie exprimé dans le Tableau 4 est plus faible. La valeur de ce rapport permet de caractériser la conformation de la plaie en cours de cicatrisation. Les valeurs les plus faibles sont enregistrées par le association FGF + dextrane sulfate dans les gels de collagène. Ainsi, au jour 8, le rapport
P/S est de 0,22, alors que, pour le FGF seul, la valeur est de 0,39, sensiblement identique à celle obtenue dans les témoins sans collagène. Les plaies témoins cicatrisent par rapprochement des lèvres et prennent un aspect ovaliforme.

Ceci est également illustré dans les photographies des faces dorsales des animaux traités.

Tableau 3
Surface de la plaie traitée
Surface de la plaie témoin (= solution physiologique)
Produits Collagène Collagène Collagène
Collagène + DS + bFGF + bFGF + DS
seul 500 pgSml 1 HgXml I g/ml et
Jours 50 g/ml
2 80,78 61,43 73,02 112,70
3 80,43 97,54 148,27 174,42
4 92,79 77,08 155,11 117,24
8 92,40 92,14 49,27 102,58
Tableau 4
Rapport P/ du périmètre de la plaie sur la surface de cette même plaie.

Produits Collagène Collagène Collagène
Témoin Collagène + bFGF + DS + DS +FGF
(sans 1 g 500 g 500 g et
Jours collagène) 1 g
1 0,19 0,22 0,25 0,20 0,19
2 0,18 0,21 0,15 0,20 0,18
3 0,22 0,36 0,16 0,26 0,18
4 0,32 0,20 0,17 0,22 0,13
6 0,37 0,20 0,29 0,23 0,15
8 0,79 0,41 0,39 0,41 0,22
b) Etude histologique :
Les régions traitées sont prélevées, fixées, imprégnées, en paraffine. L'étude histologique est réalisée sur des coupes de 7 m. Les colorations utilisées permettent des études topographiques et histochiniques.

Les figures 3 à 7 sont des photographies grossies des ccupes histologiques obtenues à 4 jours pour la figure 3, à 5 jours pour la figure 4 et à 3 jours pour les figures 5 à 7.

Fig. 3 Cx 250) represente les résultats obtenus avec
du collagène seul < témoin > et
" Fig. 4 (x 250) représente les résultats similaires
avec l'association DS + FGF dans le collagène, et
. Fig. 5 (x 500) représente un detail des tissus en
régénération correspondant à la figure 4.

Fig. 6 et 7 (x 250 > représentent des résultats de
cicatrisations de plaies obtenus respectivement avec
une solution physiologique témoin et avec une
association bFGF-dextrane sulfate.

Dans les expériences rapportées en référence aux
Exemples 3 à 5, on a utilisé les memes compositions que celles indiquées au tableau 4.

L'analyse histologique démontre que le association
FGF + DS accélère les étapes traditionnelles de la cicatrisation dermo-épidermique et augmente la qualité des tissus reconstitues par rapport aux expérimentations témoins (collagène seul). Ainsi, en présence du FGF + dextrane, une colonisation tres rapide (1 jour) des catégories cellulaires environnantes (fibroblastes, musculaires lisses) est observée & partir des tissus voisins sains, et, en particulier, å partir du conjonctif du plancher musculaire strié sous-iacent.

Dans le meme temps < figure 5 > , une néoangiogénèse permet au tissu en formation d'etre colonisé par une densité très forte de capillaires sanguins (désignés par le chiffre de référence 10 sur cette figure > , dans les tissus en régénération désignes par le chiffre de référence 11. Au bout de 3 jours contre 5 à 6 pour les témoins), la réépithélisation engagée à partir de l'épiderme des lèvres de la plaie arrive à affrontement. L'épiderme est totalement réorganisé et il présente une densite normale (figure 4, eme jours comparativement aux témoins à la densité cellulaire beaucoup plus faible (figure 3, 5ème jour > .Ces mêmes illustrations révelent l'absence de rétraction des bords de la plaie pour les punchs traités par l'association FGF + DS, contrairement aux témoins qui comblent par rétraction les tissus excisés.

La cicatrisation des plaies obtenues par scarification est évaluée par une étude histologique effectuee 3 jours après l'opération. Le traitement consiste en une seule application topique au niveau de la lésion le jour meme de l'opération. Les résultats sont présentés sur les figures 6 et 7 qi montrent les tissus de la peau ayant reçu une solution physiologique témoin (figure 6) et l'asociation de bFGF recombinant + dextrane sulfate (500 ng d bFGF et 0 ug de dextrane sulfate par ml) pour la figure 7.

Il est à noter que la présence de l'association induit l'enclenchement des mécanismes cicatriciels qui semblent totalement terminés au 3ee jour suivant la blessure figure 7). L'épiderme parfaitement reconstitué surmonte un derme dense, présentant une organisation indiscernable des tissus environnants. En revanche, la cicatrisation du témoin (figure 6) est dans les memes délais de temps, inachevée. L'épiderme plus épais est partiellement reconstitué, et le derme sous-jacent présente une densité très lache et une organisation anarchique avec des cellules nécrosées.

L'association FOF + dextrane sulfate se présente corme un puissant agent cicatrIsant in vivo accélérant d'une part les processus naturels régénératifs, et permettant d'autre part une qualité accrue de la cicatrisation par l'absence de tout phénomène de rétraction, alliée à une mobilisation rapide de, différentes catégories cellulaires nécessaires à la restauration tissulaire.

Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on va en décrire maintenant quelques exemples de réalisation, qui ne sont en aucune façon destines a en limiter la portée.

EXEMPLE 1 : Préparation d'une crème
On prepare la composition suivante
FGF ........................................... 10 g
Dextrane sulfate (n D5660 au catalogue Sigma) . 50 mg
Carboxyméthyl cellulose ....................... 2,5 g
Eau purifiée stérile et apyrogène ............... 100 ml
On obtient ainsi une crème que l'on applique matin et soir sur une plaie de type scarification, sur un rat. On observe une cicatrisation après 3 jours de traitement.

EXEMPLE 2 : Préparation d'un pansement
Le support utilisé est un film de collagène acheté auprès de la Société "Bioéthica" (Lyon). Ce film est I.réné par adsorption passive du mélange FGF-dextrane sulfate dans les proportions suivantes
FGF ............................................ 10 g
Dextrane sulfate (n-D5650 au catalogue Sigma) .. 500 g dans 10 mi de sérum physiologique stérile et apyrogène. On fait incuber pendant 30 minutes à 4-C. Le pansement obtenu, découpable à la forme de la plaie, est ensuite scellé sous vide et empaqueté.

Il peut être appliqué en cas d'ulcérations, de brûlures, de coupures et de plaies profondes.

EXEMPLE 3 : Préparation d'un fil de suture
La même préparation que ci-dessus, ainsi que le même mode opératoire, peuvent servir & imprégner un fil de suture chirurgical (type Ethicon - Vicryl BV2). Le fil de sutrure obtenu est utilisable en chirurgie.

EXEMPLE 4 : Préparation d'un collyre
On prépare la composition suivante
FGF ....................................... 600 ng
Dextrane sulfate (n D5650 au catalogue Sigma). 150 g
Larmes artificielles ......................... 3 mi
On effectue un mélange puis une lyophilisation, puis on ajoute 3 ml d'eau purifiée stérile apyrogene au noment de l'emploi.

Le collyre est appliqué dans les cas d'ulcération de la cornée, h raison de deux instillations par jour.

Claims (15)

REVENDICATIONS

1 - Composition comprenant 11 association d'au moins une forme active d'un facteur de croissance de la famille FGF et d'au moins un dextrane sulfate stabilisant l'activité biologique du FGF.

2 - Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le dextrane sulfate utilise est un dextrane sulfate hydrosolublé, un dextrane sulfate insoluble en milieu aqueux, ou un mélange des deux.

3 - Composition selon la revendication 2, renfermant au moins un dextrane sulfate hydrosoluble, caractérisée par le fait que le ou les dextranes sulfates sont présents à une concentration de 0,1 g à 50 mg par millilitre de mélange final.

4 - Composition selon la revendication 2, renfermant au moins un dextrane sulfate insoluble en milieu aqueux, caractérisée par le fait que le ou les dextranes sulfates sont présents à une concentration de 0, I g à 500 mg par millilitre ou gramme de mélange final.

5 - Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle renferme de 0,01 ng à 300 pg d'au moins une forme active de FGF, par millilitre ou gramme de mélange final FGF/dextrane sulfate.

6 - Composition selon l'une des revendications i à 5, caractérisée par le fait que le FGF est un FGF purifié sous ses formes acide ou basique, ou un mélange des deux, ou encore un dérivé ou un analogue d'au moins l'une de ces formes.

7 - Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait que l'association FGF/dextrane sulfate est incorpore dans des supports physiologiquement acceptables pour des applications in vfvo.

8 - Composition selon la revendication 7, caractérisée par le fait quelle constitue une formulation aqueuse, contenant des tampons et sels permettant de maintenir I1 association FGF/dextrane sulfate au voisinage des pH physiologiques et au voisinage de la force ionique physiologique.

9 - Composition selon l'une des revendications y et 8, caractérisée par le fait qu'elle renferme des additifs, comme des anesthésiques locaux, des substances bactériostatiques, des produits aseptisants, des produits sériques, ou un collagène hydrosoluble.

10 - Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait qu'elle est placée sous une forme directement utilisable pour une application sur la peau, comme en solution, aérosol, onction, lotion, poudre, gel.

Il - Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait qu'elle est Incluse dans un support pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable, tel qu'une pommade, une crème, un gel de collagène, un gel d'une autre nature, ou de la gélatine ; qu'elle imprègne un gel de collagène, un gel d'une autre nature, ou une autre substance faisant fonction d'éponge, un pansement, un suppcrt de p-nserwent de recouvrement, ou un biomatériau devant favoriser directement ou indirectement la réparation tissulaire, tel qu'un fil de suture chirurgical ; ou qu'elle est appliquée sur des fibres naturelles ou synthétiques.

12 - Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous une forme applicable sur la cornée, en collyre ou en gel destine à former un écran protecteur de la cornée.

13 - Composition selon le une des revendications 8 .et 9, caractérisee par le fait qu'elle est incluse dans des liposomes.

14 - Composition selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous une forme applicable localement par voie interne sur les tissus et organes du corps, par exemple comme emplêtre gastro entérique ou poudres lyophilisées, incluses ou non dans des gélules.

15 - Utilisation de la composItion telle que définie à l'une des revendications 1 à 14, comme agent thérapeutiques en cIcatrisation et régénération tissulaire.

16 - utilization de la composition telle que définie à l'une des revendications 1 b 14, comme agent cosmétique, pour améliorer le état de la peau.