JP2004523591A - 傷拘縮治療用のペプチド類 - Google Patents
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Abstract
本発明は傷拘縮の治療または予防において使用するための一定の薬物を調整するための、一定のシーケンスのX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法を提供しており、この場合に、上記ＸはＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、上記ＹはＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である。
Description
【発明の内容の開示】
【０００１】
本発明は傷拘縮の治療または予防、特に、熱傷による拘縮の予防において使用するための薬物の調製用の特定のペプチド類の使用に関する。
【０００２】
傷拘縮は一定の全層性で開講性の傷、特に全層性の熱傷の寸法を減少する過程である。この拘縮中に進展する張力および皮下の線維組織の形成により、奇形が生じ、特に、その傷が関節の一定領域に関連する場合にその関節の屈伸を固定する。これらの合併症は特に熱傷の治癒において一般に広まっている。
【０００３】
瘢痕性の拘縮は一定の治癒状態の瘢痕において生じる拘縮性の過程の結果であり、機能的または美顔的な奇形を生じる可能性のある望ましくない固定された硬質の瘢痕を生じる。一般に、傷拘縮は一定の不完全に上皮化した欠陥部分において生じるが、瘢痕拘縮は一定の上皮化して被覆された欠陥部分において生じる。この用語の「傷拘縮（wound contracture）」は傷拘縮および瘢痕拘縮の両方を含むものとして本明細書において用いられている。
【０００４】
傷拘縮および瘢痕拘縮はロス・ルドルフ（Ross Rudolph），ジェリー・バンデ・ベルグ（Jerry Vande Berg）およびＨ．ポール・エーリッヒ（H. Paul Ehrlich），「ウンド・ヒーリング：バイオケミカル・アンド・クリニカル・アスペクツ（Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects）」，Ｉ．Ｋ．コーヘン（I.K. Cohen），Ｒ．Ｆ．ディーゲルマン（R.F. Diegelman）およびＷ．Ｊ．リンドブラッド編集，Ｗ．Ｂ．サンダース・カンパニー（W.B. Saunders Company），９６頁乃至１１４頁において詳細に調べられており、この文献の内容全体が本明細書において参考文献として含まれる。
【０００５】
拘縮の有害な作用は皮膚表面の下部においても生じる可能性があり、深部の生体器官にも及ぶ。よく知られている例はデュピュイトラン拘縮（Dupuytren's contracture）における手掌腱膜の収縮および一定のシリコーン胸部移植片の周囲の包の収縮、および心臓ペースメーカー移植片における特定の合併症である。加えて、硬変性の肝臓内における収縮した線維症の瘢痕束は肝臓内の血管を圧縮して門脈圧亢進症に起因する可能性がある。さらに、別の内臓も十二指腸潰瘍の狭窄症、リウマチ性心疾患における心臓弁の拘縮、および傷害における尿道狭窄等のような拘縮の影響を受ける可能性がある。線維芽細胞および筋線維芽細胞は傷拘縮の機構に関連している。そこで、傷拘縮の抑制のために線維芽細胞および筋線維芽細胞の可動化、移動、接着または増殖に対して干渉する各種の物質または方法を使用することが提案されている。例えば、高い投与量のコルチゾンまたは関連の各種ステロイドが線維芽細胞増殖を抑制して傷拘縮を阻害することが示されている。不都合にも、これらのステロイドはこのような高い投与量で投与されるステロイドは臨床的な実施において許容し得ない副作用を生じる。
【０００６】
シアニドおよびジニトロフェノール等のような各種の細胞毒もまた傷拘縮を抑制することが報告されている。同様に、例えば、コルヒチン、ビンブラスチンおよびフェニルトイン（phenyltoin）等のような平滑筋の収縮を抑制する各種の薬物も傷拘縮を抑制することが報告されている。
【０００７】
実際の問題として、傷拘縮の調整は現在においては主に機械的および外科的である。外科医は一部の状況において傷拘縮の促進を望み、また、別の状況においては傷拘縮を抑制することを望む場合がある。以下の各種の方法、すなわち、（１）延長された副子による固定、（２）運動の範囲、（３）圧力、（４）全層皮膚移植、および（５）各種外科処置の考慮された計画が望ましくない瘢痕および傷拘縮を減少するために用いられている。
【０００８】
また、未処理状態のガーゼ等のような一定の付着性の包帯が拘縮を遅延するが予防しないことが見出されている。これに対して、活性状態の拘縮が開始する前に傷に対して供給されるナイロン等のような特定の合成フィルムは拘縮を抑制できる。
【０００９】
また、傷拘縮の開始前における一定の開口状態の傷への一定の全層の皮膚移植片の供給が傷拘縮を妨げるために有効であることが見出されている。しかしながら、費用、移植する皮膚の供給源、移植片の拒絶反応、二次感染、および関連の手術による危険性等を含む重要な問題が皮膚移植に付随している。また、薄いまたはメッシュ状の皮膚移植片を全層の皮膚移植片の代わりに供給した場合に深刻な拘縮が依然として観察される。
【００１０】
米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，９５７，９０２号は一定のアミノ酸シーケンスArg-Gly-GluおよびそのＮ−末端およびＣ−末端の各誘導体を含む各種ペプチドの傷に対する供給による傷拘縮の抑制を記載している。
【００１１】
さらに、現在においては、特定の別のペプチドが傷および瘢痕の拘縮を抑制または減少するための能力を示す生体外における有望な作用を示すことが見出されている。
【００１２】
従って、本発明は傷拘縮の治療または予防において使用するための一定の薬物の調製のためのX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yというシーケンスを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法を提供しており、この場合に、ＸはＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、ＹはＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である。
【００１３】
初期の特許出願の英国特許出願（ＧＢ−Ａ）第２３２１１９１号は糖尿病性の潰瘍等のような慢性の傷の治療のために上記のようなペプチド類の使用を記載している。
【００１４】
現在において、一定のテトラペプチドのGly-Pro-Ala-Glyがコラーゲン・ゲル収縮を抑制するために予想外に有効であることが以下の方法１において詳細に記載されている生体外線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮モデルにより見出されている。この作用は新生児期および胎児期の両方において観察されている。さらに、上記のテトラペプチドが線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮における特定の増殖因子の刺激作用を抑制することも見出されている。さらに、これらの結果は上記のテトラペプチドが生体内における傷拘縮を減少するためにも有効であるという見込みを明らかに示している。さらに、上記の結果は上記テトラペプチドの多数の誘導体が一定の包帯剤として用いられる場合に類似の活性によるか、この誘導体が生体内において一定の傷床内で徐々に上記のテトラペプチドに分解することにより、傷拘縮を減少する傾向があることも示している。
【００１５】
好ましくは、上記Ｘは生理学的な諸条件下においてＨに加水分解されるか別の方法により代謝される一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基である。さらに、好ましくは、上記Ｙは生理学的な諸条件下においてＯＨに加水分解されるか別の方法により代謝される一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である。
【００１６】
例えば、上記Ｘは一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキル基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルカルボニル基とすることができる。また、別の好ましい実施形態において、上記Ｘは一定のアミノ酸または一定の短いペプチド鎖とすることができ、この場合に、その活性化合物における全体のペプチドの長さは１２個以下のアミノ酸、好ましくは６個以下のアミノ酸である。
【００１７】
同様に、上記Ｙは一定のＣ１乃至Ｃ８のアルコキシ基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルアミノ基とすることができる。また、別の好ましい実施形態において、上記Ｙは一定のアミノ酸または一定の短いペプチド鎖とすることができ、この場合に、その活性化合物における全体のペプチドの長さは１２個以下のアミノ酸、好ましくは６個以下のアミノ酸である。
【００１８】
好ましくは、上記のＸおよびＹは共にＨであり、上記のテトラペプチドは誘導体化されていない。
【００１９】
本明細書において示されている上記活性化合物の定義はこれらの全ての活性な塩類および立体異性体に及ぶ。
【００２０】
好ましくは、上記薬剤は０．０００２重量％乃至１０重量％、さらに好ましくは０．０００５重量％乃至１重量％、さらに好ましくは０．００１重量％乃至０．１重量％、最も好ましくは０．００２重量％乃至０．０１重量％の上記ペプチドまたはペプチド誘導体を含有している。
【００２１】
好ましくは、本発明による使用方法において、上記薬物は局所的供給のための一定の固体の傷用包帯を含む。例えば、上記テトラペプチドまたはその誘導体は拘縮を減少するために一定の傷の表面に供給される一定の織り状または不織状の布地、一定のフィルムまたは一定のスポンジ等のような一定の固体の傷用包帯材料の中またはその上に分散できる。
【００２２】
上記の傷用包帯材料は生体内において吸収可能な一定の材料とすることができる。例えば、ポリラクチド／ポリグリコリド、または酸化再生セルロース（ＯＲＣ）等のような一定の合成または半合成のポリマーとすることができる。また、この材料はコラーゲン、ゼラチン、アルギネート、キトサン、ヒアルロン酸、グアー・ゴムまたはキサンタン・ガム等のような一定の生体ポリマーを含むことができる。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記ペプチドはＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９８／００１８０号および同第ＷＯ ９８／００４４６号において記載されている種類の構造を形成するためにコラーゲンと複合体化されている一定の酸化セルロースの基材中に分散されており、これらの文献の内容の全体は本明細書において参考文献として含まれる。例えば、上記の酸化セルロースは一定の凍結乾燥処理したコラーゲン・スポンジ体中に分散されている微粉砕処理したＯＲＣファイバーの形態にすることができる。このことにより、コラーゲンとの複合体化により生じる特定の治療的および共同的な作用と共に上記酸化セルロースの傷に対する持続された放出が行なえる。さらに、上記ＯＲＣ自体も上記において参照されている英国特許（ＧＢ）第９９２３２９１．０号において示されているように傷拘縮を減少する特性を有している。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、本発明による使用方法は一定の薬剤的に許容可能なキャリヤーの中に上記の活性物質を含有している一定の傷に局所的に供給するための一定の軟膏またはゲルの形態の一定の薬剤を提供する。適当なキャリヤーはヒドロキシエチル・セルロース、ヒドロキシメチル・セルロース、カルボキシメチル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース、およびこれらの混合物を含むセルロース誘導体を含有している各種ヒドロゲル、およびポリアクリル酸を含有している各種ヒドロゲル（カルボポール（Carbopols））を含む。さらに、適当なキャリヤーは、例えば、セトマクロゴル（cetomacrogol）乳化軟膏等の局所的薬物製剤において用いる各種のクリームおよび軟膏も含む。また、これらのキャリヤーはアルギネート（一定の増粘剤または刺激剤）、ベンジル・アルコール等の保存剤、リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ値を調整するための緩衝液、塩化ナトリウム等の容量オスモル濃度を調節するための物質、およびエチレン・ジアミン・テトラアセテート（ＥＤＴＡ）等の安定化剤を含むことができる。
【００２４】
上記ペプチドを含有している包帯は、例えば、ガンマ線照射により滅菌処理して、一定の微生物不透過性の容器の中に包装することができる。
【００２５】
本発明により提供される薬物は一定の傷または熱傷を負ったすぐ後にその傷または熱傷に供給することができる。
【００２６】
好ましくは、本発明により提供される薬物は一定の傷または熱傷を負ってから２日乃至７日目に供給され、この理由は、この時点がその傷または熱傷の拘縮が始まる時であるからである。また、別の好ましい実施形態において、本発明により提供される薬物は瘢痕拘縮を減少するために上皮形成が完了した後に一定の傷または熱傷に供給される。好ましくは、本発明により提供される薬物は一定の傷の上皮形成の完了前および完了後の両方において供給される。好ましくは、この供給は少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも４週間、最も好ましくは６週間以上にわたり続けられる。このことは組織の再造形が傷拘縮を生じて、瘢痕拘縮が傷治癒の開始後の一定の時間に一般的に開始してその傷の上皮形成の完了後においても継続する一定の長期間にわたる過程であるという事実を反映している。
【００２７】
好ましくは、上記の傷は一定の顆粒状の傷である。好ましくは、上記の傷は一定の全層の傷または熱傷である。好ましくは、上記全層の傷の面積は少なくとも５ｃｍ2 、さらに好ましくは少なくとも１０ｃｍ2 、最も好ましくは少なくとも２０ｃｍ2 である。好ましくは、この傷は一定の熱傷である。また、上記の薬剤は各種の胸部移植片または心臓ペースメーカーの移植片の領域内における拘縮の減少のために有用であることも予想される。
【００２８】
従って、別の態様において、本発明は傷拘縮を抑制するための一定の方法を提供しており、この方法は
（ａ）一定のシーケンスX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体を活性要素として含む一定の薬剤的に許容可能な組成物を供給する工程を含み、この場合に上記ＸはＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、上記ＹはＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基であり、さらに、
（ｂ）薬剤を必要とする一定の個人に対して一定の治療的に有効な量の上記薬剤的に許容可能な組成物を投与する工程を含む。
【００２９】
本特許出願が各種の内部傷の治療においても有用になり得ることが理解されると考える。上記の投与は上記ペプチドまたはペプチド誘導体の拘縮抑制作用を容易にする任意の手段により行なうことができる。好ましくは、この投与は局所的である。好ましくは、上記の薬物は、上記において列挙されているような、本発明による使用方法の好ましい実施形態のいずれかにより製造される。
【００３０】
次に、本発明の特定の実施形態を各添付図面に基づいて例示的にさらに説明する。
【００３１】
方法１
米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，９５７，９０２号において記載されている方法に類似している一定の方法により線維芽細胞母集団化コラーゲン・ゲル拘縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの抑制作用を決定した。
【００３２】
つまり、各種の線維芽細胞母集団化コラーゲン・ゲルを以下のように調製した。すなわち、新生児期の線維芽細胞（ＡＴＣＣにより供給されるHSF43SK）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ）において交会まで増殖した。これらの細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡにより収集して、計数してから遠心処理によりトリプシン溶液を除去した。その後、これらの細胞を１０6 個細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。
【００３３】
その後、以下の混合物、すなわち、８ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ、４ｍｌの上記細胞懸濁液、およびカリフォルニア州パロアルトのコラーゲン・コーポレーション社（Collagen Corporation）により供給される４ｍｌの水性ビトロゲン（VITROGEN）コラーゲン（濃度４ｍｇ／ｍｌ）を作成した。その後、この混合物を一定の２４個ウエル型プレート内に０．５ｍｌ／ウエルで分配して、１時間にわたり３７℃で自然にゲル化した。
【００３４】
各ゲルが硬化した後に、これらを無菌ピペットの先端部分により縁取りして自由に収縮できるようにしてから、さらに別の０．５ｍｌの分量のＦＢＳ／ＤＭＥＭを各ウエルに注意深く加えた。これらの分量はそれぞれ以下の活性成分をさらに含有していた。
無し（陰性対照）
１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、陽性対照）
３０μｇのテトラペプチド
３μｇのテトラペプチド
１．５μｇのテトラペプチド
２００ｎｇのテトラペプチド
１５０ｎｇのテトラペプチド
５ｎｇのテトラペプチド
【００３５】
存在する場合に、上記のテトラペプチドは０．５ｍｇ／ｍｌの一定濃度で以下の実施例１に従って調製され、０．１６５ｍｇ／ｍｌの各ゲル内における最終濃度を得た。各溶液を無菌状態でフィルター処理した。さらに、各増殖因子を上記の縁取りした各コラーゲン・ゲルに加える前にこれをその原液内において３７℃で１時間にわたり培養した。
【００３６】
１０日間にわたり各ゲルの写真を撮り、これらの写真からゲルの面積を測定することによりこれらのゲルの収縮を測定した。これらの結果を各図面に基づいて以下のようにまとめることができる。
【００３７】
図１ａにおいて、この棒グラフは線維芽細胞により母集団化した各コラーゲン・ゲルについての３日目におけるコラーゲン・ゲルの面積を示している。これらのゲルの全てが各ゲル内の線維芽細胞の増殖により大幅に縮んでいることが分かる。さらに、上記テトラペプチドを含有している各試験ゲルは陰性対照のゲルの収縮よりもわずかに少なく収縮しているが、統計的な有意差であるとは言えない。
【００３８】
次に、図１ｂにおいて、この図は６日目における図１ａの各ゲル・サンプルの面積を示している。これらのゲルの全てが各ゲル中の線維芽細胞増殖によりさらに縮んでいることが分かる。さらに、３μｇよりも少ない上記テトラペプチドを含有している各サンプルに比べて、これよりも高い濃度のテトラペプチドを含有している各サンプルが６日後のゲル面積の拘縮において統計的に有意差のある減少を示していることも明らかに分かる。さらに、同様の効果が図１ｃにおいて示されているように９日目においてさらに顕著になっている。
【００３９】
実施例１
上記テトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyを一定の完全自動化型のアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａペプチド・シンセサイザー中において調製した。すなわち、Fmoc/tBuを基礎とするペプチド合成の方法を使用し、この方法は酸性の不安定な側鎖の保護およびペプチド−樹脂結合に関連する塩基性の不安定な９−フルオレニルメトキシカルボニル・アミノ保護基の使用を含む。このペプチドはＦｍｏｃ−グリシン官能化型の４−アルコキシベンジル・アルコール樹脂（ワング・コーポレーション社（Wang Corporation））により合成されており、全てのアミノ酸が二重連結工程（double coupling cycles）によりそれぞれ組み込まれている。各合成工程は（１）アミン脱保護に先立つあらゆる遊離アミノ基のキャップ形成のための無水酢酸による処理、（２）有機塩基性物質のピペリジンによる処理によるＦｍｏｃの除去、および（３）次のアミノ酸の上記シーケンス内における連結を含む。この方法において、上記の所望とされるペプチドがそのＣ末端からＮ末端に向かって構築される。その後、このペプチドを室温において３時間にわたりＴＦＡ／エタンジオール／トリイソプロピルシラン／チオアニソールおよび水の一定の混合物により処理することにより上記樹脂から分離すると共に、側鎖の各種保護基を同時に除去した。その後、この樹脂をろ過により除去し、ＴＦＡをエバポレーションにより除いて、上記ペプチドをジエチル・エーテルによる沈殿およびろ過により単離した。その後、この未精製のペプチドを逆相ＨＰＬＣ処理および凍結乾燥処理により精製した。さらに、このペプチドの純度を確認するためにレーザー脱離質量分析および分析用ＨＰＬＣ処理を行なった。
【００４０】
実施例２
上記実施例１のペプチドを含有する一定の固体で生体吸収性のコラーゲン／ＯＲＣのスポンジ状包帯剤をＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９８／００１８０号において記載されているように調製した。つまり、米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，６１４，７９４号または同第（ＵＳ−Ａ）４，３２０，２０１号において記載されているように調製した上記の凍結乾燥処理したコラーゲンを０．０５ｍｌの酢酸中において１０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。その後、微粉砕処理したＯＲＣ粉末（微粉砕したサージセル（SURGICEL）布地）を上記懸濁液に１：３のＯＲＣ：コラーゲンの比率で加えて、３×３０秒にわたり低速で一定のワーリング（Waring）混合装置により均質化した。その後、上記ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で上記懸濁液に加えた。さらに、この複合懸濁液を１０分間にわたり一定の真空オーブン中において脱気した後に、一定のトレイ中に３ｍｍの深さに注いで吹付凍結処理した。その後、この凍結した懸濁液を一定の温度勾配設備を伴う一定のプログラム可能な凍結乾燥装置により凍結乾燥して脱水素熱的に架橋するか、米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第２，１５７，５２４号において記載されているような一定の溶媒乾燥処理により乾燥した。この包帯は拘縮を減少するために一定の大面積の熱傷に供給することに適している。
【００４１】
実施例３
拘縮の予防のために各種の傷に供給することに適している一定のゲル状軟膏を以下の配合により調製した。
カルボキシメチルセルロース ２．４％
ヒドロキシエチルセルロース ０．３％
塩化ナトリウム ０．２４％
プロピレン・グリコール ２０．２％
Gly-Pro-Ala-Gly ０．０１％
水 残りの量
【００４２】
上記無菌の薬剤ゲルを無菌条件下において配合した。
【００４３】
上記の各実施形態は例示のみを目的として説明されている。さらに、添付の特許請求の範囲に該当する多くの別の実施形態が当該技術分野において熟練している読者において明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１ａ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は３日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
【図１ｂ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は６日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
【図１ｃ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は９日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
【０００１】
本発明は傷拘縮の治療または予防、特に、熱傷による拘縮の予防において使用するための薬物の調製用の特定のペプチド類の使用に関する。
【０００２】
傷拘縮は一定の全層性で開講性の傷、特に全層性の熱傷の寸法を減少する過程である。この拘縮中に進展する張力および皮下の線維組織の形成により、奇形が生じ、特に、その傷が関節の一定領域に関連する場合にその関節の屈伸を固定する。これらの合併症は特に熱傷の治癒において一般に広まっている。
【０００３】
瘢痕性の拘縮は一定の治癒状態の瘢痕において生じる拘縮性の過程の結果であり、機能的または美顔的な奇形を生じる可能性のある望ましくない固定された硬質の瘢痕を生じる。一般に、傷拘縮は一定の不完全に上皮化した欠陥部分において生じるが、瘢痕拘縮は一定の上皮化して被覆された欠陥部分において生じる。この用語の「傷拘縮（wound contracture）」は傷拘縮および瘢痕拘縮の両方を含むものとして本明細書において用いられている。
【０００４】
傷拘縮および瘢痕拘縮はロス・ルドルフ（Ross Rudolph），ジェリー・バンデ・ベルグ（Jerry Vande Berg）およびＨ．ポール・エーリッヒ（H. Paul Ehrlich），「ウンド・ヒーリング：バイオケミカル・アンド・クリニカル・アスペクツ（Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects）」，Ｉ．Ｋ．コーヘン（I.K. Cohen），Ｒ．Ｆ．ディーゲルマン（R.F. Diegelman）およびＷ．Ｊ．リンドブラッド編集，Ｗ．Ｂ．サンダース・カンパニー（W.B. Saunders Company），９６頁乃至１１４頁において詳細に調べられており、この文献の内容全体が本明細書において参考文献として含まれる。
【０００５】
拘縮の有害な作用は皮膚表面の下部においても生じる可能性があり、深部の生体器官にも及ぶ。よく知られている例はデュピュイトラン拘縮（Dupuytren's contracture）における手掌腱膜の収縮および一定のシリコーン胸部移植片の周囲の包の収縮、および心臓ペースメーカー移植片における特定の合併症である。加えて、硬変性の肝臓内における収縮した線維症の瘢痕束は肝臓内の血管を圧縮して門脈圧亢進症に起因する可能性がある。さらに、別の内臓も十二指腸潰瘍の狭窄症、リウマチ性心疾患における心臓弁の拘縮、および傷害における尿道狭窄等のような拘縮の影響を受ける可能性がある。線維芽細胞および筋線維芽細胞は傷拘縮の機構に関連している。そこで、傷拘縮の抑制のために線維芽細胞および筋線維芽細胞の可動化、移動、接着または増殖に対して干渉する各種の物質または方法を使用することが提案されている。例えば、高い投与量のコルチゾンまたは関連の各種ステロイドが線維芽細胞増殖を抑制して傷拘縮を阻害することが示されている。不都合にも、これらのステロイドはこのような高い投与量で投与されるステロイドは臨床的な実施において許容し得ない副作用を生じる。
【０００６】
シアニドおよびジニトロフェノール等のような各種の細胞毒もまた傷拘縮を抑制することが報告されている。同様に、例えば、コルヒチン、ビンブラスチンおよびフェニルトイン（phenyltoin）等のような平滑筋の収縮を抑制する各種の薬物も傷拘縮を抑制することが報告されている。
【０００７】
実際の問題として、傷拘縮の調整は現在においては主に機械的および外科的である。外科医は一部の状況において傷拘縮の促進を望み、また、別の状況においては傷拘縮を抑制することを望む場合がある。以下の各種の方法、すなわち、（１）延長された副子による固定、（２）運動の範囲、（３）圧力、（４）全層皮膚移植、および（５）各種外科処置の考慮された計画が望ましくない瘢痕および傷拘縮を減少するために用いられている。
【０００８】
また、未処理状態のガーゼ等のような一定の付着性の包帯が拘縮を遅延するが予防しないことが見出されている。これに対して、活性状態の拘縮が開始する前に傷に対して供給されるナイロン等のような特定の合成フィルムは拘縮を抑制できる。
【０００９】
また、傷拘縮の開始前における一定の開口状態の傷への一定の全層の皮膚移植片の供給が傷拘縮を妨げるために有効であることが見出されている。しかしながら、費用、移植する皮膚の供給源、移植片の拒絶反応、二次感染、および関連の手術による危険性等を含む重要な問題が皮膚移植に付随している。また、薄いまたはメッシュ状の皮膚移植片を全層の皮膚移植片の代わりに供給した場合に深刻な拘縮が依然として観察される。
【００１０】
米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，９５７，９０２号は一定のアミノ酸シーケンスArg-Gly-GluおよびそのＮ−末端およびＣ−末端の各誘導体を含む各種ペプチドの傷に対する供給による傷拘縮の抑制を記載している。
【００１１】
さらに、現在においては、特定の別のペプチドが傷および瘢痕の拘縮を抑制または減少するための能力を示す生体外における有望な作用を示すことが見出されている。
【００１２】
従って、本発明は傷拘縮の治療または予防において使用するための一定の薬物の調製のためのX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yというシーケンスを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法を提供しており、この場合に、ＸはＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、ＹはＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である。
【００１３】
初期の特許出願の英国特許出願（ＧＢ−Ａ）第２３２１１９１号は糖尿病性の潰瘍等のような慢性の傷の治療のために上記のようなペプチド類の使用を記載している。
【００１４】
現在において、一定のテトラペプチドのGly-Pro-Ala-Glyがコラーゲン・ゲル収縮を抑制するために予想外に有効であることが以下の方法１において詳細に記載されている生体外線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮モデルにより見出されている。この作用は新生児期および胎児期の両方において観察されている。さらに、上記のテトラペプチドが線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮における特定の増殖因子の刺激作用を抑制することも見出されている。さらに、これらの結果は上記のテトラペプチドが生体内における傷拘縮を減少するためにも有効であるという見込みを明らかに示している。さらに、上記の結果は上記テトラペプチドの多数の誘導体が一定の包帯剤として用いられる場合に類似の活性によるか、この誘導体が生体内において一定の傷床内で徐々に上記のテトラペプチドに分解することにより、傷拘縮を減少する傾向があることも示している。
【００１５】
好ましくは、上記Ｘは生理学的な諸条件下においてＨに加水分解されるか別の方法により代謝される一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基である。さらに、好ましくは、上記Ｙは生理学的な諸条件下においてＯＨに加水分解されるか別の方法により代謝される一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である。
【００１６】
例えば、上記Ｘは一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキル基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルカルボニル基とすることができる。また、別の好ましい実施形態において、上記Ｘは一定のアミノ酸または一定の短いペプチド鎖とすることができ、この場合に、その活性化合物における全体のペプチドの長さは１２個以下のアミノ酸、好ましくは６個以下のアミノ酸である。
【００１７】
同様に、上記Ｙは一定のＣ１乃至Ｃ８のアルコキシ基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルアミノ基とすることができる。また、別の好ましい実施形態において、上記Ｙは一定のアミノ酸または一定の短いペプチド鎖とすることができ、この場合に、その活性化合物における全体のペプチドの長さは１２個以下のアミノ酸、好ましくは６個以下のアミノ酸である。
【００１８】
好ましくは、上記のＸおよびＹは共にＨであり、上記のテトラペプチドは誘導体化されていない。
【００１９】
本明細書において示されている上記活性化合物の定義はこれらの全ての活性な塩類および立体異性体に及ぶ。
【００２０】
好ましくは、上記薬剤は０．０００２重量％乃至１０重量％、さらに好ましくは０．０００５重量％乃至１重量％、さらに好ましくは０．００１重量％乃至０．１重量％、最も好ましくは０．００２重量％乃至０．０１重量％の上記ペプチドまたはペプチド誘導体を含有している。
【００２１】
好ましくは、本発明による使用方法において、上記薬物は局所的供給のための一定の固体の傷用包帯を含む。例えば、上記テトラペプチドまたはその誘導体は拘縮を減少するために一定の傷の表面に供給される一定の織り状または不織状の布地、一定のフィルムまたは一定のスポンジ等のような一定の固体の傷用包帯材料の中またはその上に分散できる。
【００２２】
上記の傷用包帯材料は生体内において吸収可能な一定の材料とすることができる。例えば、ポリラクチド／ポリグリコリド、または酸化再生セルロース（ＯＲＣ）等のような一定の合成または半合成のポリマーとすることができる。また、この材料はコラーゲン、ゼラチン、アルギネート、キトサン、ヒアルロン酸、グアー・ゴムまたはキサンタン・ガム等のような一定の生体ポリマーを含むことができる。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記ペプチドはＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９８／００１８０号および同第ＷＯ ９８／００４４６号において記載されている種類の構造を形成するためにコラーゲンと複合体化されている一定の酸化セルロースの基材中に分散されており、これらの文献の内容の全体は本明細書において参考文献として含まれる。例えば、上記の酸化セルロースは一定の凍結乾燥処理したコラーゲン・スポンジ体中に分散されている微粉砕処理したＯＲＣファイバーの形態にすることができる。このことにより、コラーゲンとの複合体化により生じる特定の治療的および共同的な作用と共に上記酸化セルロースの傷に対する持続された放出が行なえる。さらに、上記ＯＲＣ自体も上記において参照されている英国特許（ＧＢ）第９９２３２９１．０号において示されているように傷拘縮を減少する特性を有している。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、本発明による使用方法は一定の薬剤的に許容可能なキャリヤーの中に上記の活性物質を含有している一定の傷に局所的に供給するための一定の軟膏またはゲルの形態の一定の薬剤を提供する。適当なキャリヤーはヒドロキシエチル・セルロース、ヒドロキシメチル・セルロース、カルボキシメチル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース、およびこれらの混合物を含むセルロース誘導体を含有している各種ヒドロゲル、およびポリアクリル酸を含有している各種ヒドロゲル（カルボポール（Carbopols））を含む。さらに、適当なキャリヤーは、例えば、セトマクロゴル（cetomacrogol）乳化軟膏等の局所的薬物製剤において用いる各種のクリームおよび軟膏も含む。また、これらのキャリヤーはアルギネート（一定の増粘剤または刺激剤）、ベンジル・アルコール等の保存剤、リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ値を調整するための緩衝液、塩化ナトリウム等の容量オスモル濃度を調節するための物質、およびエチレン・ジアミン・テトラアセテート（ＥＤＴＡ）等の安定化剤を含むことができる。
【００２４】
上記ペプチドを含有している包帯は、例えば、ガンマ線照射により滅菌処理して、一定の微生物不透過性の容器の中に包装することができる。
【００２５】
本発明により提供される薬物は一定の傷または熱傷を負ったすぐ後にその傷または熱傷に供給することができる。
【００２６】
好ましくは、本発明により提供される薬物は一定の傷または熱傷を負ってから２日乃至７日目に供給され、この理由は、この時点がその傷または熱傷の拘縮が始まる時であるからである。また、別の好ましい実施形態において、本発明により提供される薬物は瘢痕拘縮を減少するために上皮形成が完了した後に一定の傷または熱傷に供給される。好ましくは、本発明により提供される薬物は一定の傷の上皮形成の完了前および完了後の両方において供給される。好ましくは、この供給は少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも４週間、最も好ましくは６週間以上にわたり続けられる。このことは組織の再造形が傷拘縮を生じて、瘢痕拘縮が傷治癒の開始後の一定の時間に一般的に開始してその傷の上皮形成の完了後においても継続する一定の長期間にわたる過程であるという事実を反映している。
【００２７】
好ましくは、上記の傷は一定の顆粒状の傷である。好ましくは、上記の傷は一定の全層の傷または熱傷である。好ましくは、上記全層の傷の面積は少なくとも５ｃｍ2 、さらに好ましくは少なくとも１０ｃｍ2 、最も好ましくは少なくとも２０ｃｍ2 である。好ましくは、この傷は一定の熱傷である。また、上記の薬剤は各種の胸部移植片または心臓ペースメーカーの移植片の領域内における拘縮の減少のために有用であることも予想される。
【００２８】
従って、別の態様において、本発明は傷拘縮を抑制するための一定の方法を提供しており、この方法は
（ａ）一定のシーケンスX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体を活性要素として含む一定の薬剤的に許容可能な組成物を供給する工程を含み、この場合に上記ＸはＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、上記ＹはＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基であり、さらに、
（ｂ）薬剤を必要とする一定の個人に対して一定の治療的に有効な量の上記薬剤的に許容可能な組成物を投与する工程を含む。
【００２９】
本特許出願が各種の内部傷の治療においても有用になり得ることが理解されると考える。上記の投与は上記ペプチドまたはペプチド誘導体の拘縮抑制作用を容易にする任意の手段により行なうことができる。好ましくは、この投与は局所的である。好ましくは、上記の薬物は、上記において列挙されているような、本発明による使用方法の好ましい実施形態のいずれかにより製造される。
【００３０】
次に、本発明の特定の実施形態を各添付図面に基づいて例示的にさらに説明する。
【００３１】
方法１
米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，９５７，９０２号において記載されている方法に類似している一定の方法により線維芽細胞母集団化コラーゲン・ゲル拘縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの抑制作用を決定した。
【００３２】
つまり、各種の線維芽細胞母集団化コラーゲン・ゲルを以下のように調製した。すなわち、新生児期の線維芽細胞（ＡＴＣＣにより供給されるHSF43SK）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ）において交会まで増殖した。これらの細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡにより収集して、計数してから遠心処理によりトリプシン溶液を除去した。その後、これらの細胞を１０6 個細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。
【００３３】
その後、以下の混合物、すなわち、８ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ、４ｍｌの上記細胞懸濁液、およびカリフォルニア州パロアルトのコラーゲン・コーポレーション社（Collagen Corporation）により供給される４ｍｌの水性ビトロゲン（VITROGEN）コラーゲン（濃度４ｍｇ／ｍｌ）を作成した。その後、この混合物を一定の２４個ウエル型プレート内に０．５ｍｌ／ウエルで分配して、１時間にわたり３７℃で自然にゲル化した。
【００３４】
各ゲルが硬化した後に、これらを無菌ピペットの先端部分により縁取りして自由に収縮できるようにしてから、さらに別の０．５ｍｌの分量のＦＢＳ／ＤＭＥＭを各ウエルに注意深く加えた。これらの分量はそれぞれ以下の活性成分をさらに含有していた。
無し（陰性対照）
１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、陽性対照）
３０μｇのテトラペプチド
３μｇのテトラペプチド
１．５μｇのテトラペプチド
２００ｎｇのテトラペプチド
１５０ｎｇのテトラペプチド
５ｎｇのテトラペプチド
【００３５】
存在する場合に、上記のテトラペプチドは０．５ｍｇ／ｍｌの一定濃度で以下の実施例１に従って調製され、０．１６５ｍｇ／ｍｌの各ゲル内における最終濃度を得た。各溶液を無菌状態でフィルター処理した。さらに、各増殖因子を上記の縁取りした各コラーゲン・ゲルに加える前にこれをその原液内において３７℃で１時間にわたり培養した。
【００３６】
１０日間にわたり各ゲルの写真を撮り、これらの写真からゲルの面積を測定することによりこれらのゲルの収縮を測定した。これらの結果を各図面に基づいて以下のようにまとめることができる。
【００３７】
図１ａにおいて、この棒グラフは線維芽細胞により母集団化した各コラーゲン・ゲルについての３日目におけるコラーゲン・ゲルの面積を示している。これらのゲルの全てが各ゲル内の線維芽細胞の増殖により大幅に縮んでいることが分かる。さらに、上記テトラペプチドを含有している各試験ゲルは陰性対照のゲルの収縮よりもわずかに少なく収縮しているが、統計的な有意差であるとは言えない。
【００３８】
次に、図１ｂにおいて、この図は６日目における図１ａの各ゲル・サンプルの面積を示している。これらのゲルの全てが各ゲル中の線維芽細胞増殖によりさらに縮んでいることが分かる。さらに、３μｇよりも少ない上記テトラペプチドを含有している各サンプルに比べて、これよりも高い濃度のテトラペプチドを含有している各サンプルが６日後のゲル面積の拘縮において統計的に有意差のある減少を示していることも明らかに分かる。さらに、同様の効果が図１ｃにおいて示されているように９日目においてさらに顕著になっている。
【００３９】
実施例１
上記テトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyを一定の完全自動化型のアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａペプチド・シンセサイザー中において調製した。すなわち、Fmoc/tBuを基礎とするペプチド合成の方法を使用し、この方法は酸性の不安定な側鎖の保護およびペプチド−樹脂結合に関連する塩基性の不安定な９−フルオレニルメトキシカルボニル・アミノ保護基の使用を含む。このペプチドはＦｍｏｃ−グリシン官能化型の４−アルコキシベンジル・アルコール樹脂（ワング・コーポレーション社（Wang Corporation））により合成されており、全てのアミノ酸が二重連結工程（double coupling cycles）によりそれぞれ組み込まれている。各合成工程は（１）アミン脱保護に先立つあらゆる遊離アミノ基のキャップ形成のための無水酢酸による処理、（２）有機塩基性物質のピペリジンによる処理によるＦｍｏｃの除去、および（３）次のアミノ酸の上記シーケンス内における連結を含む。この方法において、上記の所望とされるペプチドがそのＣ末端からＮ末端に向かって構築される。その後、このペプチドを室温において３時間にわたりＴＦＡ／エタンジオール／トリイソプロピルシラン／チオアニソールおよび水の一定の混合物により処理することにより上記樹脂から分離すると共に、側鎖の各種保護基を同時に除去した。その後、この樹脂をろ過により除去し、ＴＦＡをエバポレーションにより除いて、上記ペプチドをジエチル・エーテルによる沈殿およびろ過により単離した。その後、この未精製のペプチドを逆相ＨＰＬＣ処理および凍結乾燥処理により精製した。さらに、このペプチドの純度を確認するためにレーザー脱離質量分析および分析用ＨＰＬＣ処理を行なった。
【００４０】
実施例２
上記実施例１のペプチドを含有する一定の固体で生体吸収性のコラーゲン／ＯＲＣのスポンジ状包帯剤をＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９８／００１８０号において記載されているように調製した。つまり、米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第４，６１４，７９４号または同第（ＵＳ−Ａ）４，３２０，２０１号において記載されているように調製した上記の凍結乾燥処理したコラーゲンを０．０５ｍｌの酢酸中において１０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。その後、微粉砕処理したＯＲＣ粉末（微粉砕したサージセル（SURGICEL）布地）を上記懸濁液に１：３のＯＲＣ：コラーゲンの比率で加えて、３×３０秒にわたり低速で一定のワーリング（Waring）混合装置により均質化した。その後、上記ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で上記懸濁液に加えた。さらに、この複合懸濁液を１０分間にわたり一定の真空オーブン中において脱気した後に、一定のトレイ中に３ｍｍの深さに注いで吹付凍結処理した。その後、この凍結した懸濁液を一定の温度勾配設備を伴う一定のプログラム可能な凍結乾燥装置により凍結乾燥して脱水素熱的に架橋するか、米国特許出願（ＵＳ−Ａ）第２，１５７，５２４号において記載されているような一定の溶媒乾燥処理により乾燥した。この包帯は拘縮を減少するために一定の大面積の熱傷に供給することに適している。
【００４１】
実施例３
拘縮の予防のために各種の傷に供給することに適している一定のゲル状軟膏を以下の配合により調製した。
カルボキシメチルセルロース ２．４％
ヒドロキシエチルセルロース ０．３％
塩化ナトリウム ０．２４％
プロピレン・グリコール ２０．２％
Gly-Pro-Ala-Gly ０．０１％
水 残りの量
【００４２】
上記無菌の薬剤ゲルを無菌条件下において配合した。
【００４３】
上記の各実施形態は例示のみを目的として説明されている。さらに、添付の特許請求の範囲に該当する多くの別の実施形態が当該技術分野において熟練している読者において明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１ａ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は３日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
【図１ｂ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は６日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
【図１ｃ】皮膚線維芽細胞母集団化型コラーゲン・ゲル収縮におけるテトラペプチドGly-Pro-Ala-Glyの種々の濃度における作用を示しており、この測定は９日目の時点において１０ｎｇの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の存在下に行なわれている。
Claims (13)
- 傷拘縮の治療または予防において使用するための一定の薬物を調整するための、一定のシーケンスのX-NH-Gly-Pro-Ala-Gly-CO-Yを含む一定のペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法において、前記ＸがＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基であり、前記ＹがＯＨまたは一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である使用方法。
- 前記Ｘが生理学的な諸条件下においてＨに加水分解されるかその他の方法で代謝される一定の薬剤的に許容可能なＮ−末端基である請求項１に記載の使用方法。
- 前記Ｙが生理学的な諸条件下においてＯＨに加水分解されるかその他の方法で代謝される一定の薬剤的に許容可能なＣ−末端基である請求項１に記載の使用方法。
- 前記Ｘが一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキル基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルカルボニル基または一定のアミノ酸である請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の使用方法。
- 前記Ｙが一定のＣ１乃至Ｃ８のアルコキシ基または一定のＣ１乃至Ｃ８のアルキルアミノ基または一定のアミノ酸である請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の使用方法。
- 前記ＸおよびＹが共にＨである請求項１に記載の使用方法。
- 前記薬物が０．００１重量％乃至１重量％の前記ペプチドまたはペプチド誘導体を含有している請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の使用方法。
- 前記薬物が前記ペプチドまたはペプチド誘導体を上部または内部に分散している一定の固体の傷用包帯を含む請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の使用方法。
- 前記固体の傷用包帯が生体内において吸収可能な一定の固体の材料を含む請求項８に記載の使用方法。
- 前記固体の材料がコラーゲンに対して複合体化している酸化セルロースを含む請求項９に記載の使用方法。
- 前記傷拘縮が熱傷拘縮を含む請求項１乃至請求項１０のいずれかに記載の使用方法。
- 前記薬物が一定の傷に供給するための一定の軟膏またはゲルを含む請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載の使用方法。
- 前記治療が上皮形成の完了後における一定の傷に対する供給を含む請求項１乃至請求項１２のいずれかに記載の使用方法。
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