JPH0611709B2 - 角膜基質創傷の治療のための組成物 - Google Patents
角膜基質創傷の治療のための組成物Info
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- JPH0611709B2 JPH0611709B2 JP60504751A JP50475185A JPH0611709B2 JP H0611709 B2 JPH0611709 B2 JP H0611709B2 JP 60504751 A JP60504751 A JP 60504751A JP 50475185 A JP50475185 A JP 50475185A JP H0611709 B2 JPH0611709 B2 JP H0611709B2
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- Japan
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- wounds
- polypeptide
- wound
- treatment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 １．発明の分野 切り傷、擦過傷、熱傷、皮膚潰瘍、皮膚移植、及び同様
のものから生じる創傷は、広い範囲の皮膚に影響を及ぼ
すことができ、そして治療するのに長い期間を必要とす
る。長い治癒期間は、敏感な領域上の創傷、たとえば長
期にわたっての治療が困難である角膜の創傷に関して特
に問題である。これらの理由のために、皮膚創傷及び角
膜創傷の急速な治癒を促進せしめるであろう薬理学的約
薬剤に関しての長い切実な要求があった。
のものから生じる創傷は、広い範囲の皮膚に影響を及ぼ
すことができ、そして治療するのに長い期間を必要とす
る。長い治癒期間は、敏感な領域上の創傷、たとえば長
期にわたっての治療が困難である角膜の創傷に関して特
に問題である。これらの理由のために、皮膚創傷及び角
膜創傷の急速な治癒を促進せしめるであろう薬理学的約
薬剤に関しての長い切実な要求があった。
今まで、多くの研究グループが、上皮創傷の再生を促進
するために、マウス唾液腺から得られた上記成長因子
（mEGF）の使用を研究してきた。今までは、擦過傷、熱
傷、及び同様のものから生じる比較的広い創傷のmEGFに
よる治療は、創傷の治癒を促進せしめることにおいて、
末梢的に過ぎないことが明らかにされている。角膜上皮
の創傷の治癒を促進するためのmEGFの使用は、一層期待
されていたが、そのような治療が、角膜基質の創傷の治
癒速度を促進するのに有効であることは示されていな
い。
するために、マウス唾液腺から得られた上記成長因子
（mEGF）の使用を研究してきた。今までは、擦過傷、熱
傷、及び同様のものから生じる比較的広い創傷のmEGFに
よる治療は、創傷の治癒を促進せしめることにおいて、
末梢的に過ぎないことが明らかにされている。角膜上皮
の創傷の治癒を促進するためのmEGFの使用は、一層期待
されていたが、そのような治療が、角膜基質の創傷の治
癒速度を促進するのに有効であることは示されていな
い。
従って、上皮創傷、基質創傷及び角膜創傷を治療するた
めに、これらの創傷の急速な治癒を促進するであろう方
法及び薬剤を提供することが所望されるであろう。特
に、そのような薬剤を、多量にそして疾患領域の治療に
適する配合で提供することが所望されるであろう。
めに、これらの創傷の急速な治癒を促進するであろう方
法及び薬剤を提供することが所望されるであろう。特
に、そのような薬剤を、多量にそして疾患領域の治療に
適する配合で提供することが所望されるであろう。
２．従来技術の説明 ヒト及びマウス上皮成長因子（EGF）の比較及びin vivo
及びin vitroでのそれらの活性の検討がHollenberg，
“上皮成長因子−ウロガストロン，ホルモン状態を獲得
するペプチド”（“Epidermal Growch Factor-Urogastr
one,A Polypeptido Acquiring Hormonal Status”）
編、Academic Press,Inc.,ニューヨーク(1979)69〜110
ページに紹介されている。Handbook of ExperimentalPh
armacology，５７巻，Baserga,編，Springer Verlag,Be
rlin(1981)90〜132ページ中のCarpenter“上皮成長因子
(Epidermarl Growch Factor)”及びCarpenter(1979)An
n.Rev.Biochem.48：193〜216も参照のこと。
及びin vitroでのそれらの活性の検討がHollenberg，
“上皮成長因子−ウロガストロン，ホルモン状態を獲得
するペプチド”（“Epidermal Growch Factor-Urogastr
one,A Polypeptido Acquiring Hormonal Status”）
編、Academic Press,Inc.,ニューヨーク(1979)69〜110
ページに紹介されている。Handbook of ExperimentalPh
armacology，５７巻，Baserga,編，Springer Verlag,Be
rlin(1981)90〜132ページ中のCarpenter“上皮成長因子
(Epidermarl Growch Factor)”及びCarpenter(1979)An
n.Rev.Biochem.48：193〜216も参照のこと。
種々の研究が上皮創傷の治療におけるmEGFの使用を試験
した。Greaves(1980)Clin.Exp.Dermatol.5：101〜103
は、ヒト対象上の疱疹創傷に対してマウスＥＧＦを適用
した。生理的食塩水中のmEGFが、その創傷が治癒するま
で１日１回適用された。上皮層の増殖の促進は観察され
なかった。マウス中の開存性創傷へのマウスＥＧＦの典
型的な適用は、種々の程度で治癒を促進することが見い
出された。たとえば、Niallなど(1982)J.Surg.Res.33：
164〜199；Thorntonなど(1981)Burns８：156〜160参照
のこと。
した。Greaves(1980)Clin.Exp.Dermatol.5：101〜103
は、ヒト対象上の疱疹創傷に対してマウスＥＧＦを適用
した。生理的食塩水中のmEGFが、その創傷が治癒するま
で１日１回適用された。上皮層の増殖の促進は観察され
なかった。マウス中の開存性創傷へのマウスＥＧＦの典
型的な適用は、種々の程度で治癒を促進することが見い
出された。たとえば、Niallなど(1982)J.Surg.Res.33：
164〜199；Thorntonなど(1981)Burns８：156〜160参照
のこと。
角膜上皮の創傷の治癒を促進するためにマウスＥＧＦの
使用が記載されている。たとえば、Danieleなど(1979)G
raefes Archives Ophthalmologie 210：159〜165；Hoな
ど(1974)Invest.Ophthalmol.13：804〜809；Elliott(19
80)Trans.Amer.Ophthamol.Soc.30：629〜656；及びGosp
odarowiczなど(1977)Exp.Eye.Res.25：75〜89を参照の
こと。
使用が記載されている。たとえば、Danieleなど(1979)G
raefes Archives Ophthalmologie 210：159〜165；Hoな
ど(1974)Invest.Ophthalmol.13：804〜809；Elliott(19
80)Trans.Amer.Ophthamol.Soc.30：629〜656；及びGosp
odarowiczなど(1977)Exp.Eye.Res.25：75〜89を参照の
こと。
発明の要約 上記創傷及び基質創傷を治療し、それらの急速な治癒を
促進するための方法及び組成物が提供される。その方法
は、皮膚の上皮層及び基質層並びに角膜の上皮層及び基
質層の両者の増殖を促進することができる、マイトジェ
ン活性を有する精製されたポリペプチドを含む治療組成
物を使用する。治癒は、一部は繊維芽細胞への上皮細胞
及び基質細胞の分化の結果として生じ、瘢痕組織の形成
を引き起こす。前記ポリペプチドは、典型的にはヒト上
皮成長因子の既知アミノ酸配列に基づくヌクレオチド配
列を有する合成遺伝子を用いる組換えＤＮＡ技法によっ
て産生される。前記組成物は、典型的には疾患領域に適
用され、そして適切な担体又は基剤を含む。角膜以外の
領域の一般的治療のためには、担体は普通、典型的な抗
菌剤を含む軟膏又はクリームであろう。角膜治療のため
には、担体は適切な液体又は軟膏であろう。
促進するための方法及び組成物が提供される。その方法
は、皮膚の上皮層及び基質層並びに角膜の上皮層及び基
質層の両者の増殖を促進することができる、マイトジェ
ン活性を有する精製されたポリペプチドを含む治療組成
物を使用する。治癒は、一部は繊維芽細胞への上皮細胞
及び基質細胞の分化の結果として生じ、瘢痕組織の形成
を引き起こす。前記ポリペプチドは、典型的にはヒト上
皮成長因子の既知アミノ酸配列に基づくヌクレオチド配
列を有する合成遺伝子を用いる組換えＤＮＡ技法によっ
て産生される。前記組成物は、典型的には疾患領域に適
用され、そして適切な担体又は基剤を含む。角膜以外の
領域の一般的治療のためには、担体は普通、典型的な抗
菌剤を含む軟膏又はクリームであろう。角膜治療のため
には、担体は適切な液体又は軟膏であろう。
特定の態様の記載 本発明は、ヒト及び他の哺乳類の皮膚創傷及び角膜創傷
を治療し、該創傷の治癒を促進するための方法を提供す
る。その方法はまた、他の上皮破壊及び基質破壊、たと
えば慢性の潰瘍、熱傷、手術による創傷、及び中空で上
皮に被覆された器官、たとえば食道、胃、大腸及び小
腸、口、並びに尿路及び生殖路に対する外傷を治療する
のに使用されるであろう。この方法は、ヒト上皮成長因
子（hEGF）のアミノ酸配列及びマイトジェン活性に類似
するアミノ酸配列及びアミノ酸活性を有するポリペプチ
ドを含む治療組成物の局所的適用による。そのポリペプ
チドは、hEGFのアミノ酸配列をコードする遺伝子から微
生物中において産生される。典型的な態様においては、
前記遺伝子は酵母によって優先的に認識されるコドンか
ら成る合成遺伝子であり、そして前記微生物宿主は酵母
である。前記の得られたポリペプチド生成物を適切に精
製し、そして生理的に許容できる担体培地中の該ポリペ
プチドを疾患領域に適用することによって、治癒過程の
速度を実質的に早めることが見出された。
を治療し、該創傷の治癒を促進するための方法を提供す
る。その方法はまた、他の上皮破壊及び基質破壊、たと
えば慢性の潰瘍、熱傷、手術による創傷、及び中空で上
皮に被覆された器官、たとえば食道、胃、大腸及び小
腸、口、並びに尿路及び生殖路に対する外傷を治療する
のに使用されるであろう。この方法は、ヒト上皮成長因
子（hEGF）のアミノ酸配列及びマイトジェン活性に類似
するアミノ酸配列及びアミノ酸活性を有するポリペプチ
ドを含む治療組成物の局所的適用による。そのポリペプ
チドは、hEGFのアミノ酸配列をコードする遺伝子から微
生物中において産生される。典型的な態様においては、
前記遺伝子は酵母によって優先的に認識されるコドンか
ら成る合成遺伝子であり、そして前記微生物宿主は酵母
である。前記の得られたポリペプチド生成物を適切に精
製し、そして生理的に許容できる担体培地中の該ポリペ
プチドを疾患領域に適用することによって、治癒過程の
速度を実質的に早めることが見出された。
ヒトＥＧＦは尿中に見出されるマイトジェンポリペプチ
ドであり、そして該ポリペプチドは、培養中においてケ
ラチノサイト及び他の哺乳類の上皮細胞の増殖を刺激す
ることができる。該ポリペプチドは５３個のアミノ酸形
（β−hEGF）及び５２個のアミノ酸形（γ−hEGF）とし
て存在し、そしてそれらの形は同一であるが、但しγ−
hEGFはβ−hEGF上に見られるＣ−末端アルギニン残基が
ないことで異なる。両者の形についてのアミノ酸配列は
Hollenberg(1979)前記に報告されている。
ドであり、そして該ポリペプチドは、培養中においてケ
ラチノサイト及び他の哺乳類の上皮細胞の増殖を刺激す
ることができる。該ポリペプチドは５３個のアミノ酸形
（β−hEGF）及び５２個のアミノ酸形（γ−hEGF）とし
て存在し、そしてそれらの形は同一であるが、但しγ−
hEGFはβ−hEGF上に見られるＣ−末端アルギニン残基が
ないことで異なる。両者の形についてのアミノ酸配列は
Hollenberg(1979)前記に報告されている。
下記及び請求の範囲に用いられる場合、ヒト上皮成長因
子又はhEGFは、微生物により産生され、そして既知のバ
イオアッセイにより測定される場合、天然のヒト上皮成
長因子タンパク質に類似する生物的活性、たとえばマイ
トジェン活性を示すポリペプチド生成物を意味する。こ
のポリペプチド生成物は、天然のタンパク質と同じか又
は実質的に同じであるアミノ酸配列を有し、そして普通
アミノ酸の差異は５個以下であり、より普通には、アミ
ノ酸の差異は３又はそれよりも少ないであろう。多くの
場合、hEGFのアミノ酸配列が異なるのは、あったとして
も、非極性アミノ酸、すなわち脂肪族及び芳香族アミノ
酸の間の置換によってであろう。天然のアミノ酸配列か
らの逸脱は、ポリペプチド生成物のマイトジェン活性及
び上皮の治癒を促進するためのその能力に対して不都合
に影響を及ぼさないであろう。治療組成物中に混合する
前に、hEGFポリペプチドは適切に精製され（下記のよう
に）、微生物宿主から回収された他のタンパク質及び物
質が除去されるであろう。精製は、他の物質に起因する
不所望の活性が治療組成物中に存在しないことを保証す
るために必須である。
子又はhEGFは、微生物により産生され、そして既知のバ
イオアッセイにより測定される場合、天然のヒト上皮成
長因子タンパク質に類似する生物的活性、たとえばマイ
トジェン活性を示すポリペプチド生成物を意味する。こ
のポリペプチド生成物は、天然のタンパク質と同じか又
は実質的に同じであるアミノ酸配列を有し、そして普通
アミノ酸の差異は５個以下であり、より普通には、アミ
ノ酸の差異は３又はそれよりも少ないであろう。多くの
場合、hEGFのアミノ酸配列が異なるのは、あったとして
も、非極性アミノ酸、すなわち脂肪族及び芳香族アミノ
酸の間の置換によってであろう。天然のアミノ酸配列か
らの逸脱は、ポリペプチド生成物のマイトジェン活性及
び上皮の治癒を促進するためのその能力に対して不都合
に影響を及ぼさないであろう。治療組成物中に混合する
前に、hEGFポリペプチドは適切に精製され（下記のよう
に）、微生物宿主から回収された他のタンパク質及び物
質が除去されるであろう。精製は、他の物質に起因する
不所望の活性が治療組成物中に存在しないことを保証す
るために必須である。
hEGFポリペプチドは、適切な微生物宿主、好ましくは、
下記のようなポリペプチドの分泌をもたらすことができ
る酵母宿主中におけるhEGF遺伝子の発現によって得られ
る。そのhEGF遺伝子は、染色体DNA,cDNA，合成ＤＮＡ又
はそれらの組み合せ（たとえば合成ＤＮＡはhEGF遺伝子
を完結するためにcDNAと結合され得る）であることがで
きる。便利には、本発明はβ−hEGF又はγ−hEGFのいづ
れかのアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列を使用
するであろう。そのhEGF遺伝子は、目的とする宿主、典
型的には酵母によって認識される複製システム、及びhE
GF遺伝子の発現を制御する転写及び翻訳き調節制御配列
を含む染色体外要素中に取り込まれるであろう。その染
色体外要素は、多くの他の特徴、たとえば撰択可能なマ
ーカ（該要素の操作を促進せしめる）を含むことができ
る。hEGFポリペプチドを産生することができる多くの適
切な染色体外要素の構成法は、1983年８月１２日に出願
され、本発明の承継人により承継された、同時係属出願
第522,909号に記載され、その関連部分を引用によりこ
の明細書中に組み入れられている。好ましくは、本発明
の染色体外要素は、翻訳後の修飾及び遺伝子生成物の分
泌を提供するために、hEGF遺伝子と正しく読み枠を合わ
せて分泌リーダー配列及びプロセシング シグナル配列
を含むであろう。分泌はポリペプチドの回収を促進せし
め、宿主を破壊しないで培養基からの単離を可能にす
る。さらに、hEGFポリペプチドの分泌は、微生物宿主を
破壊することによって放出されるであろう細胞内タンパ
ク質及び他の物質によるＥＧＦの汚染を回避する。
下記のようなポリペプチドの分泌をもたらすことができ
る酵母宿主中におけるhEGF遺伝子の発現によって得られ
る。そのhEGF遺伝子は、染色体DNA,cDNA，合成ＤＮＡ又
はそれらの組み合せ（たとえば合成ＤＮＡはhEGF遺伝子
を完結するためにcDNAと結合され得る）であることがで
きる。便利には、本発明はβ−hEGF又はγ−hEGFのいづ
れかのアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列を使用
するであろう。そのhEGF遺伝子は、目的とする宿主、典
型的には酵母によって認識される複製システム、及びhE
GF遺伝子の発現を制御する転写及び翻訳き調節制御配列
を含む染色体外要素中に取り込まれるであろう。その染
色体外要素は、多くの他の特徴、たとえば撰択可能なマ
ーカ（該要素の操作を促進せしめる）を含むことができ
る。hEGFポリペプチドを産生することができる多くの適
切な染色体外要素の構成法は、1983年８月１２日に出願
され、本発明の承継人により承継された、同時係属出願
第522,909号に記載され、その関連部分を引用によりこ
の明細書中に組み入れられている。好ましくは、本発明
の染色体外要素は、翻訳後の修飾及び遺伝子生成物の分
泌を提供するために、hEGF遺伝子と正しく読み枠を合わ
せて分泌リーダー配列及びプロセシング シグナル配列
を含むであろう。分泌はポリペプチドの回収を促進せし
め、宿主を破壊しないで培養基からの単離を可能にす
る。さらに、hEGFポリペプチドの分泌は、微生物宿主を
破壊することによって放出されるであろう細胞内タンパ
ク質及び他の物質によるＥＧＦの汚染を回避する。
好ましい酵母宿主のために適切な分泌リーダー配列及び
プロセシング シグナル配列は、普通、ポリペプチドの
分泌を提供する、酵母中の天然に存在するＤＮＡ配列に
由来するであろう。酵母によって天然に分泌されるその
ようなポリペプチドはα−因子、ａ−因子、酸性ホスフ
ァターゼ、及び同様のものを含む。所望により、天然に
存在する配列は、たとえばプロセシング部位を定義す
る。lys-arg対の数を減じることによって（少なくとも
１対を保持しながら）又はmRNAリーダーの長さを縮小す
ることによって（分泌を提供するために十分な長さを保
持しながら）、又は点変異、欠失もしくは操作を促進す
る他の修飾、たとえば制限認識部位を導入することによ
って修飾され得る。便利には、分泌リーダー及びプロセ
シング シグナル配列は、合成構造遺伝子上に適切な付
着端を提供することによって、アダプター分子によっ
て、又は両者の組み合せによってhEGF構造遺伝子に結合
され得る。
プロセシング シグナル配列は、普通、ポリペプチドの
分泌を提供する、酵母中の天然に存在するＤＮＡ配列に
由来するであろう。酵母によって天然に分泌されるその
ようなポリペプチドはα−因子、ａ−因子、酸性ホスフ
ァターゼ、及び同様のものを含む。所望により、天然に
存在する配列は、たとえばプロセシング部位を定義す
る。lys-arg対の数を減じることによって（少なくとも
１対を保持しながら）又はmRNAリーダーの長さを縮小す
ることによって（分泌を提供するために十分な長さを保
持しながら）、又は点変異、欠失もしくは操作を促進す
る他の修飾、たとえば制限認識部位を導入することによ
って修飾され得る。便利には、分泌リーダー及びプロセ
シング シグナル配列は、合成構造遺伝子上に適切な付
着端を提供することによって、アダプター分子によっ
て、又は両者の組み合せによってhEGF構造遺伝子に結合
され得る。
hEGFポリペプチドが微生物培地から回収された後、本発
明の組成物に対して不都合な効果を有する外来性タンパ
ク質及び他の物質を取り除くために該ポリペプチドを精
製することが必要である。上に述べたように、精製は培
養基中にhEGFポリペプチドの分泌を提供することによっ
て簡単にされ、そして増強される。次に、精製は次のよ
うにして完結され得る。
明の組成物に対して不都合な効果を有する外来性タンパ
ク質及び他の物質を取り除くために該ポリペプチドを精
製することが必要である。上に述べたように、精製は培
養基中にhEGFポリペプチドの分泌を提供することによっ
て簡単にされ、そして増強される。次に、精製は次のよ
うにして完結され得る。
酵母培養物が遠心分離され、そして上清媒体が圧力濾過
及び限外濾過によって濃縮される。次に、分泌されたhE
GFを含む、この濃縮溶液は、イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけられ、そしてhEGF活性を含む画分は、さらに
高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によって精製される。
HPLCにかけた後、得られるhEGFピークは典型的には、９
５％よりも高い純度であろう。
及び限外濾過によって濃縮される。次に、分泌されたhE
GFを含む、この濃縮溶液は、イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけられ、そしてhEGF活性を含む画分は、さらに
高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によって精製される。
HPLCにかけた後、得られるhEGFピークは典型的には、９
５％よりも高い純度であろう。
本発明の組成物は、角膜基質の創傷を治療するために特
に使用されるであろう。本発明の治療は、以前には、増
殖及び再生できないと思われた角膜の内皮層の細胞分裂
を促進するであろう。
に使用されるであろう。本発明の治療は、以前には、増
殖及び再生できないと思われた角膜の内皮層の細胞分裂
を促進するであろう。
ポリペプチドは、疾患領域への適用のために生理的に許
容される担体中に導入されるであろう。担体の性質は広
く異なることができ、そして適用の予定領域に依存する
であろう。皮膚への適用のためには、クリーム基剤又は
軟膏基剤が普通好ましく、そして適切な基剤はラノリ
ン、Silvadene (Marion)（特に熱傷の治療のため
に）、Aquaphor (Duke Laboratories,South Norwal
k,(onnecticut)、及び同様のものを含む。所望により、
hEGFへの創傷の連続的な暴露をもたらすために、バンデ
ージ及び他の傷用包帯にhEGF−担体組成物を含浸するこ
とが可能であろう。エーロゾル塗布器もまた使用するこ
とができる。
容される担体中に導入されるであろう。担体の性質は広
く異なることができ、そして適用の予定領域に依存する
であろう。皮膚への適用のためには、クリーム基剤又は
軟膏基剤が普通好ましく、そして適切な基剤はラノリ
ン、Silvadene (Marion)（特に熱傷の治療のため
に）、Aquaphor (Duke Laboratories,South Norwal
k,(onnecticut)、及び同様のものを含む。所望により、
hEGFへの創傷の連続的な暴露をもたらすために、バンデ
ージ及び他の傷用包帯にhEGF−担体組成物を含浸するこ
とが可能であろう。エーロゾル塗布器もまた使用するこ
とができる。
角膜の治療のためには、担体は眼への適用に適切なもの
であろう。適切な担体は、軟膏、生理的食塩水溶液、等
張生理的食塩溶液、たとえばSorbi-careTM(Allergan Ph
arma-ceuticals)Neodecadron (Merck,Sharp & Dohm
e)、及び同様のものを含む。適切な軟膏基剤は商品名La
crilube として販売されている。接眼用担体は、それ
らが適用の直前で配合されないならば、一般的に保存
薬、たとえば塩化ベンザルコニウム及びエデト酸二ナト
リウムを含むであろう。
であろう。適切な担体は、軟膏、生理的食塩水溶液、等
張生理的食塩溶液、たとえばSorbi-careTM(Allergan Ph
arma-ceuticals)Neodecadron (Merck,Sharp & Dohm
e)、及び同様のものを含む。適切な軟膏基剤は商品名La
crilube として販売されている。接眼用担体は、それ
らが適用の直前で配合されないならば、一般的に保存
薬、たとえば塩化ベンザルコニウム及びエデト酸二ナト
リウムを含むであろう。
しばしば、長時間、典型的には24〜48時間にわたってhE
GFの放出をもたらすためにリポソーム中にhEGFを導入す
ることが望ましい。そのような導入は、hEGFが上記のよ
うな傷用包帯に含浸される場合、特に望ましい。治療組
成物中のポリペプチドの濃度は、臨界的でなく、普通該
ポリペプチドは、少なくとも１μｇ／ml、普通10μｇ／
ml〜10mg/mlの間で存在するであろう。その組成物は、
疾患領域に局所的に、典型的には点眼剤として眼に、又
はクリーム又はローションとして皮膚に適用されるであ
ろう。眼の場合、頻繁な治療が好ましく、普通、４時間
又はそれよりも短い間隔で適用される。皮膚上へは、１
日に２〜４回、又はそれよりも頻繁に治療組成物を適用
することにより、治癒期間の間疾患領域上に該治療組成
物を継続的に保持することが好ましい。
GFの放出をもたらすためにリポソーム中にhEGFを導入す
ることが望ましい。そのような導入は、hEGFが上記のよ
うな傷用包帯に含浸される場合、特に望ましい。治療組
成物中のポリペプチドの濃度は、臨界的でなく、普通該
ポリペプチドは、少なくとも１μｇ／ml、普通10μｇ／
ml〜10mg/mlの間で存在するであろう。その組成物は、
疾患領域に局所的に、典型的には点眼剤として眼に、又
はクリーム又はローションとして皮膚に適用されるであ
ろう。眼の場合、頻繁な治療が好ましく、普通、４時間
又はそれよりも短い間隔で適用される。皮膚上へは、１
日に２〜４回、又はそれよりも頻繁に治療組成物を適用
することにより、治癒期間の間疾患領域上に該治療組成
物を継続的に保持することが好ましい。
場合によっては、本発明の治療組成物は、典型的には約
0.001重量％〜２重量％で存在する有効量の麻酔薬、抗
生物質、防腐剤、及び他の薬と混合されている。
0.001重量％〜２重量％で存在する有効量の麻酔薬、抗
生物質、防腐剤、及び他の薬と混合されている。
実験 材料及び方法 １．hEGFポリペプチドの製造 次の実験に使用されるhEGFポリペプチドを酵母株AB103
中でのプラスミドpyαEGF-23の発現によって得た。プラ
スミドpyαEGF-23をBakerなど(1984)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA81：4642〜4646に記載しているように製造した。
プラスミドpyαEGF-23は、Gregory及びPreston(1977)In
t.J.Pepticle Protein Res.9：107〜118によって報告さ
れたＥＧＦのアミノ酸配列に基づく成熟上皮成長因子
（hEGF）についての合成配列を含む。hEGF遺伝子は、酵
母接合フェロモンα−因子のプロモーター及びリーダー
領域をコードする配列に該遺伝子の５′−末端及び該α
−因子遺伝子のターミネーター配列に該遺伝子の３′−
末端に結合される。hEGFのためのこの発現カセットは、
酵母シャトルベクター、すなわちｐｃ１／１中にクロー
ニングされ、そしてこれは酵母と細菌の複製起点及び遺
伝マーカー（細菌についてはａｍｐR、酵母についてはl
eu2）を含む。プラスミドpyαEGF-23により形質転換さ
れた酵母細胞は、培養中に真正な、生物的活性のhEGFを
効果的に産生し、そして分泌する（Brakeなど．，前
記）。
中でのプラスミドpyαEGF-23の発現によって得た。プラ
スミドpyαEGF-23をBakerなど(1984)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA81：4642〜4646に記載しているように製造した。
プラスミドpyαEGF-23は、Gregory及びPreston(1977)In
t.J.Pepticle Protein Res.9：107〜118によって報告さ
れたＥＧＦのアミノ酸配列に基づく成熟上皮成長因子
（hEGF）についての合成配列を含む。hEGF遺伝子は、酵
母接合フェロモンα−因子のプロモーター及びリーダー
領域をコードする配列に該遺伝子の５′−末端及び該α
−因子遺伝子のターミネーター配列に該遺伝子の３′−
末端に結合される。hEGFのためのこの発現カセットは、
酵母シャトルベクター、すなわちｐｃ１／１中にクロー
ニングされ、そしてこれは酵母と細菌の複製起点及び遺
伝マーカー（細菌についてはａｍｐR、酵母についてはl
eu2）を含む。プラスミドpyαEGF-23により形質転換さ
れた酵母細胞は、培養中に真正な、生物的活性のhEGFを
効果的に産生し、そして分泌する（Brakeなど．，前
記）。
２．hEGFの精製 酵母培養物からヒトＥＧＦを、圧力濾過及び限外濾過、
続いて0.1Ｍ酢酸中カルボン酸イオン交換樹脂(BioRex-7
0)からのバッチ吸着及び溶離；並びに高速液体クロマト
グラフィー(HPLC)によって精製した。酵母発酵からの上
清液（180）を、５平方フィートまでいくつかのSpira
/Porユニットカートリッジを用いるセルロース膜（Ultr
a/Por,分子量カットオフ１Ｋ；Pellonのタイプ“Ｃ”）
による圧力濾過にかけた。h-EGFを含む濾過された上清
液１〜２の最終サンプルをさらに、Amicon膜（ＹＭ
２，分子量カットオフ２Ｋ）による限外濾過により濃縮
し、200〜300mlを得た。
続いて0.1Ｍ酢酸中カルボン酸イオン交換樹脂(BioRex-7
0)からのバッチ吸着及び溶離；並びに高速液体クロマト
グラフィー(HPLC)によって精製した。酵母発酵からの上
清液（180）を、５平方フィートまでいくつかのSpira
/Porユニットカートリッジを用いるセルロース膜（Ultr
a/Por,分子量カットオフ１Ｋ；Pellonのタイプ“Ｃ”）
による圧力濾過にかけた。h-EGFを含む濾過された上清
液１〜２の最終サンプルをさらに、Amicon膜（ＹＭ
２，分子量カットオフ２Ｋ）による限外濾過により濃縮
し、200〜300mlを得た。
Ｐ−10樹脂(Bio-Racl)1700mlを充填したカラムを、0.1
Ｍ酢酸2500mlにより平衡化した。hEGFを含有する濃縮濾
液200〜300mlを、４℃で１時間当り0.16の速度で前記
カラムを通した。ヒトＥＧＦをカラムの包含体積から回
収した。hEGFを含む画分をプールし(400ml)、そして該
プールの前に記載したようなAmiconの限外濾過膜（ＹＭ
２，分子量カットオフ２Ｋ）を用いて濃縮した。約16mg
/mlのhEGFを含む溶液約20〜30mlを得た。次に、この溶
液を0.45μｍのAcrodiskを通して濾過した。
Ｍ酢酸2500mlにより平衡化した。hEGFを含有する濃縮濾
液200〜300mlを、４℃で１時間当り0.16の速度で前記
カラムを通した。ヒトＥＧＦをカラムの包含体積から回
収した。hEGFを含む画分をプールし(400ml)、そして該
プールの前に記載したようなAmiconの限外濾過膜（ＹＭ
２，分子量カットオフ２Ｋ）を用いて濃縮した。約16mg
/mlのhEGFを含む溶液約20〜30mlを得た。次に、この溶
液を0.45μｍのAcrodiskを通して濾過した。
前段階から得られた材料を、Ｃ４逆相HPLCカラム中に注
入し、そして0.05％トリフルオロ酢酸中５％〜80％のア
セトニトリルのグラジェントにより、およそ５５分間に
わたって溶出した。主なhEGFピークを含む画分を蒸発
し、そして凍結乾燥した。その材料を乾燥粉末として貯
蔵した。
入し、そして0.05％トリフルオロ酢酸中５％〜80％のア
セトニトリルのグラジェントにより、およそ５５分間に
わたって溶出した。主なhEGFピークを含む画分を蒸発
し、そして凍結乾燥した。その材料を乾燥粉末として貯
蔵した。
３．角膜上皮の創傷 オルオレセイン染色によって確かめられるようにｎ−オ
クタノール及びBard-Parkerの＃15のメスによるかき取
りによって、麻酔をかけられたサルの角膜から上皮細胞
を完全に取り除いた。サルに、１日に３回２滴のNeodec
adron のみ（対照の眼）又はhEGF(0.1mg/ml)を含むNeo
decadron を与えた。毎日、眼をフルオレセインにより
染色し、そして写真を取った。上皮の再生の程度を、He
wletl-Packardのジスチジング表モデル(distizing tabl
e model)(9874A)を用いて、拡大写真のプラニメーター
法によって量的に測定した。個々の創傷領域を３回測定
し、そして平均値を決定した。上皮の再生の程度を、治
癒された最初の創傷領域の百分率として表わした。治療
の４日後、Ｔ−61安楽死溶液を注入することによってサ
ルを殺し、そして角膜を取り除き、１０％の中性緩衝ホ
ルマリン中に固定し、パラフィンにより処理し、切開
し、そしてヘマトキシレン及びエオシンにより染色し
た。
クタノール及びBard-Parkerの＃15のメスによるかき取
りによって、麻酔をかけられたサルの角膜から上皮細胞
を完全に取り除いた。サルに、１日に３回２滴のNeodec
adron のみ（対照の眼）又はhEGF(0.1mg/ml)を含むNeo
decadron を与えた。毎日、眼をフルオレセインにより
染色し、そして写真を取った。上皮の再生の程度を、He
wletl-Packardのジスチジング表モデル(distizing tabl
e model)(9874A)を用いて、拡大写真のプラニメーター
法によって量的に測定した。個々の創傷領域を３回測定
し、そして平均値を決定した。上皮の再生の程度を、治
癒された最初の創傷領域の百分率として表わした。治療
の４日後、Ｔ−61安楽死溶液を注入することによってサ
ルを殺し、そして角膜を取り除き、１０％の中性緩衝ホ
ルマリン中に固定し、パラフィンにより処理し、切開
し、そしてヘマトキシレン及びエオシンにより染色し
た。
４．角膜基質の創傷 麻酔をかけられた雌のMacaca fascicularisサルの両眼
に十分な厚さで長さ５mmの中央の角膜切開を行なった。
0.1mg/mlの最終濃度でhEGFを含むNeodecadron の２滴
を、毎日３回実験の眼に適用した。対照の眼を同じよう
に、Neodecadron のみにより処理した。６及び９日
後、角膜裂傷を細隙灯（生体）顕微鏡によって調べ、そ
して写真を取った。治療の９日後、創傷の治癒の程度を
角膜／強膜接合部で前眼房中に２５ゲージカニューレを
挿入することによって測定し、そして眼内圧をTycosの
手づかみアネロイド圧力計を用いていだいに上昇せしめ
た。漏れそして次に創傷の破裂を開始するのに必要な圧
力を決定し、そして結果をステューデント対のＴ−テス
トを用いて分析した。実験の最後で、Ｔ−６１安楽死溶
液を静脈内投与することによって殺し、そして眼を摘出
し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、バラフィ
ン中に埋込み、切片にし、ヘマトキシレンによって染色
し、そして次に創傷の治癒の組織的形跡について調べ
た。
に十分な厚さで長さ５mmの中央の角膜切開を行なった。
0.1mg/mlの最終濃度でhEGFを含むNeodecadron の２滴
を、毎日３回実験の眼に適用した。対照の眼を同じよう
に、Neodecadron のみにより処理した。６及び９日
後、角膜裂傷を細隙灯（生体）顕微鏡によって調べ、そ
して写真を取った。治療の９日後、創傷の治癒の程度を
角膜／強膜接合部で前眼房中に２５ゲージカニューレを
挿入することによって測定し、そして眼内圧をTycosの
手づかみアネロイド圧力計を用いていだいに上昇せしめ
た。漏れそして次に創傷の破裂を開始するのに必要な圧
力を決定し、そして結果をステューデント対のＴ−テス
トを用いて分析した。実験の最後で、Ｔ−６１安楽死溶
液を静脈内投与することによって殺し、そして眼を摘出
し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、バラフィ
ン中に埋込み、切片にし、ヘマトキシレンによって染色
し、そして次に創傷の治癒の組織的形跡について調べ
た。
５．裂けた厚さの(split thickness)皮膚創傷 Vita-Vet の４匹の白色の成熟したミニチュアー豚（50
〜60ポンド）の胸及び脊椎傍領域を剃った。おのおのの
豚をケタミンにより麻酔した。７５個の10mm×10mmの大
きさの裂けた厚さの創傷を、改良されたCastro-Viejo皮
膚採取器によりおのおのの豚に作りだした。その創傷は
0.005インチの深さであり、そして１cmごとに配列され
た。おのおのの豚上に３グループの創傷が存在した。グ
ループ１は生理的食塩水のみの局部治療を受けた。グル
ープ２はラノリン クリーム(squibb and Sons,プリン
ストン、ニュージャジィ）による局部治療を受けた。グ
ループ３は10μｇ／mlのhEGFを含むラノリン クリーム
による局部治療を受けた。おのおのの創傷は、１２時間
ごとに創傷当り、1/2mlの適切な治療を受けた。初めの
創傷の後２４時間で、おのおのの豚上の個々のグループ
から４個き創傷を、標準刃（２２mmの幅）を用いて完全
に切除した。創傷部及び回りの非創傷皮膚を取り除い
た。皮膚採取器を0.007インチの深さにセットした。切
除された検体を４℃で１％トリプシン ブイヨン中に１
晩インキュベートした。表皮は次の日真皮から容易に分
離された。分離された表皮中に欠損が見られない場合、
その検体は治癒されたと思われた。おのおののグループ
から４個の創傷を６日間毎日切取った。
〜60ポンド）の胸及び脊椎傍領域を剃った。おのおのの
豚をケタミンにより麻酔した。７５個の10mm×10mmの大
きさの裂けた厚さの創傷を、改良されたCastro-Viejo皮
膚採取器によりおのおのの豚に作りだした。その創傷は
0.005インチの深さであり、そして１cmごとに配列され
た。おのおのの豚上に３グループの創傷が存在した。グ
ループ１は生理的食塩水のみの局部治療を受けた。グル
ープ２はラノリン クリーム(squibb and Sons,プリン
ストン、ニュージャジィ）による局部治療を受けた。グ
ループ３は10μｇ／mlのhEGFを含むラノリン クリーム
による局部治療を受けた。おのおのの創傷は、１２時間
ごとに創傷当り、1/2mlの適切な治療を受けた。初めの
創傷の後２４時間で、おのおのの豚上の個々のグループ
から４個き創傷を、標準刃（２２mmの幅）を用いて完全
に切除した。創傷部及び回りの非創傷皮膚を取り除い
た。皮膚採取器を0.007インチの深さにセットした。切
除された検体を４℃で１％トリプシン ブイヨン中に１
晩インキュベートした。表皮は次の日真皮から容易に分
離された。分離された表皮中に欠損が見られない場合、
その検体は治癒されたと思われた。おのおののグループ
から４個の創傷を６日間毎日切取った。
上記実験をくり返した（但し、グループ２はSilvadene
のみの治療及び10μｇ／mlでhEGFを含むSilvadene
による治療を受けたことが異なる）。
のみの治療及び10μｇ／mlでhEGFを含むSilvadene
による治療を受けたことが異なる）。
６．裂けた厚さの表皮創傷 Vita-Vet Laboratories,Inc.,(Marion,IN)からの４匹の
成熟したミニチュアー豚（50〜60ポンド）をケタミンに
より麻酔し、そして背胸部を剃った。おのおのの豚に対
して、８４個の10mm×10mmの大きさの裂けた厚さの皮膚
創傷を、改良された皮膚採取器により作り出した。その
創傷は、0.005インチの厚さであり、そして１cmごとに
配列された。おのおのの豚上の創傷を、それぞれ２８個
の創傷からなる３種類の治療グループにランダムに分け
た。グループ１は局部治療を受けなかった。グループ２
はラノリン クリームによる局部治療を受け、そしてグ
ループ３は10μｇ／mlのhEGFを含むラノリン クリーム
による局部治療を受けた。創傷を１２時間ごとに適切な
クリーム0.5mlにより局部的に治療した。ラノリン及びh
EGF含有ラノリンの正体は、結果が計算されるまで隠さ
れた。Silvadene クリーム中１％スルファジアジン銀
を用いて、同一の実験を行なった。
成熟したミニチュアー豚（50〜60ポンド）をケタミンに
より麻酔し、そして背胸部を剃った。おのおのの豚に対
して、８４個の10mm×10mmの大きさの裂けた厚さの皮膚
創傷を、改良された皮膚採取器により作り出した。その
創傷は、0.005インチの厚さであり、そして１cmごとに
配列された。おのおのの豚上の創傷を、それぞれ２８個
の創傷からなる３種類の治療グループにランダムに分け
た。グループ１は局部治療を受けなかった。グループ２
はラノリン クリームによる局部治療を受け、そしてグ
ループ３は10μｇ／mlのhEGFを含むラノリン クリーム
による局部治療を受けた。創傷を１２時間ごとに適切な
クリーム0.5mlにより局部的に治療した。ラノリン及びh
EGF含有ラノリンの正体は、結果が計算されるまで隠さ
れた。Silvadene クリーム中１％スルファジアジン銀
を用いて、同一の実験を行なった。
最初の創傷の後２４時間ごとに、おのおのの豚上のそれ
ぞれのグループから４個の創傷を、ランダムに選択し、
そして0.007インチの深さにセットされた２０mmの標準
刃を用いて、回りの非創傷の皮膚５mmを含んで、完全に
切除した。その切除された検体を４℃で０〜0.25％のト
リプシン ブイヨン中に２４時間インキュベートした。
表皮及び真皮はインキュベーションの後に容易に分離さ
れた。表皮創傷は、分離された表皮中にきずか残存して
いない場合、治癒されたと見なされ、又はいづれかのき
ずが存在する場合、それは治癒されていないと見なされ
た。結果をカイ二乗分析を用いて、統計的有意性を比較
した。
ぞれのグループから４個の創傷を、ランダムに選択し、
そして0.007インチの深さにセットされた２０mmの標準
刃を用いて、回りの非創傷の皮膚５mmを含んで、完全に
切除した。その切除された検体を４℃で０〜0.25％のト
リプシン ブイヨン中に２４時間インキュベートした。
表皮及び真皮はインキュベーションの後に容易に分離さ
れた。表皮創傷は、分離された表皮中にきずか残存して
いない場合、治癒されたと見なされ、又はいづれかのき
ずが存在する場合、それは治癒されていないと見なされ
た。結果をカイ二乗分析を用いて、統計的有意性を比較
した。
７．部分的厚さ(partial Thickness)の熱傷 14〜20ポンドの重さの４匹のヨークシャアー子豚を地方
で得て、そしてケタミンにより麻酔し、背胸部を剃り、
そして残る毛をジピラトリイ(dipilatory)クリームによ
り除去した。430ｇの重さの３cm×５cm真鍮性型板を水
中で７０℃に加熱し、そしておのおのの豚の背部皮膚に
１０秒間接触せしめ、そして結果として生じる水疱を取
り除いた。生検検体の組織的評価は、部分的厚さの熱傷
が起こされたことを確認した。６個の同一の創傷をおの
おのの豚の背部上に作った（９０cm2又は体表面積の６
％の合計熱傷領域）。おのおのの豚に対して、２個の創
傷を、水相溶性基剤中１％スルファジアジン銀＋hEGF(1
0μｇ／ml）により局部治療し、２個の創傷をクリーム
基剤のみにより治療し、そして２個の創傷を治療しなか
った。クリームの正体は、データが分析されるまで隠さ
れた。創傷を１週間にわたり１２時間ごとに治療した
（0.5mlのクリーム／cm2熱傷）。７日後の最後で、フィ
ブリン凝塊を取り除き、そしておのおのの創傷の写真を
取った。上皮形成したおのおのの創傷に対する最初の熱
傷領域の百分率を、拡大写真のコンピューター化された
プラニメーター法によって決定した。結果を、分散の一
元分析を用いて統計的有意性を比較した。組織的試験の
ために創傷の異なった領域からランダムに生検を行な
い、再生された表皮の存在を確めた。
で得て、そしてケタミンにより麻酔し、背胸部を剃り、
そして残る毛をジピラトリイ(dipilatory)クリームによ
り除去した。430ｇの重さの３cm×５cm真鍮性型板を水
中で７０℃に加熱し、そしておのおのの豚の背部皮膚に
１０秒間接触せしめ、そして結果として生じる水疱を取
り除いた。生検検体の組織的評価は、部分的厚さの熱傷
が起こされたことを確認した。６個の同一の創傷をおの
おのの豚の背部上に作った（９０cm2又は体表面積の６
％の合計熱傷領域）。おのおのの豚に対して、２個の創
傷を、水相溶性基剤中１％スルファジアジン銀＋hEGF(1
0μｇ／ml）により局部治療し、２個の創傷をクリーム
基剤のみにより治療し、そして２個の創傷を治療しなか
った。クリームの正体は、データが分析されるまで隠さ
れた。創傷を１週間にわたり１２時間ごとに治療した
（0.5mlのクリーム／cm2熱傷）。７日後の最後で、フィ
ブリン凝塊を取り除き、そしておのおのの創傷の写真を
取った。上皮形成したおのおのの創傷に対する最初の熱
傷領域の百分率を、拡大写真のコンピューター化された
プラニメーター法によって決定した。結果を、分散の一
元分析を用いて統計的有意性を比較した。組織的試験の
ために創傷の異なった領域からランダムに生検を行な
い、再生された表皮の存在を確めた。
hEGFの濃度を変えることに伴う表皮再生の反応が、類似
する技法を用いて評価された。２匹のヨークシャー子豚
に麻酔をかけ、そして１０個の同一の裂けた厚さの熱傷
を、147ｇの重さの３cm×３cmの真鍮性型板を用いる前
に作った。１０個の創傷を、グループ当り２個の創傷を
含む５種類のグループに割り当てた。クリーム基剤の
み、又はhEGF(10μｇ／ml，１μｇ／ml、又は0.1μｇ／
ml）を含むクリーム基剤のいづれかにより毎日２度おの
おののグループを治療するか、あるいは治療しなかっ
た。治療の７日後、フィブリン凝塊をそれぞれの創傷か
ら取り除き、次に熱傷の写真を取り、そして定量プラニ
メーター法を行ない、表皮再生のパーセントを測定し
た。結果を、分散の一元分析及びTukey HSDテストを用
いて統計的有意性について分析した。すべての部分的厚
さの熱傷実験において、おのおのの熱傷は、統計的比較
のためには独立した測定とみなされた。
する技法を用いて評価された。２匹のヨークシャー子豚
に麻酔をかけ、そして１０個の同一の裂けた厚さの熱傷
を、147ｇの重さの３cm×３cmの真鍮性型板を用いる前
に作った。１０個の創傷を、グループ当り２個の創傷を
含む５種類のグループに割り当てた。クリーム基剤の
み、又はhEGF(10μｇ／ml，１μｇ／ml、又は0.1μｇ／
ml）を含むクリーム基剤のいづれかにより毎日２度おの
おののグループを治療するか、あるいは治療しなかっ
た。治療の７日後、フィブリン凝塊をそれぞれの創傷か
ら取り除き、次に熱傷の写真を取り、そして定量プラニ
メーター法を行ない、表皮再生のパーセントを測定し
た。結果を、分散の一元分析及びTukey HSDテストを用
いて統計的有意性について分析した。すべての部分的厚
さの熱傷実験において、おのおのの熱傷は、統計的比較
のためには独立した測定とみなされた。
結果 １．角膜上皮の再生 角膜のフルオレセイン染色領域の定量プラニメーター法
は、上皮の除去の後の初めの２日間、hEGF-Neodecadron
が再上皮形成した角膜表面の百分率を有意に（Ｐ＜0.
05，カイ二乗分析）上昇せしめることを示した。治療の
次の２日間（３及び４日間）、hEGFを含むNeodecadron
により治療された眼は、Neodecadron のみにより治
療された４個の対照角膜のうち２個が治ったように、完
全にすべてが治癒された。
は、上皮の除去の後の初めの２日間、hEGF-Neodecadron
が再上皮形成した角膜表面の百分率を有意に（Ｐ＜0.
05，カイ二乗分析）上昇せしめることを示した。治療の
次の２日間（３及び４日間）、hEGFを含むNeodecadron
により治療された眼は、Neodecadron のみにより治
療された４個の対照角膜のうち２個が治ったように、完
全にすべてが治癒された。
Neodecadron のみにより治療された対照角膜中の治癒
の速度は、最初の創傷のおよそ80〜90％が治癒されるま
で、すべての４個の対照角膜において直線的であり、次
にその治癒の速度は低下した。対照的にhEGF-Neodecadr
on により治療された角膜は、その創傷が完全な治癒に
近づくにつれて減少する、治癒の急速な初期速度を伴う
曲線形の治癒速度を一貫して示した。
の速度は、最初の創傷のおよそ80〜90％が治癒されるま
で、すべての４個の対照角膜において直線的であり、次
にその治癒の速度は低下した。対照的にhEGF-Neodecadr
on により治療された角膜は、その創傷が完全な治癒に
近づくにつれて減少する、治癒の急速な初期速度を伴う
曲線形の治癒速度を一貫して示した。
Neodecadron により治療された角膜の再生された上皮
の組織学的試験は、創傷治癒の中間から最終段階におい
て、溥く染色された細胞質、及び増殖性基部上皮細胞の
特徴を示す大きく不規則な核を有する大きな立方形の基
部細胞による３〜５の細胞層を示した。対照的に、hEGF
-Neodecadron により治療された角膜は、黒く染色され
た細胞質及び正常な上皮にとって典型的である均質の核
を有する立方形の基部細胞による４〜６の細胞層を有し
た。
の組織学的試験は、創傷治癒の中間から最終段階におい
て、溥く染色された細胞質、及び増殖性基部上皮細胞の
特徴を示す大きく不規則な核を有する大きな立方形の基
部細胞による３〜５の細胞層を示した。対照的に、hEGF
-Neodecadron により治療された角膜は、黒く染色され
た細胞質及び正常な上皮にとって典型的である均質の核
を有する立方形の基部細胞による４〜６の細胞層を有し
た。
２．角膜基質創傷の治癒 治療の９日後、前眼房中に漏れを引き起こしそして次に
角膜創傷の破裂を引き起こす圧力を測定した。hEGF-Neo
decadron による治療は、Neodecadron のみで治療さ
れた角膜と比べて、漏れ圧力及び破裂圧力の両者を有意
に増大せしめた。さらに、hEGF-Neodecadron による治
療は、上皮が無傷である場合、及び上皮が実験の始めで
除却された場合の両者のNeodecadron のみの治療に対
する相対的な創傷強度を増大せしめた（Ｐ＜0.001）。
創傷の前での角膜上皮の完全な除去は、元のままの上皮
を有する角膜に行なわれた創傷と比較して、hEGFにより
治療された角膜（Ｐ＜0.01）及び対照角膜（Ｐ＜0.00
1）の両者において、有意で一層劣っている治癒を引き
起こした。このことは、上皮の存在が基質創傷の治癒の
過程を助けることを示唆する。
角膜創傷の破裂を引き起こす圧力を測定した。hEGF-Neo
decadron による治療は、Neodecadron のみで治療さ
れた角膜と比べて、漏れ圧力及び破裂圧力の両者を有意
に増大せしめた。さらに、hEGF-Neodecadron による治
療は、上皮が無傷である場合、及び上皮が実験の始めで
除却された場合の両者のNeodecadron のみの治療に対
する相対的な創傷強度を増大せしめた（Ｐ＜0.001）。
創傷の前での角膜上皮の完全な除去は、元のままの上皮
を有する角膜に行なわれた創傷と比較して、hEGFにより
治療された角膜（Ｐ＜0.01）及び対照角膜（Ｐ＜0.00
1）の両者において、有意で一層劣っている治癒を引き
起こした。このことは、上皮の存在が基質創傷の治癒の
過程を助けることを示唆する。
角膜創傷の組織学的試験は、上皮細胞のプラグが、Neod
ecadron により治療された眼中の切り傷の全長を拡張
したことを示した。これに対して、上皮細胞のプラグ
は、hEGF-Neodecadron により治療された眼における切
り傷の約1/3の長さのみを拡張した。その創傷の残る部
分においては、縁をもはや明らかに識別できず、融合
し、そして繊維状物質（多分コラーゲン）の糸状体が創
傷の部分を広げた。細隙灯生体顕微鏡による創傷の試験
は、hEGF-Neodecadron により治療された眼中の創傷が
細く、そして治癒されたように思われ、他方、Neodecad
ron のみにより治療された創傷は広くそして治癒され
ていないように思えたことを示した。
ecadron により治療された眼中の切り傷の全長を拡張
したことを示した。これに対して、上皮細胞のプラグ
は、hEGF-Neodecadron により治療された眼における切
り傷の約1/3の長さのみを拡張した。その創傷の残る部
分においては、縁をもはや明らかに識別できず、融合
し、そして繊維状物質（多分コラーゲン）の糸状体が創
傷の部分を広げた。細隙灯生体顕微鏡による創傷の試験
は、hEGF-Neodecadron により治療された眼中の創傷が
細く、そして治癒されたように思われ、他方、Neodecad
ron のみにより治療された創傷は広くそして治癒され
ていないように思えたことを示した。
３．裂けた厚さの皮膚創傷の治癒 hEGF−ラノリンにより治療された創傷（Ｎ＝16）の５０
％（８）が２日で治癒した。ラノリンのみ及び生理的食
塩水により治療された対照グループは、切除された創傷
の５０％が治癒する前に４日よりも多くの日数を要した
（Ｐ＜0.001）。６日後、切除されたすべての創傷（Ｎ
＝16）が治癒した。その結果は次のとおりであった。
％（８）が２日で治癒した。ラノリンのみ及び生理的食
塩水により治療された対照グループは、切除された創傷
の５０％が治癒する前に４日よりも多くの日数を要した
（Ｐ＜0.001）。６日後、切除されたすべての創傷（Ｎ
＝16）が治癒した。その結果は次のとおりであった。
hEGF-Silvadene による治療は、２日で６２％の治癒率
及び５日までに100％の治癒率をもたらした。これに対
して、生理食塩水又は、Silvadene のみによる治療
は、４日目まで治癒をもたらさず、そして７日後にのみ
完全な治癒をもたらした。その結果は次のとおりであっ
た。
及び５日までに100％の治癒率をもたらした。これに対
して、生理食塩水又は、Silvadene のみによる治療
は、４日目まで治癒をもたらさず、そして７日後にのみ
完全な治癒をもたらした。その結果は次のとおりであっ
た。
４．十分な厚さの皮膚創傷の治癒 350ｇの重さの２０匹の雄Spraque Dawlegネズミをこの
研究に包含した。おのおののネズミの背上に、外科的な
一次創傷を模倣するために、皮筋層を通して３cmの肩甲
骨間の皮膚切開を行なった。１０匹のネズミをランダム
にグループＡに割り当て、他方残る１０匹のネズミをグ
ループＢに割り当てた。グループＡのおのおののネズミ
は、“軟膏Ａ”１ccの治療を受け、そしてグループＢは
ネズミは“軟膏Ｂ”１ccの治療を受けた。その軟膏を、
金属性ステープルにより創傷を閉じる前に該創傷の基部
に適用した。この研究は二重盲検であり、そしてここで
“軟膏Ａ”はＫ−Ｙジェリー中hEGF10μｇ／mlから成
り、そして“軟膏Ｂ”はＫ−Ｙジェリーのみから成っ
た。
研究に包含した。おのおののネズミの背上に、外科的な
一次創傷を模倣するために、皮筋層を通して３cmの肩甲
骨間の皮膚切開を行なった。１０匹のネズミをランダム
にグループＡに割り当て、他方残る１０匹のネズミをグ
ループＢに割り当てた。グループＡのおのおののネズミ
は、“軟膏Ａ”１ccの治療を受け、そしてグループＢは
ネズミは“軟膏Ｂ”１ccの治療を受けた。その軟膏を、
金属性ステープルにより創傷を閉じる前に該創傷の基部
に適用した。この研究は二重盲検であり、そしてここで
“軟膏Ａ”はＫ−Ｙジェリー中hEGF10μｇ／mlから成
り、そして“軟膏Ｂ”はＫ−Ｙジェリーのみから成っ
た。
おのおののネズミを別々に収容し、そして切開後１０日
で、そのネズミをCO2室中で殺した。創傷を３cm×３cm
の長方形に皮筋層と共に完全に切除した。グループＡ中
のこれらのネズミは、皮膚側を上にして調べられる場
合、切開の形跡を持たなかった。しかしながら、グルー
プＢ中のネズミは、皮膚側を上にして調べられる場合、
切開がされた場所に残存する明らかなきずを有した。破
裂強度測定及びヒドロキシプロリン検定は、グループＢ
中のネズミよりもグループＡ中のネズミにおいてすべて
高かった。これらのデータは、hEGFがコラーゲン合成及
び上皮形成を高め、そして従って、多くの異なった型の
外科切開の治療に適用する可能性があることを示す。
で、そのネズミをCO2室中で殺した。創傷を３cm×３cm
の長方形に皮筋層と共に完全に切除した。グループＡ中
のこれらのネズミは、皮膚側を上にして調べられる場
合、切開の形跡を持たなかった。しかしながら、グルー
プＢ中のネズミは、皮膚側を上にして調べられる場合、
切開がされた場所に残存する明らかなきずを有した。破
裂強度測定及びヒドロキシプロリン検定は、グループＢ
中のネズミよりもグループＡ中のネズミにおいてすべて
高かった。これらのデータは、hEGFがコラーゲン合成及
び上皮形成を高め、そして従って、多くの異なった型の
外科切開の治療に適用する可能性があることを示す。
５．裂けた厚さの表皮創傷 hEGF−ラノリンにより治療された表皮創傷（ｎ＝16）の
５０％は２日で治癒し、；他方、治療しなかったグルー
プ及びラノリンにより治療された対照グループは、創傷
の５０％が治癒するのに４日よりも多くの日数を必要と
した。おのおののグループ中のすべての創傷（ｎ＝16）
は、７日目までに治癒された。同様に、水相溶性基剤中
１％スルファジアジン銀中のhEGFにより治療された創傷
のうち６０％が２日で治癒され；他方、治療されなかっ
た創傷の６０％及びクリーム基剤のみにより治療された
対照の６０％を治癒するのに４日以上を必要とした。す
べての創傷は１週間後治癒された。両方の場合、hEGFに
より治療された創傷は、治療されていない創傷又はクリ
ーム基剤のみにより治療された創傷と比較して、表皮再
生が有意に（Ｐ＜0.01）早くなった。治癒された創傷の
うち、対照の創傷及びhEGFにより治療された創傷の両者
は、７日後組織学的外観上類似していて、そしてhEGFに
より治療された創傷中には肥原変性又は化生変質の形跡
がなかった。すべての３種類のグループは、正常な豚の
皮膚の層化した鱗状上皮の特徴である。10〜12細胞層を
示した。
５０％は２日で治癒し、；他方、治療しなかったグルー
プ及びラノリンにより治療された対照グループは、創傷
の５０％が治癒するのに４日よりも多くの日数を必要と
した。おのおののグループ中のすべての創傷（ｎ＝16）
は、７日目までに治癒された。同様に、水相溶性基剤中
１％スルファジアジン銀中のhEGFにより治療された創傷
のうち６０％が２日で治癒され；他方、治療されなかっ
た創傷の６０％及びクリーム基剤のみにより治療された
対照の６０％を治癒するのに４日以上を必要とした。す
べての創傷は１週間後治癒された。両方の場合、hEGFに
より治療された創傷は、治療されていない創傷又はクリ
ーム基剤のみにより治療された創傷と比較して、表皮再
生が有意に（Ｐ＜0.01）早くなった。治癒された創傷の
うち、対照の創傷及びhEGFにより治療された創傷の両者
は、７日後組織学的外観上類似していて、そしてhEGFに
より治療された創傷中には肥原変性又は化生変質の形跡
がなかった。すべての３種類のグループは、正常な豚の
皮膚の層化した鱗状上皮の特徴である。10〜12細胞層を
示した。
６．部分的厚さの熱傷 ７日後、実質的に完全な表皮再生が水相溶性基剤中１％
スルファジアジン銀中hEGFにより治療された部分的厚さ
の熱傷上に生じ、他方治療されていない熱傷又はクリー
ム基剤のみにより治療された熱傷の実質的な領域は治療
されなかった。プラニメーター法による定量測定の結果
は、hEGFによる治療の結果として上皮形成の百分率にお
ける統計的に有意（Ｐ＜0.01）な増大を示した。その結
果は次のとおりであった。
スルファジアジン銀中hEGFにより治療された部分的厚さ
の熱傷上に生じ、他方治療されていない熱傷又はクリー
ム基剤のみにより治療された熱傷の実質的な領域は治療
されなかった。プラニメーター法による定量測定の結果
は、hEGFによる治療の結果として上皮形成の百分率にお
ける統計的に有意（Ｐ＜0.01）な増大を示した。その結
果は次のとおりであった。
治療 治癒された熱傷領域の百分
率 hEGF 93±６ 対照 36±18 治療していない 17±11 ＊（Ｐ＜0.01）は分散の一元分析及びTukey′ｓHSD試験
を用いての値である。水相溶性基剤中１％スルファジア
ジン銀中hEGF(10μｇ／ml）、水相溶性基剤中１％スル
ファジアジン銀（対照）により７日間治療された又は治
療されなかった部分的厚さの熱傷の写真に対してプラニ
メーター法による定量測定を行なった。値は、８個の創
傷についての平均±ＳＤである。
率 hEGF 93±６ 対照 36±18 治療していない 17±11 ＊（Ｐ＜0.01）は分散の一元分析及びTukey′ｓHSD試験
を用いての値である。水相溶性基剤中１％スルファジア
ジン銀中hEGF(10μｇ／ml）、水相溶性基剤中１％スル
ファジアジン銀（対照）により７日間治療された又は治
療されなかった部分的厚さの熱傷の写真に対してプラニ
メーター法による定量測定を行なった。値は、８個の創
傷についての平均±ＳＤである。
熱傷による外傷の７日後に採取された生検検体は、写真
において治癒されたと判断されたこれらの領域に完全な
表皮の再生を確かにした。hEGFにより治療された熱傷の
再生された表皮は、層化、細胞に伴う顕著な核、限られ
た細胞間水腫、及び増殖性表皮に典型的である適度の皮
膚炎症反応を示した。これに対して、ひじょうに小さな
表皮再生を、水相溶性基剤中１％スルファジアジン銀に
より治療された熱傷又は実質的な皮膚炎症反応を示した
治療されていない熱傷中に観察した。熱傷による外傷の
３５日後に採取された生検検体は、すべてのグループ中
に正常な表皮及び皮膚構造を示し、そしてhEGFにより治
療された熱傷中に化生の形跡を共わなかった。
において治癒されたと判断されたこれらの領域に完全な
表皮の再生を確かにした。hEGFにより治療された熱傷の
再生された表皮は、層化、細胞に伴う顕著な核、限られ
た細胞間水腫、及び増殖性表皮に典型的である適度の皮
膚炎症反応を示した。これに対して、ひじょうに小さな
表皮再生を、水相溶性基剤中１％スルファジアジン銀に
より治療された熱傷又は実質的な皮膚炎症反応を示した
治療されていない熱傷中に観察した。熱傷による外傷の
３５日後に採取された生検検体は、すべてのグループ中
に正常な表皮及び皮膚構造を示し、そしてhEGFにより治
療された熱傷中に化生の形跡を共わなかった。
治癒される熱傷表面の百分率を有意（Ｐ＜0.05）に高く
する、hEGF及び水相溶性基剤のみ中１％スルファジアジ
ン銀のすべての濃度を、治療されていない対照と比較す
る。しかしながら、10μｇ／mlでのhEGFにより治療され
た熱傷のみが、クリーム基剤のみにより治療された熱傷
よりも有意（Ｐ＜0.05）に一層治癒された。代表的な生
検検体の組織学的評価は、創傷の写真から治癒された断
定される領域中において完全な表皮再生を確認した。
する、hEGF及び水相溶性基剤のみ中１％スルファジアジ
ン銀のすべての濃度を、治療されていない対照と比較す
る。しかしながら、10μｇ／mlでのhEGFにより治療され
た熱傷のみが、クリーム基剤のみにより治療された熱傷
よりも有意（Ｐ＜0.05）に一層治癒された。代表的な生
検検体の組織学的評価は、創傷の写真から治癒された断
定される領域中において完全な表皮再生を確認した。
本発明によれば、皮膚創傷及び角膜創傷の両者を含む上
皮創傷の急速な治癒を促進せしめる創傷治療組成物が提
供される。その組成物は、天然のヒト上皮成長因子の配
列に基づくアミノ酸配列を有するポリペプチド生成物
を、そのような治癒を促進するのに有効な量含む。その
組成物は、角膜に対する深い創傷から得られる上皮層及
び下部の基質層の両者の再生を促進せしめることを見出
される。
皮創傷の急速な治癒を促進せしめる創傷治療組成物が提
供される。その組成物は、天然のヒト上皮成長因子の配
列に基づくアミノ酸配列を有するポリペプチド生成物
を、そのような治癒を促進するのに有効な量含む。その
組成物は、角膜に対する深い創傷から得られる上皮層及
び下部の基質層の両者の再生を促進せしめることを見出
される。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的に
いくらか詳細に記載されたが、請求の範囲内で修飾及び
変更を行なうことができる。
いくらか詳細に記載されたが、請求の範囲内で修飾及び
変更を行なうことができる。
プラスミドpyαEGF-23を、1983年８月１２日American T
ype Culture Collectionに寄託し、そして寄託番号4007
9を得た。
ype Culture Collectionに寄託し、そして寄託番号4007
9を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エイファーマン，リチャード アメリカ合衆国，ケンタッキー 40292, ルイスビル，マリ ヒル パイク 3106 (72)発明者 シュルツ，グレゴリー エル アメリカ合衆国，ケンタッキー 40292, ルイスビル，スカイラーク ドライブ 808 (72)発明者 バレンヅェラ，パブロ ディー．ティー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，アッパー テラス ＃３，455 (56)参考文献 特開 昭59−196820（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−65020（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81（1984）Ｐ．4642 〜4646
Claims (4)
- 【請求項１】角膜基質創傷の治療のための組成物であっ
て、 基質細胞の増殖を刺激することができるポリペプチド
｛該ポリペプチドは酵母によって認識される分泌リーダ
ー配列及びプロセシングシグナル配列を含む調節配列の
転写調節及び翻訳調節下で、天然に存在するヒト上皮成
長因子 （hEGF）のアミノ酸配列を少なくとも実質的にコードす
る遺伝子を担持する染色体外要素によって形質転換され
た酵母宿主を適切な培養基中において増殖せしめ、該培
養基からポリペプチドを単離し、そしてポリペプチドを
精製することによって産生される｝；及び 生理的に許容できる担体 を含んで成る組成物。 - 【請求項２】前記hEGF遺伝子が合成体である請求の範囲
第１項記載の組成物。 - 【請求項３】前記hEGF遺伝子が好ましい酵母コドンから
構成された合成遺伝子である請求の範囲第２項記載の組
成物。 - 【請求項４】前記ポリペプチドが１μｇ／ml〜10mg/ml
で担体中に存在する請求の範囲第１項記載の組成物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66309284A | 1984-10-19 | 1984-10-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63502985A JPS63502985A (ja) | 1988-11-02 |
| JPH0611709B2 true JPH0611709B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=24660436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60504751A Expired - Lifetime JPH0611709B2 (ja) | 1984-10-19 | 1985-10-16 | 角膜基質創傷の治療のための組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4959353A (ja) |
| EP (1) | EP0200757B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0611709B2 (ja) |
| AT (1) | ATE73345T1 (ja) |
| DE (1) | DE3585618D1 (ja) |
| WO (1) | WO1986002271A1 (ja) |
Families Citing this family (51)
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