KR20230066268A

KR20230066268A - 해파리 콜라겐 용도

Info

Publication number: KR20230066268A
Application number: KR1020227038544A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 먼즈 스프라그
Original assignee: 젤라진 리미티드
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2023-05-15
Also published as: CA3178844A1; WO2021205167A1; US20230148082A1; EP4132599A1; JP2023521338A; GB202005141D0; CN115551561A

Abstract

본 발명은 상처 치료에서의 해파리 콜라겐의 사용 및 상기 해파리 콜라겐의 제조에 관한 것이다.

Description

해파리 콜라겐 용도

본 발명은 상처 치료에서의 사용을 위한 해파리 콜라겐 및 이의 제조에 관한 것이다.

상처 치유는 다양한 면역 체계와 생물학적 체계 사이의 조정된 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 장기 상처는 여전히 어려운 임상 문제로, 연간 약 600만 명의 환자에게 높은 경제적 충격으로 영향을 미친다.

상처 치유는 부상 후 피부(또는 다른 장기 조직)가 스스로 회복되는 과정이다. 정상 피부에서 표피(가장 바깥쪽 층)와 진피(안쪽 또는 더 깊은 층)는 정상 상태의 평형 상태로 존재하며 외부 환경으로부터 보호된다. 피부가 찢어지면 정상적인(생리학적) 상처 치유 과정이 시작된다. 상처 치유의 고전적인 모델은 3 또는 4개의 순차적이지만 겹치는 단계를 포함한다:

1단계: 지혈.

2단계: 염증.

3단계: 확산.

4단계: 리모델링.

피부가 손상되면 일련의 복잡한 생화학적 사건이 밀접하게 조직된 캐스케이드로 발생하여 손상을 복구한다. 여러 가지 잠재적 자극(국소 조직 허혈, 바이오버든, 괴사 조직, 반복 외상 등)으로 인해 상처는 염증 단계에서 정체되어 상처의 만성화에 기여할 수 있다. 만성 상처의 주요 구성 요소 중 하나는 MMP(기질 금속단백분해효소) 수치의 상승이다. 높은 수준에서 MMP는 생존할 수 없는 콜라겐뿐만 아니라 생존 가능한 콜라겐도 분해한다. 또한, 만성 상처의 섬유아세포는 MMP의 활성을 제어하기에 적절한 수준에서 MMP의 조직 억제제(TIMP)를 분비하지 않을 수 있다. 이러한 사건은 세포 이동에 필요한 스캐폴드의 형성을 방지하고 궁극적으로 세포외 기질(ECM) 및 과립화 조직의 형성을 방지한다. 당뇨병성 족부궤양을 포함한 만성 상처의 경우, 관련된 만성 미생물 감염과 염증의 조합으로 인해 모세혈관 저하(혈류 감소) 및 절단이 발생할 수 있다. 따라서, 당뇨병성 족부궤양(DFU)을 표적으로 하는 새로운 약제는 환부에 혈류를 자극하고 상처 치유를 촉진하는 능력을 유리하게 제공할 수 있다.

콜라겐 기반 상처 드레싱은 상처에서 '희생 기질'로 작용하여 MMP 수치 상승 문제를 해결하는 데 고유하게 적합한 것으로 나타났다. 또한 콜라겐 분해 산물이 과립화 조직 형성에 필요한 다양한 세포 유형에 대해 화학주성인 것으로 입증되었다. 또한 콜라겐 기반 드레싱은 상처 삼출물을 흡수하고 습한 상처 환경을 유지하는 능력이 있다.

겔, 페이스트, 중합체, 산화 재생 셀룰로스(ORC) 및 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)과 같은 다양한 담체/결합제를 사용하는 다양한 콜라겐 드레싱을 사용할 수 있다. 이러한 제품 내의 콜라겐은 소, 돼지, 말 또는 조류 공급원에서 유래하는 경향이 있으며, 이는 비항원성으로 만들기 위해 정제된다. 그러나, 열악한 혈관신생 특성, 질병 및 바이러스 전파의 위험 증가, 및 이러한 콜라겐을 수득하는 것과 관련된 상당한 비용을 포함하여 이러한 콜라겐 유형의 사용과 관련된 많은 단점이 있다.

따라서, 상기 단점을 나타내지 않으면서 상처 치료에 사용하기에 적합한 콜라겐 공급원이 특히 유리할 것이다.

본 발명은 상처 치료에서의 사용을 위한 해파리 콜라겐에 관한 것이다. 하기에 제시된 생체 내 및 시험관 내 데이터로부터 명백할 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물이 포유류 콜라겐(예를 들어, 소)에 대한 대안으로서 상처 치료에 유용하며, 동등한 결과를 나타내고 혈관신생 특성, 증가된 안정성, 낮은 면역원성 및 낮은 바이러스 이동 및 질병/프리온 전파 위험과 같은 여러 우수한 품질을 제공한다는 것을 발견하였다. 이는 포유류 콜라겐과 비교하여 해파리 콜라겐의 물리화학적 및 아미노산 특성이 크게 상이하다는 점을 감안할 때 완전히 예상치 못한 발견이다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 상처 치료에서의 사용을 위한 조성물로서 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제2 양태는 적어도 하기의 단계를 포함하는 상기 언급된 해파리 콜라겐의 제조 방법에 관한 것이다:

i) 해파리 콜라겐 공급원으로부터 산성 가용성 콜라겐을 추출하는 단계; 및

ii) 상기 해파리 콜라겐을 정제하여 정제된 해파리 콜라겐의 용액을 제공하는 단계.

이제 본 발명의 실시형태가 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 설명될 것이다:
도 1은 캘리퍼스 측정에 의해 결정된 3일차부터 7일차까지 군 평균 너비(mm)의 변화를 보여준다.
도 2는 형태 측정에 의해 결정된 3일차부터 7일차까지 군 평균 너비(mm)의 변화를 보여준다.
도 3은 3일차부터 7일차까지 군 평균 재상피화의 변화(%)를 보여준다.
도 4는 3일차에서 7일차까지 군 평균 조직 과립화 점수(4A) 및 상처 부위 과립화의 평균 백분율(%)(4B)의 변화를 보여준다.
도 5는 Tegaderm 단독군의 H&E 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A), B) 및 C)는 3일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타내고, 패널 D), E) 및 f)는 7일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타낸다.
도 6은 해파리 콜라겐 스펀지 군에서 H&E 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A), B) 및 C)는 3일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타내고, 패널 D), E) 및 f)는 7일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타낸다.
도 7은 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트 군의 H&E 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A), B) 및 C)는 3일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타내고, 패널 D), E) 및 f)는 7일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타낸다.
도 8은 가교된 해파리 콜라겐 스펀지 군에서 H&E 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A), B) 및 C)는 3일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타내고, 패널 D), E) 및 f)는 7일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타낸다.
도 9는 Purocol® 군의 H&E 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A), B) 및 C)는 3일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타내고, 패널 D), E) 및 f)는 7일차에 수집된 상처 섹션의 이미지를 나타낸다.
도 10은 3일차와 7일차에 상이한 처리군의 콜라겐 I 염색 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다. 패널 A)는 3일차의 Tegaderm 군의 상처 섹션을 보여주고, 패널 B)는 7일차의 Tegaderm 군의 상처 섹션을 보여주고, 패널 C)는 3일차의 해파리 콜라겐 스펀지 군의 상처 섹션을 보여주고, 패널 D)는 7일차의 해파리 콜라겐 스펀지 군의 상처 섹션을 보여주고, E)는 3일차의 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트 군의 상처 섹션을 보여주고, 패널 F)는 7일에 화학적으로 변형된(티올화) 콜라겐 페이스트 그룹의 상처 섹션을 보여주고, 패널 G)는 3일차의 가교된 해파리 콜라겐 스펀지 그룹의 상처 단면을 나타내고, 패널 H)는 7일째에 가교된 해파리 콜라겐 스펀지 군의 상처 섹션을 나타내고, 패널 I)는 3일차의 Puracol® 군의 상처 섹션을 보여주고, 패널 L)은 7일차의 Puracol® 군의 상처 섹션을 보여준다.
도 11은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 Tegaderm 단독 군(3일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 12는 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 Tegaderm 단독 군(7일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 13은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 해파리 콜라겐 스펀지 군(3일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 14는 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 해파리 콜라겐 스펀지 군(7일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 15는 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트 군(3일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 16은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트 군(7일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 17은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 가교 해파리 콜라겐 스펀지 군(3일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 18은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 가교 해파리 콜라겐 스펀지 군(7일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 19는 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 Puracol® 군(3일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 20은 특정 내피 세포 마커인 CD31로 표지된 Puracol® 군(7일차)의 상처 섹션의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 21은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "시간 경과에 따른 잔여 상처 면적 %" 데이터로서 처리군의 상처 봉합 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); 비가교 스펀지; 0.5% EDC XL-분말; 1.0% EDC XL-분말; Promogran™).
도 22는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "% 상처 수축" 데이터로서 처리군의 상처 수축 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); 비가교 스펀지; 0.5% EDC XL-분말; 1.0% EDC XL-분말; Promogran™).
도 23은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 상이한 처리군 사이에서 상처 후 4일차에 처음 측정 가능한 "% 상처 재상피화"로서 상처의 재상피화에 대한 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); 비가교 스펀지; 0.5% EDC XL-분말; 1.0% EDC XL-분말; Promogran™).
도 24는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델(대략 동일 스케일)에서 각 실험군의 상처의 조직학적 외관의 대표적인 예를 도시한다. 도 25에서 각 상처의 중앙 영역을 더 높은 배율로 확대한 모습을 볼 수 있다.
도 25는 도 24에 표시된 상처의 조직학적 외관의 대표적인 예의 중앙 영역의 고배율 이미지를 도시한다.
도 26은 (A) 8일, (B) 12일, 및 (C) 16일에 1% EDC 가교 해파리 콜라겐 분말이 수화된 덩어리의 점진적인 혈관형성(V)을 나타내는 효과를 도시한다.
도 27은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "시간 경과에 따른 잔여 상처 면적 %" 데이터로서 모든 처리군의 상처 봉합 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); 1.0% EDC XL-분말; 티올화 분말; Integra® 유동성 매트릭스. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일, n=4일 42 내지 63).
도 28은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "시간 경과에 따른 잔여 상처 면적 %" 데이터로서 시험된 모든 해파리 콜라겐 처리군에 대한 상처 봉합 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).
도 29는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "시간 경과에 따른 잔여 상처 면적 %" 데이터로서 티올화 분말 및 Integra FM 처리군에 대한 상처 봉합 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).
도 30은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "% 상처 수축" 데이터로서 처리군의 상처 수축 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); XL-스펀지; 1.0% EDC XL-분말; 티올화 분말; Integra® 유동성 매트릭스. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일, n=4일 42 내지 63).
도 31은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "잔여 상처 수축 %" 데이터로서 시험된 모든 해파리 콜라겐 처리군에 대한 상처 수축 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).
도 32는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 "상처 수축 %" 데이터로서 티올화 분말 및 Integra FM 처리군에 대한 상처 수축 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).
도 33은 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 상이한 처리군 사이에서 상처 후 4일차에 처음 측정 가능한 "% 상처 재상피화"로서 상처의 재상피화에 대한 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였고 시험군은 다음과 같았다: 대조군(필름 드레싱만); 1.0% EDC XL-분말; 티올화 분말; Integra® 유동성 매트릭스. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일, n=4일 42 내지 63).
도 34는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 상이한 처리군 사이에서 상처 후 4일차에 처음 측정 가능한 "% 상처 재상피화"로서 시험된 모든 해파리 콜라겐 처리군에 대한 상처의 재상피화에 대한 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).
도 35는 db/db(BKS.CG-m Dock 7m +/_+ Leprdb/J) 당뇨병 마우스 모델에서 상이한 처리군 사이에서 상처 후 4일차에 처음 측정 가능한 "% 상처 재상피화"로서 시험된 티올화 분말 및 Integra FM 처리군에 대한 상처의 재상피화에 대한 프로파일을 도시한다. 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 시험군의 모든 동물에 대해 표시된다 - 평균 ± s.e.m.(n=12 내지 35일).

하기 상세한 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부 사항이 제시된다. 본 발명의 실시형태는 청구범위의 범주 내에 여전히 남아 있으면서 이러한 특정 세부 사항 없이 실시될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은 상처 치료에서의 사용을 위한 조성물로서, 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물을 제공한다.

문구 '상처의 치료' 또는 '상처 치료'는 손상 후 피부 및 임의의 관련 조직이 스스로 회복되는 복잡한 과정을 돕는 임의의 치료를 지칭한다. 해파리 콜라겐의 사용으로 이익을 얻을 수 있는 상처의 예는 욕창, 이식 부위, 외과적 상처, 궤양, 화상(열, 화학적 또는 전기적), 열상, 찰과상, 천자, 박리, 장액종 및/또는 혈종이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 상처는 수포성 표피박리증과 관련이 없다.

일부 실시형태에서, 해파리 콜라겐은 가수분해물 형태가 아니다. "가수분해물 형태"는 열 또는 프로테아제/콜라게나제 활성에 의해 분해되어 콜라겐 펩티드 및 젤라틴 유사 분자로 정의된 콜라겐 단편을 생성하는 콜라겐의 의미를 포함한다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 아텔로 형태일 수 있다. "아텔로 형태"는 인간에서 항원성을 유도하는 것으로 알려진 N- 및 C-말단 텔로펩티드 성분을 제거하여 수득된 콜라겐의 저-면역원성 유도체의 의미를 포함한다. 텔로펩티드는 일반적으로 유형 I 펩신으로 콜라겐을 처리하여 제거된다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 텔로 형태일 수 있다. "텔로 형태"는 텔로펩티드를 포함하는 가용성 콜라겐을 생성하는 산성 조건에서 추출된 콜라겐의 의미를 포함한다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 티올화될 수 있다. 용어 '티올화'는 티올과 반응하여 -SH 기 또는 '티올' 기가 도입된 해파리 콜라겐을 지칭하기 위한 것이다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 가교될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 '가교'는 공유 결합을 통한 2개의 독립적인 콜라겐 분자의 연결을 지칭한다. 바람직하게는, 가교될 콜라겐 분자는 콜라겐 섬유의 형태로 섬유간 가교가 발생한다. 가교된 티올화 해파리 콜라겐을 생성하기 위해, '가교 작용제' 또는 '가교제'가 사용될 수 있다. 용어 '가교 작용제' 또는 '가교제'는 특정 조건 하에서 2개의 독립적인 분자 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 작용제를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 가교제는 2개의 독립적인 콜라겐 분자를 공유적으로 연결하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 가교될 콜라겐 분자는 콜라겐 섬유 형태이다. 바람직하게는 피브릴간 가교가 일어난다. 일부 경우에, 가교제는 전형적으로 탄화수소 사슬에 의해 함께 연결된 2개 이상의 반응성 작용기로 구성된다. 2개 이상의 작용기는 반드시 동일할 필요는 없다. 탄화수소 사슬의 길이는 작용기 사이의 거리를 제어하기 위해 변경될 수도 있다. 본 발명의 맥락에서 탄화수소 사슬의 정확한 길이는 제한하려는 것이 아니다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 가교되지 않을 수 있다.

해파리 콜라겐의 공급원은 사이포조아(Scyphozoa) 아문으로부터 유래할 수 있다. 상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐의 공급원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 근구해파리목(리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo)를 포함하나 이에 제한되지 않음), 로필레마 에스쿨렌툼(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 스토몰로푸스 멜레아그리스(Stomolophus meleagris), 카시오페아(Cassiopea) 종(업사이드-다운(upside-down) 해파리)(카시오페아 안드로메다(Cassiopea andromeda)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 세마에오스테아제(Semaeostomease) 목(아우렐리아(Aurelia) 종 포함) 및 기타 종, 예컨대 네모필레마 노무라이(Nemopilema nomurai), 로필레마 에스쿨렌툼(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 스토몰로푸스 멜레아그리스(Stomolophus meleagris), 또는 이들의 임의의 조합. 바람직하게는 해파리 콜라겐의 공급원은 리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo)이다. 따라서, 콜라겐은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo) 콜라겐을 포함할 수 있다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 적어도 1 mg/mL의 농도를 가질 수 있다. 사용될 수 있는 해파리 콜라겐의 최대 농도는 50 mg/mL인 것으로 예상된다. 따라서, 해파리 콜라겐의 농도는 1 mg/mL 내지 50 mg/mL, 2 mg/mL 내지 50 mg/mL, 3 mg/mL 내지 50 mg/mL, 4 mg/mL 내지 50 mg/mL, 5 mg/mL 내지 50 mg/mL, 6 mg/mL 내지 50 mg/mL, 7 mg/mL 내지 50 mg/mL, 8 mg/mL 내지 50 mg/mL, 9 mg/mL 내지 50 mg/mL, 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 11 mg/mL 내지 50 mg/mL, 12 mg/mL 내지 50 mg/mL, 13 mg/mL 내지 50 mg/mL, 14 mg/mL 내지 50 mg/mL, 15 mg/mL 내지 50 mg/mL, 16 mg/mL 내지 50 mg/mL, 17 mg/mL 내지 50 mg/mL, 18 mg/mL 내지 50 mg/mL, 19 mg/mL 내지 50 mg/mL, 20 mg/mL 내지 50 mg/mL, 25 mg/mL 내지 50 mg/mL, 30 mg/mL 내지 50 mg/mL, 35 mg/mL 내지 50 mg/mL, 40 mg/mL 내지 50 mg/mL, 또는 45 mg/mL 내지 50 mg/mL일 수 있다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 적어도 37℃까지의 온도에서 안정할 수 있다. 용어 '안정한'은 주어진 환경 조건에서 실질적으로 변성되지 않고 바람직한 특성을 유지하는 해파리 콜라겐의 능력을 지칭하기 위한 것이다. 이는 본 발명의 의도된 사용이 대상체와 제품의 물리적 접촉을 포함한다는 것을 감안할 때 유리한 특성이다. 대상체가 인간인 것으로 예상되지만, 본 발명은 또한 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양 등에 대한 상처 치료에 사용하기 위해 수의 산업에서 사용될 수 있다.

상처 치료에 사용하기 위한 해파리 콜라겐은 하이드로겔, 페이스트, 분말, 바람직하게는 미분된 분말, 멤브레인, 스캐폴드, 용액, 스펀지 매트릭스, 나노섬유 전기방사 매트릭스, 또는 동결건조된 형태일 수 있다.

'하이드로겔'은 친수성인 중합체 사슬의 네트워크로 흡수성이 높은 물질을 생성한다. 용어 '페이스트'는 일반적으로 피부에 외용으로 사용되는 반고체 제제를 지칭하기 위한 것이다. 전형적으로, 제약 환경에서 사용할 때, 이들은 지방 염기(예를 들어, 석유 젤리)로 이루어지고 적어도 25%의 고체 물질(예를 들어, 산화아연)이다. 숙련자는 해파리 콜라겐의 선택된 형태가 치료할 특정 상처에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 화상에는 하이드로겔 또는 미세한 콜라겐 메쉬 제형이 필요할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 추가의 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 추가 약학적 활성 성분은 성장 인자, 항염증제 및 항균 약물을 포함한다. 항염증제의 예는 아스피린 살살레이트, 디플루니살, 이부프로펜, 케토프로펜, 나부메톤, 피록시캄, 나프록센, 디클로페낙, 인도메타신 및 술린닥과 같은 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)을 포함할 수 있다. 선택된 항염증 약물의 농도는 치료될 상처의 유형 및 중증도에 의존하는 것으로 이해된다. 사용될 수 있는 항균제의 예는 나노실리버, 페니실린, 오플록사신, 테트라사이클린, 아미노글리코시드 및 에리트로마이신을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 열거된 부형제 및 담체를 포함하거나 포함하지 않는 상기 언급된 약학적 활성 성분 중 둘 이상의 혼합물이 예상된다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 성장 인자를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 성장 인자는 혈소판 풍부 혈장(PRP), 상피 성장 인자 38(EGF), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-B, TGF-B2, TGF-B3), 간세포 성장 인자(HGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 과립구-단핵구 집락 자극 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 및/또는 혈관 5 내피 성장 인자(VEGF), 또는 이들의 임의의 조합이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 항균 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항균 화합물은 나노 실리버, 페니실린, 오플록사신, 테트라사이클린, 아미노글리코시드 및 에리트로마이신, 플루클록사실린, 클라리스로마이신, 독시사이클린, 겐타마이신, 메트로니다졸, 코-아목시클라브, 코-트리목사졸(페니실린 내), 세프트리악손, 피페라실린과 타조박탐, 클린다마이신, 시프로플록사신, 반코마이신, 테이코플라닌, 리네졸리드 및/또는 표준 항균제, 또는 이들의 임의의 조합이다.

상처 치료에 사용하기 위한 조성물은 상처에 국소 적용하기 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 '국소 적용'은 치료할 상처의 특정 부위에 해파리 콜라겐을 적용하는 것을 지칭하기 위한 것이다. 치료할 상처는 대상체의 피부 또는 대상체의 점막, 예를 들어 입 내부에 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 당업계에 공지된 임의의 다른 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 음압 상처 치료(NPWT)(진공 보조 폐쇄(VAC)로도 알려짐)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 이는 진공 펌프에 연결된 밀봉된 상처 드레싱을 사용하여 국소 상처 환경에 대기압 이하의 압력을 제어하여 적용하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 투여당 0.01 g/L 내지 200 g/L, 바람직하게는 1 g/L 내지 50 g/L의 용량으로 콜라겐을 포함한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 크림, 바이-겔, 연고, 마스크, 세럼, 우유, 로션, 페이스트, 폼, 에어로졸, 스틱, 샴푸, 컨디셔너, 패치, 하이드로알콜 또는 유성 수용액, 수중유 또는 유중수 또는 다중 에멀젼, 수성 또는 유성 겔, 액체, 페이스트성 또는 고형 무수 생성물, 전기방사 콜라겐 나노섬유 매트릭스, 소구체를 사용하는 수성 상의 멤브레인 및/또는 오일 분산액(이러한 소구체는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 나노구체 및 나노캡슐 또는 지질 소포와 같은 중합체성 나노입자임), 보다 바람직하게는 전기방사된 콜라겐 나노섬유 매트릭스 및/또는 멤브레인으로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 해파리 콜라겐을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체, 및/또는 약학적 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부형제 및 담체는 활성 물질이 접합되거나 접합되지 않을 수 있는 약학적 활성 성분 또는 해파리 콜라겐의 안정성을 향상시키고/향상시키거나 생물약학적 프로파일을 개선할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제 및 담체의 예는 멸균수, 올리브유, 에틸 올레에이트, 글리콜, 과당, 포도당 및 갈락토오스와 같은 단당류; 자당, 유당, 트레할로스와 같은 비환원성 이당류; 라피노스 및 멜레지토스와 같은 비환원성 올리고당; 말토덱스트린, 덱스트란 및 시클로덱스트린과 같은 비환원성 전분 유래 다당류 생성물; 및 만니톨 및 자일리톨과 같은 비환원성 알디톨을 포함할 수 있다. 추가의 적합한 부형제는 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검 및/또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 셀룰로오스 제제를 포함한다. 임의의 상기 부형제 또는 담체(또는 임의의 다른 적합한 등가물) 중 둘 이상의 혼합물이 또한 고려된다. 유사한 효과를 갖는 임의의 다른 물질도 적합할 것으로 이해된다.

바람직한 실시형태에서, 약학적 활성 성분은 1% 리도카인일 수 있다. 리도카인 또는 리도카인 하이드로클로라이드는 마취제로 일반적으로 마비제로 사용된다. 리도카인은 5% 이하 리도카인, 예를 들어 0.1% 내지 5% 리도카인, 0.5% 내지 5% 리도카인, 1% 내지 5% 리도카인, 1.5% 내지 5% 리도카인, 2% 내지 5% 리도카인, 2.5% 내지 5% 리도카인, 3% 내지 5% 리도카인, 3.5% 내지 5% 리도카인, 4% 내지 5% 리도카인 및 4.5% 내지 5% 리도카인일 수 있다. 바람직하게는, 리도카인은 0.1 내지 2%의 농도이다. 동일한 목적에 적합한 추가 마취제의 예는 벤조카인, 부탐벤, 디부카인, 리도카인, 옥시부프로카인, 프라목신, 프로파라카인, 프록시메타카인 및 테트라카인을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된 상처를 치료하기 위해 사용될 수 있다: 욕창, 이식 부위, 수술 상처, 궤양, 바람직하게는 당뇨병성 궤양, 열화상, 화학물질 화상, 전기 화상, 열상, 찰과상, 천자, 박리, 장액종, 및/또는 혈종.

본 발명은 상기 언급된 약제의 추가의 존재 또는 부재 하에 상처 드레싱의 적어도 일부를 구성할 수 있는 것으로 예상된다. 상처 드레싱은 흡수성, 유연성 및 편안함을 향상시키고 치유에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 도움이 될 수 있는 알지네이트 및 셀룰로오스 유도체와 같은 추가 성분을 함유할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 미분된 분말 형태의 해파리 콜라겐을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미분된 분말은 1 μm 내지 1000 μm의 입자 크기를 가지며, 보다 바람직하게는 미분된 분말은 200 μm 내지 500 μm의 입자 크기를 갖는다.

특정 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 콜라겐 3D 스펀지 스캐폴드 형태의 해파리 콜라겐을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 치료된 상처에서 개선된 혈관신생을 촉진한다. 바람직하게는, 개선된 혈관신생은 치료되지 않은 상처 및/또는 소 콜라겐으로 치료된 상처에 대한 것이다.

본 발명의 제2 양태에서, 적어도 하기의 단계를 포함하는, 상기 언급된 해파리 콜라겐의 제조 방법:

'정제된 해파리 콜라겐의 용액'은 실질적으로 단량체이거나 대안적으로 콜라겐 피브릴이 실질적으로 없는 단리된 해파리 콜라겐의 용액을 지칭한다. 이 맥락에서, '실질적으로 없는'은 콜라겐의 2 중량% 미만이 피브릴로 구성된 콜라겐 용액을 지칭한다. 이러한 조건에서 콜라겐 용액을 유지하기 위해, 단리된 콜라겐은 콜라겐 피브릴 형성에 불리한 조건에서 저장될 수 있다. 이는 콜라겐이 산성 조건 하에 저장됨을 의미할 수 있으며, 산성은 pH 1 내지 pH 6.5의 pH를 갖는 임의의 용액을 의미하거나, 대안적으로 염기성 조건 하에 저장됨을 의미할 수 있으며, 염기성은 pH 8 내지 pH 14의 pH를 갖는 임의의 용액을 의미한다. 비제한적인 예로서, 콜라겐은 약산의 0.1 M 용액에 저장될 수 있다. 약산은 아세트산 또는 염산일 수 있다. 콜라겐 용액 중 콜라겐의 농도는 0.1 mg/ml 내지 30 mg/ml 범위일 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐 용액의 농도는 1 mg/ml 내지 10 mg/ml이다.

해부학적 환경에서 해파리 콜라겐을 '단리' 또는 '정제'하는 여러 방법이 있다. 이들 중 다수는 숙련자에게 잘 알려져 있고 일상적일 것이다. 예를 들어, 콜라겐은 해파리의 다양한 해부학적 부분을 산성 용액에 침지하여 산 추출에 의해 해파리로부터 정제될 수 있다. '침지' 또는 '침지된'은 콜라겐 분자를 유리시키기 위해 해파리를 산성 용액에서 충분한 시간 동안 배양하는 과정을 지칭한다. 콜라겐 정제의 대안적인 방법은 효소 추출이며, 이에 의해 해파리는 콜라겐 분자를 유리시키기 위해 해부학적 환경의 저하를 선호하는 조건 하에서 그리고 충분한 시간 동안 적어도 하나의 단백질 분해 효소와 함께 배양된다. 효소 추출 방법의 정확한 온도, pH 및 배양 시간은 사용되는 단백질 분해 효소에 따라 다를 것이다. 가장 적합한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 비제한적인 예로서, 효소 펩신은 콜라겐 분자를 유리시키기 위해 산성 조건 하에 해파리와 함께 배양될 수 있다. 임의의 효소가 효소 추출 방법에 사용될 수 있는 것으로 예상되며, 상기 실시예는 어떠한 방식으로도 제한되지 않는 것으로 의도된다.

그런 다음 콜라겐은 여러 다른 수단에 의해 산 또는 효소 추출 방법의 원하지 않는 오염 물질로부터 추가로 단리되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 불용성 오염물은 원심분리로 제거될 수 있다. 보다 순수한 콜라겐 공급원이 필요한 경우, 단리된 콜라겐은 겔 여과 또는 추출 과정의 다른 가용성 오염물에 대한 콜라겐 분자의 정제를 가능하게 하는 대안적 크로마토그래피 방법을 거칠 수 있다. 추가 정제의 정확한 방법은 특별히 제한되지 않는다. 단백질 생화학자에 의해 잘 알려져 있고 일상적으로 사용되는 임의의 방법은 정제되거나 단리된 해파리 콜라겐을 수득하기 위해 조정될 수 있다. 이 단계는 또한 정제된 해파리 콜라겐의 원하는 용액을 수득하기 위해 원하는 저장 완충액으로의 해파리 콜라겐의 전달을 가능하게 할 수 있다. 이는 정제 전에 크로마토그래피 장치를 원하는 저장 완충액으로 먼저 평형화함으로써 달성될 수 있다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 잘 알려진 대안적인 방법이 많이 존재한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 콜라겐 용액은 순도가 70% 내지 99%이며, 순도는 콜라겐 분자에 기인하는 용액 중 중량%를 지칭한다. 보다 바람직하게는, 콜라겐 용액은 순도가 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다.

일부 실시형태에서, 제조 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

iii). 가교제를 첨가하여 가교된 해파리 콜라겐을 형성하는 단계.

일부 실시형태에서, 가교제는 EDC, Genipin 또는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)이다. 바람직하게는, 가교제는 EDC이다. EDC는 0.01% 내지 5%, 0.05% 내지 5%, 0.1% 내지 5%, 0.2% 내지 5%, 0.3% 내지 5%, 0.4% 내지 5%, 0.5% 내지 5%, 0.6% 내지 5%, 0.7% 내지 5%, 0.8% 내지 5%, 0.9% 내지 5%, 1% 내지 5%, 1.5% 내지 5%, 2% 내지 5%, 3% 내지 5%, 3.5% 내지 5%, 4% 내지 5%, 또는 4.5% 내지 5%의 농도일 수 있다. 바람직하게는, EDC의 농도는 0.5% 내지 1%이다.

일부 실시형태에서, 해파리 콜라겐의 제조 방법은 추출된 해파리 콜라겐을 펩티다제로 분해하여 아텔로 해파리 콜라겐을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 콜라겐을 펩티다제로 분해하는 단계에서, 펩티다제는 펩신이다. 펩신은 포유류 기원, 비포유류 기원(예를 들어, 파파인), 또는 미생물 기원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜라겐을 펩티다제로 분해하는 단계는 추출 단계 후 및 정제 단계 전이다.

상술한 해파리 콜라겐의 제조 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다: i) S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐을 제공하는 단계; 및 ii) S-S 결합의 환원에 의해 S-S 결합을 포함하는 상기 해파리 콜라겐에 -SH 기를 도입하여 -SH 기를 포함하는 콜라겐 티올을 제공하는 단계.

해파리 콜라겐이 -SH 기를 포함하기 위해서, 해파리 콜라겐은 우선 S-S 결합 또는 '디설파이드' 기를 포함해야 한다. 자연 발생 콜라겐은 일반적으로 S-S 결합을 포함하지 않는다. 디설파이드 기는 여러 경로에 의해 콜라겐에 혼입될 수 있다. S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐은 리신 및 하이드록시리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 해파리 콜라겐에 의해 수득될 수 있다. 콜라겐은 폴리펩티드 사슬의 삼중 나선으로 형성되며, 그 중 하나 이상은 일반적으로 리신 및 하이드록시리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 리신 및 하이드록시리신은 ε-아미노 기를 갖는 α-아미노산이다. 본원에 사용된 용어 '잔기'는 예를 들어 화학 반응 및 결합 형성에 의해 다른 물질에 혼입된 후 남아있는 화합물의 부분을 지칭한다. 따라서, 아미노산 '잔기'는 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 단량체의 중합된 형태를 지칭한다. 콜라겐이 리신 잔기보다 4 내지 5배 덜 풍부하지만, 하이드록시리신 잔기도 본원에 개시된 방법에 사용하기에 충분한 양으로 존재한다. 따라서, 리신 또는 하이드록시리신 잔기를 포함하는 콜라겐은 본원에 기재된 바와 같은 처리 전에 하기 화학식 XI의 잔기를 포함할 수 있다:

(XI)

상기 식에서, R⁵는 H 또는 OH이다. R⁵가 H인 경우 리신 잔기가 존재한다. R⁵가 OH인 경우 하이드록시리신 잔기가 존재하고;

X는 OH 및 화학 결합의 군으로부터 선택되고 Y는 H 및 화학 결합으로부터 선택되며, 단 X 및 Y 중 하나 또는 둘 모두는 콜라겐 내에서 펩티드 결합을 형성하는 화학 결합이다. 변형된 콜라겐의 일부를 형성하는 펩티드 사슬은 화학식 (XI)에서 "[ ]" 괄호로 묶인 것으로 표시된다. 잔기는 예를 들어 X 및 Y 중 하나 또는 다른 하나가 각각 OH 및 H인 경우 펩티드의 말단 위치에 있을 수 있다. X와 Y 둘 모두가 모두 펩티드 결합인 경우, 리신 잔기는 콜라겐의 일부를 형성하는 펩티드 사슬 내에서 말단이 아니다.

리신 및 하이드록시리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 해파리 콜라겐은 바람직하게는 리신 및 하이드록시리신 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 가용화된 해파리 콜라겐이다. 가용화는 펩신 분해 또는 산 분해에 의해 달성되어 리신 및 하이드록시리신 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 펩신 가용화된 해파리 콜라겐을 제공하거나, 산 분해에 의해 리신 및 하이드록시리신 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 산 가용화된 해파리 콜라겐을 제공할 수 있다.

리신 및 하이드록시리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 펩신 가용화된 또는 산 가용화된 해파리 콜라겐과 같은 해파리 콜라겐은 디설파이드(즉, S-S) 기를 포함하는 활성화된 디카르복실산 유도체와 반응하여 S-S 결합을 포함하는 콜라겐을 제공할 수 있다. 이 반응에서, 활성화된 디카르복실산 유도체의 카르보닐 기가 해파리 콜라겐에 존재하는 리신 또는 하이드록시리신 잔기의 ε-아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다.

활성화된 디카르복실산 유도체는 바람직하게는 하기 화학식의 화합물이다:

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ (I)

상기 식에서, R¹, R² 및 R³은 독립적으로 2가 연결 기, 바람직하게는 2가 유기 연결 기, 보다 바람직하게는 2가 탄화수소 연결 기, 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일 기 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알켄디일 또는 알킨디일 기를 나타낸다. 보다 더 바람직하게는, R¹, R² 및 R³은 독립적으로 에탄디일 또는 프로판디일 기를 나타내고, 가장 바람직하게는 에탄디일, 즉 -CH₂CH₂-를 나타낸다. R¹, R² 및 R³ 기는 1 내지 4개의 수소 원자를 하이드록실 기 또는 할로겐, 예컨대 F 또는 Cl로 대체함으로써 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, R¹ 및 R²는 동일하고; ZN은 함께 질소 함유 헤테로시클릭 기, 바람직하게는 헤테로시클릭 고리에 5 내지 6개의 원자를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 기를 나타내며, N 원자는 Z가 두 원자가가 질소에 결합된 2가 연결기를 나타내도록 화학식 (I)의 화합물의 카르보닐 기에 직접 결합된다. 헤테로시클릭 기는 포화 또는 불포화될 수 있어, Z는 특히 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일, 알켄디일 또는 알킨디일을 나타낼 수 있다. Z는 O, S 및 N으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 선택적으로 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는, ZN은 아릴 고리에 5 내지 6개의 원자를 갖는 질소 함유 헤테로아릴 기이고, 그 중 1 내지 3개의 원자는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자이고, 그 중 적어도 1개는 화학식 (I)의 화합물의 카르보닐 기에 직접 결합된 N이다. 보다 더 바람직하게는 헤테로아릴 기는 2개의 원자가 N인 아릴 고리에 5 내지 6개의 원자를 갖는다. 대안적으로, ZN은 화학식 (I)의 화합물의 카르보닐 기에 직접 결합된 1개의 N 원자를 갖는 헤테로시클릭 고리에 5 내지 6개의 원자를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 기이고 Z는 α,ω-오르가노디온디일이다. 예를 들어, α,ω-오르가노디온디일은 -C(O)R⁴C(O)-로 표시될 수 있으며, 여기서 R⁴는 2 또는 3개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일 또는 알켄디일이다.

ZN 기는 1 내지 4개의 수소 원자를 하이드록실 기 또는 할로겐, 예컨대 F, Br 또는 Cl로 대체하거나 동일한 탄소에 결합된 2개의 수소 원자를 산소 원자로 대체하여 카르보닐 기를 형성함으로써 선택적으로 치환될 수 있으며, 후자의 치환은 1회 또는 2회 발생할 수 있다.

가장 바람직하게는, ZN 기는:

1-이미다졸 즉

또는 1-피롤리딘-2,5-디온 즉

바람직한 활성화된 디카르복실산 유도체는 하기로부터 선택될 수 있다:

(II) 및

(III).

활성화된 디카르복실산 유도체(I)는 두 단계로 합성될 수 있다. 먼저, 화학식(IV)의 디아미노 디설파이드를 적어도 2몰 당량의 화학식(V)의 디카르복실산 무수물과 반응시켜 화학식(VI)의 디카르복실산 디아미드를 제공할 수 있다:

H₂N-R¹-S-S-R²-NH₂ (IV) +

(V) →

HO-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-OH (VI)

상기 식에서, R¹, R² 및 R³은 상기 정의된 바와 같다. R¹ 및 R²가 동일할 때, 화학식(IV)의 디아미노 디설파이드는 대칭 분자이며, 이는 대칭 활성화된 디카르복실산 유도체(I)를 생성할 것임이 명백할 것이다.

제1 반응 단계는 화학식(IV)의 디아미노 디설파이드를 물과 같은 용매에 용해시키고, 화학식(V)의 디카르복실산 무수물을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 산 무수물의 첨가 전에 염기가 첨가될 수 있도록 염기성 조건 하에 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수성 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 10으로 조정할 수 있다. 디카르복실산 무수물을 첨가한 후, pH가 감소할 수 있고, 추가 염기를 첨가하여 반응 동안 pH를 7 내지 10 범위로 유지하는 것이 바람직하다. 반응은 실온에서 교반하면서 수행할 수 있고 30분 내지 2시간 이내에 완료될 수 있다. 화학식(VI)의 디카르복실산 디아미드 생성물은 수성 염산과 같은 산의 첨가에 의해 pH를 예를 들어 pH 1로 낮추어 침전시킬 수 있다. 침전된 디카르복실산 디아미드(VI)는 여과에 의해 단리되고, 물로 세척된 다음 감압 하에 건조될 수 있다.

합성의 제2 단계에서 디카르복실산 디아미드(VI)는 질소 함유 헤테로시클릭 화합물의 첨가에 의해 활성화되어 활성화된 디카르복실산 유도체(I)를 제공한다:

HO-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-OH (VI) →

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ (I)

상기 식에서, R¹, R², R³ 및 NZ는 상기 정의된 바와 같다.

일 실시형태에서, 질소 함유 헤테로시클릭 화합물은 하기 화학식 (VII)의 화합물과 같은 카르보디이미드일 수 있다:

(VII)

상기 식에서, Z는 상기 정의된 바와 같다. 바람직하게는, ZN은 함께 1 내지 3개의 원자는 O, N 및 S로부터 선택된 헤테로원자이고 적어도 1개는 N인 5 내지 6개의 원자를 아릴 고리에 갖는 질소 함유 헤테로아릴 기이다. 카르보디이미드(VII)는 보다 바람직하게는 1,1'-카르보닐-디이미다졸 등이다.

디카르복실산 디아미드(VI) 1 몰당 카르보디이미드의 2몰 당량 이상을 사용해야 한다. 이론적으로, 반응은 디카르복실산 디아미드(VI) 1몰당 2몰 당량의 이산화탄소와 2몰 당량의 이미다졸을 생성할 것이다. 이산화탄소 기체의 발생은 반응이 진행 중임을 나타낸다. 반응은 감압 하에서 수행될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 질소 함유 헤테로시클릭 화합물은 하기 화학식 (VIII)의 N-하이드록시 헤테로시클릭 화합물일 수 있다:

(VIII)

상기 식에서, ZN은 함께 1이 N이고 Z가 α,ω-오르가노디온디일인 헤테로시클릭 고리에서 5 내지 6개의 원자를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 기이다. 예를 들어, α,ω-오르가노디온디일은 -C(O)R⁴C(O)-로 표시될 수 있으며, 여기서 R⁴는 2 또는 3개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일 또는 알켄디일이다. N-하이드록시 헤테로시클릭 화합물(VIII)은 가장 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드이다.

제2 반응 단계는 디카르복실산 디아미드(VI)를 무수 디메틸포름아미드와 같은 용매에 용해시킨 다음 질소 함유 헤테로시클릭 화합물(VII) 또는 (VIII)을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 활성화된 디카르복실산 유도체(I)는 용액으로부터 침전된다. 생성물을 여과에 의해 수집하고, 무수 에틸 아세테이트로 세척하고, 감압 하에 건조시킬 수 있다.

본 발명의 방법의 첫 번째 단계로 돌아가서, 리신 및 하이드록실리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 공급원 콜라겐은 화학식 (I)의 활성화된 디카르복실산 유도체와 같은 디설파이드 기를 포함하는 활성화된 디카르복실산 유도체와 반응하여 S-S 결합을 포함하는 콜라겐, 예컨대 S-S 결합을 포함하는 유형 I, II, III, IV, V, VI, IX, X 및 XI 중 하나 이상의 콜라겐을 제공할 수 있다. 이 반응에서 활성화된 디카르복실산 유도체의 카르보닐 기는 콜라겐에 존재하는 리신 또는 하이드록시리신 잔기의 ε-아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 형성하여 디설파이드 기를 혼입할 수 있다. 반응은 다음과 같이 나타낼 수 있다:

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ (I) + 콜라겐-NH₂ →

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-콜라겐 + HNZ

이 반응은 활성화된 디카르복실산 유도체의 둘 모두의 활성화된 카르복실 기가 콜라겐, 특히 다른 콜라겐 삼중 헬릭스 또는 피브릴과 반응할 때 가교 콜라겐을 계속 제공할 수 있다.

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-콜라겐 + 콜라겐-NH₂ →

콜라겐-HN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-콜라겐 + HNZ

반응은 소스 콜라겐을 용매에 용해시켜 수행될 수 있다. 소스 콜라겐의 용해는 2-단계 과정으로 수행될 수 있다. 제1 단계에서 소스 콜라겐은 메탄올과 혼합될 수 있다. 제2 단계에서 극성 비양성자성 용매가 첨가된다. 예를 들어, 소스 콜라겐은 메탄올과 디메틸설폭사이드의 혼합물에 첨가될 수 있고 팽창될 수 있습니다. 소스 콜라겐의 용해가 완료될 때까지 교반하면서 추가 디메틸설폭사이드를 첨가할 수 있다. 그런 다음 감압 하에서 증발시켜 용액에서 메탄올을 제거할 수 있다. 이 가용화 과정은 아텔로콜라겐과 텔로콜라겐 둘 모두와 함께 사용될 수 있다.

활성화된 디카르복실산 유도체는 그 다음 용매, 특히 무수 극성 비양성자성 용매, 예컨대 디메틸설폭사이드에 용해될 수 있다. 화학식 (I)의 활성화된 디카르복실산 유도체는 물에 민감하기 때문에, 콜라겐과의 반응은 바람직하게는 디메틸설폭사이드와 같은 무수 극성 비양성자성 용매에서 수행된다. 그런 다음 용매에 용해된 활성화된 디카르복실산 유도체를 소스 콜라겐 용액에 첨가한다. 활성화된 디카르복실산 유도체의 카르보닐 기는 소스 콜라겐에 존재하는 리신 또는 하이드록시리신 잔기의 ε-아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다.

혼합물은 겔이 형성될 때까지 실온, 예를 들어 22℃에서 교반될 수 있다. 겔을 함유하는 혼합물은 이후 예를 들어 12 내지 18시간 동안 방해받지 않고 정치될 수 있다. 그런 다음 디메틸설폭사이드는 과량의 아세톤과 혼합하고, 경사분리에 의해 콜라겐 겔을 수집한 다음 더 많은 아세톤과 재블렌딩하여 겔에서 추출될 수 있다. 그런 다음 혼합물을 예를 들어 0.5 내지 1시간 동안 교반할 수 있고 이어서 여과에 의해 콜라겐을 단리하고, 아세톤으로 세척한 다음, 물-에탄올(30:70 v/v)로 세척하고 에탄올로 탈수시켰다. 이에 의해 S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐이 제공된다.

대안적인 실시형태에서, S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐은 디설파이드 기를 포함하는 광반응성 가교제를 포함하도록 콜라겐-결합 단백질을 변형하고, 이것을 해파리 콜라겐과 결합하여 복합물을 제공하고, 복합체를 조사하여 광반응성 가교제를 가교시켜 디설파이드 기를 콜라겐에 혼입시킴으로써 제공될 수 있다.

이 경로는 콜라겐에서 티올 기를 생성할 수 있는 부위-특이적 광-가교 전략을 사용하여 해파리 콜라겐에 단백질-결합 부위를 생성한다. 이는 부위-지정 돌연변이 유발에 의한 콜라겐-결합 단백질 내로 시스테인 잔기의 도입을 포함한다. 광반응성 가교제, 바람직하게는 APDP는 단백질 상의 시스테인 -SH 기에 도입될 수 있다. APDP로 변형된 단백질과 콜라겐의 복합체는 자외선(UV) 조사에 의해 가교될 수 있다. 디설파이드 가교 결합은 환원에 의해 절단될 수 있으며, -SH 기는 해파리 콜라겐에 생성된다.

제1 단계에서, 시스테인 잔기를 포함하는 콜라겐-결합 단백질이 제공된다. 시스테인 잔기는 가교제와의 반응에 필요한 설프하이드릴 기를 포함하기 때문에 필요하다. 콜라겐 결합 단백질은 예를 들어 색소 상피 유래 인자(PEDF)일 수 있다. PEDF는 문헌[Biochemistry, 2003, 42, pages 3160-3167]에 개시된 바와 같이 Yasui et al에 의해 확인된 콜라겐 결합 부위를 갖는 알려진 항-혈관신생/신경영양 인자이다.

필요한 경우, 콜라겐 결합 단백질이 아직 존재하지 않거나 콜라겐 결합 단백질에 충분한 시스테인이 포함되어 있지 않은 경우 시스테인이 콜라겐 결합 단백질에 포함될 수 있다. 시스테인 치환은 예를 들어 콜라겐 결합 부위가 국소화되고(F383) 부위의 반대 표면(Y211)에 있는 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 이루어질 수 있다. 이러한 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하는 방법은 문헌[J. D. J. Biol. Chem. 2002, 277, 4223-4231] 및 문헌[R. R. Biochemistry 1992, 31, 9526-9532]에서 확인된다.

시스테인 치환의 결과로 도입된 설프하이드릴 기는 광반응성 가교제와 반응할 수 있다. 광반응성 가교제는 이작용성이어야 한다. 특히, 광반응성 가교제는 술프하이드릴 기와 반응하여 디설파이드 결합을 생성할 수 있는 작용기를 포함해야 한다. 이러한 적합한 작용기 중 하나는 피리딜-디티오 기, 즉 C₅NH₅-S-S-, 특히 2-피리딜 디티오이다. 광반응성 가교제는 또한 광조사 하에서 콜라겐과 가교 결합할 수 있는 작용기를 포함해야 한다. 이러한 적합한 작용기 중 하나는 아지드 기, 특히 페닐 아지드, 특히 파라 -C₆H₄-N₃와 같은 아릴 아지드 기이다.

N-[4-(p-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'피리딜디티오)프로피온아미드(APDP)는 바람직한 광반응성 가교제 중 하나이다. APDP의 디설파이드 기는 시스테인의 설프하이드릴 기와 반응하여 시스테인과 광반응성 가교제 사이에 디설파이드 결합을 생성함으로써 S-S 기를 포함하는 광반응성 가교제 변형된 콜라겐 결합 단백질을 제공할 수 있다. 이 반응의 일부로 2-피리딜 티온이 이탈기로 유리된다.

광반응성 가교제 변형 콜라겐 결합 단백질은 그 다음 해파리 콜라겐과 결합되어 광반응성 가교제 변형 콜라겐 결합 단백질과 해파리 콜라겐의 복합체를 제공할 수 있다. 이 단계에서, 광반응성 가교제 변형 콜라겐 결합 단백질은 해파리 콜라겐의 단백질 결합 부위에 결합하여 복합체를 형성한다. 광반응성 가교제 변형된 콜라겐 결합 단백질과 콜라겐의 복합체는 예를 들어 자외선(UV) 광으로 조사될 수 있다. 조사는 광반응성 가교제에 존재하는 가교할 수 있는 작용기가 복합체 내의 인접한 콜라겐과 공유 결합을 형성하게 한다. 예를 들어, 가교할 수 있는 작용기가 페닐 아지드인 경우, 250 내지 280 nm 범위의 파장의 조사는 니트렌을 생성할 것이고, 이는 그런 다음 콜라겐의 C-H 또는 C-NH₂와 같은 친핵성 또는 활성 수소 기를 공격하여 C-H 또는 N-H 결합을 가로질러 삽입하여 가교를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, S-S 기를 포함하는 광반응성 가교제 변형 콜라겐 결합 단백질이 콜라겐에 혼입되어 S-S 결합을 포함하는 콜라겐을 제공한다. 이 경로에 의해 콜라겐 단백질 결합 부위 부근에 디설파이드 기가 제공되는 것이 명백할 것이다.

이어서, 설프하이드릴 기는 상기 논의된 방법, 즉 활성화된 디카르복실산 유도체 또는 광반응성 가교제 방법을 사용하여 제공될 수 있는 S-S 결합을 포함하는 콜라겐에 도입될 수 있다. S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐은 적합한 환원제와 반응할 수 있다. 환원제는 디설파이드 결합을 2개의 설프하이드릴 기로 환원시켜, 디설파이드 기가 위치하는 활성화된 디카르복실산 유도체 잔기 또는 광반응성 가교제 잔기를 절단한다. 이러한 환원은 2개의 순차적인 티올-디설파이드 교환 반응에 의해 진행되며, 그 결과 디설파이드 기가 환원되어 설프하이드릴(-SH) 기를 포함하는 해파리 콜라겐이 생성된다.

적합한 환원제는 예를 들어 디티오트레이톨(DTT), (2S)-2-아미노-1,4-디머캅토부탄(DTBA) 및 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 HCl(TCEP 하이드로클로라이드)을 포함한다. 디티오트레이톨이 바람직한 환원제이다.

환원 단계는 7.5 내지 9.5, 보다 바람직하게는 약 8 내지 9.5 범위, 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 글리신/수산화나트륨 완충 용액과 같은 완충 용액에 S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐을 첨가함으로써 수행될 수 있다. S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐은 본질적으로 산성일 수 있으며, 그렇다면 수산화나트륨과 같은 염기로 중화가 필요할 수 있다.

바람직하게는, 동일한 완충액에서 디설파이드 기 1몰당 적어도 2몰 당량의 DTT 환원제를 첨가할 수 있고 반응을 30℃에서 2 내지 6시간 동안 진행되게 한다. 반응 완료 후, 액체의 pH는 예를 들어 HCl을 사용하여 2로 감소될 수 있다. 그런 다음 혼합물을 묽은 HCl 용액으로 투석하고 원심분리하고 동결 건조하여 -SH 기를 갖는 해파리 콜라겐 티올을 제공할 수 있다.

감소는 콜라겐 사슬의 약간의 분해를 유발할 수 있다. 결과적으로, 더 짧은 반응 시간, 더 낮은 pH 및 더 낮은 온도를 모두 사용하여 저하를 최소화할 수 있다.

S-S 결합을 포함하는 해파리 콜라겐이 광반응성 가교제 변형된 콜라겐 결합 단백질을 사용하여 제공될 때, 변형된 콜라겐 결합 단백질은 콜라겐 티올을 형성하는 단계 이전에 광반응성 가교 단계 d를 통해 콜라겐에 여전히 부착될 것임이 명백할 것이다. S-S 결합의 환원은 광반응성 가교제의 S-S 결합을 절단할 것이다.

해파리 콜라겐이 리신 및 하이드록시리신 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 화학식 (X)의 리신 또는 하이드록시리신 잔기를 포함하는 해파리 콜라겐 티올이 제공된다:

(X)

상기 식에서, R¹, R³ 및 R⁵는 상기 정의된 바와 같다. 예를 들어, R¹ 및 R³은 2가 연결 기, 바람직하게는 2가 유기 연결 기, 보다 바람직하게는 2가 탄화수소 연결 기, 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일 기 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알켄디일 또는 알킨디일 기로부터 독립적으로 선택된다. 보다 더 바람직하게는, R¹ 및 R³은 독립적으로 에탄디일 또는 프로판디일 기, 가장 바람직하게는 에탄디일(즉, -CH₂CH₂-)을 나타낸다. 아미노산 잔기가 리신 잔기인 경우 R⁵는 H이다. 아미노산 잔기가 하이드록시리신 잔기인 경우 R⁵는 OH이고; X는 OH 및 화학 결합의 군으로부터 선택되고 Y는 H 및 화학 결합으로부터 선택되며, 단 X 및 Y 중 하나 또는 둘 모두는 콜라겐 내에서 펩티드 결합을 형성하는 화학 결합이다. 변형된 콜라겐의 일부를 형성하는 펩티드 사슬은 화학식 (X)에서 "[ ]" 괄호로 묶인 것으로 표시된다. 잔기는 예를 들어 X 및 Y 중 하나 또는 다른 하나가 각각 OH 및 H인 경우 펩티드의 말단 위치에 있을 수 있다. X와 Y 둘 모두가 모두 펩티드 결합인 경우, 리신 잔기는 콜라겐의 일부를 형성하는 펩티드 사슬 내에서 말단이 아니다.

본 발명은 티올화되거나 되지 않을 수 있는 본원에 개시된 해파리 콜라겐의 제조 방법을 추가로 제공하며, 이는 하기 단계를 추가로 포함한다: i) 정제된 해파리 콜라겐 또는 콜라겐 티올 용액을 수성 중화 완충액과 혼합하는 단계; 및 ii) 콜라겐 피브릴이 형성될 수 있도록 충분한 시간 동안 혼합물을 배양하는 단계로서, 가교제가 단계 i) 또는 ii)에서 첨가되어 가교 콜라겐을 제공하는 단계.

용어 '중화 완충액'은 pH를 pH 4 내지 pH 9의 pH로 증가 또는 감소시키기 위해 정제된 해파리 콜라겐 용액을 희석할 수 있는 임의의 완충액을 지칭한다. 중화 완충액의 조성은 특별히 제한되지 않으며, 콜라겐 피브릴 형성이 진행되기 위해서는 정제된 해파리 콜라겐 용액의 pH를 높이거나 낮추어야만 한다. 뿐만 아니라, 완충액에는 가교 과정을 방해할 수 있는 이온, 화합물 또는 분자가 실질적으로 없어야 한다. 따라서, 미반응 아민이 실질적으로 없는 완충액이 특히 바람직하다. 비제한적인 예로서, 중화 완충액은 1x 내지 10x 인산염 완충 식염수(PBS)일 수 있으며, 여기서 1x 또는 10x는 PBS의 농도를 지칭한다. 1x PBS의 조성은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. PBS의 정확한 농도(즉, 1x 또는 예를 들어 10x)는 정제된 해파리 콜라겐 용액과 혼합할 때 필요한 희석 인자에 전적으로 의존하며, 정제된 해파리 콜라겐 용액이 실질적으로 중화되어 콜라겐 피브릴 형성이 진행될 수 있도록 하기 위함이다. 일부 실시형태에서, 중화 완충액은 수산화나트륨이다.

용어 '피브릴 형성' 또는 '피브릴로 생성'은 콜라겐 분자가 제어된 응집을 거쳐 고차의 잘 구조화된 거대분자 어셈블리를 형성하는 과정을 지칭한다. 생체 내 콜라겐은 섬유소 구조로의 응집이 주변 조직 및/또는 세포외 기질의 구성요소에 대한 구조적 지지를 제공하는 주로 세포외 단백이다. 콜라겐, 특히 포유류 콜라겐의 응집은 잘 알려진 현상이다. 포유류 및 해양 콜라겐의 상이한 동형은 우선적으로 상이한 다른 거대분자 구조로 응집된다. 각 콜라겐 동형에서 형성된 독특한 거대분자 구조는 콜라겐 폴리펩티드의 물리화학적 특성과 피브릴로 생성이 촉진되는 조건에 의해 결정된다. 포유류 또는 어류에서 수득한 고차 콜라겐 구조, 즉 콜라겐 피브릴은 포유류 및/또는 어류 콜라겐 하이드로겔을 생성하기 위해 시험관 내에서 이용되었다. 따라서, 해파리 콜라겐으로부터 하이드로겔을 형성하기 위해서는, 해파리 콜라겐이 고차 구조로 조립되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 고차 구조는 피브릴이다.

콜라겐 피브릴이 형성되는 조건 하에 가교하는 것으로 알려진 임의의 가교제가 본 발명에 사용하기에 적합한 가교제가 될 것으로 예상된다. 특정 적용에서, 세포에 독성이 없는 가교제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 가교제는 제니핀, 1,4-BDDGE, 또는 뮤코염소산으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 가교제는 제니핀 또는 1,4-BDDGE이다.

이제 본 발명을 하기 실시예 및 연구를 참조하여 추가로 설명한다.

실시예

실시예 1 - 피부 상처 치유의 뮤린 모델에서 해파리 콜라겐 스펀지, 가교 해파리 콜라겐 스펀지 및 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트의 효과를 결정하기 위한 연구.

목적

C57BL/6J 마우스의 절제, 피부 상처 치유 모델에서, 해파리 콜라겐 스펀지; 가교 해파리 콜라겐 스펀지; 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트의 성능을 시판 상처 제품인 Puracol®과 비교.

절차

5 내지 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 80마리는 각각 40마리 마우스의 2개의 코호트로 Epistem에 의해 제공되었다. 마우스의 각 코호트를 2주 동안 순응시켰고 코호트당 8마리의 마우스를 5개의 처리군 중 하나로 랜덤화하였다. 0일(상처의 날)에 모든 동물을 마취하고 면도하고 각 마우스의 등쪽 정중선 양쪽의 동일한 상대 위치에 2개의 6 mm 직경 절개 상처를 만들었다. 할당된 치료군에 따라 하기 드레싱 중 하나가 각 마우스의 상처 구멍에 적용되었다: 미리 형성된 해파리 콜라겐 스펀지(표준 또는 가교); 화학적으로 변형된(티올화) 콜라겐 겔; 미리 절단된 Puracol® 드레싱; 치료 없음. 상처 치료 적용 후, 각 상처를 덮기 위해 Tegaderm 필름 드레싱을 적용하였다. 시술 후 마우스를 가온 캐비닛에 넣고 마취에서 회복시킨 후 보관실로 다시 보내졌다. 모든 마우스는 상처가 났을 때부터 개별적으로 수용되었다. Tegaderm 필름 드레싱의 감염 및 박리의 징후가 있는지 하루에 한 번 이상 모니터링하였다. 정상적인 마우스 활동으로 인한 Tegaderm의 접힘으로 인해 연구의 수명 기간 동안 상처 상태의 시각적 평가 및 상처 너비 측정을 정확하게 수행할 수 없었다.

각 코호트에서, 치료군당 4마리의 마우스는 상처 3일 후에 안락사되었고 4마리는 상처 7일 후에 안락사되었다. 마우스는 경추 탈구로 인도적으로 살해되었고 두 상처가 모두 포함된 등쪽 피부 스트립이 절단되었다. 상처 너비는 디지털 캘리퍼스를 사용하여 결정되었다; 상처는 또한 육안적 치유의 정도에 따라 주관적인 시각적 점수(1-5)를 할당받았다. 개별 상처는 조직학적 처리 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 횡단 상처 섹션의 준비를 위해 액체 질소에서 반은 급속 동결되고 반은 10% 중성 완충된 포르말린에 고정되어 이등분되었다. 각 상처 섹션에 대해 컴퓨터 보조 형태 측정법(Zeiss Axiohome 시스템)을 사용하여 상처 너비 및 재상피화 정도를 결정하였다. 또한, 과립화 조직 성숙도에 대한 주관적인 점수를 각 상처에 할당하고 과립화 조직의 면적을 결정하였다.

결과

감소된 상처 너비에 의해 입증된 바와 같이(도 1 및 도 2) 각 치료군은 3일차부터 7일차까지 절단 상처의 치유가 재상피화 백분율(도 3) 및 과립화(도 4)(과립화 조직 성숙도 및 과립화 영역 둘 모두)를 증가시켰음을 입증하였다. Tegaderm 단독 대조군의 경우 평균 상처 너비가 3일차에 (4.57 ± 0.93) mm에서 7일차에 (3.71 ± 0.92) mm로 감소하였다(인용된 수치는 평균 ± 표준 편차임).

가교 해파리 콜라겐 스펀지 군은 3일차 평균 상처 너비가 (5.11 ± 1.46) mm이고 7일차 값이 (3.16 ± 0.80) mm로 상처 봉합의 가장 큰 양을 보여주었다(도 2). 최소 상처 봉합은 7일차 평균 상처 너비 (3.96 ± 1.03) mm로 Puracol® 군에서 관찰되었다.

Tegaderm 단독군의 재상피화는 3일차에 (17.2 ± 10.5)%에서 7일차에 (59.7 ± 37.9)%로 진행되었다. Puracol® 군은 7일차에 (73.2 ± 27.1)%로 가장 많은 재상피화를 보여주었고, 가교된 해파리 콜라겐 스펀지 군은 (70.7 ± 30.3)%에서 유사한 수준의 재상피화를 나타냈다(도 3).

과립화 점수 및 과립화 면적(총 상처 면적의 백분율)은 모든 군에서 3일차부터 7일차까지 증가하였다(도 4). Tegaderm 단독군의 경우 3일차 평균 과립화 점수는 (1.46 ± 0.52)이었고 과립화 조직은 상처 공간의 (33 ± 24)%를 차지했다. 7일차까지 이 군의 평균 과립화 점수는 (2.08 ± 0.51)로 증가했으며, 상처 공간의 (61 ± 31)%는 과립화 조직이었다. Puracol® 군은 3일차에 (1.17 ± 0.39)의 가장 낮은 과립화 점수를 가졌으며, 상처 공간 내 과립화 조직은 단지 (5 ± 6)%였으며; 그러나, 7일차까지, 이 군은 (2.63 ± 0.52)의 가장 높은 과립화 조직 점수를 가졌고, 상처 공간의 (81 ± 20)%는 과립화 조직이었다. 해파리 콜라겐 스펀지 군과 화학적으로 변형된(티올화) 콜라겐 페이스트 군은 3일차에 Tegaderm 단독군과 유사한 양의 과립화를 보였고, 가교 해파리 콜라겐 스펀지를 사용한 치료는 3일차에 상처 공간의 과립화 조직 양의 대략 절반과 관련이 있었으며 단 (15 ± 21)%였다. 7일차에 가장 낮은 평균 과립화 조직 점수(1.67 ± 0.50)는 화학적으로 변형된(티올화) 콜라겐 페이스트 군에서 관찰되었으며, 상처 공간의 단지 (48 ± 41)%가 과립화 조직이었다. 3일차에 과립화를 나타내는 상처 공간의 비율의 차이에도 불구하고, 둘 모두의 유형의 해파리 콜라겐 스펀지는 7일차에 유사한 수준의 과립화와 관련이 있었으며, 표준 및 가교 결합 스펀지에 대해 각각 (2.30 ± 0.82) 및 (2.18 ± 0.75) 점수를 받았다.

H&E로 염색된 상처 단면을 관찰한 결과 Puracol®과 가교 해파리 콜라겐 스펀지의 명백한 구조가 3일차에 상처를 덮고 있는 것으로 나타났다. 가교 해파리 콜라겐 스펀지를 사용하여 스펀지 아래의 치유 상피의 이동이 용이하게 명백하였다. 각 군의 대표적인 상처 이미지는 도 5(Tegaderm 단독), 도 6(해파리 콜라겐 스펀지), 도 7(화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트), 도 8(가교 해파리 콜라겐 스펀지) 및 도 9(Puracol®)에 도시되어 있다. 이들은 상처에 인접한 상처가 없는 피부(종종 과형성 상피층이 있음)와 함께 상처 가장자리를 보여준다. Tegaderm 드레싱은 이미지에서 피부 표면 위에 물결 모양의 선으로 볼 수 있다.

모든 상처 섹션에서 콜라겐 I 면역반응이 관찰되었으며; 대표적인 이미지는 도 10에 나와 있으며, 이는 H&E 이미지에도 표시되는 상처에서 나온 것이다. 눈에 띄는 콜라겐 1 면역반응은 상처 가장자리와 7일차 상처 공간 전체에서 관찰할 수 있다.

결론

동물들은 부작용 없이 다양한 시험 항목을 잘 견뎠다. 상처 후 7일 동안, 상처는 대부분의 동물에서 재상피화의 증거와 함께 잘 치유되었으며 과립화 조직의 양과 성숙도 모두 시간이 지남에 따라 증가하였다. 둘 모두의 유형의 해파리 콜라겐 스펀지는 Tegaderm 드레싱 단독보다 7일차까지 상처 공간의 조직 과립화 정도와 관련하여 더 우수했으며, 가교 해파리 콜라겐 스펀지도 더 많은 재상피화를 보여주었다. 대조적으로, 해파리 스펀지와 참조 제품 Puracol® 드레싱의 성능은 유사했다.

이 연구는 해파리 콜라겐이 상처 치료용으로 시장에 이미 알려진 제품에 대해 적어도 동등한 효능을 가진 적절한 대안임을 보여준다. 이러한 알려진 제품은 일반적으로 포유류 기원이며 그 자체로 많은 단점과 관련이 있다. 따라서 상처 치료에 적합한 대체 콜라겐 공급원의 제공은 매우 유리하다.

실시예 2 - 마우스 상처 치유 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에 대한 항-마우스 CD31 항체를 사용한 면역조직화학 표지.

목적

이 연구의 목적은 피부 상처 치유 뮤린 모델에서 시험 항목의 효과를 결정하기 위한 연구인 연구 18/099에서 수득한 항-마우스 CD31, 152개의 FFPE 마우스 상처를 섹션화하고 면역조직화학적으로 표지하는 것이었다. CD31은 혈관신생을 결정하고 측정하는 데 일반적으로 사용되는 내피 세포 마커이다.

절차

연구 18/099(- 3일 및 7일 시점에서 피부 상처 치유 뮤린 모델에서 시험 항목의 효과를 결정하기 위한 연구)동안 수득한 152개의 FFPE 마우스 상처를 슬라이드당 2개의 비-직렬 섹션이 있는 하나의 슬라이드를 제공하기 위해 3 μm 두께로 절단하였다. 섹션을 충전된 슬라이드에 장착하고 37℃에서 밤새 건조시켰다.

152개의 FFPE 섹션을 탈랍하고 재수화한 후 실온에서 5분 동안 Proteinase K(Dako S3020)를 사용한 단백질 분해를 사용하여 항원 검색을 수행하였다. 내인성 퍼옥시다아제를 TBST에서 0.3% H2O2로 15분 동안 차단한 후 비특이적 결합을 2.5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단하였다. 섹션을 실온에서 1시간 동안 0.3125 μg/ml로 항-마우스 CD31, 래트 단일클론 항체, 클론 MEC13.3(BD Pharmingen 550274)과 함께 배양하였다. 상응하는 래트 단일클론 IgG2a 이소형 대조군이 하나의 샘플에 1차 항체에 일치하는 농도로 포함되었다. 미처리 마우스 피부 샘플이 양성 조직 대조군으로 포함되었다. 섹션을 TBST로 세척한 다음 항-래트, 마우스 흡착 중합체(Vector ImmPress MP-7444)와 함께 배양하였다. 모든 표지는 DAB(Vector ImmPact SK-4105)를 사용하여 시각화되었으며 섹션은 영구적으로 장착되기 전에 헤마톡실린으로 대조염색되었다. 표지된 각 슬라이드를 해당 블록과 비교하여 일치 여부를 확인하고 품질 관리 절차의 일부로 현미경으로 검사하였다.

30개의 대표적인 이미지는 이미지 캡처를 위해 컴퓨터 워크스테이션에 설치된 Zeiss Axioscope A1 현미경, AxioCam MRc 카메라 및 AxioVision 소프트웨어로 이루어진 AxioVision 이미징 시스템을 사용하여 촬영되었다. 이미지는 x10 대물렌즈를 사용하여 촬영되었다.

각 치료 상처 드레싱 군의 대표 이미지(Tegaderm 단독, 해파리 콜라겐 스펀지, 화학적으로 변형된(티올화) 해파리 콜라겐 페이스트, 가교 해파리 콜라겐 스펀지 및 Puracol)을 3일차(도 11, 13, 15, 17 및 19)와 7일차(도 12, 14, 16, 18 및 20)에 촬영하였다. 방향을 위해 각 상처는 표피가 가장 높은 곳, 즉 이미지 상단에서 이미지화되었다.

결과 및 결론

연구 18/099에서 채취한 상처 샘플은 마우스 특이적 내피 세포 마커인 CD31에 대해 성공적으로 표지되었으며, 이는 해파리 콜라겐으로 처리된 샘플에서 발생하는 혈관신생을 나타낸다.

생체 내 데이터와 마찬가지로, 상기 시험관 내 데이터는 해파리 콜라겐이 상처 치료에 사용하기 위한 소 콜라겐의 적절한 대안이며, 질병/프리온 전염의 위험 증가, 오염 위험 증가 및 포유류 공급원으로부터 콜라겐을 수득하는 것과 관련된 상당한 비용과 같은 포유류 콜라겐 사용과 관련된 단점이 결여된 것임을 보여준다. 이 발견은 포유류 콜라겐에 대한 해파리 콜라겐의 물리화학적 및 아미노산 특성이 크게 다르다는 점을 감안할 때 놀라운 것이다.

실시예 3 - db/db(BKS.CG-m Dock 7 ^m +/_+ Lepr ^db /J) 당뇨병 마우스의 전체 두께 절제 상처 치유에 대한 해파리 유래 콜라겐 제형의 영향에 대한 조사.

목적

피부 상처 치유 지연 모델인 BKS.Cg- m Dock7m +/+ Leprdb /J (db/db) 당뇨병 마우스의 상처 치유에 대한 세 가지 해파리 유래 콜라겐 제형의 영향을 조사하기 위함.

절차

시험 중인 재료:

- 96웰 플레이트 형성(~6 mm 직경) Jellagen 비가교 스폰지 - CHCl3 멸균.

- 미분된 0.5% EDC* 가교 Jellagen 분말 - CHCl3 멸균(4 g).

- 미분된 1% EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드) 가교 Jellagen 분말 - CHCl3 멸균(4 g).

- Promogran™(Protease Modulating Matrix, Acelity, USA). 로트 1912V001; 2021년 2월 28일 만료.

BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J 당뇨병 마우스 모델

하기 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있다. 이 연구의 실제 단계는 2019년 9월 19일에서 2019년 10월 9일 사이에 수행되었다.

당뇨병 마우스(BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J, Jackson Labs, Bar Harbour, ME, USA)를 약 9 내지 10주령에 영국으로 데려왔고 연구 시작 전 1주일 동안 적응시켰다. 동물은 영국 내무부 규정 및 당뇨병 동물의 특정 요구 사항에 따라 유지되었다. 동물을 5개의 처리군에 무작위로 할당하였다(표 1).

간단히 말해서, 마우스를 이소플루오란과 공기를 사용하여 마취하고, 프로토콜에 따라 등쪽 옆구리 피부를 잘라내고 세척하였다. 척추에서 약 5 mm 떨어진 왼쪽 등 옆구리에 단일 표준화된 전체 두께 상처(10 mm × 10 mm)가 생성되었다. 상처는 멸균 식염수에 적신 거즈 면봉으로 세척하고 멸균 거즈로 건조시켰다. 그런 다음 15 μL의 멸균 생리 식염수를 각 상처의 표면에 적용하였다. 그런 다음 시험 중인 재료를 식염수에 적신 상처의 표면에 직접 적용하였다.

군 2의 상처는 ~6 mm 직경(96웰 형성) 비가교 Jellagen 스펀지를 받았다; 군 5는 상업용 비교기 Promogran™(Acelity, USA)의 6 mm 디스크를 받았고, 군 3과 4는 5 mg의 EDC-가교 Jellagen 분말을 받았다(각각, 0.5% 및 1.0% EDC 가교). 생성물 적용 직후, 모든 상처를 반폐쇄 필름 드레싱 Tegaderm™ 필름(3M Deutschland GmbH, Germany)으로 드레싱하였다. 이 필름 드레싱의 상태는 연구 내내 매일 검사되었으며 박리되면 교체하였다.

상처 후 4일, 8일, 12일 및 16일차에 모든 동물을 재마취하고, 필름 드레싱과 유리 파편을 제거하고 상처(및 변연 피부)를 멸균 식염수에 적신 거즈를 사용하여 부드럽게 세척하였다(상처 내 기존 제품은 방해하지 않음). 그런 다음 상처를(사진에 표시되지 않음) 멸균 생리 식염수 15 μl로 적시고 선택한 날짜에 선택한 군의 상처에 제품을 다시 재적용하였다.

원래 군 2(가교되지 않은 Jellagen 스폰지)와 군 5(Promogran™, Acelity, USA)의 상처는 상처 후 4일차에 제품을 두 번째 적용하도록 의도되었다. 이들 제품 중 어느 것도 심각한 저하를 경험하지 않았다는 관찰에 비추어, 이 시점에서 재적용을 수행하지 않기로 결정(및 후원자와 동의)하였다. 그러나, 기존의 분해되지 않은 제품을 사전 제거하지 않고 제품 재적용은 권취 후 8, 12 및 16일차에 수행하였다.

제품을 재적용한 후(표시된 경우), Tegaderm™ 필름 드레싱으로 상처를 재드레싱하고(상기와 같음) 동물을 따뜻한 환경(~35℃)에서 회복하게 하였다. 상처 직후와 4, 8, 12, 16 및 20일차에 세척한 후 모든 상처를 보정/식별판과 함께 디지털 사진으로 촬영하였다.

모든 동물은 부상 후 20일차에 도태되었다. 종료 1시간 전 모든 동물은 조직학적 섹션에서 세포 증식의 검출 가능성을 용이하게 하기 위해 생리 식염수 중 5-브로모-2'-데옥시우리딘(Sigma B5002)을 i.p. 주입(30 μg/g)하였다. 그런 다음 모든 상처에서 상처 및 주변 변연 조직을 채취하였다. 조직을 고정하고(Neutral Buffered Formalin, Sigma) 파라핀 왁스에 포매하여 조직학적 조사를 용이하게 하였다.

개요

이 연구는 치유가 손상된 db/db 당뇨병 마우스에서 전체 두께 절제 피부 상처의 복구에 국소적으로 적용된 3가지 해파리 유래 제형(비가교 Jellagen 스펀지, 0.5% EDC 가교 Jellagen 분말 및 1.0% EDC 가교 Jellagen 분말)의 효과를 조사하였다.

이들 제형/제품을 투여받은 상처의 치유를 시판 비교제(Promogran™ Protease Modulating Matrix, Acelity, USA)를 투여받은 상처의 치유 및 대조군(필름 드레싱만) 처리 상처의 치유와 서로 비교하였다.

상처 치유는 (i) 신피 회복 반응의 개시 및 (ii) 상처 봉합 측면에서 20일 기간에 걸쳐 평가되었다. 신진피 조직 형성의 개시는 각 시점에서 각 군에서 반응하는 상처의 수로 표현하였다. 상처 봉합은 전반적인 측면과 상처 수축 및 상처 재상피화의 구성 요소 측면에서 모두 고려되었다. 상처 봉합(수축 및 재상피화)은 상처 후 0, 4, 8, 12, 16 및 20일에 촬영한 디지털 사진에서 결정되었다. 조직학적 수준에서, 상처 조직의 H&E 염색 섹션(20일차에 수확)을 간략히 고려하고 과립화 조직 형성 및 재상피화 측면에서 그리고 (2개의 EDC 가교 분말 제형의 경우) 조직 재생을 지원하기 위한 구조적 스캐폴드로서의 잠재적 사용 측면에서 비교하였다.

결과 요약 - 상처 봉합

부상 직후와 4, 8, 12, 16 및 20일차에 각 상처를 식별/보정 플레이트와 함께 디지털 사진으로 촬영하였다. 주어진 시점에서 주어진 상처에 대해, 상처 봉합은 손상 직후(즉, 0일) 초기 상처 면적에 대하여 잔여 상처 면적의 백분율로 표현되었다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 면적 잔여 데이터는 아래 표 2에 설명되어 있고 도 21에 도시되어 있다.

상처 봉합(시간 경과에 따른 '개방 상처 면적'의 변화 측면에서)을 고려할 때 다음이 관찰되었다:

- 평가된 3개의 젤라젠 제품 모두 12일차부터 '필름 드레싱만' 대조군 치료에 비해 봉합을 유의하게 촉진하는 것으로 나타났다.

- 3가지 Jellagen 제품을 비교했을 때 비가교 스펀지를 적용했을 때 1.0% EDC 가교 분말과 유사한 수준의 봉합이 나타났으며, 이들 둘 모두 1.0% EDC 가교 분말에 대한 반응보다 약간 더 큰 것으로 나타났다. 3가지 Jellagen 제품 치료군 간에 봉합에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

결과 요약 - 상처 수축

수축은 상처의 "몸" 내 과립화 조직의 압축으로 인한 상처 가장자리의 구심 이동이다. 이 과정을 주도하는 "압축"력은 섬유아세포 계통의 세포에 있는 것으로 생각된다. 이 연구에서 수축 백분율은 다음과 같이 계산되었다:

비당뇨병 마우스의 상처는 수축에 의해 주로 봉합되는 반면, 당뇨병 마우스의 상처(예컨대 이 연구에 사용된 상처)는 수축 능력이 현저히 감소하였다(아마도 저하된 과립화 조직 형성으로 인함). 결과적으로, 당뇨병 동물의 치료되지 않은 상처는 비당뇨 동물의 상처보다 더 큰 정도로 재상피화에 의해 봉합되는 경향이 있다. 향상된 수축의 관찰은 과립화 조직 기능의 개선을 시사하며, 이는 차례로 형성되는 과립화 조직의 양의 증가, 형성 속도의 증가 또는 조직의 수축 능력 증가로 설명될 수 있다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 수축 데이터는 표 3(아래)에 설명되어 있고 도 22에 도시되어 있다.

상처 수축에 대한 치료의 영향을 고려할 때 다음이 관찰되었다:

- 고려된 모든 치료는 8일차부터 '필름 드레싱만' 대조군 치료에 비해 상처 수축을 유의하게 가속화하는 것으로 나타났다.

- 3가지 Jellagen 제품을 비교했을 때, 수축은 1.0% EDC 가교된 분말에 반응하여 더 광범위한 경향이 있었고, 이는 0.5%에 반응하여 관찰된 것보다 더 광범위한 경향이 있었고, 차례로 비가교된 스펀지에 반응하여 관찰된 것보다 더 광범위한 경향이 있었다. 통계 분석에서 1.0% EDC 가교 분말의 적용은 비가교 스펀지를 사용한 치료에 비해 수축을 유의하게 촉진하는 것으로 나타났다.

결과 요약 - 상처 재상피화

주어진 상처에 대해, 주어진 시점에서, 재상피화 영역은 손상 직후 그 상처의 원래 영역의 백분율로 표현되었다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 재상피화 데이터는 표 4(아래)에 설명되어 있고 도 23에 도시되어 있다.

상처 재상피화에 대한 치료의 영향을 고려할 때 다음이 관찰되었다:

- Jellagen 처리군을 고려할 때, 비가교 스펀지의 적용이 EDC 가교 분말의 적용보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다.

- 비가교 스펀지에 대한 재상피화는 8일, 12일 및 16일차에 Promogran™ 처리군에서 관찰된 것보다 더 큰 것으로 밝혀졌으며; 20일차에는 더 적은 것으로 밝혀졌다.

- 20일차 연구 결론 시점에 유사한 수준의 재상피화가 달성되었지만 대부분의 연구에서 EDC 가교 분말에 대한 재상피화는 '필름 드레싱만' 대조군 처리에 대한 반응보다 낮은 경향이 있었다.

결과 요약 - 신피 조직 생성 개시

연구의 모든 상처는 8일차까지 매일 시각적으로 평가되었고, 이후에는 10, 12, 14, 16 및 20일차에 시각적으로 평가되어 "치유" 상태를 확립하였다. 각 상처는 중앙 상처 부위 내에서 "신피 조직 생성 활성"을 나타내는지 여부에 대해 점수를 매겼다. 점수는 두 명의 독립적인 관찰자가 독립적으로 수행했으며 "신피 조직 생성 활성"을 나타내는 상처의 평균%를 각 평가 지점에서 처리군 간에 비교하였다. 각 치료군에서 각 일자마다 반응한 상처의 수를 표 5에 나타냈다. 각 군에 대한 평균 반응 시간을 표 6에 나타냈다. '필름 드레싱만' 처리군의 상처 10개 중 10개가 연구 기간 동안 반응하지 않았기 때문에 이 군의 '반응 시간'의 평균 값은 20보다 큰 알 수 없는 값이라는 것에 유의해야 한다.

세 가지 젤라젠 제품 모두의 적용은 '필름 드레싱만' 대조군 처리와 비교할 때 중심 상처 부위 내에서 '신피 조직 형성'의 개시를 촉진했다. 조사된 세 가지 Jellagen 처리 중 1.0% EDC 가교 분말이 가장 빠른 '개시'를 일으켰고 0.5% EDC 가교 분말이 그 뒤를 이었고 마지막은 비가교 스펀지였다. 세 제품 모두 Promogran™보다 효과적이지는 않지만 효과적이었다.

결과 요약 - 상처 조직학

상처 조직은 상처 주위 피부와 함께 상처 후 20일차에 연구의 결론에 따라 각 동물로부터 채취되었다. 조직 샘플을 고정하고 처리하고 파라핀 왁스에 포매하였다. 섹션(~6 μm)은 각 상처의 중심에서 두개골-꼬리 방향으로 취했다. 이 섹션은 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고 디지털 스캔했다. 각 실험군의 상처 모양의 대표적인 예는 도 24 및 도 25에 도시되어 있다. 각 군의 상처에 대한 과립화 조직 침착의 일반적인 수준 및 상처 재상피화 정도가 아래에 설명되어 있다.

대조군으로 처리된 상처는 제한된 과립화 조직 형성과 제한된 재상피화를 나타냈다(둘 모두 상처 가장자리에 제한됨).

비가교 스펀지의 적용은 대조군에 비해 과립화 조직 형성 및 재상피화를 증가시켰다. '품질'이 가변적인 것으로 밝혀졌지만, 과립화 조직은 상처 기저부 전체에 형성되었다. 대부분의 상처에 명백한 제품 잔류물이 없다.

두 EDC 가교 분말의 적용은 대부분의 상처에서 최소한의 재상피화와 함께 증가된 과립화 조직 형성을 야기하였다. 이러한 제품은 과립화 조직 침착을 위한 스캐폴드 역할을 하는 것으로 보이며 완전히 세포화되면 재상피화를 지원할 수 있다. 심한 상처 이미지와 조직학적 외관을 기반으로, 이 제품은 20일의 연구 기간 동안 심각한 저하를 경험하지 않은 것으로 보인다.

EDC 가교 해파리 콜라겐 분말은 상처 가장자리에서 새로운 혈관의 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. 이는 1.0% 분말에서 가장 분명하게 나타났으며 거시적으로는 상처 표면의 수화 덩어리의 바깥쪽 가장자리에서 점진적으로 발적을 볼 수 있으며 조직학적 섹션에서도 분명했다(도 26).

연구 결과

이 연구에서 평가된 3가지 Jellagen 제품 모두 db/db 당뇨병 마우스 손상 치유 모델에서 상처 치유에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

비가교 콜라겐 스펀지는 수축과 재상피화를 촉진하여 상처 봉합을 촉진하고 과립화 조직 형성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 스펀지 물질은 광범위한 압축, 제한된 저하를 경험했으며 상처 조직에 혼입되지 않은 것으로 나타났다.

가교 분말은 주로 상처 수축 과정을 촉진하여 상처 봉합을 촉진하였으며 이는 이러한 제품이 과립화 조직 형성을 위한 스캐폴드 역할을 하는 능력으로 설명될 수 있다.

실시예 4 - db/db(BKS.Cg-m Dock7 ^m +/+ Lepr ^db /J) 당뇨병 마우스의 전체 두께 절제 상처 치유에 대한 해파리 유래 콜라겐 제형의 영향 조사

목적

절차

시험 중인 재료:

- 가교 해파리 스펀지(Jellagen). 500 μL AMY2(4.5 mg/mL)를 사용하여 24웰 플레이트로 제작. 1% EDC 가교 CHCl₃ 멸균. DOM OCT 2020. 스펀지는 상처 크기로 절단.

- 미분된 1% EDC* 가교 해파리 콜라겐 분말(Jellagen) - CHCl₃ 멸균(개별 상처 분취량 ~2.5 mg).

- 미분된 티올화 해파리 콜라겐 분말(Jellagen) - CHCl₃ 멸균(개별 상처 분취량 ~2.5 mg).

- 비교: Integra® 유동성 상처 매트릭스(Integra Lifesciences Inc. Princeton, USA). 제품 코드: FDR 301, 로트: 4679547, 2021년 9월 30일 만료.

BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J 당뇨병 마우스 모델

하기 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있다.

당뇨병 마우스(BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J, Jackson Labs, Bar Harbour, ME, USA)를 약 9 내지 10주령에 영국으로 데려왔고 연구 시작 전 1주일 동안 적응시켰다. 동물은 영국 내무부 규정 및 당뇨병 동물의 특정 요구 사항에 따라 유지되었다. 동물을 5개의 처리군에 무작위로 할당하였다(표 7).

재적용일에(상기 표 7 참조), 동물을 재마취하고, 필름 드레싱과 유리 파편을 제거하고 상처(및 변연 피부)를 멸균 식염수에 적신 거즈를 사용하여 부드럽게 세척하였다(상처 내 기존 제품은 방해하지 않음). 그런 다음 상처를(사진에 표시되지 않음) 멸균 생리 식염수 15 μl로 적시고 선택한 날짜에 선택한 군의 상처에 제품을 다시 재적용하였다. 제품을 재적용한 후(표시된 경우), Tegaderm™ 필름 드레싱으로 상처를 재드레싱하고 동물을 따뜻한 환경(~35℃)에서 회복하게 하였다. 상처 직후와 상처 후 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 상처를 보정/식별판과 함께 디지털 사진으로 촬영하였다.

상처 후 35일차에, 각 군에서 8마리의 동물을 희생시켰다. 남아있는 모든 동물은 상처 후 63일차에 도태되었다.

결과 요약 - 상처 봉합

부상 직후와 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 각 상처를 식별/보정 플레이트와 함께 디지털 사진으로 촬영하였다. 주어진 시점에서 주어진 상처에 대해, 상처 봉합은 손상 직후(즉, 0일) 초기 상처 면적에 대하여 잔여 상처 면적의 백분율로 표현되었다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 면적 잔여 데이터는 도 27에 도시되어 있다. 스펀지의 존재로 인해 XL-스폰지 처리군에서 상처 가장자리의 명확한 시각화를 수득하는 것이 항상 가능한 것은 아니므로 해당 시험군에 대한 값은 도 27에 포함되지 않았다.

- 고려된 모든 처리는 상처 후 적어도 35일까지 '필름 드레싱만' 대조군 처리와 비교하여 봉합을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 티올레이트 분말과 대조군 처리군을 제외하고 35일에서 63일 사이에 모든 군에서 상처 치유의 일부 퇴행이 나타났다.

- 평가된 각각의 Jellagen 제품은 적어도 12일차부터(1.0% EDC XL 분말 및 티올화 분말의 경우 4일차) '필름 드레싱만' 대조군 처리에 비해 상처 봉합을 유의하게 촉진하는 것으로 밝혀졌다(도 27).

- 2가지 Jellagen 제품을 비교했을 때, 티올화 분말을 받은 상처는 35일차까지 가장 큰 반응을 보였고(n=12), 1% EDC XL-분말이 그 뒤를 이었다(도 28). 나중 시점(35일 후)(여기서 n=4)에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.

- 티올화 분말을 Integra 제품과 비교했을 때, 매우 유사한 봉합 프로파일이 35일(n=12)까지 관찰되었고(도 29) 42일부터 63일까지(n=4) 티올화 분말에 대해 약간 증가된 봉합이 관찰되었다(도 27).

결과 요약 - 상처 수축

비당뇨병 마우스의 상처는 수축에 의해 주로 봉합되는 반면, 당뇨병 마우스의 상처(예컨대 이 연구에 사용된 상처)는 수축 능력이 현저히 감소하였다(아마도 저하된 과립화 조직 형성으로 인함). 결과적으로, 당뇨병 동물의 치료되지 않은 상처는 비당뇨 동물의 상처보다 더 큰 정도로 재상피화에 의해 봉합되는 경향이 있다. 향상된 수축의 관찰은 과립화 조직 기능의 개선을 시사하며, 이는 차례로 형성되는 과립화 조직의 양의 증가, 형성 속도의 증가 또는 조직의 수축 능력 증가로 설명될 수 있다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 수축 데이터는 도 30에 도시되어 있다.

- 고려된 모든 처리는 상처 후 적어도 35일까지 '필름 드레싱만' 대조군 처리와 비교하여 상처 수축을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

- 평가된 3가지 Jellagen 제품은 적어도 12일차부터 '필름 드레싱만' 대조군 처리에 비해 상처 수축을 유의하게 촉진하는 것으로 밝혀졌다(XL-스펀지의 경우 4일차, 1% EDC XL-분말의 경우 8일차, 티올화 분말의 경우 8일차에 거의 유의미함)(도 30).

- 3가지 Jellagen 제품을 비교했을 때(도 31), 티올화 분말을 받은 상처는 35일까지 가장 큰 수축을 나타냈으며(여기서 n=12), XL-스폰지 및 1% EDC XL-분말은 Integra 제품에 필적하는 약간 더 낮은 수축을 촉진했다(도 30).

- 티올화 분말을 Integra 제품과 비교했을 때(도 32), 증가된 수축이 티올화 분말에 대해 관찰되었으며, 20일과 28일에서 42일 사이에 통계적 유의성에 도달했으며(p≤0.029), 16일과 24일에 거의 유의미했다(각각 p = 0.060 및 0.068).

결과 요약 - 상처 재상피화

주어진 상처에 대해, 주어진 시점에서, 재상피화 영역은 손상 직후 그 상처의 원래 영역의 백분율로 표현되었다. 모든 치료군에 대한 평균 백분율 상처 재상피화 데이터는 표 4(아래)에 설명되어 있고 도 33에 도시되어 있다. 스펀지가 제자리에 남아 있는 동안 XL-스폰지를 받은 상처의 재상피화를 정확하게 측정할 수 없었으므로 해당 처리의 결과는 도 33에 포함되지 않았다.

- 고려된 모든 처리는 상처 후 적어도 35일까지 '필름 드레싱만' 대조군 처리와 비교하여 상처 재상피화를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

- Jellagen 1% EDC XL 분말 및 Jellagen 티올화 분말 제품 둘 모두 최소 16일차부터 '필름 드레싱만' 대조군에 비해 상처 수축을 크게 촉진하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 티올화 분말을 받은 상처는 12일차부터 35일차까지 대조군 상처에 비해 상처 재상피화가 유의하게 증가된 것으로 나타났고(p≤0.007) 1% EDC XL-분말 제품을 받은 상처는 16일차부터 35일차까지 대조군 상처에 비해 상처 재상피화가 크게 증가했으며(p≤0.028), 12일차에는 거의 유의미했다(p=0.052).

- 1% EDC XL-분말과 티올화 분말을 비교했을 때(도 34), 티올화 분말을 받은 상처는 35일차까지 가장 큰 재상피화를 나타냈고(여기서 n=12), 1% EDC XL 분말은 약간 더 낮은 재상피화를 촉진했다.

- 티올화 분말을 Integra 제품과 비교했을 때(도 34), Integra 제품은 일반적으로 상처 후 35일차까지 재상피화 수준이 약간 증가하여 16, 28 및 35일차에 유의미한 수준에 도달했다(p≤0.039). 그러나, 티올화 분말은 상처 후 8일차에 유의하게 증가된 재상피화를 나타냈다(p=0.010).

Claims

상처 치료에서의 사용을 위한 조성물로서, 해파리 콜라겐을 포함하는, 사용을 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상처가 수포성 표피박리증과 관련이 없는, 사용을 위한 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 해파리 콜라겐이 가수분해물 형태가 아닌, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 아텔로 형태인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 텔로 형태인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 티올화되는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리가 가교결합되는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐의 공급원이 사이포조아(Scyphozoa) 아문으로부터 유래하는, 사용을 위한 조성물.
제8항에 있어서, 해파리 콜라겐의 공급원이 리조스토마스 풀모(Rhizostomas pulmo), 로필레마 에스쿨렌툼(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 스토몰로푸스 멜레아그리스(Stomolophus meleagris), 아우렐리아 종(Aurelia sp.), 카시오페아 안드로메다(Cassiopea andromeda), 네모필레마 노무라이(Nemopilema nomurai), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 하이드로겔, 페이스트, 분말, 바람직하게는 미분된 분말, 멤브레인, 스캐폴드, 용액, 스펀지 매트릭스, 나노섬유 전기방사 매트릭스 또는 동결 건조된 형태인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 성장 인자를 추가로 포함하는, 사용을 위한 조성물.
제11항에 있어서, 적어도 하나의 성장 인자가 혈소판 풍부 혈장(PRP), 상피 성장 인자 38(EGF), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-B, TGF-B2, TGF-B3), 간세포 성장 인자(HGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 과립구-단핵구 집락 자극 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 및/또는 혈관 5 내피 성장 인자(VEGF), 또는 이들의 임의의 조합인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항균 화합물을 추가로 포함하는, 사용을 위한 조성물.
제13항에 있어서, 적어도 하나의 항균 화합물이 나노 실리버, 페니실린, 오플록사신, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 에리트로마이신, 겐타마이신, 플루클록사실린, 클라리스로마이신, 독시사이클린, 겐타마이신, 메트로니다졸, 코-아목시클라브, 코-트리목사졸(페니실린 내), 세프트리악손, 피페라실린과 타조박탐, 클린다마이신, 시프로플록사신, 반코마이신, 테이코플라닌, 리네졸리드 및/또는 표준 항균제, 또는 이들의 임의의 조합인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 상처에 대한 국소 적용을 위해 제형화되는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐이 투여당 0.01 g/L 내지 200 g/L, 바람직하게는 1 g/L 내지 50 g/L의 용량으로 투여되는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 크림, 바이-겔, 연고, 마스크, 세럼, 우유, 로션, 페이스트, 폼, 에어로졸, 스틱, 샴푸, 컨디셔너, 패치, 하이드로알콜 또는 유성 수용액, 수중유 또는 유중수 또는 다중 에멀젼, 수성 또는 유성 겔, 액체, 페이스트성 또는 고형 무수 생성물, 전기방사 콜라겐 나노섬유 매트릭스, 소구체를 사용하는 수성 상의 멤브레인 및/또는 오일 분산액(이러한 소구체는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 나노구체 및 나노캡슐 또는 지질 소포와 같은 중합체성 나노입자임), 보다 바람직하게는 전기방사된 콜라겐 나노섬유 매트릭스 및/또는 멤브레인으로 제형화된, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체, 및/또는 약학적 활성 성분을 추가로 포함하는, 사용을 위한 조성물.
제18항에 있어서, 약학적 활성 성분이 바람직하게는 0.1 내지 2% 농도의 리도카인인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 상처가 욕창, 이식 부위, 수술 상처, 궤양, 바람직하게는 당뇨병성 궤양, 열화상, 화학물질 화상, 전기 화상, 열상, 찰과상, 천자, 박리, 장액종, 및/또는 혈종인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 미분된 분말의 형태인, 사용을 위한 조성물.
제21항에 있어서, 미분된 분말이 1 μm 내지 1000 μm의 입자 크기를 갖고, 바람직하게는 미분된 분말이 200 μm 내지 500 μm의 입자 크기를 갖는, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 콜라겐이 콜라겐 3D 스펀지 스캐폴드의 형태인, 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 치료된 상처에서 개선된 혈관신생을 촉진하고, 선택적으로 개선된 혈관신생은 치료되지 않은 상처 및/또는 소 콜라겐으로 치료된 상처에 대한 것인, 사용을 위한 조성물.
적어도 하기 단계를 포함하는 제1항에 정의된 바와 같은 해파리 콜라겐의 제조 방법:
i) 해파리 콜라겐 공급원으로부터 산성 가용성 콜라겐을 추출하는 단계; 및
ii) 상기 해파리 콜라겐을 정제하여 정제된 해파리 콜라겐의 용액을 제공하는 단계.
제25항에 따른 해파리 콜라겐의 제조 방법으로서, 하기 단계를 추가로 포함하는 해파리 콜라겐의 제조 방법:
iii). 가교제를 첨가하여 가교된 해파리 콜라겐을 형성하는 단계.
제26항에 있어서, 상기 가교제가 EDC, Genipin 또는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)인, 해파리 콜라겐의 제조 방법.
제27항에 있어서, 상기 가교제는 EDC이고, 선택적으로 EDC는 0.01% 내지 5%의 농도이고, 바람직하게는 EDC는 0.5% 내지 1%의 농도인, 해파리 콜라겐의 제조 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 추출된 해파리 콜라겐을 펩티다제로 분해하여 아텔로 해파리 콜라겐을 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 펩티다제는 펩신인, 해파리 콜라겐의 제조 방법.
제29항에 있어서, 콜라겐을 펩티다제로 분해하는 단계가 추출 단계 이후 및 정제 단계 이전인, 해파리 콜라겐의 제조 방법.