JPH07316066A - 創傷治癒剤 - Google Patents
創傷治癒剤Info
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- JPH07316066A JPH07316066A JP6138097A JP13809794A JPH07316066A JP H07316066 A JPH07316066 A JP H07316066A JP 6138097 A JP6138097 A JP 6138097A JP 13809794 A JP13809794 A JP 13809794A JP H07316066 A JPH07316066 A JP H07316066A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 種々の創傷に対し、本質的治療薬となりうる
新しい細胞成長因子を有効成分として含有する、治療効
果や安全性の高い創傷治癒剤を提供する。 【構成】 創傷治癒剤に、有効成分としてトロンボモジ
ュリン様蛋白質を含有させる。あるいはトロンボモジュ
リン様蛋白質に加えてヒト細胞成長因子を含有させる。
新しい細胞成長因子を有効成分として含有する、治療効
果や安全性の高い創傷治癒剤を提供する。 【構成】 創傷治癒剤に、有効成分としてトロンボモジ
ュリン様蛋白質を含有させる。あるいはトロンボモジュ
リン様蛋白質に加えてヒト細胞成長因子を含有させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトロンボモジュリン（以
下、ＴＭと略す。）様蛋白質を含有することを特徴とす
る創傷治癒剤およびＴＭ様蛋白質とヒト成長因子とを含
有することを特徴とする創傷治癒剤に関する。
下、ＴＭと略す。）様蛋白質を含有することを特徴とす
る創傷治癒剤およびＴＭ様蛋白質とヒト成長因子とを含
有することを特徴とする創傷治癒剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】創傷治癒機構は皮膚、結合および支持組
織において類似している。ここでの組織とは、皮膚、
骨、軟骨のみならず、筋肉および器官を包み込むコラー
ゲン基質からなる支持筋膜をも含むものである。
織において類似している。ここでの組織とは、皮膚、
骨、軟骨のみならず、筋肉および器官を包み込むコラー
ゲン基質からなる支持筋膜をも含むものである。
【０００３】創傷部位における治癒プロセスは、普通い
くつかのグループの特殊な細胞あるいは蛋白質が関与し
ている複雑な生物学的機構によって起こるが、成長因子
が必須であることは良く知られている。成長因子は創傷
領域内に放出され、創傷内に移動し、そこで因子は角質
細胞および繊維芽細胞の増殖あるいは成長を刺激し、脈
管形成を開始し、基質形成および創傷領域の再造形を行
う［テンダイクら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，７９
３−７９８，１９８９］。
くつかのグループの特殊な細胞あるいは蛋白質が関与し
ている複雑な生物学的機構によって起こるが、成長因子
が必須であることは良く知られている。成長因子は創傷
領域内に放出され、創傷内に移動し、そこで因子は角質
細胞および繊維芽細胞の増殖あるいは成長を刺激し、脈
管形成を開始し、基質形成および創傷領域の再造形を行
う［テンダイクら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，７９
３−７９８，１９８９］。
【０００４】なお、この際、繊維芽細胞は新たなコラー
ゲンを合成し、放出する細胞としても重要である。繊維
芽細胞によって生成される他の蛋白質は基質に寄与す
る。このような蛋白質の一つであるフィブロネクチンは
主要な細胞を基盤となる基質に結合することを促進する
重要な物質であり、創傷修復中にその合成が強化され
る。
ゲンを合成し、放出する細胞としても重要である。繊維
芽細胞によって生成される他の蛋白質は基質に寄与す
る。このような蛋白質の一つであるフィブロネクチンは
主要な細胞を基盤となる基質に結合することを促進する
重要な物質であり、創傷修復中にその合成が強化され
る。
【０００５】このように、生体の損傷部では成長因子が
タイムリーに放出され、単独でまたは共同して細胞の遊
走・増殖・分化を進めていく。創傷治癒に関与する成長
因子として、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）、インスリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）な
どが良く知られている。ＥＧＦは繊維芽細胞、血管内皮
細胞、上皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、上皮細
胞の遊走を促進し、組織修復過程においては上皮の再生
に中心的な役割を果たしている。ＦＧＦは繊維芽細胞、
血管平滑筋細胞、血管内皮細胞の増殖あるいは成長を促
すほか、血管内皮細胞の遊走を促進し、血管再生に中心
的な役割を果たしている。ＩＧＦはＰＤＧＦと共同して
作用し、繊維芽細胞の増殖あるいは成長や上皮細胞の正
常な分化増殖を促進する。現在、これらの因子につい
て、それぞれ臨床応用研究が進められているが、創傷治
癒剤としての効果は必ずしも十分とは言えず、より効果
的な成長因子あるいは創傷治癒剤が切望されているのが
現状である。
タイムリーに放出され、単独でまたは共同して細胞の遊
走・増殖・分化を進めていく。創傷治癒に関与する成長
因子として、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）、インスリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）な
どが良く知られている。ＥＧＦは繊維芽細胞、血管内皮
細胞、上皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、上皮細
胞の遊走を促進し、組織修復過程においては上皮の再生
に中心的な役割を果たしている。ＦＧＦは繊維芽細胞、
血管平滑筋細胞、血管内皮細胞の増殖あるいは成長を促
すほか、血管内皮細胞の遊走を促進し、血管再生に中心
的な役割を果たしている。ＩＧＦはＰＤＧＦと共同して
作用し、繊維芽細胞の増殖あるいは成長や上皮細胞の正
常な分化増殖を促進する。現在、これらの因子につい
て、それぞれ臨床応用研究が進められているが、創傷治
癒剤としての効果は必ずしも十分とは言えず、より効果
的な成長因子あるいは創傷治癒剤が切望されているのが
現状である。
【０００６】一方、トロンボモジュリン（ＴＭ）は１９
８１年にエスモンらにより血管内皮細胞表面上に存在す
る抗凝固物質として発見され［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８，２２４９−２２５４、１
９８１］、その後１９８７年に鈴木らによりその全一次
構造が明らかにされた［ＥＭＢＯ Ｊ．６、１８９１−
１８９７，１９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，４３５０
−４３５７，１９８７］糖蛋白質である。ＴＭは、トロ
ンビンと１：１で結合し、トロンビンの凝固促進作用を
抑制するとともにトロンビンによるプロテインＣ活性化
を著しく促進させることにより効率よく凝固系を抑制す
ることから、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、各種
血栓症等の予防や治療に有用であることが示唆されてお
り、近年では、遺伝子組み替え技術を利用して、ＴＭの
アミノ酸配列の部分構造を有する様々なヒトＴＭ様物質
（ＷＯ８８／０５０５３、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，１２０５巻，ｐ１６２−１７０）を用
いて、ＤＩＣ治療薬としての臨床応用が試みられつつあ
る。
８１年にエスモンらにより血管内皮細胞表面上に存在す
る抗凝固物質として発見され［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８，２２４９−２２５４、１
９８１］、その後１９８７年に鈴木らによりその全一次
構造が明らかにされた［ＥＭＢＯ Ｊ．６、１８９１−
１８９７，１９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，４３５０
−４３５７，１９８７］糖蛋白質である。ＴＭは、トロ
ンビンと１：１で結合し、トロンビンの凝固促進作用を
抑制するとともにトロンビンによるプロテインＣ活性化
を著しく促進させることにより効率よく凝固系を抑制す
ることから、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、各種
血栓症等の予防や治療に有用であることが示唆されてお
り、近年では、遺伝子組み替え技術を利用して、ＴＭの
アミノ酸配列の部分構造を有する様々なヒトＴＭ様物質
（ＷＯ８８／０５０５３、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，１２０５巻，ｐ１６２−１７０）を用
いて、ＤＩＣ治療薬としての臨床応用が試みられつつあ
る。
【０００７】このようにＴＭは広く凝固線溶系に作用す
る分子であると考えられているが、他方、細胞機能に及
ぼす影響についてはほとんど知られていない。
る分子であると考えられているが、他方、細胞機能に及
ぼす影響についてはほとんど知られていない。
【０００８】今田らは、マウステトラカルシノーマＦ９
細胞をレチノイン酸あるいはサイクリックＡＭＰ（ｃＡ
ＭＰ）で内胚葉系細胞に分化させると、マウスＴＭと同
じ機能を有し、また、遺伝子クローニングの結果マウス
ＴＭとまったく同一であることが明かとなったフェトモ
ジュリン（ＦＭ）が内胚葉系細胞に発現されること、さ
らに、ＴＭ／ＦＭが血管内のみならず、組織液と直接接
することのない組織、あるいはまた、細胞間の相互作用
の場、たとえば、肺胞、神経上皮、心房、洞結節、およ
び胚発生の中期から後期にかけて心臓のペースメーカー
などに一時的に発現されることを報告した［Ｄｅｖ．Ｂ
ｉｏｌ．１４０，１１３−１２２，１９９０］。
細胞をレチノイン酸あるいはサイクリックＡＭＰ（ｃＡ
ＭＰ）で内胚葉系細胞に分化させると、マウスＴＭと同
じ機能を有し、また、遺伝子クローニングの結果マウス
ＴＭとまったく同一であることが明かとなったフェトモ
ジュリン（ＦＭ）が内胚葉系細胞に発現されること、さ
らに、ＴＭ／ＦＭが血管内のみならず、組織液と直接接
することのない組織、あるいはまた、細胞間の相互作用
の場、たとえば、肺胞、神経上皮、心房、洞結節、およ
び胚発生の中期から後期にかけて心臓のペースメーカー
などに一時的に発現されることを報告した［Ｄｅｖ．Ｂ
ｉｏｌ．１４０，１１３−１２２，１９９０］。
【０００９】以上のような報告が見られるが、ＴＭが細
胞に対して直接成長促進作用を有することを記載した報
告は知られていない。
胞に対して直接成長促進作用を有することを記載した報
告は知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】創傷に対し、その本質
的治療薬となりうる新しい細胞成長因子を有効成分とし
て含有する、より有効で安全性の高い創傷治癒剤を提供
することが本発明の課題である。
的治療薬となりうる新しい細胞成長因子を有効成分とし
て含有する、より有効で安全性の高い創傷治癒剤を提供
することが本発明の課題である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＴＭの各種
細胞に対する成長促進効果に関する研究を行っている途
上、ＴＭが抗凝固作用を示す濃度に比し、はるかに低濃
度において、スイス３Ｔ３細胞に直接作用しその成長お
よび増殖を促進することを見いだし、さらには他の成長
因子とともに用いると一層高い活性を示すと言う事実を
見いだし、さらに鋭意研究を重ねて本発明を完成した。
細胞に対する成長促進効果に関する研究を行っている途
上、ＴＭが抗凝固作用を示す濃度に比し、はるかに低濃
度において、スイス３Ｔ３細胞に直接作用しその成長お
よび増殖を促進することを見いだし、さらには他の成長
因子とともに用いると一層高い活性を示すと言う事実を
見いだし、さらに鋭意研究を重ねて本発明を完成した。
【００１２】本発明の第１の態様は、トロンボモジュリ
ン様蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする
創傷治癒剤である。トロンボモジュリン様蛋白質は、以
下のアミノ酸配列１を有することが好ましい。 （アミノ酸配列１） 1 10 Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly 11 20 Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly 21 30 Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly 31 40 Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala 41 50 Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr 51 60 Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu 61 70 Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp 71 80 Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu 81 90 Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His 91 100 Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu 101 110 Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val 111 120 Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys 121 130 Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu 131 140 Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg 141 150 Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu 151 160 Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala 161 170 Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro 171 180 His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr 181 190 Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr 191 200 Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr 201 210 Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp 211 220 Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 221 230 Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr 231 240 Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala 241 250 Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp 251 253 Ser Gly Lys 本発明の第２の態様は、トロンボモジュリン様蛋白質と
ヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする創傷治
癒剤である。ここで、トロンボモジュリン様蛋白質とし
ては、上述の第１の態様と同様に、上述のアミノ酸配列
１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子
は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又は
ヒトｂ−ＦＧＦであることが好ましい。
ン様蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする
創傷治癒剤である。トロンボモジュリン様蛋白質は、以
下のアミノ酸配列１を有することが好ましい。 （アミノ酸配列１） 1 10 Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly 11 20 Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly 21 30 Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly 31 40 Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala 41 50 Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr 51 60 Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu 61 70 Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp 71 80 Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu 81 90 Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His 91 100 Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu 101 110 Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val 111 120 Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys 121 130 Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu 131 140 Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg 141 150 Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu 151 160 Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala 161 170 Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro 171 180 His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr 181 190 Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr 191 200 Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr 201 210 Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp 211 220 Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 221 230 Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr 231 240 Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala 241 250 Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp 251 253 Ser Gly Lys 本発明の第２の態様は、トロンボモジュリン様蛋白質と
ヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする創傷治
癒剤である。ここで、トロンボモジュリン様蛋白質とし
ては、上述の第１の態様と同様に、上述のアミノ酸配列
１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子
は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又は
ヒトｂ−ＦＧＦであることが好ましい。
【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】本明細書において、「トロンボモジュリン
（ＴＭ）様蛋白質」の語は、ＴＭ、ＴＭの生物学的もし
くは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列を有す
るペプチド又はそれらの類似物を意味する。また、「創
傷治癒剤」の語は、種々の創傷、潰瘍、皮膚障害等のた
めの治癒剤を広く包含する。
（ＴＭ）様蛋白質」の語は、ＴＭ、ＴＭの生物学的もし
くは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列を有す
るペプチド又はそれらの類似物を意味する。また、「創
傷治癒剤」の語は、種々の創傷、潰瘍、皮膚障害等のた
めの治癒剤を広く包含する。
【００１５】本発明の創傷治癒剤の有効成分であるＴＭ
様蛋白質は、遺伝子組み替え技術で生産することができ
る。ヒトの治療剤に用いるためには、ヒトのアミノ酸配
列を有するものが好ましい。具体的には、遺伝子工学的
手法により製造され、鈴木らにより示されたヒトＴＭの
一次構造［ＥＭＢＯ．Ｊ．６，１８９１−１８９７、１
９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，４３５０−４３５７，
１９８７］を有するポリペプチドおよびその生物学的も
しくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列から
なるフラグメントが挙げられる。
様蛋白質は、遺伝子組み替え技術で生産することができ
る。ヒトの治療剤に用いるためには、ヒトのアミノ酸配
列を有するものが好ましい。具体的には、遺伝子工学的
手法により製造され、鈴木らにより示されたヒトＴＭの
一次構造［ＥＭＢＯ．Ｊ．６，１８９１−１８９７、１
９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，４３５０−４３５７，
１９８７］を有するポリペプチドおよびその生物学的も
しくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列から
なるフラグメントが挙げられる。
【００１６】鈴木らによれば、完全長のヒトＴＭは５５
７アミノ酸残基により構成され、それは、Ｎ末端より順
に、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の５つのドメイ
ン構造から構成される。また、その抗凝固活性は６つの
上皮成長因子（ＥＧＦ）様構造の繰り返しから成るＤ２
ドメインの、４番目から６番目のドメイン（ＥＧＦ４５
６）に限局することが知られている。本発明の治癒剤に
使用し得るフラグメントの例としては、鈴木らにより開
示されたＥＧＦ４５６ペプチド構造を包含する種々のペ
プチドフラグメント［特開平１−６２１９］などが挙げ
られる。さらに具体的には、ヒトＴＭのＮ末端より２１
４−４６６番目のＤ２ドメインのアミノ酸残基により構
成されるペプチド（以後ＴＭＥ1-6 とする）、２２７−
４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド
（Ｄ２）、１−４９７番目のアミノ酸残基により構成さ
れるペプチド（Ｄ１２３）、１−４６２番目のアミノ酸
残基により構成されるペプチド（Ｄ１２）、２２７−４
９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ
２３）、１−５５７番目のアミノ酸残基により構成され
るペプチド（Ｄ１２３４５）、３４５−４６２番目のア
ミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｅ４５６）など
が好ましい。そして、これらのフラグメントの内、ＴＭ
の第２番目のドメイン、すなわちＥＧＦ様構造ドメイン
の１番目から６番目までの構造を包含する、２１４−４
６６番目のアミノ酸残基により構成されるフラグメント
（ＴＭＥ1-6 ）、即ち、前述のアミノ酸配列１を有する
ものが最も好ましい。
７アミノ酸残基により構成され、それは、Ｎ末端より順
に、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の５つのドメイ
ン構造から構成される。また、その抗凝固活性は６つの
上皮成長因子（ＥＧＦ）様構造の繰り返しから成るＤ２
ドメインの、４番目から６番目のドメイン（ＥＧＦ４５
６）に限局することが知られている。本発明の治癒剤に
使用し得るフラグメントの例としては、鈴木らにより開
示されたＥＧＦ４５６ペプチド構造を包含する種々のペ
プチドフラグメント［特開平１−６２１９］などが挙げ
られる。さらに具体的には、ヒトＴＭのＮ末端より２１
４−４６６番目のＤ２ドメインのアミノ酸残基により構
成されるペプチド（以後ＴＭＥ1-6 とする）、２２７−
４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド
（Ｄ２）、１−４９７番目のアミノ酸残基により構成さ
れるペプチド（Ｄ１２３）、１−４６２番目のアミノ酸
残基により構成されるペプチド（Ｄ１２）、２２７−４
９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ
２３）、１−５５７番目のアミノ酸残基により構成され
るペプチド（Ｄ１２３４５）、３４５−４６２番目のア
ミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｅ４５６）など
が好ましい。そして、これらのフラグメントの内、ＴＭ
の第２番目のドメイン、すなわちＥＧＦ様構造ドメイン
の１番目から６番目までの構造を包含する、２１４−４
６６番目のアミノ酸残基により構成されるフラグメント
（ＴＭＥ1-6 ）、即ち、前述のアミノ酸配列１を有する
ものが最も好ましい。
【００１７】なお、上記フラグメントは遺伝子組み替え
技術を用いて、ＴＭ又は上記ペプチドの構造の一部を欠
失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修
飾した改変体およびＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ
−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失さ
せた類似物などでも良い。具体的には、上記ポリペプチ
ドの構成アミノ酸が一部欠如しているか［特開平２−２
５５６９９、ＥＰ０４７４２７３Ａ２］、他のアミノ酸
に置換されたもの［ＷＯ９１／１５５１４、ＷＯ９３／
１５５７５５、特開平５−３１０７８７が挙げられる。
また、メチオニンを他のアミノ酸に置換することによっ
て酸化を防止したもの［ＷＯ９１／１５５１４］、ある
いはアミノ酸配列を修飾することによって蛋白分解酵素
による分解を防止したもの［ＷＯ９３／１５７５５］が
挙げられる。また、コンドロイチン及び／又はコンドロ
イチン硫酸を含む糖鎖を有するもの［ＷＯ９１／０４２
７６、ＷＯ９１／０５８０３、ＥＰ０４１２８４１Ａ
１］、ウシトロンボモジュリン由来の酸性アミノ酸配列
を含むＯ−グリコシド糖鎖結合部位を付加し、コンドロ
イチン硫酸糖鎖を結合させたもの［ＥＰ０４８８３１７
Ａ２］、あるいは、Ｏ−グリコシル化部位領域の糖鎖を
修飾あるいはＯ−グリコシル化部位領域を欠失させたも
の［ＷＯ９２／０３１４９］、コンドロイチン及び／又
はコンドロイチン硫酸を含まないもの［特開平４−２１
０７００］などが挙げられる。
技術を用いて、ＴＭ又は上記ペプチドの構造の一部を欠
失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修
飾した改変体およびＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ
−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失さ
せた類似物などでも良い。具体的には、上記ポリペプチ
ドの構成アミノ酸が一部欠如しているか［特開平２−２
５５６９９、ＥＰ０４７４２７３Ａ２］、他のアミノ酸
に置換されたもの［ＷＯ９１／１５５１４、ＷＯ９３／
１５５７５５、特開平５−３１０７８７が挙げられる。
また、メチオニンを他のアミノ酸に置換することによっ
て酸化を防止したもの［ＷＯ９１／１５５１４］、ある
いはアミノ酸配列を修飾することによって蛋白分解酵素
による分解を防止したもの［ＷＯ９３／１５７５５］が
挙げられる。また、コンドロイチン及び／又はコンドロ
イチン硫酸を含む糖鎖を有するもの［ＷＯ９１／０４２
７６、ＷＯ９１／０５８０３、ＥＰ０４１２８４１Ａ
１］、ウシトロンボモジュリン由来の酸性アミノ酸配列
を含むＯ−グリコシド糖鎖結合部位を付加し、コンドロ
イチン硫酸糖鎖を結合させたもの［ＥＰ０４８８３１７
Ａ２］、あるいは、Ｏ−グリコシル化部位領域の糖鎖を
修飾あるいはＯ−グリコシル化部位領域を欠失させたも
の［ＷＯ９２／０３１４９］、コンドロイチン及び／又
はコンドロイチン硫酸を含まないもの［特開平４−２１
０７００］などが挙げられる。
【００１８】また、本発明の製剤の有効成分としてのヒ
トＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−
ＦＧＦは、それぞれ、ＩＧＦ、インスリン、ＥＧＦ，Ｆ
ＧＦ様活性を有する物質であればいずれでも良い。例え
ば、動物の体内や動物細胞で産生される天然由来の物
質、遺伝子組み替え技術で生産される物質、また遺伝子
組み替え技術で、これらの構造の一部を欠失させたり、
アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体
および糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などが挙げ
られる。
トＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−
ＦＧＦは、それぞれ、ＩＧＦ、インスリン、ＥＧＦ，Ｆ
ＧＦ様活性を有する物質であればいずれでも良い。例え
ば、動物の体内や動物細胞で産生される天然由来の物
質、遺伝子組み替え技術で生産される物質、また遺伝子
組み替え技術で、これらの構造の一部を欠失させたり、
アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体
および糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などが挙げ
られる。
【００１９】本発明の第２の態様は、以上のようなＴＭ
様蛋白質の他にヒト細胞成長因子も有効成分として含有
するものである。これより、ＴＭ様蛋白質又はヒト細胞
成長因子単独から治癒剤を構成した場合に対して、大き
な治癒効果を得ることが可能となる。
様蛋白質の他にヒト細胞成長因子も有効成分として含有
するものである。これより、ＴＭ様蛋白質又はヒト細胞
成長因子単独から治癒剤を構成した場合に対して、大き
な治癒効果を得ることが可能となる。
【００２０】本発明の第２の態様において、ヒト細胞成
長因子としては、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒ
トＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦの中から選ばれる１種を使用
することが好ましい。また、このようなヒト細胞成長因
子としては、公知のいかなる製剤学的製造法により得ら
れたものでも使用することができる。
長因子としては、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒ
トＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦの中から選ばれる１種を使用
することが好ましい。また、このようなヒト細胞成長因
子としては、公知のいかなる製剤学的製造法により得ら
れたものでも使用することができる。
【００２１】本発明の第１の態様及び第２の態様のいず
れの治癒剤も種々の剤型にすることができ、その場合に
種々の添加剤等の成分を配合することができる。例え
ば、ＴＭ様蛋白質は、薬剤として一般的に用いられる適
当な担体または、媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植
物油（例、ゴマ油、オリーブ油）、鉱油（例、ワセリ
ン、パラフィン）、高級アルコール（例、セタノール、
ステアリルアルコール）、高級脂肪酸（例、ステアリン
酸、パルミチン酸）、無害性有機溶媒（例、エタノー
ル）等、さらには必要に応じて賦形剤（例、マンニトー
ル、カルボキシメチルセルロース）、着色剤、乳化剤
（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴ
ム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油系界面活性剤、ポリエチレングリコール系界面活性
剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリ
ウム）、安定化剤（例、糖、糖アルコール、アルブミ
ン）または保存剤（例、ベンジルアルコール、パラベ
ン）、保湿剤（例、尿素、コレステロール）、酸化防止
剤（例、トコフェロール）等と適宜組み合わせて、生体
に効果的に投与するのに適した注射剤、経皮吸収剤、点
眼剤、経鼻吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは
注射剤もしくは経皮吸収剤に調製することが出来る。例
えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水
剤、あるいは浸透圧ポンプに封入した形等で提供でき
る。また、経皮吸収剤としては、液剤、軟膏剤、クリー
ム剤、ゲル剤、バップ剤、人工皮膚類等で提供できる。
れの治癒剤も種々の剤型にすることができ、その場合に
種々の添加剤等の成分を配合することができる。例え
ば、ＴＭ様蛋白質は、薬剤として一般的に用いられる適
当な担体または、媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植
物油（例、ゴマ油、オリーブ油）、鉱油（例、ワセリ
ン、パラフィン）、高級アルコール（例、セタノール、
ステアリルアルコール）、高級脂肪酸（例、ステアリン
酸、パルミチン酸）、無害性有機溶媒（例、エタノー
ル）等、さらには必要に応じて賦形剤（例、マンニトー
ル、カルボキシメチルセルロース）、着色剤、乳化剤
（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴ
ム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油系界面活性剤、ポリエチレングリコール系界面活性
剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリ
ウム）、安定化剤（例、糖、糖アルコール、アルブミ
ン）または保存剤（例、ベンジルアルコール、パラベ
ン）、保湿剤（例、尿素、コレステロール）、酸化防止
剤（例、トコフェロール）等と適宜組み合わせて、生体
に効果的に投与するのに適した注射剤、経皮吸収剤、点
眼剤、経鼻吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは
注射剤もしくは経皮吸収剤に調製することが出来る。例
えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水
剤、あるいは浸透圧ポンプに封入した形等で提供でき
る。また、経皮吸収剤としては、液剤、軟膏剤、クリー
ム剤、ゲル剤、バップ剤、人工皮膚類等で提供できる。
【００２２】本発明の創傷治癒剤の投与方法としては、
例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与
等の方法によって、ＴＭ蛋白質量として一日約０．０１
〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１
００μｇ／ｋｇとなる量を投与したり、浸透圧ポンプ等
に封入し生体に留置することにより連続的に投与するこ
とが出来る。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−
１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ
−ＦＧＦを有効成分として含有させた製剤は、上記のＴ
Ｍ様蛋白質投与と同時に、各因子をそれぞれ、一日約
０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、
０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与することが好
ましい。
例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与
等の方法によって、ＴＭ蛋白質量として一日約０．０１
〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１
００μｇ／ｋｇとなる量を投与したり、浸透圧ポンプ等
に封入し生体に留置することにより連続的に投与するこ
とが出来る。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−
１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ
−ＦＧＦを有効成分として含有させた製剤は、上記のＴ
Ｍ様蛋白質投与と同時に、各因子をそれぞれ、一日約
０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、
０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与することが好
ましい。
【００２３】また、経皮吸収剤として、熱傷、創傷部位
に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤等の
方法により局所適用することにより、例えば、ＴＭ様蛋
白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに
好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で適用
することができる。なお、ヒトＴＭ様蛋白質に加えてヒ
トＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦま
たはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤は、
上記のＴＭ様蛋白質適用と同時に、各因子をそれぞれ、
一日約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましく
は、０．１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を適用する。
に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤等の
方法により局所適用することにより、例えば、ＴＭ様蛋
白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに
好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で適用
することができる。なお、ヒトＴＭ様蛋白質に加えてヒ
トＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦま
たはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤は、
上記のＴＭ様蛋白質適用と同時に、各因子をそれぞれ、
一日約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましく
は、０．１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を適用する。
【００２４】さらに、熱傷のときに用いる培養皮膚移植
等に際しては、細胞の培養液中に、例えば、ヒトＴＭ様
蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さら
に好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添
加することもできる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒト
ＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまた
はヒトｂ−ＦＧＦをＴＭ様蛋白質添加と同時に、各因子
をそれぞれ、約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに
好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加す
ることもできる。
等に際しては、細胞の培養液中に、例えば、ヒトＴＭ様
蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さら
に好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添
加することもできる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒト
ＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまた
はヒトｂ−ＦＧＦをＴＭ様蛋白質添加と同時に、各因子
をそれぞれ、約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに
好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加す
ることもできる。
【００２５】
【作用】本発明の創傷治癒剤は、有効成分として、繊維
芽細胞などの細胞の成長および増殖促進効果を発揮する
ＴＭ様蛋白質、あるいはＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因
子の双方を含有するので、種々の創傷、たとえば、角膜
潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創傷
のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深
部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮
膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚
創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍などの治療
に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚
発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
芽細胞などの細胞の成長および増殖促進効果を発揮する
ＴＭ様蛋白質、あるいはＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因
子の双方を含有するので、種々の創傷、たとえば、角膜
潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創傷
のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深
部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮
膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚
創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍などの治療
に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚
発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
【００２６】また、本発明の創傷治癒剤は、繊維芽細胞
以外の、たとえば血管内皮細胞等に対する成長促進作用
も有するので、血管内皮細胞障害を伴う炎症性疾患、た
とえば、動脈硬化症あるいは糖尿病に対する治療効果も
有する。
以外の、たとえば血管内皮細胞等に対する成長促進作用
も有するので、血管内皮細胞障害を伴う炎症性疾患、た
とえば、動脈硬化症あるいは糖尿病に対する治療効果も
有する。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるもので
はない。
る。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００２８】実施例１（ヒトＴＭの取得例：ＴＭＥ1-6
） 名和らの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１，７２９−７３７，
１９９０］に準じてｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわ
ち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフ
ラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、
制限酵素処理を行いｐＲＳ７ＴＭを調製した。さらに、
ｐＲＳ７ＴＭのＴＭシグナルシーケンスをインターフェ
ロンγシグナルシ−ケンスで置き換え、さらにＮ末端シ
ーケンスを欠失させた。すなわち、Ｓａｌ−ＢｓｔＮ１
制限酵素処理により８０ｂｐの新しいシグナルシーケン
スを含むフラグメントを、ＰｓｔI 制限酵素処理により
１番目のＥＧＦドメインをコードしているフラグメント
を取得した後、リンカーと結合させｐＴＭＰ２２を作製
した。このｐＴＭＰ２２をＨｉｎｄIII −ＭｌｕI 制限
酵素処理し、生じたフラグメントをｐＴＭｓ０７のＨｉ
ｎｄIII −ＭｌｕI フラグメントと置換しｐＰ７ＴＭを
作製した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｒｉｃｈ領域を欠失させる
ためにｐＴＭｓ０７をＨｉｎ ｃII制限酵素処理してフ
ラグメントを単離し、さらにＨｐａ II制限酵素処理を
行うことにより６番目のＥＧＦドメインをコードしてい
る７０ｂｐのフラグメントを取得した。このフラグメン
トのＬｙｓ−４６６の後にストップコドンを含むリンカ
ーを結合させた後、Ａｐａ I −Ｘｂａ I 制限酵素処
理を行い、生じたフラグメントをｐＰ７ＴＭのＡｐａ
I −Ｘｂａ I 部位に組み込みｐＰＧ３ＴＭを作製し
た。
） 名和らの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１，７２９−７３７，
１９９０］に準じてｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわ
ち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフ
ラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、
制限酵素処理を行いｐＲＳ７ＴＭを調製した。さらに、
ｐＲＳ７ＴＭのＴＭシグナルシーケンスをインターフェ
ロンγシグナルシ−ケンスで置き換え、さらにＮ末端シ
ーケンスを欠失させた。すなわち、Ｓａｌ−ＢｓｔＮ１
制限酵素処理により８０ｂｐの新しいシグナルシーケン
スを含むフラグメントを、ＰｓｔI 制限酵素処理により
１番目のＥＧＦドメインをコードしているフラグメント
を取得した後、リンカーと結合させｐＴＭＰ２２を作製
した。このｐＴＭＰ２２をＨｉｎｄIII −ＭｌｕI 制限
酵素処理し、生じたフラグメントをｐＴＭｓ０７のＨｉ
ｎｄIII −ＭｌｕI フラグメントと置換しｐＰ７ＴＭを
作製した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｒｉｃｈ領域を欠失させる
ためにｐＴＭｓ０７をＨｉｎ ｃII制限酵素処理してフ
ラグメントを単離し、さらにＨｐａ II制限酵素処理を
行うことにより６番目のＥＧＦドメインをコードしてい
る７０ｂｐのフラグメントを取得した。このフラグメン
トのＬｙｓ−４６６の後にストップコドンを含むリンカ
ーを結合させた後、Ａｐａ I −Ｘｂａ I 制限酵素処
理を行い、生じたフラグメントをｐＰ７ＴＭのＡｐａ
I −Ｘｂａ I 部位に組み込みｐＰＧ３ＴＭを作製し
た。
【００２９】このプラスミド（ｐＰＧ３ＴＭ）を、常法
に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−
Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞をＧｅ
ｎｅｔｉｃｉｎを含む培地でさらに２〜３週間培養する
ことにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロ
ニーをさらに培養した。この培養上精を抗ＴＭモノクロ
−ナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ｒＴＭＥ1-
6 を得た。
に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−
Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞をＧｅ
ｎｅｔｉｃｉｎを含む培地でさらに２〜３週間培養する
ことにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロ
ニーをさらに培養した。この培養上精を抗ＴＭモノクロ
−ナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ｒＴＭＥ1-
6 を得た。
【００３０】実施例２（ヒトＴＭによる繊維芽細胞に対
する効果１：増殖促進効果） スイス３Ｔ３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）を１０％牛胎児血清（Ｃ
Ｓ：ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社）に懸濁
し、３５ｍｍの培養プレートに１ウェルあたり１×１０
4 個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉ
ｒの条件で培養した。２４時間後に５０ｎｇ／ｍｌのヒ
トＴＭを含む種々の濃度のＣＳを含むＤＭＥＭ培地
（０．１〜１０％ＳＣ）に培地交換し、その後は２日間
に一度（図１の矢印参照）培地交換した。細胞は０．２
５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理し、細
胞数を測定した。なお、リコンビナントヒトＴＭは、実
施例１に記載した方法に従い、ヒトＴＭのＥＧＦ１−６
ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニ
ーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯーＫ１細胞）で発現
後、均一に精製したものを使用した。
する効果１：増殖促進効果） スイス３Ｔ３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）を１０％牛胎児血清（Ｃ
Ｓ：ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社）に懸濁
し、３５ｍｍの培養プレートに１ウェルあたり１×１０
4 個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉ
ｒの条件で培養した。２４時間後に５０ｎｇ／ｍｌのヒ
トＴＭを含む種々の濃度のＣＳを含むＤＭＥＭ培地
（０．１〜１０％ＳＣ）に培地交換し、その後は２日間
に一度（図１の矢印参照）培地交換した。細胞は０．２
５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理し、細
胞数を測定した。なお、リコンビナントヒトＴＭは、実
施例１に記載した方法に従い、ヒトＴＭのＥＧＦ１−６
ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニ
ーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯーＫ１細胞）で発現
後、均一に精製したものを使用した。
【００３１】この結果を図１に示す。図１から明らかな
ように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）は０．１％あるいは１
％血清の存在下で細胞増殖作用を示した。
ように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）は０．１％あるいは１
％血清の存在下で細胞増殖作用を示した。
【００３２】一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖促進能
は、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織の成長を起こし得る細胞分
化と直接関連しており、強いｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖促進
能を有する薬剤がｉｎ ｖｉｖｏにおいても成長刺激効
果を有することは成長因子の研究においては良く知られ
ているところである。したがって、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-
6 ）は、生体でも効果を有することがわかる。
は、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織の成長を起こし得る細胞分
化と直接関連しており、強いｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖促進
能を有する薬剤がｉｎ ｖｉｖｏにおいても成長刺激効
果を有することは成長因子の研究においては良く知られ
ているところである。したがって、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-
6 ）は、生体でも効果を有することがわかる。
【００３３】実験例３（ヒトＴＭによる繊維芽細胞に対
する効果２：ＤＮＡ合成促進効果） スイス３Ｔ３細胞を１０％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤ
ＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルのマイクロタイタープ
レートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの
条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、
培養液を０．１％牛胎児血清（ＣＳ）を含む（又は含ま
ない）ＤＭＥＭで置換し４８時間培養することにより、
細胞を完全に非活動性とさせた。次に、表１及び図２に
示すように、種々の濃度のヒトＴＭおよび種々の濃度の
成長因子を添加し、３７℃、２０時間培養した。その後
3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え、さらに８
時間培養した。ウェルを氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で
洗浄して、過剰の 3Ｈ−チミジンを除いた後、細胞を
０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理
してプレートより剥離させ、グラスファイバーフィルタ
ー上に集めた。細胞を氷冷したトリクロル酢酸（ＴＣ
Ａ）で洗浄後、フィルター上に残存する放射能を液体シ
ンチレーションカウンターにより測定した。なお、リコ
ンビナントヒトＴＭは、実施例１に従い、ヒトＴＭのＥ
ＧＦ１−６ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）
をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯーＫ１細
胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。ＩＧＦ
−１およびｂＦＧＦはインタージェン社、インスリンは
和光純薬、ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー
社よりそれぞれ購入して使用した。
する効果２：ＤＮＡ合成促進効果） スイス３Ｔ３細胞を１０％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤ
ＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルのマイクロタイタープ
レートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの
条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、
培養液を０．１％牛胎児血清（ＣＳ）を含む（又は含ま
ない）ＤＭＥＭで置換し４８時間培養することにより、
細胞を完全に非活動性とさせた。次に、表１及び図２に
示すように、種々の濃度のヒトＴＭおよび種々の濃度の
成長因子を添加し、３７℃、２０時間培養した。その後
3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え、さらに８
時間培養した。ウェルを氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で
洗浄して、過剰の 3Ｈ−チミジンを除いた後、細胞を
０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理
してプレートより剥離させ、グラスファイバーフィルタ
ー上に集めた。細胞を氷冷したトリクロル酢酸（ＴＣ
Ａ）で洗浄後、フィルター上に残存する放射能を液体シ
ンチレーションカウンターにより測定した。なお、リコ
ンビナントヒトＴＭは、実施例１に従い、ヒトＴＭのＥ
ＧＦ１−６ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）
をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯーＫ１細
胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。ＩＧＦ
−１およびｂＦＧＦはインタージェン社、インスリンは
和光純薬、ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー
社よりそれぞれ購入して使用した。
【００３４】結果を図２および表１に示す。
【００３５】図２から明らかなように、ヒトＴＭ（ＴＭ
Ｅ1-6 ）は血清の存在下あるいは非存在下においてＤＮ
Ａ合成促進作用を示した。
Ｅ1-6 ）は血清の存在下あるいは非存在下においてＤＮ
Ａ合成促進作用を示した。
【００３６】
【表１】 （注） *；ｐ＜０．０５ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝
５） **；ｐ＜０．０１ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝５） 表１から明らかなように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1ー6 ）は単
独でＤＮＡ合成促進作用を示すのみならず、細胞成長因
子として知られている上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）や塩
基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）とは相加的な作
用を示し、インシュリンあるいはインシュリン様細胞成
長因子−１（ＩＧＦ−１）とは相乗的なＤＮＡ合成促進
作用を示した。
５） **；ｐ＜０．０１ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝５） 表１から明らかなように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1ー6 ）は単
独でＤＮＡ合成促進作用を示すのみならず、細胞成長因
子として知られている上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）や塩
基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）とは相加的な作
用を示し、インシュリンあるいはインシュリン様細胞成
長因子−１（ＩＧＦ−１）とは相乗的なＤＮＡ合成促進
作用を示した。
【００３７】実験例４（ヒトＴＭによる繊維芽細胞に対
する効果３：グルコース輸送促進効果） 浜中らの方法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８６、８
３−８９、１９９０］に準じて実施した。すなわち、ス
イス３Ｔ３細胞を１０％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤＭ
ＥＭ培地に懸濁し、２４ウェルのマルチプレートに播種
し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフ
ルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．
５％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤＭＥＭで置換し４８時
間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭ、１０ｎｇ／
ｍｌＥＧＦあるいは１０％ＣＳを添加し、３７℃、６時
間培養した。細胞をＫＲＰ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、
１．４７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4、８．０６ｍＭ Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％ウシ血清
アルブミン、ｐＨ７．４）で一回洗浄した後、０．５ｍ
ｌの同緩衝液で３７℃、３０分間プレインキュベートし
た。その後２−デオキシ−Ｄ−［１−3 Ｈ］グルコース
（０．５μＣｉ／ウェル、１０μＭ）を加え、１０分間
培養した。ウェルを２５ｍＭグルコースを含む氷冷リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄して過剰の放射能を除い
た後、０．１％ＳＤＳ処理して細胞破砕液を得、その放
射能を液体シンチレーションカウンターにより測定し
た。なお、リコンビナントヒトＴＭは、実施例に従い、
ヒトＴＭのＥＧＦ１−６ドメインを包含するペプチド
（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（Ｃ
ＨＯーＫ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用
した。ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社よ
り購入して使用した。結果を表２に示す。
する効果３：グルコース輸送促進効果） 浜中らの方法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８６、８
３−８９、１９９０］に準じて実施した。すなわち、ス
イス３Ｔ３細胞を１０％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤＭ
ＥＭ培地に懸濁し、２４ウェルのマルチプレートに播種
し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフ
ルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．
５％牛胎児血清（ＣＳ）を含むＤＭＥＭで置換し４８時
間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭ、１０ｎｇ／
ｍｌＥＧＦあるいは１０％ＣＳを添加し、３７℃、６時
間培養した。細胞をＫＲＰ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、
１．４７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4、８．０６ｍＭ Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％ウシ血清
アルブミン、ｐＨ７．４）で一回洗浄した後、０．５ｍ
ｌの同緩衝液で３７℃、３０分間プレインキュベートし
た。その後２−デオキシ−Ｄ−［１−3 Ｈ］グルコース
（０．５μＣｉ／ウェル、１０μＭ）を加え、１０分間
培養した。ウェルを２５ｍＭグルコースを含む氷冷リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄して過剰の放射能を除い
た後、０．１％ＳＤＳ処理して細胞破砕液を得、その放
射能を液体シンチレーションカウンターにより測定し
た。なお、リコンビナントヒトＴＭは、実施例に従い、
ヒトＴＭのＥＧＦ１−６ドメインを包含するペプチド
（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（Ｃ
ＨＯーＫ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用
した。ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社よ
り購入して使用した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】 （注） *；ｐ＜０．０５ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝
５） **；ｐ＜０．０１ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝５） 表２から明らかなように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）は２
−デオキシグルコース取り込みの促進作用を示した。
５） **；ｐ＜０．０１ ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝５） 表２から明らかなように、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）は２
−デオキシグルコース取り込みの促進作用を示した。
【００３９】実施例５（製剤例１） 以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過
したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結
乾燥して注射用製剤を調製した。
したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結
乾燥して注射用製剤を調製した。
【００４０】 ＴＭＥ1-6 ５ｍｇ 精製ゼラチン ５０ｍｇ リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ 塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ マンニトール ２５ｍｇ 。
【００４１】実施例６（製剤例２） 以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を
調製した。
調製した。
【００４２】ＴＭＥ1-6 ０．０１％ 白色ワセリン ９６．８％ 流動パラフィン ３ ％ ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％ 。
【００４３】実施例７（製剤例３） 以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を
調製した。
調製した。
【００４４】 ＴＭＥ1-6 ０．０１％ ヒト成長因子 ０．０１％ 白色ワセリン ９６．８％ 流動パラフィン ３ ％ ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％ 。
【００４５】
【発明の効果】本発明の創傷治癒剤は、組織損傷部位の
細胞、たとえば繊維芽細胞などの細胞の成長あるいは増
殖を促進する効果を発揮するヒトＴＭ様蛋白質あるいは
ヒト成長因子を含有するので、種々の創傷、例えば、角
膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創
傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、
深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮
膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚
創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍などの治療
に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚
発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。また、
本発明の製剤は、繊維芽細胞以外の、例えば血管内皮細
胞等に対する成長促進作用も期待できるので、血管内皮
細胞障害を伴う炎症性疾患、例えば、動脈硬化症あるい
は糖尿病に対する治療効果も期待できる。
細胞、たとえば繊維芽細胞などの細胞の成長あるいは増
殖を促進する効果を発揮するヒトＴＭ様蛋白質あるいは
ヒト成長因子を含有するので、種々の創傷、例えば、角
膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創
傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、
深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮
膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚
創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍などの治療
に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚
発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。また、
本発明の製剤は、繊維芽細胞以外の、例えば血管内皮細
胞等に対する成長促進作用も期待できるので、血管内皮
細胞障害を伴う炎症性疾患、例えば、動脈硬化症あるい
は糖尿病に対する治療効果も期待できる。
【００４６】また、本発明の製剤は、上記の創傷に対
し、公知の製剤に比較して、より優れた作用を有してお
り、創傷治癒剤として有用である。
し、公知の製剤に比較して、より優れた作用を有してお
り、創傷治癒剤として有用である。
【図１】図１は、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）のスイス３Ｔ
３細胞の増殖に及ぼす影響を示したグラフである。
３細胞の増殖に及ぼす影響を示したグラフである。
【図２】図２は、ヒトＴＭ（ＴＭＥ1-6 ）のスイス３Ｔ
３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフであ
る。
３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフであ
る。
Claims (8)
- 【請求項１】 トロンボモジュリン様蛋白質を有効成分
として含有することを特徴とする創傷治癒剤。 - 【請求項２】 前記トロンボモジュリン様蛋白質が、以
下のアミノ酸配列１を有する請求項１に記載の創傷治癒
剤。 （アミノ酸配列１） 1 10 Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly 11 20 Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly 21 30 Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly 31 40 Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala 41 50 Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr 51 60 Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu 61 70 Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp 71 80 Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu 81 90 Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His 91 100 Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu 101 110 Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val 111 120 Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys 121 130 Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu 131 140 Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg 141 150 Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu 151 160 Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala 161 170 Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro 171 180 His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr 181 190 Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr 191 200 Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr 201 210 Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp 211 220 Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 221 230 Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr 231 240 Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala 241 250 Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp 251 253 Ser Gly Lys - 【請求項３】 トロンボモジュリン様蛋白質とヒト細胞
成長因子とを有効成分として含有することを特徴とする
創傷治癒剤。 - 【請求項４】 前記トロンボモジュリン様蛋白質が、請
求項２記載のアミノ酸配列１を有する請求項３に記載の
創傷治癒剤。 - 【請求項５】 ヒト細胞成長因子がヒトＩＧＦ−１であ
る請求項３又は４に記載の創傷治癒剤。 - 【請求項６】 ヒト細胞成長因子がヒトインスリンであ
る請求項３又は４に記載の創傷治癒剤。 - 【請求項７】 ヒト細胞成長因子がヒトＥＧＦである請
求項３又は４に記載の創傷治癒剤。 - 【請求項８】 ヒト細胞成長因子がヒトｂ−ＦＧＦであ
る請求項３又は４に記載の創傷治癒剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6138097A JPH07316066A (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | 創傷治癒剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6138097A JPH07316066A (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | 創傷治癒剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07316066A true JPH07316066A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=15213886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6138097A Withdrawn JPH07316066A (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | 創傷治癒剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07316066A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006135493A2 (en) | 2005-06-09 | 2006-12-21 | Blue Blood Biotech Corp. | A composition for wound healing and use thereof |
| WO2007036107A1 (fr) * | 2005-09-27 | 2007-04-05 | Genescience Pharmaceuticals Co., Ltd | Formulation à application externe et ses procédés de préparation et utilisations |
| JP4832515B2 (ja) * | 2005-06-09 | 2011-12-07 | ブルー ブラッド バイオテック コーポレーション | 創傷治癒用の組成物及びその使用 |
| US8093211B2 (en) | 2000-07-31 | 2012-01-10 | Bar-Ilan University | Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds |
| US8349793B2 (en) | 2010-01-11 | 2013-01-08 | Heal0r, Ltd. | Method for treatment of inflammatory disease and disorder |
| US8367606B2 (en) | 2005-08-29 | 2013-02-05 | Healor Ltd. | Method and compositions for prevention and treatment of diabetic and aged skin |
-
1994
- 1994-05-26 JP JP6138097A patent/JPH07316066A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8093211B2 (en) | 2000-07-31 | 2012-01-10 | Bar-Ilan University | Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds |
| WO2006135493A2 (en) | 2005-06-09 | 2006-12-21 | Blue Blood Biotech Corp. | A composition for wound healing and use thereof |
| EP1899475A4 (en) * | 2005-06-09 | 2011-06-08 | Chuan-Chi Chiang | COMPOSITION USED IN WOUND HEALING AND USE THEREOF |
| JP4832515B2 (ja) * | 2005-06-09 | 2011-12-07 | ブルー ブラッド バイオテック コーポレーション | 創傷治癒用の組成物及びその使用 |
| US8367606B2 (en) | 2005-08-29 | 2013-02-05 | Healor Ltd. | Method and compositions for prevention and treatment of diabetic and aged skin |
| WO2007036107A1 (fr) * | 2005-09-27 | 2007-04-05 | Genescience Pharmaceuticals Co., Ltd | Formulation à application externe et ses procédés de préparation et utilisations |
| US7858582B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-28 | Genescience Pharmaceuticals Co., Ltd. | Ophthalmic hGM-CSF preparation |
| US8349793B2 (en) | 2010-01-11 | 2013-01-08 | Heal0r, Ltd. | Method for treatment of inflammatory disease and disorder |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050517 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050927 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050929 |