CN115551561A

CN115551561A - 水母胶原蛋白的用途

Info

Publication number: CN115551561A
Application number: CN202180029377.8A
Authority: CN
Inventors: 安德鲁·梅恩斯·斯普拉格
Original assignee: Geragen Co ltd
Current assignee: Geragen Co ltd
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-12-30
Also published as: EP4132599A1; WO2021205167A1; CA3178844A1; US20230148082A1; KR20230066268A; JP2023521338A; JP7496888B2; GB202005141D0

Abstract

本发明涉及水母胶原蛋白在治疗伤口中的用途以及所述水母胶原蛋白的制造。

Description

水母胶原蛋白的用途

技术领域

本发明涉及用于治疗伤口的水母胶原蛋白及其制造。

背景技术

伤口愈合是一个复杂的过程，涉及不同免疫系统与生物系统之间的协调相互作用。长期伤口仍然是一个具有挑战性的临床问题，每年影响大约600万患者，具有很高的经济影响。

伤口愈合是皮肤(或另一器官组织)在受伤后自行修复的过程。在正常皮肤中，表皮(最外层)和真皮(内层或更深层)处于稳态平衡状态，并且与外界环境隔绝。当皮肤破裂时，伤口愈合的正常(生理)过程开始了。伤口愈合的经典模型包括三个或四个连续又重叠的阶段：

阶段1：止血。

阶段2：炎症。

阶段3：增生。

阶段4：重塑。

皮肤受伤后，一系列复杂的生化事件会以紧密协调的级联方式发生以修复损伤。由于许多潜在刺激(局部组织缺血、生物负载、坏死组织、反复创伤等)，伤口可能在炎性阶段停滞，从而导致伤口的慢性化。慢性伤口的一个关键组成部分是基质金属蛋白酶(MMP)水平升高。在升高的水平下，MMP不仅会降解不能存活的胶原蛋白，还会降解存活的胶原蛋白。另外，慢性伤口中的成纤维细胞可能无法分泌足够水平的MMP组织抑制剂(TIMP)来控制MMP的活性。这些事件阻止了细胞迁移所需支架的形成，并最终阻止了细胞外基质(ECM)和肉芽组织的形成。在包含糖尿病足溃疡在内的慢性伤口的情况下，相关的慢性微生物感染和炎症的组合可能导致毛细血管退化(血流减少)和截肢。因此，靶向糖尿病足溃疡(DFU)的新药物可以有利地提供刺激血液流向受影响区域并促进伤口愈合的能力。

基于胶原蛋白的伤口敷料已被证明特别适合通过充当伤口中的‘牺牲基质’来解决MMP水平升高的问题。还已经证明，胶原蛋白分解产品对于形成肉芽组织所需的多种细胞类型具有趋化性。另外，基于胶原蛋白的敷料具有吸收伤口渗出物和维持湿润伤口环境的能力。

许多不同的胶原蛋白敷料可供使用，所述胶原蛋白敷料采用各种载体/组合剂，如凝胶、糊剂、聚合物、氧化再生纤维素(ORC)和乙二胺四乙酸(EDTA)。这些产品中的胶原蛋白往往源自牛、猪、马或禽类来源，其经过纯化以使其无抗原性。然而，有许多与这些胶原蛋白类型的使用相关的缺点，包含血管生成特性差、疾病和病毒传播风险增加以及与获得这些胶原蛋白相关的相当大的成本。

因此，将适合用于治疗伤口而不显示上述缺点的胶原蛋白来源将是特别有利的。

发明内容

本发明涉及用于治疗伤口的水母胶原蛋白。如将从下文呈现的体内和体外数据中显而易见的，本发明人惊奇地发现包括水母胶原蛋白的组合物可作为哺乳动物胶原蛋白(例如，牛)的替代物用于治疗伤口，同时显示等效的结果和提供许多优越的品质，如血管生成特性、增加的稳定性、低免疫原性以及较低的病毒传播和疾病/朊病毒传播风险。鉴于与哺乳动物胶原蛋白相比，水母胶原蛋白的物理化学和氨基酸特性大不相同，这是一个完全出乎意料的发现。

因此，本发明的第一方面涉及用于治疗伤口的组合物，其中所述组合物包括水母胶原蛋白。

本发明的第二方面涉及一种制造上述水母胶原蛋白的方法，其至少包括以下步骤：

i)从水母胶原蛋白来源中提取酸溶性胶原蛋白；以及

ii)纯化所述水母胶原蛋白以提供经纯化的水母胶原蛋白溶液。

附图说明

现将参照附图仅借助于实例描述本发明的实施例，在所述附图中：

图1示出了从第3天到第7天的组平均宽度(mm)的变化，由卡尺测量确定。

图2示出了从第3天到第7天的组平均宽度(mm)的变化，由形态测量学确定。

图3示出了从第3天到第7天的组平均上皮再生(％)的变化。

图4示出了从第3天到第7天的组平均组织肉芽评分(4A)和伤口面积肉芽平均百分比(％)(4B)的变化。

图5示出了仅Tegaderm组的H&E染色伤口切片的代表性图像。图A)、B)和C)表示第3天从伤口切片收集的图像，图D)、E)和f)表示第7天从伤口切片收集的图像。

图6示出了水母胶原蛋白海绵组的H&E染色伤口切片的代表性图像。图A)、B)和C)表示第3天从伤口切片收集的图像，图D)、E)和f)表示第7天从伤口切片收集的图像。

图7示出了来自化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊组的H&E染色伤口切片的代表性图像。图A)、B)和C)表示第3天从伤口切片收集的图像，图D)、E)和f)表示第7天从伤口切片收集的图像。

图8示出了交联的水母胶原蛋白海绵组的H&E染色伤口切片的代表性图像。图A)、B)和C)表示第3天从伤口切片收集的图像，图D)、E)和f)表示第7天从伤口切片收集的图像。

图9示出了

组的H&E染色伤口切片的代表性图像。图A)、B)和C)表示第3天从伤口切片收集的图像，图D)、E)和f)表示第7天从伤口切片收集的图像。

图10示出了第3天和第7天来自不同处理组的胶原蛋白I染色伤口切片的代表性图像。图A)示出了Tegaderm组在第3天的伤口切片，图B)示出了Tegaderm组在第7天的伤口切片，图C)示出了水母胶原蛋白海绵组在第3天的伤口切片，图D)示出了水母胶原蛋白海绵组在第7天的伤口切片，E)示出了化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊组在第3天的伤口切片，图F)示出了化学修饰的(硫醇化)胶原蛋白糊组在第7天的伤口切片，图G)示出了交联的水母胶原蛋白海绵组在第3天的伤口切片，图H)示出了交联的水母胶原蛋白海绵组的在第7天伤口切片，图I)示出了

组在第3天的伤口切片，并且图L)示出了

组在第7天的伤口切片。

图11示出了仅Tegaderm组(第3天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图12示出了仅Tegaderm组(第7天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图13示出了水母胶原蛋白海绵组(第3天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图14示出了水母胶原蛋白海绵组(第7天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图15示出了化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊组(第3天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图16示出了化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊组(第7天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图17示出了交联的水母胶原蛋白海绵组(第3天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图18示出了交联的水母胶原蛋白海绵组(第7天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图19示出了

组(第3天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图20示出了

组(第7天)的伤口切片的代表性图像，标记有特定的内皮细胞标志物CD31。

图21以“随时间推移剩余的伤口面积％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中处理组的伤口闭合曲线。实验如实例3所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；非交联海绵；0.5％ EDC XL粉末；1.0％ EDC XL粉末；Promogran^TM)。

图22以“伤口收缩％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中处理组的伤口收缩曲线。实验如实例3所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；非交联海绵；0.5％ EDC XL粉末；1.0％ EDC XL粉末；Promogran^TM)。

图23以“伤口上皮再生％”示出了伤口的上皮再生曲线，所述上皮再生在db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中不同处理组之间受伤后第4天首次可测量。实验如实例3所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；非交联海绵；0.5％ EDCXL粉末；1.0％EDC XL粉末；Promogran^TM)。

图24示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中每个实验组中伤口组织学外观的代表性实例(大约等比例)。在图25中可以找到每个伤口中心区域的更高放大倍数视图。

图25示出了图24中显示的伤口组织学外观的代表性实例的中心区域的更高放大倍数图像。

图26示出了1％ EDC交联的水母胶原蛋白粉末对以下的影响：(A)第8天；(B)第12天；以及(C)第16天，示出了水合肿块的进行性血管形成(V)。

图27以“随时间推移剩余的伤口面积％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中所有处理组的伤口闭合曲线。实验如实例4所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；1.0％ EDC XL粉末；硫醇化粉末；

可流动基质。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天，n＝4，第42天至第63天)。

图28以“随时间推移剩余的伤口面积％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中所有被测水母胶原蛋白处理组的伤口闭合曲线。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

图29以“随时间推移剩余的伤口面积％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中硫醇化粉末和Integra FM处理组的伤口闭合曲线。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

图30以“伤口收缩％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中处理组的伤口收缩曲线。实验如实例4所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；XL海绵；1.0％ EDC XL粉末；硫醇化粉末；

图31以“伤口收缩％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中所有测试的水母胶原蛋白处理组的伤口收缩曲线。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

图32以“伤口收缩％”数据示出了db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中硫醇化粉末和Integra FM处理组的伤口收缩曲线。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

图33以“伤口上皮再生％”示出了伤口的上皮再生曲线，所述上皮再生在db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中不同处理组之间受伤后第4天首次可测量。实验如实例4所述进行，并且测试组为：对照(仅薄膜敷料)；1.0％ EDC XL粉末；硫醇化粉末；

图34以“伤口上皮再生％”示出了所有测试的水母胶原蛋白处理组的伤口的上皮再生曲线，所述曲线在db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中不同处理组之间受伤后第4天首次可测量。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

图35以“伤口上皮再生％”示出了测试的硫醇化粉末和Integra FM处理组的伤口的上皮再生曲线，所述曲线在db/db(BKS.CG-m Dock 7m+/_+Leprdb/J)糖尿病小鼠模型中不同处理组之间受伤后第4天首次可测量。如实例4中所描述的进行实验。示出了测试组中所有动物的结果–平均值±s.e.m.(n＝12至第35天)。

具体实施方式

在以下详细描述中，阐明了许多具体细节以便彻底理解本发明。本领域普通技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实施本发明的实施例，同时仍保持在权利要求的范围内。

在第一方面，本发明提供用于治疗伤口的组合物，其中所述组合物包括水母胶原蛋白。

短语‘伤口的治疗’或术语‘伤口治疗’是指有助于皮肤和任何相关组织在受伤后自我修复的复杂过程的任何治疗。可能受益于使用水母胶原蛋白的伤口的实例包含但不限于压疮、移植部位、外科手术伤口、溃疡、烧伤(热、化学或电)、撕裂伤、擦伤、刺伤、撕脱伤、血清肿和/或血肿。在优选的实施例中，伤口与大疱性表皮松解症(EpidermolysisBullosa)无关。

在一些实施例中，水母胶原蛋白不是水解产物形式。对于“水解产物形式”，包含已通过热或蛋白酶/胶原蛋白酶活性降解以产生定义为胶原蛋白肽和明胶样分子的胶原蛋白片段的胶原蛋白的含义。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是其去端肽形式。对于“去端肽形式”，包含通过去除已知在人体中诱导抗原性的N端和C端端肽组分而获得的胶原蛋白的低免疫原性衍生物的含义。通常通过用I型胃蛋白酶处理胶原蛋白来去除端肽。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是其端肽形式。对于“端肽形式”，包含在酸性条件中提取的胶原蛋白产生包含末端肽的可溶性胶原蛋白的含义。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是硫醇化的。术语‘硫醇化’是指水母胶原蛋白与硫醇反应，导致引入-SH基团或‘硫醇’基团。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是交联的。在本发明的上下文中，术语‘交联的’是指两个独立的胶原蛋白分子通过共价键连接。优选地，待交联的胶原蛋白分子是胶原蛋白纤维的形式，导致发生原纤维间的交联。为了产生交联的硫醇化水母胶原蛋白，可以使用‘交联剂’(‘cross-linking agent’或‘cross-linker’)。术语‘交联剂’(‘cross-linkingagent’或‘cross-linker’)是指在某些条件下可以在两个独立分子之间形成共价连接的试剂。在本发明的上下文中，交联剂用于共价连接两个独立的胶原蛋白分子。优选地，待交联的胶原蛋白分子是胶原蛋白纤维的形式。优选地发生原纤维间交联。在一些情况下，交联剂通常由通过烃链连接在一起的两个或更多个反应性官能团组成。两个或更多个官能团不一定必须相同。烃链的长度也可以改变以控制官能团之间的距离。在本发明的上下文中烃链的确切长度并非旨在限制。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是非交联的。

水母胶原蛋白的来源可以来自钵水母纲(Scyphozoa)亚门。用于治疗伤口的水母胶原蛋白的来源可以选自由以下组成的组：根口水母(Rhizostomeae)目，包含但不限于褐色根口水母(Rhizostomas pulmo)、沙海蜇(Rhopilema esculentum)、地中海水母(Rhopilema nomadica)、炮弹水母(Stomolophus meleagris)、仙女水母属(Cassiopeasp.)(仙女水母)，包含但不限于仙后水母(Cassiopea andromeda)、旗口水母(Semaeostomease)目，包含海月水母属(Aurelia sp.)和其它属，如野村水母(Nemopilemanomurai)、沙海蜇、地中海水母、炮弹水母或其任何组合。优选地，水母胶原蛋白的来源是褐色根口水母。因此，胶原蛋白可以包括至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的褐色根口水母胶原蛋白。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以具有至少1mg/mL的浓度。设想可以使用的水母胶原蛋白的最大浓度为50mg/mL。因此，水母胶原蛋白的浓度可以在1mg/mL至50mg/mL、2mg/mL至50mg/mL、3mg/mL至50mg/mL、4mg/mL至50mg/mL、5mg/mL至50mg/mL、6mg/mL至50mg/mL、7mg/mL至50mg/mL、8mg/mL至50mg/mL、9mg/mL至50mg/mL、10mg/mL至50mg/mL、11mg/mL至50mg/mL、12mg/mL至50mg/mL、13mg/mL至50mg/mL、14mg/mL至50mg/mL、15mg/mL至50mg/mL、16mg/mL至50mg/mL、17mg/mL至50mg/mL、18mg/mL至50mg/mL、19mg/mL至50mg/mL、20mg/mL至50mg/mL、25mg/mL至50mg/mL、30mg/mL至50mg/mL、35mg/mL至50mg/mL、40mg/mL至50mg/mL或45mg/mL至50mg/mL之间。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以在高达至少37℃的温度下保持稳定。术语‘稳定’是指水母胶原蛋白在给定的环境条件下基本不变性并维持其期望的特性的能力。鉴于本发明的预期用途涉及产品与受试者的物理接触，这是有利的特性。设想受试者是人，然而本发明也可用于兽医行业，例如用于狗、猫、马、牛、山羊、绵羊等的伤口治疗。

用于治疗伤口的水母胶原蛋白可以是水凝胶、糊剂、粉末，优选地微粉化粉末、膜、支架、溶液、海绵基质、纳米纤维静电纺丝基质，或者呈冻干形式。

‘水凝胶’是一种亲水的聚合物链网络，产生高吸水性材料。术语‘糊剂’是指一种半固体制剂，通常旨在用于皮肤外用。通常，当用于药物配置时，其由脂肪基(例如，凡士林)组成，并且是至少25％的固体物质(例如，氧化锌)。技术人员将认识到水母胶原蛋白的选择形式可能取决于待治疗的特定伤口。例如，烧伤可能需要水凝胶或细胶原蛋白网调配物。

根据本发明的供使用的组合物可以包括另外的药物活性成分。另外的药物活性成分包含生长因子、抗炎剂和抗微生物药物。抗炎剂的实例可以包含非甾体抗炎药(NSAID)，如阿司匹林双水杨酸酯(aspirin salsalate)、双氟尼柳(diflunisal)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、吡罗昔康(piroxicam)、萘普生(naproxen)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)和舒林酸(sulindac)。所选抗炎药的浓度应理解为取决于待治疗伤口的类型和严重程度。可以使用的抗微生物剂的实例包含但不限于纳米银、青霉素(penicillin)、氧氟沙星(ofloxacin)、四环素(tetracycline)、氨基糖苷类和红霉素(erythromycin)。设想了两种或更多种上述药物活性成分的混合物，有或没有上文列出的赋形剂和载体。

在一些实施例中，根据本发明的供使用的组合物进一步包括至少一种生长因子。在优选的实施例中，所述至少的生长因子是富血小板血浆(PRP)、上皮生长因子38(EGF)、转化生长因子-β(TGF-B、TGF-B2、TGF-B3)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞-单核细胞集落刺激生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1(IGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血管5内皮生长因子(VEGF)或其任何组合。

根据本发明的供使用的组合物可以进一步包括至少一种抗微生物化合物。优选地，所述至少一种抗微生物化合物是纳米银、青霉素、氧氟沙星、四环素、氨基糖苷类和红霉素、氟氯西林(flucloxacillin)、克拉霉素(clarithromycin)、强力霉素(doxycycline)、艮他霉素(gentamicin)、甲硝唑(metronidazole)、复合阿莫西林-克拉维酸(co-amoxiclav)、复方新诺明(co-trimoxazole)(在青霉素中)、头孢曲松(ceftriaxone)、哌拉西林(piperacillin)与他唑巴坦(tazobactam)、克林霉素(clindamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)、利奈唑胺(linezolid)和/或标准护理抗微生物剂或其任何组合。

可调配用于治疗伤口的组合物以局部施涂于伤口。在本发明的上下文中，术语‘局部施涂’旨在指将水母胶原蛋白施涂于待治疗的伤口的特定部位。待治疗的伤口可以存在于受试者的皮肤上或受试者的粘膜上，例如口腔内部。根据本发明的供使用的组合物可以调配用于通过本领域已知的任何其它途径施用。例如，根据本发明的供使用的组合物可以调配用于通过负压伤口疗法(NPWT)(也称为真空辅助闭合(VAC))施用，所述疗法涉及使用连接到真空泵的密封伤口敷料，对局部伤口环境受控施加低于大气压的压力。

在一些实施例中，根据本发明的供使用的组合物包括每次施用剂量为0.01g/L至200g/L，优选地1g/L至50g/L的胶原蛋白。

根据本发明的供使用的组合物可以调配成霜剂、双凝胶、软膏、面膜、血清、乳、洗剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、棒、洗发剂、调节剂、贴剂、水醇或油性水溶液、水包油或油包水或多重乳液、水性或油性凝胶、液体、糊状或固体无水产品、静电纺丝胶原蛋白纳米纤维基质、膜和/或使用球体在水相中的油分散剂，这些球体是聚合物纳米颗粒，如纳米球和纳米胶囊或离子和/或非离子类型的脂质囊泡，更优选地静电纺丝胶原蛋白纳米纤维基质和/或膜。

根据本发明的供使用的包括水母胶原蛋白的组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂和/或载体，和/或药学活性成分。赋形剂和载体可以增强药物活性成分或水母胶原蛋白的稳定性和/或改善药物活性成分或水母胶原蛋白的生物药物特性，所述药物活性成分或水母胶原蛋白可能具有或不具有缀合的活性物质。合适的药学上可接受的赋形剂和载体的实例可以包含无菌水、橄榄油、油酸乙酯、乙二醇、单糖，如果糖、葡萄糖和半乳糖；非还原性二糖，如蔗糖、乳糖和海藻糖；非还原性寡糖，如棉子糖和松三糖；非还原淀粉衍生的多糖产物，如麦芽糖糊精、葡聚糖和环糊精；以及非还原性糖醇，如甘露醇和木糖醇。其它合适的赋形剂包含纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。还设想了两种或更多种上述赋形剂或载体(或任何其它合适的等效物)的混合物。应当理解，具有类似效果的任何其它物质也将是合适的。

在优选的实施例中，药物活性成分可以是1％的利多卡因(lidocaine)。利多卡因或盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)是一种麻醉剂，通常用作麻木剂。利多卡因可以是至多5％的利多卡因，例如介于0.1％与5％之间的利多卡因、0.5％与5％之间的利多卡因、1％与5％之间的利多卡因、1.5％与5％之间的利多卡因、2％与5％之间的利多卡因、2.5％与5％之间的利多卡因、3％与5％之间的利多卡因、3.5％与5％之间的利多卡因、4％与5％之间的利多卡因以及4.5％与5％之间的利多卡因。优选地，利多卡因的浓度为0.1％至2％。适用于相同目的的另外的麻醉剂的实例包含但不限于苯佐卡因(benzocaine)、丁苯安(butamben)、地布卡因(dibucaine)、利多卡因、奥布卡因(oxybuprocaine)、普拉莫辛(pramoxine)、丙美卡因(proparacaine)、丙氧间卡因(proxymetacaine)和丁卡因(tetracaine)。

根据本发明的供使用的组合物可用于治疗选自由以下组成的列表的伤口：压疮、移植部位、外科手术伤口、溃疡，优选地糖尿病溃疡、热烧伤、化学烧伤、电烧伤、撕裂伤、擦伤、刺伤、撕脱伤、血清肿和/或血肿。

设想本发明可以构成伤口敷料的至少一部分，有或没有上述药剂的另外存在。伤口敷料可以含有另外的成分，如藻酸盐和纤维素衍生物，所述另外的成分可以增强吸收性、柔韧性和舒适性，并且有助于维持有利于愈合的环境。

在一个实施例中，根据本发明的供使用的组合物可以包括呈微粉化粉末形式的水母胶原蛋白。优选地，微粉化粉末具有1μm至1000μm的粒径，更优选地，微粉化粉末具有200μm至500μm的粒径。

在特定实施例中，根据本发明的供使用的组合物可以包括呈胶原蛋白3D海绵支架形式的水母胶原蛋白。

在一些实施例中，根据本发明的供使用的组合物促进治疗的伤口中血管生成的改善。优选地，改善的血管生成是相对于未治疗的伤口和/或用牛胶原蛋白治疗的伤口而言的。

在本发明的第二方面，一种制造上述水母胶原蛋白的方法，其至少包括以下步骤：

i)从水母胶原蛋白来源中提取酸溶性胶原蛋白；以及

‘纯化的水母胶原蛋白溶液’是指分离的水母胶原蛋白溶液，所述溶液基本上是单体的，或可替代地基本上不含胶原蛋白原纤维。在此上下文中，‘基本上不含’是指胶原蛋白溶液中少于2重量％的胶原蛋白由原纤维组成。为了在这些条件下维持胶原蛋白溶液，可以将分离的胶原蛋白储存在不利于胶原蛋白原纤维形成的条件下。这可以意指胶原蛋白在酸性条件下储存，其中酸性意指其pH为pH 1至pH 6.5的任何溶液，或可替代地在碱性条件下，其中碱性意指其pH为pH 8至pH 14的任何溶液。作为非限制性实例，胶原蛋白可以储存在0.1M的弱酸溶液中。弱酸可以是乙酸或盐酸。胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度可以在0.1mg/ml至30mg/ml的范围内。优选地，胶原蛋白溶液的浓度为1mg/ml至10mg/ml。

有多种方法可以从解剖环境中‘分离’或‘纯化’水母胶原蛋白。这些中的许多对于技术人员来说是熟知的并且是常规的。例如，可以通过酸提取从水母中纯化胶原蛋白，其中将水母的不同解剖部位沐浴在酸性溶液中。‘沐浴’(‘bathing’或‘bathed’)是指将水母在酸性溶液中温育足够量的时间以释放胶原蛋白分子的过程。胶原蛋白纯化的替代性方法是酶提取，其中将水母与至少一种蛋白水解酶一起温育足够量的时间，并处在有利于解剖环境降解的条件下以释放胶原蛋白分子。酶提取方法的确切温度、pH和温育时间将取决于所使用的蛋白水解酶而有所不同。最合适的条件对于熟练技术人员来说是熟知的。作为非限制性实例，酶胃蛋白酶可以在酸性条件下与水母一起温育以释放胶原蛋白分子。设想在酶提取方法中可以使用任何酶，并且上述实例决不旨在限制。

然后可以通过许多不同的方式将胶原蛋白从酸或酶提取方法的不期望的污染物中进一步分离或纯化。例如，不溶性污染物可以通过离心去除。如果需要更纯的胶原蛋白来源，则可以对分离的胶原蛋白进行凝胶过滤，或使用能纯化胶原蛋白分子的替代性色谱方法，以去除提取过程中的其它可溶性污染物。进一步纯化的确切方法没有特别限制。蛋白质生物化学家熟知和常规使用的任何方法都可以用于获得纯化的或分离的水母胶原蛋白。此步骤还可以将水母胶原蛋白转移到期望的储存缓冲剂中，以获得期望的纯化的水母胶原蛋白溶液。这可以通过在纯化前首先用期望的存储缓冲剂平衡色谱设备来实现。存在许多可用于此目的的替代性、熟知的方法。优选地，用于本发明的胶原蛋白溶液的纯度为70％至99％，其中纯度是指溶液中可归因于胶原蛋白分子的重量％。更优选地，胶原蛋白溶液的纯度为至少95％、96％、97％、98％或99％。

在一些实施例中，制造方法进一步包括以下步骤：

iii).添加交联剂以形成交联的水母胶原蛋白。

在一些实施例中，交联剂是EDC、京尼平(Genipin)或聚乙二醇(PEG)。优选地，交联剂是EDC。EDC的浓度可以是0.01％至5％、0.05％至5％、0.1％至5％、0.2％至5％、0.3％至5％、0.4％至5％、0.5％至5％、0.6％至5％、0.7％至5％、0.8％至5％、0.9％至5％、1％至5％、1.5％至5％、2％至5％、3％至5％、3.5％至5％、4％至5％或4.5％至5％。优选地，EDC的浓度是0.5％至1％。

在一些实施例中，制造水母胶原蛋白的方法进一步包括用肽酶消化提取的水母胶原蛋白以提供去端肽水母胶原蛋白。优选地，在用肽酶消化胶原蛋白的步骤中，所述肽酶是胃蛋白酶。胃蛋白酶可以是哺乳动物来源的、非哺乳动物来源的(例如，木瓜蛋白酶)或微生物来源的。在一些实施例中，用肽酶消化胶原蛋白的步骤是在提取步骤之后和纯化步骤之前

上述水母胶原蛋白的制造方法可以进一步包括以下步骤：i)提供包括S-S键的水母胶原蛋白；ii)通过还原S-S键在所述包括S-S键的水母胶原蛋白中引入-SH基团以提供包括-SH基团的胶原蛋白硫醇。

为了使水母胶原蛋白包括-SH基团，水母胶原蛋白必须首先包括S-S键或‘二硫化物’基团。天然存在的胶原蛋白通常不包括S-S键。二硫化物基团可以通过多种途径掺入胶原蛋白中。包括S-S键的水母胶原蛋白可以通过具有赖氨酸和羟赖氨酸残基之一或两者的水母胶原蛋白获得。胶原蛋白由多肽链的三螺旋形成，其中一个或多个通常包括赖氨酸和羟赖氨酸残基之一或两者。赖氨酸和羟赖氨酸是具有ε-氨基的α-氨基酸。如本文所使用的，术语‘残基’是指在掺入(例如通过化学反应和键形成)另一种物质之后剩余的化合物部分。因此，氨基酸‘残基’是指存在于多肽中的氨基酸单体的聚合形式。尽管胶原蛋白中的含量比赖氨酸残基少4倍至5倍，但羟赖氨酸残基的含量也足以用于本文所公开的方法。因此，包括赖氨酸或羟赖氨酸残基的胶原蛋白，在如本文所描述的处理之前，可以包括式(XI)的残基：

其中R⁵是H或OH。当R⁵是H时，存在赖氨酸残基。当R⁵是OH时，存在羟基赖氨酸残基；并且

X选自基团OH和化学键，且Y选自H和化学键，条件是X和Y中的一个或两个是在胶原蛋白内形成肽键的化学键。形成经修饰的胶原蛋白的一部分的肽链在式(XI)中用“[]”括起来。残基可以在肽的末端位置，例如如果X和Y中的一个或另一个分别是OH和H。如果X和Y都是肽键，则赖氨酸残基在肽链中是非末端的，形成胶原蛋白的一部分。

包括赖氨酸和羟赖氨酸残基中的一种或两种的水母胶原蛋白优选地是包括赖氨酸和羟赖氨酸中的一种或两种的溶解的水母胶原蛋白。可以通过胃蛋白酶消化或酸消化以提供包括赖氨酸和羟赖氨酸中的一种或两种的胃蛋白酶溶解的水母胶原蛋白或通过酸消化以提供包括赖氨酸和羟赖氨酸中的一种或两种的酸溶解的水母胶原蛋白来实现溶解。

水母胶原蛋白，如胃蛋白酶溶解的或酸溶解的水母胶原蛋白，包括赖氨酸和羟赖氨酸残基中的一种或两种，可以与包括二硫化物(即S-S)基团的活化的二羧酸衍生物反应以提供包括S-S键的胶原蛋白。在此反应中，活化的二羧酸衍生物的羰基可以与水母胶原蛋白中存在的赖氨酸或羟赖氨酸残基的ε-氨基反应形成酰胺键。

活化的二羧酸衍生物优选地是下式的化合物：

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ (I)

其中R¹、R²和R³独立地表示二价连接基团，优选地二价有机连接基团，更优选地二价烃连接基团，如具有1个至6个碳原子的烷二基或具有2个至6个碳原子的烯二基或炔二基。仍更优选地，R¹、R²和R³独立地表示乙二基或丙二基，最优选地乙二基，即-CH₂CH₂-。基团R¹、R²和R³可以通过用羟基或卤素(如F或Cl)取代一个至四个氢原子而独立地任选地取代。在优选的实施例中，R¹和R²相同；ZN和ZN一起表示含氮杂环基，优选地在杂环中具有5个至6个原子的含氮杂环基，其中N原子直接与式(I)的化合物的羰基键合，使得Z表示二价连接基团，其中两个化合价与氮键合。杂环基可以是饱和的或不饱和的，使得Z可以表示烷二基、烯二基或炔二基，特别是具有2个至4个碳原子。Z可以任选地包括1个或2个选自O、S和N的杂原子。

更优选地，ZN是在芳环中具有5个至6个原子的含氮杂芳基，其中1个至3个原子是选自O、N和S的杂原子，其中至少1个是与式(I)的化合物的羰基直接键合的N。仍更优选地，杂芳基在芳环中具有5个至6个原子，其中2个原子是N。可替代地，ZN是在具有1个N原子的杂环中具有5个至6个原子的含氮杂环基，所述N原子与式(I)的化合物的羰基直接键合，并且Z是α,ω-有机二酮二基。例如，α,ω-有机二酮二基可以表示为–C(O)R⁴C(O)-，其中R⁴是具有2个或3个碳原子的烷二基或烯二基。

基团ZN可以任选地通过用羟基或卤素(如F、Br或Cl)取代一个至四个氢原子或通过用氧原子取代与相同碳键合的两个氢原子以形成羰基来取代，其中后一种取代可以发生一次或两次。

最优选地，基团ZN是：

1-咪唑，即

或1-吡咯烷-2,5-二酮，即

优选的活化的二羧酸衍生物可以选自：

活化的二羧酸衍生物(I)可以分两步合成。首先，式(IV)的二氨基二硫化物可以与至少两个摩尔当量的式(V)的二羧酸酐反应以提供式(VI)的二羧酸二酰胺：

H₂N-R¹-S-S-R²-NH₂(IV)+

(V)→HO-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-OH (VI)

其中R¹、R²和R³是如以上所定义的。显然，当R¹和R²相同时，式(IV)的二氨基二硫化物是对称分子，这将产生对称的活化的二羧酸衍生物(I)。

第一反应步骤可以通过将式(IV)的二氨基二硫化物溶解在如水等溶剂中并添加式(V)的二羧酸酐来进行。优选的是反应在碱性条件下进行，这样在添加酸酐之前，可以添加碱。例如，可以添加氢氧化钠水溶液将pH调节到10。添加二羧酸酐后，pH可能会降低，优选的是在反应期间通过添加另外的碱将pH维持在7至10的范围内。所述反应可以在室温下在搅拌下进行并且可以在30分钟至2小时内完成。式(VI)的二羧酸二酰胺产物可以通过添加酸(如盐酸水溶液)来降低pH，例如pH达到1来沉淀。可以通过过滤，用水洗涤，然后在减压下干燥来分离沉淀的二羧酸二酰胺(VI)。

在合成的第二步骤中，通过添加含氮杂环化合物来活化二羧酸二酰胺(VI)以提供活化的二羧酸衍生物(I)：

HO-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-OH (VI)→ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ (I)

其中R¹、R²、R³和NZ是如以上所定义的。

在一个实施例中，含氮杂环化合物可以是碳二亚胺，如式(VII)的化合物：

其中Z是如以上所定义的。优选地，ZN一起为芳环中具有5个至6个原子的含氮杂芳基，其中1个至3个原子是选自O、N和S中的杂原子，其中至少1个是N。碳二亚胺(VII)更优选地是1,1'-羰基-二咪唑等。

每摩尔二羧酸二酰胺(VI)应使用至少2摩尔当量的碳二亚胺。理论上，每摩尔二羧酸二酰胺(VI)，所述反应将产生2摩尔当量的二氧化碳和2摩尔当量的咪唑。二氧化碳气体的放出表明反应正在进行。反应可以在减压下进行。

在另一个实施例中，含氮杂环化合物可以是式(VIII)的N-羟基杂环化合物：

其中ZN一起是杂环中具有5个至6个原子的含氮杂环基，其中1是N，并且Z是α,ω-有机二酮二基。例如，α,ω-有机二酮二基可以表示为–C(O)R⁴C(O)-，其中R⁴是具有2个或3个碳原子的烷二基或烯二基。N-羟基杂环化合物(VIII)最优选地是N-羟基琥珀酰亚胺。

第二反应步骤可以通过将二羧酸二酰胺(VI)溶解在如无水二甲基甲酰胺等溶剂中，然后添加含氮杂环化合物(VII)或(VIII)来进行。活化的二羧酸衍生物(I)从溶液中沉淀。通过过滤收集产物，用无水乙酸乙酯洗涤，并且在减压下干燥。

回到本发明方法的第一步骤，包括赖氨酸和羟赖氨酸残基中的一种或两种的来源胶原蛋白可以与包括二硫化物基团的活化的二羧酸衍生物，如式(I)的活化的二羧酸衍生物反应以提供包括S-S键的胶原蛋白，如包括S-S键的I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、IX型、X型和XI型中的一种或多种的胶原蛋白。在此反应中，活化的二羧酸衍生物的羰基可以与胶原蛋白中存在的赖氨酸或羟赖氨酸残基的ε-氨基反应形成酰胺键，从而并入二硫化物基团。所述反应可以表示为：

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NZ(I)+胶原蛋白-NH₂→ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-胶原蛋白+HNZ

当活化的二羧酸衍生物的两个活化的羧基与胶原蛋白，特别是与不同的胶原蛋白三螺旋或原纤维反应时，此反应可继续提供交联的胶原蛋白：

ZN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-胶原蛋白+胶原蛋白-NH₂→胶原蛋白-HN-C(O)-R³-C(O)-NH-R¹-S-S-R²-NH-C(O)-R³-C(O)-NH-胶原蛋白+HNZ

所述反应可以通过将来源胶原蛋白溶解在溶剂中来进行。来源胶原蛋白的溶解可以分两步进行。在第一步中，可以将来源胶原蛋白与甲醇混合。在第二步中，添加极性非质子溶剂。例如，可以将来源胶原蛋白添加到甲醇和二甲亚砜的混合物中，并使其膨胀。可以在搅拌下添加另外的二甲亚砜，直到源胶原蛋白完全溶解。然后可以通过在减压下蒸发从溶液中去除甲醇。此溶解过程可以与去端肽胶原蛋白和端肽胶原蛋白一起使用。

然后可以将活化的二羧酸衍生物溶解在溶剂中，特别是无水极性非质子溶剂，如二甲亚砜。由于式(I)的活化的二羧酸衍生物对水敏感，与胶原蛋白的反应优选地在如二甲亚砜等无水极性非质子溶剂中进行。然后将溶解在溶剂中的活化的二羧酸衍生物添加到来源胶原蛋白溶液中。活化的二羧酸衍生物的羰基可以与来源胶原蛋白中存在的赖氨酸或羟赖氨酸残基的ε-氨基反应形成酰胺键。

混合物可以在室温下搅拌，例如22℃，直到形成凝胶。然后可以使含有凝胶的混合物保持不受干扰，例如持续12小时至18小时。然后可以通过与过量丙酮混合从凝胶中提取二甲亚砜，通过倾析收集胶原蛋白凝胶，然后与更多丙酮重新混合。然后可以搅拌混合物，例如持续0.5小时至1小时，随后通过过滤分离胶原蛋白，用丙酮洗涤，然后用水-乙醇(30:70v/v)洗涤并用乙醇脱水。由此提供了包括S-S键的水母胶原蛋白。

在替代性实施例中，包括S-S键的水母胶原蛋白可以通过修饰胶原蛋白结合蛋白以包含包括二硫化物基团的光反应性交联剂来提供，将其与水母胶原蛋白结合以提供复合物并照射所述复合物以交联光反应性交联剂以将二硫化物基团并入胶原蛋白中。

此途径通过使用位点特异性光交联策略在水母胶原蛋白上产生蛋白质结合位点，从而允许在胶原蛋白中产生硫醇基团。这涉及通过定点诱变将半胱氨酸残基引入胶原蛋白结合蛋白。可以将光反应性交联剂，优选地APDP引入蛋白质上的半胱氨酸-SH基团。APDP修饰的蛋白质和胶原蛋白的复合物可以通过紫外线(uv)照射进行交联。然后可以通过还原裂解二硫键交联，并在水母胶原蛋白上产生-SH基团。

在第一步中，提供了包括半胱氨酸残基的胶原蛋白结合蛋白。半胱氨酸残基是必需的，因为所述半胱氨酸残基包括与交联剂反应所必需的巯基。胶原蛋白结合蛋白可以是例如色素上皮衍生因子(PEDF)。PEDF是一种已知的抗血管生成/神经营养因子，具有如Yasui等人《生物化学(Biochemistry)》,2003,42,第3160-3167页中所公开的鉴定的胶原蛋白结合位点。

如有必要，如果半胱氨酸不存在或如果胶原蛋白结合蛋白不含有足够的半胱氨酸，则可以将半胱氨酸掺入胶原蛋白结合蛋白中。半胱氨酸取代可以通过定点诱变进行，例如，其中胶原蛋白结合位点位于(F383)和所述位点的相对表面(Y211)上。进行此类定点诱变的方法见于《生物化学杂志(J.D.J.Biol.Chem.)》2002,277,4223-4231和《氧化还原生物化学(R.R.Biochemistry)》1992,31,9526-9532。

由于半胱氨酸取代而引入的巯基然后可以与光反应性交联剂反应。光反应性交联剂应该是双官能的。具体地，光反应性交联剂应该包括能够与巯基反应以产生二硫键的官能团。一种此类合适的官能团是吡啶基-二硫基，即C₅NH₅-S-S-，特别是2-吡啶基二硫基。光反应性交联剂还应该包括能够在光照射下与胶原蛋白交联的官能团。一种此类合适的官能团是叠氮化物基团，特别是芳基叠氮化物基团，如苯基叠氮化物，尤其是对-C₆H₄-N₃。

N-[4-(对叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3'-(2'吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)是优选的光反应性交联剂的一个实例。APDP的二硫化物基团可以与半胱氨酸的硫基反应，在半胱氨酸与光反应性交联剂之间产生二硫键，从而提供包括S-S基团的光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白。作为此反应的一部分，2-吡啶硫酮作为离去基团被释放。

然后可以将光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白与水母胶原蛋白结合，以提供光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白和水母胶原蛋白的复合物。在此步骤中，光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白与水母胶原蛋白的蛋白结合位点结合形成复合物。然后可以照射光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白和胶原蛋白的复合物，例如用紫外(UV)光照射。照射导致存在于光反应性交联剂上的能够交联的官能团与复合物中的相邻胶原蛋白形成共价键。例如，当能够交联的官能团是苯基叠氮化物时，在250nm至280nm的波长范围内照射会产生氮烯，然后所述氮烯可以攻击胶原蛋白上的亲核或活性氢基团，如C-H或C-NH₂，以通过插入C-H或N-H键产生交联。以此方式，包括S-S基团的光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白被掺入到胶原蛋白中以提供包括S-S键的胶原蛋白。很明显，二硫化物基团将通过此途径在胶原蛋白蛋白结合位点附近提供。

然后可以将巯基引入包括S-S键的胶原蛋白中，所述S-S键可以通过上文讨论的任一方法提供，即使用活化的二羧酸衍生物或光反应性交联剂方法。包括S-S键的水母胶原蛋白可以与合适的还原剂反应。还原剂将二硫键还原成两个巯基，从而裂解二硫化物基团所在的活化的二羧酸衍生物残基或光反应性交联剂残基。此类还原通过两个连续的硫醇-二硫化物交换反应进行，导致二硫化物基团的还原产生包括巯基(-SH)基团的水母胶原蛋白。

合适的还原剂包含例如二硫苏糖醇(DTT)、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(DTBA)和三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP盐酸盐)。二硫苏糖醇是优选的还原剂。

还原步骤可以通过将包括S-S键的水母胶原蛋白添加到缓冲溶液中来进行，如pH在7.5至9.5范围内，更优选地约8至9.5，优选地约8.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液。包括S-S键的水母胶原蛋白可能天生是酸性的，并且如果是这样，可能需要用如氢氧化钠等碱中和。

优选地，在相同缓冲剂中每摩尔二硫化物基团可以添加至少两个摩尔当量的DTT还原剂，并且反应在30℃下进行2小时至6小时。反应完成后，可以将液体的pH降低至2，例如使用HCl。然后可以用稀HCl溶液对混合物进行透析、离心和冷冻干燥以提供具有-SH基团的水母胶原蛋白硫醇。

还原可能会导致胶原蛋白链的轻微降解。因此，更短的反应时间、更低的pH和更低的温度都可以用来最小化任何降解。

显然，当使用光反应性交联剂修饰的胶原蛋白结合蛋白提供包括S-S键的水母胶原蛋白时，在形成胶原蛋白硫醇的步骤前，经修饰的胶原蛋白结合蛋白仍将通过光反应性交联剂步骤d与胶原蛋白连接。S-S键的还原将裂解光反应性交联剂的S-S键。

当水母胶原蛋白包括赖氨酸和羟赖氨酸残基中的一种或两种时，提供包括式(X)的赖氨酸或羟赖氨酸残基的水母胶原蛋白硫醇：

其中R¹、R³和R⁵是如以上所定义的。例如，R¹和R³独立地选自二价连接基团，优选地二价有机连接基团，更优选地二价烃连接基团，如具有1个至6个碳原子的烷二基或具有2个至6个碳原子的烯二基或炔二基。仍更优选地，R¹和R³独立地表示乙二基或丙二基，最优选地乙二基(即-CH₂CH₂-)。当氨基酸残基是赖氨酸残基时，R⁵是H。当氨基酸残基是羟赖氨酸残基时，R⁵是OH；X选自基团OH和化学键，且Y选自H和化学键，条件是X和Y中的一个或两个是在胶原蛋白内形成肽键的化学键。形成经修饰的胶原蛋白的一部分的肽链在式(X)中用“[]”括起来。残基可以在肽的末端位置，例如如果X和Y中的一个或另一个分别是OH和H。如果X和Y都是肽键，则赖氨酸残基在肽链中是非末端的，形成胶原蛋白的一部分。

本发明进一步提供了一种制造本文所公开的水母胶原蛋白的方法，所述水母胶原蛋白可以被硫醇化或不被硫醇化，所述方法进一步包括以下步骤：i)将纯化的水母胶原蛋白或胶原蛋白硫醇的溶液与水性中和缓冲剂混合；以及ii)将混合物温育足够量的时间以使胶原蛋白原纤维形成，其中在步骤i)或ii)中添加交联剂以提供交联的胶原蛋白。

术语‘中和缓冲剂’是指可以稀释纯化的水母胶原蛋白溶液，以将pH提高或降低到pH4至pH 9的任何缓冲剂。中和缓冲剂的组成没有特别限制，只要其必须增加或降低纯化的水母胶原蛋白溶液的pH，以使胶原蛋白原纤维的形成可以进行。此外，缓冲剂必须基本上不含可能干扰任何交联过程的离子、化合物或分子。因此，特别期望一种基本上不含未经反应的胺的缓冲剂。仅作为非限制性实例，中和缓冲剂可以是1x至10x磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中1x或10x是指PBS的浓度。1x PBS的组成对于技术人员来说是熟知的。PBS的确切浓度(即1x或例如10x)将完全取决于与纯化的水母胶原蛋白溶液混合时所需的稀释因子，以使纯化的水母胶原蛋白溶液基本上被中和，从而使胶原蛋白原纤维的形成可以进行。在一些实施例中，中和缓冲剂是氢氧化钠。

术语‘原纤维形成’或‘原纤维生成’是指胶原蛋白分子经过受控聚集以形成更高阶、结构良好的大分子组装体的过程。体内胶原蛋白主要是一种细胞外蛋白质，其聚集成纤维状结构为周围组织和/或细胞外基质的组分提供结构支持。胶原蛋白，特别是哺乳动物胶原蛋白的聚集是众所周知的现象。哺乳动物和海洋胶原蛋白的不同的同种型优先地聚集成不同的大分子结构。由每种胶原蛋白同种型形成的独特的大分子结构受胶原蛋白多肽的物理化学特性和促进原纤维生成的条件控制。更高阶胶原蛋白结构，即从哺乳动物或鱼类获得的胶原蛋白原纤维，已在体外被利用以产生哺乳动物和/或鱼类胶原蛋白水凝胶。因此，为了从水母胶原蛋白形成水凝胶，水母胶原蛋白优选组装成更高阶结构。优选地，更高阶结构是原纤维。

设想任何已知在形成胶原蛋白原纤维的条件下交联的交联剂将是用于本发明的合适的交联剂。在某些应用中，可能期望使用对细胞无毒的交联剂。在某些实施例中，交联剂可以选自京尼平、1,4-BDDGE或二氯醛基丙烯酸。优选地，交联剂是京尼平或1,4-BDDGE。

现在参考以下实例和研究进一步描述本发明。

实例

实例1-确定水母胶原蛋白海绵、交联的水母胶原蛋白海绵和化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊在皮肤伤口愈合的小鼠模型中的作用的研究。

目标

比较水母胶原蛋白海绵；交联的水母胶原蛋白海绵；化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊与可商购获得的伤口产品

在C57BL/6J小鼠的切除性皮肤伤口愈合模型中的性能。

程序

Epistem提供了八十(80)只雄性C57BL/6J小鼠，年龄为5周至6周，分为两个队列，每个队列40只小鼠。每个队列的小鼠适应两周，每队列八只小鼠被随机分配到五个处理组之一。在第0天(受伤日)，对所有动物进行麻醉、剃毛，并在每只小鼠的背中线两侧的相同相对位置上切下两个6mm直径的切除性伤口。根据指定的处理组，将以下敷料之一施涂于每只小鼠的伤口腔：预先形成的水母胶原蛋白海绵，标准或交联的；化学修饰的(硫醇化)胶原蛋白凝胶；预切

敷料；无治疗。在进行伤口治疗后，施涂Tegaderm薄膜敷料以覆盖每个伤口。程序后将小鼠放入保温柜中，并且让其从麻醉中恢复，然后再将其送回它们的饲养室。从受伤时起，所有小鼠都被单独饲养。每天至少监测一次伤口是否有任何感染迹象和Tegaderm薄膜敷料的脱落。由于正常小鼠活动引起的Tegaderm折叠，在研究的生命周期内无法准确地进行伤口状况的视觉评估和伤口宽度的测量。

从每个队列中，每个处理组的四只小鼠在受伤后3天被安乐死，四只小鼠在受伤后7天被安乐死。通过颈脱位人道地杀死小鼠，并且切除含有两个伤口的背侧皮肤条。使用数字卡尺确定伤口宽度；伤口还根据肉眼可见的愈合的程度进行主观视觉评分(1至5)。将单个伤口一分为二，一半在液氮中速冻，一半固定在10％中性缓冲福尔马林中，用于组织学处理和制备苏木精(Haematoxylin)和伊红(Eosin，H&E)染色的横向伤口切片。对于每个伤口切片，使用计算机辅助形态测定法(Zeiss Axiohome系统)确定伤口宽度和上皮再生程度。另外，为每个伤口分配肉芽组织成熟度的主观评分，并确定肉芽组织的面积。

结果

从第3天到第7天，每个处理组均显示切除性伤口的愈合，如伤口宽度减小(图1和2)、上皮再生百分比增加(图3)和肉芽增加(图4)(肉芽组织成熟度和肉芽面积)。对于仅Tegaderm的对照组，平均伤口宽度从第3天的(4.57±0.93)mm减少到第7天的(3.71±0.92)mm(引用的数字是平均值±标准偏差)。

交联的水母胶原蛋白海绵组显示的伤口闭合量最大，第3天的平均伤口宽度为(5.11±1.46)mm，第7天的值为(3.16±0.80)mm(图2)。在

组中观察到的伤口闭合最少，第7天的平均伤口宽度为(3.96±1.03)mm。

仅Tegaderm组中的上皮再生从第3天的(17.2±10.5)％进展到第7天的(59.7±37.9)％。

组在第7天显示出最多的上皮再生，为(73.2±27.1)％，交联的水母胶原蛋白海绵组显示出相似的上皮再生水平，为(70.7±30.3)％(图3)。

所有组的肉芽评分和肉芽面积(占总伤口面积的百分比)从第3天到第7天增加(图4)。对于仅Tegaderm组，第3天的平均肉芽评分为(1.46±0.52)，肉芽组织占(33±24)％的伤口空间。到第7天，此组的平均肉芽评分已增加到(2.08±0.51)，其中(61±31)％的伤口空间是肉芽组织。

组在第3天的肉芽评分最低，为(1.17±0.39)，伤口空间内只有(5±6)％的肉芽组织；然而，到第7天，此组的肉芽组织评分最高，为(2.63±0.52)，其中(81±20)％的伤口空间是肉芽组织。水母胶原蛋白海绵组和化学修饰的(硫醇化)胶原蛋白糊组在第3天显示出与仅Tegaderm组相似的肉芽量，而在第3天，使用交联的水母胶原蛋白海绵治疗的伤口空间中肉芽组织量大约为一半，仅为(15±21)％。对于化学修饰的(硫醇化)胶原蛋白糊组，在第7天观察到最低的平均肉芽组织评分(1.67±0.50)，只有(48±41)％的伤口空间是肉芽组织。尽管第3天出现肉芽的伤口空间比例存在差异，但两种类型的水母胶原蛋白海绵在第7天的肉芽水平相似，标准和交联的海绵的评分分别为(2.30±0.82)和(2.18±0.75)。

对H&E染色的伤口横截面的观察表明，在第3天可以看到

和交联的水母胶原蛋白海绵的明显结构覆盖在伤口上。使用交联的水母胶原蛋白海绵，海绵下方愈合上皮的迁移很明显。每组伤口的代表性图像如图5(仅Tegaderm)、图6(水母胶原蛋白海绵)、图7(化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊)、图8(交联的水母胶原蛋白海绵)和图9

所示。这些显示伤口边缘，伤口附近有未受伤的皮肤(通常具有增生的上皮层)。在图像中，Tegaderm敷料可以看作是皮肤表面上方的波浪线。

在所有伤口切片中观察到胶原蛋白I免疫反应性；代表性图像在图10中示出，所述图像来自也出现在H&E图像中的伤口。可以在伤口边缘观察到突出的胶原蛋白1免疫反应性，并且在第7天伤口穿过伤口空间。

结论

动物对不同测试项目的耐受性良好，没有不良反应。在受伤后的七天里，大多数动物的伤口愈合良好，有上皮再生迹象，并且肉芽组织的量和成熟度都随着时间的推移而增加。两种类型的水母胶原蛋白海绵都优于仅Tegaderm敷料，就第7天伤口空间中的组织肉芽程度而言，交联的水母胶原蛋白海绵也表现出更多的上皮再生。相反，水母海绵和参考产品

敷料的性能相似。

此研究表明，水母胶原蛋白是一种合适的替代品，其功效至少与市场上用于治疗伤口的已知产品相当。这些已知产品通常是哺乳动物来源的，因此具有许多缺点。因此，提供适合治疗伤口的替代性胶原蛋白来源是极其有利的。

实例2-使用抗小鼠CD31抗体对小鼠伤口愈合福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品进行免疫组织化学标记。

目标

此研究的目标是对通过研究18/099获得的152个FFPE小鼠伤口进行切片并用抗小鼠CD31进行免疫组织化学标记，所述研究旨在确定测试项在皮肤创伤愈合鼠类模型中的作用。CD31是一种内皮细胞标志物，通常用于确定和测量血管生成。

程序

在研究18/099(一项确定测试项在第3天和第7天时间点在皮肤创伤愈合鼠类模型中的作用的研究)期间获得的152个FFPE小鼠伤口以3μm厚度切片以提供一个载玻片，每个载玻片具有两个非连续切片。将切片安装在带电的载玻片上，并且在37℃下干燥过夜。

在室温下使用蛋白酶K(Dako S3020)蛋白水解消化5分钟进行抗原修复之前，将152个FFPE切片脱蜡和再水合。用TBST中的0.3％ H2O2封闭内源性过氧化物酶持续15分钟，之后用2.5％山羊血清封闭非特异性结合持续30分钟。将切片与抗小鼠CD31、大鼠单克隆抗体、克隆MEC13.3(BD Pharmingen 550274)在室温下以0.3125μg/ml温育1小时。在一个样品上以与初级抗体匹配的浓度包含对应的大鼠单克隆IgG2a同种型对照。包含未经处理的小鼠皮肤样品作为阳性组织对照。在TBST中洗涤切片，并且然后将切片与抗大鼠、小鼠吸附聚合物(Vector ImmPress MP-7444)一起温育。使用DAB(Vector ImmPact SK-4105)可视化所有标记，并且在永久安装之前用苏木精复染切片。将每个标记的载玻片与其对应块进行检查以确认匹配，并且作为质量控制程序的一部分进行显微镜检查。

使用AxioVision成像系统拍摄了三十张代表性图像，所述成像系统由安装在计算机工作站上以捕获图像的Zeiss Axioscope A1显微镜、AxioCam MRc相机和AxioVision软件组成。使用x10物镜拍摄图像。

在第3天(图11、图13、图15、图17和图19)和第7天(图12、图14、图16、图18和图20)拍摄来自每个治疗伤口敷料组(仅Tegaderm、水母胶原蛋白海绵、化学修饰的(硫醇化)水母胶原蛋白糊、交联的水母胶原蛋白海绵和Puracol)的代表性图像。对于朝向，每个伤口都以表皮最上层，即在图像的顶部进行成像。

结果和结论

从研究18/099中采集的伤口样品成功标记了小鼠特异性内皮细胞标志物CD31，所述小鼠特异性内皮细胞标志物表明在这些用水母胶原蛋白处理的样品中发生了血管生成。

与体内数据一样，上述体外数据表明水母胶原蛋白是用于治疗伤口的牛胶原蛋白的合适替代品，所述水母胶原蛋白缺乏与使用哺乳动物胶原蛋白相关联的缺点，如疾病/朊病毒传播风险增加、污染风险增加以及从哺乳动物来源获得胶原蛋白相关的高昂成本。鉴于水母胶原蛋白与哺乳动物胶原蛋白的物理化学和氨基酸特性截然不同，此发现令人惊讶。

实例3–研究水母源性胶原蛋白调配物对db/db(BKS.CG-m Dock 7^m+/_+Lepr^db/J)糖尿病小鼠全层切除性伤口愈合的影响。

目标

研究三种水母源性胶原蛋白调配物对BKS.Cg-m Dock7m+/+Leprdb/J(db/db)糖尿病小鼠(一种皮肤伤口愈合延迟模型)伤口愈合的影响。

程序

被测材料：

-96孔板成型的(直径约6mm)Jellagen非交联海绵-CHCl3灭菌。

-微粉化0.5％ EDC*交联的Jellagen粉末-CHCl3无菌(4g)。

-微粉化1％ EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐)交联的Jellagen粉末-CHCl3无菌(4g)。

-Promogran^TM(蛋白酶调节基质，美国Acelity公司(Acelity,USA))。批号1912V001；有效期2021年2月28日。

BKS.Cg-m Dock7m+/+Leprdb/J糖尿病小鼠模型

下面简要概述所采用的方法。此研究的存活阶段于2019年9月19日与2019年10月9日之间进行。

大约9周至10周龄的糖尿病小鼠(BKS.Cg-m Dock7m+/+Leprdb/J，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Labs,Bar Harbour,ME,USA))被带到英国，并在研究开始前适应环境一周。根据英国内政部(UK Home Office)规定和糖尿病动物的具体要求饲养动物。动物被随机分配到5个处理组(表1)。

表1-实验组

简而言之，使用异氟烷和空气麻醉小鼠，并且根据方案夹住其背侧皮肤并清洁。在距脊柱大约5mm的左背侧创建单个标准化全层伤口(10mm x 10mm)。用无菌盐水浸泡的纱布拭子清洁伤口并用无菌纱布干燥。然后将15μL无菌生理盐水施涂于每个伤口的表面。然后将被测材料直接施涂于盐水湿润的伤口表面。

组2的伤口接受了一个直径约6mm(96孔)的非交联Jellagen海绵；组5中的那些伤口接受了6mm的商用比较物Promogran^TM(美国Acelity公司)圆盘，并且组3和组4接受了5mgEDC交联的Jellagen粉末(分别为0.5％和1.0％ EDC交联的)。产品施涂后，立即用半封闭薄膜敷料Tegaderm^TM薄膜(德国3M朗盛德国有限责任公司(3M Deutschland GmbH,Germany))涂覆所有伤口。在整个研究过程中每天检查此薄膜敷料的状况，如果其脱落则更换。

在受伤后第4天、第8天、第12天和第16天，重新麻醉所有动物，去除其薄膜敷料和任何游离碎片，并且使用无菌盐水浸泡的纱布轻轻清洁其伤口(和边缘皮肤)(不干扰任何伤口内的现有产品)。然后对伤口进行拍照(未示出)，用15μl无菌生理盐水润湿，并且在选定天数将产品重新施涂于选定组的伤口。

最初打算让组2(非交联Jellagen海绵)和组5(Promogran^TM，美国Acelity公司)在受伤后第4天第二次施涂产品。鉴于观察到这些产品均未发生显著降解，因此决定(并与发起人达成一致)此时不再进行重新施涂。然而在受伤后第8天、第12天和第16天进行产品重新施涂(无需事先去除现有未降解产品)。

重新施涂产品后(在指示的情况下)，用Tegaderm^TM薄膜敷料重新涂覆伤口(如上)，并且让动物在温暖的环境(约35℃)中恢复。受伤后即刻，以及随后在第4天、第8天、第12天、第16天和第20天清洁后，所有伤口都与校准/识别板一起进行了数字拍照。

所有动物在受伤后第20天被淘汰。在终止前一小时，所有动物都接受了生理盐水中的5-溴-2'-脱氧尿苷(Sigma B5002)i.p.注射(30μg/g)，以促进在组织切片中检测细胞增殖的可能性。然后从所有伤口采集伤口和周围边缘组织。将组织固定(中性缓冲福尔马林，西格玛公司(Sigma))并包埋在石蜡中以促进组织学研究。

概述

此研究检查了局部施涂三种水母源性调配物(非交联Jellagen海绵、0.5％ EDC交联的Jellagen粉末和1.0％ EDC交联的Jellagen粉末)对愈合受损db/db糖尿病小鼠全层切除性皮肤伤口修复的影响。

将接受这些调配物/产品的伤口愈合情况与接受商用比较物(Promogran^TM蛋白酶调节基质，美国Acelity公司)的伤口愈合情况以及对照(仅薄膜敷料)处理的伤口愈合情况进行比较。

在20天的时间里，根据(i)新真皮修复应答的开始和(ii)伤口闭合来评估伤口愈合。新真皮组织形成的开始表示为每组在每个时间点响应的伤口数量。伤口闭合从整体角度和其组成部分伤口收缩和伤口上皮再生方面进行了考虑。伤口闭合(收缩和上皮再生)由在伤后第0天、第4天、第8天、第12天、第16天和第20天拍摄的数字照片确定在组织学水平上，简要考虑了伤口组织(第20天采集)的H&E染色切片，并且在肉芽组织形成和上皮再生方面进行了比较，并且在其作为支持组织再生的结构支架的潜在用途(对于两种EDC交联的粉末调配物)方面进行了比较。

结果总结-伤口闭合

在受伤后即刻以及随后在第4天、第8天、第12天、第16天和第20天对每个伤口以及识别/校准板进行数字拍照。对于给定时间点的给定伤口，伤口闭合表示为相对于受伤后即刻(即第0天)初始伤口面积的剩余百分比伤口面积。所有处理组的平均剩余百分比伤口面积数据在下表2中描述并在图21中示出。

表2-所有研究组的百分比“剩余伤口面积”数据。

当考虑伤口闭合(对于随时间变化的‘％开放伤口面积’而言)时，观察到以下情况：

-从第12天起，与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，评估的所有三种Jellagen产品均发现显著促进闭合。

-当比较三种Jellagen产品时，未交联海绵的施涂产生了与1.0％ EDC交联的粉末相似的闭合水平，发现两者都略高于对1.0％ EDC交联的粉末的应答。在三种Jellagen产品处理组之间未观察到闭合的统计学显著差异。

结果总结-伤口收缩

收缩是伤口边缘的向心运动，这是由于伤口“身体”内的肉芽组织压实所致。驱动此过程的“压实”力被认为存在于成纤维细胞谱系的细胞中。在此研究中，百分比收缩计算如下：

非糖尿病小鼠的伤口主要通过收缩闭合，而糖尿病小鼠(如此研究中使用的那些)的伤口收缩能力显著降低(可能是由于肉芽组织形成不足)。因此，糖尿病动物未经治疗的伤口倾向于通过上皮再生到比非糖尿病动物的上皮再生更大的程度而闭合。对增强收缩的观察表明肉芽组织功能得到改善，这又可以通过肉芽组织形成量的增加、形成速度的增加或组织的收缩能力增加来解释。所有处理组的平均百分比伤口收缩数据在表3(下方)中描述并在图22中示出。

表3-“百分比伤口收缩”数据总结。

当考虑治疗对伤口收缩的影响时，观察到以下情况：

-从第8天起，与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，所有考虑的治疗均发现显著加速伤口收缩。

-当比较三种Jellagen产品时，对1.0％ EDC交联的粉末产生应答的收缩倾向于更广泛，这往往比对0.5％产生应答时观察到的更广泛，而后者又往往比对非交联海绵产生应答的收缩更广泛。统计分析发现，与使用非交联海绵治疗相比，使用1.0％ EDC交联的粉末可以显著促进收缩。

结果总结-伤口上皮再生

对于给定的伤口，在给定的时间点，上皮再生的面积表示为受伤后即刻该伤口的原始面积的百分比。所有处理组的平均百分比伤口上皮再生数据在表4(下方)中描述并在图23中示出。

表4-“百分比伤口上皮再生”数据总结

当考虑治疗对伤口上皮再生的影响时，观察到以下情况：

-当考虑Jellagen处理组时，发现施涂非交联海绵比施涂EDC交联的粉末更有效。

-在第8天、第12天和第16天，发现对非交联海绵产生应答的上皮再生大于在Promogran^TM处理组中观察到的；并且在第20天更少。

-在大部分研究中，对EDC交联的粉末产生应答的上皮再生往往低于对‘仅薄膜敷料’对照治疗产生应答的上皮再生，尽管在第20天得出研究结论时已经达到了相似的上皮再生水平。

结果总结-新真皮组织生成的开始

每天对研究中的所有伤口进行目视评估，直到第8天，随后在第10天、第12天、第14天、第16天和第20天确定其“愈合”状态。每个伤口都根据其是否在中央伤口区域内表现出“新真皮组织生成活动”进行评分。评分由两名独立观察者独立进行，并且在每个评估点比较处理组之间表现出“新真皮组织生成活性”的伤口的平均％。表5显示了每个处理组每天响应的伤口数量。表6显示了每组的平均响应时间。应当注意，由于‘仅薄膜敷料’处理组的10个伤口中有10个在研究期间没有响应，因此此组‘响应时间’的平均值是一个大于20的未知值。

表5-显示‘新真皮组织形成开始’的伤口数量(下划线表示实现了100％开始)

表6-响应时间(以天为单位)

与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，所有三种Jellagen产品的施涂都促进了中央伤口区域内‘新真皮组织形成’的开始。在所研究的三种Jellagen治疗中，1.0％ EDC交联的粉末导致最快的‘开始’，其次是0.5％ EDC交联的粉末，最后是非交联海绵。所有三种产品都与Promogran^TM一样有效(如果不是更有效的话)。

结果总结-伤口组织学

在受伤后第20天得出研究结论时，从每只动物身上采集伤口组织以及周围的每个伤口皮肤。将组织样品固定、处理并包埋在石蜡中。从每个伤口的中心沿头尾方向截取切片(约6μm)。这些切片用苏木精和伊红(H&E)染色并且进行数字扫描。图24和图25示出了每个实验组中伤口外观的代表性实例。下面描述了每组伤口的肉芽组织沉积的典型水平和伤口上皮再生的程度。

对照治疗的伤口显示出有限的肉芽组织形成和有限的上皮再生(两者均局限于伤口边缘)。

相对于对照，非交联海绵的施涂导致肉芽组织形成和上皮再生增加。尽管发现‘质量’是可变的，但肉芽组织在整个伤口基部形成。大部分伤口无明显产品残留。

两种EDC交联的粉末的施涂导致肉芽组织形成增加，大多数伤口的上皮再生程度最低。这些产品似乎充当了肉芽组织沉积的支架，(并且当完全细胞化时)可以支持上皮再生。基于大体伤口图像和组织学外观，这些产品在20天的研究期间内似乎没有发生显著降解。

EDC交联的水母胶原蛋白粉末似乎促进了新血管从伤口边缘生长到其中。这在1.0％粉末中最为明显(肉眼可见，伤口表面水合块外缘逐渐发红)，并且在组织切片上也很明显(图26)。

研究结果

在此研究中评估的所有三种Jellagen产品均被发现对db/db糖尿病小鼠受损愈合模型中的伤口愈合具有积极影响。

非交联胶原蛋白海绵通过促进收缩和上皮再生来促进伤口闭合，并且被发现促进肉芽组织形成。海绵材料经历了广泛的压实、有限的降解并且似乎没有融入伤口组织中。

交联的粉末主要通过促进伤口收缩过程来促进伤口闭合，这可以通过这些产品作为肉芽组织形成支架的能力来解释。

实例4–研究水母源性胶原蛋白调配物对db/db(BKS.Cg-m Dock7^m+/+Lepr^db/J)糖尿病小鼠的全层切除性伤口愈合的影响

目标

程序

被测材料：

-交联的水母胶原蛋白海绵(Jellagen)。使用500μL AMY2(4.5mg/mL)在24孔板中制成。1％ EDC交联的CHCl₃无菌。DOM 2020年10月。海绵切成伤口大小。

-微粉化1％ EDC*交联的水母胶原蛋白粉末(Jellagen)-CHCl₃无菌(约2.5mg的单独伤口等分试样)。

-微粉化硫醇化水母胶原蛋白粉末(Jellagen)-CHCl₃无菌(约2.5mg的单独伤口等分试样)。

-比较物：

可流动伤口基质(美国普林斯顿的英特格拉生命科学公司(Integra Lifesciences Inc.Princeton,USA))。产品代码：FDR 301，批号：4679547，有效期2021年9月30日。

BKS.Cg-m Dock7m+/+Leprdb/J糖尿病小鼠模型

下面简要概述所采用的方法。

大约9周至10周龄的糖尿病小鼠(BKS.Cg-m Dock7m+/+Leprdb/J，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室)被带到英国，并在研究开始前适应环境一周。根据英国内政部规定和糖尿病动物的具体要求饲养动物。动物被随机分配到5个处理组(表7)。

表7-实验组

在重新施涂的天数(参见上表7)，重新麻醉动物，去除其薄膜敷料和任何游离碎片，并且使用无菌盐水浸泡的纱布轻轻清洁其伤口(和边缘皮肤)(不干扰任何伤口内的现有产品)。然后对伤口进行拍照(未示出)，用15μl无菌生理盐水润湿，并且在选定天数将产品重新施涂于选定组的伤口。重新施涂产品后(在指示的情况下)，用Tegaderm^TM薄膜敷料重新涂覆伤口，并且使动物在温暖的环境(约35℃)中恢复。在受伤后即刻和受伤后第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天和第63天对伤口以及校准/识别板一起进行数字拍照。

在受伤后第35天，每组8只动物被处死。所有剩余的动物在受伤后第63天被宰杀。

结果总结–伤口闭合

在受伤后即刻以及随后在第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天和第63天对每个伤口以及识别/校准板进行数字拍照。对于给定时间点的给定伤口，伤口闭合表示为相对于受伤后即刻(即第0天)初始伤口面积的剩余百分比伤口面积。所有处理组的平均剩余百分比伤口面积数据在图27中示出。由于海绵的存在，XL海绵处理组的伤口边缘并不总是能够清晰可见，因此该测试组的值未包含在图27中。

-与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，所有考虑的治疗都被发现可以增加闭合，直到受伤后至少第35天。在第35天与第63天之间，除硫醇化粉末和对照组处理组外，所有组的伤口愈合都出现了一些倒退。

-从至少第12天(对于1.0％ EDC XL粉末和硫醇化粉末第4天)开始，与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，发现评估的每种Jellagen产品都能显著促进伤口闭合(图27)。

-当比较两种Jellagen产品时，接受硫醇化粉末的伤口在第35天(其中n＝12)表现出最大的应答，其次是1％ EDC XL粉末(图28)。在后来的时间点(第35天之后)(其中n＝4)没有发现显著差异。

-当将硫醇化粉末与Integra产品进行比较时，在第35天(n＝12)(图29)观察到非常相似的闭合曲线，并且从第42天到第63天(n＝4)(图27)观察到硫醇化粉末的闭合略有增加。

结果总结–伤口收缩

非糖尿病小鼠的伤口主要通过收缩闭合，而糖尿病小鼠(如此研究中使用的那些)的伤口收缩能力显著降低(可能是由于肉芽组织形成不足)。因此，糖尿病动物未经治疗的伤口倾向于通过上皮再生到比非糖尿病动物的上皮再生更大的程度而闭合。对增强收缩的观察表明肉芽组织功能得到改善，这又可以通过肉芽组织形成量的增加、形成速度的增加或组织的收缩能力增加来解释。所有处理组的平均百分比伤口收缩数据在图30中示出。

当考虑治疗对伤口收缩的影响时，观察到以下情况：

-与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，所有考虑的治疗均发现显著增加伤口收缩，直至受伤后至少35天。

-从至少第12天(对于XL海绵第4天，对于1％ EDC XL粉末第8天，并且对于硫醇化粉末在第8天接近显著)开始，与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，发现评估的三种Jellagen产品中的每种都能显著促进伤口收缩(图30)。

-当比较三种Jellagen产品时(图31)，接受硫醇化粉末的伤口在第35天表现出最大的收缩(其中n＝12)，XL海绵和1％ EDC XL粉末促进的收缩略低，与Integra产品相当(图30)。

-当将硫醇化粉末与Integra产品进行比较时(图32)，观察到硫醇化粉末的收缩增加，在第20天和第28天至第42天达到统计学显著(p≤0.029)，在第16天和第24天接近显著性(分别为p＝0.060和0.068)。

结果总结–伤口上皮再生

对于给定的伤口，在给定的时间点，上皮再生的面积表示为受伤后即刻该伤口的原始面积的百分比。所有处理组的平均百分比伤口上皮再生数据在表4(下方)中描述并在图33中示出。当海绵保持在原位时，无法准确测量接受XL海绵的伤口上的上皮再生，因此该处理的结果未包含在图33中。

当考虑治疗对伤口上皮再生的影响时，观察到以下情况：

-与‘仅薄膜敷料’对照治疗相比，所有考虑的治疗都被发现可增加伤口上皮再生，直到受伤后至少35天。

-从至少第16天开始，与‘仅薄膜敷料’对照相比，Jellagen 1％ EDC XL粉末和Jellagen硫醇化粉末产品均被发现显著促进伤口收缩。具体地，在第12天至第35天与对照伤口相比，接受硫醇化粉末的伤口表现出显著增加的伤口上皮再生(p≤0.007)，并且在第16天至第35天与对照伤口相比，接受1％ EDC XL粉末产品的伤口表现出显著增加的伤口上皮再生(p≤0.028)，在第12天接近显著(p＝0.052)。

-当比较1％ EDC XL粉末和硫醇化粉末时(图34)，接受硫醇化粉末的伤口在第35天(其中n＝12)表现出最大的上皮再生，1％ EDC XL粉末促进的上皮再生稍低。

-当将硫醇化粉末与Integra产品进行比较时(图34)，Integra产品通常表现出到受伤后第35天的上皮再生水平略有增加，在第16天、第28天和第35天达到显著(p≤0.039)。然而，硫醇化粉末在受伤后第8天表现出上皮再生显著增加(p＝0.010)。

Claims

1.一种用于治疗伤口的组合物，其中所述组合物包括水母胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的供使用的组合物，其中所述伤口与大疱性表皮松解症(Epidermolysis Bullosa)无关。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白不呈水解产物形式。

4.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白呈其去端肽形式。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白呈其端肽形式。

6.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白是硫醇化的。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的供使用的组合物，其中水母是交联的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白的来源来自钵水母纲(Scyphozoa)亚门。

9.根据权利要求8所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白的来源选自由以下组成的组：褐色根口水母(Rhizostomas pulmo)、海蜇(Rhopilema esculentum)、地中海水母(Rhopilema nomadica)、炮弹水母(Stomolophus meleagris)、海月水母属(Aureliasp.)、仙后水母(Cassiopea andromeda)、野村水母(Nemopilema nomurai)或其任何组合。

10.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白呈水凝胶、糊剂、粉末，优选地微粉化粉末、膜、支架、溶液、海绵基质、纳米纤维静电纺丝基质形式，或者呈冻干形式。

11.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种生长因子。

12.根据权利要求11所述的供使用的组合物，其中所述至少一种生长因子是富血小板血浆(PRP)、上皮生长因子38(EGF)、转化生长因子-β(TGF-B、TGF-B2、TGF-B3)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞-单核细胞集落刺激生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1(IGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血管5内皮生长因子(VEGF)或其任何组合。

13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种抗微生物化合物。

14.根据权利要求13所述的供使用的组合物，其中所述至少一种抗微生物化合物是纳米银、青霉素(penicillin)、氧氟沙星(ofloxacin)、四环素(tetracycline)、氨基糖苷类、红霉素(erythromycin)、庆大霉素(gentamycin)、氟氯西林(flucloxacillin)、克拉霉素(clarithromycin)、强力霉素(doxycycline)、艮他霉素(gentamicin)、甲硝唑(metronidazole)、复合阿莫西林-克拉维酸(co-amoxiclav)、复方新诺明(co-trimoxazole)(在青霉素中)、头孢曲松(ceftriaxone)、哌拉西林(piperacillin)与他唑巴坦(tazobactam)、克林霉素(clindamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)、利奈唑胺(linezolid)和/或标准护理抗微生物剂或其任何组合。

15.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白被调配用于局部施涂于伤口。

16.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述胶原蛋白以每次施用0.01g/L至200g/L，优选地1g/L至50g/L的剂量施用。

17.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其调配成霜剂、双凝胶、软膏、面膜、血清、乳、洗剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、棒、洗发剂、调节剂、贴剂、水醇或油性水溶液、水包油或油包水或多重乳液、水性或油性凝胶、液体、糊状或固体无水产品、静电纺丝胶原蛋白纳米纤维基质、膜和/或使用球体在水相中的油分散剂，这些球体是聚合物纳米颗粒，如纳米球和纳米胶囊或离子和/或非离子类型的脂质囊泡，更优选地静电纺丝胶原蛋白纳米纤维基质和/或膜。

18.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白进一步包括药学上可接受的赋形剂和/或载体和/或药学活性成分。

19.根据权利要求18所述的供使用的组合物，其中所述药学活性成分是利多卡因(lidocaine)，优选地浓度为0.1％至2％。

20.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中待治疗的所述伤口是压疮、移植部位、外科手术伤口、溃疡，优选地糖尿病溃疡、热烧伤、化学烧伤、电烧伤、撕裂伤、擦伤、刺伤、撕脱伤、血清肿和/或血肿。

21.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白呈微粉化粉末形式。

22.根据权利要求21所述的供使用的组合物，其中所述微粉化粉末具有1μm至1000μm的粒径，优选地其中所述微粉化粉末具有200μm至500μm的粒径。

23.根据权利要求1至20中任一项所述的供使用的组合物，其中所述水母胶原蛋白呈胶原蛋白3D海绵支架形式。

24.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的组合物，其中所述组合物促进经治疗的伤口中的血管生成得以改善，任选地其中所述改善的血管生成是相对于未治疗的伤口和/或用牛胶原蛋白治疗的伤口而言的。

25.一种制造根据权利要求1所述的水母胶原蛋白的方法，所述方法至少包括以下步骤：

i)从水母胶原蛋白来源中提取酸溶性胶原蛋白；以及

26.根据权利要求25所述的制造水母胶原蛋白的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：

iii).添加交联剂以形成交联的水母胶原蛋白。

27.根据权利要求26所述的制造水母胶原蛋白的方法，其中所述交联剂是EDC、京尼平(Genipin)或聚乙二醇(PEG)。

28.根据权利要求27所述的制造水母胶原蛋白的方法，其中所述交联剂是EDC，任选地其中所述EDC的浓度为0.01％至5％，优选地其中所述EDC的浓度为0.5％至1％。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的制造水母胶原蛋白的方法，其中所述方法进一步包括用肽酶消化所提取的水母胶原蛋白以提供去端肽水母胶原蛋白，任选地其中所述肽酶是胃蛋白酶。

30.根据权利要求29所述的制造水母胶原蛋白的方法，其中所述用肽酶消化所述胶原蛋白的步骤是在所述提取步骤之后和所述纯化步骤之前进行的。