KR100382042B1 - 창상 치료를 위한 βｉｇ-ｈ3 단백질 또는 그의 일부도메인을 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 창상 치료를 위한 βig-h3 단백질 또는 그의 일부 도메인을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 유전자 조작을 통해 재조합한 βig-h3 재조합 단백질, 즉 천연 βig-h3와 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하는 재조합 단백질 또는 그의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 연고기제 또는 창상치유에 효과적인 천연 고분자 물질인 수용성 키토산(chitosan)을 기제(base)로 하여 혼합한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 그 유효성분인 βig-h3 단백질에 의한 재상피화 및 교원섬유형성 촉진등의 작용에 의하여 창상치료에 탁월한 효과를 보이며, 특히 키토산 혼합 약학적 조성물은 키토산의 항미생물성, 생체 적합성 및 삼출물의 흡수성에 의한 창상 치유 효과에 의하여, 창상 치료의 횟수를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 만성 창상의 치유를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.

Description

창상 치료를 위한 βｉｇ-ｈ3 단백질 또는 그의 일부 도메인을 포함하는 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing βig-h3 recombinant protein or its domains for wound healing}

본 발명은 창상 치료를 위한 βig-h3 단백질 또는 그의 일부 도메인을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 유전자 조작을 통해 재조합한 βig-h3 재조합 단백질, 즉 천연 βig-h3와 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하는 재조합 단백질 또는 그의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 연고기제 또는 창상치유에 효과적인 천연 고분자 물질인 수용성 키토산(chitosan)을 기제(base)로 하여 혼합함으로써, 재상피화와 교원섬유 형성 촉진등의 작용에 의하여 창상치료에 탁월한 효과를 보이며, 특히 키토산을 기제로 한 경우, 키토산의 항미생물성, 생체 적합성 및 삼출물의 흡수성에 의한 창상 치유 효과에 의하여 창상 치료의 횟수를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 만성 창상의 치유를 위하여 유용하게 이용될 수 있는 혼합한 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 창상치유에 관한 연구는 세포생물학적, 분자생물학적 분야로 더욱 세분화되고 있고, 창상치유 촉진에 관한 임상적 적용 또한 더욱 광범위해지고 있으나, 아직도 미세한 세포생물학, 분자생물학적 기전에는 의문점들이 많다.

현재까지 밝혀진 바에 의하면, 창상치유는 손상에 대한 조직의 반응이며, 조직회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제(differentiation and replication), 기질단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생, 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다(Steed, D.L. et al., Clin. Plast. Surg. 25, 397, 1998). 이러한 창상치유 과정의 초기에 나타나 이후 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장인자를 들 수 있는데, 이들은 창상치유 과정 전반에 걸쳐 강력한 영향을 미치면서 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고, 창상 주변환경 또한 조절하므로, 이를 이용한 치료의 개발이 꾸준히 진행되고 있다. 현재까지 널리 연구되어진 성장인자들 중에서 PDGF(platelet-derived growth factor)는 교원섬유 대사를 촉진시키고 섬유아세포와 대식세포의 이동을 촉진시키며 주화성, 혈관신생, 섬유아세포의 분화를 촉진시키는 작용을 하며(Mustoe, T.A, et al., J. Clin. Invest. 87, 694, 1991; Lepisto, J. et al., J. Surg. Res. 53, 596, 1992), EGF(epidermal growth factor)는 상피화와 섬유아세포의 분화, 혈관신생을 증가시킨다고 알려졌다(Franklin, J.D. et al., Plast. Resonst Surg. 64, 766, 1979; Buckly, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7340, 1985). 또한, bFGF(basic fibroblast growth factor)는 혈관신생, 상피화와 교원섬유 침착을 촉진시키며 헤파린과 여러 형태로 결합하여 그와 관련된 작용을 하고(Tsuboi, R. et al., J. Exp. Med. 172, 245, 1990; Kinsnorth, A. N. et al., Br. J. Surg. 77, 409, 1990), IGF(insulinlike growth factor)는 세포의 분화를 증진시키는 역할을 하며, VEGF(vascular endothelial growth factor)는 혈관의 투과성을 증가시키며 혈관신생을 촉진하는 물질로 밝혀졌다.

그 외에도 많은 성장인자와 사이토카인들이 창상치유에 관여한다고 알려져 있는데, 그 중 하나인 TGF-β(transforming growth factor-β)는 여러 가지 세포들의 성장과 분화에 관여하는 물질로, 포유류에서는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 세가지 종류가 존재하고, 성장조절, 면역반응의 조절, 골생성의 자극, 연골특이적분자(cartilage specific macromolecule)의 유도, 창상치유 촉진 등의 여러 가지 복잡한 기능을 한다고 알려졌다(Bennett, N.T. et al., Am. J. Surg. 165, 728, 1993). 이러한 TGF-β는 창상치유시기의 상피에 나타나는데, 이는 재상피화 동안 각질형성세포(keratinocyte) 내의 인테그린(integrin) 발현을 자극하는 것으로 보여진다. TGF-β 발현에 관한 최근 연구에서는, TGF-β3 mRNA가 정상 피부의 상피, 급성 및 만성 창상에서 발현되고, TGF-β1 mRNA는 정상피부와 만성 창상에서는 발현되지 않으나 급성 창상에서 재생되는 상피층에서 발현되며, TGF-β2 mRNA는 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다(Schmid, P. et al., J. Pathol. 171, 191, 1993).아직까지 상기 기작에 대한 정설이 확립된 것은 아니지만 TGF-β가 재상피화에 큰 역할을 할 것으로 예측된다.

상기한 TGF-β의 관련 유전자로 알려진 βig-h3는 Skonier 등에 의해 처음 동정된 유전자로, TGF-β1을 처리한 인체폐선암종 세포주인 A549 세포주에서 cDNA 자료 선별 중 동정되었으며, TGF-β1으로 처리한 후 2일만에 20배 이상의 증가를 보이는 것으로 보고되었다(Stonier, J. et al., DNA cell Biol. 11, 511, 1992). βig-h3의 DNA 서열분석에 의해, βig-h3 단백질은 아미노 말단 분비 서열(amino-terminal secretory sequence)과 몇가지 인테그린(integrin)에 대하여 리간드 식별(ligand recognition)이 가능한 카르복시 말단(carboxy-terminal) Arg-Gly-Asp(RGD) 배열을 가진 683개의 아미노산으로 구성되어 있음이 밝혀졌다.

또한, βig-h3는 4개의 반복된 내부 도메인(internal domain), 즉 fas-1 도메인을 포함하고 있는데, 상기 모티프(motif)는 포유류, 곤충, 성게, 식물, 효소 및 미생물 등의 페리오스틴(periostin), 파시클린 I(fasciclin I), 성게의 HLC-2, 조류의 Algal-CAM 및 미코박테리아의 MPB70과 같은 분비 단백질이나 막(membrane) 단백질 내에도 존재하며, 높은 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다(Kawamoto, T. et al., Biochem. Biophys. Acta. 1395, 288, 1998). 상기 도메인은 110 내지 140 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 특히 상동성이 높은 약 10개의 아미노산으로 이루어진 H1 및 H2가 내부에 존재한다.

βig-h3을 포함한 페리오스틴 및 파스클린 I 단백질은 4개의 fas-1으로 구성되어 있으며, HLC-2는 2개, MPB70은 1개의 fas-1으로 구성되어 있다. 이들의 생물학적인 기능은 아직 밝혀져 있지 않지만, 이들 중 몇몇은 세포 유착에 관여하는 것으로 확인되었다. 특히, βig-h3, 페리오스틴 및 파스클린 I 단백질은 섬유아세포, 골아세포(osteoblast) 및 신경세포에서 세포 부착을 매개하는 것으로 알려졌으며, Algal-CAM 역시 조류인 볼복스(Volvox)의 배(embryo)에서 세포유착에 관여하는 것이 밝혀졌다(LeBaron, R. G., et al., J. Invest. Dermatol. 104, 844, 1995; Horiuchi, K. et al., J. Bone Miner. Res. 14, 1239, 1999; Huber, O. et al.,EMBO J.13, 4212, 1994).

구체적으로, βig-h3는 진피내 섬유아세포의 유착과 확장을 촉진하는 보고가 있었는데, 조직 특이적 분포에 관한 연구를 통하여 βig-h3가 안조직(eye tissue)에서 정상 성인의 각막상피, 각막 내 태아간질세포(fetal stromal cell)와 치유과정중의 각막내피 및 간질 세포에서 발현되는 것으로 보고되었고, 신장의 사구체 근접부장치(juxtaglomerular apparatus)와 근위 세관(proximal tubule)에서 발현되며, 당뇨병이 있는 경우 그 발현이 증가된다는 것이 밝혀졌다. 그 외 정상인의 관상동맥의 내피하 평활근(subendothelial smooth muscle)에서 발현되고, 동맥경화시 혈관 내막에서 발현이 증가된다는 보고가 있으나, 아직 정상피부조직과 피부창상에서의 βig-h3의 발현은 정립되어 있지 않다(Klintworth, G.K. et al., Am. J. Pathol. 152, 743, 1998; Munier, F.L. et al., Nature Genetics 15, 247, 1997; Streeten, B. W. et al., Arch. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 893, 1997).

최근 연구에 의하면, βig-h3은 인테그린 α1β1에 특이적으로 인식되며,RGD 모티프와 관계없이 독자적으로 인테그린 α1β1과 작용하여 세포의 유착과 확장을 촉진시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Ohno, S. et al.,Biochim. Biophys. Acta1451,196, 1999). 또한, H1 및 H2 펩타이드 역시 βig-h3에 의해 매개되는 세포 유착에 영향을 미치지 못하는 것이 확인되었다.

이에 본 발명자들은 상기의 사실을 토대로 하여 정상피부조직에서 TGF-β의 발현과 βig-h3의 발현이 상호 밀접한 관계가 있는 것을 밝혀내고, 만성창상에서 그 발현의 현저한 증가를 확인하였는데, 이는 결과적으로 βig-h3이 진피내 섬유아세포의 유착이나 확장에 관여하여, 만성창상의 경우 창상치유 과정을 지속적으로 유지시켜주는 역할을 하는 것을 의미한다.

또한, 상기의 결과에 근거하여 βig-h3의 창상에 대한 직접적인 작용으로 섬유아세포 증식의 하강조절, 염증세포 침윤의 상대적 감소, 초기 혈관생성의 촉진 함을 밝히고, fas-1 도메인을 하나 이상 포함하도록 유전자 조작한 βig-h3 재조합 단백질을 유효성분으로 포함한 연고기제와, 항미생물성, 생체 적합성 및 삼출물의 흡수성등이 높아 창상 치유에 효과적인 키토산을 기제로 하여 약학적 조성물을 제조하여, 상기 조성물이 창상치료에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 창상부위에서의 재상피화와 교원섬유 형성을 촉진하는 βig-h3 재조합 단백질 또는 βig-h3의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나이상 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 창상치료용 연고기제와 이외에 유효성분으로서 항미생물성, 생체 적합성 및 삼출물의 흡수성등이 높아 창상 치유에 효과적인 키토산을 추가로 포함하는 창상치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 원판 모양의 패치 형태로 제조된 βig-h3 단백질 또는 그의 유도체를 포함하는 키토산 혼합 조성물을 나타내는 것이고,

도 2는 βig-h3 단백질 또는 그의 유도체를 포함하는 키토산 혼합 조성물을 이용하여 백서의 창상치유 효과를 조사하기 위한 적용방법을 나타낸 것이고,

도 3은 정상조직내에서 TGF-β 및 βig-h3의 발현양상을 염색에 의하여 나타낸 사진이고,

A : 진피상부 및 상피층내의 기저층(stratum basale), 유극층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum)에서의 TGF-β 발현 양상

B : 진피 상부 및 상피 기저층에서의 βig-h3 발현양상

C : 상피 기저층을 따라 띠 모양으로 나타나는 βig-h3 발현양상

D : 세포핵 내의 βig-h3의 발현 양상

도 4는 만성창상에서의 TGF-β 발현을 면역조직학적 분석을 통하여 보여주는 사진이고,

A : 진피상부 및 상피층내의 기저층, 유극층, 과립층에서의 TGF-β 발현 양 상

B : 창상 직하부 세포, 기질, 혈관주위의 TGF-β 발현 양상

도 5는 만성창상에서의 βig-h3 발현을 면역조직학적 분석을 통하여 보여주는 사진이고,

A : 창상변연 B : 창상 직하부

C : 과립층 D : 창상 및 창상변연의 세포핵내 발현

도 6은 βig-h3 의 fas-1 도메인 각각을 포함하는 재조합 단백질의 모식도를 나타낸 것이고,

도 7은 연고기제를 적용한 후, 창상면적의 육안적 형태를 나타낸 사진이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 8은 연고기제를 적용한 후, 재상피화에 대한 광학현미경적 관찰 결과를 나타낸 것이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 9는 연고기제를 적용한 후, 교원섬유형성에 대한 광학현미경적 관찰 결과를 나타낸 것이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 10은 키토산 혼합 조성물을 창상에 적용한 후, 창상면적의 육안적 형태를 나타낸 사진이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 11은 키토산 기제에 재조합 βig-h3 D-Ⅳ 3x 및 βig-h3 D-Ⅳ 4x 단백질을 혼합한 복합체의 창상치유 효과를 나타내는 것이다.

A : 3일째 B : 6일째

C : 9일째 D : 12일째

본 발명은 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하는 βig-h3 재조합 단백질 또는 그의 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 창상치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 βig-h3 재조합 단백질 또는 그의 일부 도메인을 포함하는 재조합 단백질외에 키토산을 유효성분으로 포함하는 창상치료용 약학적 조성물을 제공한다

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 βig-h3 단백질과 TGF-β의 정상 및 만성창상조직 내의 발현을 확인하였다.

정상피부조직의 진피층 내에서 TGF-β와 βig-h3는 모두 진피의 상부 즉 유두층에서 발현되고, 상피층에서는 TGF-β는 기저층, 유극층, 과립층에서 발현되나 βig-h3는 기저층에서만 발현된다. 만성창상 내에서는 창상 직하부와 창상 변연에서sms TGF-β와 βig-h3가 모두 발현되나, 창상 변연의 진피층 내에서 TGF-β와βig-h3는 모두 비슷한 발현양상을 보이는 반면, 창상 변연의 상피층 내에서는 TGF-β가 과립층까지 발현되는데 비해 βig-h3는 기저층과 일부 유극층에서만 발현된다.

상기한 결과에 의하면, 정상피부조직에서 TGF-β의 발현과 βig-h3의 발현은 상호 밀접한 관계가 있는 것으로 생각되며 전체적으로 비슷한 발현 양상을 보여 준다. 유두 TGF-β 및 βig-h3 단백질이 진피를 포함한 진피 상부와 상피의 기저층에서만 띠모양으로 발현되는 것으로 비추어 볼때, βig-h3가 상피와 진피의 상호작용 즉 신호전달과 유관할 것으로 사료되며 상피의 조절에도 관여할 것으로 예상된다.

또한, 만성창상에서는 βig-h3 발현의 현저한 증가를 볼 수 있는데, 이는 결과적으로 창상의 형성이후 TGF-β의 발현과 더불어 진피 및 상피 내의 βig-h3 발현이 증가되는 것으로 해석되어 질 수 있고, 결국 βig-h3 가 진피내 섬유아세포의 유착이나 확장에 관여하여, 만성창상의 경우 창상치유 과정을 지속적으로 유지시켜주는 역할을 할 것으로 예측된다.

상기한 사실에 근거하여 본 발명자들은 창상치유에 효과적인 약학적 조성물을 제조하기 위하여, 이의 유효성분으로서 βig-h3 재조합 단백질 또는 상기 단백질의 일부 도메인으로서 βig-h3 단백질의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 제조하였다.

βig-h3 재조합 단백질은 천연 βig-h3 단백질과 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함한다. 본 발명에서는 상기의 βig-h3 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 창상 치유에 효과적임을 확인하였다.

또한, 상기 βig-h3 재조합 단백질의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상을 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 역시 창상 치유에 효과적임을 확인하였는데, 이는 상기 도메인 내에 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 높은 상동성을 보이며 존재함으로 인하여, 이들 도메인만으로도 창상치유에 충분히 효과적임을 의미한다.

본 발명에서 βig-h3 재조합 단백질 또는 상기 단백질의 일부 도메인으로서 βig-h3 단백질의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 연고기제와 키토산 혼합 조성물의 두 가지 방법으로 제조될 수 있다.

먼저, 연고기제는 상기 단백질을 인산염 완충액에 녹인 후, 연고기제에 최종농도가 각각 100 ㎍/㎖이 되도록 섞어 제조한다.

상기 연고기제를 창상을 유발시킨 백서에 적용하여 조직학적 분석을 시행한 결과, 기존의 창상치료에 효과적인 것으로 알려진 양성 대조군으로서 사용된 피브로넥틴 처리 창상, βig-h3 재조합 단백질 및 그의 일부 도메인을 처리한 창상에서 대조창상에 비해 창상면적이 감소하는 것을 확인하였으며, 재상피화도 먼저 일어났다. 피브로넥틴으로 처리한 창상에서 나타난 상기와 같은 결과는 피브로넥틴이 세포 유착, 세포 이동, 단핵구 주화성의 촉진, 세포 성장과 유전자 발현 조절 등의 역할을 하며, 각질형성세포의 이동에 필요한 기질의 주된 구성요소이기 때문이다(Clark, R.A.F. et al., J. Invest. Dermatol. 79, 264, 1982).

창상치유 과정에 본 발명의 βig-h3 단백질을 이용하는 것은 양성 대조군으로 사용된 창상치유 촉진 효능에 있어서는 피브로넥틴과 비슷하지만, 피브로넥틴이 혈장을 이용하여 분리하여야 하는 어려움이 있는데 반하여, βig-h3는 유전자 조작을 통해 대장균에서 쉽게 얻을 수 있으므로 그 생산이나 이용의 편의성에 있어 훨씬 우수하다.

또한, 본 발명자들은 상기의 βig-h3 재조합 단백질 및 그의 일부 도메인을 이용한 창상치유 효과를 증진시키기 위하여, 키토산을 유효성분으로 함께 포함하는 키토산 혼합 조성물을 제조하였다.

키토산 혼합 조성물은 수용성 키토산(Poly(1→4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan)을 멸균 증류수에 녹여 1% 용액으로 만든 후, 겐타마이신(gentamycin) 을 첨가하고, 상기의 재조합 단백질 각각을 500 ㎍/㎖의 농도로 첨가시킨 다음, -70℃로 얼린 후 동결건조기(freeze drier, Il-Shin, Korea)에서 약 12시간 정도 동결건조시켜 원판 모양의 패치 형태로 제조한다(도 1참조).

현재까지 창상치유를 도모하는 목적으로 많은 생체 재료들이 개발되었는데 본 발명에서 사용한 키토산은 갑각류의 껍질, 곤충류, 연체동물, 곰팡이, 효모, 버섯 등 지구상에서 풍부하게 존재하는 천연 고분자 물질인 키틴(chitin)을 탈아세틸화(deacetylation)시켜 얻어지는 물질로, 오염물 처리를 위한 음이온 작용제, 농업용 재료, 음식 첨가물, 항응고제, 항혈전제, 지혈제, 화장품 재료, 직물, 종이, 필름, 스폰지 등의 원료, 분석시약이나 크로마토그래피의 재료로 사용되어 왔다(Muzzarelli, R., 1st ed, New York, Marcel Dekker, p179, 1994; US Patent 2,040,880; US Patent 2,040,879; Hirano, S., Biotechnol. Annu. Rev. 2, 237, 1996). Hoffmeister 등에 의해 키토산의 창상치유 효과가 알려진 후 여러 실험적, 임상적 보고가 있어 왔는데, 아직 그 정확한 기전은 밝혀지지 않았으나 항미생물성, 생체적합성, 삼출물의 흡수성 등으로 인해 좋은 창상치유제로 임상적 적용이 예상된다(Hoffmeister, F.S. et al., Surg. 56, 1129, 1964; Kratz, G. etal., Scand. J. Plast. Reconstr. Hand. Surg. 32, 381, 1998; Hoekstra, A. et al., Biomaterials 19, 1467, 1998).

본 발명에서는 이러한 키토산을 기제로 βig-h3 재조합 단백질을 혼합한 복합체를 사용하여 치료 횟수의 감소와 창상치유 촉진의 효과를 얻을 수 있었는데, 특히 본 발명의 바람직한 실시예의 하나로, 수용성 키토산을 이용하여 패치 형태로 제조하여 창상에 적용함으로써 키토산이 창상에서 천천히 용해되고 이와 함께 단백질이 서서히 분비되는 성질을 이용하여 연고형보다 한번 적용으로 오래 효능이 지속될 수 있도록 하였다.

상기의 약학적 조성물은 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 비경구의 여러 가지 제형, 특히 외용물약, 크림, 젤, 연고, 스프레이, 분무제, 현탁제등으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 창상의 정도와 면적에 따라 포함하고 있는 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 βig-h3 재조합 단백질 또는 상기 단백질의 일부 도메인은 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로, 키토산은 제제상에 0.1% 이상을 포함하는 유효 용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 외용 비경구 투여제이므로, 급성 독성은 나타나지 않았다..

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> βig-h3와 TGF-β의 정상 및 만성창상조직 내의 발현 확인

<1-1> 검사물(specimen) 채취

1999년 3월부터 1999년 8월까지 만성창상으로 수술받은 환자로부터 정상피부조직 5개와 만성창상조직 10개를 채취하였다. 고식적 보존적 치료에도 불구하고 최소 4주이상 창상치유가 되지 않는 조직을 만성창상조직으로 간주하였고, 각 창상조직은 약 1 cm의 정상조직을 포함하여 절제하였으며, 절제 후 결손 부위는 각 환자에 맞는 적절한 수기로 재건을 시행하였다. 만성창상 10개에 대한 병명과 창상기간은표 1과 같다.

<표 1> 만성창상의 유형 및 창상기간

환자 No.	창상 유형	창상기간(월)
1	욕창(sacral)	2
2	욕창(sacral)	3
3	욕창(trochanter)	1
4	당뇨병성 족부궤양(pretibia area)	2
5	당뇨병성 족부궤양(foot)	3
6	욕창(ischium)	2
7	근막염(knee)	6
8	창상파열(back)	1
9	전신성 홍반성낭창 궤양(sacral)	1
10	정맥성 궤양(lower leg)	2

<1-2> βig-h3와 TGF-β의 발현 확인

파라핀에 포매된 조직을 4 ㎛ 두께로 박절하여 유기식염수를 부착한 슬라이드(Probe-on plus slide, Fisher Scientific, U.S.A)에 부착시켜 탈파라핀과 함수과정을 거쳐 증류수로 세척하였다. 10 mM 구연산 완충액(citrate buffer, pH 6.0)을 750 와트(watt) 전자렌지로 5분간 먼저 가온한 후에 슬라이드를 넣고 5분간 2회가온 처리하여 항원표출하였다. 20분간 실온에 방치하여 온도를 서서히 낮춘 후, 트리스 완충 식염수(Tris buffered saline(TBS), 50mM, pH 7.4)로 세척하고, 이어 0.3% 과산화수소용액으로 처리하고 TBS로 세 차례 더 세척하였다. 조직 내 비특이 항원을 차단하기 위해 말 혈장(normal horse serum)에 30분간 반응시키고, TGF-β (Santa Cruz, USA), βig-h3 (made by dept. of biochemistry, Kyungpook National Univ. School of Medicine, Korea)을 1 : 500으로 희석하여 일차항체를 반응시킨 후, 챔버(chamber)에 두고 4℃ 수조에서 하룻밤 동안 반응을 시켰다. 다시 TBS로 세 차례 세척하고 이차항체(Sandon, USA)를 30분간 반응시키고, ABC 시약(avidin-biotin conjugate reagent)과 실온에서 30분간 반응시켰다. TBS로 세척하고 트리스 염산(Tris-HCl, pH 7.6) 완충액으로 다시 세척한 후 AEC 크로모겐(Sandon, USA)으로 발색시키고 증류수에 수세한 후, 이어 헤마톡실린(Mayer Hematoxilin)으로 20초간 대조염색하고 봉입하여 슬라이드를 완성하였다. 염색 정도의 판정은 음성반응을 0, 10% 미만의 양성반응을 1+, 50% 미만의 양성반응을 2+, 50% 이상의 양성반응을 3+로 하였다.

그 결과,도 3에서 보듯이, 정상조직내에서 TGF-β는 진피내에서 1+ 혹은 2+정도의 염색도를 보였고, 진피의 상부, 혈관 주위 등에서 더 강한 염색성을 보였다. 상피층내에서는 3+정도의 염색도를 보였는데 상피층내에서는 기저층(stratum basale), 유극층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum)에서 발현되는 양상을 보였다. βig-h3는 진피에서 TGF-β와 마찬가지로 1+ 혹은 2+정도의 염색도를 보이며 상피의 기저층 직하부, 유두진피(papillary dermis), 혈관 주위 등에서염색성이 강했다. 상피층내에서는 1+ 혹은 2+정도의 염색도를 보였는데 거의 대부분이 기저층에서만 발현되었다. βig-h3의 발현에서 일부의 진피 세포에서는 세포질(cytoplasm)뿐만이 아니라 세포핵 내에서도 염색이 되는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 만성창상 내의 βig-h3와 TGF-β 발현에 있어서,표 2에 나타난 바와 같이 TGF-β는 창상 직하부에서 10례 중 3례에서 2+였고, 7례에서 3+였으며, 창상 변연에서는 10례중 6례에서 2+, 4례에서 3+였다. βig-h3는 창상 직하부에서 10례중 2례에서 2+, 나머지 8례에서 3+였고, 창상 변연에서는 4례에서 2+, 6례에서 3+였다. 창상 직하부, 즉 육아조직이나 궤양 내에서는 βig-h3와 TGF-β 모두가 염증세포나 섬유세포 등의 내부에서 염색되는 결과를 보였고, 특히 혈관주위에서 증가된 염색성을 보였다. 창상 변연에서는 진피와 상피 모두에서 발현되는 양상을 보였다. 또한, TGF-β가 상피층 중 기저층과 유극층 외 과립층까지 전반적으로 염색되는데 비해, βig-h3는 주로 기저층과 기저층 직상부에서 강한 염색성을 보였으며, 세포핵 내에서 염색되는 세포수가 정상에 비해 더 증가하는 양상을 보였다(도 4및도 5).

<표 2> 만성창상의 면역조직화학적 염색 분석

환자	창상직하부	창상변연
	TGF-β	βig-h3	TGF-β	βig-h3
1	3+	3+	2+	2+
2	3+	3+	2+	3+
3	3+	2+	3+	3+
4	3+	3+	2+	2+
5	2+	3+	2+	2+
6	3+	3+	3+	3+
7	2+	3+	2+	3+
8	2+	3+	3+	3+
9	3+	3+	3+	2+
10	3+	3+	2+	3+

* 염색정도; 0 : 음성 1+ : 10% 이하 양성

2+ : 10 내지 50% 양성 3+ : 50% 이상 양성

<실시예 2> 재조합 βig-h3 단백질 및 그의 일부 도메인을 포함한 연고기제와 키토산 혼합 조성물의 창상치유 효과

<2-1> 재조합 βig-h3 단백질의 발현 및 정제

상기한 결과로부터 본 발명자들은 βig-h3 가 진피내 섬유아세포의 유착이나 확장에 관여하며, 만성창상의 경우 창상치유 과정을 지속적으로 유지시켜주는 역할을 하는 것을 확인하고, 이를 이용한 약학적 조성물을 위한 βig-h3의 재조합 단백질을 제조하였다.

βig-h3의 재조합 단백질은 다양한 형태로 제조되었다. 즉, 천연 βig-h3 단백질과 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b, βig-h3의 각각의 도메인을 포함하는 재조합 단백질 βig-h3 D-Ⅰ, βig-h3 D-Ⅱ, βig-h3 D-Ⅲ, βig-h3 D-Ⅳ 및 상기 4번째 도메인을 2개 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X를 제조하였다.

구체적으로 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b는 βig-H3 cDNA로부터 아미노 말단부분이 일부 결실된Asp718 -BglⅡ 단편을 pET-29β의EcoRⅤ와EcoRⅠ부위에 삽입하여 제조한 pHis-β-b를 이용하여 발현하였으며, βig-h3의 일부 도메인만을 포함하는 각각의 재조합 단백질은 아미노산 서열 129번부터 241번까지, 237번부터 377번까지, 368번부터 506번까지, 498번부터 637번까지 해당하는 βig-h3 cDNA 각각의 절편들을 PCR에 의해 증폭시킨 후, 벡터 pET-29b(+)의EcoRV 및XhoI 위치에 클로닝하여 각각 pβig-h3 D-Ⅰ, pβig-h3 D-Ⅱ, pβig-h3 D-Ⅲ 및 pβig-h3 D-Ⅳ로 명명한 발현벡터를 이용하여 제조하였다(도 6).

상기 벡터들을 각각 형질전환시킨 대장균 세포주(E.coliBL 21 DE3)는 50 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함한 37℃ LB 배양액에서, 595 nm 흡광도가 0.5∼0.6까지 배양하고, 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-(-)-thiogalactopyranoside)로 37℃에서 3시간 동안 재조합 βig-h3 단백질의 발현을 유도하여, 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, o.5 mM DTT)에 재부유시키고 초음파로 분쇄하였다. 봉입체 형태로 발현된 단백질들은 8 M 요산 변성완충액으로 용해시켰고, 변성된 단백질들은 Ni-NTA 수지(resin, Qiagen)을 이용해 정제하였다. 재조합 단백질은 200 mM 이미다졸(imidazole) 용액에서 용리한 다음, 50 mM 염화나트륨을 포함한 20 mM 트리스 염산 완충액 내에서 고농도에서 저농도 요산으로 차례로 투석하여 정제하였다. 상기 발현 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE에 의하여 확인하였다. βig-h3 D-Ⅰ, βig-h3 D-Ⅱ, βig-h3 D-Ⅲ 및 βig-h3 D-Ⅳ 재조합 단백질들은 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 His-β-b 재조합 단백질과는 달리 모두 수용성으로 합성되어 변성단계를 거치지 않아도 되며, 많은 양을 쉽게 얻을 수가 있다.

상기의 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b 및 βig-h3의 일부 도메인을 포함하는 각각의 재조합 단백질에 대한 세포부착활성을 조사하였다.

세포 부착 활성은 다음과 같이 측정하였다. 세포부착 활성 실험에 이용된 사람의 각막상피세포(HCE 세포)는 15%의 소혈청(fetal bovine serum), 젠타마이신(40 ㎍/㎖), 인슐인(5 ㎍/㎖), 콜레라 톡신(0.1 ㎍/㎖) 및 사람의 상피 성장호르몬인 hEGF(10 ng/㎖)을 포함하는 DMEM(DMEM/F-12, Gibco BRL) 배지를 이용하여, 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건으로 배양하였다.

먼저, 상기의 재조합 βig-h3 단백질을 37℃에서 1시간 동안 96 웰 플레이트(Falcon)에 부착시킨 후, 동일한 온도에서 0.2% BSA를 포함하는 인산염 완충용액으로 세척하여 부착되지 않고 남아있는 단백질들을 제거하였다. 각 세포는 트립신을 처리하여 2 × 10⁵cells/㎖의 농도로 배양액에 현탁시키고, 0.1 ㎖ 씩 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

상기 웰 플레이트를 37℃에서 1시간 방치한 후, 부착되지 않은 세포는 인산염 완충용액으로 세척하여 제거하였다. 부착된 세포는 헥소스아미다아제 기질(hexosamidase substrate)로 작용하는 3.75 mM p-니트로페놀-N-아세틸 1-β-D-글리코사미니드(p-nitrophenol-N-acetyl l-β-D-glycosaminide) 및 0.25% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 50 mM 구연산 완충용액(citrate buffer, pH 5.0)를 첨가하여, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 5 mM EDTA를 포함하는 50 mM 글리신 완충용액(glycine buffer, pH 10.4)을 첨가하여 효소 활성을 정지시킨 후, 멀티스캔 MCC/340 마이크로플레이트 분석기(Multiskan MCC/340 microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포부착 활성을 나타내는 지표의 하나로 세포 표면적을 측정하기 위하여는, 4 × 10⁴개의 세포를 기질이 부착된 48-웰 플레이트 내에 첨가하였다. 기질에 부착된 세포는 8% 글루타르알데히드(glutaraldehyde, Sigma)로 고정시키고, 20% 메탄올(methanol)에 용해시킨 0.25% 크리스탈 바이올렛(crystal violet, Sigma)으로 염색하였다. 세포 표면적은 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Image-Pro plus software, Media Cybernetics)를 사용하여 측정하였다. 상기 측정은 각 실험 마다 위치당 200 내지 300회 측정하였으며, 이를 3회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 2번째 fas-1 도메인과 4번째 fas-1 도메인을 포함하는 재조합 단백질 βig-h3 D-Ⅱ 및 βig-h3 D-Ⅳ가 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b에 상응하는 활성을 나타낸 반면, 1번째 fas-1 도메인은 미약하게, 3번째 fas-1 도메인은 세포 부착 활성을 거의 나타내지 않았다. 세포부착 활성을 나타내는 2번째 및 4번째 도메인은 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 높은 상동성을 보이며 존재하는데, 이러한상동성이 세포부착 활성 및 창상치유 효과를 나타내는데 중요한 역할을 할 것으로 생각할 수 있다.

상기 발현벡터 pHis-β-b, pβig-h3 D-Ⅱ 및 pβig-h3 D-Ⅳ에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체는 각각E. coliBL21/His-β-b,E. coliBL21/Hisβ-g 및E. coliBL21/Hisβ-e로 명명하였으며, 2000년 4월25일자로 생명공학 연구소 유전자 은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18008P, KCTC 18010P 및 KCTC 18009P).

상기의 결과를 토대로 4번째 도메인을 하나 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X 재조합 단백질의 창상치유효과를 확인하기 위하여 상기의 단백질을 하기와 같은 방법으로 제조하여 이들의 창상치유 효과를 확인하였다.

즉, 4번째 도메인에 해당하는 아미노산 498에서 637까지의 단편을 PCR로 합성하여 Klenow로 3' 말단부분을 평활화시킨 후, 상기에서 제조한 4번째 도메인을 포함하는 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ의EcoRV 부위에 삽입하고 이를 pβig-h3 D-IV 2X라 명명하였다. pβig-h3 D-IV 2X의 삽입절편을EcoRV와XhoI으로 잘라내어 역시 같은 방법으로 Klenow로 3' 말단부분을 평활화시킨 후, pβig-h3 D-Ⅳ 및 pβig-h3 D-IV 2의 EcoR V 부위로 각각 삽입하고, 이를 pβig-h3 D-Ⅳ 3X와 pβig-h3 D-Ⅳ 4X로 명명하였다.

이들 모든 재조합 단백질은 3시간동안 1 mM IPTG로 발현을 유도하고 Ni-NTA 수지(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 분리된 재조합 단백질들은 50 mM NaCl과 300 mM 이미다졸(imidazole)을 포함한 20mM Tris-HCl로 용출하여 분리 정제하였다. βig-h3 D-IV, βig-h3 D-IV 2x, 3x 및 4x는 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질과는 달리 모두 수용성으로 합성되어 변성단계를 거치지 않아도 되며, 많은 양을 쉽게 얻을 수가 있다.

상기 발현벡터 중 βig-h3의 4번째 도메인을 4개 포함하고 있는 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ 4X에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-e4X는 2000년 4월 25일자로 생명공학 연구소 유전자 은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18011P).

<2-2> 재조합 βig-h3 단백질 및 그의 일부 도메인을 포함한 연고기제와 키토산 혼합 조성물의 제조

<2-2-1> 실험군의 선정

상기한 세포부착 활성 결과에 근거하여 선별한 재조합 βig-h3 단백질, 즉 천연 βig-h3 단백질과 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하고 있는 Hisβ-b, 4개의 도메인 중 4번째 도메인만을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ 및 상기 도메인을 다수개 포함하고 있는 βig-h3 D-Ⅳ 3X와 βig-h3 D-Ⅳ 4X의 창상치유 효과를 알아보기 위하여 연고기제를 이용한 실험군 1과, 키토산을 기제로 상기 4종류의 재조합 βig-h3 단백질을 혼합한 복합체를 이용한 실험군 2로 나누어, 각군마다 20마리의 백서를 배분하였다. 실험군 1에서는 백서의 등에 직경 2cm의 원형의 피부전층창상 4곳을 만들어 각 창상에 도포한 연고의 내용물에 따라 실험군 1-A, 1-B, 1-C, 1-D로 세분하였다.

1-A : 연고 기제(ointment base)에 아무 물질도 혼합하지 않고 연고 기제 만을 하루에 1 g씩 도포한 창상.

1-B : 연고 기제에 피브로넥틴(fibronectin)을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를 하루에 1 g씩 도포한 창상.

1-C : 연고 기제에 Hisβ-b 단백질을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를 하루에 1 g씩 도포한 창상.

1-D : 연고 기제에 βigh3-D-Ⅳ 단백질을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를 하루에 1 g씩 도포한 창상.

실험군 2에서는 백서의 등에 직경 7mm의 원형의 피부전층결손을 4곳에 만들어 각 창상에 도포한 키토산 기제와 혼합된 내용물에 따라 2-A, 2-B, 2-C, 2-D, 2-E, 2-F로 세분하였다.

2-A : 아무 물질도 혼합하지 않고 키토산 기제만을 창상에 도포한 창상.

2-B : 키토산 기제에 피브로넥틴을 500 ㎍/ml 농도로 혼합한 복합체를 도 포한 창상.

2-C : 키토산 기제에 βig-h3-WT 단백질을 500 ㎍/ml 농도로 혼합한 복합 체를 도포한 창상.

2-D : 키토산 기제에 βigh3-D-Ⅳ 단백질을 500 ㎍/ml 농도로 혼합한 복합 체를 도포한 창상.

2-E : 키토산 기제에 βigh3-D-Ⅳ 3X 단백질을 500 ㎍/㎖ 농도로 혼합한복합체를 도포한 창상.

2-F : 키토산 기제에 βigh3-D-Ⅳ 4X 단백질을 500 ㎍/ml 농도로 혼합한 복합체를 도포한 창상.

기존에 창상 치유에 효과가 있는 것으로 알려져 있어 양성 대조군으로 사용한 피브로넥틴은 하기의 방법으로 정제하였다.

즉, 백서의 구연산염 첨가혈장(citrated rat plasma)과 젤라틴-세파로즈 4B(gelatin-sepharose 4B)에서 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 피브로넥틴(fibronectin)을 정제하였다. 혈장을 비치환된 세파로즈 4B(sepharose 4B)로 실온에서 여과하고 그 유출액을 0.05 M EACA(ε-amino caproic acid), 0.02 M 구연산나트륨, 0.02% 소디움 아자이드(sodium azaid)를 포함한 0.05 M 트리스 염산으로 평형화시킨 젤라틴-세파로즈(gelatin sepharose 4B)에 부하시켰다. 혈장단백 대부분을 용리한 후, 1 M 염화나트륨을 포함한 완충액으로 세척했다. 흡착된 피브로넥틴은 3 M 요산 등장 완충액으로 용리했는데, 요산 용리액은 바로 인산염 완충액(phosphate buffer saline, PBS, pH7.2)으로 약 48시간 투석시켜 피브로넥틴을 정제하였다. 정제된 피브로넥틴의 농도는 280 nm에서 자외선(UV) 흡광도로 결정하였고, 동결건조 후 -20℃에서 보관하였다.

<2-2-2> βig-h3 재조합 단백질을 포함하는 연고기제 및 키토산 혼합 조성물의 제조

실험군 1에서는 정제된 피브로넥틴과 Hisβ-b, βigh3-D-Ⅳ 단백질을 인산염완충액에 녹인 후, 연고기제에 최종농도가 각각 100 ㎍/ml이 되도록 섞어 연고를 제조하여 사용하였다. 사용한 연고기제는 수용성 연고기제(삼아베이스)를 사용하였으며, 연고기제 1 g당 경납 38 ㎎, 스테아릴알코올 116 ㎎, 폴리에틸렌글리콜 38 ㎎, 농글리세린 192 ㎎, 에탄올 23 ㎎, 라울릴 황산나트륨 ㎎, 파라옥시안식향산에칠 0.87 ㎎, 파라옥시안식향신부칠 0.12 ㎎ 및 정제수를 포함하고 있다.

실험군 2에서는 연고가 아닌 키토산 복합체를 사용하였다. 먼저 분자량이 600,000 Dalton인 수용성 키토산(Poly(1→4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan, (주)자광) 분말 1 g을 멸균 증류수 100 ㎖에 녹여 1% 용액으로 만든 후, 12 웰 플레이트(Corning)에 각각 2 ㎖씩 나누어 담은 후, 겐타마이신(gentamycin) 100 ㎍을 각각 첨가했다. 복합체의 종류에 따라 피브로넥틴, βig-h3 b, βigh3-D-Ⅳ, βigh3-D-Ⅳ 3X 및 βigh3-D-Ⅳ 4X를 각각 500 ㎍/ml 의 농도로 첨가시킨 다음, -70℃로 얼린 후 동결건조기(freeze drier, Il-Shin, Korea)에서 약 12시간 정도 동결건조시켜 원판 모양의 복합체를 제작하였다(도 1).

<2-3> βig-h3 재조합 단백질 및 키토산 혼합 조성물의 창상치유 효과

<2-4-1> βig-h3 재조합 단백질을 포함하는 연고기제의 창상치유 효과

먼저 백서를 에테르로 마취시킨 후, 등을 면도하여 베타딘 용액으로 소독하였다. 실험군 1에서는 백서의 등 4 군데에 지름 약 2 cm의 원형의 창상을 15번 수술칼을 이용해 피부전층으로 만들고, 각각의 창상에 실험군 1-A, 1-B, 1-C, 1-D,에 사용된 연고를 약 1 g 도포한 후 드레싱용 합성물질(Tegaderm^??, 3M)로 창상을 덮고 압력붕대로 가볍게 싸주었다. 연고의 교체는 하루 1회 매일 시행하였다.

먼저, 실험군 1에서 각각 육안적 형태측정을 시행하였다. 동일한 눈금자를 각 창상연과 평행으로 근접되게 위치시킨 후 같은 거리에서 근접 사진촬영을 실시하고, 사진을 컴퓨터 스캔한 후 이미지 분석기(NIH image analysis system, Bio-Optics)를 이용하여 남은 상처의 면적을 측정하였다. 이때 백서는 에테르로 충분히 흡입마취시킨 후, 근육이 완전 이완된 상태에서 실시하였으며, 실험군 1에서는 22일째까지 2일에 한번씩 측정하여 비교 분석하였고, 실험군 2에서는 측정주기를 15일까지 3일에 한번씩으로 하였다. 측정된 값들은 시간에 따른 각 실험군간의 상호비교로 분산분석법(ANOVA test)과 쉐페법(Scheffe's test)을 이용하였다.

연고기제를 사용한 실험군 1에서 창상면적은 창상형성 직후부터 서서히 감소하였으며, 그 중 연고 기제만으로 처리한 군에 비해 피브로넥틴과 βig-h3 단백질을 적용한 군에서 그 면적 감소가 더욱 빠른 것을 확인할 수 있었다. 창상면적의 감소는 창상치유 초기보다 7일 이후 현저한 차이가 나타나기 시작하였으며, 통계학적으로는 수술 후 2일, 8일, 10일에서 1-A 창상에 비해 다른 창상들에서 유의한 차이가 있었으나(p＜0.05) 다른 창상들 상호간에는 유의한 차이는 없었다(표 3및도 7).

<표 3> βig-h3 재조합 단백질을 포함한 연고기제의 창상면적의 감소효과

수치: 평균값±표준 편차,

* : 분산분석법(ANOVA test)과 쉐페법(Scheffe's test)의한 유의도 p＜0.05

a,b : 통계학적 차이를 보이는 수치

또한, 광학현미경 조직학적 분석을 실험군 1에서 시행하였다. 창상부위들을 3, 7, 10, 14, 20일째 생검한 후 즉시 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후, 6 ㎛ 두께로 잘라 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin, HE) 및 마손의 트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 수행하여 관찰하였다. 각 사용물질들의 시간에 따른 창상치유 효과는 재상피화 및 교원섬유의 형성 등을 관찰하였는데, 이 중 재상피화는 그 생성정도를 반정량화하여 상피층의 형성이 되지 않는 경우를 0, 상피층이 형성되기 시작할 경우를 1+, 형성은 되었으나 상피층의 구조가 불완전할 경우를 2+, 상피층의 형성이 완전할 경우를 3+로 등급화하였다. 측정된 값들은 시간에 따른 각 실험군간의 상호비교와 각 실험군 내에서의 시간에 따른 차이에 대해 분산분석법와 쉐페법을 이용하여 통계 처리하였다. 교원섬유의 형성은 트리크롬 염색상 그 형성의 정도가 매우 미약한 경우를 1+, 그 형성이 엉성한 경우 2+, 형성의 정도가 밀집되어 있는 경우를 3+로 등급화하여 비교하였다.

먼저 재상피화에 대한 광학현미경적 관찰 결과는, 실험군 1-B, 1-C, 1-D에서는 7일에서 10일경사이에 시작되어 20일경에는 재상피화가 모두 이루어진 것으로 나타났으나, 대조군인 1-A에서는 14일경에도 아직 재상피화가 시작되지 못하였고 20일경에도 재상피화를 완성하지 못하였다(표 4및도 8).

<표 4> 창상에서의 재상피화

일군	3	7	10	14	20
1-A(대조군)	0	0	0	0	2+
1-B(피브로넥틴)	0	1+	1+	2+	3+
1-C(His-β-b)	0	0	1+	2+	3+
1-D(βig-h3D-Ⅳ)	0	0	1+	2+	3+

교원섬유(collagen fiber)의 형성에 있어서는표 8에 나타난 바와 같이, 초기 7일까지는 실험군 1-A, 1-D에서 1+ 정도로 미약한 형성을 나타나는데 비해, 1-B 및1-C에서 2+ 정도로 차이를 보이나 약 10일경에는 모든 창상에서 2+로 비교적 풍부한 교원섬유의 형성을 관찰할 수 있었다. 약 14일경에 이르러서는 모든 창상에서 3+ 로 밀집되고 잘 배열된 교원섬유를 관찰할 수 있으며 그 양도 더욱 증가되었다(표 8및도 9). 이러한 교원섬유 형성의 증가는 창상치유가 잘 일어남을 의미하는 것이다.

<표 8> 창상에서의 교원섬유 형성양상

일군	3	7	10	14	20
1-A(대조군)	1+	1+	2+	3+	3+
1-B(피브로넥틴)	1+	2+	2+	3+	3+
1-C(His-β-b)	1+	2+	2+	3+	3+
1-D(βig-h3D-Ⅳ)	1+	1+	2+	3+	3+

교원섬유의 형성정도 0 : 음성 1+ : 매우 미약

2+ : 형성 3+ : 매우 밀집된 형성

<2-4-2> βig-h3 재조합 단백질을 포함한 키토산 혼합 조성물의 창상치유 효과

실험군 2에서는 백서의 등에 직경 약 7 mm의 원형의 피부전층창상을 4군데에 만들고 각각 실험군 2-A, 2-B, 2-C, 2-D, 2-E, 2-F에 사용된 복합체로 덮은 후, 드레싱용 합성물질로 다시 덮고 압력붕대로 싸주었으며 복합체의 교체는 3일 간격으로 시행하였다(도 2).

βig-h3 재조합 단백질을 포함한 키토산 혼합 조성물의 창상치유 효과를 관찰한 결과,표 9에 나타나 바와 같이, 실험군 2-A를 제외한 2-B, 2-C에서 한 마리, 2-D에서 두 마리 외의 모든 백서에서 12일부터 15일 사이에 완전한 창상치유가 됨을 관찰하였다. 창상면적은 전체 창상에서 창상형성 직후부터 감소하였으며, 2-A에서는 전기간 동안 비교적 서서히 감소하는 경향을 보이나, 그 외 나머지 창상에서는 초반 3일 정도까지 급격히 감소하고 약 9일 정도까지 완만히 감소한 후 다시 급격히 감소하는 양상을 보였다. 창상 상호간의 비교를 볼 때 3일에 2-B, 2-C, 2-D에서 2-A에 비해 유의한 차이가 있었으며(p＜0.05) 6일과 12일에 2-B와 다른 창상과의 차이에 유의성이 있었다(p＜0.05)(표 9및도 10).

<표 9> βig-h3 재조합 단백질을 포함한 키토산 혼합 조성물의 창상면적의 감소효과

일군	0	3*	6*	9	12*	15
2-A(키토산)	54.4±4.0	34.5±2.5a	25.0±8.1a	18.2±5.8	9.1±1.3a	2.6±0.0
2-B(키토산+ 피브로넥틴)	50.6±3.3	21.5±1.0b	15.9±4.0b	13.5±1.8	2.6±0.5b	1.0±0.2
2-C(키토산+His-β-b)	50.1±3.5	27.0±7.5b	19.4±5.6a	18.0±8.2	4.7±1.8a	1.0±.02
2-D(키토산+βig-h3 D-Ⅳ)	49.0±3.7	27.7±1.8b	19.8±4.7a	17.7±5.1	4.8±1.4a	1.3±0.2

수치: 평균값±표준 편차,

* : 분산분석법(ANOVA test)과 쉐페법(Scheffe's test)의한 유의도 p＜0.05

a,b : 수직적으로 통계학적 차이를 보이는 수치

이외에도4번째 도메인만을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ이 창상치유에 효과적이라는 상기 결과를 근거로 본 발명자들은 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 βigh3-D-Ⅳ, βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X를 유효성분으로 함유한 키토산제제를 제조하여 상기 도메인의 각막상피세포 부착 및 창상치유 효과를 확인하였다.

그 결과, 키토산 기제에 재조합 βig-h3 D-IV 3X 및 4X 단백질을 혼합한 복합체의 창상치유 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

2-A를 제외한 2-B에서 한 마리, 2-E, 2-F에서 두 마리 외의 모든 백서에서 12일부터 15일 사이에 완전히 창상치유가 되었으며, 창상면적은 전체 창상에서 창상형성 직후부터 감소하였고, 2-A에서는 전기간 동안 비교적 서서히 감소하는 경향을 보이나, 그 외 나머지 창상에서는 초반 3일 정도까지 급격히 감소하고 약 9일 정도까지 완만히 감소한 후 다시 급격히 감소하는 양상을 보였다. 창상 상호간의 비교를 볼 때 3일에서 15일 전 기간에 걸쳐 2-B, 2-E, 2-F에서 2-A에 비해 유의한 차이가 있었다(p＜0.05)(표 4 및 도 11).

<표 4> 창상면적의 감소효과(㎟)

일군	0	3*	6*	9*	12*	15*
2-A(키토산)	49.3±4.0	34.5±0.6a	26.1±0.5a	13.8±0.5a	10.8±0.3a	3.4±0.2a
2-B(키토산+피브로넥틴)	49.2±0.5	24.1±0.6b	12.9±0.6b	9.7±0.8b	3.2±0.4b	0.8±0.2b
2-E(키토산+βig-h3 3X)	49.2±1.5	25.3±0.7b	16.6±0.6b	11.2±0.5b	5.0±0.8b	1.2±0.2b
2-F(키토산+βig-h3 4X)	48.5±0.4	24.5±0.6b	14.1±0.7b	9.6±0.6b	4.2±0.3b	1.1±0.2b

수치: 평균값±표준 편차,

* : 분산분석법(ANOVA test)에 의한 유의도 p＜0.05

a,b : 통계학적 차이를 보이는 수치

본 발명의 키토산 혼합 조성물과 연고기제에 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하고 있는 조성물의 창상면적을 백분율로 환산하여 비교하면 하기 표 와 같이 나타날 수 있다.

일군	0	6	12
대조군	연고	100100	6946	2717
	키토산
피브로넥틴	연고	100100	5831	175
	키토산
Hisβ-b	연고	100100	5439	159
	키토산
Hisβ-e	연고	100100	6340	1410
	키토산

각 수치는 상처의 원래 크기를 100으로 하였을 때 상대적 크기 값으로 나타낸 것으로 대조군을 포함한 모든 군에서 연고제보다 키토산 제제를 사용한 경우에서 현저히 상처의 크기가 줄어든 것을 알 수 있다.

결론적으로 βig-h3는 창상 내에서 TGF-β와 함께 창상치유 과정 중에 나타나 창상치유촉진에 중요한 역할을 하며, 이러한 사실을 이용한 본 발명의 창상치유를 위한 약학적 조성물은 키토산 기제와 혼합하여 복합체를 만들면 창상의 좋은 치료제로 응용될 수 있을 것이다.

본 발명은 유전자 조작을 통해 재조합한 βig-h3 재조합 단백질, 즉 천연 βig-h3와 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함한 재조합 단백질 또는 그의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 연고기제 또는 창상치유에 효과적인 천연 고분자 물질인 수용성 키토산(chitosan)을 기제(base)로 하여 혼합한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 그 유효성분인 βig-h3 단백질에 의한 재상피화 및 교원섬유형성 촉진등의 작용에 의하여 창상 치유에 탁월한 효과를 보이며, 특히 키토산 혼합 약학적 조성물의 항미생물성, 생체 적합성 및 삼출물의 흡수성에 의한 창상 치유 효과에 의하여, 창상 치료의 횟수를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 만성 창상의 치유를 위하여 유용하게 이용될 수 있다. 이외에도 본 발명의 수용성 키토산을 이용하여 패치 형태의 키토산 혼합 약학적 조성물은 키토산이 창상에서 천천히 용해되고 이와 함께 단백질이 서서히 분비되는 성질을 이용하여 연고형보다 한번 적용으로 오래 효능이 지속될 수 있어 유용하다.

Claims (9)

1. βig-h3 단백질의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 단독으로 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 창상치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 유효성분으로 수용성 키토산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 창상치료용 약학적 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, βig-h3의 2번째 fas-1 도메인은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 237-377를 포함하며, 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-g(수탁번호: KCTC 18010P)로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 창상치료용 약학적 조성물.
6. 제 1항에 있어서, βig-h3의 4번째 fas-1 도메인은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 498-637를 포함하며, 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-e(수탁번호: KCTC 18009P)로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 창상치료용 약학적 조성물.
7. 제 1항에 있어서, βig-h3의 2번째 fas-1 도메인 또는 4번째 fas-1 도메인 각각을 단독 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 498-637로 이루어진 도메인을 4개 포함하며, 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-e4x(수탁번호: KCTC 18011P)로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제 2항에 있어서, 수용성 키토산을 이용하여 패치 형태로 제조된 것을 특징으로 하는 창상치료용 약학적 조성물.
9. 1) 수용성 키토산(Poly(1→4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan)을 멸균 증류수에 녹여 용액으로 만드는 단계;

   2) βig-h3 재조합 단백질 또는 βig-h3 단백질의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인을 단독으로 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 단계 1)의 용액에 첨가하는 단계; 및,

   3) 상기 용액을 동결건조시켜 원판 모양의 패치 형태로 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 8항의 창상치료용 약학적 조성물의 제조방법.